RS50242B - Primena derivata 4-h-1-benzopiran-4-ona kao inhibitora preteranog razmnožavanja ćelija glatkih mišića - Google Patents

Description

Oblast u koju spada pronalazak

Pronalazak se odnosi na primcnu derivata 4-H-l-benzopiran-4-ona kao inhibitora preteranog razmnožavanja ćelija glatkih mušica (SMC).

Izjava u vezi sa federalnim finansiranjem istraživanja ili razvoja

Ovaj je pronalazak ostvaren uz podršku Nacionalnog institituta za zdravlje na osnovu rešenja o finansiranju br. HL03658 i AG15234.

Poznato stanje tehnike

Ćelijsko reagovanje na povredu krvnih sudova - poremećaj, aktiviranje, gubitak različitosti, preterano razmnožavanje i kretanje ćelija - dostižu vrhunac u kliničkim pojavama kao što je restenoza, koja se javlja posle balonske angioplastike, umetanja cevčice za širenje radi lečenja humanog aterosklerotičkog oboljenja<1.>Preterano razmnožavanje ćelija glatkih mišića (SMO) zajedničko je, reklo bi se objedinjujućc, svojstvo modela oštećenja krvnih sudova, a SMO su glavne ćelijske komponente povreda sa pokožicom"". Obnovljen interes za suzbijanje prevelikog razmnožavanja SMO posledica je povećane primenc usađenih cevčica za lečenje koronarnih oboljena, pošto restenoza u tim usađenim cevči-cama skoro u potpunosi zavisi od obrazovanja pokožice i prevelikog razmnoža-vanja SMO \ Procenjeno je da je čak 100 000 pacijenata sa usađenim cevčicama zahtevalo lečenje samo tokom 1997 \ zbog Čega bijedan efikasan inhibitor prevelikog razmnožavanja SMO, koji se može Iako davati, imao značajno kliničko i ekonomsko opravdanje<6.>

Napori da se spreči preterano razmnožavanje SMO u modelima povreda kivnih sudova, bilo mođulisanjem ćelijskih posrednika reagovanja preteranim razmnožavanjem, bilo neposrednom uticanjem na mehanizam ćelijskog ciklusa, dali se važan uvid u obrazovanje pokožice. Razvoj ćelijskog ciklusa je čvrsto kon-trolisan proces pozitivno regulisan kinazama zavisnim od ciklina (Odks) i njiho-vim ciklinskim rcgulacionim nižim jedinicama ', a negativno inhibitorima Ođk i genima koji suzhijaju tumore kao što je retinoblastomski protein (Rb) i p>3'\ Adcnovirusno posredovano prckomerno izražavanje endogenih Odk inhibitora p2l i p27<k>,|<>><1>ili jednog konstitutivno aktivnog oblika Rh blokira obrazovanje pokožice kod modela povrede karotidc pacova^'". Slično tome. suzbijanje dclo-va nja faktora 1-2F transkripcije preko srodnih mesta vezivanja DNK koja se isto tako preterano izražavaju takode suzhija preterano razmnožavanje SMC i obrazovanje pokožice '<2>. Takve studije podržavaju opštu hipotezu da jc inhibiranje ćelijskog ciklusa privlačan cilj za intervenciju kod obrazovanja oštećenja krvnih sudova.

Mada su genetske intervencije doprinele razumevanju mehanima koji reguliše obrazovanje pokožice, one imaju taj nedostatak da za sada nisu klinički pogodnne za lečenje vaskularnih oboljenja kod ljudi. Neko u vodi rastvorljivo jedinjenje male molekulske mase, sa regulacionim delovanjem specifičnim na ćelijski ciklus, naročito koje se može primeniti oralno, imalo bi široku primenu i eksperimentalno i, moguće, klinički. Nedavno definisan flavon, flavopiridol, jeste jedan Cdk inhibitor koji snažno blokira delovanje Cdk2, Cdo, i CdK411 /.a razliku od drugih farmakoloških inhibitora Cdks, flavopiridol se ističe svojom specifičnošću na kinazu, mogućnošću dobijanja oralnog oblika, kao i svojom sna-gom, jer je efikasan u nanomolskim koncentracijama<1>. Ova jedinstvena svojstva daju povoljan profil nusgrcdnih dejstava koji je doveo do ispitivanja flavopiridola u fazi I kliničkih ispitivanja za lečenje izraslina koje su otporne na lečenje ''. Polazeći od tih svojstava, ispitivali smo sposobnost flavopiridola da suzbije prekomerno razmnožavanje SMC in vitro i posle povrede balonom karotidne arterije pacova. Pokazali smo da je flavopiridol jedan moćan i selektivan inhibitor razvoja ćelijskog ciklusa i da zaustavlja prekomerno razmnožavanje SMC i in vivo i in vitro. Šta više, obrazovanje pokožice efikasno je blokirano oralnim dozama flavopiridola nižim od onih za koje se zna da deluju toksično na ljude.

Neočekivano je utvrđeno da su derivati 4-H-l-benzopiran-4-ona pogodan inhibitor prekomernog razmnožavanja SMC. Poznato je da su derivati 4-II-I-benzopiran-4-ona pogodni za kontrolu tumora. Iznenađujuće je, međutim, da deriva-ti 4-H-l-benzopiran-4-ona prema oovom pronalasku efikasno deluju kao inhibitor prekomernog razmnožavanja SMC na nivou doziranja manjem od nivoa doziranja koji su morali da se koriste kod kontrole rasta tumora.

Prema tome, jedan je predmet ovog pronalaska primena derivata 4-H-l-benzopiran-4-ona kao inhibitora prekomernog razmnožavanja ćelija glatkih mišića.

Slika 1.Delovanje lfavopiridol na sintezu DNK HASMC.A. Nepokretne HASMC obrađivane su bez (-) i sa ( + ) bFGF (osnovni faktor rasta fibroblasta) (10 ng/ml) i sa naznačenim koncentracijama flavopiridola (nmol/L) u trajanju od 24 h. Uključivanje BrdU (5-bromo-2'-deoksiuridina) kao mere preterano« razmno-žavanja određeno je jednim ispitivanjem na bazi ELISA i izraženo kao procenat uključivanja kod izostavljanja obrade sa bFGF.<*>p<0,05, poreeleno sa neobra-đenim ćelijama, t p<0,05, poređeno sa obradom sa bFGF bez flavopiridola. H. HASMC su obrađivane sa bFGF (10 ng/ml), trombinom (2 U/ml) ili nosačem sa ili bez flavopiridola (75 nmol) i mereno je uključivanje BrdU.<*>p<0,05, porc-deno sa neobrađenim ćelijama.<**><0,05, poredeno sa obradom samo sa bFGF. t p<0.05. poredeno sa obradom samo sa trombinom.

Slika 2.Delovanje flavopiridola na preterano razmnožavanje HASMC.Nepokretne HASMC bile su obrađivane samo sa bFGF (10 ng/ml) (□). bFGF i flavo-piriđolom (75 nmol/L) (□). ili nosačem (□) u naznačenim vremenima trajanja i određenje broj ćelija posle obrade. Rezultati su izraženi kao broj ćelija po čašici (X IO3).

Slika 3.Delovanje flavopiridola na aktivnost kinaze u HASMC zavisne od ciklina.Nepokretne HASMC obrađivane su sa bFGF (10 ng/ml), trombinom (2 U/ml) ili nosačem sa ili bez flavopiridola (75 nmol/L), a fosforilovanje histona Hl uzeto jc kao mera aktivnosti Cdk i izraženo u procentima delovanja Cdk bez obrade sa bFGF.<*>p<0,05, poredeno sa neobrađenim ćelijama.<**>p<0,05, poredeno sa obradom samo sa bP'GF. t p<0,05, poredeno sa obradom samo sa trombinom.

Slika 4.Regulisanje flavopiridolom proteina povezanih sa ćelijskim ciklusom.Nepokretne HASMC obrađivane su sa ( + ) ili bez (-) bFGF (10 ng/ml), trombinom (2 U/ml) i/ili flavopiridolom (75 nmol/L) u trajanju od 24 h. Imunobojenje ćelijskih lizata vršeno je specifičnim antitelima koja raspoznaju Ciklin D, (gornja traka), PCNA (srednja traka) i fosfori!izovane (pRb) i hiperfosforilizovane (ppRb) Rb (donja traka).

Slika 5.Delovanje flavopiridola na aktivnost MAP kinaze u HASMC.Nepokretne HASMC obrađivane su sa ( + ) ili bez (-) bFGF (10 ng/ml), trombinom (2 U/ml), PD98059 (30 ^.mol/L) i/ili flavopiridolom (75 nmol/L) u trajanju od 30 min. Nivoi fosforilizovanog Erkl (pErkl) i L;rk2 (pErk2) mereni su imunobojenjem sa jednim antitelom specifičnim na fosforilizovanje koje prepoznaje oba proteina (gornja traka). Aktivnost MAP kinaze merena je jednim ispitivanjem kinaze u gelu, koristeći mijelinski osnovni protein kao podlogu (donja traka).

Slika 6.Sposobnost preživljavanja HASMC posle obrade flavopiridolom.Nepokretne HASMC obrađivane su flavopiridolom (75 nmol/L). TNF-D (50 ng/ml) ili nosačem u naznačenim trajanjima. Sposobnost preživljavanja ćelija procenjena je isključivanjem tripan plavog. Rezultati su izraženi kao procenat ćelija sposobnih za život prema ukupnom broju ćelija.

Slika 7.Suzbijanje flavopiridolom obrazovanja pokožice u karotidnoj arteriji pacova posle povrede balonom.Odnosi pokožica/okolna površina mereni su na histo-loškim isečcima karotnih arterija pacova lečenih sa ili bez flavopiridola (5 mg/kg) tokom 5 dana posle povrede. Arterije su ispitivane 7. (n=12) i 14. (n=12) dana posle povrede. Takođe je dat procenat PCNA-pozitivnih jedara (±SEM [standardno odstupanje od srednje vrcdnosti| kao procenat od izbrojanih jedara) u pokožici arterija u svakoj vremenskoj tački i u svakoj grupi lečenja.<*>p<0,05 poredeno sa lečenjem pomoću nosača.

Slika 8.HistološkiLsečci karotidnih arterija pacova.Isečci su od arterija 7 (trake A i B) i 14 (trake C i D) dana posle povrede. Arterije prikazane na trakama A i C su od pacova lečenih flavopiridolom (5 mg/kg) ubacivanjem cevčicom u stomak, dok su arterije na trakama F> i D od pacova obrađenih samo nosačem. Originalno povećanje, X 100.

Slika 9.Izražavanje Cdk2 u karolidnim arterijama pacova posle povrede balonom.Isečci su od arterija 7 (trake A i B) i 14 (trake C i D) dana posle povrede. Arterije prikazane na trakama A i C su od pacova lečenih flavopiridolom (5 mg/kg) ubacivanjem cevčicom u stomak, dok su arterije na trakama B i D od pacova obrađenih samo nosačem. Cdk2-pozitivna jedra, smeštena pretežno u pokožici, bojena su Vector plavim postupkom alkalne fosfataze. Originalno povećanje, X 100.

Pogodni su 4-H-l-benzopirani jedinjenja formule

pri čemu

Rtje vodonik, alkil sa 1 do 6 ugljenikovih atoma, aril-C1-C4-alkil; C^Cg-alkil supstituisan sa halogenom, hidroksi ili karboksi; C^-Ce-cikloalkil, piriđil, tienil, C3-C6-cikloalkil-C1-C4-alkil, CrCg-alkenil, (VCValkinil, fenil; fenil, monosupstituisan ili višestruko supstituisan sa halogenom, CrC4-alkilom, CrC4-alkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2, CONH-alkilom, CON(alkil)2) nitro, trifluorometilom, amino, C,-Ca-alkilamino, di-CrC4-alkilamino, ili fenilom; naftil, karboksil, -CHO, COO-CrC4-alkil, neki primarni amino, alkilamino, aralkilamino, đialkilamino, amiđo, arilamino, diarilamino ili -CH20-C[-C4-aIkil;

R2je vodonik, alkil sa 1 do 6 ugljenikovih atoma, aril, nitro, amino, di-Ci-C4-alkilamino, jedan halogen, hidroksil, alkoksi, -COOH, -COO-C,-C4-alkil, -CHO, -CH2OH ili -CH20-CrC4-alkil;

R3je vodonik, CrC4-alkil; C,-C4-alkil supstituisan sa haligenom, hidroksi ili karboksi; hidroksil, karboksil, nitro, amino, CrC4-alkilamino, di-CrC4- alkilamino, halogen, -0-alkil-C(0)-alkil, -CHO, -CH2OH, -CH20-CrC4-alkil ili R2N-C(0)-0-, gde R je H, C-CValkil, cikloalkil; ili -0-alkil-C(b)-alkii ili aril;

R4je vodonik, hidroksil, CrC4-alkoksi, CrC4-alkanoiioksi, CrC4-alkoksi-karbonil, ariloksi, amino, C,-C4-alkilamino, di-CrC4-alkilamino, ili R'rN-C(0)-O- pri čemu R' je H, CrC6-alkil, cikloalkil ili aril;

Rt je vodonik, Cj-Q-aIkil, ari]-C,-C4-alkil, CrCć-cikIoalkil, CrC6-cikloalkil-Cr C4-alkil, alkil amino, C,-C4-alkanoil, -C(0)-0-CrC4-alkil ili aroil, gde je arilna grupa u Ru R2>Rj, R4i Rsnesupstituisan fenil ili fenil koji je jednostruko ili više-struko supstituisan sa halogenom, CrC4-alkilom, CrC4-alkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2, CONH-alkilom, CON(alkil),, nitro, trifluormetilom, amino, C.rC4-aIkiIamino, di-CrC4alkilamino ili fenilom;

m je ceo broj između 0 i 3, a n je 1,

i njegove farmakološki prihvatljive aditivne soli kiselina.

Jedinjenja prema pronalasku imaju dva centra nesimetričnosti, jedan na mestu gde je heterociklični prsten koji sadrži azot fuzionisan na benzopiransku grupu (C-4<1>), drugi kod R4-supstituisanog ugljenikovog atoma (C-3'), što znači da su moguća dva para optičkih izomera Definicija jedinjenja prema pronalasku obuhvata sve moguće stereoizomere i njihove mešavine. Naročito obuhvata racemske oblike i izdvojene optičke izomere koji imaju specificirano dejstvo. Dva se racemata mogu razdvojiti fizičkim postupcima kao što je, na primer, frakciona kristalizacija. Pojedinačni optički izomeri mogu se dobiti od racemata uobičajenim postupcima kao što je, na primer, obrazovanje soli sa jednom optički aktivnom kiselinom posle čega sledi kristalizacija.

Primeri alkilnih grupa pogodnih za R[do R5 jesu pravolinijski ili račvasti radikali koji imaju do 6, najbolje do 5 ugljenikovih atoma, na primer metil, etil, propil, izopropil, t-butil, pentil ili izopentil.

Primeri supstituisanih alkilnih grupa pogodnih za R1do R5jesu haloalkili kao što su trifluorometil, hidroksialkil, kao što je hidroksietil, ili karboksialkil, kao što je karboksietil.

Pogodni primeri jedne cikloalkil grupe koja ima 3 do 6 ugljenikovih atoma a predstavljaju jeR{do Rs, jesu ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil ili cikloheksil. Ciklopropilmetil je primer cikloalkilalkila.

Primer aralkil grupe koju predstavljaju R, do Rs jeste jedna fenilalkil grupa u kojoj je fenil grupa nesupstituisana ili je monosupstituisana ili je polisupstituisana sa supstituentima kao što su halogen, C,-C4-alkil, C,-C4-alkoksi ili nitro ili sa nekom trifluorometil grupom, amino grupom ili supstituisanom amino grupom.

Primer arilne grupe koju predstavljaju R, do R5jeste jedna fenil grupa koja je nesupstituisana ili je monosupstituisana ili je polisupstituisana sa supstituentima kao što su halogen, Cj-C4-alkil, CrC4-aIkoksi, hidroksil, karboksil, COO-alkil, CONH2, CONH-alkil, CON(alkil)2, nitro ili trifluorometil, amino, CrC4-alkilamino, di-C,-C4-alkilamino, aromatične heterociklične grupe kao što su piridilne grupe, i policiklični aromatični radikali kao što su naftil grupe.

Pogodan primer jedne alkilamino grupe koju predstavljaju R, do R<jeste (CH2)n-NR6R7, gde n je 1 do 3 a R6 i R7su alkil a takvi su kako su napred definisani u slučaju samih R[do R5. Pored toga R6i R7zajedno sa atomom azota na koji su vezani mogu biti jedan heterociklični prsten koji ima jedan ili više hetero atoma. Pogodni primeri heterocikličnih prstenova koje obrazuju Rf, i R7zajedno sa azotovim atomom na koji su vezani jesu piperidin, pirolidin. morfolin. piperazin ili imidazol, od kojih svi mogu biti nesupstituisani ili supstituisani u jednom ili više položaja sa CrC4-alkilom, Q-C4-alkoksi ili arilom ili hidroksilom ili amino grupom.

Pogodni primeri soli jedinjenja prema pronalasku, sa neorganskim ili organskim kiselinama, jesu hidrohloridi, hidrobromidi, sulfati, fosfati, acetati, oksalati, tartrati, citrati, maleati ili fumarati.

Preporučljiva su jedinjenja formule Ia

gde Rtje vodonik, CpC^-alkil, naftil, fenil; fenil monosupstituisan ili polisupstituisan sa halogenom, Ci-C4-alkilom, CVC-alkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2, CONH-alkilom, CON(alkil)2, nitro, trifluorometilom, amino, C1-C4-alkilamino, di-C1-C4-alkilamino, ili fenilom; piridil ili tienil; R2je vodonik ili Cj-Cj-alkil;

R5je CrC3-alkil, C3-Cs-cikloalkil ili C3-C5-cikloalkil-CrC4-alkil.

Posebno su preporučljiva jedinjenja formule Ia, kod koji Rjje fenil, tienil, piridil, hlorofenil, dihlorofenil, metilfenil, aminofenil, bromofenil, hidroksi fenil ili naftil;

R2je vodonik a

R$je metil.

Posebno važno jedinjenje je (-)-cis,-5,7-dihidroksi-2-)(2-hlorfenil)-8-[4-(3-hidroksi-l-metil)-piperidinil]-4H-benzopiran-4-on (Flavopiridol), posebno u obliku hidrohlorida.

Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu se pripremati kako je opisano u američkim patentima br. 4,900,727 i 5,284,856 koji su ovde uključeni kao literatura. Primeri u pomenutim američkim patentima takođe su od značaja za ovu prijavu.

Jedinjenja prema ovom pronalasku sprečavaju preterano razmnožavanje ćelija glatkih mišića. Zbog toga su sledeći predmet pronalaska farmaceutska sredstva za sprečavanje preteranog razmnožavanja ćelija glatkih mišića, a koja sadrže najmanje jedno jedinjenje formule I kako je napred definisano, ili bar jednu od njegovih farmakološki prihvatljivih aditivnih soli kiselina, kao i primena jednog jedinjenja formule I kako je napred definisano za pripremanje nekog farmaceutskog sredstva koje inhibitorno deluje na preterano razmno-žavanje ćelija glatkih mišića. Tipično područje primene za jedinjenja prema ovom pronalasku jesu oboljenja/poremećaji/povrede koje su praćene oštećenjem krvnih sudova praćenim velikim brojem ćelija glatkih mišića. Veoma važan primer za to su oštećenja, lezije, posle povrede balonom. Druga važna oblast primene jeste sprečavanje restenoze posle usadivanja cevčice za proširenje kivnih sudova.

Derivati 4H-l-bcnzopiran-4-ona koriste se prema pronalasku na opšte poznat način koji je poznat stručnjaku. Za farmaceutske proizvode jedna dclo-tvorna količina pomenutc aktivne supstance primenjuje se sama za sebe ili, poželjnije, u kombinaciji sa pogodnim farmaceutskim pomoćnim materijama a u vidu tableta, obloženih tableta, kapsula, supozitorijuma, emulzija, suspenzija ili rastvora, pri čemu je sadržaj aktivnog jedinjenja do 95%, najbolje između 10 i 75%.

Stručnjak će znati koji su pomoćni dodaci pogodni za željenu formulaciju farmaceutskih sredstava zahvaljujući svom stručnom znanju. Pored dodataka za

tablete, ili rastvarača, sredstva za obrazovanje gela, osnova za supozitorijumc i drugih dodataka aktivnoj supstanci, mogu se koristiti, na primer, antioksidatori. sredstva za dispergovanje, emulgatori, sredstva protiv penušanja, sredstva za poboljšanje ukusa, konzervansi, rastvarači ili sredstva za bojenje.

Aktivna se supstanca može davati oralno, parenteralno, intravenski ili rektalno, mada se smatra da je oralno davanje najbolje. Za jedan oblik oralnog davanja, aktivna se supstanca može mešati sa drugim jedinjenjima zajedno sa dodacima koji su pogodni za tu svrhu, kao što su razni punioci, stabilizatori ili inertni razređivači, a mogu se koristiti uobičajeni postupci za dobijanje oblika pogodnog za davanje, kao što su tablete, obložene tablete, tvrde želatinske kap-sule, i vodene, alkoholne ili uljne suspenzije ili rastvori. Primeri inertnih punilaca koji se mogu koristiti jesu gumarabika, magnezijum oksid, laktoza, glukoza ili škrob, naročito kukuruzni škrob. S tim u vezi, formulacije se mogu pripremati kao suve granule ili vlažne granule. Primeri pogodnih uljnih dodataka ili rastva-rača jesu biljna ili životinjska ulja, kao što su suncokretovo ulje ili riblje ulje.

Za potkožno ili intravensko davanje, obrazuje se neki rastvor, suspenzija ili emulzija aktivne supstance, a po potrebi se koriste supstance koje su uobiča-jene za ovu svrhu, kao što su rastvarači, emulgatori ili drugi dodaci. Primeri pogodnih rastvarača su voda, fiziološki rastvor natrijum hlorida ili alkoholi, na primer etanol, propanol ili glicerol, a takođe i rastvori šećera kao što su rastvori glukoze ili manitola, ili neka mešavina raznih napred pomenutih rastvarača.

Dnevna doza derivata 4H-l-benzopiran-4-ona treba da se bira tako da odgovara željenom dejstvu. Derivati 4H-l-benzopiran-4-ona mogu se davati u dozi koja je manja od 70%, bolje manja od 60%, a posebno manja od 50%'doze koja se koristi za kontrolisanje rasta tumora kod odnosnog sisara. Primer bi bila - kod transplatacije organa sa drugih vrsta na miša - doza od oko 5 mg/kg telesne mase davana oralno jednom dnevno. To je polovina doze koja suzbija rast tumora kao iste vrste životinja (Drees i dr. C.lin. Cancer Res. 1997; 3; 273-279).

Farmakokinetska svojstva derivata 4FI-l-benzopiran-4-ona mogu dovesti do davanja pomenutog jedinjenja nekoliko puta dnevno ili birati formulacije sa sporim ispuštanjem.

Primeri

1. Flavopiridol suzbija preterano razmnožavanje ćelija glatkih mišića i obrazovanje pokožice kod povrede karotidc pacova kao iri vivo modelu povrede krvnih sudova.

Uhodani model povrede karotidc pacova, kod koga obrazovanje ozledc sa pokožicom posle kateterom izazvane povrede kritično zavisi od preteranog razmnožavanja SMC (Clowes i dr., Lab, Invest. 1983; 49:327-333, Clowes i dr. Circ. Res. 1985; 56:139-145), korišćen je da bi se ispitalo da li Flavopiridol izaziva zaustavljanje rasta SMC in vivo kao što čini in vitro. Flavopiridol je davan oralno u dozi od 5 mg/kgf dnevno, počev od dana povrede i u toku četiri dana posle toga, pošto taj vremenski period pokriva početno izazivanje Cdk2 i prvi talas preteranog razmnožavanja SMC (Circ. Res. 1995; 77:445-465, Circ. Res. 1997; 80:418-426). Prosečna površina pokožice i prosečna unutrašnja površina definisane po površini 7 i 14 dana posle povrede, a veličina ozlede sa pokožicom izražena je kao odnos površine pokožice prema unutrašnjoj površini. Po dvanaest životinja bilo je u lečenoj i u nelečenoj grupi. Odnos je posle 7 dana bio 1,00 +/-0.05 u arterijama pacova koji su dobijali nosač i 0,65 +/- 0,04 u arterijama pacova lečenih Flavopiridolom. smanjenje od 35%. Posle 14 dana taj je odnos bio 1,08 +/- 0,04 kod pacova koji su primali nosač i 0,66 +/- 0,03 kod pacova lečenih Flavopiridolom, smanjenje od 38,9%. Ova su delovanja statistički značajna u obe vremenske tačke (P<0,05).

Postupci

Materijali- Flavopiridol (L86-8275, (-)-cis, -5,7-dihidroksi-2-(2-hlorofeniI)-8-[4-(2-hidroksi-l-metil)piperidiniIJ-4H-bcnzopiran-4-on) isporučila je firma PIoechst Marion Roussel, Inc., rastvoren u dimetil sulfoksidu kao standardni rastvor od 50 mmol/L za eksperimente sa kulturama ćelija, ili u vodi za in vivo eksperimente. Osnovni faktor rasta fibroblasta (bFGF) kupljen je od Collaborative Biochemicals a trombin od firme Sigma. MEKI inhibitor PD98059 nabavljen je od New England Biolabs.

Ćelijska kultura- Ćelije glatkih mišića humane aorte (HASMC) nabavljene su kod firme Clonetics i gajene su kako je ranije opisano<1>. Ćelije su korišćene kod prolaza 5-9. Pre vršenja eksperimenta prekinut je rast ćelija pri 80% popunjenosti u trajanju od 48 h sa medijumom koji je sadržao 0,2% seruma goveđeg fetusa.

ELISA preteranog razmnožavanja ćelija -Preterano razmnožavanje bilo je mereno ELISA postupkom (Amersham Life Science). HASMC ćelije gajene su u želatinom obloženim pločama sa 96 čašica i učinjene nepokretnim. Ćelije su obrađivane sa 10 ng/ml bFGF, 2 U/ml trombina ili nosačem, u trajanju od 24 h. Flavopiridol (75 nmol/L) davan jc I čas pre obrade faktorom rasta. Dodan jc 5-bromo-2'-dcoksiuridin (BrdU) tlo krajnje koncentracije od 10jtiinol/L tokom posleđnja 2 h obrade. Lfključcnjc BrdU mereno je kako jc opisano ". Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ±SKM (standardno odstupanje od srednje vrednosti) za 12 uzoraka iz dva nezavisna eksperimenta.

Brojanje ćelija -HASMC ćelije zaustavljenog rasta, narasle do 50% popunjc-nosti, u pločama sa po 6 čašica, obrađivane su sa ili bez flavopiridila (75 nmol/L) ili bFGF (10 ng/ml). U određenim intervalima posle obrade ćelije su tripsinizo-vane a broj ćelija određen jc koristeći jedan hemocitometar.

Western analiza bojenjem -Nepokretne HASNC obrađivane su sa ili bez faktora rasta i/ili flavopiridola, kako je naznačeno. VVestern analiza bojenjem vršena je kako je ranije opisano<1S.>Primarna su antitela bila: poliklonično antihumano ciklin Dl antitelo (M-20, Santa Cruz), monoklonično antihumano PCNA (anti-gen jedra ćelija koje se preterano razmnožavaju) antitelo (PC10, Sigma), p44/42 (Frkl/Erk2) MAP kinazno monoklonično antitelo specifično na fosforilizovanje (New Fvngland Biolabs) i jedno monoklonično anti-Rb antitelo (G3-2245, Pharmigen), koje raspoznaje fosforilizovane (pRb) i jako fosforilizovane (ppRb) Rh vrste. Za studije imuno-bojenja eksperimenti su ponavljani najmanje tri puta.

Delovanje Cdk -Nepokretne HASMC obrađivane su agonistima i inhibitorima tokom 24 h a ukupni lizati ćelija pripremljeni su kako jc opisano za VVestern analizu bojenjem. Ispitivanje kinaze vršeno je pomoći kompleta za histon II, ispitivanje kinaze (Upstate Biotechnologv) a prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 10p. 1peptidnih inhibitora za proteinsku kinazu C (2/xmol/L) i proteinsku kinazu A (2/imol/L), 100 ,ug ćelijskih lizata, 10 p\ pufera za ispitivanje i 10 ^.1 mešavine koja je sadržala 75/i,mol/L magnezijum hlorida, 500/imoI/L ATP i 1 jiCi/ml [y-',<2>P]ATP stavljeno jeu epruvetu mikrocentrifuge. Posle 10 min inkubacije na 30°C, alikvoti su naneti pipetom na fosfocelulozne papire. Papiri su isprani u 0,75% fosfornoj kiselini, a potom je vršeno merenje cpm u jednom scintilacionom brojaču (Beckman). Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ±SEM (standardno odstupanje od srednje vrednosti) za 3 uzorka i predstavljaju tri nezavisna eksperimenta.

Ispitivanje kinaze u gelu- Nepokretne FIASMC obrađivane su 30 min faktorom rasta a ukupni lizati pripremljeni su kako je opisano za VVestern analizu bojenjem. U nekim su eksperimentima HASMC prethodno 60 min obrađivane sa 30 jLimol/L PD98059, flavopiridolom ili nosačem. Jednake količine proteina (50 p,g/traka) rastvorene su na poliakrilamidnom gelu koji jc kopolimerizovan sa 350jug/ml mijelinskog osnovnog proteina. Gel jc obrađen sa |y-<,2>P]ATP a autografija jc izvedena kako je opisano<1>.

Izdvajanje tripan plavim -HASMC su gajene u posudama prečnika 5 cm, pri maloj popunjenosti i zaustavljen im je rast kako jc opisano. Ćelije su obrađene flavopiridolom (75 nmol/L) ili faktorom-": tumorske nekroze (TNF- :: 50 ng/,1) u naznačenim vremenima trajanja. Posle uklanjanja međijuma, u posude jc dodano 0.4'/? tripan plavog u fosfatom puferovanom slanom rastvoru. Posle 5 min prebrojane su pomoću mikroskopa ćelije u posudama. Plave ćelije su hrojanc kao ćelije nesposobne za život.

Model povrede karotide pacova -Povreda karotidne arterije pacova izvedena jc u suštini kako jc opisano<1.>Odrasli mužjaci pacova soja Sprague-Dawlcy (400-500 g, Zivic-Miller) anestezovani su intraperitonalnom injekcijom ketamina (2 mg/kg) i ksilazina (4 mg/kg). U levu unutrašnju karotidu uvučen je jedan 2F embolektomski kateter. Balon je naduvan slanim rastvorom i provučen dužinom arterije tri puta da bi načinio ranu koja se širi i ogoljuje. Desna jc karotidna arterija ostala nepovredena i služila za kontrolu povrede kod svake od životinja. Neposredno posle oporavka od anestezije i četiri dana posle toga, pacovima jc davano, na slepo, tj. bez znanja onih koji su to radil, flavopiridol (5 mg/kg u vodi) ili voda neposrednim unošenjem u želudac. Svi su pacovi preživeli operacije i nije bilo primetnih znakova toksičnosti povezane sa davanjem leka u primenjenim dozama. U određenim vremenskim intervalima posle povrede karotidc pacovi su anestezovani kao i ranije i perfuziono fiksirani sistemski sa 4% paraformalđehi-dom u fosfatno puferovanom slanom rastvoru. Izvađene su desna i leva karotiđa i proširene ubrizgavanjem 4% paraformaldehida kroz šupljinu, posle čega su dehiđrirane i pohranjene u 70% etanolu na 4°C. Imunohistohemija je izvedena kako jc ranije opisano ''\ koristeći monoklonično PCNA antitelo i jedno polt-klonično antihumano Cdk2 antitelo (M2-G, Santa Cruz).

Analiza slika- Uklonjeno je krajnje udaljeno i najbliže područje svake od arterija (oko500 jam).Deset preseka između njih (po 8 ju,m svaki) uzeti na odstojanjima od 500/xmanalizirano jc od svake arterije. Staklene su pločice fiksirane i bojene hematoksilinom i eosinom kako je ranije opisano<l8.>Koristeći jedan Nikon Diaphot 300 mikroskop i jean 4X objektiv, svaki je od preseka snimljen kao digitalna fotografija koristeći jednu Hamamatsu C5985 video kameru i TOPro 2.4] (Coreco, Inc.). Unutrašnja površina i površina pokožice bile su određene koristeći NIH Image softver. Granice unutrašnje površine i pokožice određene su jednim projektorom dijapozitiva (A,M.) a proverene na slepo drugim projektorom (C.P.). Veličina ozlede izražena je kao odnos pokožice i unutrašnje povr-šine. Rezultati za svaku grupu izraženi su kao srednja vrednost ±SEM (standardno odstupanje od srednje vrednosti). 92% ili više slika moglo se protumačiti u svakoj od grupa, dok su ostale oštećene sredstvima za fiksiranje i nisu analizirane.

Statistička analiza -Kad je to odgovaralo, podaci iz kvantitativnih studija izra-žavani su kao kao srednja vrednost ± SEM (standardno odstupanje od srednje vrednosti). Za grupe sa višestrukom obradom korišćena je faktorijalna ANOVA a potom Fišerov test najmanje značajne razlike. Statistički značaj prihvaćen jc pri p< 0,05.

Rezultati

Flavopiridol suzbija preveliko razmnožavanje HASMC- Na osnovu sposobnosti flavopiridola da sprečava preterano razmnožavanje raznih linija ćelija tumora, ispitali smo hipotezu da bi njegova primena blokirala rast primarne kulture humanih SMC IIASMC čiji jc rast zaustavljen obrađene su sa SMC" mitoucnom bFGF (10 ng/ml) tokom 24 h u prisustvu rastuće koncentracije flavopiridola a preterano je razmnožavanje mereno ispitivanjem na bazi BUSA postupka. U poredenju sa neobrađenim ćelijama, preterano razmnožavanje ćelija obrađenih sa bFGF bilo jc povećano 5,4 puta (slika IA). Prethodna obrada u trajanju od I h sa svega 50 nmol/L flavopiridola značajno je smanjila preveliko razmnožavanje HASMC (do 3,9 puta, p<0,05), učinak koji je bio skoro maksimalan kod koncentracije od 75 nmol/L. Slični su rezultati dobijeni koristeći apsorbovanjc timidina kao nezavisnu meru sinteze DNK (nije prikazano).

Da bi se proverila opštost delovanja flavopiridola na prekomerno razmnožavanje SMC, ispitali smo uticaj mitogeneze izazvane trombinom (2 U/ml), koji delujc preko jednog receptora spojenog sa G proteinom, a u poredenju sa bFGF koji stimuliše jedan Član familije receptora tirosin kinaze. Flavopiridol (75 nmol/L) značajno je i moćno suzbio preterano razmnožavanje HASMC izazvano i sa bFGF i sa trombinom (5,4 puta prema 1,8 puta i 2,4 puta prema 0,7 puta. p<0,05, slika 1B). Vršili smo prebrojavanje ćelija da bi potvrdili da je delovanje na razvoj ćelijskog ciklusa u HASMC stvarno odraz promena u prekomernom razmnožavanju. bFGF (10 ng.ml) izazvao je trostruko povećanje broja ćelija posle tri dana obrade (slika 2). Slično rezultatima iz ispitivanja na bazi BLISA-c. flavipiridol (75 nmol/L) efikasno je blokirao preterano razmonožavanje ćelija izazvano sa bFGF.

Flavopiridol suzbija delovanje Cdk i izražavanje u HASMC gena povezanih sa

ćelijskim ciklusom- Da bi se procenilo specifično delovanje flavopirina na mehanizam ćelijskog ciklusa, mi smo merili aktivnost histon FI1 kinaze u ćelijskom lizatu HASMC stimulisanih faktorom rasta. Fosforulisanje histona Hl odražava delovanja CdC2i Cdk2<20.>Obrada HASMC sa bFGF i trombinom dovela jc do povećanja od 4,4 puta, odnosno 3,6 puta, aktivnosti histon Hl aktivnosti (slika 3). Ta povećanja aktivnosti kinaze zavisne od ciklina bila su potpuno blokirana prethodnom obradom flavopiridolom (75 nmol/L).

VVestern analizom bojenjem takode smo proveravali da li flavopiridol utiče na regulisanje, izazvano faktorom rasta, proteina povezanih sa ćelijskim ciklusom u HASMC. CiklinDyje jedan ciklin G, faze koji je regulisan na veću vrednost stimulacijom faktora rasta pa je naglo razložen tokom izvlačenja iz ćelijskog ciklusa<21>. Nivoi ciklin Dl proteina bili su regulisani 6,3 puta, odnosno 3,2 puta, kao reakcija na obradu sa bFGF i trombinom tokom 24 časa (slika 4), delovanje koje se može potpuno blokirati prethodnom obradom sa flavopiridilom. Slično tome, povećano izražavanje PCNA, koji je sintetizovan pretežno u toku S faze povezano sa razmnožavanjem DNK ", takode je blokirano prethodnom obradom sa flavopiridolom. Kao poslednje merenjc proteina povezanih sa ćelijskim ciklusom, ispitali smo fosforilizovanje Rs kao reagovanje na izražavanje faktora rasta koristeći jedno antitelo koje prepoznaje fosforilizovani Rb. Rb jc regulator ćelijskog ciklusa koji se vezuje na faktor E2F transkripcije i dezaktivira kada jc Rb u nefosforilizovanom stanju i inicira prekidanje rasta SMC in vivo. Fosforilizovanje dezaktivira Rb i omogućuje nastavak razvoja kroz S fazu. Analiza fosfori I izacijc Rb je posebno važna zbog toga što jc Rb cilj Cdk, i Cdk4in vivo. I trombin i bFGF izazivali su hiperfosforilizovanje Rbm, dejstvo koje jc bilo suz-hijeno flavopiridolom. Opšte uzev, ti su rezultati ukazali da flavopiridol utiče na delovanje G, i kontrolnih elemenata ćelijskog ciklusa, povezanih sa S fazom, u HASMC zajedno sa delovanjem na suzbijanje rasta.

Flavopiridol ne deluje na fosforilizovanje ili na delovanje MAP kinaze -Da bi sc potvrdilo da flavopiridol deluje specifično na nivou ćelijskog ciklusa, a ne nespe-cifično na putanjama ispred kinaze, merili smo fosforilizovanje i aktivnost Iirkl (p44 MAP kinaze) i Erk2 (p42 MAP kinaze), dva člana familije MAP kinaza. Izabrali smo ove kinaze pošto su one neposredno ispred transkripcionih doga-đaja koji se javljaju kao reakcija na stimulante rasta a iza izvesnog broja kritičnih putanja mitogenskog signalisanja<24.>Potpuno reagovanje MAO kinaza ukazuje da su i prethodne mitogenske putanje takode neoštećene. Merili smo status fosforilizovanja F.rkl i Erk2 jednim monokloničnim antitelom koje specifično prepoznaje fosforilizovane, što znači, i aktivirane oblike. Kao kontrolu u ovim eksperimentima koristili smo PD98059, jedan moćan i selektivan inhibitor aktiviranja MAP kinaze. Povećane količine fosforilizovanih Erkl i Erk2 detek-tovane su posle obrade HASMC sa trombinom i bFGF u trajanju od 30 min, poredeno sa neobrađenim ćelijama (slika 5, gornja traka). Fosforilizovanje Erkl i Ei k2 i trombinom i sa bFGF bilo je blokirano sa PD98059, ali ne i sa flavopiridolom. Da bi se ovi nalazi potvrdili, merili smo aktivnost Erkl i Erk2 ispitivanjem kinaze u gelu (slika 5, donja traka). Ponovo smo utvrdili da su aktivnosti Erkl i Lirk2 bile povećane kao reakcija na trombin i na bFGF, pojava koja se može suzbiti sa PD98059 ali ne i sa flavopiridolom. Ovi eksperimentu u sklopu sa onim prikazanim na slikama 3 i 4, pokazuju da su delovanja flavopiridina na preterano razmnožavanje HASMC posledica specifičnog zaustavljanja mehani-zma ćelijskog ciklusa blokiranjem aktivnosti Cdk bez uticanja na prethodne signalne događaje.

Flavopiridol ne smanjuje sposobnost za život HASMC -Raniji izveštaju o delovanju flavopiridola u drugim vrstama ćelija pokazali su da, u zavisnosti od vrste ćelija, flavopiridol može ili da izazove prekid rasta bez uticaja na sposobnost za život, ili može izazvati apoptozu<16>'<26>"<29.>Zbog toga smo procenjivali da li je flavopiridol smanjio sposobnost za život FIASMC merenjem izdvajanja tripan plavog u raz-im vremenskim tačkama posle obrade. Nepokretne FIASMC obrađivane su flavopiridolom (75 nmol/L), nosačem ili TNF-C! (50 ng/,1), citokinom poznatom da izaziva apoptozu u toj vrsti ćelija '10. Dok je TNF-i ' moćno smanjio sposobnost za život KASMC, što je dovelo do smrti u suštini svih ćelija obrađivanih tokom 24 h, flavopiridol nije tako delovao (slika 6). Zapaženo je da kod većih koncentracija i dužih inkubacija može doći do nekih smanjenja sposobnosti za život u prisustvu flavopiridola (nije prikazano). Ipak, u uslovima vršenih ispitivanja, flavopiridol prc svega izaziva zaustavljanje rasta a da ne utiče na sposobnost za živor SMC:Flavopiridol suzbija preterano razmnožavanje ćelija glatkih mišića i obrazovanje

pokožice in vivo u modelu povrede krvnih sudova u vidu povrede karotide pacova -

Koristili smo uhodani model povrede karotide pacova. kod koga jc obrazovanje ozleđe sa pokožicom posle povrede izazvane kateterom kritično zavisno od preteranog razmnožavanja SMC~\tla bi ispitali tla li flavopiridol izaziva prekid rasta SMC in vivo kako što to čini in vitro. Davali smo flavopiridol oralno u dozi od 5 mg/kg jednom dnevno, počev od dana povrede i sledeća četiri dana, pošto taj period vremena pokriva početno izazivanje Cdk2 i prvi talas preteranog razmnožavanja SMC kod ovog modela ?'<32.>Prosečna površina pokožice i prosečna unutrašnja površina definisane su po površini 7 i 14 dana posle povrede, a veličina ozlede sa pokožicom izražena je kao odnos površine pokožice prema unutrašnjoj površini. Po dvanaest životinja bilo je u lcčenoj i u nelećenoj grupi. Odnos je posle 7 dana bio 1,0 ± 0.05 u arterijama pacova koji su dobijali nosač i 0,65 ± 0,04 u arterijama pacova lečenih flavopiridolom. smanjenje od 35% (slika 7). Posle 14 dana taj je odnos bio 1,08 ± 0,04 kod pacova koji su primali nosač i 0,66 ± 0,03 kod pacova lečenih flavopiridolom, smanjenje od 38,9%. Ova su delovanja statistički značajna u obe vremenske tačke (P<0,05). Primeri preseka arterija prikazani su na slici 8.

Da bi neposredno pokazali da je flavopiridol suzbijao preterano razmnožavanje ćelija glatkih mišića, bojili smo sekcije za izražavanje PCNA u reperezentativnim poljima svake od arterija i određivali procenat PCNA-pozitivnih jedara u poko-žici. Posle 7 dana 31,1±7,2% jedara u povređenim arterijama nelečenih pacova bilo je PCNA-pozitivno, dok je samo 11,8 ± 1,5% povredenih arterija kod pacova lečenih flavopiridolom bilo PCNA-pozitivno (slika 7; p<0.05). Posle 14 dana PCNA-pozitivna jedra nalazila su se u 10,4 ± 2.0% ćelija pokožice od lečenih povredenih arterija pacova, ali samo u 4,2 ± 0,5% ćelija pokožice nelečenih arterija pacova (p<0,05). (PCNA-pozitivna jedra retko se viđaju u nepovređenim arterijama nezavisno od lečenja.) Isto tako su Cdk:-pozitivne ćelije bile mnogo rede u pokožici pacova lečenih flavopiridolom (slika 9, trake A i C) poredeno sa arterijama nelečenih pacova (trake B i D), i 7 i 14 elana posle povrede.

Diskusija

U ovoj studiji smo ispitivali da li je novi Cdk inhibitor, flavopiridol, najjači i najspecifičniji poznati inhibitor Cdks, pogodan kandidata za suzbijanje preteranog razmnožava SMC in vivo, pogotovo u uslovima povrede krvnih sudova. Raniji pokušaji da se terapeutski usmeri mehanizam ćelijskog ciklusa za lečenje bolesti krvnih sudova dali su razlog za ove studije<9>"<12>. Međutim postupci prinic-njeni u tu svrhu zasnivali su se na tehnologijama transfera gena za suzbijanje razvoja ćelijskog ciklusa. Za sada velike prepreke sprečavaju kliničku primenu ovih tehnika ?\ U toku naših studija objavljeno je da CVT-31, jedno nedavno otkriveno jedinjenje koje takode ima svojstva suzbijanja Cdk ali pri mikromo-larnim koncentracijama, takođe može da suzbija obrazovanje pokožice. Među-tim, zahteva sc da se CVT-313 unese u karotidnu arteriju u trenutku povrede da bi proizveo to dejstvo 1J. Nasuprot tome, mi smo pokazali da flavopiridol kada sc daje oralno može moćno suzbiti obrazovanje pokožice do stepena upoređivog sa drugim klinički značajnim agensima "' b' ,f>. Oralno delovanje flavopiridola čini ga praktično jedinstvenim medu agensima za koje sc pokazalo da su aktivni kod životinjskih modela povreda krvnih sudova. Njegova selektivnost, moćnost i lako davanje čine da llavopiridil bude izvanredan kandidat za ispitivanje terapcutskih koristi od suzbijanja ćelijskog ciklusa kod ozleda krvnih sudova koti čoveka.

Izabrali smo da dajemo flavopiridol u koncentaciji (5 mg/kg) jednakoj polovini od one koja suzbija rast tumora kod transplatacije organa sa drugih vrsta na miša<27>. Treba napomenuti da koncentracija flavopiridila od 75 nmol/L dovodi do skoro potpunog suzbijanja prekomernog razmnožavanja SMC u našim studi-jama, pri čemu su srednje koncentracije u serumu od 425 nmol/L ostvarene u dozama ispod toksičke granice u Fazi I studija refraktornih karcinoma kod ljudi<l7>. Naši rezultati ukazuju da mnogo manje doze inhibitora ćelijskog ciklusa od onih koje se koriste kod tumora mogu biti delotvorne kod lečenja bolesti krvnih sudova kao što jc restenoza, uz istovremenu korist od povećane tolerantnosti.

Mada smo pokazali da flavopiridol izaziva prekid rasta a da ne utiče na sposobnost za život FIASMC u kulturi, kao i smanjeno obrazovanje pokožice posle obrade flavopiridilom in vivo, ne možemo biti sigurni da je zaustavljanje ćelijskog ciklusa jedini činilac smanjenja obrazovanja pokožice kod ozleda kario-tidc. Flavopiridol može da izazove prekid rasta sa ili bez izazivanja apoptoze, u zavisnosti od posmatrane vrste ćelija 29. Interesantno je da flavopiridol sprečava apoptozu u PCI2 ćelijama koje su bile terminalno diferencirane, dok izaziva apoptozu kod nediferenciranih ćelija PC12 koje se prekomerno razmnožavaju<2S>. Mada su naši in vitro eksperimenti vršeni u uslovima koji imitiraju fenotip SMC pre povrede, moguće je da SMC mogu različito reagovati na flavopiridil posle povrede i da čak dođe do apoptoze. Mada je uloga apoptoze kod ozleda krvnih sudova nejasna, izražavanje Fas Uganda u SMC izaziva apoptozu i blokira obrazovanje pokožice kod kunića posle povrede balonom , ukazujući time da ako flavopiridol stvarno izaziva apoptozu SMC in vivo, kao što čini kod PC 12 ćelija koje se preterano razmnožavaju, to bi mogao biti fenomen izlečenja u kontekstu obrazovanja pokožice. Drugi mehanizmi takođe mogu doprineti delovanju flavopiridola na obrazovanje lezija. Tako, na primer, suzbijanje ćelijskog ciklusa po-sredstvom protivsmernog oligodeoksinukleotida poboljšava endotelijalnu funk-iju kod transplantata u veni kunića<M>. Potrebno je dalje studije usmeriti na druge mehanizme delovanja flapiridola na DMC in vivo, a ne samo na prekid rasta.

Rasmatrajući prikazanu ulogu prevelikog razmnožavanja SMC kod obrazovanja ozlede posle povrede karotide pacova 2' 3, interesantno je napomenuti da je, uprkos temeljnog delovanja flavopiridola in vitro, njegova sposobnost da suzbije obrazovanje pokožice (mada značajna) bila skromnija u uslovima naših in vivo eksperimenata. Nije verovatno da se ubrzano prekomerno razmnožavanje SMC javlja posle prekidanja davanja flavopiridola, pošto se indeksi prekomernog razmnožavanja održavaju i do 14 dana posle povrede (slike 7 i 9). Verovatnije je da ili druge komponente obrazovanja ozlede, kao što je kretanje SMC i obrazovanje vanćelijskih matrica, još uvek doprinose obrazovanju ozlede, čak i bez značajnog prekomernog obrazovanja razmnožavanja SMC, ili tla jc davanje flavopiridola jednom dnevno nedovoljno da kod ovog modela potpuno zaustavi prekomerno razmnožavanje. Noviji podaci ukazuju da je biološki poluživot flavopiridola ne duži od 2,5 časa, što može značiti da je druga hipoteza ispravna. Dalje studije ćc možda moći da odrede jedan efikasniji režim doziranja<v>).

Naši rezultati ukazuju tla flavopiridol može suzbiti prekomerno razmno-žavanje SMC a time i obrazovanje pokožice kod uobičajenih modela oboljenja krvnih sudova u malim životinjama. Mora sc ukazati da jc važnost suzbijanja prekomernog razmnožavanja SMC kontroverzna kod humanih ozleda krvnih sudova i može se razlikovasti u zavisnosti od prirode ozlede i vremena kad jc uočeno prekomerno razmnožavanje. Indeks prekomernog razmnožavanja SMC u humanim ateroktomnim uzorcima karakteristično je mali mada ti uzorci možda ne odražavaju promenc u prekomcrnom razmnožavanju u ranijim, kritičnijim stepenima razvoja ozlede. Pored toga, preoblikovanje arterija nezavisno od rasta pokožice može biti uzrok značajnog dcla obtrukcija u šupljem krvnom sudu posle angioplastike kod ljudi<41.>Nasuprot tome, indeksi mitotičke aktivnosti u SMC su mnogo veći (25% PCA-pozitivni) kod ateroktomnih uzoraka humanih ozleda sa retenozom u implantiranoj cevčici, što je u skladu sa utvrđenom ulogom hiperplazije SMC, ali ne i sa preoblikovanjem, kod ovog procesa<4.>Kako sc ugradnja cevčica za proširenje krvnih sudova povećava a time i klinički problem restenoze u implantatu, tako će se povećavati i potreba za neko efikasno sredstvo za zaustavljanje hiperplazije SMC i obrazovanja pokožice. Kako je flavopiridol jedan moćan lek, koji se može davati oralno, sa specifičnim inhibitornim dclova-njem na Cdk, i kako su poznate bezbedne doze flavopiridola za ljude, flavopiridol se može rasmatrati kao farmakološki kandidat za sprečavanje restenoze u implantatu kod ljudi.

Postupci i rezultati: Koristeći odgajene humane ćelije glatkih mišića aorte, utvrdili smo da je flavopiridol u koncentraciji od svega 75 nmol/L doveo do skoro potpunog suzbijanja prekomernog razmnožavanja ćelija izazvanog osnovnim faktorom rasta fibroblasta i trombinom. Pri toj dozi flavopiridol je suzbio aktivnost kinaze zavisnu od ciklina, mereno fosforilizovanjen histona Hl. ali nije ispoljio nikakvo dejstvo na aktiviranje MAP kinaze. Aktiviranje proteina cikltnD, povezanog sa ćelijskim ciklusom, antigena jezgra ćelije koja se naglo razmno-žava, i proteina fosforilizovanog retinablastoma takođe je bilo blokirano flavopiridolom. Flavopiridol nije imao uticaja na sposobnost za život ćelije. Da bi sc proverilo da li je flavopiridol imao isto dejstvo in vivo kada je davan oralno, ispitivali smo obraazovanje pokožice u karotidnim arterijama pacova nakon povrede balonom. Flavopiridol (5 mg/kg) davan neposredno u želudac smanjio je površinu pokožice za 35% i za 39% za 7, odnosno za 14 dana posle povrede.

Zaključci: Flavopiridol suzbija rast SMC in vitro i in vivo. Mogućnost njegovog oralnog davanja i selektivnost za kinaze zavisne od ciklina, čine ga potencijalnim terapeutskim alatom za lečenje ozleda krvnih sudova praćenih velikom količi-nom SMC.

Claims (7)

1. Upotreba jedinjenja formuleI gde: Rije vodonik, alkil sa 1 do 6 ugljenikovih atoma, aril-Ci-Gralkil; Ci-Cć-alkil supstituisan sa halogen om, hidroksi ili karboksi; C3-Q-cikloalkil, piridil, tienil, Ci-C6-cikloalkil-Ci-C4-alkil, C2-C6-alkenil, C2-Cć-alkinil, fenil; fenil, monosupstituisan ili višestruko supstituisan sa halogenom, Ci-C-t-alkilom, Ci-C4-alkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2) CONH-alkilom, CON(alkil)2jnitro, trifluorometilom, amino, CrC4-alkiIarnino, di-C|-C4-alkilamino, ili fenilom; naftil, karboksil, -CHO, COO-Ci-Gralkil, neki primarni amino, alkilamino, aralkilamino, dialkilamino, amido, arilamino, diarilamino ili -CH2O-C1-C4-alkil; R2 je vodonik, alkil sa 1 do 6 ugljenikovih atoma, alil, nitro, amino, di-Cj-C4-alkilamino, jedan halogen, hidroksil, alkoksi, -COOH, -COO- Ci-C4-alkil, -CHO, - CH2OH ili -CH20- CrC4-alkil; R3 je vodonik, C|-C4-alkil; C|-C4-alkil supstituisan sa haligenom, hidroksi ili karboksi; hidroksil, karboksil, nitro, amino, Ci-C4-alkilamino, di- C1-C4- alkilamino, halogen, -0-alkil-C(0)-alkil, -CHO, -CH2OH, -CH20- d-C4-alkil ili R2N-C(0)-0-, gde R je H, C,-C6-alkil, cikloalkil; ili -0-alkiI-C(0)-alkil ili alil; R4 je vodonik, hidroksil, Ci-C4-alkoksi, C|-C4-alkanoiloksi, C1-C4-alkoksikarbonil, ariloksi, amino, Ci-C4-alki]amino, di- C]-C4-alkilamino, ili R'2-N-C(0)0- pri čemu R' je H, OC6-alkil, cikloalkil ili alil; R5je vodonik, Cj-CValkil, aril- C|-C4-alkil, CVCe-cikloalkil, C3-C6-cikloalkil-Ci-CValkil, alkil amino, Ci-C4-alkanoil, -C(0)-0- Ci-C4-alkil ili aroil, gde je arilna grupa u Ri,R2, R3, R4 i R5nesupstituisan fenil ili fenil koji je jednostruko ili višestruko supstituisan sa halogenom, Ci-C4-alkilom, Ct-CValkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2, CONH-alkilom, CON(alkil)2, nitro, trifluormetilom, amino, Ci-C4-alkilamino, di- Ci-C4alkilamino ili fenilom; m je ceo broj između 0 i 3, a nje 1, ili njegove farmakološki prihvatljive soli adicionih kiselina za dobijanje leka za inhibiciju proliferacije glatkih mišića, pri čemu je doza jedinjenja formule I manja od 70%, poželjno manja od 60%, a još bolje manja od 50% od doze koja je potrebna za kontrolu rasta tumora.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što je jedinjenje, jedinjenje formule Ia gde Rije vodonik, C]-C3-alkil, naftil, fenil; fenil monosupstituisan ili polisupstituisan sa halogenom, Ci-CU-alkilom, Ci-C4-alkoksi, hidroksilom, karboksilom, COO-alkilom, CONH2, CONH-alkilom, CON(alkil)2, nitro, trifluorometilom, amino, Ci-C4-alkilamino, di- Ci-C4-alkilamino, ili fenilom; piridil ili tienil; R2je vodonik ili C]-C3-alkil; R5 je Ci-C3-alkil, C3-Cs-cikloalkil ili C3-C5-cikloalkil- Ci-Ct-alkil.

3. Upotreba prema zahtevu 2, naznačena time, što supstituenti formule Ia imaju sledeća značenja: Rije fenil, tienil, piridil, hlorofenil, dihlorofenil, metilfenil, aminofenil, bromofenil, hidroksi fenil ili naftil; R2 je vodonik R5 je metil.

4. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što je jedinjenje, (-)-cis,-5,7-dihidroksi-2- )(2-hlorfenil)-8-[ 4-(3-hidroksi-1 -metil)-piperidinil]-4H-benzopiran-4-on (Flavopiridol).

5. Upotreba prema jednom od zahteva 1 -4, naznačena time, što je lek za lečenje lezija vaskularnih glatko- mišićnih ćelija.

6. Upotreba prema jednom od zahteva 1 -4, naznačena time, što se lek koristi za lečenje lezija posle povrede balon-kateterom.

7. Upotreba prema jednom od zahteva 1 -4, naznačena time, što se lek koristi za lečenje pacijenta posle implantacijestent- a.