KR101734937B1

KR101734937B1 - ERRγ 역작동제를 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법에 적용되는 효능 증진제

Info

Publication number: KR101734937B1
Application number: KR1020150148369A
Authority: KR
Inventors: 전용현; 이재태; 이인규; 토덤데브라싱즈; 정신영; 이상우; 하정희; 안병철; 김성헌; 조성진; 김진아
Original assignee: 경북대학교병원; 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2017-05-16
Also published as: KR20170047827A

Abstract

본 발명은 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법(radioiodine therapy)에서의 치료 효과를 증진시키기 위한 효능 증진제 및 이를 암세포에 투여함으로써 NIS(sodium iodide symporter) 기능이 향상된 암세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 효능 증진제는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 효능 증진제를 암세포에 투여하여 NIS 기능이 향상된 암세포를 효과적으로 제조함으로써 미분화 갑상선암 치료를 위한 관련 연구 및 임상에의 적용을 보다 용이하게 할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

ERRγ 역작동제를 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법에 적용되는 효능 증진제{EFFICACY ENHANCER APPLIED TO RADIOIODINE THERAPY FOR TREATMENT OF CANCER COMPRISING ERRγ INVERSE AGONIST AS AN EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법(radioiodine therapy)에서의 치료 효과를 증진시키기 위한 효능 증진제 및 이를 암세포에 투여함으로써 NIS(sodium iodide symporter) 기능이 향상된 암세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer; ATC)은 인간에게 발병하는 것으로 알려진 가장 공격적이고 치명적인 암들 중 하나이다 (1, 2). ATC는 갑상선샘으로부터 폐, 뼈, 국소 임파절, 및 뇌로 급속히 전이된다 (3). 이는 대부분의 갑상선암을 설명하는 고분화(well-differentiated) 양성 갑상선암의 성질과 대조되며, 따라서, 수술, 방사선 요법, 및 화학 요법을 단독으로 또는 조합한 ATC의 치료는 환자 생존에 효과를 나타내지 못해왔다 (4-7). 그 결과, 신규한 치료 방법의 개발이 절실히 요구된다.

나트륨 요오드 공수송체(sodium iodide symporter; NIS)는 요오드의 세포 내 활성 유입을 매개하는 세포막(plasma membrane) 당단백질이다 (8). 갑상선암에서, 내생의 NIS는 임상적 상황에서 방사성 요오드 요법의 광범위한 적용을 수용하며, 이는 수년에 걸쳐 최소의 부작용으로 악성 세포들을 제거하는 효과적인 치료법으로 알려져 왔다. ATC 세포를 포함하여, 저분화성 암세포는 NIS 수준의 감소를 이끄는 점진적인 탈분화를 나타내는 경향이 있다 (9, 10). 이는 ATC 세포가 높은 농도로 요오드를 세포 내에 축적하지 못하게 하고, 이에 따라 방사성 요오드 요법에 세포 내성을 초래하여, 결국 불량한 예후로 이끈다 (11). 따라서, 유전자 전달 (12, 13) 및 후성유전자(epigenome)-변경 약물 등을 이용한 후성유전학적 조절 (14)과 같은 몇 가지 방법을 이용하여 ATC 세포에서 NIS 기능을 회복시키기 위한 많은 시도가 수행되어 왔지만, 이제까지 만족스러운 결과는 얻어지지 않았다.

에스트로겐 관련 수용체(estrogen related receptors; ERRα, ERRβ 및 ERRγ)는 에스트로겐 수용체(estrogen receptors; ERs)와 높은 수준의 서열 동일성을 갖는 기본 구조적으로 활성인 핵 수용체이다 (15). ERR 아이소폼(isoform)은 심장, 뇌, 신장, 췌장 및 간과 같은 몇몇 장기에서 우선적으로 발현된다 (16, 17). 최근, 몇몇 연구는 ERRγ는 2형 진성 당뇨병, 알코올-유도된 산화적 스트레스, 간 손상 및 손상된 간의 당신생작용(gluconeogenesis)을 통한 미생물 감염, 간 인슐린 시그널링 및 철 대사 (21)와 같은 몇몇 대사성 질환에 관련됨을 보여준다 (18, 19).

결정 구조 연구는 ERR이 리간드 없이 기본 구조적으로 활성이며, 몇몇 소분자 리간드가 ERR의 기능적 활성을 활성화 또는 억제할 수 있음을 예증한다 (22). 이들 중, 아래 구조식으로 표시되는 4-하이드록시 타목시펜 유사체인 GSK5182(IUPAC Name: 4-[(Z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-5-hydroxy-2-phenylpent-1-enyl]phenol)는 또 다른 핵 수용체와 상호작용하지 않는 ERRγ의 선택적인 역작동제이다. 몇몇 계열의 증거는 GSK5182가 PGC-1α-의존적 방식으로 간의 당신생작용 억제를 통해 당뇨병 증상을 경감시킬 뿐 아니라 (19, 23), ERRγ-매개된 헵시딘(hepcidin) mRNA 발현의 감소에 의해 항균 효과 또한 나타냄을 (21) 밝혔다. ERRγ의 생물학적 효과는 각종 질병 모델에서 광범위하게 연구되어 왔으나, ATC에서 NIS 기능에 대한 ERRγ의 역할은 지금까지 명확히 연구되어 있지 않다.

<GSK5182의 구조식>

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 암 치료를 위한 방사성 요오드 요법의 효과를 증진시키기 위한 효능 증진제를 제공하고자 하는 것이다. 또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명의 상기 효능 증진제를 투여함으로써 NIS 기능을 향상시킨 암세포를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ERRγ 역작동제(estrogen-related receptor gamma inverse agonist)를 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법(radioiodine therapy)에 적용되는 효능 증진제를 제공한다.

상기 ERRγ 역작동제는 하기 구조식으로 나타낸 GSK5182, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물인 것이 바람직하다.

상기 ERRγ 역작동제는 내생의 ERRγ 단백질의 발현을 조절할 수 있다.

상기 ERRγ 역작동제는 MAP 키나아제(mitogen-activated protein kinase)를 조절할 수 있다.

상기 ERRγ 역작동제는 NIS(sodium iodide symporter)의 기능을 향상시킬 수 있다.

상기 ERRγ 역작동제는 막-국재화된 NIS(membrane-localized NIS)를 증가시킬 수 있다.

상기 ERRγ 역작동제는 방사성 요오드 섭취를 증진시킬 수 있다.

상기 암은 갑상선암(thyroid cancer)인 것이 바람직하다.

상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(analpastic thyroid cancer)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 암세포에 ERRγ 역작동제(estrogen-related receptor gamma inverse agonist)를 투여하여 NIS(sodium iodide symporter) 기능이 향상된 암세포의 제조 방법을 제공한다.

상기 암세포는 갑상선암세포(thyroid cancer cell)인 것이 바람직하다.

상기 갑상선암세포는 미분화 갑상선암세포(analpastic thyroid cancer cell)인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 효능 증진제는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 효능 증진제를 암세포에 투여하여 NIS 기능이 향상된 암세포를 효과적으로 제조함으로써 미분화 갑상선암 치료를 위한 관련 연구 및 임상에의 적용을 보다 용이하게 할 수 있는 우수한 효과가 있다.

도 1은 미분화 갑상선암 세포에서 방사성 요오드 섭취에 대한 GSK5182의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 미분화 갑상선암 세포에서 비히클 처리 및 비히클+KClO₄ 처리에 의한 요오드 섭취를 비교한 그래프이다.
도 3은 시간 경과에 따른 GSK5182-처리된 미분화 갑상선암 세포에서의 요오드 섭취 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 미분화 갑상선암 세포에서 내생 ERRγ 단백질에 대한 GSK5182의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 미분화 갑상선암 세포에서 GSK5182-유도된 MAP 키나아제 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 GSK5182에 의한 막-국재화된 NIS 단백질의 양의 증가 양상을 나타낸 것이다.
도 7은 scanning densitometry에 의한 막성 NIS 단백질 및 총 NIS 단백질 농도를 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 8은 미분화 갑상선암 세포에 GSK5182 처리 후 증가된 ¹³¹I의 증가된 세포독성을 보여주는 결과이다.
도 9는 clonogenic assay 후 미분화 갑상선암 세포주인 (A) CAL-62 및 (B) BHT-101의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 미분화 갑상선암 세포에서 GSK5182의 작용 메커니즘을 모식적으로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

각종 핵 수용체들 중, 그의 활성제 레티논산(RA)을 통한 레티논산 수용체 RAR은 시험관 내 및 생체 내에서 비-갑상선암 및 갑상선암에서 요요드 섭취(uptake)를 재자극하는데 효과적인 것으로 입증되어 왔다 (24, 25). 본 발명자들은 핵 수용체 계열의 ERRγ가, NIS 기능에 대한 RA 및 RAR의 생물학적 역할과 유사하게, 갑상선암에서 NIS 기능을 제어하는데 관련될 수도 있음을 추측하였다.

ATC 세포에서 NIS 기능에 대한 ERRγ의 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 ERRγ의 특이적 역작동제로서 아래 구조식으로 나타낸 GSK5182(4-[(Z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-5-hydroxy-2-phenylpent-1-enyl]phenol)를 채택하고, 내생의 ERRγ 단백질의 변화 및 이 약제에 의한 MAP 키나아제 시그널링을 조사하였다. 또한, ATC 세포에서 NIS 단백질의 기능적 활성 및 발현 수준에 대한 GSK5182의 효과를 평가하였다. 최종적으로, GSK5182 처리로부터 ¹³¹I의 증진된 세포독성 효과를 ATC 세포에서 평가하였다.

ERRγ의 역작동제인 GSK5182가 ATC 세포에서 내생의 ERRγ 단백질 수준을 감소시키고, MAP 키나아제 시그널링의 활성화를 이끈다는 것을 본 발명자들은 증명하였다. 중요하게는, GSK5182의 처리 결과 ATC 세포에서 투여량- 및 시간-의존적 방식으로 증진된 방사성 요오드 섭취가 초래된다. GSK5182-유도된 ERK-1/2 활성화 및 방사성 요오드 섭취의 증가는 모두 선택적 MEK 저해제인 PD98059에 의해 완전히 저해된다. 추가의 검사는 GSK5182가 총 NIS 단백질의 농도에 영향을 미치지 않으면서 NIS 세포막 단백질을 증가시킴을 나타내었다. 추가로, GSK5182에 의하여 조절된 NIS 작용의 증진은 방사성 요오드 요법에 대한 ATC 세포의 감수성을 증가시킨다.

최근에, 많은 연구들이 각종 대사성 및 심장 질환에서 GSK5182-유도된 ERRγ 조절로부터 흥미로운 치료 결과를 나타내었지만 (18, 20, 21, 26), 갑상선암, 특히 미분화 갑상선암에서 NIS 작용 조절에 대한 GSK5182-유도된 ERRγ의 관련성을 풀어낸 연구는 없었다.

ATC 세포에서 방사성 요오드 섭취에 대한 GSK5182의 효과를 결정하기 위한 시도에서, 본 발명자들은, 각각 K-RAS 및 BRAF 유전자의 특징적인 돌연변이를 갖는, 두 개의 상이한 미분화 갑상선암 세포 BHT-101 및 CAL-62를 선택하였다. 이들 세포주는 세포독성 효과를 직접적으로 유도할 뿐만 아니라 NIS 작용을 조절하는 몇몇 약물의 치료 효능을 평가하는데 사용되어 왔다 (14, 27). 흥미롭게도, ATC 세포를 GSK5182와 함께 인큐베이션하면 방사성 요오드 섭취의 투여량-의존적 및 시간-의존적 증가가 일어나지만, 비히클-처리된 세포에서는 무시할만한 양의 섭취를 보였다. 이들 발견으로부터, 본 발명자들은 증가된 요오드 섭취가 조절된 NIS 작용과 관련되었는지의 여부에 의문을 품었다. 따라서, NIS 단백질의 특이적 저해제인 과염소산염 (KClO₄)을 GSK5182-처리된 세포에 도입함으로써 요오드 섭취 시험을 추가로 수행하였다. KClO₄는 NIS 단백질의 기능적 활성을 입증하기 위하여 널리 사용되어 왔다 (8). KClO₄를 이용한 요오드 섭취 분석은 증진된 방사성 요오드 섭취가 기본 수준으로 저해됨을 명확히 보여주었으며, 이는 증가된 요오드 섭취가 GSK5182-유도된 NIS 작용 조절과 관련됨을 밝혀주었다. 그 후, 증진된 요오드 섭취가 GSK5182-유도된 내생의 ERRγ 단백질에서의 변화와 관련될 수 있음이 추측되었다.

본 발명자들은 두 ATC 세포주들이 모두 상당하며 유사한 ERRγ 단백질의 발현 수준을 나타내었으며, GSK5182의 처리가 ERRγ 단백질 농도를 현저히 감소시켰음을 관찰하였다. 이들 결과들은 GSK5182-유도된 내생의 ERRγ 단백질 감소가 NIS 작용에 영향을 미칠 수 있고, ATC 세포에서 증가된 방사성 요오드 섭취를 최종적으로 이끈다는 것을 제안한다.

MAP 키나아제는 세포 표면 수용체로부터 중요한 세포 내 분자로 신호를 전달하는 진화적으로 보존된 효소이다 (28). MAP 키나아제들 중에, p38 MAP 키나아제는 세로토닌 수송체의 정상적인 기본 발현의 유지 (29) 및 노르에피네프린 수송체 (30)의 활성화 개선에 관련되는 것으로 확인되어 왔다. Katherine 등은 PI3K 활성화가 유방암 (MCF-7) 세포에서 불충분하게 글리코실화된 세포 내 NIS 단백질 발현을 유도하고, 요오드 섭취능을 이끈다는 것을 보고하였다 (31). 또 다른 보고는, MEK 저해제를 이용한 MEK 저해 결과 인간 유방암 세포에서 라이소좀-매개된 NIS 분해를 통한 NIS 단백질 수준의 감소가 초래됨을 보여주었으며, 이는 MEK 활성화가 인간 유방암에서 NIS 단백질 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 함을 제안한다 (32).

더욱 최근에는, Lee 등은 phorbol 12-myristate 13-acetate를 이용한 단백질 키나아제 C 시그널링의 활성화가 NIS-발현 비-갑상선 암세포에서 요오드 섭취를 하향조절하고, EGF-매개된 MAP 키나아제 활성화가 방사성 요오드 섭취를 역으로 증진시킨다는 것을 보고하였다. 이들 연구에 근거하여, ATC 세포의 증진된 방사성 요오드 섭취가 이들 키나아제 경로의 상향조절과 관련될 수 있음이 추정되었다. 포스포어-ERK1/2-특이적 항체를 이용한 면역블롯팅 분석으로부터, 본 발명자들은 ERK 시그널링이 두 ATC 세포 유형 모두에 구조적으로 활성이며, GSK5182 처리가 포스포릴화된 MAP 키나아제 수준을 증가시킬 수 있음을 발견할 수 있었다. 역으로, MAP 키나아제의 선택적 저해제인 PD98059는 ERK1/2 MAP 키나아제의 증가된 포스포릴화 및 GSK5182에 의해 유도된 요오드 섭취를 저해한다. 따라서, ATC 세포의 증진된 방사성 요오드 섭취는 ERRγ 단백질의 GSK5182-유도된 감소 결과 초래되는 MAP 키나아제 시그널링의 활성화에 관련될 수 있음을 상정하는 것은 타당할 것이다.

NIS 단백질 및 세포막-국재화된 NIS 단백질의 총 양은 갑상선 세포 내에서 요오드 수송 능에 매우 중요하다. NIS 단백질의 충분한 발현이 갑상선 암세포에서 관찰된다 하더라도, NIS의 세포내 보유로 인하여, 효과적인 방사성 요오드 요법을 생성하기에 적절한 요오드 섭취는 일어날 수 없다. NIS 수송체는 갑상선 세포에서 완전히 작용되기 위해서는 세포막 단백질로 전위되어질 필요가 있다. 갑상선-자극 호르몬은 NIS의 막 보유를 생성하는데 필요하며, 이의 부족은 갑상선 세포에서 요오드 섭취의 급성 감소를 이끈다 (33). 또한, NIS의 충분한 내생의 발현을 갖는 유방암 세포는 부족한 요오드 섭취능을 나타내었으며, 이는 부분적으로는 NIS 단백질의 세포내 국재화 결과 초래되었다 (24, 34).

이들 보고에 근거하여, 본 발명자들은 ERRγ 단백질 수준의 하향조절 및 GSK5182에 의한 MAP 키나아제의 활성화가 전체 및 세포막 NIS 단백질 상태에 영향을 미칠 수 있음을 추측하였다. 본 발명자들은 비히클-처리된 세포에서 막 NIS 단백질의 증가 없이 내생적으로 발현된 총 NIS 단백질을 검출할 수 있었다. 비록 일부 보고들은 ATC 세포가 NIS 단백질을 발현하지 않음을 증명하였지만 (35), 본 발명자들은 본 연구에서 두 가지 ATC 세포들 모두에서 NIS 단백질 발현을 명백히 검출할 수 있다. 이러한 차이는 고감도 및 특이성을 갖는 항-NIS 특이적 항체의 개발 뿐 아니라 더욱 양호한 실험 조건의 개발로 인한 것일 수 있다. 놀랍게도, GSK5182-처리된 ATC 세포를 이용한 비오티닐화 실험은 세포막에서 미성숙한 NIS 단백질의 증가를 밝혔다. 그러나, 총 세포 용균물 단백질에서 NIS 단백질의 변화는 없다. 요오드 수송의 GSK5182-유도된 증가를 설명하는 정확한 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 많은 수송체의 국재화 및 작용 모두에 영향을 미치는 일반적인 전사 후 메커니즘은 글리코실화 및 포스포릴화 과정을 포함하기 때문에 (36), 유사한 과정이 NIS-조절 과정에 연루될 수 있음이 가능할 수 있다.

갑상선암에 대한 성공적인 방사성 요오드 요법은 주로 치료용 방사성 요오드의 효과적인 축적에 따라 달라진다. GSK5182에 의한 증진된 방사성 요오드 섭취가 ATC 세포에 대하여 잠재적인 세포독성 효과를 유도할 수 있음을 상정하는 것은 타당할 것이다. 특징적으로, 본 발명에서, GSK5182 처리는 ATC 세포에 대한 치료적 방사성 요오드의 사멸 효과를 증진시키기에 충분하였지만, ¹³¹I 단독으로는 ATC 세포에 대한 충분한 세포독성 효과를 유도할 수 없었다. 이들 발견은 ERRγ-조절된 NIS 작용이 임상적으로 사용되는 ¹³¹I 투여량을 이용하여 허용가능한 치료 결과를 가능하게 하는 방사성 요오드 섭취를 달성하기에 타당한 시도를 제공할 수 있음을 제안한다. SPECT 또는 PET와 같은 핵의학 영상 기기를 이용하여, 살아있는 마우스 ATC 종양모델에서 GSK5182-유도된 방사성 요오드 섭취능을 평가하기 위하여 추가적인 임상 전 연구가 요구된다.

따라서, 본 발명은 ERRγ 역작동제(estrogen-related receptor gamma inverse agonist)를 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법(radioiodine therapy)에 적용되는 효능 증진제를 제공한다.

상기 암은 갑상선암(thyroid cancer)인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 효능 증진제, 바람직하게는 GSK5182, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학적으로 허용된 염은 인체에 독성이 낮고 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않아야 한다. 약학적으로 허용된 염 제조에 사용될 수 있는 유리산은 무기산과 유기산으로 나눌 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등이 사용될 수 있다. 유기산은 초산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마린산, 말레산, 말론산, 프탈산, 숙신산, 젖산, 구연산, 시트르산, 글루콘산, 타타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파르트산, 글루탐산 등이 사용될 수 있다. 유기염기부가염 제조에 사용될 수 있는 유기염기는 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디시클로헥실아민 등이다. 아미노산부가염기 제조에 사용될 수 있는 아미노산은 알라닌, 글라이신 등의 천연아미노산이다.

본 발명에 따른 효능 증진제, 바람직하게는 GSK5182은 상기한 약학적으로 허용된 염과 더불어 모든 수화물 그리고 용매화물도 포함한다. 수화물 및 용매화물은 GSK5182 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 1,4-디옥산과 같은 물과 섞일 수 있는 용매에 녹인 다음에 유리산 또는 유리염기를 가한 후에 결정화되거나 또는 재결정화될 수 있다. 그러한 경우, 용매화물 (특히, 수화물)이 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 효능 증진제로서 동결건조와 같은 방법으로 제조 가능한 다양한 양의 물 함유 화합물 이외에 수화물을 비롯한 화학 양론적 용매화물도 포함한다.

본 발명의 효능 증진제는 GSK5182, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유할 수 있고, 여기에 통상의 무독성 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보강제 및 부형제 등을 첨가하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제 또는 비경구투여용 제제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 효능 증진제에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 포함될 수 있다. 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 효능 증진제의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 0.01 내지 1,000mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수 회로 분할 투여할 수도 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 효능 증진제는 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 효능 증진제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 효능 증진제는 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명의 효능 증진제의 투여 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 발명의 상기 설명된 효능 증진제는, 상술된 바와 같이, 대상에 직접 투여됨으로써 임상적 치료 효과를 얻을 수 있음은 물론, 구체적인 임상 적용 이전 단계, 예를 들어, 임상 전 연구 단계, 구체적으로는 대상으로부터 분리된 암조직 또는 암세포에 본 발명의 효능 증진제를 적용함으로써 그 효능을 평가 및 개선하기 위한 연구 목적으로도 사용될 수 있다. 이 경우, 대상으로부터 분리된 암조직 또는 암세포에 본 발명의 효능 증진제를 적용하는 방법은 인 비트로(In vitro) 환경 또는 동물 모델 등을 제한 없이 이용할 수 있음은 본 발명의 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다.

따라서, 본 발명은 암세포에 ERRγ 역작동제(estrogen-related receptor gamma inverse agonist)를 투여하여 NIS(sodium iodide symporter) 기능이 향상된 암세포의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들의 위에서 상세히 설명된 발견은 ERRγ-조절된 MAP 키나아제 경로가 NIS 작용의 조절에 중요한 역할을 할 수 있음을 제안한다 (도 10). 이들 발견은 또한, 방사성 요오드 요법을 가능하게 하기 위하여 NIS 작용을 증진시키기 위한 이들 시그널링 경로의 적절한 조절이 현실적으로 실현가능함을 제안하여, 미분화 갑상선암에 대한 새로운 치료 전략을 밝힌다. 미래에, ERRγ 역작동제는 보조약물로서 ATC 환자에 대한 신규 치료 프로토콜의 개발에 도입될 수 있다. 본 발명자들의 본 연구는, ATC 세포에서 방사성 요오드 섭취의 보다 효과적인 재유도를 매개하기 위하여, ERRγ 활성을 조절하기 위한 신규 약물 후보의 발견 또는 GSK5182 유도체의 발견을 위한 추가의 연구를 보장한다. 요오드 유기화의 결핍은 ATC 세포에서 효과적인 방서성 요오드 요법에 대한 제한 요소이기 때문에, ATC 세포에서 요오드 유기화에 대한 GSK5182의 효과를 밝히는 추가의 연구가 필요하다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

1.1. 세포

미분화 갑상선암 세포주, BHT-101 및 CAL-62를 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen로부터 구매하였다. 두 세포주를 모두 10% FBS, 1% 항생제-항진균제 (Hyclone)로 고도로 보충된 DMEM 배지 내에서, 5% CO₂ 분위기하에서 37℃로 유지하였다.

1.2. ¹²⁵ I 섭취 분석 (Uptake Assay)

세포들을 24-웰 플레이트에 24시간 동안 플레이팅한 후, 대한민국 대구 소재의 대구-경북 첨단의료산업진흥재단(Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation; DGMIF)에 의해 합성된 GSK5182로 처리하고, DMSO 중 100mM 저장(stock) 용액으로 제조하고 -80℃에서 24시간 동안 저장하였다.

약물-함유 배지를 흡인 후, 세포를 1mL HBSS로 세척하고, 0.5% 소 혈청 알부민 (bHBSS), 3.7kBq 무-담체(carrier-free) ¹²⁵I (Perkin-Elmer) 및 10μmol/L의 요오드화 나트륨 (비활성 740MBq/mmol)을 함유하는 행크스 균형 염용액 (Hank' balanced salt solution: HBSS) 500μ와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포들을 빙냉된 bHBSS로 2회 세척하고, 500μl의 2% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)로 용균시켰다. 감마 카운터 (Cobra II; Canberra Packard, Packard Bioscience)를 이용하여 방사능을 측정하였다. 세포들의 방사능을 BCA 키트 (Pierce Protein Biology)에 의해 결정된 총 단백질 농도를 이용하여 정규화하였다. 세포들을 300μM KClO₄ (NIS에 대한 특이적 저해제로서)와 함께 30분 동안 예비-인큐베이션하여 요오드 섭취를 저해하고, 이어서 상기 기재된 것과 같이 ¹²⁵I 섭취 시험을 하였다.

1.3. 클론형성(Clonogenic) 분석

세포들을 6-웰 플레이트에 도말하고, 24시간 동안 두었다. 25μM GSK5182를 이용하여 24시간 동안 처리 후, 약물-함유 배지를 폐기하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 배지를 그 후 6시간 동안 50μCi ¹³¹I (KIRAMS, Korea) 존재 또는 부재 하에서 DMEM으로 대체하였다. 세포들을 차가운 bHBSS로 세척하고, 6회의 배가 (six doublings)에 대응하는 시간 동안 정규 배양 배지에 두었다. 최종적으로, 세포들을 4% 파라포름알데히드 (PFA) 용액 내에서 고정시키고 0.05% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하였다. 50개가 넘는 세포를 갖는 제어 콜로니 및 ¹³¹I 처리된 콜로니를 계수하였다.

1.4. 웨스턴 블롯

세포들을 GSK5182 없이 또는 GSK5182와 함께 24 시간 동안 처리하고, 차가운 PBS로 2회 세척하였으며, 완전한 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 RIPA 버퍼 (Roche)로 용균시켰다. NIS에 대한 세포막 단백질의 경우, 샘플들을 제조자 지시사항에 따라 단백질 비오티닐화 키트 (EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin, Thermo Scientific)를 이용하여 제조하였다. 간략하게는, 비처리된-세포 또는 처리된 세포들 중 어느 하나를 빙냉된 PBS/CM (0.1mM 염화 칼슘 및 1mM 염화 마그네슘을 함유하는 PBS, pH 7.3)로 2회 세척하고, PBS/CM 중의 EZ 링크 NHS-설포-SS-비오틴 (1mg/mL)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 PBS/CM 중 차가운 100mM 글리신을 이용하여 2회 세척함으로써 퀀칭시키고, PBS/CM 중 100mM 글리신과 함께 4℃에서 20분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 후 세포들을 4℃에서 1시간 동안 일정하게 진탕하며 프로테아제 저해제 칵테일 및 포스파타제 저해제를 함유하는 RIPA 버퍼 (Roche)를 이용하여 용균시키기 전에 PBS/CM을 이용하여 빠르게 2회 세척하였다. 용균액을 4℃에서 30분 동안, 16,000g에서 원심분리하였다. 상등액 일부는 총 세포 단백질 면역블롯에 대해 사용하였다. 잔여 샘플을, 실온에서 1시간 동안 100μL 스트렙트아비딘 비즈 (Thermo Scientific)와 함께 인큐베이션함으로써 막 단백질을 수득하는데 이용하였다. 비즈를 RIPA 버퍼를 이용하여 3회 세척하고, 결합된 단백질을 실온에서 30분 동안 50μL의 라에멜리(Laemmli) 버퍼 (62.5M 트리스, pH 6.8; 20% 글리세롤; 2% SDS; 5% b-머캡토에탄올; 및 0.01% 브롬페놀 블루)를 이용하여 용리하였다. 균등량의 총 세포막 단백질 및 비오티닐화 세포막 단백질을 각 레인(lane) 위에 부하하고(load) 4-12% 기울기 Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에 의해 분해시켰다(resolve). 단백질을 0.2μm PVDF 막 (Invitrogen)으로 이동시켰다. 막을 일차 쥐 단일클론성 인간 NIS-특이적 항체 (희석 1:1000, Thermo Scientific, Catalog#: MS-1653-P1, 클론: FP5A)와 함께 인큐베이션하고, 이어서 HRP-공액된 2차 항체와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. ECL-Plus (Amersham Pharmacia)는, 제조자 방법에 따라 퍼옥시다아제 활성을 검출하는데 사용되었다. 유사하게, 다른 단백질의 경우에서도, 단백질의 균등량을 각 레인에 부하하고, 4-12% 기울기 Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에 의해 분해시켰다. 단백질을 0.2μm PVDF 막 (Invitrogen)으로 이동시켰다. 막을 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 그 후 실온에서 적절한 HRP-공액된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 제조자 프로토콜에 따라 ECL-Plus를 이용하여 퍼옥시다아제 활성을 검출하였다. 밴드 밀도를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 결정하였다.

1.5. 통계 분석

모든 데이터는 평균±로서 나타내었으며, 통계적 유의성은 GraphPad Prism 5의 스튜던트 검정(Studenttest)을 이용하여 결정하였다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

2. 결 과

2.1. ERRγ의 역작동제에 의한 ATC 세포에서의 증진된 방사성 요오드 섭취

GSK5182를 이용한 처리는 투여량-의존적 방식으로 두가지 ATC 세포주 모두에서 방사성 요오드 섭취의 현저한 증가를 결과로서 초래하였다(도 1의 A). 요오드 섭취의 최대 상대적 배율은 50μ GSK5182의 농도에서 수득된 비히클 군에 비교하여, BHT-101 및 CAL-62 세포 각각에서 2.3 및 2.9였다. 따라서, 50μ GSK5182를 추가의 요오드 섭취 시험에 주로 사용하였다.

증가된 방서성 요오드 섭취가 GSK5182에 의하여 NIS 작용의 조절에 관련되는지의 여부를 시험하기 위하여, NIS의 특이적 저해제인 KClO₄를 GSK5182-처리된 BHT-101 및 CAL-62 세포와 함께 공동인큐베이션하고, 방서성 요오드 섭취 수준의 변화를 결정하였다. 비히클-처리된 세포 및 조합된 비히클과 KC KClO₄-처리된 세포 간의 방서성 요오드 섭취 수준은 두 ATC 세포에서 다르지 않았으며, 이는 이들 ATC 세포가 무시할만한 정도의 NIS-매개 요오드 섭취 활성을 갖는다는 것을 나타낸다 (도 2). KClO₄는 GSK5182-처리된 세포의 두 유형 모두에서 증진된 방서성 요오드 섭취를 완전히 차단하며 (도 1의 B), 이는 요오드 섭취의 증대가 GSK5182에 의해 매개된 NIS의 개선된 작용적 활성과 직접 관련됨을 암시한다.

본 발명자들은 GSK5182-처리된 BHT-101 및 CAL-62 세포에서 방서성 요오드 섭취 수준을 상이한 시점에 따라 평가하였다. 빠르게는 처리 후 2시간 내에 두 개의 처리된 세포들 모두에서 방서성 요오드 섭취의 증가가 관찰되었으며, 이는 24시간째에 그 피크에 도달하였다 (도 3).

2.2. ATC 세포에서 GSK5182에 의한 내생의 ERRγ의 하향-조절

ATC 세포에서 ERRγ 단백질 수준에 대한 GSK5182의 영향을 결정하기 위하여, ERRγ-특이적 항체를 이용하여 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 두 개의 BHT-101 및 CAL-62 세포 모두 ERRγ 단백질의 내생의 발현을 나타내었다. GSK5182를 이용한 처리 결과 두 세포 모두에서 ERRγ 단백질의 현저한 감소가 초래되었으며, BHT-101 및 CAL-62 세포에서는 각각 3.6배 및 2.4배의 상대적 감소가 있었다 (도 4).

2.3. MAP 키나아제 시그널링의 활성화를 통한 ATC 세포에서 막- 국재화 된(membrane-localized) NIS 단백질의 증가

p44 및 p42 ERK와 같은 포스포릴화된 MAP 키나아제 수준의 현저한 증가가 GSK5182로 처리된 두 가지 ATC 세포 모두에서 발견되었다 (도 5의 A). BHT-101 세포에서 ERK1 및 ERK2의 포스포릴화된 형태의 상대적 증가는 각각 1.6-배 및 2.1-배였다. GSK5182 처리 결과 CAL-62 세포에서 포스포릴화된 p44 및 p42 ERK에서 각각 5.8배 및 2.2-배의 증가가 일어났으며, 이는 선택적 MEK 저해제 PD98059에 의하여 완전히 저해되었다 (도 5의 B).

NIS 단백질 상태에 대한 GSK5182의 효과를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 세포막 비오티닐화 키트를 이용하여 GSK5182-처리된 ATC 세포로부터 수집된 막질의(membranous) 총 NIS 단백질의 수준에서의 변화를 NIS-특이적 항체를 이용한 면역블롯팅을 이용하여 검사하였다. 도 6의 A에 예시된 바와 같이, GSK5182는 대조구 세포에 비교하여, 두 ATC 세포 모두에서 미성숙한 형태를 갖는 세포막-국재화된 NIS 단백질의 급격한 증가를 유도하였다. 밴드 강도의 정량 분석은 BHT-101 및 CAL-62 세포 각각에서 막 NIS 단백질의 3.8배 및 6.0배 증가를 각각 나타내었다 (도 7). 그러나, 미처리된 및 GSK5182-처리된 ATC의 총 세포 용균물에서 NIS 단백질 수준에서의 유의한 변화는 없었다. PD98059 처리를 이용한 방서성 요오드 섭취는, GSK5182-유도된 요오드 섭취가 두 ATC 세포주 모두에서 기본 수준으로 복귀되었음을 증명한 한편, PD98059를 단독으로 이용한 세포들의 인큐베이션은 요오드 섭취에 영향을 미치지 않았다 (도 6의 B).

2.4. ATC에서 GSK5182에 의한 131I 매개된 세포독성의 개량

도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 클론형성 분석은 GSK5182 또는 ¹³¹I 단독 중 어느 하나를 이용하여 처리된 ATC 세포에서 최소의 세포독성 효과를 증명하였다. ¹³¹I 또는 GSK5182 군의 상대적 콜로니-형성능은 CAL-52 세포에서 각각 92.9 % 및 94.5 % 였다. CAL-62 세포와 유사하게, ¹³¹I 또는 GSK5182 군의 상대적 콜로니-형성능은 BHT-101에서 각각 95.2 % 및 93.2 %였다. 그러나, ¹³¹I와 GSK5182의 조합 결과 CAL-62 및 BHT-101 각각에서 대략 58.5 % 및 72.8 %로 콜로니-형성능의 현저한 감소가 일어났다.

Claims

하기 구조식으로 나타낸 GSK5182, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법(radioiodine therapy)에 적용되는 효능 증진제:
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제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 내생의 ERRγ 단백질의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 MAP 키나아제(mitogen-activated protein kinase)를 조절하는 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 NIS(sodium iodide symporter)의 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 5항에 있어서, 상기 유효성분은 막-국재화된 NIS(membrane-localized NIS)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 방사성 요오드 섭취를 증진시키는 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 1항에 있어서, 상기 암은 갑상선암(thyroid cancer)인 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
제 8항에 있어서, 상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(analpastic thyroid cancer)인 것을 특징으로 하는 효능 증진제.
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