KR102249561B1

KR102249561B1 - N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 종양의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102249561B1
Application number: KR1020190117193A
Authority: KR
Inventors: 홍진태; 이희범
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2021-05-10
Also published as: KR20210035426A

Abstract

본 발명은 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 종양의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드는 골육종 세포의 증식을 억제하므로 종양의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 종양의 예방 및 치료용 조성물{N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide for preventing and treating tumor diseases}

본 발명은 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드(N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide)를 유효성분으로 함유하는 종양의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

골육종(osteosarcoma, OS)은 아주 드물게 뼈 이외의 조직에 발생하기도 하지만 대부분 뼈에 발생하는 가장 흔한 유형의 원발성 악성 골 종양으로 전체 악성 종양의 0.2%를 차지하는 매우 드믄 암이다. 주로 젊은 연령층에 발행함에도 유전적 요인 외에는 그 원인과 효과적인 치료방법은 널리 알려져 있지 못한 상황이다. 골육종은 절제술을 주로 시행하며 수술을 못하는 경우 항암화학요법만을 사용하는데 일반적으로 방사선 치료는 잘 듣지 않아 방사선 치료가 시행하지 않는 암으로 알려져있다.

아포토시스(Apoptosis)는 모든 생물체에 필수적인 생물학적 과정이며 종양 발달의 주요 특징이다. Caspase-3 활성화는 세포 생존과 사멸을 유지하기 위해 세포 단백질의 분해를 유도하며, proapoptotic lymphoma protein-2(Bcl2) 단백질 군과 anti-apoptotic Bcl2 단백질 군에 의해 조절된다.

STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)는 다양한 종양에서 지속적으로 활성화되며 종양 성장에도 관여한다. Mitogen Activated Protein Kinases(MAPK : ERK, p38 및 JNK(c-Jun N-terminal kinase)) 신호 전달 계통도 STAT3의 완전 활성화에 중요하다고 알려져 있다.

또한, 최근 연구에서는 Src(proto-oncogenic nonreceptor tyrosine kinase)가 STAT3를 활성화시켜 종양 성장을 자극하여 종양 형성에 중요한 역할을 하는것을 입증했다.

따라서, 골육종(osteosarcoma, OS) 진행에서 세포 내 경로의 상세한 역할에서 신규한 분자의 확인과 포괄적인 이해는 악성 종양 환자의 치료를 위한 유망한 치료 전략이 될 수 있다.

(001) 대한민국 등록 특허 KR 10-1426125

이에 본 발명자들은 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 화합물을 연구한 결과, 본 발명의 화합물이 STAT3의 DNA 결합 활성을 저해하고, 세포사멸(apoptosis)을 유도하며, 세포주기 조절 단백질의 발현을 감소시키고, 인 비트로(in vitro) 및 이종 이식 동물모델(in vivo)에서 종양의 성장을 효과적으로 억제한다는 것을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 종양은 골육종, 연골육종 또는 골수종이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성을 억제한다.

상기 STAT3는 STAT 패밀리의 일원 단백질로서, 사이토카인(cytokine) 또는 성장인자(growth factor)에 반응하여 유전자의 전사(transcription)를 활성화시키는 전사 활성자(transcription activator)로 작용한다. 상기 STAT3 단백질은 대부분의 종양 세포에서 활성화되어 있고, 종양 세포의 증식이나 침윤에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 화합물은 암세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도한다. 본 발명의 화합물은 세포사멸 유도성(proapoptotic) 단백질의 발현을 증가시키며, 항-세포사멸성(anti-apoptotic) 단백질의 발현을 감소시킨다.

본 발명의 조성물은 (i) 상기 설명된 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공된다.

상기 용어“약제학적 유효량”은 본 발명의 화합물이 약학적 활성성분으로서 생체내로 투여되었을 때 실질적인 종양 억제 효과를 발휘하기에 충분하고 적합한 양을 의미한다.

상기 용어“약제학적으로 허용되는”은 사람에게 투여되었을 때 알레르기반응이나 이와 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정되며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-yl)설페닐]아세트아마이드는 골육종 세포의 증식을 억제하므로 종양의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 골육종 세포에서 세포 성장에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A) G721-0282의 화학 구조,
(B) MG63 및 U2OS 세포에 G721-0282를 0, 10, 30, 50 μM의 농도로 24, 48 및 72시간 동안 처리하여 배양한 세포 생존력을 확인한 그래프,
(C) MG63 및 U2OS 세포에 0, 10, 30, 50 μM의 농도로 24시간 동안 처리한 후, MG63 및 U2OS의 형태학적 변화를 나타낸 사진.
도 2는 골육종 세포에서 아포토시스에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A) MG63 및 U2OS 세포에 G721-0282를 24시간 동안 처리하고, FITC-접합된 TUNEL과 함께 배양하고 공 초점 현미경으로 분석한 사진,
(B) 동일한 양의 세포 용해물을 cdk4, cdk6 및 Cyclin D1에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블롯팅으로 분석한 사진(β-액틴은 로딩 대조군).
도 3은 MG63 및 U2OS 세포에서 아포토시스 조절 단백질의 발현에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A, B) 24시간 동안 지시된 농도의 G721-0282로 세포를 처리한 후, PARP 및 caspase-3(A), 또는 서바이빈 및 Bcl-2(B)에 대한 항체를 사용하여 용해물을 분석한 사진,
(C) MG63 및 U2OS 세포에 G721-0282를 1시간 동안 처리한 후, 동일한 양의 용해물을 phospho-ERK(p-ERK), ERK, phospho-JNK(p-JNK), JNK, phospho-p38(p-p38)및 p38에 대한 항체로 검출한 사진.
도 4는 Src/STAT3 경로에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A) MG63 및 U2OS 세포에 10, 30 및 50 mM 농도로 6시간 동안 G721-0282로 처리한 다음 phospho-Src(p-Src), Src, phospho-STAT3(p-STAT3) 및 STAT3 항체로 검출한 사진,
(B) MG63 세포에 50 mM 농도로 6시간 동안 G721-0282로 처리한 다음 p-STAT3 (녹색)을 rabbit anti-p-STAT3 항체, Alex-488-접합된 이차 항체로 면역 염색하며, 세포를 DAPI(핵 마커, 파란색)로 염색한 사진(하단 패널에는 첫 번째 패널과 두 번째 패널의 병합된 이미지).
도 5는 G721-0282 매개 Src/STAT3 경로에 대한 Chi3L1의 효과를 나타낸 결과이다:
(A-B) 세포를 Chi3L1 플라스미드(A) 또는 Chi3L1 siRNA(B)로 24시간 동안 형질 전환한 다음 p-Src, Src, p-STAT3, STAT3, Chi3L1 및 β-actin 항체로 검출한 사진,
(C-D) 세포를 Chi3L1 플라스미드(C) 또는 Chi3L1 siRNA(D)로 24시간 동안 형질 감염시킨 후, 세포를 고정시키고 투과시키고 Chi3L1(적색) 및 p-STAT3(녹색)을 항-Chi3L1 및 항-STAT3 항체로 면역 염색한 후, Alex-488- 및 568-접합된 이차 항체를 사용하여 섹션을 DAPI(파란색)로 염색한 사진,
(E) Chi3L1을 사용한 G721-0282의 도킹 모델에서의 분자 표면을 나타낸 사진.
도 6은 세포 이동, 침입 및 종양 성장에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A-B) G721-0282가 MG-63 세포에서 세포 이동을 억제함을 나타낸 사진(A) 및 그래프(B),
(C) 세포를 G721-0282(0, 10, 30, 50μM)로 24시간 동안 처리한 후, MMP2 및 MMP9에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블롯팅으로 동일한 양의 용해물을 분석한 사진,
(D-E) 보이든 챔버 분석 결과는 대조군보다 G721-0282 군에서 더 침습된 세포를 확인한 사진(D) 및 그래프(E)
(F-G) 세포에 14일 동안 G721-0282(0, 10, 30, 50μM)와 함께 배양한 다음 광학 현미경으로 콜로니를 확인한 사진(F) 및 그래프(G).
도 7은 이종 이식 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 G721-0282의 효과를 나타낸 결과이다:
(A-D) MG63 보유 마우스 오른쪽 하단 측면에 형성된 종양(A), 종양 부피(B), 종양 크기(C) 및 종양 중량(D)의 나타낸 사진,
(E) 대조군 및 G721-0282-처리된 MG63 보유 마우스의 종양 단면을 나타낸 사진
(F) 인간의 정상 골 및 인간 종양 골에서 p-STAT3의 발현 양상을 나타낸 사진.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 N-아릴-2-[(6-부틸-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리도[2,3-d]피리미딘-5-일)설페닐]아세트아마이드(N-Allyl-2-[(6-butyl-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-5-yl)sulfanyl]acetamide)는 "G721-0282"로 약칭하여 기재한다.

본 발명에서는 G721-0282를 이용하여 in vitro 및 in vivo에서 골육종 세포 및 그 분자 메커니즘에 대한 효과를 조사한 결과, G721-0282가 골육종 세포의 증식을 억제하고 TUNEL 세포의 세포 사멸을 유도하였다. 아포토시스(apoptosis)에는 세포사멸 단백질(apoptotic protein)인 PARP와 procaspase-3의 상향 조절이 동반 되었으나 반대로 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein, 세포사멸을 억제하는 단백질)인 Survivin, Bcl-2의 하향 조절시켰다. G721-0282는 골육종 세포에서 Src와 STAT3의 인산화를 감소시키면서 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 불활성화를 유도하였다. Chi3L1의 과발현은 G721-0282의 효과를 강화시키는 반면, Chi3L1의 녹다운은 G721-0282의 영향을 감소시켰다. 또한, G721-0282는 연질 한천에서도 세포의 이동, 침입 및 콜로니 형성을 억제시켰다.

따라서, G721-0282는 이종 이식 생체 내 모델에서 Chi3L1, PCNA, Cyclin D1, p-STAT3의 발현량을 감소시키고, 골육종 세포에서 Src/STAT3 경로의 억제하며, 골 종양 조직에서 종양 발생을 억제함을 확인하였다.

<실시예 1> 실험 재료 및 실험 방법

<1-1> 동물모델

마우스를 12h light-12h dark의 실험실 동물 관리의 평가 및 SPF(spespecific pathogen-free) 동물 시설 평가 및 인정 표준 케이지에 보관하였다.

본 발명에서는 마우스를 포함한 모든 프로토콜은 충북 대학교 동물 실험 및 사용위원회(IACUC)에 의해 검토되고 승인되었으며 한국 국립 연구소의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(CBNUA-792-15-01)를 준수하였다.

<1-2> G721-0282

G721-0282(순도 98%)는 ChemiDiv Inc.(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 원래 용액을 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 함유된 200 ug/ml 저장 용액으로 가공하였다.

<1-3> 세포 배양과 트렌스펙션(transfection)

MG63 및 U2OS 세포(인간 골육종 세포주)를 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구입하여 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100 units ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)을 37℃에서 5% CO₂ 및 95%로 습도를 조절하였다. 세포의 직접 시딩(5×10⁵ 세포/6 웰 플레이트)하여 실험을 수행하였다. 밤새 배양 후, 배양 배지를 신선한 DMEM으로 대체하고 세포를 다양한 농도의 G721-0282로 처리하였다. 트렌스펙션을 위해, 세포를 Lipofectamine 3000 및 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 트렌스펙션시켰다.

<1-4> 세포 증식 분석

세포 증식을 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay로 측정하여 NADH-의존성 탈수소 효소 활성을 검출 하였다 (Park et al., 2017).

<1-5> TUNEL 분석법

DNA fragmentation은 말단 deoxynucleotidyl transferase-mediated FITC-dUDP nick-end labeling(TUNEL)에 의해 검사되었다. TUNEL 분석은 제조사의 지시에 따라 in situ Cell Death Detection Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다.

<1-6> 면역세포화학

세포를 유리 커버 슬립상에서 성장시키고 G721-0282로 배양하였다. 세포를 실온에서 15분 동안 10% 포르말린에 고정시켰다. 1X PBS로 3회 세척한 후, 세포를 1X PBS 중 0.2% Triton X-100으로 20 분간 투과시키고, 1X PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 1X PBS로 5% BSA로 차단시켰다. 그런 다음, 세포를 실온에서 하룻밤 동안 anti-p-STAT3(1:200, Cell signaling) 항체와 함께 배양하고, 3회 세척하고, Alexa-488 접합된 2차 항체(1:500, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 세포를 DAPI(Sigma-Aldrich)로 염색하고 세 번 씻은 후 유리 슬라이드에 올려 놓고 공초점 현미경(K1-Fluo Confocal Laser Scanning Microscope, 한국)에서 관찰했다.

<1-7> 분자 도킹 분석(Molecular docking model)

G721-0282와 Chi3L1 사이의 분자 도킹 분석은 Autodock VINA를 사용하여 수행하였다. CHI3L1-DNA 복합체의 3 차원 구조를 Protein Data Bank[PDB : 1VKX]에서 검색하고 CHI3L1의 3 차원 구조를 Chem3D와 ChemDraw를 사용하여 만들었으며, 이 구조체는 AutodockTools를 사용하여 추가로 준비하였다. 그리드 박스(grid box)는 CHI3L1 모노머를 중심으로하고, 그리드 박스의 크기는 전체 모노머를 포함하도록 조정하였다. 분자 도킹 분석은 다양한 기본 포괄성(exhaustiveness) 값인 16, 24, 32, 40 및 60에서 수행하였다. 최고의 바인딩 모델을 위한 분자 그래픽은 Discovery Studio Visualizer를 사용하였다.

<1-8> 면역 조직 화학

모든 시료는 포르말린에 고정시키고 검사를 위해 파라핀에 집어 넣었다. 시료(5 μm 두께)를 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색하고 면역 조직 화학으로 분석하였다. 자일렌 용액에 침지하여 시료을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 열-매개 항원 회복되게 처리하며, 증류수로 세척하고 면역 조직 화학 절차를 진행하였다. 내인성퍼옥시다제 활성은 메탄올 중 1% 과산화수소 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음 1X PBS(Sigma, St. Louis, MO)로 5분 동안 세척하였다.시료를 1X PBS에 희석된 5% BSA로 30분 동안 희석하고, 4℃에서 특정 항체와 함께 밤새 인큐베이션 한 다음, 1X PBS로 3회 세척하였다. 면역 검출은 실온에서 1시간 동안 horseradish peroxidase(HRP)-접합 이차 항체(1 : 500, Jackson ImmunoResearch)에서 배양하여 시작하였다. 1X PBS로 세척한 후, 0.02% 3, 3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 염색체 현상을 수행하고 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비 염색제로 착색시켰다. 마지막으로, 시료를 에탄올로 탈수시키고, 자일렌으로 세척한 다음, Permount(Fisher Scientific, Rockford, IL)로 장착하고 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 평가하였다.

<1-9> Soft agar assay

0.6% 한천 2ml를 바닥에 6-웰플레이트 상에 겹쳐 놓은 다음, 0.3% 한천 3ml를 최상층으로 층을 이루게 하였다. 그런 다음 MG63 세포의 최상층에 다양한 농도의 G721-0282를 처리하였다. 세포를 5% CO₂ 대기하에서 37℃로 14일간 유지하고, 광학 현미경으로 콜로니를 관찰하고 정량화하였다.

<1-10> Boyden chamber assay

침습 분석은 기존의 알려진 방법을 변형하여 사용하였다. 전체 배지에서 1 일동안 성장시킨 다음 기하 급수적으로 성장하는 세포를 수집하고, 사용된 배지를 화학 주성(chemotaxis)에 대한 조건화 배지로서 설정하였다. Nuclepore 필터를 얼음 상에 1 ml 마트리겔(matrigel)로 코팅한 다음, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. Boyden 챔버는 각각의 하부 챔버에 24 μl의 조절된 배지, 위쪽으로 향하는 matrigel-coated Nuclepore 필터, 및 각 상부 챔버에 2×10⁴ 개의 세포를 포함하는 50 μl의 혈청 감소(5% 이하) 배지로 조립하였다. 6시간 동안 조직 배양 배양기에서 Boyden 챔버를 배양한 후, 필터를 뒤집고 메탄올에 고정시킨 후 H & E로 염색 하였다. 필터를 지나 이동한 세포는 침습성 세포로 계산하였다.

<1-11> 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석은 전술 한 바와 같이 수행되었다 (Park et al. 2018).

<1-12> 이종이식 동물 모델

6 주령 수컷 BALB/c 무흉선 누드 마우스는 Samtako(경기도 오산)에서 구입 하였다. 인간의 골육종 MG63 세포(1×10⁷ 세포)를 이전에 기술된 바와 같이 캐리어 마우스의 우측-하부 플랭크에 피하 주사하였다(Jo et al, 2010; Yun et al., 2014). 10일 후, 두 그룹의 마우스(n=5)에 G721-0282(18.9 mg/kg)를 주 2회 35일 동안 복강 주사하였다. 대조군 마우스(n=5)를 35일 동안 주2회 비히클로 처리 하였다. 실험 종료시, 안락사를 위해 경추 탈구를 시행하였다.

<1-13> 인간의 정상 골 및 종양 샘플

인간의 정상 골 및 종양 조직 용해물은 GeneTex, Inc \(Irvine, CA)로부터 입수하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

<1-14> 통계분석

GraphPad Prism version 5 program(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터는 평균±S.E.M.로 표시됩니다. Newman-Keuls test를 이용하여 데이터에 대해 유의성있는 유의성을 나타내었다. P <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

<실시예 2> 실험 결과

<2-1> G721-0282의 세포 성장 억제 분석 결과

골육종 세포에서 G721-0282의 세포 성장 억제 효과를 분석하였다.

구체적으로, MG63 및 U2OS 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩한 후, G721-0282를 0, 10, 30, 50 μM의 농도로 24, 48 및 72시간 동안 각각 처리한 다음 MTT 분석방법으로 세포 생존력은 분석하였다.

그 결과, G721-0282는 종양 세포에서 농도 및시간에 따라 세포 증식을 유의하게 억제시킴을 확인하였다(도 1B).

또한, 형태학적으로 MG63 세포 및 U2OS 세포의 크기가 G721-0282의 처리에 의해 점차 감소하였고, MG63 세포는 U2OS 세포와 비교하여 농도 의존적 방식으로 G721-0282의 처리에 의해 작은 원형 단일 세포 형태로 변화되었다(도 1C).

<2-2> G721-0282는 세포사멸 및 세포주기 정지 유도 분석 결과

G721-0282의 종양 증식 억제 효과를 추가로 입증하기 위해, TUNEL 분석을 사용하여 DNA 가닥 파괴를 분석함으로써 아포토시스 정도를 측정하였다.

그 결과, 공 초점 현미경으로 관찰된 바와 같이 G721-0282의 처리에 의해 사멸세포가 상당히 증가되었다(도 2A).

세포 증식 및 세포 주기의 G1에서 S기로의 전이에 필요한 사이클린 D1은 cdk4 및 cdk6에 의해 조절되며, MG63 및 U2OS 세포에서 G721-0282의 처리에 의해 용량-의존적 방식으로 사이클린 D1, cdk4 및 cdk6의 발현이 억제되었다(도 2B).

<2-3> G721-0282의 아포토시스 조절 단백질 및 MAPK 단백질 조절 분석 결과

G721-0282-유도된 아포토시스와 관련된 메카니즘을 조사하기 위해, 다양한 아포토시스 및 항아포토시스 단백질에 의한 발현 수준의 변화를 MG63 및 U2OS 세포에서 분석하였다.

그 결과, G721-0282는 PARP 및 procaspase-3 밴드의 소멸 및 절단 생성물에 의해 보여지는 바와 같이 PARP 및 procaspase-3의 절단을 유도하였다(도 3A).

G721-0282는 농도 의존적 방식으로 서바이빈(Survivin) 및 Bcl-2와 같은 항아포토시스 단백질의 발현을 억제하였다(도 3B).

웨스턴 블롯 분석 결과에서 G721-0282의 처리가 용량 의존적 방식으로 ERK1/2, JNK 및 p38 MAPK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein)의 활성화를 유의하게 감소시켰다(도 3C).

<2-4> G721-0282의 Src/STAT3 억제 분석 결과

골육종 세포는 Src 및 STAT3을 발현하는 것으로 알려져 있으므로, G721-0282가 MG63 및 U2OS 세포에서 Src 및 STAT3 활성을 억제하는지 분석하였다.

구체적으로, MG63 및 U2OS 세포에 0, 10, 30 및 50 mM 농도로 6시간 동안 G721-0282를 처리한 다음 phospho-Src(p-Src), Src, phospho-STAT3(p-STAT3) 및 STAT3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하였다. MG63 세포에 50 mM 농도로 6시간 동안 G721-0282를 처리한 다음 p-STAT3(녹색)을 rabbit anti-p-STAT3 항체, Alex-488-접합된 이차 항체로 면역 염색하고, 세포를 DAPI(핵 마커, 파란색)로 염색하여 촬영하였다.

그 결과, G721-0282는 용량-의존적으로 Src 및 STAT3의 활성을 억제하였다 (도 4A).

또한, G721-0282 처리는 DAPI-염색된 핵에서 STAT3의 인산화 및 전위가 MG63 세포에서 감소된 것으로 나타났다(도 4B).

G721-0282가 STAT3의 핵 전위를 억제할 수 있는지를 분석하였다. Src 및 STAT3이 Chi3L1의 형질 감염 또는 녹다운에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하기 위해, 세포를 Chi3L1 또는 siRNA로 형질 감염시켰다.

그 결과, G721-0282의 핵 전위 억제 효과는 Chi3L1의 과발현에 의해 증가하지만 Chi3L1의 녹다운에 의해 감소되었고(도 5A 및 5B), STAT3의 인산화 및 전위는 공 초점 현미경에 의해 일치되었다(도 5C 및 5D).

Chi3L1에 대한 G721-0282의 가능한 결합 부위를 확인하기 위해, G721-0282 및 CHI3L1을 이용한 계산 도킹(computational docking) 실험을 수행하였다(도 5C).

그 결과, G721-0282가 도킹 모델에서 W31, R35, F58, W59, W99, N100, R263, E290, T293, W352 및 L356에서 Chi3L1과 상호 작용한다는 것을 확인하였다(도 5E).

<2-5> G721-0282의 세포 이동, 침입 및 콜로니 형성 억제 분석 결과

골육종 세포에 대한 G721-0282의 항-이동(anti-migratory) 효과는 상처 치료 이동 분석으로 평가하였다.

그 결과, MG63 세포에서 G721-0282의 처리에 따라 대조군과 비교하여 세포 이동이 억제되었다(도 6A 및 6B).

또한, MMP가 ECM(extracellular matrix) 분해, 전이 및 침습에 관여하기 때문에, 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MMP의 발현을 조사하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 G721-0282는 처리 농도에 따라 MMP-2 및 MMP-9 단백질 발현을 감소시켰다(도 6C).

또한, MG63 세포의 침입에 대한 G721-0282의 억제 효과는 Boyden 챔버에서 Matrigel-코팅된 폴리 카보네이트 필터를 통한 세포 침투로 입증하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 G721-0282를 처리하면 세포의 침습을 억제시켰다(도 6D 및 6E).

아울러, 콜로니 형성에 의해 비부착증식(anchorage-independent growth)에 G721-0282의 효과를 입증하였다.

그 결과, G721-0282는 대조군과 비교하여 비부착 콜로니 형성을 유의적으로 감소시켰다(도 6F 및 6G).

<2-6> G721-0282의 이종 이식 마우스에서 종양 형성 억제 분석 결과

골육종 세포에서 G721-0282의 직접적인 역할을 확인하기 위해, 생체 내 이종 이식 마우스에서 G721-0282의 항종양 활성을 조사하였다.

구체적으로, 종양이 발달하는 35일 동안 모니터링하였으며, MG63 세포는 BALB/c 무흉선마우스의 우측 하부 측면에 주입하였으며, 실험이 끝날 때 마우스를 사멸시켜 종양을 절개하여 그 형성 정도를 확인하였다.

그 결과, 대조군 및 G721-0282-처리된 마우스 간에 종양 성장에 유의한 차이를 확인하였다. G721-0282로 처리되거나 처리되지 않은 이종 이식 마우스에서 종양을 확인하였다(도 7A). G721-0282로 처리되거나 처리되지 않은 이종 이식 마우스 종양의 부피(도 7B), 종양 크기 및 중량(도 7C 및 7D)를 측정한 결과 대조군과 비교하여 유의하게 감소됨을 확인하였다. 면역 조직 화학(IHC) 분석을 통하여 Chi3L1 및 증식세포 핵 항원(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA), 사이클린 D1 및 p-STAT3의 발현이 현저하게 감소하였다(도 7E).

또한, Chi3L1 발현이 인간 골 종양 조직에서 p-STAT3 발현과 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 7F).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 골종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서, 상기 골종양은 골육종, 연골육종 또는 골수종인 것인 골종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성을 억제하는 것인 골종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 골육종 세포에서 세포사멸 유도성(pro-apoptotic) 단백질의 발현을 증가시키는 것인 골종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 골육종 세포에서 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)의 발현을 감소시키는 것인 골종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.