JP2023081768A - 脂肪肝治療剤、医薬組成物、治療方法、及びスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】脂肪肝治療剤、脂肪肝治療剤を適用した医薬組成物、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を有効成分とする、脂肪肝治療剤。【選択図】なし

Description

本発明は、脂肪肝治療剤、医薬組成物、治療方法、及びスクリーニング方法に関する。

近年、先進諸国において、肥満者が増加し、肥満により引き起こされる疾患の治療が大きな問題となっている。肥満は、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、脂質異常症、高血圧症、脂肪肝、脂肪肝炎、動脈硬化症等の疾患や病態の原因となる。

肥満者においては、継続した過栄養状態により脂肪組織は拡大し、体重が増加する。脂肪組織の脂肪蓄積量には限界があり、蓄積しきれなくなった脂肪は、脂肪組織以外の肝臓、筋肉等に沈着し、いわゆる異所性脂肪となる。

異所性脂肪の沈着は、インスリンが効きにくくなるインスリン抵抗性を誘導し、メタボリックシンドローム等の様々な疾患の要因となっている。
これに対し、特許文献１には、非アルコール性脂肪肝炎マーカー、及びそれを用いた治療薬のスクリーニング方法が記載されている。

特開２０２１－０９９２４８号公報

しかしながら、脂肪肝の治療方法としては、食餌療法及び運動療法が一般的であり、脂肪肝に有効な治療剤は知られていない。そこで、本発明は、脂肪肝治療剤、脂肪肝治療剤を適用した医薬組成物、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１の態様は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を有効成分とする、脂肪肝治療剤である。

前記第１の態様において、前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を低下させる低分子化合物であることが好ましい。
この場合、前記阻害剤は、ＡＫＢ９７７８（ＣＡＳ番号１００８５１０－３７－９）であってもよい。

前記第１の態様において、前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現量を低下させるものであってもよい。
この場合、前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。

また、本発明の第２の態様は、前記第１の態様に記載の脂肪肝治療剤若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。

また、本発明の第３の態様は、前記第２の態様に記載の医薬組成物を、治療を必要とするヒト以外の動物に投与することを含む、治療方法である。

また、本発明の第４の態様は、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を測定する工程を含み、前記被験物質の存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性が、前記被験物質の非存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性と比較して低いことが、前記被験物質が、脂肪肝を治療する作用を有することを示す、スクリーニング方法である。

本発明によれば、脂肪肝治療剤、脂肪肝治療剤を適用した医薬組成物、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。

高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの体重の変化を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、１５週齢及び２５週齢におけるＷＴマウス及びＫＯマウスの、１日の食事摂取量を示すグラフである。

高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの腹部を解剖した後、撮影した写真である。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における中性脂肪をＢｏｄｉｐｙ染色により可視化した写真である。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓の重量を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓の総脂質を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓トリグリセリド値を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓コレステロール値を示すグラフである。

普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの肝臓における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの血清における、ＡＬＴ活性を解析した結果を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、ＡＳＴ活性を解析した結果を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、ＴＧ量を解析した結果を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、Ｔ－Ｃｈｏ量を解析した結果を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、アディポネクチン量を解析した結果を示すグラフである。

高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスにおける、ブドウ糖投与後の血糖値を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、インスリン投与後の血糖値を示すグラフである。

高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の重量を測定した結果を示すグラフである。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を顕微鏡観察した結果を示す写真である。 ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の平均直径を測定した結果を示すグラフである。

普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの脂肪組織における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＣＤ１１ｃのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＴｇｆｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。 ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフである。 ＰＴＰファミリーの活性に対する、ＡＫＢ９７７８の用量反応曲線を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓の重量を計測した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、肝臓切片のＢｏｄｉｐｙ色素染色の結果を示す写真である。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、総脂質量を測定した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、トリグリセリド量を測定した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、コレステロール量を測定した結果を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＴＮＦαレベルを解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＩＬ６レベルを解析した結果を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＡＬＴレベルを解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＡＳＴレベルを解析した結果を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＴＧレベルを解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、Ｔ－Ｃｈｏレベルを解析した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、アディポネクチンレベルを解析した結果を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、ブドウ糖投与後の血糖値を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、インスリン投与後の血糖値を示すグラフである。

ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の重量を測定した結果を示すグラフである。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を顕微鏡観察した結果を示す写真である。 ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の平均直径を測定した結果を示すグラフである。

投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＣＤ１１ｃのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＴｇｆｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。 投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。 投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフである。 Ｖｅｈｉｃｌｅを作用させた３Ｔ３－Ｌ１細胞の抽出物を二次元電気泳動で展開した後の泳動像である。 ＡＫＢ９７７８を作用させた３Ｔ３－Ｌ１細胞の抽出物を二次元電気泳動で展開した後の泳動像である。 各組織における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。 受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現をｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより解析した結果を示す写真である。

受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰｓ）は、タンパク質のチロシン残基に結合したリン酸基を加水分解する酵素群である。ＲＰＴＰは、プロテインチロシンキナーゼと拮抗的に機能することで、チロシンリン酸化を介した情報伝達において重要な役割を果たしている。

ヒトゲノムには２１種類のＲＰＴＰｓが存在し、これらは構造上の相同性から８つのサブファミリーに分類される。発明者らは、Ｒ３サブファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに着目した。

発明者らは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯが、脂肪組織において高発現していることを見出した。また、発明者らは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ遺伝子ノックアウトマウスは、野生型マウスに比べて、高脂肪・高ショ糖食で飼育した場合に、脂肪組織が著しく拡大することも見出した。

また、発明者らは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ遺伝子ノックアウトマウスは、野生型マウスに比べて、高脂肪・高ショ糖食で飼育した場合に、脂肪組織における脂質蓄積量が増加するとともに、肝臓における脂質蓄積量が減少することにより、脂肪組織での炎症、肝機能、血糖値維持能及びインスリン抵抗性が改善することも見出した。

また、発明者らは、肥満状態のマウスに対して、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性を阻害するＡＫＢ９７７８を投与すると、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ遺伝子ノックアウトマウスと同様に、脂肪組織における脂質蓄積量が増加するとともに、肝臓における脂肪蓄積量が減少することにより、脂肪組織での炎症、肝機能、血糖値維持能、インスリン抵抗性が改善することも見出した。

［脂肪肝治療剤］
一実施形態において、本発明は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を有効成分とする、脂肪肝治療剤を提供する。

本明細書において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤とは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性を阻害する物質、又は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現を抑制する物質であれば、どのようなものであってもよい。

（第１実施形態）
一実施形態において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性阻害剤であってもよい。

前記活性阻害剤としては、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性を阻害する限り特に限定されず、天然化合物、合成化合物、既存薬、代謝物等の低分子化合物、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのドミナントネガティブ変異体、抗体、抗体断片、又はアプタマー等が挙げられる。

低分子化合物としては、例えば、ＡＫＢ９７７８が挙げられる。ＡＫＢ９７７８は、Ｒａｚｕｐｒｏｔａｆｉｂとも呼ばれる。ＡＫＢ９７７８のＣＡＳ番号は、１００８５１０－３７－９である。
ＡＫＢ９７７８は、下記式（１）で表される化合物である。

ＡＫＢ９７７８は、ＰＴＰＲＢの阻害剤であることが知られている。これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、ＡＫＢ９７７８が、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＢ以外に、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＪ及び受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに対して高い阻害活性を示し、これらの中でも、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに対して、最も高い阻害活性を示すことを明らかにした。また、ＡＫＢ９７７８は、血管新生を阻害することが知られている。マウスモデルにおいて、ＡＫＢ９７７８は、加齢による網膜黄斑変性、虚血による網膜血管新生を抑制することが知られている（例えば、米国特許第１０２２００４８号明細書を参照）。

（第２実施形態）
一実施形態において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現量を低下させるものであってもよい。

受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現量を低下させる物質としては、ＰＲＴＲＯに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡの配列は、当業者であれば適宜設計することができる。

上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤は、塩又はそれらの溶媒和物であってもよい。
塩としては、脂肪肝治療剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。これらの中でも、塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。

溶媒和物としては、脂肪肝治療剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。これらの中でも、溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。

（投与対象）
上記実施形態にかかる受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を、投与する対象、又は接触させる対象としては、例えば、動物個体、前記動物の組織、前記動物の細胞であってもよい。

投与対象の動物個体としては、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを有する動物であれば特に限定されない。前記動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類等の脊椎動物等が挙げられる。

前記動物の組織としては、例えば、前記動物から分離された組織であってもよいし、オルガノイド等の人工的に作製された組織であってもよい。前記組織としては、例えば、肝臓等が挙げられるが、これに限定されない。

前記動物の細胞としては、例えば、前記動物から分離された細胞、前記動物から作製された培養細胞等が挙げられる。培養細胞としては、例えば、初代培養細胞、株化された細胞等が挙げられる。

株化された細胞は、一般的には不死化した細胞であり、癌細胞であってもよい。株化された細胞としては、公知の細胞を用いることができる。
株化された細胞は、例えば、多分化能を有する細胞、組織幹細胞、それらの細胞から分化させた細胞であってもよい。多分化能を有する細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。

上記動物の種類としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等が挙げられる。

（その他の成分）
上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤は、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、脂肪肝治療剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、後述する、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、角質軟化剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、油性基剤、乳化剤、乳化安定剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、保型剤、潤沢剤等が挙げられる。

（含有量）
上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤に含まれる受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤の含有量は、脂肪肝治療剤が本発明の効果を発揮する限り特に制限されず、脂肪肝治療剤の総質量（１００質量％）に対して、例えば、０．０１～５０質量％であってもよく、０．１～３０質量％が好ましく、１～１０質量％であることがより好ましい。

上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤の用途は、特に限定されず、例えば、治療用医薬組成物、予防用医薬組成物等の医薬組成物、実験用組成物等であってもよいし、食品組成物等に配合して使用してもよい。
これらの中でも、医薬組成物に配合して用いることが好ましく、治療用医薬組成物に配合して用いることがより好ましい。

上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤の使用方法及び使用量は、本発明の効果を発揮する限り特に制限されず、当業者であれば、適宜設定可能である。

以上説明した実施形態にかかる脂肪肝治療剤によれば、投与対象又は接触対象において受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性又は発現量を低下させることが可能である。これにより、肝臓及び血液における脂質量の減少、肝機能障害マーカーの低下、肝臓、血液及び脂肪組織における炎症反応の減弱、血糖値維持能及びインスリン応答性を改善することが可能である。

上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤を、脂肪肝の症状を呈している対象動物に投与することにより、脂肪肝の症状を改善することができる。

上記実施形態にかかる脂肪肝治療剤によれば、例えば、メタボリックシンドローム、脂肪肝・脂肪肝炎、脂質異常症、ＩＩ型糖尿病、動脈硬化症等の症状を改善することが可能である。これにより、肥満状態の動物個体において、健康を増進することが可能である。

［医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、上記実施形態の脂肪肝治療剤若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。

本実施形態にかかる医薬組成物が含み得る、脂肪肝治療剤の塩としては、医薬組成物が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。これらの中でも、塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。

本実施形態にかかる医薬組成物が含み得る、脂肪肝治療剤又はその塩の溶媒和物としては、医薬組成物が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。これらの中でも、溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。

（剤型）
本実施形態の医薬組成物は、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、皮膚外用剤、貼付剤等が挙げられる。

（薬学的に許容される担体）
薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム－グリコール－スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、緩衝液、生理食塩水等の希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられる。

（その他の成分）
本実施形態にかかる医薬組成物は、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、例えば、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤等が挙げられる。

ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、乳酸、酒石酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等の有機酸類、ピロリン酸ナトリウム等の有機酸塩類、水酸化ナトリウム等の無機塩基類、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン等の有機アミン類等が挙げられる。

抗酸化剤としては、例えばジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、α－トコフェロール、エリソルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはＥＤＴＡ－２Ｎａ等が挙げられる。

防腐剤又は保存剤としてはメチルパラベン等のパラベン類、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
清涼化剤としてはハッカ（ｌ－メントール）、カンフル、エタノール、ユーカリ油等が挙げられる。

着色剤としては、例えば、赤色２０２号、酸化鉄等が挙げられる。
キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（エデト酸塩）、エチドロン酸４Ｎａ、三リン酸５Ｎａ、ペンテト酸５Ｎａ等が挙げられる。

医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

本実施形態にかかる治療用医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、治療用医薬組成物の製剤は経口剤のために通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等の添加剤を用いて、常法により製造することができる。
使用可能な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、クエン酸、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等が挙げられる。
本実施形態にかかる治療用医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、その治療用医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製されたものであってもよい。

本実施形態にかかる医薬組成物が、非経口的投与に用いられる場合、前記医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等を含んでもよい。
本実施形態にかかる医薬組成物が、非経口的投与に用いられる場合、前記医薬組成物は、アンプル、バイアル、注射器のカートリッジ等に、単位投与量又は複数回投与量ずつ容器に封入されてもよい。

（治療の対象）
本実施形態にかかる医薬組成物の治療対象の疾患は、脂肪肝である。

投与対象の動物個体としては、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを有する動物であれば特に限定されない。前記動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類等の脊椎動物等が挙げられる。

上記動物の種類としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等が挙げられる。

（有効量）
本実施形態の医薬組成物は、脂肪肝治療剤若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の治療的有効量を含んでいてもよい。

「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。例えば、前記治療的有効量は、治療又は予防の対象となる疾患を治療又は予防できる量であり得る。本実施形態の医薬組成物における、脂肪肝治療剤若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の含有量は、前記治療的有効量に応じて適宜選択することができる。

（投与方法）
動物個体への投与は、非経口投与であってもよいし。経口投与であってもよい。

非経口投与としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔投与、脳室内投与、髄腔内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与等の局所投与等、全身投与が挙げられる。

（投与量）
動物個体への投与量は、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
例えば、ヒトに対する脂肪肝治療剤の経口投与量は、脂肪肝治療剤の種類、脂肪肝の症状等により変動するが、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１～５００ｍｇ、好ましくは約１．０～２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。

ヒトに対する脂肪肝治療剤の経口投与量は、脂肪肝治療剤の種類、脂肪肝の症状等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１～５００ｍｇ、好ましくは約１．０～２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．００１～１０ｍｇ、好ましくは約０．０１～５ｍｇ、より好ましくは約０．０２～２ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。

本実施形態にかかる医薬組成物によれば、投与対象において受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性又は発現量を低下させることが可能である。これにより、肝臓及び血液における脂質量の減少、肝機能障害マーカーの低下、肝臓、血液及び脂肪組織における炎症反応の減弱、血糖値維持能及びインスリン応答性を改善することが可能である。

本実施形態にかかる医薬組成物を、脂肪肝の症状を呈している対象動物に投与することにより、脂肪肝の症状を改善することができる。

本実施形態にかかる医薬組成物によれば、例えば、メタボリックシンドローム、脂肪肝・脂肪肝炎、脂質異常症、ＩＩ型糖尿病、動脈硬化症等の症状を改善することが可能である。これにより、肥満状態の動物個体において、健康を増進することが可能である。

［治療方法］
本発明は、一実施形態において、上記実施形態にかかる医薬組成物を、治療を必要とするヒト以外の動物に投与することを含む、治療方法を提供する。本実施形態にかかる医薬組成物の治療対象の疾患は、脂肪肝である。

ヒト以外の動物としては、例えば、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを有する動物であれば特に限定されない。前記動物としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類等の脊椎動物等が挙げられる。

上記動物の種類としては、ヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等のヒト以外の霊長類等が挙げられる。

本実施形態にかかる治療方法において、有効量及び投与方法としては、［医薬組成物］において上述したものが挙げられる。

本実施形態にかかる治療方法によれば、投与対象において受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性又は発現量を低下させることが可能である。これにより、肝臓及び血液における脂質量の減少、肝機能障害マーカーの低下、肝臓、血液及び脂肪組織における炎症反応の減弱、血糖値維持能及びインスリン応答性を改善することが可能である。

本実施形態にかかる治療方法によれば、脂肪肝の症状を改善することができる。本実施形態にかかる治療方法によれば、例えば、メタボリックシンドローム、脂肪肝・脂肪肝炎、脂質異常症、ＩＩ型糖尿病、動脈硬化症等の症状を改善することが可能である。これにより、肥満状態の動物個体において、健康を増進することが可能である。

［スクリーニング方法］
一実施形態において、本発明は、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を測定する工程を含み、前記被験物質の存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性が、前記被験物質の非存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性と比較して低いことが、前記被験物質が、脂肪肝を治療する作用を有することを示す、スクリーニング方法を提供する。

被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等に由来する物質が挙げられる。

ＡＫＢ９７７８は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を低下させる化合物であり、脂肪肝を治療する作用を有する。そこで、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を有意に低下させる被験物質は、脂肪肝を治療する作用を有するということができる。

本実施形態において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性の測定方法は特に限定されず、例えば、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに対して、ホスファターゼ人工基質を用いて測定する方法が挙げられる。人工基質としては、例えば、ＤｉＦＭＵＰ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）等の蛍光基質であってもよい。

本実施形態において、スクリーニングに用いられる受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯは、組換えタンパク質であってもよいし、野生型の動物細胞から分離したものであってもよい。

組換えタンパク質を発現させる細胞としては特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。あるいは、組換えタンパク質は、無細胞タンパク質合成系で合成されてものであってもよい。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、治療方法が挙げられる。

１実施形態において、本発明は、脂肪肝の治療のための受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を提供する。

１実施形態において、本発明は、脂肪肝の治療剤を製造するための受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を提供する。

上記の各実施形態において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を低下させるものであってもよいし、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現量を低下させるものであってもよい。

受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤は、低分子化合物であってもよく、ＡＫＢ９７７８（ＣＡＳ番号１００８５１０－３７－９）であってもよい。

受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。

上記実施形態において、有効量、投与量、投与方法としては、［医薬組成物］において上述したものが挙げられる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料と方法］
（マウスの飼育並びに体重と摂食量の測定）
実験に用いた全てのマウスは、設定温度：２４℃（許容範囲：２３～２６℃）、設定湿度：５５％（許容範囲：４０～７０％）、明暗各１２時間（照明：８：００～２０：００）に維持された動物飼育室で飼育した。受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの遺伝子欠損マウスと野生型マウスは、高脂肪・高ショ糖食（Ｆ２ＨＦＨＳＤ，オリエンタル酵母；エネルギー比率がタンパク質：脂肪：炭水化物＝１７．２：５４．５：２８．３）を自由摂食させて飼育した。

体重および摂餌量は、毎週定日の８：００から９：００の間に測定した。ｏｂ／ｏｂマウスは、普通食（ＣＡ－１，クレアジャパン）を自由摂食させて飼育した。体重及び摂餌量は、毎週定日の８：００から９：００の間に測定した。飼育終了後に解剖を行い、目的とする臓器・組織を切除し、重量を測定した。

（薬剤の投与）
ＡＫＢ９７７８（Ｓｕｎｄｉａ ＭｅｄｉＴｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａに合成を依頼）は、５ｍｇ／ｍｌとなるように１０％ＨＰＣＤ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，ナカライテスク）に溶解し、マウス１匹あたり１０ｍｇ／ｋｇ体重の量を、毎日８：００から９：００に腹腔内に投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群には１０％ＨＰＣＤだけを同量投与した。

（肝臓組織切片のＢｏｄｉｐｙ染色）
肝脂質の蓄積を調べるために、凍結肝切片をＢｏｄｉｐｙ４９３／５０３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。マウスを１０％ホルムアルデヒドで還流固定した後、肝臓を取り出し、１０％ホルムアルデヒド中で後固定した。次いで、凍結切片を作成し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの濃度に希釈したＢｏｄｉｐｙ４９３／５０３中に室温で２０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で封入処理した。キーエンス蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８１０で蛍光画像を取得し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ｖ２２．５．１（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理を行った。

（肝臓からの脂質の抽出とトリグリセリドとコレステロールの定量解析）
肝組織からの脂質の抽出はクロロホルム／メタノール抽出法で行った。肝組織を秤量し、３倍量のクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ）を加えてテフロン（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズした後、１倍量のメタノール、１倍量のクロロホルムと１倍量の０．７３％ＮａＣｌを混合しながら加えた。

次いで、これを７５０×ｇで１０分間遠心して、二相に分離させた。脂質を含む下相を回収し、窒素気流下で蒸発させて脂質抽出物を得た。この抽出物の重量を測定し、「Ｌｉｖｅｒ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ」とした。また、脂質抽出物をイソプロパノールに溶解して、ラボアッセイトリグリセリド（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ）とラボアッセイコレステロール（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ）を用いて、トリグリセリド量とコレステロール量を測定した。

（ＲＮＡの抽出と定量ＰＣＲ）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出と精製はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ゲノムＤＮＡの除去とともにｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を行った。

定量ＰＣＲ解析では、ｃＤＮＡの増幅にＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量解析を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の初期変性の後、９５℃で５秒と６０℃で３０秒のセットを４０サイクル行った。各遺伝子の発現量は、Ｇａｐｄｈに対する相対値として算出した。それぞれのｃＤＮＡの増幅には以下のプライマーセットを用いた。

Ｍｃｐ１の解析には、配列番号１及び配列番号２のプライマーセットを用いた。
Ｔｎｆａの解析には、配列番号３及び配列番号４のプライマーセットを用いた。
ＩＬ６の解析には、配列番号５及び配列番号６のプライマーセットを用いた。
ＣＤ１１ｃの解析には、配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いた。
Ｔｇｆｂ１の解析には、配列番号９及び配列番号１０のプライマーセットを用いた。
Ｆａｓｎの解析には、配列番号１１及び配列番号１２のプライマーセットを用いた。
Ｇａｐｄｈの解析には、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーセットを用いた。

（血清中のＴＮＦ、ＩＬ６、アディポネクチンの測定）
マウスより血液を採取し、氷上に３０分間置いたのち、１２００×ｇで２０分間遠心分離して血清を得た。血清サンプルについて、Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、レビスアディポネクチン－マウス／ラットＥＬＩＳＡキット（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＷＡＫＯ）を用いて、それぞれＴＮＦα、ＩＬ６、アディポネクチンの定量解析を行った。

（血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、トリグリセリド（ＴＧ）、トータル コレステロール（Ｔ－Ｃｈｏ）の測定）
マウスより血液を採取し、氷上に３０分間置いたのち、１２００×ｇで２０分間遠心分離して血清を得た。血清サンプル中のＡＬＴ、ＡＳＴ、トリグリセリド、トータル コレステロールの測定は、オリエンタル酵母工業株式会社に依頼した。

（糖負荷試験とインスリン負荷試験）
糖負荷試験では、マウスを一晩（１２時間）絶食させた後、ブドウ糖（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内に注射した。インスリン負荷試験では、６時間の絶食後、インスリン（２．０Ｕ／ｋｇ体重）を腹腔内に注射した。その後、グラフに示された時刻（０～１２０分）に、尾部先端から血液を採取し、グルコメーター（Ａｖｅｎｔｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて血糖値を測定した。

（脂肪細胞の大きさの定量化）
マウスを１０％ホルムアルデヒドで還流固定した後、精巣周囲の脂肪組織を取り出し、１０％ホルムアルデヒド中で後固定した。脱水処理後、パラフィンに包埋し、切片を作成した。切片を脱パラフィン処理後、Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ）で染色した。

次いで、切片を０．３％エオシン溶液で染色し、エタノールで洗浄後、脱水処理を行い、ＰＡＲＡ ｍｏｕｎｔ Ｎ（Ｆａｌｍａ）で封入した。キーエンス蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８１０で画像を取得し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ｖ２２．５．１（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理を行った。また、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて１匹のマウスあたり４００個の脂肪細胞の直径を測定した。

（ウエスタンブロッティング）
脂肪組織を４倍量のＲＩＰＡ緩衝液（１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，１２０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコール酸、１％ノニデットＰ－４０、１０％グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１ｍＭフェニルスルホニルフルオリド）中で、テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。

次いで、１５０００×ｇで１５分間遠心分離した上清について、ＢＣＡマイクロアッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、タンパク質濃度を測定した。この抽出液をＳＤＳサンプルバッファーと混合し、７５℃で１５分間熱処理した。

次いで、各サンプル１０μｇを７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離した後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。このメンブレンを３％ ＢＳＡ溶液でブロッキング後、同液で１／１０００に希釈した抗リン酸化ＡＫＴ抗体（ＣＳＴ， ＃４０６０）及びペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とインキュベートした後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＥＣＬ Ｐｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて化学発光による検出を行った。検出にはルミノイメージアナライザーＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ ＩＩ（ＡＴＴＯ）を用いた。検出が終わったメンブレンはＷＢ剥離溶液（ナカライテスク）で処理して抗体を除去した後、新たに抗ＡＫＴ抗体（ＣＳＴ，＃４６９１）を用いて抗リン酸化ＡＫＴ抗体と同様に検出を行った。

（ＡＫＢ９７７８の各ＰＴＰに対する阻害活性の解析）
受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ，受容体型プロテインチロシンホスファターゼＪ，受容体型プロテインチロシンホスファターゼＢの細胞内領域は、大腸菌の発現系を用いて調製した。受容体型プロテインチロシンホスファターゼＣ，受容体型プロテインチロシンホスファターゼＤ，プロテインチロシンホスファターゼ－１Ｂの細胞内領域はカイコの発現系を用いて調製した。Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，ｐＨ７．０）に、ＰＴＰタンパク質及び様々な濃度のＡＫＢ９７７８を加えた溶液に、ホスファターゼの人工基質であるＤｉＦＭＵＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を最終濃度が１０ｍＭになるように添加することで反応を開始した。反応は３７℃で３０分間行った。コロナ マルチグレーティング マイクロプレートリーダ ＳＨ－９０００Ｌａｂ（日立ハイテクサイエンス）を使用して、３５０／４５５ｎｍの励起／発光波長を用いて蛍光値を測定することでＡＫＢ９７７８の阻害活性を解析した。

（３Ｔ３－Ｌ１細胞中の受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの基質分子（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の単離）
マウス３Ｔ３－Ｌ１線維芽細胞はＡＴＣＣから入手した。細胞は増殖培地（１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）で密集成長（コンフルエント）になるまで増殖させた後、培養液を分化培地（増殖培地に１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．５ｍＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，２０μｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎを加えた培地）に変換して分化誘導を行った。分化開始の３日後から、脂肪細胞培地（増殖培地に２０μｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎを加えた培地）に変換し、新鮮な培地を１日おきに与えた。分化誘導から１４日後に細胞を解析に使用した。

ＡＫＢ９７７８を１０μＭの濃度で培地に添加して１０分間インキュベートした３Ｔ３－Ｌ１と未添加の３Ｔ３－Ｌ１について、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて抽出を行った。１５０００×ｇで１５分間遠心分離した上清から４０μｌのＡｎｔｉ Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｅａｄｓ（ＣＹＴ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）を用いて、チロシンリン酸化されたタンパク質を回収した。回収したタンパク質は１０％トリクロロ酢酸・アセトンで沈殿させた後、アセトンで洗浄し乾燥させた。

次いで、サンプルをサンプル緩衝液（７Ｍ ｕｒｅａ，２Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ，５％ ＣＨＡＰＳ，１．５％ ＤＴＴ，１％ ＩＰＧ ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に溶解し、７ｃｍ長のｐＨ３－１１ ＮＬ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。ＤｒｙＳｔｒｉｐはＩＰＧｐｈｏｒ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｕｎｉｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて等電点電気泳動を行った。泳動後、平衡緩衝液１（２％ ＤＴＴ， ６Ｍ尿素， ３０％グリセロール， ４％ ＳＤＳ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．８）で２０分間平衡処理を行い、さらに、ＤＴＴの代わりに２．５％のヨードアセトアミドを含む平衡緩衝液２中で、さらに２０分間ＤｒｙＳｔｒｉｐを平衡化した。ＤｒｙＳｔｒｉｐを７．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に置き、２次元目の電気泳動を行った。

泳動分離後、ゲルを銀染色ＭＳキット（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ）で染色し、ＡＫＢ９７７８処理でリン酸化比が亢進したスポットに対応するスポット（赤丸の部分）を切り出した。ゲル中のタンパク質の同定は日本プロテオミクスに委託した（トリプシン処理後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで解析した）。

以下に示す実験例において、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。
図１０～図１７において、Ｖｅｈは対照群を示し、ＡＫＢは、投与群を示す。

［実験例１］
（ノックアウトマウスの解析１）
受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ遺伝子を欠損する（Ｐｔｐｒｏ－ＫＯ）マウスの表現型について解析を行った。本明細書において、Ｐｔｐｒｏ－ＫＯマウスは、ＲＢＲＣ０１２３５（ＲＩＫＥＮ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いた。

まず、野生型雄マウス（以下、単にＷＴマウスという場合がある）、及びＰｔｐｒｏ－ＫＯ雄マウス（以下、単にＫＯマウスという場合がある）を、普通食を給餌して長期間飼育し、この間の体重を測定した。その結果、野生型マウスとＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスとの間では、体重に有意な差は認められなかった。

次いで、ＷＴ雄マウス及びＫＯ雄マウスに対して、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）を給餌して長期間飼育し、この間の体重、及び食餌摂取量を測定した。体重及び食餌摂取量は、ＷＴ雄マウス及びＫＯ雄マウス、それぞれ８匹ずつについて測定した。
結果を図１Ａ、図１Ｂに示す。

図１Ａは、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの体重の変化を示すグラフである。
図１Ｂは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、１５週齢及び２５週齢におけるＷＴマウス及びＫＯマウスの、１日の食事摂取量を示すグラフである。

図１Ａに示されるように、ＨＦ・ＨＳＤ飼育下では、ＷＴマウスでは、２０週齢以降に体重増加が鈍化した。これに対し、ＫＯマウスでは、継続した体重の増加が観察された。

図１Ｂに示されるように、ＨＦ・ＨＳＤ飼育下では、ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比べて、摂食量が有意に多かった。

［実験例２］
（ノックアウトマウスの解析２）
Ｐｔｐｒｏノックアウトマウスの肝臓と脂肪組織における、脂肪の蓄積の表現型について、解析した。

実験例１と同様に、ＷＴマウス及びＫＯマウスを、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した。２４週齢の各マウスについて、腹部臓器の形状、中性脂肪蓄積量、肝臓重量、肝臓の総脂質、肝臓トリグリセリド値、肝臓コレステロール値を解析した。腹部臓器の形状以外の測定結果は、いずれも、８匹のマウスで得られた結果を平均したものである。結果を図２Ａ～図２Ｆに示す。

図２Ａは、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの腹部を解剖した後、撮影した写真である。
図２Ｂは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における中性脂肪をＢｏｄｉｐｙ染色により可視化した写真である。

図２Ｃは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓の重量を示すグラフである。
図２Ｄは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓の総脂質を示すグラフである。
図２Ｅは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓トリグリセリド値を示すグラフである。
図２Ｆは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓コレステロール値を示すグラフである。

図２Ａに示されるように、ＨＦ・ＨＳＤ飼育下では、ＫＯマウスにおいては、野生型マウスに比べて、脂肪組織が著しく増大していた。

図２Ａに示されるように、ＨＦ・ＨＳＤ飼育下であっても、ＫＯマウスの肝臓の大きさは、野生型マウスとは異なり、小さいままであった。ＷＴマウスの肝臓は白っぽく見える脂肪肝の様相を呈していたが、ＫＯマウスの肝臓は赤色の正常な外観を示していた。

図２Ｂに示されるように、ＷＴマウスの肝臓では、大量の中性脂肪が蓄積されている様子が観察された。これに対し、ＫＯマウスの肝臓では、中性脂肪の蓄積が大きく抑制されていることが明らかになった。

図２Ｃに示されるように、ＨＦ・ＨＳＤ飼育下であっても、ＫＯマウスは、ＷＴマウスよりも、肝臓の肥大化が抑制され、ＫＯマウスの肝臓の重量は、ＷＴマウスの肝臓の重量の半分程度であった。

図２Ｄ～Ｆに示されるように、ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比べて、肝臓における、トリグリセリド、コレステロール等の脂質蓄積量が有意に少ないことが明らかになった。

［実験例３］
（ノックアウトマウスの解析３）
Ｐｔｐｒｏノックアウトマウスの肝臓における、炎症マーカーについて解析した。

実験例１と同様に、ＷＴマウス及びＫＯマウスを、普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した。各マウスの肝臓における炎症マーカーの発現量の変化を定量ＰＣＲによって比較した。各発現量は、Ｇａｐｄｈの発現量によって正規化した。結果は、いずれも、８匹のマウスで得られた結果を平均したものである。結果を図３Ａ～図３Ｃに示す。

図３Ａは、普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの肝臓における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図３Ｂは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図３Ｃは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの肝臓における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図３Ａ～図３Ｃに示されるように、ＷＴマウスは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育されることにより、Ｍｃｐ１、ＩＬ６、Ｔｎｆａの炎症マーカーの数値が大きく上昇していた。これに対し、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育することにより炎症マーカーの発現量の増加が、大きく抑制されることが明らかになった。

［実験例４］
（ノックアウトマウスの解析４）
Ｐｔｐｒｏノックアウトマウスの血液中における肝機能障害のマーカー、脂質量、抗炎症物質量の値を解析した。

実験例１と同様に、ＷＴマウス及びＫＯマウスを、高脂肪・高ショ糖食で飼育した。各マウスの血清中における、肝機能障害のマーカー、脂質量、抗炎症物質量の値を比較した。肝機能障害のマーカーとして、ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性、ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を測定した。脂質量として、ＴＧ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）量、Ｔ－Ｃｈｏ（ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）量を測定した。抗炎症物質量として、アディポネクチン量を測定した。結果は、いずれも、８匹のマウスで得られた結果を平均したものである。結果を図４Ａ～図４Ｅに示す。

図４Ａは、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの血清における、ＡＬＴ活性を解析した結果を示すグラフである。
図４Ｂは、高脂肪・高ショ糖食で飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、ＡＳＴ活性を解析した結果を示すグラフである。
図４Ｃは、高脂肪・高ショ糖食で飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、ＴＧ量を解析した結果を示すグラフである。
図４Ｄは、高脂肪・高ショ糖食で飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、Ｔ－Ｃｈｏ量を解析した結果を示すグラフである。
図４Ｅは、高脂肪・高ショ糖食で飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの血清における、アディポネクチン量を解析した結果を示すグラフである。

図４Ａ～Ｂに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合の肝機能障害のマーカーの値が低下し、脂質量が低下し、抗炎症物質量が増加していた。

［実験例５］
（ノックアウトマウスの解析５）
Ｐｔｐｒｏ ノックアウトマウスの血糖値維持能とインスリン応答性を解析した。

実験例１と同様に、ＷＴマウス及びＫＯマウスを、高脂肪・高ショ糖食で飼育した。
耐糖能試験として、各マウスにブドウ糖を投与した後、血糖値の上昇を測定した。
インスリン負荷試験として、各マウスにインスリンを投与した後、血糖値の低下を測定した。結果を図５Ａ～図５Ｂに示す。

図５Ａは、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスにおける、ブドウ糖投与後の血糖値を示すグラフである。
図５Ｂは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、インスリン投与後の血糖値を示すグラフである。

図５Ａに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合に、ブドウ糖投与後の血糖値上昇が有意に抑制されており、その後の血糖値はより迅速に低下した。
この結果は、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、血糖値維持能が亢進していることを示している。

図５Ｂに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合に、インスリン投与後に、より顕著に血糖値が低下した。
この結果は、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、インスリンシグナルが亢進していることを示している。

［実験例６］
（ノックアウトマウスの解析６）
Ｐｔｐｒｏ ノックアウトマウスの脂肪組織を解剖学的に解析した。

実験例１と同様に、ＷＴマウス及びＫＯマウスを、高脂肪・高ショ糖食で飼育した。
各マウスについて、精巣周囲脂肪組織の重量、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を解析した。結果を図６Ａ～図６Ｃに示す。

図６Ａは、高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の重量を測定した結果を示すグラフである。
図６Ｂは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を顕微鏡観察した結果を示す写真である。
図６Ｃは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の平均直径を測定した結果を示すグラフである。

図６Ａに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、精巣周囲脂肪組織の重量が有意に増大していることが明らかになった。
図６Ｂに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、より多くの肥大化した脂肪細胞が観察された。
図６Ｃに示されるように、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、脂肪細胞の平均直径が約１．３倍であった。

以上の結果から、高脂肪・高ショ糖食で飼育した場合、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、脂肪細胞がより大きくなる。これにより、脂肪組織における脂肪蓄積量が増大する。その結果、肝臓組織等の脂肪組織以外の組織における、脂肪の蓄積が抑制される、と推測された。

［実験例７］
（ノックアウトマウスの解析７）
高脂肪・高ショ糖食での飼育による、Ｐｔｐｒｏ ノックアウトマウスの精巣周囲脂肪組織における、炎症マーカー、代謝マーカーの発現量の変化を解析した。

ＷＴマウス及びＫＯマウスを、普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した。各マウスの肝臓における炎症マーカー、代謝マーカーの発現量の変化を定量した。

炎症マーカーとして、Ｍｃｐ１、Ｔｎｆａ、ＩＬ６を解析した。炎症性マクロファージのマーカーとして、ＣＤ１１ｃを解析した。また、組織の繊維化に働く遺伝子であるＴｇｆｂ１、脂肪合成に働く遺伝子であるＦａｓｎを解析した。定量ＰＣＲによって比較した各発現量は、Ｇａｐｄｈの発現量によって正規化した。結果を図７Ａ～図７Ｆに示す。

図７Ａは、普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの脂肪組織における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図７Ｂは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図７Ｃは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＣＤ１１ｃのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図７Ｄは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図７Ｅは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＴｇｆｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図７Ｆは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの脂肪組織における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図７Ａ～図７Ｄに示されるように、ＷＴマウスは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育されることにより、精巣周囲脂肪組織において、Ｍｃｐ１、Ｔｎｆａ、ＣＤ１１ｃ、ＩＬ６の炎症マーカーの数値が大きく上昇していた。これに対し、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育することによる炎症マーカーの発現量の増加が、大きく抑制されていた。

図７Ｅに示されるように、ＷＴマウスは、ＨＦ・ＨＳＤで飼育されることにより、精巣周囲脂肪組織において、組織の繊維化に働く遺伝子であるＴｇｆｂ１の発現量が顕著に上昇していた。これに対し、ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育することによるＴｇｆｂ１の発現量の増加が、大きく抑制されていた。

図７Ｆに示されるように、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、ＮＤで飼育した場合でも、脂肪組織におけるＦａｓｎの発現量が約１．５倍であった。ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育された場合、脂肪組織におけるＦａｓｎの発現量が約４倍であった。

［実験例８］
（ノックアウトマウスの解析８）
高脂肪・高ショ糖食での飼育による、Ｐｔｐｒｏ ノックアウトマウスの精巣周囲脂肪組織における、糖代謝、脂質代謝を制御するシグナル伝達経路の活性の変化を解析した。

ＷＴマウス及びＫＯマウスを、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した。各マウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴの活性化を解析した。

図８Ａは、普通食（ＮＤ）又は高脂肪・高ショ糖食（ＨＦ・ＨＳＤ）で飼育した、ＷＴマウス及びＰｔｐｒｏ－ＫＯマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。
図８Ａは、ＷＴマウス８匹及びＫＯマウス８匹についての解析結果を示している。

図８Ｂは、ＮＤ又はＨＦ・ＨＳＤで飼育した、ＷＴマウス及びＫＯマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフである。

図８Ａ～図８Ｂに示されるように、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、精巣周囲脂肪組織において、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合に、ＡＫＴが活性化していることが明らかになった。

以上示したように、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合に、脂肪組織への脂肪蓄積量が顕著に増大し、脂肪組織以外の臓器への脂肪の蓄積が抑制される。これにより、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、肝機能障害、インスリン抵抗性が低く抑えられている、と推測される。

更に、ＫＯマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、炎症反応及び繊維化が抑制されることに加えて、脂質合成が活性化する。これにより、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、ＨＦ・ＨＳＤで飼育した場合に、脂肪組織への脂肪蓄積量が顕著に増大することが示唆された。

［実験例９］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析１）
受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのフォスファターゼ活性に対する、ＡＫＢ９７７８の阻害効果を解析した。

ＡＫＢ９７７８は、ＰＴＰＲＢの活性阻害剤として知られている。ＰＴＰＲＢは、血管新生に関与することが知られている。ＡＫＢ９７７８は、網膜や脈絡膜の血管新生を抑制することが知られている。

人工蛍光基質ＤｉＦＭＵＰを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により、ＰＴＰＲファミリーに対するＡＫＢ９７７８の阻害活性を解析した。解析では、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＪ、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＢ、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＣ、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＤ、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂを対象とした。結果を図９及び表１に示す。
図９は、ＰＴＰファミリーの活性に対する、ＡＫＢ９７７８の用量反応曲線を示すグラフである。

その結果、ＡＫＢ９７７８は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＢ以外に、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＪ及び受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに対して高い阻害活性を示した。これらの中でも、ＡＫＢ９７７８は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯに対して、最も高い阻害活性を示すことが明らかになった。

［実験例１０］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析２）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与し、形質の変化を解析した。

ｏｂ／ｏｂマウスは、高度肥満モデルマウスとして知られている。ｏｂ／ｏｂマウスに対し、１６週齢から４週間にわたり、毎日１０ｍｇ／ｋｇ体重のＡＫＢ９７７８又はビークルを腹腔投与した。ｏｂ／ｏｂマウスは、１６週齢において、定常的な高度肥満状態に至っており、体重増加はほぼ停止している。ＡＫＢ９７７８の投与期間中、摂食量と体重について、ＡＫＢ９７７８投与群と対象群との間に有意な差は認められなかった。

ＡＫＢ９７７８又はビークルの投与開始から４週間後、投与群及び対照群のマウスにおいて、肝臓重量、肝臓における脂肪の蓄積量を解析した。結果を図１０Ａ～図１０Ｅに示す。

図１０Ａは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓の重量を計測した結果を示すグラフである。
図１０Ｂは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、肝臓切片のＢｏｄｉｐｙ色素染色の結果を示す写真である。

図１０Ｃは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、総脂質量を測定した結果を示すグラフである。
図１０Ｄは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、トリグリセリド量を測定した結果を示すグラフである。
図１０Ｅは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、コレステロール量を測定した結果を示すグラフである。

図１０Ｂに示されるように、投与群の肝臓では、対照群に比べて、中性脂肪の蓄積が抑制されている様子が観察された。
図１０Ｃ～図１０Ｅに示されるように、投与群の肝臓では、対照群に比べて、総脂質、トリグリセリド、コレステロールの蓄積量が低減されている様子が観察された。

［実験例１１］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析３）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与し、肝臓における炎症マーカーと代謝マーカーの発現量の変化を定量ＰＣＲによって解析した。

実験例１０と同様にして、ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８又はビークルを腹腔投与した。次いで、各マウスについて、炎症マーカーであるＭｃｐ１、Ｔｎｆａ、ＩＬ６、脂肪合成に働くＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲにより解析した。

図１１Ａは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１１Ｂは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１１Ｃは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１１Ｄは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図１１Ａ～図１１Ｄに示されるように、投与群の肝臓では、対照群に比べて、炎症マーカー、脂肪合成に働く遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下することが明らかになった。

［実験例１２］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析４）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与し、血液における、炎症マーカー、肝機能障害マーカー、脂質量、及び抗炎症マーカーを解析した。

実験例１０と同様にして、ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８又はビークルを腹腔投与した。次いで、各マウスについて、血液の炎症マーカーであるＴＮＦα及びＩＬ６、肝機能障害マーカーであるＡＬＴ及びＡＳＴレベル、中性脂肪（ＴＧ）量及び総コレステロール量（Ｔ－Ｃｈｏ）量、並びに、抗炎症マーカーであるアディポネクチンレベルを解析した。結果は、いずれも、８匹のマウスで得られた結果を平均したものである。結果を図１２Ａ～図１２Ｇに示す。

図１２Ａは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＴＮＦαレベルを解析した結果を示すグラフである。
図１２Ｂは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＩＬ６レベルを解析した結果を示すグラフである。

図１２Ｃは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＡＬＴレベルを解析した結果を示すグラフである。
図１２Ｄは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＡＳＴレベルを解析した結果を示すグラフである。

図１２Ｅは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、ＴＧレベルを解析した結果を示すグラフである。
図１２Ｆは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、Ｔ－Ｃｈｏレベルを解析した結果を示すグラフである。
図１２Ｇは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの血清における、アディポネクチンレベルを解析した結果を示すグラフである。

図１２Ａ～図１２Ｆに示されるように、投与群の血液では、対照群に比べて、炎症マーカー及び肝機能障害マーカーのレベル、脂肪量が低下することが明らかになった。
図１２Ｇに示されるように、投与群の血液では、対照群に比べて、抗炎症マーカーのレベルが上昇することが明らかになった。

［実験例１３］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析５）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与し、血糖値維持能とインスリン応答性を解析した。

実験例１０と同様にして、ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８又はビークルを腹腔投与した。
次いで、各マウスについて、耐糖能試験として、各マウスにブドウ糖を投与した後、血糖値の上昇を測定した。
インスリン負荷試験として、各マウスにインスリンを投与した後、血糖値の低下を測定した。結果を図１３Ａ～図１３Ｂに示す。

図１３Ａは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、ブドウ糖投与後の血糖値を示すグラフである。
図１３Ｂは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、インスリン投与後の血糖値を示すグラフである。

図１３Ａに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、ブドウ糖投与後の血糖値上昇が有意に抑制されており、その後の血糖値はより迅速に低下した。
この結果は、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、血糖値維持能が向上していることを示している。

図１３Ｂに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、インスリン投与後に、より顕著に血糖値が低下した。
この結果は、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、インスリンシグナルが亢進していることを示している。

［実験例１４］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析６）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与し、脂肪組織を解剖学的に解析した。

実験例１０と同様にして、ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８又はビークルを腹腔投与した。
次いで、各マウスについて、精巣周囲脂肪組織の重量、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を解析した。結果を図１４Ａ～図１４Ｃに示す。

図１４Ａは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の重量を測定した結果を示すグラフである。
図１４Ｂは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の形態を顕微鏡観察した結果を示す写真である。
図１４Ｃは、ＡＫＢ９７７８投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスにおける、精巣周囲脂肪組織の脂肪細胞の平均直径を測定した結果を示すグラフである。

図１４Ａに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、精巣周囲脂肪組織の重量が有意に増大していることが明らかになった。
図１４Ｂに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、より多くの肥大化した脂肪細胞が観察された。
図１４Ｃに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、脂肪細胞の平均直径が約１．２倍であった。

［実験例１５］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析７）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与した後、精巣周囲脂肪組織における、炎症マーカー、代謝マーカーの発現量の変化を解析した。

投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの肝臓における炎症マーカー、代謝マーカーの発現量の変化を定量した。

炎症マーカーとして、Ｍｃｐ１、Ｔｎｆａ、ＩＬ６を解析した。炎症性マクロファージのマーカーとして、ＣＤ１１ｃを解析した。また、組織の繊維化に働く遺伝子であるＴｇｆｂ１、脂肪合成に働く遺伝子であるＦａｓｎを解析した。定量ＰＣＲによって比較した各発現量は、Ｇａｐｄｈの発現量によって正規化した。結果を図１５Ａ～図１５Ｆに示す。

図１５Ａは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、Ｍｃｐ１のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１５Ｂは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＴｎｆａのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１５Ｃは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＣＤ１１ｃのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図１５Ｄは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＩＬ６のｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１５Ｅは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＴｇｆｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。
図１５Ｆは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織における、ＦａｓｎのｍＲＮＡの発現量を解析した結果を示すグラフである。

図１５Ａ～Ｃに示されるように、投与群のマウスでは、対照群のマウスと比較して、炎症マーカーの発現量が有意に低下していることが明らかになった。また、脂肪合成に働く遺伝子であるＦａｓｎの発現量が上昇していることが明らかになった。

［実験例１６］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析８）
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、ＡＫＢ９７７８を投与した後、精巣周囲脂肪組織における、糖代謝、脂質代謝を制御するシグナル伝達経路の活性の変化を解析した。

図１６Ａは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示すグラフである。
図１６Ａは、ＷＴマウス８匹及びＫＯマウス８匹についての解析結果を示している。

図１６Ｂは、投与群及び対照群のｏｂ／ｏｂマウスの精巣周囲脂肪組織における、ＡＫＴのリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフである。

［実験例１７］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ阻害剤を用いた解析９）
３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞に対して、ＡＫＢ９７７８を作用させた後、タンパク質を電気泳動することにより、チロシンリン酸化が亢進するタンパク質として、Ｖｉｍｅｎｔｉｎを同定した。

受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの基質分子を明らかにする目的で、脂肪細胞のモデル細胞である成熟した３Ｔ３－Ｌ１細胞に対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ又はＡＫＢ９７７８を作用させた。次いで、各細胞の抽出物を二次元電気泳動に供した。結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。

図１７Ａは、Ｖｅｈｉｃｌｅを作用させた３Ｔ３－Ｌ１細胞の抽出物を二次元電気泳動で展開した後の泳動像である。
図１７Ｂは、ＡＫＢ９７７８を作用させた３Ｔ３－Ｌ１細胞の抽出物を二次元電気泳動で展開した後の泳動像である。

次いで、２個の二次元電気泳動像を比較し、ＡＫＢ９７７８によりリン酸化が亢進したスポット（図１７Ｂ中、矢じりが指すスポット）を切り出した。次いで、質量分析により、スポットに含まれたタンパク質を解析した結果、Ｖｉｍｅｎｔｉｎを同定した。

この結果は、ＡＫＢ９７７８により、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性が抑制され、Ｖｉｍｅｎｔｉｎのチロシンリン酸化が亢進することを示している。Ｖｉｍｅｎｔｉｎは、脂肪細胞において油滴の形成に働くことが知られている。ＡＫＢ９７７８が脂肪細胞に作用してＶｉｍｅｎｔｉｎのチロシンリン酸化の亢進させることにより、脂肪組織への脂肪蓄積が増大する、と推測された。

以上示したように、ＡＫＢ９７７８をｏｂ／ｏｂマウスに投与することにより、肝臓及び血液における脂質量の減少、肝機能障害マーカーの低下、肝臓、血液及び脂肪組織における炎症反応の減弱、血糖値維持能及びインスリン応答性の改善が観察された。

ＡＫＢ９７７８による上述の現象は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯノックアウトマウスにおいてみられた現象と同様のものである。すなわち、ＡＫＢ９７７８は、主に受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの活性を阻害することにより、上述の効果を引き起こした、と考えられる。

ＡＫＢ９７７８を肥満状態のマウスに投与することにより、脂肪組織への中性脂肪の蓄積能が増大し、肝臓等の脂肪組織以外の臓器にあった脂肪が脂肪組織へ移行したものと推測される。また、肝臓での脂質合成が減少すると同時に脂肪組織での炎症が抑制されることにより、肝機能が改善するとともに、血糖値維持能及びインスリン抵抗性の改善につながったと考えられる。

この結果は、肥満状態のマウスに対してＡＫＢ９７７８を投与することにより、“健康的な肥満”という状態が作り出されたとも言える。
また、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを阻害することにより、メタボリックシンドローム、脂肪肝・脂肪肝炎、脂質異常症、ＩＩ型糖尿病、動脈硬化症等の症状を改善できることが示唆された。

［実験例１８］
（受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現解析）
各組織における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの発現量を解析した。

各組織における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの発現量を、定量ＰＣＲにより解析した。具体的には、腎臓、精巣周囲脂肪組織、後肢筋肉、心臓、肝臓における発現量を解析した。発現量はＧａｐｄｈで正規化し、相対値を算出した。結果を図１８Ａに示す。

図１８Ａは、各組織における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。
図１８Ａに示すように、精巣周囲脂肪組織において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの高い発現量が認められた。

次いで、精巣周囲脂肪組織における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現を、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより解析した。結果を図１８Ｂに示す。

図１８Ｂは、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現をｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより解析した結果を示す写真である。図１８Ｂ中、スケールバーは、２００μｍを示す。
図１８Ｂに示すように、精巣周囲脂肪組織において、受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯ ｍＲＮＡの発現が認められた。

本発明によれば、脂肪肝治療剤、脂肪肝治療剤を適用した医薬組成物、脂肪肝治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。本発明の脂肪肝治療剤は、メタボリックシンドロームの治療剤として好適に用いることができる。

Claims (8)

1. 受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの阻害剤を有効成分とする、脂肪肝治療剤。
2. 前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を低下させる低分子化合物である、請求項１に記載の脂肪肝治療剤。
3. 前記阻害剤は、ＡＫＢ９７７８（ＣＡＳ番号１００８５１０－３７－９）である、請求項２に記載の脂肪肝治療剤。
4. 前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯの発現量を低下させるものである、請求項１に記載の脂肪肝治療剤。
5. 前記阻害剤は、前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯを標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項４に記載の脂肪肝治療剤。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の脂肪肝治療剤若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
7. 請求項６に記載の医薬組成物を、治療を必要とするヒト以外の動物に投与することを含む、治療方法。
8. 脂肪肝治療剤のスクリーニング方法であって、
   被験物質の存在下における受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性を測定する工程を含み、
   前記被験物質の存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性が、前記被験物質の非存在下における前記受容体型プロテインチロシンホスファターゼＯのホスファターゼ活性と比較して低いことが、前記被験物質が、脂肪肝を治療する作用を有することを示す、スクリーニング方法。

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