CZ300395B6 - Lécivo pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu - Google Patents

Lécivo pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu Download PDF

Info

Publication number
CZ300395B6
CZ300395B6 CZ20012804A CZ20012804A CZ300395B6 CZ 300395 B6 CZ300395 B6 CZ 300395B6 CZ 20012804 A CZ20012804 A CZ 20012804A CZ 20012804 A CZ20012804 A CZ 20012804A CZ 300395 B6 CZ300395 B6 CZ 300395B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
group
alkylamino
treatment
flavopiridol
Prior art date
Application number
CZ20012804A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20012804A3 (cs
Inventor
Campbell Patterson@Winston
A. Dumont@Jennifer
Original Assignee
Aventis Pharmaceuticals Inc.
Board Of Regents, University Of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharmaceuticals Inc., Board Of Regents, University Of Texas System filed Critical Aventis Pharmaceuticals Inc.
Publication of CZ20012804A3 publication Critical patent/CZ20012804A3/cs
Publication of CZ300395B6 publication Critical patent/CZ300395B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Použití 4-H-1-benzopyran-4-onového derivátu obecného vzorce I, ve kterém obecné symboly mají definované specifické významy, pro výrobu léciva pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu.

Description

Vynález se týká léčiva pro inhibici proliferace buněk hladkých svalů, pro léčení vaskulárních lézí buňkami bohatých hladkých svalů, pro léčení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro léčení pacientů po implantaci stentů.
Dosavadní stav techniky
Buněčné odezvy na vaskulámí poškození, mezi které patří buněčná dysfunkce, aktivace, dediferenciace, proliferace a migrace, kulminují v klinických příhodách, jakými jsou restenózy, ke kterým dochází po balónkové angioplastice a uložení stentů v rámci léčení humánních aterosklerotických onemocnění. Proliferace buněk hladkých svalů (SMC - Smooth Muscle Cell) je společným a patrně i jednotícím znakem modelů vaskulámího poškození a SMC jsou hlavní celulámí složkou neointimálních lézí. Obnovený zájem o inhibici proliferace buněk hladkých svalů doprovázelo četnější používání stentů při léčení koronárních onemocnění, poněvadž restenózy způsobené stenty (restenózy in-stent) jsou téměř výlučně závislé na neointimální formaci a hyperplazii (zvětšení počtu buněk) SMC. Odhaduje se, že v samotném roce 1997 vyžadovalo léčení až 100 000 pacientů s restenózami in-stent. V důsledku toho by snadno aplikovatelný účinný inhibi25 tor hyperplazie SMC mohl mít značný klinický a ekonomický dopad.
Pokusy inhibovat proliferaci SMC v modelech vaskulámího poškození buď modulací buněčných mediátorů proliferační odezvy, nebo přímou interferencí s mechanismem buněčného cyklu poskytly zajímavé pohledy na neointimální formaci. Progrese buněčné cyklu je pečlivě kontrolo30 váným dějem pozitivně regulovaným cyklin-dependentními kinázami (Sdks) a jejich cyklinovými regulačními podjednotkami a negativně regulovaným inhibitory Cdk a nádor-supresivními geny, jakými jsou retinoblastomový protein (Rb) a p53. Adenovirálně mediovaná nadměrná exprese endogenní Cdk-inhibitorů p21 a p27klp 1 nebo konstituěně aktivní forma Rb blokují neointimální tvorbu v modelu poškození krysí karotídy; stejně tak inhibice aktivity transkripčního faktoru E2F kompetitivní nadměrnou expresí příbuzných DNA vazebných míst rovněž inhibuje proliferaci SMC a neointimální tvorbu. Tyto studie podporují hypotézu, že inhibice buněčného cyklu představuje přitažlivý způsob intervence do tvorby vaskulárních lézí.
I když genetické intervence napomáhaly při rozrušení mechanismu regulujícího neointimální tvorbu, jsou nicméně nevýhodné vzhledem k tomu, že v současné době nejsou ještě vhodné pro klinické léčení vaskulárních chorob u lidí. Proto by ve vodě rozpustná nízkomolekulámí sloučenina se specifickým regulačním účinkem na buněčný cyklus, zejména v případě orálního podání, měla širokou jak experimentální, tak potenciálně klinickou aplikovatelnost. Nedávno identifikovaný flavon, flavopiridol je inhibitorem Cdk, který potentně blokuje aktivitu Cdk2, Cdc2 a Cdkt.
Na rozdíl od ostatních inhibitorů Cdk je flavopiridol pozoruhodný pro svojí specifičnost vůči kináze, jeho biodostupnost při orálním podání a jeho potenci vzhledem k tomu, že je účinný při nanomolámích koncentracích. Tyto jedinečné charakteristiky mají za následek příznivý profil vedlejších účinků, který vedl k testování flavopiridolu ve fázi I klinických testů v rámci léčení neoplazmů vzdorujících léčbě.
Vzhledem k těmto vlastnostem byla nyní v rámci vynálezu zkoumána schopnost flavopiridolu inhibovat proliferaci SMC in vitro a po poškození krysí karotídy následkem balónkové angioplastice. Bylo prokázáno, že flavopiridol je potentním a selektivním inhibitorem progrese buněčného cyklu a že zastavuje proliferaci SMC jak in vivo, tak in vitro; kromě toho orální dávky flavopiri-1 CZ 300395 B6 dolu, které jsou nižší než dávky, o kterých je známo, že mají na člověka toxický účinek, účinně blokují neointimální tvorbu.
Nyní bylo s překvapením zjištěno, že 4-H-l-benzopyran-4-nové deriváty jsou vhodné jako 5 inhibitory proliferace SMC. Je známo, že 4-H-benzopyran^J-onové deriváty jsou vhodné pro kontrolu nádorů. Je však překvapující, že 4-H-l-benzopyran^4—onové deriváty podle vynálezu působí účinně jako inhibitor proliferace SMC v dávkových úrovních nižších, než jsou dávkové úrovně, které musí být použity pro kontrolu nádorového růstu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je použití 4-H-l-benzopyran^4-onového derivátu vzorce 1
ve kterém
Ri znamená atom vodíku, alkyl mající 1 až 6 uhlíkových atomů, aryl-Ci-C4-aIkylovou skupinu; C]-C6-alkylovou skupinu substituovanou halogenem, hydroxyskupinou nebo karboxyskupinou; C3-C6-cykloalkylovou skupinu, pyridylovou skupinu, thienylovou skupinu, C3-C6-cyklo20 alky1-Ci-C4-alkylovou skupinu, C2-C6-alkenylovou skupinu, C2-C6-alkyny lovou skupinu, fenylovou skupinu; fenylovou skupinu mono- nebo polysubstituovanou halogenem, Cj-C4alkylovou skupinou, Ci-C4-alkoxy skupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluormethylovou skupinou, aminoskupinou,, C]-C4-alkylamino25 skupinou, di- C]-C4-alkylaminoskupinou nebo fenylovou skupinou; naftylovou skupinu, karboxylovou skupinu, skupinu -CHO, COO-C]-C4~alkylovou skupinu, primární aminoskupinu, alkylaminoskupinu, aralkyl aminoskupinu, dialkylamínoskupinu, amidoskupinu, aryl aminoskupinu, diarylaminoskupinu nebo -CH2O-C,-C4-alkylovou skupinu,
R2 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu mající 1 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, di-C1-C4-alkylaminoskupinu, halogen, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu, skupinu -COOH, -COO-C|-C4-alkylovou skupinu, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH nebo -CH2O-C]-C4-al kýlo vou skupinu,
R3 znamená atom vodíku, C]-C4-alkylovou skupinu; Ci~C4-alkylovou skupinu substituovanou halogenem, hydroxyskupinou nebo karboxyskupinou; hydroxylovou skupinu, karboxylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, C|-C4-alkylaminoskupinu, di-C]-C4-alkylaminoskupinu, halogen, -0-alkyl-C(0)-alkylovou skupinu, -CHO, -CH2OH, -CH2O-Ci-C4-alkylovou skupinu nebo skupinu R2N-C(O)-O-, ve které R znamená H, Ci-C4-alkylovou skupinu, cyklo40 alkylovou skupinu nebo O-alkyl-C(O)-alkýlovou skupinu, nebo arylovou skupinu,
-2CZ 300395 B6
Kt znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu, C|-C4-alkoxy skupí nu, C|-C4-alkanoyloxyskupinu, Cr-C4-a!koxykarbonylovou skupinu, aiyloxyskupinu, aminoskupinu, C]-C4-alkylaminoskupinu, di- Ci-C4-alkylaminoskupinu nebo skupinu R'2-N-C(O)-<>-, ve které R' znamená H, C|-C6-alkylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu nebo arylovou skupinu,
R5 znamená atom vodíku, Ci-C6-alkylovou skupinu, aiyl- Ci-C4~alkylovou skupinu, Cr^Cócykloalkylovou skupinu, C3-C6-cykloalkyl- C,-C4-alkylovou skupinu, alkylaminoskupinu, C(C4-alkanoylovou skupinu, -C(O)-O-, Cj-C4-alkylovou skupinu nebo aroylovou skupinu, přičemž arylová skupina v R|, R2, R3, R4 a R5 znamená nesubstituovanou fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu, která je mono- nebo polysubstituovaná halogenem, C)-C4-alkylovou skupinu, Ci-C4-alkoxyskupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-al kýlovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluormethy lovou skupinou, aminoskupinou, C|~C4-alkylaminoskupinou, di- Ci-C4-alkyl· aminoskupinou nebo fenylovou skupinou m znamená celé číslo mezi 0 a 3 a n znamená 1, nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou pro výrobu léčiva pro inhibiei proliferace buněk hladkých svalů, přičemž dávkování sloučeniny vzorce I je méně než 70 %, výhodně méně než 60 %, zejména méně než 50 % dávkování, které by bylo nezbytné pro kontrolu nádorového růstu.
Výhodné je použití, při kterém je 4-H-l-benzopyran-4-onovým derivátem sloučenina vzorce la
(la), ve kterém
R] znamená atom vodíku, C|-C3-alkylová skupina, naftylová skupina, fenylová skupina, feny30 lová skupina mono- nebo polysubstituovaná halogenem, Q-C^-alkylovou skupinou, C,-C4alkoxyskupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkýlovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluormethylovou skupinou, aminoskupinou, Ct-C4-alkylaminoskupinou, di-C,-C4-al kyl aminoskupinou nebo fenylovou skupinou; pyridylovou skupinu nebo thienylovou skupinu,
R2 znamená atom vodíku nebo Ci-C3-alkylovou skupinu;
R5 znamená Ci-C3-alkylovou skupinu, C3-C5-cykloalkylovou skupinu nebo C3-C5-cykloalkyl- Ci^C4-alkylovou skupinu.
-3CZ 300395 B6
Výhodné je použití, při kterém substituenty vzorce la mají následující významy:
R, znamená fenylovou skupinu, thienylovou skupinu, pyridylovou skupinu, ch lorfeny lovou skupinu, dich lorfeny lovou skupinu, methylfeny lovou skupinu, aminofenylovou skupinu, bromfenylovou skupinu, hydroxy feny lovou skupinu nebo naftylovou skupinu;
R2 znamená atom vodíku a
Rg znamená methylovou skupinu.
Výhodné je použití, při kterém 4-H-l-benzopyran-4-onovým derivátem je (-)—cis—5,7—dihydroxy-2-(2-chlorfenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-methyl)piperidyl]-4H-benzopyran-4-on (Flavopiridol).
Výhodné je použití, při kterém je léčivo určeno pro léčení vaskulámích lézí buňkami bohatých hladkých svalů.
Výhodné je použití, při kterém je léčivo určeno pro léčení lézí po poškození balónkovou angio20 plastikou.
Výhodné je použití, při kterém je léčivo určeno pro léčení pacientů po implantaci stentů.
Sloučeniny podle vynálezu mají dvě asymetrická centra, a sice jedno v místě, kde je heterocyk25 lický kruh obsahující dusík kondenzován s benzopyrazonovým zbytkem (C-4'), a druhé v R4substituovaném uhlíkovém atomu (C-3'), což znamená, že jsou v tomto případě možné dva páry optických izomerů. Definice sloučenin podle vynálezu zahrnuje všechny možné stereoizomery ajejich směsi. Tato definice zejména zahrnuje racemické formy a izolované optické izomeiy mající specifikovanou účinnost. Oba racemáty mohou být štěpeny fyzikálními metodami, mezi které patří zejména frakcionaění krystalizace. Individuální optické mohou být získány z racemátů konvenčními postupy, mezi které například patří vytvoření soli s opticky aktivní kyselinou a následná krystalizace.
Příklady alkylových skupin, které jsou vhodné jako významy pro R| až Rs, jsou přímé nebo rozvětvené skupiny obsahující až 6, výhodně až 5, uhlíkových atomů, přičemž těmito skupinami jsou například methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, isopropylová skupina, terc.butylová skupina, pentylová skupina nebo isopentylová skupina.
Příklady substituovaných alkylových skupin, které jsou vhodné jako významy pro Rt až R5, jsou halogenalkylová skupina, jako například tri fiuormethy lová skupina, hydroxyalkylová skupina, jako například hydroxyethylová skupina, nebo karboxyalkylová skupina, jako například karboxyethylová skupina.
Vhodné příklady cykloalkylová skupiny, která obsahuje 3 až 6 uhlíkových atomů a je vhodná jako význam pro R] až R5, jsou cyklopropylová skupina, cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina nebo cyklohexylová skupina. Cyklopropylmethylová skupina je příkladem cykloalkylalkylové skupiny.
Příkladem aralkylové skupiny, která je vhodná jako význam pro Ri až R5, je feny laiky lová skupina, která je nesubstítuovaná nebo monosubstituovaná nebo polysubstituovaná substituenty, jakými jsou halogen, alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo nitro-skupina, nebo trifluormethylovou skupinou, amino-skupinou a substituovanou amino-skupinou.
-4CZ 300395 B6
Příkladem arylové skupiny, která je vhodná jako význam pro R! až R5, je fenylová skupina, která je nesubstituovaná nebo monosubstituovaná nebo polysubstituovaná substituenty, jakými jsou halogen, alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, hydroxylová skupina, karboxylová skupina, COO-alkylová skupina, skupina
CONH2, CONH-alkylová skupina, CON(alkyl)2alkylová skupina, nitro-skupina nebo trifluoraminová skupina, amino-skupina, alkylamino-skupina, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, di-alkylamino-skupina, ve které každý alkylový zbytek obsahuje I až 4 uhlíkové atomy, aromatické heterocyklické skupiny, jako například pyridylová skupina, a polycyklické aromatické skupiny, jako například naťitylová skupina.
Vhodným příkladem alkylamino-skupiny ve významech Ri až R5 je skupina (CH2)n-NR6R7, ve které n znamená 1 až 3 a R$ a R7 znamenají alkylovou skupinu a mají výše uvedený význam pro případ, kdy R! až R5 znamenají alkylovou skupinu; kromě toho R$ a R7 mohou tvořit společně s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány, heterocyklickou skupinu obsahující jeden nebo více heteroatomů. Vhodnými příklady heterocyklických skupin, které jsou tvořeny R6 a R7 společně s atomem dusíku, ke kterému jsou vázány, jsou piperidinová skupina, pyrrolidinová skupina, morfolinová skupina, piperazinová skupina nebo imidazolová skupina, přičemž všechny tyto skupiny mohou být nesubstituované nebo substituované v jedné nebo několika polohách alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo arylovou skupinou nebo hydroxylovou skupinou nebo amino-skupinou.
Vhodnými příklady solí sloučenin podle vynálezu s anorganickými nebo organickými kyselinami jsou hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, fosfáty, acetáty, oxaláty, tartráty, citráty, maleáty nebo fumaráty.
Přehled obrázků na výkresech
Na připojených výkresech:
Obr. 1 znázorňuje účinek flavopiridolu na syntézu HASMC DNA. 1 A: Kviescentní HASMC byly ošetřeny v nepřítomnosti (-) nebo přítomnosti (+) bFGF (10 ng/ml) a při indikovaných koncentracích flavopiridolu (nmol/L) po dobu 24 hodin. Inkorporace BrdU jako měřítko proliferace byla určena stanovením na bázi ELISA a vyjádřena jako inkorporace při absenci ošetření bFGF.
*p<0,05, ve srovnání s neošetřenými buňkami. tp<0,05, ve srovnání s ošetřením bFGF při absenci flavopiridolu. IB: HASMC byly ošetřeny bFGF (10 ng/ml), trombinem (2U/ml) nebo vehikulem v přítomnosti nebo absenci flavopiridolu (75 nmol/1) a byla měřena inkorporace BrdU. *p<0,05, ve srovnání s neošetřenými buňkami, **p<0,05, ve srovnání se samotným ošetřením bFGF. fp<0,05, ve srovnání s ošetřením samotným trombinem.
Obr. 2 znázorňuje účinek flavopiridolu na proliferaci HASMC. Kviescentní HASMC byly ošetřeny samotným bFGF (10 ng/ml) (♦), bFGF a flavopiridolem (75 nmol/1) (·) nebo vehikulem () po indikované doby a po ošetření byly stanoveny počty buněk. Výsledky jsou vyjádřeny jako počty buněk na jamku (xlO3).
Obr. 3 znázorňuje účinek flavopiridolu na aktivitu cyklin-dependentní kinázy v HASMC. Kviescentní HASMC byly ošetřeny bFGF (10 ng/1), trombinem (2 U/ml) nebo vehikulem v přítomnosti nebo při absenci flavopiridolu (75 mmol/l), přičemž byla kvantifikována fosforylace histonu Η1 jako měřítko aktivity Cdk a vyjádřena jako procentická aktivita Cdk při absenci ošetření bFGF.
*p<0,05, ve srovnání s neošetřenými buňkami. **p<0,05, ve srovnání s ošetřením samotným bFGF. fp<0,05, ve srovnání s ošetřením samotným trombinem.
Obr. 4 znázorňuje regulaci proteinů vztahujících se k buněčnému cyklu flavopiridolem. Kviescentní HASMC byly ošetřeny v přítomnosti (+) nebo v nepřítomnosti (-) bFGF (10 ng/ml), trom55 binem (10 ng/ml) nebo/a flavopiridolem (75 mmol (1) po dobu 24 hodin. Za použití specifických
-5CZ 300395 B6 protilátek pro cyklin D] (horní řada), PCNA (střední řada) a fosforylovaný (pRb) a hyperfosforylovaný (ppRb) Rb (spodní řada) byl proveden imunoblotting buněčných lyzátů.
Obr. 5 znázorňuje účinky flavopiridolu na aktivitu kinázy MAP v HASMC. Kviescentní HASMC byly ošetřeny v přítomnosti (+) nebo v nepřítomnosti (-) bFGF (10 ng/ml) trombinem (2U/ml), PD98059 (30 pmol/l) nebo/a flavopiridolem (75 nmol/1). Hladiny fosfory lovaného Erkl (pErkl) a Erk2 (pErk2) byly měřeny imunoblottingem s fosforylačně specifickou protilátkou rozpoznávající oba proteiny (horní řada). Aktivita kinázy MAP byla měřena in-gel kinázovým stanovením za použití myelinového bazálního proteinu ve funkci substrátu (spodní řada).
Obr. 6 znázorňuje životnost HASMC po léčení flavopiridolem. Kviescentní HASMC byly ošetřeny flavopiridolem (75 nmol/1), TNF-a (50 ng/ml) nebo vehikulem po uvedené doby. Buněčná životnost byla vyhodnocena za použití vybarvení tryptanovou modří. Získané výsledky jsou vyjádřeny jako procentický podíl živých buněk vztažený na celkový počet buněk.
Obr. 7 znázorňuje inhibicí neointimální tvorby v krysí karotidě po poškození způsobeném balónkovou angioplastikou flavopiridolem. Neointimální/mediální poměry byly měřeny v histologických řezech nebo krysích karotidách neošetřených nebo ošetřených flavopiridolem (5 mg/kg) po dobu 5 dnů po poškození. Artérie byly zkoumány 7 (n=12) a 14(n= 12) dnů po poškození. Rovněž je uveden procentický podíl PCNA-pozitivních nukleí (± SEM, vyjádřeno jako procentický podíl počítaných nukleí) v neointimách arterií pro každý časový úsek a ošetřovanou skupinu. *p<0,05, ve srovnání s ošetřením vehikulem.
Obr, 8 znázorňuje histologické řezy krysích karotid. Řezy jsou získány 7 dní (Obr. 8A a 8B) a 14 dní (Obr. 8C a 8D) po poškození. Artérie zobrazené na Obr. 8A a 8C byly získány z krys ošetřených flavopiridolem (5 mg/kg) podávaným v potravě; artérie na Obr. 8B a 8D byly získány z krys ošetřovaných pouze vehikulem. Řezy jsou na obrázcích zvětšeny lOOkrát.
Obr. 9 znázorňuje expresi Cdk2 po poškození krysích karotid balónkovou angioplastikou. Řezy artérií jsou získány 7 dní (Obr. 9 A a Obr. 9B) a 14 dní (Obr. 9C a Obr.9D) po poškození. Artérie zobrazené na Obr. 9A a Obr. 9C byly získány z krys ošetřených flavopiridolem (5 mg/kg) podávaným v potravě, zatímco artérie zobrazené na Obr. 9B a Obr. 9D byly získány z krys, které byly ošetřeny pouze samotným vehikulem, Cdk2-pozitivní nuklea, nacházející se převážnou měrou na neointimě, se obarví Vektorovou modří za použití alkalickofosfatázové metody. Řezy jsou na obrázcích zvětšeny 1 OOkrát.
Sloučeniny, které se používají podle vynálezu, mohou být připraveny postupy popsanými v patentových dokumentech US 4 900 727 a US 5 284 856. Konkrétní postupy příprav těchto sloučenin jsou uvedeny v příkladových částech těchto patentových dokumentů.
Sloučeniny používané podle vynálezu inhibují proliferaci buněk hladkých svalů. Dalšími předměty vynálezu jsou proto farmaceutické přípravky pro inhibici proliferace buněk hladkých svalů, jejichž podstata spočívá v tom, že obsahují alespoň jednu výše definovanou sloučeninu obecného vzorce I nebo alespoň jednu z jejích farmakologicky přijatelných adičních solí s kyselinami, a použití výše definované sloučeniny obecného vzorce I pro přípravu farmaceutického přípravku mající inhibiční účinek vůči proliferaci buněk hladkých svalů. Typickými aplikačními oblastmi sloučenin podle vynálezu jsou choroby/poruchy/poškození, která jsou doprovázena vaskulámími lézemí buněk hladkých svalů. Velmi důležitým příkladem uvedených stavů jsou léze, ke kterým dochází po poškozeních způsobených balónkovou angioplastikou. Další aplikační oblastí je pre50 vence restenózy po implantaci stentů.
4H-l-Benzopyran^l-onové deriváty se používají podle vynálezu obecně obvyklým způsobem, který je odborníkům v daném oboru znám. Ve farmaceutických přípravcích se používá účinné množství uvedené účinné látky buď samotné, nebo výhodně v kombinaci s vhodnými farmaceu55 tickými pomocnými látkami ve formě tablet, povlečených tablet, kapslí, čípků, suspenzí nebo
-6CZ 300395 B6 roztoků, přičemž obsah účinné sloučeniny činí v uvedených galenických formách až 95 %, výhodně 10 až 75%.
Pro odborníka v daném oboru je zřejmé, které pomocné látky jsou vhodné pro žádoucí formulování farmaceutického přípravku, což pramení z jeho profesionálních znalostí. Vedle pomocných látek pro tablety nebo rozpouštědel, gelotvomých látek a bází pro Čípky a ostatních pomocných látek pro účinnou látku je možné použít například antioxidační činidla, dispergační činidla, emulgační činidla, odpěňovače, látky korigující vůni a chuť, konzervační činidla, solubilizační činidla nebo barvicí přísady.
Uvedená účinná látka může být podávána orálně, parenterálně, intravenózně nebo rektálně, přičemž výhodným podáním je orální podání. Za účelem vytvoření přípravku pro orální podání může být účinná látka smíšena s ostatními přísadami, které jsou vhodné pro daný účel a podání a kterými jsou například pomocné látky, stabilizátory nebo inertní ředidla, přičemž k převedení takto získaných směsí do vhodné aplikační formy se použijí obvyklé postupy, přičemž těmito aplikačními formami jsou zejména tablety, povlečené tablety, tvrdé želatinové kapsle a vodné, alkoholické nebo olejové suspenze nebo roztoky. Příklady použitelných inertních pomocných látek jsou arabská guma, oxid hořečnatý, laktóza, glukóza nebo škrob, zejména kukuřičný škrob.
V tomto kontextu může být formulace připravena jako suché granule nebo vlhké granule. Příklady vhodných olejovitých pomocných látek nebo rozpouštědel jsou rostlinné nebo živočišné oleje, jakými jsou například slunečnicový olej nebo olej z tresčích jater.
Pro subkutánní nebo intravenózní podání se formuluje roztok, suspenze nebo emulze účinné látky za použití pomocných látek, které se pro daný účel konvenčně používají a kterými jsou zejména solubilizační činidla, emulgační činidla a další pomocné látky. Příklady vhodných rozpouštědel jsou voda, fyziologický roztok chloridu sodného nebo alkoholy, například ethanol, propanol nebo glycerol, ale také roztoky cukrů, jakými jsou například roztoky glukózy nebo roztoky mannitolu, nebo směsi různých výše zmíněných rozpouštědel.
Dávka 4H-l—benzopyran-4-onových derivátů, která je určena pro denní podání, bude zvolena tak, aby odpovídala požadovanému účinku. 4H-l-Benzopyran^l-onové deriváty mohou být podány v dávce, která je nižší než 70 %, výhodně nižší než 60 %, zejména nižší než 50 % dávky, která se používá pro kontrolu nádorového růstu u daného savce. Příkladem by byla v rámci myšího modelu „cancer mouše“ s xenoroubem dávka asi 5 mg/kg tělesné hmotnosti podaná orálně jednou denně. Tato dávka je polovinou dávky, která inhibuje u stejného zvířecího modelu nádorový růst (Drees a kol., Clin. Cancer Res. 1997,3:273-279).
Farmakokinetické vlastnosti 4H-l-benzopyran-4—onových derivátů by mohly učinit nezbytným podávat uvedenou sloučeninu několikrát denně anebo použít formulaci s pozvolným uvolňováním účinné látky.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují vlastní rozsah vynálezu, kteiý je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků a obsahem popisné části.
Příklady provedení vynálezu
1. Flavopiridol inhibuje proliferaci buněk hladkých svalů a neointimální tvorbu in vivo v rámci modelu vaskulámího poškození krysí karotidy.
Standardní model poškození krysí karotidy, při kterém je tvorba neointimální léze po katétrem indukovaném poškození je kriticky závislá na proliferaci SMC (Clowes a kol. Lab. invest. 1983, 49:327-333, Clowes a kot, Circ. Res. 1985, 56:139-145) pro zkoumání, zda flavopiridol způsobí zastavení růstu SMC in vivo stejně tak, jako je toho schopen in vitro.
-7CZ 300395 B6
Flavopiridol byl podáván orálně v dávce 5 mg/kg jednou denně, přičemž se sjeho podáváním započne v den, ve kterém došlo k poškození, a pokračuje po dobu čtyř následujících dnů, poněvadž tato časová etapa pokrývá prvotní indukci Cdk2 a první vlnu proliferace SMC při tomto modelu (Circ. Res. 1995, 77:445-465, Circ. Res. 1997, 80:418-426). Střední intimální a mediální oblasti byly kvantifikovány 7 a 14 dnů po uvedeném poškození a neointimální leze byla vyjádřena jako poměr neointimální oblasti k mediální oblasti. V každé ošetřené a neošetřené skupině bylo po dvanácti zvířatech. Uvedený poměr v sedmém dni byl 1,00+/-0,05 v arteriích zvířat ošetřených vehikulem, zatímco tento poměr činil 0,65+/-0,04 v arteriích zvířat ošetřených flavopiridolem, což představuje snížení rovné 35 %. Ve čtrnáctý den byl poměr neointimální/mediální oblast roven 1,08+/-0,04 v arteriích krys ošetřených vehikulem, zatímco stejný poměr činil 0,66+/0,03 v arteriích krys ošetřených flavopiridolem, což představuje snížení rovné 38,9 %. Tyto účinky byly statisticky významné pro oba časové údaje (P<0,05).
Metody
Materiály
Flavopiridol (L86-8275, (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorfenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-methyl)piperidyl]-4H—benzopyran-4—on) byl poskytnut společností Hoechst Marion Russel, lne. a byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu za účelem získání zásobního roztoku s koncentrací 50 mmol/1 pro experimenty s buněčnými kulturami nebo ve vodě za účelem získání zásobního roztoku pro experimenty in vivo. Bazální fibroplastový růstový faktor (bFGF) je komerčně dostupný u společnosti Collaborative Biochemical, zatímco trombin je komerčně dostupný u společnosti New England Biolabs.
Buněčná kultura: buňky hladkého svalu lidské aorty (HASMC - Human Aortic Smooth Muscle Cells) byly získány od společnosti Clonetics a byly kultivovány způsobem popsaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81:24—33. Buňky byly použity při pasážích 5-9. Ještě před provedením experimentů byl růst buněk zastaven při 80% konfluenci po dobu 48 hodin za použití média obsahujícího 0,5 % fetálního bovinního séra.
Měření buněčné proliferace stanovením ELIS A: buněčná proliferace byla měřena stanovením ELIA (Amersham Life Science). HASMC byly kultivovány na želatinou ovrstvených 96 jamkových plotnách a převedeny do kviescentního stavu. Tyto buňky byly potom ošetřeny 10 ng/ml bFGF, 2 U/ml trombinu nebo vehikulem po dobu 24 hodin. Flavopiridol byl podán (75 nmol/1) 1 hodinu před ošetřením růstovým faktorem. 5—brom-2'-deoxyuridin (BrdU) byl přidán k dosažení finální koncentrace 10 pmol/l v průběhu posledních dvou hodin ošetření. Inkorporace BrdU byla měřena způsobem popsaným v Ruef J. a kot, Induction of rat aortic smooth muscle cell growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal, Circulation 1998, 97:10711078. Získané výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnota plus/minus SEM pro 12 vzorků při dvou nezávislých experimentech.
Počítání buněk: růstově zastavené buňky HASMC narostlé do 50% konfluence na 6-jamkových plotnách byly ošetřeny nebo neošetřeny flavopiridolem (75 mmol/l) nebo bFGF (10 ng/ml). V intervalech po ošetření byly buňky trypsinizovány a počty buněk byly stanoveny za použití hemocytometru.
Analýza Western blot: Kviescentní buňky HASMC byly ošetřeny nebo neošetřeny růstovým faktorem nebo/a flavopiridolem, jak to již bylo uvedeno. Analýza Western blot byla provedena způsobem popsaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth Ín ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81:24-33. Primárními protilátkami byly: polyklonální protilátka anti-humánního cyklinu Dl (M-20, Santa Cruz), monoklonální protilátka anti-humánního jádrového antigenu proliferace buněk (PCNA) komerčně dostupná u společnosti Sigma pod označe-8CZ 300395 B6 ním PC 10, monoklonální protilátka fosforylačně specifické p44/42 (Erkl/Erk2) kinázy MAP (New Englang Biolabs) a monoklonální protilátka anti-Rb (G3-245, Pharmigen), které jsou specifické pro fosforylované (pRb) a vysoce fosforylované (ppRb) druhy Rb. Při imunoblottingových studiích byly experimenty prováděny alespoň třikrát.
Aktivita Cdk: Kviescentní buňky HASMC byly ošetřeny agonisty a inhibitory po dobu 24 hodin, přičemž celkové buněčné lyzáty byly připraveny způsobem uvedeným v souvislosti s analýzou Western blot. Kinázová stanovení byla provedena za použití soupravy Histone 1^ kinase assay kit (Upstate Biotechnology) podle instrukcí výrobce. Stručně specifikováno: 10 μΐ peptidového io inhibitoru pro protein kinázu C (2 pmol/l) a protein kinázu A (2 pmol/l), 100 pg buněčného lyzátu, 10 μΙ testového pufru a 10 μΐ směsi obsahující 75 pmol/l chloridu hořečnatého, 500 pmol/l
ATP a 1 pCi/ml [γ-32Ρ] ATP se smísí v mikroodstředivkové kyvetě. Po inkubaci při teplotě 30 °C po dobu 10 minut se odpipetují alikvoty na fosfocelulózové papíry. Tyto papíry se promyjí v 0,75% kyselině fosforečné, načež se změří rozpady za minutu ve scint i lačním čítači (Beckman).
Získané výsledky jsou vyjádřeny jako plus/minus SEM pro tři vzorky, přičemž výsledky jsou získány ze tří nezávislých měření.
Kinázové stanovení in-gel: Kviescentní buňky HASMC byly ošetřeny růstovým faktorem po dobu 30 minut, načež se připraví celkové buněčné lyzáty způsobem, který již byl popsán v sou20 vislosti s analýzou Western blotting. V některých experimentech byly buňky HASMC předběžně zpracovány po dobu 60 minut 30 pmol/l PD98059, flavopiridolem nebo vehikulem. Stejná množství proteinu (50 pg/linie) byla rozpuštěna na polyakrylamidovém gelu, který byl kopolymerován s 350 pg/ml myelinového bazálního proteinu. Tento gel byl potom ošetřen [γ-32P] ATP a podroben autoradiografii způsobem popsaným v Ruef J. a kol., Induction of rat aortic smooth muscle cell growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal, Circulation 1998, 97:10711078.
Vybarvení trypanovou modří: Buňky HASMC byly kultivovány v 5 cm Petriho miskách při nízké konfluenci a zastaveném růstu již výše popsaným způsobem. Tyto buňky byly potom ošetřeny flavopiridolem (75 nmol/1) nebo nádorovým nekrózním faktorem-α (TNF-a; 50 ng/ml) po uvedené doby. Po odstranění média se do Petriho misek přidá 0,4% trypanová modř ve fosfátem pufrováném fyziologickém roztoku. Po 5 minutách se buňky v Petriho miskách spočítají pod mikroskopem. Modré buňky jsou počítány jako buňky neživé.
Model poškození krysí karotidy: Poškození krysí karotidy bylo v podstatě provedeno způsobem popsaným v Clowes AW a kol., Kinetics of cellular proliferation after arterial injury, Lab. Invest. 1983, 49:327-333. Dospělí krysí samečkové Sprague-Dawley (tělesná hmotnost 400 až 500 g, Zivic-MÍIler) bylí anestetizování intraperitoneální injekcí ketaminu (2 mg/kg) a xylazinu (4 mg/kg). Levá vnitřní karotida byla potom kanulována embolektomickým katétrem 2F. Baló40 nek byl nafouknut fyziologickým roztokem a tažen třikrát skrze artérii s cílem vytvořit rozšířené a obnažené poškození. Pravá karotida se nepoškodí a slouží jako kontrolní subject pro každé zvíře. Bezprostředně po probrání se zvířat z anestezie a potom ještě po dobu čtyř následujících dnů byl krysám v potravě podáván flavopiridol (5 mg/kg ve vodě) nebo pouze voda jako slepý pokus. Všechny krysy zákrok přežily a nejevily žádnou známu otravy po podání účinné látky při použitých dávkách. Ve specifikovaných časových intervalech po poškození karotidy byly krysy anestetizovány výše uvedeným způsobem a podrobeny perfuzně fixní systemické infuzi 4% paraformaldehydem ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku. Pravá i levá karotida byly vyjmuty a rozšířeny injekcí 4% paraformaldehydu skrze průsvit artérie, načež byly dehydratovány a přechovávány v 70% ethanolu při teplotě 4 °C.
Imunohistochemie byla provedena způsobem popsaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81:24-33 za použití monoklonální protilátky PCN A a polyklonální anti-humánní protilátky Cdk2 (M2-G, Santa Cruz).
-9CZ 300395 B6
Obrazová analýza: Okrajové distální a proximální oblasti každé artérie byly odstraněny (přibližně 500 pm). Z každé artérie bylo analyzováno deset intermediámích průřezů (každý 8 pm) odebraných 500 pm od sebe. Řezy byly fixovány a obarveny hematoxylinem a eosinem způsobem popsaným y Ruef J. a kol, Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81:24-33. Za použití mikroskopu Nikon Diaphot 300 a 4 násobného objektivu byl každý průřez artérií zaznamenán jako digitální obraz pomocí videokamery Hamamatsu C5985 a TCPro 2.41 (Coreco, Inc.). Mediální a neointimální oblasti byly stanoveny za použití softwaru NIH Image. hranice mediálních a neointimálních oblastí byly stanoveny jedním prohlížečem (A. M) a ověřeny slepou zkouškou pomocí druhého prohlížeče (C. P.). Velikost léze io byla vyjádřena jako neointimální/mediální poměr. Výsledky pro každou skupinu byly vyjádřeny jako střední plus/minus SEM. 92 % nebo ještě více obrazů každé skupiny bylo interpretovatelných; zbylé obrazy byl poznamenány pozměněnou strukturou buněk a nebyly analyzovány.
Statistická analýza: V případech, kdy to bylo vhodné, byly údaje z kvantitativních studií vyjádře15 ny jako střední plus/minus SEM. U násobně ošetřených skupin byl použit faktoriál ANOVA a následný test alespoň jedné významné Fischerovy diference. Statistický význam byl akceptován při p<0,05.
Výsledky
Flavopiridol inhibuje prolíferaci buněk HASMC: na základě schopnosti flavopiridolu inhibovat prolíferaci různých nádorových buněčných řad byla testována hypotéza spočívající vtom, že flavopiridol by mohl blokovat také růst primární kultury lidských SMC. Růstově zastavené buňky HASMC byly ošetřeny za použití SMC mitogenu bFGF (10 ng/ml) po dobu 24 hodin v přítomnosti rostoucích koncentrací flavopiridolu a proliferace byla měřena stanovením na bázi ELISA. Ve srovnání s neošetřenými buňkami byla proliferace buněk ošetřených bFGF zvýšena 5,4 krát (Obr. 1). Předběžné jednohodinové ošetření za použití pouze 50 nmol/1 flavopiridolu významně snížilo prolíferaci buněk HASMC (na 3,9 krát, p<0,05).
Stejné výsledky byly získány za použití absorpce thymidinu, které představuje nezávislé měření syntézy DNA (nezobrazeno).
Za účelem testování obecného aspektu účinků flavopiridolu na prolíferaci SMC byl zkoumán jeho účinek na mitogenezi indukovanou trombinem (2 U/min), který působí na s G proteinem kopulovaný receptor, na rozdíl od bFGF, který stimuluje člen skupiny receptorů tyrosin kinázy. Flavopiridol (75 nmol/1) významně a potentně inhibuje jak prolíferaci buněk HASMC indukovanou bFGF, tak i prolíferaci indukovanou trombinem 5,4krát versus 1,8krát resp. 2,4 krát versus 0,7krát (p<0,05, Obr. IB). Bylo provedeno počítání buněk s cílem potvrdit, že účinek flavopiridolu na průběh buněčného cyklu u buněk HASMC skutečně odráží změny v prolíferaci. bFGF (10 ng/ml) indukoval trojnásobné zvýšení počtu buněk po třech dnech ošetření (Obr. 2). Shodně s výsledky získanými při stanovení na bázi ELISA flavopiridol (75 nmol/1) účinně blokuje proliferaci indukovanou bFGF.
Flavopiridol inhibuje aktivitu Cdk a genovou expresi související s buněčným cyklem u buněk
HASMC: s cílem vyhodnotit specifický účinek flavopiridolu na mechanismus buněčného cyklu byla měřena histon Hl kinázová aktivita v buněčných lyzátech z buněk HASMC stimulovaných růstovým faktorem. Fosforylace histonu Hl je indikátorem aktivit Cdc2 a Cdk2. Ošetření buněk HASMC faktorem bFGF a trombinem má za následek 4,4násobné resp. 3,6násobné zvýšení histon Hl kinázové aktivity (Obr. 3). Tato zvýšení aktivity cyklin-dependentní kinázy byla zcela blokována předběžným ošetřením flavopiridolem (75 nmol/1).
Použitím analýzy Western blot bylo rovněž zkoumáno, zda flavopiridol ovlivňuje růstovým faktorem indukovanou regulaci proteinů souvisejících s buněčným cyklem u buněk HASMC. Cyklin D| je Gi fázový cyklin, který je směrem vzhůru regulován stimulací růstovým faktorem a rychle odbourán v průběhu odvedení z buněčného cyklu. Hladiny proteinu cyklin Dl byly regulovány
-10CZ 300395 B6 směrem vzhůru 6,3krát resp. 2,2krát v odezvu na ošetření faktorem bFGF a trombinem po dobu 24 hodin (Obr. 4), což je účinek, který by mohl být zcela blokován předběžným zpracováním flavopiridolem. Stejně tak zvýšená exprese PCNA, který je převážně syntetizován v průběhu fáze S buněčného cyklu souběžně s replikací DNA, byl rovněž blokován předběžným ošetřením flavo5 piridolem. Jako finální aspekt proteinů souvisejících s buněčným cyklem byla zkoumána fosforylace Rb v odezvu na expresi růstového faktoru za použití protilátky specifické pro fosfory 1 ováný Rb. Rb je regulátor buněčného cyklu, který se váže na transkripční faktor E2F a inaktivuje transkripční faktor E2F, když je Rb v nefosforylovaném stavu, a indukuje zastavení růstu SMC in vivo. Fosforylace inaktivuje Rb a umožňuje průběh fáze S buněčného cyklu. Analýza fosforylace io Rb je obzvláště relevantní vzhledem k tomu, že Rb je cílem Cdk2 a Cdk4 in vivo. Jak tromb in, tak i faktor bFGF indukuje hyperfosforylaci Rb, což je účinek, který byl inhibován flavopiridolem. Společně tyto výsledky ukazují, že flavopiridol ovlivňuje expresi a aktivitu Gi a regulačních prvků buněčného cyklu souvisejících s fází S tohoto cyklu u buněk HASMC a má takto růstově inhibiční účinky.
Flavopiridol nemá účinek na fosforylaci nebo aktivitu kinázy MAP: S cílem ujistit se, že flavopiridol působil specificky v úrovni buněčného cyklu a nikoliv nespecificky na horní část kinázového schématu, byla měřena fosforylace a aktivita Erkl (p44 MAP kináza) a Erk2 (p42 MAP kináza), což jsou dva členy skupiny kinázy MAP. Pro uvedené měření byly zvoleny kinázy vzhledem ktomu, že se nachází bezprostředně před transkripčními ději, ke kterým dochází v odezvu na růstové stimuly, a bezprostředně za řadou kritických mitogenních signálních cest. Nedotčená odezva kinázou MAP ukazuje, že jsou nedotčeny také předcházející mitogenní cesty. Byl měřen fosforylační statut Erkl a Erk2 za použití monoklonální protilátky, která specificky rozpoznává fosforylované a tudíž aktivované formy. Jako kontrolní subjekt při těchto experimen25 těch byl použit PD98059, což je potentní a selektivní inhibitor aktivace kinázy MAP. Po ošetření buněk HASMC trombinem a faktorem bFGF po dobu 30 minut byla ve srovnání s neošetřenými buňkami detekována zvětšená množství fosforylovaných Erkl a Erk2 (Obr. 5, horní řada). Fosforylace Erkl a Erk2 jak trombinem, tak i faktorem bFGF byla blokována předběžným ošetřením za použití PD98059, avšak nikoliv flavopiridolu. S cílem potvrdit tato zjištění byla měřena aktivita Erkl a Erk2 kinázovým stanovením in-gel (Obr. 5, spodní řada). Znovu bylo nalezeno, že aktivity Erkl a Erk2 byly zvýšeny v odezvu na trombin a faktor bFGF, což je účinek, který byl inhibovatelný produktem PD98059, avšak nikoliv flavopiridolem. Tyto experimenty společně s experimenty, jejichž výsledky jsou zobrazeny na Obr. 3 a Obr. 4, poskytují důkaz toho, že účinky flavopiridolu na proliferaci buněk HASMC jsou způsobeny specifickým zastavením mecha35 nismu buněčného cyklu blokováním aktivity Cdk, aniž by přitom byly ovlivněny předcházející signální děje.
Flavopiridol nesnižuje životnost buněk HASMC: dřívější studie týkající se aktivity flavopiridolu v ostatních typech buněk prokázaly, že v závislosti na buněčné řadě může flavopiridol buď indu40 kovat zastavení růstu aniž by při tom ovlivnil životnost buněk, nebo může způsobit apoptózu. Bylo proto nyní zjišťováno, zda flavopiridol snižuje životnost buněk HASMC, tím, že byla provedena vybarvení vzorků buněčné kultury trypanovou modří v různých časových okamžicích po léčení. Kviescentní buňky HASMC byly ošetřeny flavopiridolem (75 nmol/1), vehikulem nebo TN'F-a (50 ng/ml), což je cytokin, o kterém je známo, že indukuje apoptózu u tohoto typu buněk.
Zatímco TNF-α potentně snížil životnost buněk HASMC, což mělo za následek smrt v podstatě všech buněk po 24 hodinách, neměl flavopiridol takový účinek (Obr. 6). Bylo zjištěno, že za použití vyšších koncentrací a delších inkubačních dob může dojít k určitému snížení životnosti buněk v přítomnosti flavopiridolu (není zobrazeno). Nicméně za podmínek testu flavopiridol především indukuje zastavení růstu buněk, aniž by přitom ovlivnil životnost SMC.
Flavopiridol inhibuje proliferaci buněk hladkých svalů a neointimální tvorbu in vivo v modelu vaskulámího poškození krysí karotidy: byl použit zavedený model poškození krysí karotidy, ve kterém je tvorba neointimální leze po poškození indukovaným katétrem kriticky závislá na proliferaci SMC s cílem zkoumat, zda flavopiridol indukuje zastavení růstu SMC in vivo, pakliže je toho schopen in vitro. Flavopiridol byl podáván v dávce 5 mg/kg jednou denně, přičemž se
- 11 CZ 300395 B6 s podáním započne v den poškození a v podávání se pokračuje ještě po dobu čtyř následujících dnu, poněvadž tento časový interval pokrývá v tomto modelu prvotní indukci Cdk2 a první vlnu proliferace SMC. Kvantifikují se střední intimální a mediální oblasti 7 a 14 dnů po poškození, přičemž rozsah neointimální leze se vyjádří jako poměr neointimální oblasti k mediální oblasti.
V každé ošetřené a neošetrené skupině bylo dvanáct zvířat. Neointimální/mediální poměr v sedmém dnu činil l,00±0,05 v artériích krys ošetřovaných vehikulem a 0,65±0,04 v artériích ošetřovaných flavopiridolem, což představuje snížení rovné 35,0 % (Obr. 7). Ve čtrnáctý den činil neointimální/mediální poměr 1,08±0,04 u krys ošetřených vehikulem a 0,66±0,03 u krys ošetřených flavopiridolem, což představuje snížení rovné 38,9 %. Tyto výsledky byly statisticky významné io v obou uvedených časových údajích (p<0,05). Reprezentativní arteriální řezy jsou zobrazeny na
Obr. 8.
Za účelem přímého prokázání, že flavopiridol inhibuje proliferaci buněk hladkých svalů, byly řezy pro expresi PCN A v reprezentativních oblastech z každé artérie vybarveny a byl stanoven procentický podíl PCNA-pozitivních nukleí vneointimě. Sedmý den bylo 31,1 ±7,2% nukleí v poškozených artériích neošetřených krys PCNA-pozitivní, zatímco pouze 11,8±1,5 % poškozených artérií krys ošetřených flavopiridolem bylo PCNA-pozitivní (Obr. 7; p<0,05). Čtrnáctý den byla PCNA-pozitivní nuklea přítomna v 10,4±2,0 % neointimálních buněk u ošetřených poškozených krysích artérií, avšak v pouze 4,2±0,5 % neointimálních buněk u neošetřených krysích artérií (p<0,05). (PCNA-pozitivní nuklea byla zřídka pozorována u nepoškozených artérií, a to bez ohledu na typ ošetření). Podobně byly Cdkr-pozitivní buňky mnohem méně běžné v neointimě krys ošetřených flavopiridolem (Obr. 9, řada A a C) a to ve srovnání s artériemi neošetřených krys (řada B a D) jak 7 dnů, tak i 14 dnů po poškození.
Diskuze
V uvedených studiích bylo zkoumáno, zda nový Cdk inhibitor, kterým je flavopiridol představující nejpotentnější a specifický inhibitor Cdk, je vhodným kandidátem pro inhibici proliferace SMC in vivo, obzvláště doprovázející vaskulámí poškození. Pro tyto studie poskytly racionální základ dřívější pokusy zasáhnout terapeuticky do mechanismu buněčného cyklu za účelem léčení vaskulámích onemocnění; nicméně metody použité za tímto účelem spočívaly v technologii přenosu genů použité s cílem inhibovat průběh buněčného cyklu. V současnosti klinickému použití těchto technik však brání zatím nepřekonatelné překážky. V průběhu studií souvisejících s touto přihláškou vynálezu bylo publikováno, že CVT-313, což je nedávno identifikovaná sloučenina, která má rovněž Cdk inhibiční vlastnosti, avšak při mikromolámích koncentracích, může rovněž inhibovat neointimální tvorbu; bylo však nezbytné, aby CVT-313 byl zaveden do karotidy v době, ve které dochází k poškození, aby se dosáhlo požadovaného účinku. Na rozdíl od toho bylo v rámci této přihlášky vynálezu prokázáno, že flavopiridol v případě, že je podán orálně, může potentně inhibovat neointimální tvorbu, a to v míře, která je srovnatelná s mírou účinku ostatních relevantních klinických činidel. Tato orální účinnost flavopiridolu je mezi činidly, o kterých je známo, že jsou účinná ve zvířecích modelech vaskulámího poškození, výjimečná. Selektivita, potence a snadnost podání činí z flavop i ridolu znamenitého kandidáta pro zkoumání terapeutických výsledků inhibice buněčného cyklu in vivo u humánních vaskulámích lézí.
Bylo určeno podávat flavopiridol orálně v koncentraci, která je rovna (5 mg/kg) polovině koncentrace, která inhibuje nádorový růst u xenoroubů modelu cancer mouše, Je pozoruhodné, že flavopiridolové koncentrace 75 nmol/1 mají za následek téměř úplnou inhibici proliferace SMC, přičemž střední koncentrace v krevním séru rovné 425 nmol/1 byly dosaženy v dávkách, které leží pod prahem toxicity ve fázi I studií týkajících se léčení těžce léčitelných lidských karcinomů.
Výsledky získané v rámci této přihlášky vedou k závěru, že při potlačení vaskulámích onemocnění, mezi které patří restenózy, mohou být účinné mnohem nižší dávky inhibitorů buněčného cyklu, než jaké jsou dávky použité v rámci neoplazie, a při dosažení zvýšené tolerability.
I když se podařilo prokázat, že flavopiridol indukuje zastavení buněčného růstu bez ovlivnění životnosti buněk HASMC v buněčné kultuře a že dochází ke snížení neointimální tvorby po léče-12CZ 300395 B6 ní flavopiridolem, nepodařilo se dosáhnout jistoty v tom, že zastavení buněčného cyklu je jediným faktorem omezujícím neointimální tvorbu u lézí karotidy. Flavopiridol je schopen indukovat zastavení buněčného růstu, a to při současném indukování nebo bez současného indukování apoptózy, a to v závislosti na pozorovaném typu buněk. Je zajímavé, že flavopiridol inhibuje apoptózu u buněk PC 12, které byly terminálně diferenciované a také indukuje apoptózu u nediferenciovaných buněk PC 12, kteréjsou proliferující. I když experimenty provedené v rámci této přihlášky vynálezu byly provedeny za podmínek, které by napodobovaly fenotyp SMC před poškozením, je možné, že SMC mohou mít odlišnou odezvu na flavopiridol po poškození a že unich může dokonce dojít k apoptóze. Zatímco role apoptózy u vaskulárních lézí je nejasná, io indukuje exprese ligandů Fas v SMC apoptózu a blokuje neointimální tvorbu u králíků po poškození způsobeném balónkovou angioplastikou, což vede k závěru, že, jestliže flavopiridol skutečně indukuje apoptózu SMC in vivo, jako je tomu u proliferujících buněk PC 12, potom může jít o užitečný jev v kontextu neointimální tvorby. I ostatní mechanismy mohou rovněž přispívat k účinkům flavopiridolu na tvorbu lézí. Tak například antimediátorová oligodeoxynukleotidem mediovaná inhibiee buněčného cyklu zlepšuje endoteliální funkci u králičího žilní ho roubu. Za účelem objasnění účinků flavopiridolu, odlišných od zastavení růstu buněk na SMC in vivo, bude ještě nezbytné realizovat další doplňující studie.
Vzhledem k demonstrované roli proliferace SMC při tvorbě lézí po poškození krysí karotidy je zajímavé uvést, že přes výrazné účinky flavopiridolu in vitro, byla jeho schopnost inhibovat neointimální tvorbu (i když významná) skromnější za podmínek experimentů in vivo. Pro toto pozorování bylo zvažováno několik vysvětlení. Je nepravděpodobné, že by k urychlené proliferaci SMC docházelo po ukončení podávání flavopiridolu, neboť rozdíly v proliferačních indexech jsou trvalé v průběhu 14 dnů po poškození (Obr. 7 a Obr. 9). Je přijatelnějším vysvětlením, že buď i další složky tvorby léze, jakými jsou SMC migrace a produkce extracelulámí matrice, také přispívají k tvorbě léze, a to dokonce i při absenci významné proliferace SMC, nebo že dodávka flavopiridolu jednou denně je nedostatečná k úplnému zastavení proliferace v uvedeném modelu. Nedávno zjištěné údaje ukazující, že biologický poločas flavopiridolu činí pouze 2,5 hodiny vede k závěru, že pravděpodobně bude správnější spíše druhá z uvedených hypotéz. Provedením dal30 ších studií bude možné zjistit pravděpodobně ještě účinnější dávkový režim.
Získané výsledky ukazují, že flavopiridol je schopen inhibovat proliferaci SMC a tudíž i neointimální tvorbu v obecně uznávaných malých zvířecích modelech vaskulámího onemocnění. Je třeba zdůraznit, že relevance inhibiee proliferace SMC je diskutabilní u lidských vaskulárních lézí a může se lišit v závislosti na charakteru léze a na době, při které se provádí pozorování proliferace. Proliferační index SMC u humánních atheroktomických vzorků je pozoruhodně nízký, i když tyto vzorky nemusí odrážet proliferační změny v časnějších a kritičtějších stádiích rozvoje lézí. Kromě toho arteriální remodeling nezávislý na neointimálním růstu může být zodpovědný za významnou míru luminální obstrukce po angioplastice u lidí. Na rozdíl od toho, jsou indexy mitotické aktivity u SMC mnohem vyšší (25 % PCNA-pozitivních subjektů) v atheroktomických vzorcích lidských lézí s restenózou indukovanou zavedením stentů, což je konzistentní s přijatou rolí SMC hyperplazie, avšak nikoliv remodelingu. Vzhledem k tomu, že dochází k rostoucímu počtu aplikací stentů a tedy i k rostoucímu počtu klinických problémů souvisejících s restenózami po zavedení stentů, existuje potřeba mít k dispozici účinný prostředek k zastavení SMC hyperplazie a neointimální tvorby. Poněvadž flavopiridol je potentní orálně biodostupná účinná látka se specifickou Cdk-inhibiční účinností a poněvadž je známo, že dávky flavopiridolu jsou bezpečné pro lidské pacienty, může být flavopiridol považován za farmakologického kandidáta pro prevenci restenóz u lidí spojených se zavedením stentů.
Metody a výsledky
Při použití kultivovaných lidských buněk hladkého svalu aorty bylo zjištěno, že flavopiridol v koncentraci pouze 75 nmol/1 má za následek téměř úplnou inhibicí proliferace indukovanou bazálním fíbroblastovým růstovým faktorem a trombinem. Při uvedené dávce flavopiridol inhi55 boval aktivitu cyklin-dependentní kinázy, což bylo potvrzeno měřením histon H) fosforylace,
- 13CZ 300395 B6 avšak neměl vliv na aktivaci MAP kinázy. Flavopiridolem byla rovněž blokována indukce proteinů cyklin D] souvisejících s buněčným cyklem, jádrového antigenu proliferujících buněk a fosforylovaného retin ob lastomového proteinu. Flavopiridol neměl žádný účinek na životnost buněk. S cílem testovat, zda flavopiridol má obdobnou účinnost in vivo v případě, že je podáván orálně, byla zkoumána neointimální tvorba v krysích karotidách po poškození balónkovou angioplastikou. Flavopiridol (5 mg/kg) podávaný v potravě redukoval neointimální oblast o 35 a 39 % 7 resp. 14 dnů po poškození.
Závěry
Flavopiridol inhibuje SMC růst in vitro a in vivo. Jeho orální biodostupnost a selektivita pro cyklin—dependentní kinázy z něj činí potenciální terapeutický nástroj při léčení SMC vaskulárních lézí.

Claims (7)

1. Použití 4-H-l-benzopyran—4-onového derivátu vzorce I ve kterém
25 R] znamená atom vodíku, alkyl mající 1 až 6 uhlíkových atomů, aryl-Ci-C4-alkylovou skupinu; C]-C6-alkylovou skupinu substituovanou halogenem, hydroxyskupinou nebo karboxyskupinou; C^Cft-cykloalkýlovou skupinu, pyridylovou skupinu, thienylovou skupinu, C3-C6cykloalkyl-Ci^C4-alkýlovou skupinu, C2-C6-alkenylovou skupinu, C2-C6-alkynylovou skupinu, fenylovou skupinu; fenylovou skupinu mono- nebo polysubstituovanou halogenem, C1-C4—alky30 lovou skupinou, Ci-C4-alkoxyskupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COOalkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluormethylovou skupinou, aminoskupinou,, Ci-C4-alkylaminoskupinou, diC1-C4-alkylaminoskupinou nebo fenylovou skupinou; naftylovou skupinu, karboxylovou skupinu, skupinu -CHO, COO-C|-C4-alky lovou skupinu, primární aminoskupínu, alky lam i no skup i35 nu, aralkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, amidoskupinu, aryl aminoskupínu, diarylaminoskupinu nebo -CH20-Ci-C4-alkylovou skupinu,
R2 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu mající 1 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupínu, di-Ci-C4-alkylaminoskupinu, halogen, hydroxylovou skupinu,
40 alkoxyskupinu, skupinu -COOH, -COO-Cj-C4-alkylovou skupinu, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH nebo -CH2O-Ci-C4-alkylovou skupinu,
-14CZ 300395 B6
R3 znamená atom vodíku, Ci-C4-alkylovou skupinu; Ci-C4-alkylovou skupinu substituovanou halogenem, hydroxyskupinou nebo karboxyskupinou; hydroxylovou skupinu, karboxylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, Ci-C4-alkylaminoskupinu, di-C]-C4-alkylaminoskupinu, halogen, -O-alkyl-C(O)-alkýlovou skupinu, -CHO, -CH2OH, -C'H20-<’|-C4-alkylovou
5 skupinu nebo skupinu R2N-C(O)-O-, ve které R znamená H, C]-C4-alkylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu nebo O-alkyl-C(O)~alkýlovou skupinu, nebo arylovou skupinu,
R4 znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu, C1-C4-alkoxyskupinu, Ci-C4-alkanoyloxyskupinu, C|-C4-alkoxykarbonylovou skupinu, aryloxyskupinu, aminoskupinu, Ci-C4—alkyl10 aminoskupinu, di- Ci-C4-alkylaminoskupinu nebo skupinu R'2-N-C(O)-O-, ve které R' znamená H, Ci-C6-alkylovou skupinu, cykloalkýlovou skupinu nebo arylovou skupinu,
R5 znamená atom vodíku, Ci-Cfc-alkylovou skupinu, aryl- C)-C4-alkylovou skupinu, C3-C6cykloalkylovou skupinu, C3-C6-cykloalkyl- Ci-C4-a1kylovou skupinu, alkylaminoskupinu, Ct15 C4-alkanoylovou skupinu, -C(O)-O- C|-C4-alkylovou skupinu nebo aroylovou skupinu, přičemž aryiová skupina v Rb R2, R3, R4 a R5 znamená nesubstituovanou fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu, kteráje mono- nebo polysubstituovaná halogenem, Ci-C4-alkylovou skupinu, C|-C4-alkoxyskupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou,
20 trifluormethylovou skupinou, aminoskupinou, Ci-C4-alkylaminoskupinou, di- C|-C4-alkylaminoskupinou nebo fenylovou skupinou m znamená celé číslo mezi 0 a 3 a
25 n znamená 1, nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou pro výrobu léčiva pro inhibici proliferace buněk hladkých svalů, přičemž dávkování sloučeniny vzorce I je méně než 70 %, výhodně méně než 60 %, zejména méně než 50 % dávkování, které by bylo nezbytné pro kontrolu nádoro30 vého růstu.
2. Použití podle nároku 1, při kterém je 4—H-l-benzopyran-4-onovým derivátem sloučenina vzorce Ia (fe),
35 ve kterém
Ri znamená atom vodíku, C]-C3-alkylová skupina, naftylová skupina, fenylová skupina, fenylová skupina mono- nebo polysubstituovaná halogenem, Ct-C4-alkylovou skupinou, C)-C4alkoxyskupinou, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou,
40 skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluormethylovou skupinou, aminoskupinou, Ci-C4-alkylaminoskupinou, di-Ci-C4-alkylaminoskupinou nebo fenylovou skupinou; pyridylovou skupinu nebo thienylovou skupinu,
-15CZ 300395 B6
R2 znamená atom vodíku nebo C]-C3-alkylovou skupinu;
R5 znamená C)-C3-alkylovou skupinu, C3-C5~cykloalky lovou skupinu nebo C3-C5-cykloalkyl- C]-C4-alkylovou skupinu.
3. Použití podle nároku 2, při kterém substituenty vzorce Ia mají následující významy:
R] znamená fenylovou skupinu, thienylovou skupinu, pyridylovou skupinu, chlorfenylovou skupinu, dichlorfenylovou skupinu, methylfenylovou skupinu, aminofenylovou skupinu, bromfenylovou skupinu, hydroxyfenylovou skupinu nebo naftylovou skupinu;
r2 znamená atom vodíku a
R5 znamená methylovou skupinu.
4. Použití podle nároku 1, při kterém 4-H-l-benzopyran-4~onovým derivátem je (-)-cis-5,7d ihydroxy-2-(2-ch 1 orfenyl )-8-[4-(3-hydroxy-1-methy l)piperidy!]-4 H-benzopyran-4-on (Flavopiridol).
5. Použití podle některého z nároků 1 až 4, při kterém je léčivo určeno pro léčení vaskulámích lézí buňkami bohatých hladkých svalů.
6. Použití podle některého z nároků 1 až 4, při kterém je léčivo určeno pro léčení lézí po poškození balónkovou angioplastikou.
7. Použití podle některého z nároků 1 až 4, při kterém je léčivo určeno pro léčení pacientů po implantaci stentů.
CZ20012804A 1999-02-01 2000-01-18 Lécivo pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu CZ300395B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24338099A 1999-02-01 1999-02-01
US09/468,665 US6399633B1 (en) 1999-02-01 1999-12-21 Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20012804A3 CZ20012804A3 (cs) 2002-08-14
CZ300395B6 true CZ300395B6 (cs) 2009-05-06

Family

ID=22918541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20012804A CZ300395B6 (cs) 1999-02-01 2000-01-18 Lécivo pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu

Country Status (38)

Country Link
US (1) US6399633B1 (cs)
EP (1) EP1150746B1 (cs)
JP (1) JP4755759B2 (cs)
KR (1) KR100793047B1 (cs)
CN (1) CN1219556C (cs)
AP (1) AP1469A (cs)
AR (1) AR042569A1 (cs)
AT (1) ATE275428T1 (cs)
AU (1) AU777368B2 (cs)
BG (1) BG65151B1 (cs)
BR (1) BR0007911A (cs)
CA (1) CA2360668C (cs)
CR (1) CR6448A (cs)
CZ (1) CZ300395B6 (cs)
DE (1) DE60013555T2 (cs)
DK (1) DK1150746T3 (cs)
EA (1) EA004786B1 (cs)
EE (1) EE04851B1 (cs)
ES (1) ES2226792T3 (cs)
HK (1) HK1042445B (cs)
HR (1) HRP20010521A2 (cs)
HU (1) HU229263B1 (cs)
ID (1) ID30180A (cs)
IL (1) IL144668A (cs)
ME (1) MEP10508A (cs)
NO (1) NO330512B1 (cs)
NZ (1) NZ512822A (cs)
OA (1) OA11755A (cs)
PL (1) PL197693B1 (cs)
PT (1) PT1150746E (cs)
RS (1) RS50242B (cs)
SI (1) SI1150746T1 (cs)
SK (1) SK286747B6 (cs)
TR (1) TR200102223T2 (cs)
TW (1) TWI273907B (cs)
UA (1) UA73110C2 (cs)
WO (1) WO2000044362A2 (cs)
ZA (1) ZA200105596B (cs)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0102480D0 (en) * 2001-01-31 2001-03-14 Cyclacel Ltd Marker
PL211300B1 (pl) * 2002-04-17 2012-05-31 Cytokinetics Inc Związek i kompozycja zawierająca ten związek
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
US20040106647A1 (en) * 2002-06-28 2004-06-03 Schneider Michael D. Modulators of Cdk9 as a therapeutic target in cardiac hypertrophy
US20040082613A1 (en) * 2002-06-28 2004-04-29 Schneider Michael D. Modulators of Cdk9 as a therapeutic target in cardiac hypertrophy
EP1539234A4 (en) * 2002-09-05 2006-02-15 Medimmune Inc METHODS OF PREVENTING OR TREATING CELLULAR MALIGNITES BY ADMINISTERING CD2 ANTAGONISTS
US8034831B2 (en) 2002-11-06 2011-10-11 Celgene Corporation Methods for the treatment and management of myeloproliferative diseases using 4-(amino)-2-(2,6-Dioxo(3-piperidyl)-isoindoline-1,3-dione in combination with other therapies
US7563810B2 (en) 2002-11-06 2009-07-21 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases
EP2316487B1 (en) 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof
JP4934426B2 (ja) 2003-08-18 2012-05-16 メディミューン，エルエルシー 抗体のヒト化
US20060228350A1 (en) * 2003-08-18 2006-10-12 Medimmune, Inc. Framework-shuffling of antibodies
EP2422811A2 (en) 2004-10-27 2012-02-29 MedImmune, LLC Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
JP5153613B2 (ja) 2005-03-18 2013-02-27 メディミューン，エルエルシー 抗体のフレームワーク・シャッフル
KR20080025174A (ko) 2005-06-23 2008-03-19 메디뮨 인코포레이티드 응집 및 단편화 프로파일이 최적화된 항체 제제
WO2007010342A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Sahajanand Biotech Private Limited Implantable medical devices comprising a flavonoid or derivative thereof for prevention of restenosis
JP2008255008A (ja) * 2005-07-19 2008-10-23 Tokyo Medical & Dental Univ 滑膜細胞増殖抑制剤
NZ566180A (en) * 2005-07-29 2011-04-29 Resverlogix Corp Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of complex diseases and their delivery by insertable medical devices
JP5209625B2 (ja) 2006-08-28 2013-06-12 協和発酵キリン株式会社 アンタゴニストのヒトｌｉｇｈｔ特異的ヒトモノクローナル抗体
PL2118074T3 (pl) 2007-02-01 2014-06-30 Resverlogix Corp Związki chemiczne do celów profilaktyki i leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego
AU2008232902B2 (en) 2007-03-30 2013-10-03 Medlmmune, Llc Antibody formulation
ES2532402T3 (es) 2008-06-26 2015-03-26 Resverlogix Corporation Métodos de preparación de derivados de quinazolinona
ES2542835T3 (es) 2009-01-08 2015-08-12 Resverlogix Corporation Compuestos para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares
EP2408454A2 (en) 2009-03-18 2012-01-25 Resverlogix Corp. Novel anti-inflammatory agents
JP5813626B2 (ja) 2009-04-22 2015-11-17 レスバーロジックス コーポレイション 新規抗炎症剤
US20130225530A1 (en) 2010-07-12 2013-08-29 Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Wogonin for the prevention and therapy of cardiac hypertrophy
DK2668210T3 (da) 2011-01-26 2020-08-24 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf
KR102011641B1 (ko) 2011-11-01 2019-08-19 리스버로직스 코퍼레이션 치환된 퀴나졸리논을 위한 경구 즉시 방출 제형
CN116574185A (zh) 2012-07-25 2023-08-11 塞尔德克斯医疗公司 抗kit抗体及其用途
CA2887129A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 Igenica, Inc. Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
WO2014080290A2 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Rvx Therapeutics Inc. Cyclic amines as bromodomain inhibitors
US9765039B2 (en) 2012-11-21 2017-09-19 Zenith Epigenetics Ltd. Biaryl derivatives as bromodomain inhibitors
MX2015007921A (es) 2012-12-21 2016-03-03 Zenith Epigenetics Corp Compuestos heterociclicos novedosos como inhibidores de bromodominio.
SG11201509982UA (cs) 2013-06-06 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics Inc
DK3041507T3 (da) 2013-08-26 2021-07-26 Biontech Res And Development Inc Nukleinsyrer, der koder for humane antistoffer mod sialyl-lewis a
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR102614642B1 (ko) 2014-06-04 2023-12-19 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 강글리오사이드 ｇｄ２에 대한 사람 단클론 항체
PT3333191T (pt) 2014-12-11 2020-12-15 Pf Medicament Anticorpos anti-c10orf54 e suas utilizações
BR112017015880A2 (pt) 2015-03-03 2018-07-31 Kymab Ltd anticorpos, usos e métodos
JO3789B1 (ar) 2015-03-13 2021-01-31 Resverlogix Corp التراكيب والوسائل العلاجية المعتمدة لمعالجة الامراض المتعلقة بالمتممة
RU2717829C2 (ru) 2015-04-20 2020-03-26 Толеро Фармасьютикалз, Инк. Прогнозирование ответа на альвоцидиб с помощью анализа профиля митохондрий
TR201911032T4 (tr) 2015-05-18 2019-08-21 Tolero Pharmaceuticals Inc Artırılmış biyoyararlanıma sahip alvocıdıb ön ilaçları.
JP7083497B2 (ja) 2015-08-03 2022-06-13 スミトモ ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド がんの処置のための併用療法
EP3909983A1 (en) 2015-12-02 2021-11-17 STCube & Co. Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
KR20180100122A (ko) 2015-12-02 2018-09-07 주식회사 에스티사이언스 당화된 btla(b- 및 t-림프구 약화인자)에 특이적인 항체
CN109803684B (zh) 2016-08-23 2022-08-23 卫材 R&D 管理有限公司 用于治疗肝细胞癌的组合疗法
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11279694B2 (en) 2016-11-18 2022-03-22 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
EP4218820A3 (en) 2017-03-16 2023-09-20 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination therapies for the treatment of breast cancer
CN111051346A (zh) 2017-05-31 2020-04-21 斯特库伯株式会社 使用免疫特异性结合btn1a1的抗体和分子治疗癌症的方法
KR20200015602A (ko) 2017-05-31 2020-02-12 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 분자 및 이의 치료적 용도
EP3635007A1 (en) 2017-06-06 2020-04-15 STCube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that bind to btn1a1 or btn1a1-ligands
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
US11707522B2 (en) 2017-10-13 2023-07-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human antibodies to Tn antigen
EP3824287A1 (en) 2018-07-20 2021-05-26 Pierre Fabre Médicament Receptor for vista
KR20210099066A (ko) 2018-12-04 2021-08-11 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 암의 치료를 위한 작용제로서 사용하기 위한 cdk9 억제제 및 그의 다형체
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
CN113559244B (zh) * 2021-08-02 2023-12-26 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Ctrp13脂肪因子的新用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998013344A1 (en) * 1996-09-26 1998-04-02 Bristol-Myers Squibb Company A process for the preparation of chiral ketone intermediates useful for the preparation of flavopiridol and analogs

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN164232B (cs) * 1986-04-11 1989-02-04 Hoechst India
US5284856A (en) * 1988-10-28 1994-02-08 Hoechst Aktiengesellschaft Oncogene-encoded kinases inhibition using 4-H-1-benzopyran-4-one derivatives
US5733920A (en) 1995-10-31 1998-03-31 Mitotix, Inc. Inhibitors of cyclin dependent kinases
US5849733A (en) 1996-05-10 1998-12-15 Bristol-Myers Squibb Co. 2-thio or 2-oxo flavopiridol analogs
ES2301194T3 (es) 1997-02-05 2008-06-16 Warner-Lambert Company Llc Pirido 2,3-d pirimidinas y 4-aminopirimidinas como inhibidores de la proliferacion celular.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998013344A1 (en) * 1996-09-26 1998-04-02 Bristol-Myers Squibb Company A process for the preparation of chiral ketone intermediates useful for the preparation of flavopiridol and analogs

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000044362A3 (en) 2001-04-05
JP4755759B2 (ja) 2011-08-24
YU54401A (sh) 2004-05-12
DE60013555T2 (de) 2005-09-29
PT1150746E (pt) 2004-12-31
EA200100742A1 (ru) 2001-12-24
MEP10508A (en) 2010-06-10
HRP20010521A2 (en) 2002-08-31
IL144668A (en) 2005-06-19
NZ512822A (en) 2005-01-28
BG65151B1 (bg) 2007-04-30
OA11755A (en) 2005-07-19
BR0007911A (pt) 2001-10-16
CA2360668C (en) 2009-03-17
DK1150746T3 (da) 2005-01-10
HUP0200804A3 (en) 2004-03-29
ZA200105596B (en) 2002-10-07
NO330512B1 (no) 2011-05-09
TR200102223T2 (tr) 2004-12-21
TWI273907B (en) 2007-02-21
ES2226792T3 (es) 2005-04-01
IL144668A0 (en) 2002-05-23
CA2360668A1 (en) 2000-08-03
CZ20012804A3 (cs) 2002-08-14
NO20013335D0 (no) 2001-07-05
AP1469A (en) 2005-09-26
CN1219556C (zh) 2005-09-21
CR6448A (es) 2004-03-17
WO2000044362A2 (en) 2000-08-03
ID30180A (id) 2001-11-08
EE04851B1 (et) 2007-06-15
JP2002535356A (ja) 2002-10-22
EP1150746A2 (en) 2001-11-07
BG105751A (en) 2002-02-28
AU3209800A (en) 2000-08-18
HU229263B1 (en) 2013-10-28
NO20013335L (no) 2001-09-25
SK286747B6 (sk) 2009-04-06
KR20010093309A (ko) 2001-10-27
UA73110C2 (en) 2005-06-15
PL197693B1 (pl) 2008-04-30
AR042569A1 (es) 2005-06-29
DE60013555D1 (de) 2004-10-14
HUP0200804A2 (hu) 2002-12-28
SK10862001A3 (sk) 2002-07-02
RS50242B (sr) 2009-07-15
PL350735A1 (en) 2003-01-27
HK1042445B (zh) 2006-01-13
EP1150746B1 (en) 2004-09-08
KR100793047B1 (ko) 2008-01-10
ATE275428T1 (de) 2004-09-15
AU777368B2 (en) 2004-10-14
HK1042445A1 (en) 2002-08-16
SI1150746T1 (en) 2005-02-28
US6399633B1 (en) 2002-06-04
CN1338958A (zh) 2002-03-06
AP2001002218A0 (en) 2001-09-30
EE200100385A (et) 2002-12-16
EA004786B1 (ru) 2004-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ300395B6 (cs) Lécivo pro inhibici proliferace bunek hladkých svalu, pro lécení vaskulárních lézí bunkami bohatých hladkých svalu, pro lécení lézí po poškození balónkovou angioplastikou a pro lécení pacientu po implantaci stentu
Zhu et al. Puerarin attenuates high-glucose-and diabetes-induced vascular smooth muscle cell proliferation by blocking PKCβ2/Rac1-dependent signaling
CA2207333C (en) Use of nebivolol as an anti-atherogenic
US20140234343A1 (en) Composition for prevention or treatment of ischemic cardiac disease, comprising inhibitor against age-albumin synthesis or release of mononuclear phagocyte system cells as active ingredient
KR100308332B1 (ko) 기관또는조직보호제
Premkumar et al. Synergistic interaction between 17‐AAG and phosphatidylinositol 3‐kinase inhibition in human malignant glioma cells
KR101201956B1 (ko) 파카스트리사민을 유효성분으로 함유하는 과증식성 피부질환과 악성흑색종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US6218437B1 (en) Treatment and prevention of hepatic disorders
KR102191405B1 (ko) 간 질환 예방 또는 치료용 조성물
IL268708A (en) Pharmaceutical preparations for combined treatment
KR101093930B1 (ko) 스코파론의 신규 용도
ITMI20110208A1 (it) Eterocicli ad attivita&#39; antiipertensiva
US20110201618A1 (en) Kmups inhibiting proliferation and obliteration of pulmonary artery
AU1780292A (en) Pharmaceutical compositions and methods for preventing skin tumor formation and causing regression of existing tumors
MXPA01007278A (en) The use of 4-h-1-benzopyran-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
JP2023081768A (ja) 脂肪肝治療剤、医薬組成物、治療方法、及びスクリーニング方法
Patel et al. Inactivation of Ppp1r15a minimises weight gain and insulin resistance during caloric excess in mice

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140118