WO2017069376A1 - ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물 - Google Patents

ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2017069376A1
WO2017069376A1 PCT/KR2016/006698 KR2016006698W WO2017069376A1 WO 2017069376 A1 WO2017069376 A1 WO 2017069376A1 KR 2016006698 W KR2016006698 W KR 2016006698W WO 2017069376 A1 WO2017069376 A1 WO 2017069376A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ikkε
inflammatory
bio
present
lps
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/006698
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
안영근
김용숙
김주희
Original Assignee
전남대학교병원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교병원 filed Critical 전남대학교병원
Publication of WO2017069376A1 publication Critical patent/WO2017069376A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol

Definitions

  • the present invention relates to an inflammatory disease containing a BIO compound ((2'Z, 3'E) -6-bromoindirubin-3'-oxime) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, as an IKK ⁇ inhibitor. It relates to a pharmaceutical composition and method for prophylaxis or treatment.
  • an inflammatory reaction is a biodefense reaction process for repairing and regenerating damage caused by an invasion that causes organic changes in cells or tissues of a living body, and this reaction process includes local blood vessels, various tissue cells of body fluids and immune cells, etc.
  • This works Normally, the inflammatory response induced by external invading bacteria is a defense system for protecting the living body, whereas abnormally excessive inflammatory response is induced, and various diseases appear. These diseases are called inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease is a disease that threatens human life by amplifying and sustaining inflammation of various inflammatory mediators secreted from target cells activated by external stimuli.
  • inflammation-related diseases include IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ and IFN-I.
  • LPS lipopolysaccharide
  • NF- ⁇ B Nuclear Factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer In B-Cells
  • IKK I ⁇ B kinase complex consisting of IKK ⁇ , IKK ⁇ , IKK ⁇
  • IKK phosphorylates I ⁇ B to induce proteolysis, thereby releasing NF- ⁇ B that was bound to I ⁇ B in active form.
  • IKK ⁇ has also been found to be an upper regulator, and is reported to be overexpressed in macrophages present in the body fat of obese or diabetic diseased animals, and is known to be associated with metabolic diseases.
  • the relationship between IKK ⁇ and inflammatory pathologies associated with myocardial infarction has not been established.
  • myocardial infarction is a disease that is blocked by the main blood vessels of the heart, the blood flow is cut off the supply of oxygen and nutrients, cardiac cells (cardiomyocyte) death or necrosis of the cardiac function is reduced.
  • cardiac cells cardiac cells
  • myocardial infarction occurs, macrophages, which are immune cells, enter the surrounding cardiomyocytes, activating NF- ⁇ B to induce inflammatory reactions and myocardial fibrosis. If the inflammatory response is not terminated due to various causes, the pathological lesions expand. There is a problem that lowers the heart structure and heart function.
  • drugs such as aspirin and antithrombotic agents are known as prophylactic / treatment agents for myocardial infarction, but aspirin has problems such as allergy and resistance, and anti-thrombotic agents have a bleeding risk.
  • the mortality rate within one year after myocardial infarction is over 10%, and due to the irreversible progression to heart failure, there is little other alternative than heart transplantation, and therefore, there is a need for the development of a new drug with strong therapeutic efficacy.
  • Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) is a serine / threonine protein kinase consisting of ⁇ and ⁇ isoforms, each encoded by separate genes, and is known to be associated with signal transduction pathways that regulate various cellular functions. Since abnormalities in the pathway using GSK3 as a modulator are associated with disease pathogenesis such as leukemia, diabetes mellitus, Alzheimer's disease, and neuropathy, the development of inhibitors targeting GSK3 for the treatment of these diseases is active. 10-1290509).
  • Compound (2'Z, 3'E) -6-bromoindirubin-3'-oxime (hereinafter referred to as 'BIO' compound) as a GSK3 inhibitor is a compound that inhibits the enzymatic activity of GSK3 ⁇ , an enzyme involved in glycogen metabolism. Cell differentiation, diabetes and Alzheimer's therapeutic effects have been reported. However, it is not known whether pathological microenvironmental control can improve the deterioration of the function / structure of infarct myocardium, and the relationship with IKK ⁇ is not known. On the other hand, amlexanox and omega3-fatty acid are known as inhibitors to suppress excessive increase in IKK ⁇ .
  • the present inventors have found that the BIO compound can block the initiation of the inflammatory response by NF- ⁇ B by inhibiting IKK ⁇ , which is a higher regulator of NF- ⁇ B, and completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases, containing a BIO compound as an active ingredient as an IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ) inhibitor.
  • an object of the present invention is to provide a method and use for treating inflammatory diseases such as myocardial infarction using the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, containing a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient as an IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ) inhibitor. .
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering the BIO compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the present invention also provides a prophylactic or therapeutic use of an inflammatory disease of the BIO compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the BIO compound is characterized in that it is contained at a concentration of 1 to 5uM.
  • the inflammatory disease is characterized in that myocardial infarction, sepsis, multiple organ failure, bronchitis or acute respiratory distress syndrome.
  • the prevention or treatment of the inflammatory disease is characterized in that by the inhibition of IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ) in macrophages.
  • the prevention or treatment of myocardial infarction is characterized by the inhibition of IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ) in cardiomyocytes or cardiomyocytes.
  • BIO compound-containing composition of the present invention it is possible to block the initiation of the inflammatory response by inhibiting IKK ⁇ , which is a higher regulator of the transcription factor NF- ⁇ B, which induces the expression of inflammatory cytokines in macrophages, various inflammatory diseases It can be usefully used in the treatment of.
  • IKK ⁇ is a higher regulator of the transcription factor NF- ⁇ B, which induces the expression of inflammatory cytokines in macrophages, various inflammatory diseases It can be usefully used in the treatment of.
  • the BIO compound inhibits IKK ⁇ in myocardial / myocardial fibroblasts, and thus, a therapeutic effect can be expected for myocardial infarction accompanied with inflammation / pathological fibrosis.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting confirming the expression changes of inflammatory markers (iNOS) and NF- ⁇ B regulators (I ⁇ B ⁇ and IKK ⁇ ) induced by LPS treatment in macrophages.
  • iNOS inflammatory markers
  • I ⁇ B ⁇ and IKK ⁇ NF- ⁇ B regulators
  • Figure 2 shows the results of Western blotting confirming the expression changes of inflammatory markers (iNOS) and NF- ⁇ B regulators (I ⁇ B ⁇ , IKK ⁇ , pIKK ⁇ ) upon treatment of BIO compounds with LPS in macrophages.
  • inflammatory markers iNOS
  • NF- ⁇ B regulators I ⁇ B ⁇ , IKK ⁇ , pIKK ⁇
  • Figure 3 shows the results of Western blotting when the BIO compound is treated with LPS in macrophages, the expression changes of phosphorylated forms of AKT and STAT1, which are phosphorylated substrate proteins of IKK ⁇ .
  • Figure 4 shows the results of Western blotting of the expression change of IKK ⁇ , a higher regulator of NF- ⁇ B, when BIO compounds are treated with LPS in cardiomyocytes.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting of the expression change of IKK ⁇ , which is a higher regulator of NF- ⁇ B, when BIO compounds are treated with LPS in cardiomyocytes.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, containing as an active ingredient a compound of formula 1 ('BIO' compound) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ) inhibitor. .
  • the BIO compound ((2'Z, 3'E) -6-bromoindirubin-3'-oxime) is known as a reversible ATP-competitive GSK-3 ⁇ inhibitor and is undifferentiated in embryonic stem cells of humans and mice It was originally reported as a substance to maintain.
  • the present invention includes such BIO compounds as well as derivatives thereof which exhibit the same / similar efficacy in vivo or in vitro.
  • the BIO compound may be prepared with pharmaceutically acceptable salts and solvates thereof according to methods conventional in the art.
  • 'Pharmaceutically acceptable salts' include salts of acidic or basic groups, unless specifically noted.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts. It can be prepared through.
  • the BIO compound may be contained in a concentration of 1-10 uM, preferably 1-5 uM, more preferably 5 uM. Too low a concentration does not have an effect. Too high a concentration is toxic, so you should check the appropriate concentration according to the situation.
  • Inflammation in the present invention generally refers to a localized protective response of body tissues to host invasion due to foreign substances or harmful stimuli, the cause of which is caused by an infectious agent such as bacteria, viruses and parasites, burns or Physical causes such as irradiation, or chemicals such as toxins, drugs or industrial reagents, or immune responses such as allergies and autoimmune reactions, or abnormal conditions associated with oxidative stress.
  • an infectious agent such as bacteria, viruses and parasites, burns or Physical causes such as irradiation, or chemicals such as toxins, drugs or industrial reagents, or immune responses such as allergies and autoimmune reactions, or abnormal conditions associated with oxidative stress.
  • 'inflammatory disease' in the present invention, but myocardial infarction, sepsis, multiple organ failure, bronchitis or acute respiratory distress syndrome is preferred.
  • the treatment of inflammatory diseases includes alleviation, alleviation and improvement of symptoms of inflammatory diseases, and also means lowering the possibility of developing inflammatory diseases.
  • LPS lipopolysaccharide, lipopolysaccharide
  • LPS acts on inflammatory cells, endothelial cells, etc. of the host to promote cytokine secretion.
  • compositions of the present invention may further comprise ingredients such as existing therapeutically active ingredients, other adjuvants, pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the preparation, and includes saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, etc. It is not limited and may further contain other conventional additives, such as an antioxidant and a buffer solution as needed.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be preferably formulated according to the individual components using methods disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, inhalant, or external skin preparation.
  • 'individual' means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. Mean mammal.
  • the ⁇ pharmaceutically effective amount '' refers to the type and severity of the disease to be administered, the age and sex of the patient, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of administration, the duration of treatment, the factors including the concurrent drug and other medical fields It is determined according to well-known factors in the amount can be easily determined by those skilled in the art in an amount capable of obtaining the maximum effect without side effects in consideration of all the above factors.
  • composition of the present invention is not limited to the 'administration method' as long as the target tissue can be reached.
  • examples include oral administration, arterial injection, intravenous injection, transdermal injection, intranasal administration, coronary administration or intramuscular administration.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • composition of the present invention can be used in a variety of drugs, foods and beverages for the prevention and improvement of inflammatory diseases, and can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules or beverages.
  • BIO compound which is an active ingredient in the composition for preventing or treating inflammatory diseases according to the present invention, is involved in suppressing inflammatory cytokine production and suppressing LPS-associated signaling through IKK ⁇ inhibition.
  • inflammatory markers iNOS
  • BIO compounds which is due to an increase in I ⁇ Ba and NF- ⁇ B inactivation following inhibition of IKK ⁇ .
  • the BIO compound of the present invention is deteriorated in cardiac function due to inflammatory pathology during myocardial infarction. It also suggests that it can be improved.
  • BIO compound (Sigma) was dissolved in DMSO for cell experiments and diluted with cell culture solution.In animal experiments, the BIO compound (Sigma) was dissolved in a 1: 1 mixture of phosphorylated buffer solution (PBS) and ethyl alcohol. 0.2 kg was used daily by intraperitoneal injection.
  • PBS phosphorylated buffer solution
  • Mouse macrophage RAW264.7 (Korea Cell Line Bank) was cultured by adding 10% fetal bovine serum to DMEM culture.
  • Cardiac cells were excised by separating the left myocardium from a sterile workbench after removing the heart of rats 2 days old and washing with physiological saline. These myocardial tissues were placed in collagenase enzyme solution, shaken at 37 ° C. for reaction, and centrifuged to collect only the supernatant and placed in a cell culture flask. After 1 hour, the supernatant was transferred to a new culture flask from the cardiomyocytes attached to the bottom of the cell culture flask to separate the floating cardiomyocytes. At this time, both cells were cultured in DMEM medium (Gibco-BRL, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and used for subsequent experiments.
  • DMEM medium Gibco-BRL, USA
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 2 In macrophage lines LPS Inflammatory by irritation Marker (iNOS ) And Of IKK ⁇ Increased expression
  • Raw264.7 cells were incubated in DMEM medium (4mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110mg / L sodium pyruvate, 10% FBS) in a 6well culture dish, and then after 1 day of LPS (100ng / ml) for 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 4 hours, 8 hours, 24 hours treatment was stimulated. Each sample was then washed with PBS, washed once with PBS, cells were lysed with lysis buffer and centrifuged to obtain supernatant, followed by SDS-PAGE, transfer to nitrocellulose membrane, and anti-iNOS, I ⁇ B ⁇ . , IKK ⁇ antibody was confirmed the degree of expression of each protein (control: GAPDH).
  • DMEM medium 4mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110mg / L sodium pyruvate, 10% FBS
  • LPS 100ng / ml
  • Example 3 In macrophage lines Inflammatory by BIO Compound Marker ( iNOS ) And Of IKK ⁇ Suppress expression
  • Raw264.7 cells were incubated with DMEM medium (4 mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110 mg / L sodium pyruvate, 10% FBS) in a 6-well culture dish, and then LPS (100 ng / ml) + vehicle (0.1) after one day. % DMSO in PBS), or LPS (100 ng / ml) + BIO (5 ⁇ ) was treated for 15 minutes, 4 hours, 24 hours. Each sample was then washed with PBS, washed once with PBS, cells were lysed with lysis buffer and centrifuged to obtain supernatant, followed by SDS-PAGE, transfer to nitrocellulose membrane, and anti-iNOS, I ⁇ B ⁇ . , pIKK ⁇ , IKK ⁇ antibody was confirmed the expression level of each (control: GAPDH).
  • DMEM medium 4 mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110 mg / L sodium pyruvate, 10% FBS
  • the expression of the inflammatory marker iNOS in the macrophage treated with LPS + vehicle increased from 4 hours to the maximum at 24 hours, whereas the expression of iNOS during LPS + BIO treatment Not observed at all.
  • the expression of I ⁇ B ⁇ was increased in all groups of 15 minutes, 4 hours, and 24 hours at the time of LPS + BIO treatment compared to LPS + vehicle treatment.
  • Example 4 In macrophage lines by BIO compound IKK ⁇ Substrate (p- Akt / p- STAT1 Suppression of
  • Raw264.7 cells were incubated with DMEM medium (4 mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110 mg / L sodium pyruvate, 10% FBS) in a 6-well culture dish, and then LPS (100 ng / ml) + vehicle (0.1) after one day. % DMSO in PBS), or LPS (100 ng / ml) + BIO (5 ⁇ ) was treated for 15 minutes, 4 hours, 24 hours. Each sample was then washed with PBS, washed once with PBS, cells were lysed with lysis buffer and centrifuged to obtain supernatant, followed by SDS-PAGE, transfer to nitrocellulose membrane, and anti-pAkt (S473). ), pAkt (T308), pSTAT1 (S473) antibody was confirmed the degree of expression of each protein (control group: GAPDH).
  • DMEM medium 4 mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110 mg / L sodium
  • the expression level of the phosphorylated (pAkt (S473)) protein of AKT (S473) which is known as the phosphorylation substrate of IKK ⁇ in macrophages, was the highest in 4 hours after LPS treatment.
  • the expression level of phosphorylated (pAkt (T308)) protein of AKT (T308) showed the maximum amount at 24 hours of LPS treatment, it was confirmed that expression was suppressed when LPS and BIO were treated together.
  • the hearts of young rats 2 days old were extracted, 116 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.35), 0.8 mM NaH 2 PO 4 , 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO 4
  • Cell precipitates were obtained by treatment with collegenase (0.4 mg / ml) / pancreatin (0.6 mg / ml) in the containing solution and centrifugation.
  • These cells were mixed in plating culture (70% DMEM, 15% M199, 15% FBS, 100 U / ml peniciline / streptomycin), and then cultured in a 100 ⁇ culture plate coated with 1% gelatin.
  • the finally obtained cardiomyocytes were treated with vehicle (0.1% DMSO in PBS) treatment group for 24 hours; 24 hour LPS (100 ng / ml) treatment group; The experiment was carried out by dividing into 24 hours LPS (100ng / ml) + BIO (1 ⁇ M) treatment group. Each sample was then washed with PBS, cell lysed, lysed with lysis buffer, centrifuged, supernatant taken, SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose membrane, followed by anti-IKK ⁇ antibody. The degree of protein expression was confirmed (control: GAPDH).
  • cardiomyocytes were obtained in the same manner as in Example 5-1, except that the hearts of young rats 2 days old were extracted, and only the cells attached to the bottom were separated and used in culture.
  • the BIO compound of the present invention can also improve cardiac function deterioration due to inflammatory pathology during myocardial infarction.
  • BIO compound-containing composition of the present invention it is possible to block the initiation of the inflammatory response by inhibiting IKK ⁇ , which is a higher regulator of NF- ⁇ B, a transcription factor that induces the expression of inflammatory cytokines in macrophages. It can be usefully used in the treatment of.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은, IKKε 억제제로서 BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 BIO 화합물 함유 조성물에 의하면, 대식세포에 있어서 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-κB에 대하여 상위 조절인자인 IKKε을 억제함으로써 염증반응 개시를 차단할 수 있는 바, 다양한 염증질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, BIO 화합물이 심근/심근섬유세포에서도 IKKε을 억제하는 바, 염증 또는 병리적 섬유화가 동반되는 심근경색에 대하여도 치료효과를 기대할 수 있다.

Description

ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물
본 발명은, IKKε 억제제로서 BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 칭한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환이다.
많은 염증관련 질환의 발병에는 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 대표적인 염증관련 사이토카인으로는 IL-1β, TNF-α, IFN-I 등이 있다. 또한, 염증반응의 유도물질들 중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 그람음성세균의 세포 표면을 구성하는 물질로서 백혈구와 같은 면역세포와 상호 작용을 하며, 염증관련 사이토카인의 조절에 관여한다.
상기 염증관련 사이토카인의 발현은, NF-κB(Nuclear Factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer In B-Cells)라고 하는 세포내 염증반응을 개시하는 전사인자(transcription factor)에 의해 유도된다. 이때, NF-κB는 세포질내에서 IκB와 결합되어 비활성형으로 존재하지만, 상위 조절인자에 의해 IκB와 결합이 해제되면 활성형으로 유리되어 핵(nucleus)내로 들어가서 염증반응을 위한 전사인자로서 작용하게 되는 것이다.
이때, NF-κB를 활성형으로 switch-on시키기 위한 상위 조절인자로서, IKKα, IKKβ, IKKγ로 이루어진 IKK(IκB kinase) complex가 알려져 있다. IKK는 IκB를 인산화시켜 단백질 분해를 유도하고, 이에 의해 IκB와 결합되어 있던 NF-κB가 활성형으로 release되도록 한다. 또한, 최근에는 IKKε 역시 상위 조절인자로 밝혀진 바 있으며, 비만 또는 당뇨질환 실험동물의 체지방에 존재하는 대식세포에서 과발현 되어있는 것으로 보고되어, 대사성 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아직까지 심근경색과 관련된 염증병리작용과 IKKε의 관련성에 대하여는 밝혀진 바 없다.
한편, 심근경색증(myocardial infarction)은 심장의 주요 혈관이 막혀 혈류가 단절됨으로써 산소와 영양소의 공급의 차단되어, 심근세포(cardiomyocyte) 고사 또는 괴사에 의해 심기능이 저하되는 질환이다. 심근경색이 일어나게 되면 주변 심근세포에 면역세포인 대식세포가 침투하여 NF-κB를 활성화시킴으로써 염증반응 및 심근 섬유화를 유도하게 되는데, 만약 다양한 원인으로 염증반응이 종결되지 않을 경우, 병리적 병변이 확장되어 심장 구조 및 심기능을 저하시키는 문제가 발생한다.
종래, 심근경색증의 예방/치료제로서 아스피린, 항혈전제 등의 약물이 알려져 있으나, 아스피린의 경우 알러지, 내성 등의 문제점이 있으며, 항혈전제의 경우에는 출혈 위험성이 있다. 또한, 심근경색 치료 후 1년 내 사망률은 10%를 넘고, 심부전으로의 비가역적 진행으로 인하여 심장 이식 외에 다른 대안이 거의 없기 때문에, 강력한 치료효능을 갖는 새로운 약제의 개발이 필요하다.
글리코겐 신타제 키나아제-3(GSK-3)는 각각 별개의 유전자에 의해 코딩되는 α 및 β isoform으로 이루어진 세린/트레오닌 단백질 키나아제로서, 다양한 세포 기능을 조절하는 신호 전달경로와의 관련성이 알려져 있다. GSK3을 조절자로서 이용하는 경로에서의 이상은 백혈병, 당뇨병, 알츠하이머, 신경장애와 같은 질환 발병기전과 연관되어 있기 때문에, 이들 질환 치료를 위하여 GSK3를 타겟으로 하는 억제제의 개발이 활발하다(한국등록특허 제10-1290509호).
GSK3 억제제로서 화합물 (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(이하, 'BIO' 화합물)은 글리코겐 대사 관여 효소인 GSK3β의 효소활성을 억제하는 화합물로서, 줄기세포 분화, 및 당뇨, 알츠하이머 치료효과가 보고된 바 있다. 그러나, 아직까지 병리적 미세환경 제어를 통하여, 경색심근의 기능/구조의 악화를 개선할 수 있는지에 대하여는 밝혀진 바 없을 뿐만 아니라, IKKε와의 관련성에 대하여도 알려진 바 없다. 한편, 과도한 IKKε의 증가를 억제하기 위한 억제제로는 현재 amlexanox와 오메가3-지방산이 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 BIO 화합물이 NF-κB의 상위 조절인자인 IKKε을 억제함으로써, NF-κB에 의한 염증반응 개시를 차단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 IKKε(IκB kinase ε) 저해제로서 BIO 화합물을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용한 심근경색 등의 염증질환 치료방법 및 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, IKKε(IκB kinase ε) 저해제로서 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016006698-appb-I000001
또한, 본 발명은, 상기 BIO 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 BIO 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 염증질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 BIO 화합물은 1 내지 5uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 염증질환은 심근경색, 패혈증, 다발성 장기부전, 기관지염 또는 급성 호흡곤란 증후군인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료는 대식세포에서의 IKKε(IκB kinase ε) 억제에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 심근경색의 예방 또는 치료는 심근세포 또는 심근섬유세포에서의 IKKε(IκB kinase ε) 억제에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 BIO 화합물 함유 조성물에 의하면, 대식세포에 있어서 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-κB에 대하여 상위 조절인자인 IKKε을 억제함으로써 염증반응 개시를 차단할 수 있는바, 다양한 염증질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, BIO 화합물이 심근/심근섬유세포에서도 IKKε을 억제함을 밝혔는 바, 염증/병리적 섬유화가 동반되는 심근경색에 대하여도 치료효과를 기대할 수 있다.
도 1은, 대식세포에서 LPS 처리에 의하여 유도되는 염증성 마커(iNOS) 및 NF-κB 조절인자(IκBα 및 IKKε)의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 2는, 대식세포에서 LPS와 함께 BIO 화합물을 처리시, 염증성 마커(iNOS) 및 NF-κB 조절인자(IκBα, IKKε, pIKKε)의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 3은, 대식세포에서 LPS와 함께 BIO 화합물을 처리시, IKKε의 인산화 기질 단백질인 AKT, STAT1의 인산화형의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 4는, 심근세포에서 LPS와 함께 BIO 화합물을 처리시, NF-κB의 상위 조절인자인 IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 5는, 심근섬유세포에서 LPS와 함께 BIO 화합물을 처리시, NF-κB의 상위 조절인자인 IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
본 발명은, IKKε(IκB kinase ε) 저해제로서 하기 화학식 1의 화합물('BIO' 화합물) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016006698-appb-I000002
상기 BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심)은 가역적인 ATP-경쟁적 GSK-3β 억제제로 알려져 있으며, 인간 및 마우스의 배아줄기세포에서 미분화상태를 유지시키는 물질로 최초 보고되었다. 본 발명은 이러한 BIO 화합물 뿐만 아니라, 생체 또는 시험관내에서 동일/유사 효능을 나타내는 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 BIO 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용매화물로 제조될 수 있다. '약학적으로 허용가능한 염'은, 특별히 언급되지 않는 한, 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 BIO 화합물은 1-10uM 농도, 바람직하게는 1-5 uM 농도, 더욱 바람직하게는 5uM 농도로 함유될 수 있다. 농도가 너무 낮으면 효과를 나타내지 않으며, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 상황에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.
본 발명에서 '염증'이란, 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극으로 인한 숙주 침입에 관한 신체 조직의 국소화된 보호 반응으로 나타나는 결과로서, 이러한 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성원인, 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인, 또는 독소, 약물 또는 산업적 시약과 같은 화학약품, 또는 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역 반응, 또는 산화성 스트레스와 관련된 이상 상태일 수 있다.
본 발명에서 '염증질환'에 특별한 제한은 없으나, 심근경색, 패혈증, 다발성 장기부전, 기관지염 또는 급성 호흡곤란 증후군인 것이 바람직하다. 또한, 염증질환의 치료란, 염증질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 염증질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명에서 사용하는 용어인 'LPS (lipopolysaccharide, 지질다당류)'란 그람음성세균 표층의 펩티드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요 구성성분으로 세포 1개당 약 3×105분자(표면의 20~30%)가 존재한다. LPS는 숙주의 염증세포, 내피세포 등에 작용하여 사이토카인의 분비를 촉진한다.
본 발명의 약학 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명에서 '개체'란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 '약학적 유효량'은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 '투여방법'에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 염증질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 BIO 화합물은, IKKε 억제를 통하여 염증성 사이토카인 생성 억제, LPS 관여 신호전달 억제에 관여한다.
본 발명에서는, 대식세포에서 LPS 자극에 의해 유도되는 염증성 마커(iNOS)의 발현이 BIO 화합물에 의하여 저해되고, 이는 IKKε의 억제에 따른 IκBa의 증가및 NF-κB 비활성화에 기인한다는 것을 밝혔다.
또한, 본 발명에서는, 심장세포에서 LPS 자극에 의해 유도되는 IKKε의 발현이 BIO 화합물에 의하여 저해됨을 밝혔는바, 본원발명의 BIO 화합물이 일반적인 항염증 효과 이외에, 심근경색시의 염증병리에 의한 심기능 저하 역시 개선시킬 수 있음을 시사한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 시료 준비 및 세포배양
1-1. 시료준비
BIO 화합물(Sigma)은 세포실험시에는 DMSO에 녹여 세포배양액으로 희석하여 사용하였으며, 동물실험시에는 인산화버퍼용액(PBS)과 에틸알코올을 1:1로 혼합한 용액에 용해하여 실험 rat의 체중당 0.2kg을 매일 복강내 주사하여 사용하였다.
1-2. 세포배양
마우스 대식세포주인 RAW264.7(한국세포주은행)는 DMEM 배양액에 소태아혈청 10%를 첨가하여 배양하였다.
심장세포는, 생후 2일된 rat의 심장을 적출하고 생리식염수로 세척한 후, 멸균 작업대에서 좌심근을 분리하여 절편화하였다. 이들 심근조직을 collagenase 효소 용액에 넣고 37℃에서 흔들어 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 모아 세포배양 플라스크에 두었다. 1시간 후, 세포배양 플라스크 바닥에 부착된 심근섬유세포로부터 상층액을 새로운 배양 플라스크로 옮겨 부유되어 있는 심근세포를 분리하였다. 이때 두 세포 모두 10% 소태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM 배지(Gibco-BRL, USA)에 배양하여 이후의 실험에 이용하였다.
실시예 2: 대식세포주에서 LPS 자극에 의한 염증성 마커 ( iNOS ) 및 IKKε의 발현 증가
마우스 대식세포주인 Raw 264.7를 LPS(100ng/ml)로 염증자극한 후, 염증성 마커인 iNOS(inducible NO synthase)와 NF-κB 조절인자인 IκBα, IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, Raw264.7 세포를 6well 배양접시에서 DMEM 배지(4mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110mg/L sodium pyruvate, 10% FBS)로 배양한 후, 하루 지나 LPS(100ng/ml)를 15분, 30분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 처리하여 자극을 주었다. 이후, 각각의 샘플은 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 용해시키고 원심분리하여 상층액을 취한 후 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하여, 항-iNOS, IκBα, IKKε 항체로 각각의 단백질 발현정도를 확인하였다(대조군: GAPDH).
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 대식세포에서 LPS(100ng/ml) 처리시 염증성 마커인 iNOS의 발현이 4시간째부터 증가하여 24시간에서 최대량을 보였다. IκBα의 경우는, LPS 미처리시 다량 발현되다가 LPS 처리 15분, 30분만에 분해되어 소실되고, 이후 다시 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, IKKε은 NF-κB의 상위 조절인자로서 LPS 처리 4시간부터 발현이 점차 증가됨을 확인하였다.
IκBα의 소실은 NF-κB 활성화에 의한 염증반응의 개시를 의미하는 것이기 때문에, 상기 결과로부터 NF-κB가 초기 15분 내지 30분만에 활성화되어, 이에 의해 염증성 마커인 iNOS의 양이 증가되었음을 알 수 있다.
실시예 3: 대식세포주에서 BIO 화합물에 의한 염증성 마커 ( iNOS ) 및 IKKε의 발현 억제
마우스 대식세포주인 Raw 264.7를 LPS(100ng/ml)로 염증자극함과 동시에 BIO(5μM) 화합물 처리시, 염증성 마커인 iNOS(inducible NO synthase)와 NF-κB 조절인자인 IκBα, IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, Raw264.7 세포를 6well 배양접시에서 DMEM 배지(4mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110mg/L sodium pyruvate, 10% FBS)로 배양한 후, 하루 지나 LPS(100ng/ml) + vehicle(0.1% DMSO in PBS), 또는 LPS(100ng/ml) + BIO(5μM)을 15분, 4시간, 24시간 처리하였다. 이후, 각각의 샘플은 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 용해시키고 원심분리하여 상층액을 취한 후 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하여, 항-iNOS, IκBα, pIKKε, IKKε 항체로 각각의 단백질 발현정도를 확인하였다(대조군: GAPDH).
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대식세포에서 LPS + vehicle 처리시에는 염증성 마커인 iNOS의 발현이 4시간째부터 증가하여 24시간에서 최대량을 보인 반면, LPS + BIO 처리시에는 iNOS의 발현이 전혀 관찰되지 않았다. IκBα의 경우는, LPS + vehicle 처리에 비하여 LPS + BIO 처리시에, 15분, 4시간, 24시간 처리군 모두에서 IκBα의 발현이 증가함을 확인하였다.
IκBα의 발현증가는 NF-κB 비활성화를 의미하는 것이기 때문에, 상기 결과로부터 BIO 화합물이 NF-κB를 억제시킴으로써 염증성 마커인 iNOS의 발현이 저해되었음을 알 수 있다.
또한, BIO 화합물 처리시에는 phospho-IKKε(p-IKKε)와 IKKε 모두 발현 억제되었는바, 이러한 결과는 BIO 화합물이 (NF-κB의 상위 조절인자인) IKKε의 강력한 억제제로서 기능한다는 것을 의미한다.
실시예 4: 대식세포주에서 BIO 화합물에 의한 IKKε 기질(p- Akt /p- STAT1 )의 발현 억제
마우스 대식세포주인 Raw 264.7를 LPS(100ng/ml)로 염증자극함과 동시에 BIO(5μM) 화합물 처리시, IKKε의 인산화 기질로 알려진 Akt와 STAT1 인산화형의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, Raw264.7 세포를 6well 배양접시에서 DMEM 배지(4mM L-glutamine, pyridoxine hydrochloride, 110mg/L sodium pyruvate, 10% FBS)로 배양한 후, 하루 지나 LPS(100ng/ml) + vehicle(0.1% DMSO in PBS), 또는 LPS(100ng/ml) + BIO(5μM)을 15분, 4시간, 24시간 처리하였다. 이후, 각각의 샘플은 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 용해시키고 원심분리하여 상층액을 취한 후 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하여, 항-pAkt(S473), pAkt(T308), pSTAT1(S473) 항체로 각각의 단백질 발현정도를 확인하였다(대조군: GAPDH).
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대식세포에서 IKKε의 인산화 기질로 알려진 AKT(S473)의 인산화형(pAkt(S473)) 단백질 발현 정도는 LPS 처리 4시간만에 최대의 양을 보이다가 24시간에는 감소하는 반면, LPS와 BIO를 함께 처리시에는 발현이 모두 억제되는 것을 확인하였다. 또한, AKT(T308)의 인산화형(pAkt(T308)) 단백질 발현 정도는 LPS 처리 24시간에 최대의 양을 보인 반면, LPS와 BIO를 함께 처리시에는 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
IKKε의 또 다른 인산화 기질로 알려진 STAT1(S473)의 인산화형 역시, LPS 처리 4시간만에 최대의 양을 보이다가 24시간에는 감소하는 반면, LPS와 BIO를 함께 처리시에는 발현이 모두 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, BIO 화합물이 IKKε의 활성을 억제하여 IKKε pathway와 관련된 하위 인자들의 인산화 반응 역시 저해됨을 의미하는 것이다.
실시예 5: 심장세포에서 BIO 화합물에 의한 IKKε의 발현 억제
5-1. 심근세포에서 BIO 화합물에 의한 IKKε의 발현 억제
rat 심근세포(cardiomyocyte)를 LPS(100ng/ml)로 염증자극함과 동시에 BIO(1μM) 화합물 처리시, IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, 생후 2일된 어린 래트의 심장을 적출하여, 116mM NaCl, 20mM HEPES (pH 7.35), 0.8mM NaH2PO4, 5.6mM glucose, 5.4mM KCl, 0.8mM MgSO4 함유 용액 중의 collegenase(0.4mg/ml)/pancreatin(0.6 mg/ml)으로 처리하고 원심분리함으로써 세포 침전물을 얻었다. 이들 세포를 plating 배양액(70% DMEM, 15% M199, 15%FBS, 100 U/ml peniciline/streptomycin)에 혼합한 뒤, 1% 젤라틴으로 코팅된 100π 배양접시에 배양하였다. 배양시 부유 세포만을 분리하여 다시 젤라틴으로 코딩된 100π 배양접시에 18시간 배양시켜 심근세포를 분리하였다. 분리된 심근세포를 PBS 버퍼로 세척하고 maintenance 배양액 (80% DMEM, 20% M199, 100 U/ml of penicilin and streptomycin)으로 재배양시켰다.
최종적으로 수득한 심근세포는, 24시간 vehicle(0.1% DMSO in PBS) 처리군; 24시간 LPS(100ng/ml) 처리군; 24시간 LPS(100ng/ml) + BIO(1μM) 처리군으로 나누어 실험을 진행하였다. 이후, 각각의 샘플은 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 용해시키고 원심분리하여 상층액을 취한 후 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하여, 항-IKKε 항체로 단백질 발현정도를 확인하였다(대조군: GAPDH).
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3의 대식세포주에서의 결과와 마찬가지로, 심근세포에서도 LPS에 의해 유도된 IKKε 발현이, BIO 화합물에 의해 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
5-2. 심근섬유세포에서 BIO 화합물에 의한 IKKε의 발현 억제
rat 심근섬유세포(cardiac fibroblast)를 LPS(100ng/ml)로 염증자극함과 동시에 BIO(1μM) 화합물 처리시, IKKε의 발현 변화를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, 생후 2일된 어린 래트의 심장을 적출하여, 배양시 바닥에 부착된 세포만을 분리하여 이용한 이외에는, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 하여 심근섬유세포를 수득하였다.
최종적으로 수득한 심근섬유세포는, 24시간 vehicle(0.1% DMSO in PBS) 처리군; 24시간 LPS(100ng/ml) 처리군; 24시간 LPS(100ng/ml) + BIO(1μM) 처리군으로 나누어 실험을 진행하였다. 이후, 각각의 샘플은 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 용해시키고 원심분리하여 상층액을 취한 후 SDS-PAGE 하고, 니트로셀룰로스 막으로 트랜스퍼하여, 항-IKKε 항체로 단백질 발현정도를 확인하였다(대조군: GAPDH).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 5의 결과와 마찬가지로, 심근섬유세포에서도 LPS에 의해 유도된 IKKε 발현이, BIO 화합물에 의해 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 본원발명의 BIO 화합물이 일반적인 항염증 효과 이외에, 심근경색시의 염증병리에 의한 심기능 저하 역시 개선시킬 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명의 BIO 화합물 함유 조성물에 의하면, 대식세포에 있어서 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-κB에 대하여 상위 조절인자인 IKKε을 억제함으로써 염증반응 개시를 차단할 수 있는 바, 다양한 염증질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (7)

  1. IKKε(IκB kinase ε) 저해제로서 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016006698-appb-I000003
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 1 내지 5uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 염증질환은 심근경색, 패혈증, 다발성 장기부전, 기관지염 또는 급성 호흡곤란 증후군인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료는 대식세포에서의 IKKε(IκB kinase ε) 억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 심근경색의 예방 또는 치료는 심근세포 또는 심근섬유세포에서의 IKKε(IκB kinase ε) 억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환 치료방법.
  7. 제 1 항에 따른 약학 조성물의, 염증질환 치료용도.
PCT/KR2016/006698 2015-10-20 2016-06-23 ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물 WO2017069376A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150146245 2015-10-20
KR10-2015-0146245 2015-10-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017069376A1 true WO2017069376A1 (ko) 2017-04-27

Family

ID=58557710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/006698 WO2017069376A1 (ko) 2015-10-20 2016-06-23 ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017069376A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022229985A1 (en) * 2021-04-29 2022-11-03 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Soluble analogues of 6bio thereof and implementation thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110020468A (ko) * 2009-08-24 2011-03-03 한국과학기술원 인간 배아줄기세포에서 중간엽 줄기세포로 분화시키는 방법
KR20130026762A (ko) * 2011-09-06 2013-03-14 동국대학교 산학협력단 스타틴계 약물 및 윈트 신호 전달 조절제를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 및 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20130101557A (ko) * 2010-11-02 2013-09-13 고꾸리쯔다이가꾸호오진 구마모또 다이가꾸 장세포의 제조 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110020468A (ko) * 2009-08-24 2011-03-03 한국과학기술원 인간 배아줄기세포에서 중간엽 줄기세포로 분화시키는 방법
KR20130101557A (ko) * 2010-11-02 2013-09-13 고꾸리쯔다이가꾸호오진 구마모또 다이가꾸 장세포의 제조 방법
KR20130026762A (ko) * 2011-09-06 2013-03-14 동국대학교 산학협력단 스타틴계 약물 및 윈트 신호 전달 조절제를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 및 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEUREL, ELEONORE ET AL.: "Glycogen Synthase Kinase-3 Promotes the Synergistic Action of Enterferon-gamma on Lipopolysaccharide-induced IL -6 Production in RAW264.7 Cells", CELLULAR SIGNALLING, vol. 21, 2009, pages 978 - 985, XP026072424 *
MEIJER, LAURENT ET AL.: "GSK-3-Selective Inhibitors Derived from Tyrian Purple Indirubins", CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 10, December 2003 (2003-12-01), pages 1255 - 1266, XP002444147 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022229985A1 (en) * 2021-04-29 2022-11-03 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Soluble analogues of 6bio thereof and implementation thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101934328B1 (ko) 아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
OA11755A (en) The use of 4-H-1-benzopyran-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation.
WO2019151840A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2017088775A1 (zh) 苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物用于抑制肝纤维化的用途
KR101665846B1 (ko) Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US11844779B2 (en) PKC-Delta-I inhibitor formulations and uses thereof
US10350184B2 (en) Derivatives used in the treatment of muscle atrophy
WO2021006663A1 (ko) O-사이클릭 피토스핑고신-1-포스페이트를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물
EP3091972B1 (en) Method of treating liver disorders
RU2727142C2 (ru) Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
CN112218635A (zh) 用于保护心肌细胞的药物组合物
WO2017069376A1 (ko) ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물
KR101666605B1 (ko) TNP(N2-(m-Trifluorobenzyl), N6-(p-nitrobenzyl)purine)를 유효성분으로 함유하는 아세트아미노펜 유래 간 독성 예방 및 치료용 조성물
KR101617584B1 (ko) 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US9458086B1 (en) Compositions and methods for adipocyte modulation
Owen et al. Chromosome marker studies in the graft-versus-host reaction in the chick embryo
JP2012111713A (ja) ウィザノライド成分を組み合わせた抗癌剤
KR20120074362A (ko) 멜리틴 성분을 포함하는 암 전이 억제제
KR101694063B1 (ko) Ｂｉｏ 화합물을 함유하는 심혈관질환의 치료용 조성물
TWI587860B (zh) 喹啉衍生化合物用於製備Ｔａｕ蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途
JP2007514732A (ja) 神経変性過程の予防及び治療のためのテルル誘導体
Harris et al. Diet-induced protection against lipopolysaccharide includes increased hepatic NO production
KR101119793B1 (ko) 퍼옥시레독신의 활성저해작용을 갖는 피페리딘계 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물
WO2021201171A1 (ja) 神経炎症の抑制、そのための組成物及び方法
KR102414532B1 (ko) 이소리퀴리티제닌 유도체를 포함하는 갈색 지방 유도화 분화 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16857634

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16857634

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1