KR101617584B1 - 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 복막 투석액에 관한 것이다. 본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 EMT 및 복막 세포의 세포사멸을 효과적으로 억제하기 때문에, 복막 섬유화 또는 복막 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of peritoneal fibrosis}

본 발명은 TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 복막 투석액에 관한 것이다.

당뇨병을 포함한 대사성 증후군, 고혈압, 신독성 물질 노출 기회의 증가, 약물 남용 및 공해 등에 의해 말기 신부전증으로 투석 치료를 받는 환자의 수는 기하급수적으로 늘어나고 있다. 국내에서도 말기 신부전 환자는 매년 10% 이상 증가하고 있으며, 이들 대부분은 혈액 투석과 복막 투석 등의 치료를 받는다. 복막 투석 환자는 자신의 복막을 "living dialysis membrane"으로 평생에 걸쳐 사용하여야 하므로, 수분 및 요독 제거의 기능이 잘 유지되는 건강한 복막은 성공적인 복막투석의 필수 불가결한 사항이다.

복막 투석을 장기간 시행할 경우 형태학적으로 중피 세포 탈락, 복막 섬유화, 혈관 변화 및 혈관신생 등이 발생할 수 있고, 기능적으로 한외여과부전 및 용질이동이 일어난다는 문제점이 있다. 이러한 변화들은 복막투석의 효율을 감소시켜 말기 신부전 환자에서 복막 투석 치료를 중단하게 만드는 중요한 원인이 된다(Margetts PJ, Bonniaud P. Basic mechanisms and clinical implications of peritoneal fibrosis. Perit Dial Int. 23(6):530-541,2003).

장기적으로 투석을 받는 환자에서 발생되는 복막 섬유화는 비가역적이고 불가피한 변화로 간주되며, 이러한 복막 섬유화는 복막 투석 시작 후 1-5년 사이에 환자 60%에서 나타나고, 투석 5년 후에는 평균 80% 이상의 환자에서 관찰되는 높은 발생률을 보인다.

이전의 연구들은 복막 투석 동안에 세포들이 표현형 변이인, EMT (epithelial-to-mesenchymal transition)를 겪는다고 제시하였다. EMT는 정상배아 발생과정 및 정상조직 회복 뿐만 아니라 신장, 폐, 눈, 대장 등에서 만성 염증질환으로 인한 섬유화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 인간 복막 중피 세포의 EMT는 복막 섬유화의 개시에 중요한 역할을 하며 이는 복막투석 환자에서 증명된 바 있다. 구체적으로, 복막 투석 환자로부터 분리한 복막 중피 세포에는 EMT 수준과 관련이 있는 GPR78/94의 증가가 관찰되며, 이러한 EMT는 E-cadherin 및 ZO-1의 발현의 감소와 de novo α-smooth muscle actin (이하, α-SMA) 발현 축적이 특징으로 알려져 있다. EMT는 가역적 과정으로 알려져 있기 때문에, EMT를 억제하는 것은 복막 기능을 보존하기 위한 치료적 타겟으로 고려될 수 있다.

상기와 같이 복막 섬유화가 일어나게 되면 투석을 시행할 수 없으므로 복막 투석의 장기 수행을 위해서는 복막 섬유화를 감소시키거나 예방하는 것이 매우 중요한 과제이다.

복막 섬유화를 예방 및 치료하기 위해서, 생체에 적합한 투석액의 개발, 투석액 내의 당 분해산물 농도 감소, 포도당 중합체 투석액, 세포내 유리기 제거 물질 및 퍼페니돈(Pirfenidone; PFD)과 같은 항섬유화 제제 등에 관한 연구가 보고되고 있으나, 아직까지 복막 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있는 약물에 대한 보고는 미흡한 실정이다. 따라서 부작용이 없고 치료 효과가 우수한 새로운 복막 섬유화 억제 약품의 개발에 대한 필요성이 있다.

본 발명의 목적은 TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 복막 투석액을 제공하는 것이다.

본 발명은 TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid)를 유효성분으로 포함하는 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, TUDCA는 "2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino] ethanesulfonic acid"을 화학명칭으로 하는 하기 구조식으로 표시되는 화합물을 의미한다:

TUDCA는 양친성 담즙산으로서, 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid)의 타우린(taurine) 컨쥬게이트 형태이다. TUDCA는 동물(예들 들어, 웅담)에서 추출하거나, 상업적으로 구매하여 사용하거나(예를 들어, Sigma-Aldrich), 공지된 방법으로 합성하여 사용할 수 있다.

본 발명의 TUDCA는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에서 TUDCA의 약학적으로 허용가능한 염은, TUDCA에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 허용가능한 염"은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 TUDCA의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

산부가염에 사용되는 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막 중피 세포의 EMT (epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제하고, 복막의 세포사멸을 억제함으로써 복막의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 복막 섬유증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 "복막 섬유증"은 복막이 섬유화된 상태를 의미하는 것으로서 복막에 섬유세포가 비정상적으로 형성된 것을 말한다. 복막의 섬유화는 예를 들어, 투석에 의해서 발생할 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 복막 섬유증 또는 섬유화의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 복막 섬유증 또는 섬유화의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "EMT (epithelial-to-mesenchymal transition)"는 상피세포가 중간엽 세포로 표현형 변이되는 것을 의미한다. 구체적으로 EMT는 세포간 결합이 느슨해지고 세포 골격이 변하면서 조직이 운동성을 획득하는 현상으로, 세포가 본래의 세포 표현형을 상실하고 간엽세포의 표현형으로 전환되는 것을 말한다. EMT가 유도되면 섬유아세포의 축적을 초래할 수 있으며, EMT의 유도는 복막 섬유화의 중요한 메커니즘으로 인식된다.

이러한 EMT는 소포체 스트레스 [ER (Endoplasmic recticulum) stress]에 의해 신장과 폐에서 유도된다고 보고된 바 있다. 소포체 스트레스(ER stress)는 섬유아세포를 축적시켜 EMT와 기관 섬유화를 일으킨다. 또한, ER 스트레스는 MAPKinase, Smad 및 Src 활성화를 통하여 배양된 폐포 상피 세포에서 EMT를 유도한다. 소포체 내강의 접히지 않은 단백질의 축적은 소포체 막으로부터 소포체 스트레스의 중추 조절자인 글루코스 조절 단백질(GPR)78/94을 방출시키고, GPR78를 이량체화하거나 세포 중 다른 위치로 이동시킨다.

TGF-β1는 ER 스트레스를 유도하고, 복막 중피 세포의 표현형 변이를 통하여 복막 섬유화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 구체적인 일 양태에서, 본 발명은 복막 중피 세포에서 ER 스트레스가 TGF-β1-유도성 EMT의 유도제이자 매개체인 것을 확인하였다. 보다 상세하게 TGF-β1는 인간 복막 중피 세포에서 XBP-1 스플라이싱과 함께 GRP78/94 및 ATF6의 발현을 증가시켰다(도 1).

본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막 중피 세포의 소포체 스트레스를 억제하여 EMT를 억제한다. 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 TUDCA는 TGF-β1의 처리로 증가한 GRP78/94, XBP-1 스플라이싱 및 ATF6의 발현을 유의성있게 감소시켰다(도 2).

또한, 본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막 중피 세포에 특이적으로 작용하여 EMT를 억제하고 섬유아세포의 축적을 억제하는 효과를 가진다.

TGF-β1-유도성 EMT는 상피세포 마커인 E-cadherin의 발현 감소와 중간엽 세포 마커인 α-SMA (α-smooth muscle actin)의 발현 증가가 나타나는 것이 특징이다. 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 TUDCA는 TGF-β1을 처리한 인간 복막 중피 세포에서 E-cadherin의 발현을 증가시켰고 α-SMA의 발현을 감소시켰다(도 3). 보다 상세하게 TGF-β1+TUDCA의 처리군은 E-cadherin의 발현과 α-SMA의 발현이 TGF-β1 미처리군과 유사하였다. 이와 같은 TUDCA의 효과는 종래 ER 스트레스 억제제로 알려져 있는 4-PBA (4-phenylbutyrate)와 비교하여 차별성이 있는, 복막 중피 세포에 대한 특이적 효과이다.

구체적인 일 양태에서, TUDCA와 4-PBA를 각각 처리하고 TGF-β1를 처리한 인간 복막 중피 세포에서 세포의 형태, E-cadherin 및 α-SMA의 발현을 확인하였다(도 4). TGF-β1+4-PBA군에서는 TGF-β1 처리군과 유사한 가늘고 긴, 섬유형의 세포가 많이 관찰되었으며, α-SMA 및 E-cadherin의 발현 수준도 TGF-β1 처리군과 유사한 결과를 나타내었다. 반면, TGF-β1+TUDCA군에서는 TGF-β1 미처리군과 유사한 장방형의 세포가 관찰되었고, 무시할만한 α-SMA 축적과 함께 뚜렷한 E-cadherin 발현이 확인되었다. 이를 통해 TUDCA는 복막 중피 세포에서 TGF-β1 유도성 EMT를 효과적으로 완화시킬 수 있고, 복막 섬유화 또는 복막 섬유증의 예방 및 치료제로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막 중피 세포의 TGF-β1 유도성 세포사멸을 억제한다.

구체적인 일 양태에서, TUDCA가 인간 복막 중피 세포에서 TGF-β1 유도성 세포사멸을 차단하는지 확인하기 위하여 Annexin V-FITC 결합에 대한 플로우 사이토메트릭 분석을 수행하였다. 그 결과, TUDCA는 TGF-β1 유도성 세포사멸을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 5).

본 발명의 복막 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 고형 제제에는 마그네슘, 스티레이드, 탈크 같은 윤활제도 포함될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필레글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 90 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 50 내지 90 중량%로 포함될 수 있다. 상기 첨가제의 예로는 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제, 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁제, 안정제, 착색제, 방향제, 수용성 첨가제, 부형제 등 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 보다 상세하게는 미결정 셀룰로오스, 락토스, 만니톨, 나트륨 시트레이트, 칼슘 포스페이트, 글리신 및 전분; 글리콜산 전분나트륨, 크로스포비돈, 크로스카르멜로즈 나트륨 및 특정 복합 실리게이트 등을 포함하는 붕해제; 포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 수크로오스, 젤라틴, 아카시아 검, 마크로골, 경질 무수 규산, 합성 규산 알루미늄, 규산 칼슘 또는 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트와 같은 규산염 유도체, 인산수소칼슘과 같은 인산염, 탄산칼슘과 같은 탄산염, 및 이들의 혼합물을 포함하는 결합제 및 스테아르산, 스테아르산 칼슘 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 스테아르산 금속염류, 탈크, 콜로이드 실리카, 자당지방산에스테르, 수소첨가된 식물성 오일, 고융점의 왁스, 글리세릴지방산에스테르류, 글리세롤디베헤네이트, 활석 및 이들의 혼합물을 포함하는 활택제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물에서 TUDCA의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 100 mg, 특히 약 0.1 내지 10 mg으로 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회 등으로 나누어 복수개의 단일 투여량 형태로 투여할 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에서 증감될 수 있으므로 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하 주사 등에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 치료학적으로 유효한 양의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 복막 섬유증의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "개체"는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 동물을 의미하고, 일 구체예에서는 포유류를, 또 다른 구체예에서는 인간을 의미한다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 질환을 치료 또는 예방하는데 유효한 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미한다.

또한, 본 발명은 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 복막 투석액을 제공한다. 상기 TUDCA 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 EMT 및 복막 세포의 세포사멸을 억제하므로, 복막 투석액 중에 포함되어 복막 섬유화 및 복막 섬유증을 개선, 지연, 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 복막 투석액은 삼투제, 완충액, 전해질 및 그들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어 삼투제는 포도당, 포도당 중합체(예를 들어, 말토덱스트린, 아이코덱스트린), 포도당 중합체 유도체, 시클로덱스트린, 변성전분, 히드록시에틸 전분, 폴리올, 과당, 아미노산, 펩티드, 단백질, 아미노당, 글리세롤, N-아세틸 글루코사민(NAG) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 완충액은 중탄산염, 락테이트, 피루베이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(즉, 트리스히드록시메틸아미노메탄), 아미노산, 펩티드, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 전해질은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 염화물을 포함할 수 있다.

본 발명의 복막 투석액은 하나 이상의 투석 성분(투석 용액의 요소 또는 구성 성분) 및 치료적 유효량의 유효물질을 포함할 수 있으며, 복막 섬유화 및 복막 섬유증을 개선, 완화, 예방 또는 치료하기 위한 성분으로 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 상기 복막 투석액은 투석 농축물일 수 있으며, 투석액에는 약 0.1 μM 내지 약 1000 μM의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 포함될 수 있다.

상기 복막 투석액은 단일 용기 내의 단일 투석 용액 또는 별도로 수용된 또는 다중-챔버를 가진 용기의 투석부로 사용될 수 있으며, 복막 투석 시 기존에 사용되는 투석액과 동시에 또는 시간차를 두고 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 EMT 및 복막 세포의 세포사멸을 효과적으로 억제하기 때문에, 복막 섬유화 또는 복막 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 복막 중피 세포(HPMC)에서 ER 스트레스에 대한 TGF-β1의 영향을 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 정량 분석 결과를 나타낸 것이다(*p<0.05 대. 기타).
도 2는 인간 복막 중피 세포(HPMC)에서 TGF-β1 유도성 ER 스트레스에 대한 TUDCA의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 정량 분석 결과를 나타낸 것이다(*p<0.05 대. 기타).
도 3은 TGF-β1 유도성 EMT에서 TUDCA의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, 역위상차 현미경을 이용하여 얻은 세포 형태 이미지, 웨스턴 블롯 및 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다(*p<0.05 대. 기타).
도 4는 TGF-β1 유도성 EMT에서 TUDCA와 4-PBA의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, 역위상차 현미경을 이용하여 얻은 세포 형태 이미지, 웨스턴 블롯 결과 및 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다(*p<0.05 대. 기타).
도 5는 TGF-β1 유도성 세포사멸에 대한 TUDCA의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, Annexin V-FITC 결합에 대한 플로우 사이토메트릭 분석 결과를 나타낸 그래프이다(*p<0.05. 대 기타).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 실험방법>

1. 시약

별도로 기재하지 않는 한, 모든 화합물 및 조직 배양 플레이트는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Co.; St. Louis, MO, USA) 및 Nunc Labware (Waltham, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2. 인간 복막 중피 세포( HPMCs )의 분리

인간 복막 중피 세포(HPMCs)는 공지된 방법을 사용하여 분리하고 유지하였다. 구체적으로, 선택 복부 수술을 시행한 환자 중 동의한 환자로부터 인간 장막 일부를 얻었으며, 이를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하고 0.05% 트립신-0.02% EDTA 용액에서 37℃를 유지하면서 지속적인 교반과 함께 배양하였다. 배양 후, 상청액을 4℃에서 5분 동안 500×g으로 원심분리하였으며, 이후 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 26 mmol/L NaHCO₃를 함유하는 M199에서 배양하였다. 분주 48시간 후에 배지의 절반을 교체한 후, 전체 배지를 4일에 한번씩 교체하였다. 모든 실험은 두 번째 및 네 번째 계대(passage) 사이의 세포를 사용하여 수행하였다. 조직 수확물들은 기관(ECT 1647-35)의 윤리의원회에서 승인하였고, 각 환자로부터 사전 동의를 얻었다.

3. 인간 복막 중피 세포( HPMCs )의 세포 형태 분석

세포 형태는 역위상차 현미경(Axiovert 200; Carl Zeiss, Oberkochen,Germany)으로 분석하였고, 이미지는 디지털 카메라(AxioCam HRC; Carl Zeiss)로 얻었다.

4. 웨스턴 블롯을 통한 EMT 마커 변화의 확인

단백질 샘플을 세포 용해물(30 ㎍)로부터 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고, 10% SDS-PAGE 겔상에 ?긴 후, 전자염색(electroblotting)을 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 블롯은 하기 항원에 결합하는 일차 항체들과 함께 차단 용액 중 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다:

GPR78/94 (Enzo Life Sciences, Plymouth, PA), p-PERK, p-eIF2α, ATF4, ATF6, CHOP (Cell signaling, Danvers), E-cadherin (BD Bioscience, Bedford, MA), α-SMA (Abcam) 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology).

블랏을 PBS 및 Tween 20으로 세척한 후, 각 일차 항체에 상응하는 홀스 래디쉬 패록시다아제-컨쥬게이트화된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였고, 이어서 강화 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드는 덴시토메트리(densitometry)로 정량하였고, 인간 β-actin의 발현과 비교하였다.

5. X-box-결합 단백질( XBP -1) 스플라이싱에 대한 역전사효소 - PCR 분석

XBP-1 mRNA의 스플라이싱은 스플라이싱되지 않은(unspliced) 동형단백질(isoform)(424 bp) 및 스플라이싱된(spliced) 동형 단백질(isoform)(398 bp) 모두를 검출하는 XBP-1 특이적 프라이머를 사용하여 반정량(semiquantitative) RT-PCR에 의해 검출하였다:(정방향 프라이머: CTGGAAAGCAAGTGGTAGA, 역방향 프라이머: CTGGGTCCTTCTGGGTAGAC) 또는 β-actin: (정방향 프라이머: TTCTGACCCATGCCCACCAT, 역방향 프라이머: ATGGATGATATCGCCGCGCTC).

6. 정량 실시간- PCR 분석(Quantitative real time- PCR analysis)

전사의 수준은 제조사(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)의 지시에 따라 이중 가닥 DNA 특이적 염색으로서 SYBR Green Ⅰ을 사용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (RT-PCR)로 확인하였다. PCR 반응은 5 μM의 cDNA, 10 μM의 SYBR Green PCR 마스터 믹스 및 반응 당 최종 부피 20 μM에 대하여 5 pM의 E-cadherin의 센스 및 안티센스 프라이머(정방향 프라이머: ACCCCTGTTGGTGTCTTT, 역방향 프라이머: TTCGGGCTTGTTGTCATTCT) 또는 α-SMA(정방향 프라이머: GGGAATGGGACAAAAAGACA, 역방향 프라이머: CTTCAGGGGCAACACGAA)를 이용하여 수행하였다.

일차 농도는 각 프라이머의 최적 농도 분석에 대한 예비적 실험에 의해서 결정되었다. 각 샘플 중에서 타겟 유전자의 상대적 mRNA의 발현 수준은 비교 CT(comparative CT) 방법을 사용하여 계산하였다. CT 값은 형광 신호가 정의된 실무율 보다 더 높을 때의 사이클 숫자이다. 통계적 분석을 위하여 적어도 세 번의 독립적 PCR 과정을 수행하였다. PCR 산물의 양은 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인, β-actin으로 정규화하였다.

7. 세포 세포사멸 평가: Annexin V- FITC 결합에 대한 플로우 사이토메트릭 분석

12시간 내지 48시간 동안 HPMC를 TM 또는 TG에 노출시킨 후, 세포를 DMEM 중의 트립신/EDTA 혼합액으로 처리하여 세포 현탁액을 제조하였다. 세포는 1×10⁶의 농도로 1×Annexin V 결합 완충액 중에서 재분산시켰다. 100 ㎕ 세포 현택액을 5 ㎕의 FITC Annexin V와 함께 15분 동안 어둠속 상온에서 인큐베이션시킨 후, 400 ㎕의 1×결합 완충액을 각 튜브에 첨가하였다. 샘플들을 FACS Calibur 플로우 사이토메터(Beckton Dickinson, San Jose, CA) 및 CellQuest 소프트웨어(Beckton Dickinson)으로 분석하였다. 세포사멸은 Annexin V 양성 세포들의 분획을 측정함으로써 평가하였다.

8. 통계적 분석

모든 데이타는 평균±SD 로 표시하였다. 군 간의 다양한 파라메터 간의 차이는 Student's t-test로 평가하였다. 결과는 P 값이 ≤0.05이었다면 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실시예 1: 인간 복막 중피 세포( HPMC )에서 ER 스트레스에 대한 TGF - β1의 영향

TGF-β1 (1 ng/ml)이 인간 복막 중피 세포에서 ER 스트레스를 유도하는지 확인하기 위하여, 소포체 스트레스의 중추 조절자인 글루코스 조절 단백질(GPR)78/94, XBP-1, ATF-6, CHOP, p-PERK, p-elF2α, ARF4의 발현 수준을 측정하였다. 발현 수준의 측정은 상술한 웨스턴 블롯과 RT-PCR 정량 분석 방법으로 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, TGF-β1 (1 ng/ml)을 인간 복막 중피 세포에 처리한 결과 GRP78/94, XBP-1 및 ARF6의 발현이 증가하였다. 한편, p-PERK, p-elF2α, ARF4의 발현 수준은 큰 변화가 관찰되지 않았다.

실시예 2: 인간 복막 중피 세포( HPMC )에서 TGF - β1 유도성 ER 스트레스에 대한 TUDCA의 효과

TUDCA의 EMT 개선 효과를 확인하기 위하여 TGF-β1 (1 ng/ml)로 인간 복막 중피 세포에서 ER 스트레스를 유도하고, TUDCA (300 μM) 처리 유무에 따른 GPR78/94, XBP-1 및 ATF-6의 발현 수준을 상술한 웨스턴 블롯과 RT-PCR 정량 분석 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, TGF-β1 (1 ng/ml)의 처리군에서는 GPR78/94, XBP-1 및 ATF-6의 발현 수준이 증가하였고, TGF-β1+TUDCA (300 μM) 처리군에서는 TGF-β1 미처리 군의 발현 수준과 유사한 정도로 GPR78/94, XBP-1 및 ATF-6의 발현이 감소되는 것이 측정되었다. 이를 통해 TUDCA가 ER 스트레스로 유도되는 복막 섬유화 또는 복막 섬유증을 효과적으로 억제할 수 있는 물질임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: TGF-β1 유도성 EMT에서 TUDCA의 효과

TUDCA의 EMT 개선효과를 확인하기 위하여, TGF-β1 (1 ng/ml)를 이용하여 인간 복막 중피 세포에서 EMT를 유도한 후, TUDCA (300 μM)처리 유무에 따른 변화를 확인하였다. 구체적으로, 세포 형태 이미지는 상술한 역위상차 현미경을 이용하여 관찰하였고, 상피세포 마커인 E-cadherin과 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 발현 변화는 상술한 웨스턴 블롯과 실시간 PCR법을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, TGF-β1 (1 ng/ml)의 처리는 장방형의 세포형태를 가진 인간 복막 중피 세포를 신장된 방추형태의 세포로 변화시키는 형태변화를 유도하였으며, TGF-β1 축적 48시간까지 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 축적과 함께 상피세포 마커인 E-cadherin의 감소를 보여주었다. 반면 TUDCA를 처리한경우, TGF-β1 유도된 세포 형태 변화와 α-SMA 및 E-cadherin의 발현 변화를 TGF-β1 미처리 군과 같은 수준으로 조절하는 결과를 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로 위상차 현미경으로 관찰한 결과, TGF-β1를 처리한 실험군에서는 장방형 및 조약돌 형태와 달리 가늘고 긴, 섬유형의 세포가 관찰된 반면, TGF-β1 미처리 또는 TGF-β1+TUDCA가 처리된 인간 복막 중피 세포에서는 무시할만한 α-SMA 축적과 함께 뚜렷한 E-cadherin 발현이 확인되었고, 이를 통해 TGF-β1 처리에 의한 EMT 유도가 TUDCA 처리에 의해 완화될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: TGF-β1 유도성 EMT에서 TUDCA 및 4-PBA의 효과

종래 ER 스트레스 억제제로 알려진 4-PBA(4-phenylbutyrate)와의 EMT 개선 효과를 비교하기 위하여, TGF-β1 (1 ng/ml)로 인간 복막 중피 세포에 EMT를 유도하고, TUDCA (300 μM)와 4-PBA (5 mM)의 처리에 따른 효과를 비교하였다. 구체적으로 세포 형태 이미지는 상술한 역위상차 현미경을 이용하여 관찰하였고, 상피세포 마커인 E-cadherin과 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 발현 변화는 상술한 웨스턴 블롯과 실시간 PCR법을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, TGF-β1의 처리에 따라 장방형의 세포형태를 가진 인간 복막 중피 세포를 신장된 방추형태의 세포로 변화시키는 형태변화가 유도되었고, α-SMA의 축적와 함께 E-cadherin의 감소가 나타났다.

TGF-β1+4-PBA군에서는 TGF-β1 처리군과 유사한 가늘고 긴, 섬유형의 세포가 많이 관찰되었으며, α-SMA 및 E-cadherin의 발현 수준도 TGF-β1 처리군과 유사한 결과를 나타내었다. 반면, TGF-β1+TUDCA군에서는 TGF-β1 미처리군과 유사한 장방형의 세포가 관찰되었고, 인간 복막 중피 세포에서는 무시할만한 α-SMA 축적과 함께 뚜렷한 E-cadherin 발현이 확인되었다. 이를 통해 종래 ER 스트레스 억제제로 알려진 4-PBA는 복막 중피 세포에서는 EMT 억제 효과가 미미한 것을 확인할 수 있었고, 반면 본 발명의 TUDCA는 복막 중피 세포에서 TGF-β1 유도성 EMT를 효과적으로 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: TGF-β1 유도성 세포사멸에 대한 TUDCA의 효과

TUDCA가 인간 복막 중피 세포에서 TGF-β1 유도성 세포사멸을 차단하는지 확인하기 위하여 상술한 Annexin V-FITC 결합에 대한 플로우 사이토메트릭 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그래프 중 괄호 안의 숫자는 Annexin V 결합의 형광 강도 시프트를 나타낸 것이다.

도 5에 나타나듯이, TUDCA (300 μM)는 TGF-β1 (1 ng/ml)으로 유도된 세포사멸을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

제제예 1: 산제의 제조

TUDCA 100mg

유당 100mg

탈 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

TUDCA 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

TUDCA 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

TUDCA 100mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of peritoneal fibrosis <130> P15-002-EHWA <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of E-cadherin <400> 1 acccctgttg gtgtcttt 18 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of E-cadherin <400> 2 ttcgggcttg ttgtcattct 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of alpha SMA <400> 3 gggaatggga caaaaagaca 20 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of alpha SMA <400> 4 cttcaggggc aacacgaa 18

Claims (7)

1. TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 복막 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제하는 것인 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막의 세포사멸을 억제하는 것인 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 복막 섬유증은 투석에 의해 발생하는 것인 약학적 조성물.
5. TUDCA(taurine-conjugated ursodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 복막 투석액.
6. 제5항에 있어서, TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제하는 것인 복막 투석액.
7. 제5항에 있어서, TUDCA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복막의 세포사멸을 억제하는 것인 복막 투석액.
   

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