KR101694063B1 - Ｂｉｏ 화합물을 함유하는 심혈관질환의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 심장조직을 구성하는 서로 다른 타입의 세포에 대해 각각 특이적으로 작용함으로써, 즉 심근세포의 성장을 유도하는 이외에, 심근섬유세포의 증식은 억제하며, 대식세포의 염증성 매개체를 강력히 억제함으로써, 심근경색 발병 후 심장의 조직과 기능을 현저히 회복시킬 수 있는 바, 심근경색을 포함하는 다양한 심혈관질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＢＩＯ 화합물을 함유하는 심혈관질환의 치료용 조성물{Composition comprising BIO compound for treating cardiovascular disease}

본 발명은, BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다.

심근경색증(myocardial infarction)은 심장의 주요 혈관이 막혀 혈류가 단절됨으로써 산소와 영양소의 공급의 차단되어, 심근세포(cardiomyocyte) 고사 또는 괴사에 의해 심기능이 저하되는 질환이다. 심근경색후 심근세포의 고사/괴사는 조직의 염증을 유발하고 심장근육의 수축기능을 저하시키기 때문에, 우리몸은 이에 대한 보상기전으로서 대식세포가 유입되어 심근세포의 잔여부산물을 제거하고 혈관 신생을 유도하여 경색부위의 혈류를 재개시킨다. 또한, 수축기능을 지속시키기 위하여 심근섬유세포(cardiac fibroblast)가 증식하여 경색부위로 이동한 후 세포외기질을 형성함으로써 소실된 심근세포(cardiomyocyte)의 자리를 대체하는 결과, 심장조직의 염증반응이 다시 개시되고 심장의 펌프기능은 저하되는 문제가 발생한다.

심근 경색 후의 사망은 경색 발생 수시간 이내에 가장 많이 일어나는데, 1시간 이내에 약 50%의 환자가 사망하고, 24시간 이내에 약 80%의 환자가 사망하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 심근경색의 조기 치료가 요망되고, 심근경색증 발생 후 재발을 예방함으로써 심근경색증 후 장기 사망률과 이환율을 줄일 필요가 있다.

종래, 심근경색증의 예방/치료제로서 아스피린, 항혈전제 등의 약물이 알려져 있으나, 아스피린의 경우 알러지, 내성 등의 문제점이 있으며, 항혈전제의 경우에는 출혈 위험성이 있다. 또한, 심근경색 치료 후 1년 내 사망률은 10%를 넘고, 심부전으로의 비가역적 진행으로 인하여 심장 이식 외에 다른 대안이 거의 없기 때문에, 강력한 치료효능을 갖는 새로운 약제의 개발이 필요하다.

한편, 글리코겐 신타제 키나아제-3(GSK-3)는 각각 별개의 유전자에 의해 코딩되는 α 및 β isoform으로 이루어진 세린/트레오닌 단백질 키나아제로서, 다양한 세포 기능을 조절하는 신호 전달경로와의 관련성이 알려져 있다. GSK3을 조절자로서 이용하는 경로에서의 이상은 백혈병, 당뇨병, 알츠하이머, 신경장애와 같은 질환 발병기전과 연관되어 있기 때문에, 이들 질환 치료를 위하여 GSK3를 타겟으로 하는 억제제의 개발이 활발하다(한국등록특허 제10-1290509호).

GSK3 억제제로서 화합물 (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(이하, 'BIO' 화합물)는 글리코겐 대사 관여 효소인 GSK3β의 효소활성을 억제하는 화합물로서, 줄기세포 분화, 및 당뇨, 알츠하이머 치료효과가 보고된 바 있다. 그러나, 아직까지 심근세포의 증식 외에, 심근섬유세포의 선택적 증식억제와 대식세포의 염증성 표현형 억제라는 병리적 미세환경 제어를 통하여, 경색심근의 기능/구조의 악화를 개선할 수 있는지에 대하여는 밝혀진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 BIO 화합물이 심근경색 후 심장을 구성하고 있는 심근세포, 심근섬유세포, 및 염증성 대식세포에 선택적으로 작용하여, 심근의 병리적 미세환경을 제어함으로써 심근경색증을 포함하는 다양한 심혈관질환을 치료할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 BIO 화합물을 유효성분으로 함유하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용한 심혈관질환의 치료방법 및 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 하기 화학식 1의 BIO 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은, 상기 BIO 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 BIO 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 심혈관질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 BIO 화합물은 2.5 내지 5uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 심혈관질환의 예방 또는 치료는 심근세포(cardiomyocyte)의 증식촉진 및 심근섬유세포(cardiac fibroblast)의 증식억제에 의한 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 심혈관질환의 예방 또는 치료는 대식세포의 염증성 억제에 의한 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 심혈관질환은 심근경색, 협심증, 동맥경화증, 또는 부정맥인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 BIO 화합물 함유 조성물에 의하면, 심장조직을 구성하는 서로 다른 타입의 세포에 대해 각각 특이적으로 작용함으로써, 즉 심근세포의 성장을 유도하는 이외에, 심근섬유세포의 증식은 억제하며, 대식세포의 염증성 매개체를 강력히 억제함으로써, 심근경색 발병 후 심장의 조직과 기능을 현저히 회복시킬 수 있는 바, 심근경색을 포함하는 다양한 심혈관질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, BIO 화합물이라는 단일 화합물이 심장조직을 구성하는 서로 다른 세포들에 달리 작용하여 심근보호 효과를 나타내기 때문에, 염증 또는 병리적 섬유화가 동반되는 다른 질환에 대하여도 치료효과를 기대할 수 있다.

도 1은, BIO 화합물에 의한 심근세포(CM)의 증식유도 효과를 BrdU-세포증식 어세이로 확인하여 정량화한 결과이다.
도 2는, BIO 화합물에 의한 심근섬유세포(cFB)의 증식억제 효과를 BrdU-세포증식 어세이로 확인하여 정량화한 결과이다.
도 3은, BIO 화합물에 의한 심근세포와 심근섬유세포의 선택적 조절 효과를 평가하기 위하여 BIO(5uM) 처리에 의한 세포증식률만 따로 계산하여 정량화한 결과이다.
도 4는, 심근경색(MI) 동물모델에서 BIO 화합물이 심근섬유화를 억제하는지 여부를 조직염색법으로 확인한 결과이다.
도 5는, BIO 화합물에 의한 in vitro 대식세포 염증성 억제효과를 평가하기 위하여, 대식세포주(RAW264.7)에서 염증성 마커(iNOS)의 발현량 감소여부를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 6은, BIO 화합물에 의한 in vivo 대식세포 염증성 억제효과를 평가하기 위하여, 심근경색 동물모델에서 심근내로 유입된 대식세포의 특성을 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 7은, BIO 화합물의 심근세포와 심근섬유세포 증식에 대한 선택적 효과가 GSK3β 억제활성과 관련있는지 확인하기 위하여, 심근섬유세포에 BIO 화합물과 다른 GSK3β의 억제제(LiCl)를 각각 처리한 후 p-GSK3β(비활성형)의 발현양을 웨스턴 블랏팅으로 비교평가한 결과이다.
도 8은, 심근섬유세포의 증식 억제효과를 BIO 처리군과 다른 GSK3β의 억제제(LiCl) 처리군에서 비교평가한 결과이다.

본 발명은, 하기 화학식 1의 화합물('BIO' 화합물) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 심혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 BIO 화합물((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심)은 가역적인 ATP-경쟁적 GSK-3β 억제제로 알려져 있으며, 인간 및 마우스의 배아줄기세포에서 미분화상태를 유지시키는 물질로 최초 보고되었다. 본 발명은 이러한 BIO 화합물 뿐만 아니라, 생체 또는 시험관내에서 동일/유사 효능을 나타내는 그 유도체를 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 BIO 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용매화물로 제조될 수 있다. '약학적으로 허용가능한 염'은, 특별히 언급되지 않는 한, 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 BIO 화합물은 1-10uM 농도, 바람직하게는 2.5-5 uM 농도, 더욱 바람직하게는 5uM 농도로 함유될 수 있다. 농도가 너무 낮으면 효과를 나타내지 않으며, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 상황에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.

본 발명에서 심혈관질환에 특별한 제한은 없으나, 심근경색, 협심증, 동맥경화증, 부정맥 등의 심혈관질환인 것이 바람직하다. 또한, 심혈관질환의 치료란, 심혈관질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 심혈관질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명의 약학 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명에서 '개체'란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 '약학적 유효량'은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 '투여방법'에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 심혈관질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에서는, BIO 화합물이 심근세포(CM)의 증식을 유도하는 한편, 심근섬유세포(cFB)의 증식은 억제함을 발견하였는 바, BIO 화합물이 심근경색 후 심장조직에 공존하는 심근세포와 심근섬유세포 중 심기능 회복에 positive한 심근세포를 선택적으로 활성시키는 반면, 심기능 회복에 negative한 심근섬유세포를 선택적으로 비활성시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 2 내지 4).

또한, 본 발명에서는, BIO 화합물이 심근경색(MI) 동물모델에서도 실제로 심장의 이완수축 기능을 잘 유지시킴으로써 심기능을 개선하고, 심근섬유화를 억제함으로써 심근경색 치료에 유효함을 확인하였다(실시예 5).

또한, 본 발명에서는, BIO 화합물이 in vitro(대식세포주) 및 in vivo(심근경색 동물모델) 모두에서 대식세포의 염증특성을 억제함으로써 심근경색 치료에 유효함을 확인하였다(실시예 6).

또한, 본 발명에서는, BIO 화합물의 심근세포와 심근섬유세포 증식에 대한 선택적 효과가 GSK3β 억제 활성과 관련 없으며, 심근섬유세포 증식 억제효과를 다른 GSK3β 억제제(LiCl)와 비교평가한 결과, LiCl에서는 관찰되지 않는 BIO 화합물 특유의 성질임을 확인하였다(실시예 7).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 시료 준비 및 세포배양

1-1. 시료준비

BIO 화합물(Sigma)은 세포실험시에는 DMSO에 녹여 세포배양액으로 희석하여 사용하였으며, 동물실험시에는 인산화버퍼용액(PBS)과 에틸알코올을 1:1로 혼합한 용액에 용해하여 실험 rat의 체중당 0.2kg을 매일 복강내 주사하여 사용하였다.

1-2. 심장 세포배양

생후 2일된 rat의 심장을 적출하고 생리식염수로 세척한 후, 멸균 작업대에서 좌심근을 분리하여 절편화하였다. 이들 심근조직을 collagenase 효소 용액에 넣고 37℃에서 흔들어 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 모아 세포배양 플라스크에 두었다. 1시간 후, 세포배양 플라스크 바닥에 부착된 심근섬유세포로부터 상층액을 새로운 배양 플라스크로 옮겨 부유되어 있는 심근세포를 분리하였다. 이때 두 세포 모두 10% 소태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM 배지(Gibco-BRL, USA)에 배양하여 이후의 실험에 이용하였다.

실시예 2: BIO 화합물에 의한 심근세포(CM)의 증식유도 효과

BIO 화합물이 심장 세포증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 심근세포(CM)과 심근섬유세포(cFb)를 함께 공배양한 후, BIO를 2.5 uM, 5 uM의 농도로 각각 처리하여 2일과 5일 후 세포증식을 정량화하였다.

심근경색 후 심장조직은 심근세포와 심근섬유세포가 공존하고 있으므로, 이를 모사하기 위하여 공배양 모델을 사용하였으며, 심근세포와 심근섬유세포를 구분하기 위하여, 심근세포는 cardiac troponin I라는 심근세포 특이 단백질에 대한 항체를 이용하여 구분하였다.

세포증식 어세이는 새롭게 DNA 합성되는 정도를 확인하기 위하여, BrdU(bromodeoxyuridine)를 세포배양액에 미리 첨가하여 세포의 DNA에 부착되도록 한 후, 항-BrdU 항체를 이용하여 발색을 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 배양중인 심근세포 중 세포분열을 하는(증식하고 있는) 심근세포의 증식율을 나타내는 'BrdU (+) CM/total CM'(회색 막대)과; 배양중인 심근세포와 심근섬유세포 전체 중 심근세포가 차지하는 비율을 나타내는 'CM/total cell'(검정 막대) 모두 BIO 처리에 의하여 현저하게 증가함을 알 수 있었다. 이때, BrdU (+) 세포는 현재 증식하고 있는 세포를, total cell은 배양중인 심근세포와 심근섬유세포를, total CM은 배양중인 심근세포를 의미한다.

실시예 3: BIO에 의한 심근섬유세포(cFB)의 증식억제 효과

BIO에 의한 심근섬유세포(cFB)의 증식억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 심근세포/심근섬유세포 공배양 모델에서, 전체 세포는 DAPI를 염색하여 세포수를 카운팅하고, cardiac troponin I로 염색되지 않고 DAPI로만 염색된 세포를 심근섬유세포로 간주하여 카운팅하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양중인 심근섬유세포 중 세포분열을 하는(증식하고 있는) 심근섬유세포의 증식율을 나타내는 'BrdU (+) cFB/total cFB'(회색 막대)과; 배양중인 심근세포와 심근섬유세포 전체 중 심근섬유세포가 차지하는 비율을 나타내는 'cFB/total cell'(검정 막대) 모두 BIO 처리에 의하여 현저하게 감소함을 알 수 있었다.

실시예 4: BIO에 의한 심근세포와 심근섬유세포의 선택적 조절 효과

BIO에 의해 심근세포와 심근섬유세포가 각각 선택적으로 조절되는지를 평가하기 위하여, 실시예 2 및 3의 결과 중 BIO 5uM 처리에 의한 세포증식률만 따로 계산하여 정량화하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, BIO에 의해 심근세포(회색 막대)와 심근섬유세포(검정색 막대)의 증식이 서로 반대로, 즉 선택적으로 조절되었음을 알 수 있었다.

실시예 5: 심근경색 후 BIO에 의한 심기능 /심근섬유화 개선효과

심근경색(MI) 동물모델에서 BIO 화합물이 실제 심기능을 개선하고 심근섬유화를 억제하는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

우선, 심근경색을 유도하기 위하여, 체중 200~230g의 래트를 ketamine (50mg/kg)와 xylazine (5mg/kg)으로 마취하고 흉부를 제모하고 소독하였다. 래트의 기도를 확보하여 마취호흡기를 연결시킨 후, 흉부를 절개하여 심장을 노출시켜 좌전하행지(left anterior descending artery, LAD) 부위의 심근을 봉합하여 혈류를 차단함으로서 심근경색(MI) 동물모델을 확립하였다.

이후, 상기 심근경색 동물모델에 생리식염수(saline) 또는 BIO를 매일 0.2mg/체중의 양으로 복강주사한 후, 2주일 후에 래트를 마취하여 심장초음파검사로 심기능을 검사하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군(MI+saline)에 비하여 BIO 처리군(MI+BIO)에서는, 심장의 이완수축 기능이 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다 (*; 생리식염수군과 통계적 차이 있음).

지표	Non-MI	MI + Saline	MI + BIO
IVSd	0.110 ± 0.029	0.063 ± 0.013	0.079 ± 0.013*
IVSs	0.140 ± 0.022	0.070 ± 0.014	0.084 ± 0.028
LVIDd	0.893 ± 0.022	1.013 ± 0.026	0.900 ± 0.066*
LVIDs	0.580 ± 0.012	0.885 ± 0.024	0.736 ± 0.074*
LVPWd	0.130 ± 0.014	0.078 ± 0.010	0.089 ± 0.023
LVPWs	0.170 ± 0.012	0.073 ± 0.005	0.115 ± 0.019*
EDV	1.523 ± 0.111	2.135 ± 0.153	1.563 ± 0.308*
ESV	0.460 ± 0.035	1.483 ± 0.121	0.911 ± 0.251*
EF	69.845 ± 2.360	30.673 ± 1.659	41.313 ± 6.823*
SV	1.063 ± 0.102	0.653 ± 0.052	0.651 ± 0.116
FS	35.180 ± 1.89	12.615 ± 0.755	18.262 ± 3.525*

이때, 상기 지표가 의미하는 바는 다음과 같다.

IVSd; interventricular septum (diastole), 확장기 심실 중격의 두께

IVSs; interventricular septum (systole), 수축기 심실 중격의 두께

LVIDd; left ventricular internal dimension (diastole), 확장기 좌심실 내벽의 두께

LVIDs; left ventricular internal dimension (systole), 수축기 좌심실 내경

LVPWd; left ventricle posterior wall thickness (diastole), 확장기 좌심실 내경

LVPWs; left ventricle posterior wall thickness (systole), 수축기 좌심실 후벽의 두께

EF; ejection fraction, 박출 계수

FS; fractional shortening, 구획 단출률

또한, 심근섬유화를 정량하기 위하여, 심장조직을 적출하여 포르말린에 고정한 후, 파라핀 블록으로 조직을 가공한 후 10 um 두께로 절편을 만들어 Masson's trichrom법으로 조직염색하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(MI+vehicle)에 비하여 BIO 처리군(MI+BIO)에서는, 섬유화 영역(청색부분)이 현저히 감소하였음을 알 수 있었다.

실시예 6: BIO에 의한 대식세포 염증성 억제 효과

6-1. in vitro 억제효과 확인

마우스 대식세포주인 RAW264.7(한국세포주은행)를 DMEM 배양액에 소태아혈청 10%를 첨가하여 배양한 후, 대식세포의 염증개시를 위하여 100 ng/mL 농도의 LPS(lipopolysaccharide)를 배양액에 첨가하였다. 이후, BIO 화합물을 0, 1, 2.5, 5uM의 농도로 처리한 후, 염증성 마커인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현유도에 미치는 영향을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, BIO 미처리군에 비하여 BIO 처리군에서는 농도 의존적으로 iNOS 발현이 감소되었는 바, 대식세포의 염증성이 억제됨을 알 수 있었다.

6-2. in vivo 억제효과 확인

대식세포는 크게 염증성 M1형과 항염증성 M2형으로 구분할 수 있는데, 조직의 염증초기에는 대식세포가 염증성 M1 특성으로 인하여 주변의 불순물이나 박테리아 등의 감염원을 제거하고, 이후에는 M2형 항염증성으로 특성이 전환되어 조직의 염증반응을 종료시키고 손상된 조직을 복구하는 역할을 수행한다. 그러나 만약, 이러한 정상적인 진행이 일어나지 않으면 병적인 염증이 지속되고 조직의 치유과정이 지연되어 심장의 구조와 기능의 저하를 유발하게 된다.

따라서, 심근경색(MI) 동물모델에서 BIO 화합물이 대식세포의 이러한 특성 변화에 어떠한 영향을 미치는지 평가하기 위하여, 상기 실시예 5의 심근경색 동물모델 심장조직에서 심근내로 유입된 대식세포의 특성을 면역형광염색으로 확인하였다.

구체적으로, 심근경색 심장조직 슬라이드에 항-CD68 항체와 항-Arg1 항체를 처리하고, 2차 항체로 형광이미지를 가시화시켜, 공초점현미경으로 800배 확대하여 조직을 관찰하였다. 조직내 대식세포는 CD68를 발현하고 있으므로 항-CD68 항체를 이용하여 대식세포를 구분한 것이다. 또한, 조직내 대식세포의 특성을 구분하기 위하여 사용되고 있는 마커는, 염증성 M1 대식세포의 경우 iNOS이고, 항염증성 M2 대식세포는 Arg1(arginase 1)이므로, 심근경색 후 2주일째 심장의 대식세포 표현형이 M2로 얼마나 잘 전환되었는지를 판단하기 위하여, 대식세포의 항염증성 마커인 Arg1으로 염색한 것이다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, BIO 처리군의 심근내에서는 Arg1 발현 대식세포가 우세하였는 바, 심근경색 동물모델에서 BIO 화합물이 항염증성 M2형의 대식세포로 특성변화 유도함을 알 수 있었다.

실시예 7: BIO와 다른 GSK3 억제제( LiCl ) 와의 비교실험

7-1. GSK3β 억제여부

BIO 화합물의 심근세포와 심근섬유세포 증식에 대한 선택적 효과가 GSK3β 억제 활성과 관련있는지 확인하기 위하여, 다른 GSK3β의 억제제로 알려진 LiCl와 비교 실험을 수행하였다. GSK3β는 인산화된 형태가 비활성 상태이므로, 웨스턴 블랏팅으로 p-GSK3β의 발현양 증가여부를 확인하여 GSK3β의 억제를 평가하였다.

구체적으로, 심근섬유세포에 0, 0.25, 2.5, 5μM 농도의 BIO 화합물과, LiCl을 각각 2일간 처리한 후, 항-p-GSK3β, 항-GSK3β 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, BIO 5μM의 처리군과 LiCl 처리군을 비교해보면, LiCl 처리시에만 비활성형인 p-GSK3β가 증가하였다. 이러한 결과는, BIO가 종래 GSK3β의 억제제로 알려져 있기는 하나, 본 발명에서는 심근섬유세포에서 BIO가 GSK3β의 억제 활성을 통하지 않음을 의미하는 것이다.

7-2. 심근섬유세포 증식 억제여부

상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 심근섬유세포의 증식 억제효과를 BIO 처리군과 LiCl 처리군에서 비교평가하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 심근섬유세포의 증식 억제효과는 BIO 5μM, 10μM의 처리군에서만 관찰되었고, LiCl 처리군에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, BIO 화합물이 GSK3β 효소 억제활성과는 별개의 독특한 작용기전을 통해 심근섬유세포의 증식을 선택적으로 억제함을 시사하는 것이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 심근경색의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 심근경색의 예방 또는 치료는 심근섬유세포의 증식 억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 심근경색의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 2.5 내지 5uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 심근경색의 예방 또는 치료는 대식세포의 염증성 억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
5. 삭제

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