WO2021201171A1 - 神経炎症の抑制、そのための組成物及び方法 - Google Patents

神経炎症の抑制、そのための組成物及び方法 Download PDF

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neuroinflammation
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萩原正敏
小林亜希子
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    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells

Definitions

  • the present disclosure relates to suppression of neuroinflammation, compositions and methods for that purpose.
  • the present disclosure relates to assisting the transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons, in one or more embodiments, the compositions and methods thereof.
  • the present disclosure relates to, in one or more embodiments, the promotion of stabilization of Nrf2 (NF-E2-related factor 2) protein in glial cells, compositions and methods for that purpose.
  • the present disclosure relates to the protection of nerve cells from neuroinflammation, the compositions and methods thereof, in one or more embodiments.
  • Parkinson's disease is a progressive neurodegenerative disease characterized by the loss of dopaminergic neurons (dopaminergic neurons) in the substantia nigra striatum.
  • dopaminergic neurons dopaminergic neurons
  • iPS cells or iPSCs induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells have the potential to supply large amounts of dopaminergic nerves. Therefore, pluripotent stem cells are considered as a new source of donor cells.
  • neural progenitor cells and dopaminergic neurons differentiated from stem cells such as iPS cells have an extremely low survival rate (survival rate) after transplantation into the brain (Patent Document 1).
  • Microglia are a type of glial cells located in the central nervous system (brain and spinal cord). Microglia are also called microglia or Hortega cells. Microglia are thought to be immunocompetent cells such as macrophages. Microglia have various actions and roles such as antigen-presenting action, which is the starting point of immune response, innate immunity action against foreign substances, phagocytosis against foreign substances and waste products, assisting the formation of neural circuits, and production of various substances that affect surrounding cells. Has. Microglia become active due to external stimuli, stress, etc., and produce useful substances such as antioxidants and nutritional factors.
  • microglia secrete inflammatory cytokines, chemokines, nucleic acids, excitatory amino acids such as glutamic acid, active oxygen species, proteases, etc. due to pathological activation, and damage surrounding cells, thereby causing neuroinflammation. It becomes. Therefore, microglia can also cause neurodegeneration of the central nervous system (Patent Document 2).
  • DYRK1A protein which is a protein kinase
  • DYRK1A protein is a protein kinase
  • DYRK is a general term for enzymes that mean dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase.
  • the present disclosure in one aspect, provides a pharmaceutical composition for suppressing neuroinflammation.
  • the present disclosure in one aspect, provides a pharmaceutical composition for assisting the transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons.
  • the present disclosure in one aspect, provides a pharmaceutical composition for promoting stabilization of the Nrf2 protein in glial cells.
  • the present disclosure in one aspect, provides a pharmaceutical composition for protecting nerve cells from neuroinflammation.
  • the present disclosure relates to, in one embodiment, a pharmaceutical composition for suppressing neuroinflammation, which comprises a compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present disclosure relates to neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons containing a compound having the ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present disclosure is a medicament for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells, which comprises, in other embodiments, a compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is included in the composition.
  • a pharmaceutical composition for protecting nerve cells from neuroinflammation which comprises, as an active ingredient, a compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof. ..
  • the present disclosure relates to a method for suppressing neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure in other embodiments, comprises administering to the recipient an effective amount of the pharmaceutical composition according to the present disclosure before, simultaneously, or after transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons.
  • the present invention relates to a method for improving the viability of the transplanted cells.
  • the present disclosure relates to a method for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells and protecting nerve cells from neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject in another aspect. ..
  • the present disclosure comprises frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and multiple sclerosis, which, in other aspects, comprises administering to the subject an effective amount of the pharmaceutical composition according to the present disclosure. It relates to a method of amelioration, progression inhibition, and / or treatment of a disease associated with neuroinflammation selected from the group.
  • neuroinflammation can be suppressed in one or more embodiments.
  • the survival rate after transplantation of the neural progenitor cells, stem cells, and / or neurons to be transplanted can be improved.
  • stabilization of the Nrf2 protein in glial cells can be promoted and improved.
  • nerve cells can be protected from neuroinflammation.
  • FIG. 1 relates to the induction of p21 and Nrf2 in glial cells.
  • FIG. 1A shows the results of Western blot analysis when microglial cells were treated with Compound 1.
  • FIG. 1B is a representative image of glial cells treated with compounds 1 and 2.
  • FIG. 1C is an example of quantification of the signal intensity of Nrf2 in the nucleus of Cd11b-positive cells.
  • FIG. 2 relates to suppression of neuroinflammation (microglial cytokine production).
  • FIG. 2A shows the results of qPCR evaluation of cytokine, chemokine, and iNOS mRNA production during lipopolysaccharide (LPS) treatment.
  • FIG. 2B shows the results of ELISA quantification of cytokines produced by LPS stimulation.
  • FIG. 2C shows the results of qPCR analysis on the production of the indicated cytokines in the presence or absence of Nrf2.
  • FIG. 3 relates to an improvement in neuron transplantation efficiency.
  • FIG. 3A is an experimental scheme.
  • FIG. 3B is a representative image of iPSC-derived dopaminergic neurons (DA neurons) transplanted into mouse striatal tissue.
  • FIG. 3C shows the results of quantitative analysis of transplanted cells.
  • FIG. 4 relates to suppression of neurodegeneration caused by neuroinflammation.
  • FIG. 4A is an experimental scheme.
  • FIG. 4B is a representative image of the substantia nigra of the treated animal.
  • FIG. 4C shows the result of quantifying the number of TH-positive cells in the substantia nigra compact (SNpc).
  • FIG. 4D is the result of a quantitative analysis of glia activation by qPCR of striatal tissue one day after the last LPS injection.
  • 4E and F are the results of analysis of cytokine and chemokine levels shown from the striatal tissue of Day 1 by qPCR (E) and ELISA (F).
  • FIG. 5 relates to the mechanism of neuroprotective function (improvement of transplantation efficiency of iPS cell-derived neurons and inhibitory effect of cytopathic effect due to cell inflammation).
  • FIG. 5A is a representative image of hiPSC-derived dopaminergic neural progenitor cells.
  • FIG. 5B is a quantitative analysis of the number of hNuclei.
  • FIG. 5C is a PCR quantification.
  • the present disclosure is based on the finding that a compound having the ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein can suppress neuroinflammation.
  • the present disclosure is also based on the finding that a compound having the ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein can improve the retention rate (survival rate, survival rate) of neurons transplanted into the brain.
  • the present disclosure is also based on the finding that compounds capable of inhibiting the phosphorylation activity of the DYRK1A protein can promote the stabilization of the Nrf2 protein in glial cells and protect them from neuroinflammation.
  • DYRK1A The mechanism by which a compound having an inhibitory ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein exerts an effect capable of suppressing neuroinflammation is not clear in detail, but is presumed as follows. Normally, microglia, which play a role in supporting nerves, are activated when subjected to stress such as injury or neuroinflammation, release inflammatory cytokines and reactive oxygen species, and degenerate neurons. At this time, if DYRK1A is inhibited, cyclins D1 and p21 are stabilized, the decomposition of Nrf2 is stopped, and Nrf2 is stabilized. This Nrf2 suppresses the expression of genes that produce pro-inflammatory cytokines and suppresses the excessive activation of microglia.
  • Neuroinflammation inhibitor A pharmaceutical composition for suppressing neuroinflammation, which comprises, as an active ingredient, a compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter, also referred to as a neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure). ).
  • the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure can suppress neuroinflammation by suppressing excessive activation of microglia in one or more embodiments.
  • the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure can suppress excessive activation of microglia and suppress neuroinflammation by promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells.
  • the glial cell refers to a non-neuronal cell that supports a neuron (nerve cell), and in one or more embodiments, microglia, astrocytes, and oligodedrocytes are mentioned, and microglia are preferable.
  • Nrf2 is a transcription factor important for maintaining homeostasis of the living body.
  • stabilization of the Nrf2 protein means that, in one or more embodiments, the degradation of the Nrf2 protein is suppressed and the intracellular amount of the Nrf2 protein is increased. Stabilization of Nrf2 can be confirmed in one or more embodiments with reference to examples.
  • the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure can be made into a dosage form suitable for the administration form by applying a well-known formulation technique in one or more embodiments.
  • the administration form is not limited to these, and examples thereof include oral administration in the form of tablets, capsules, granules, powders, pills, lozenges, syrups, liquids and the like.
  • parenteral administration in the form of injections, liquids, aerosols, suppositories, patches, poultices, lotions, liniments, ointments, eye drops and the like can be mentioned.
  • compositions of the present disclosure are further pharmaceutically acceptable carriers, preservatives, surfactants, pH adjusters, diluents, additives described above, or other pharmaceuticals. May contain an acceptable component.
  • excipient examples include, but are not limited to, starch, potato starch, starch such as corn starch, lactose, crystalline cellulose, calcium hydrogen phosphate and the like.
  • examples of the lubricant include, but are not limited to, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, shellac, talc, carnauba wax, paraffin and the like.
  • examples of the binder include, but are not limited to, polyvinylpyrrolidone, macrogol, and compounds similar to the excipient.
  • disintegrant examples include, but are not limited to, compounds similar to the excipients and chemically modified starch / celluloses such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and crosslinked polyvinylpyrrolidone. ..
  • the stabilizer includes, but is not limited to, paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalconium chloride; phenol and cresol. Such as phenols; timerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid can be mentioned.
  • the flavoring agent include, but are not limited to, sweeteners, acidulants, flavors and the like that are usually used.
  • the solvent used in the production of the liquid preparation is not limited to these, but ethanol, phenol, chlorocresol, purified water, distilled water and the like can be used, and if necessary, a surfactant or an emulsifier can also be used.
  • a surfactant or an emulsifier include, but are not limited to, polysorbate 80, polyoxyl 40 stearate, lauromacrogol and the like.
  • the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure may be administered to a subject suffering from a disease associated with neuroinflammation.
  • Diseases associated with neuroinflammation include frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and multiple sclerosis in one or more embodiments.
  • Targets include humans and non-human animals. Examples of the animal include mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, and monkeys in one or more embodiments.
  • the dose of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure may vary depending on symptoms, age, administration method, and the like.
  • the method of use is not limited to these, but is intermittent or continuous so that the concentration of the compound of the active ingredient in the body is between 100 nM and 1 mM, orally, transdermally, submucosally, subcutaneously, and intramuscularly.
  • the lower limit is 0.01 mg (preferably 0.1 mg) and the upper limit is 0.01 mg (preferably 0.1 mg) per day in terms of the compound of the active ingredient for the subject (adult in the case of human).
  • 2000 mg (preferably 500 mg, more preferably 100 mg) may be administered once or in several divided doses depending on the symptoms.
  • the lower limit is 0.001 mg (preferably 0.01 mg) and the upper limit is 500 mg (preferably 50 mg) per day for a subject (adult in humans). Is administered once or in several divided doses according to the symptoms.
  • the present disclosure relates to a method for suppressing neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure relates to a method for suppressing excessive activation of microglia and suppressing neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure in other embodiments, suppresses excessive activation of microglia by promoting stabilization of the Nrf2 protein, which comprises administering an effective amount of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure to a subject. It relates to a method of suppressing neuroinflammation.
  • the present disclosure relates to a method for improving, suppressing progression, and / or treating a disease associated with neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure in one embodiment, is the transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons containing a compound having the ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for assisting (hereinafter, also referred to as a transplantation aid according to the present disclosure).
  • cell transplantation means, in one or more embodiments, transplanting cells to a specific site of a transplant target (recipient) and engrafting (fixing) the transplanted site and / or a peripheral site thereof. And / or appropriately differentiate according to the surrounding environment.
  • Specific sites to be transplanted include, in one or more embodiments, the nervous system, central nervous system (eg, brain, spinal cord), peripheral nervous system, or tissues thereof.
  • adjustance for transplantation refers to an improvement in the survival rate, colonization rate, and / or survival rate of transplanted cells after transplantation in one or more embodiments. Improvements in cell viability, colonization, and / or survival can be confirmed in one or more embodiments with reference to Examples.
  • "transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons” may be, in one or more embodiments, transplantation of these cells themselves, or in a form comprising other cells. It may be a transplant, and may be a form of transplant in which neural progenitor cells, stem cells, and / or neurons are included in a part of an organ (organ), tissue, or aggregate.
  • the "nerve progenitor cell” refers to a cell capable of differentiating into a nerve cell, and the differentiation stage thereof is not particularly limited.
  • the neural progenitor cells used in the present disclosure may be neural stem cells in one or more embodiments.
  • the neural progenitor cells used in the present disclosure may be cells isolated from mammalian brain tissue such as humans in one or more embodiments.
  • the neural progenitor cells used in the present disclosure were obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and human-induced pluripotent stem cells (iPS cells) in one or more embodiments. It may be a cell (sometimes referred to as an ES cell-derived cell or an iPS cell-derived cell, respectively).
  • pluripotent stem cells used in the present disclosure include pluripotent stem cells and neural stem cells that can differentiate into neural cells in one or more embodiments.
  • the pluripotent stem cells include ES cells, iPS cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation, sperm stem cells (GS cells), and embryonic germ cells (in one or more embodiments).
  • EG cells cultured fibroblasts
  • pluripotent stem cells (Muse cells) derived from bone marrow stem cells, and the like.
  • the neuron (nerve cell) is not particularly limited, and examples thereof include neurons induced to differentiate from neural progenitor cells in one or more embodiments.
  • the neural progenitor cells and neurons to be transplanted include, in one or more embodiments, dopaminergic neuron progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells and dopaminergic neurons differentiated from pluripotent stem cells. Can be mentioned.
  • the transplantation aid according to the present disclosure can be used so as to be administered to the recipient before, at the same time as, or after the transplantation to the transplantation target (recipient).
  • the transplant aid may be added to the cells to be transplanted prior to transplantation.
  • Recipients include humans or non-human animals. Examples of the animal include mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, and monkeys in one or more embodiments.
  • the cells to be transplanted can also be the above-mentioned human or non-human animal cells.
  • the recipient and the type of cell to be transplanted may be the same or different.
  • the dose of the transplantation aid according to the present disclosure varies depending on the purpose of administration, administration method, situation of administration target (gender, age, body weight, medical condition, etc.), but when administered to humans, one or more.
  • the active ingredient may be used to be administered at 10-1200 mg, or 100-1200 mg, per day. Alternatively, it may be the same as the above-mentioned neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure.
  • the administration route of the transplantation aid according to the present disclosure includes direct contact with the transplanted part or transplanted cells, or oral, transdermal, submucosal, subcutaneous, intramuscular, intravascular, intracerebral, or intraperitoneal administration.
  • Examples of commonly used administration forms include solvents, tablets, capsules, granules, fine granules, powders, sublingual tablets, syrups, suspensions and the like.
  • Transplantation aids in the form of liquids may be administered parenterally as injections.
  • the above-mentioned dosage form can be produced by blending the active ingredient according to the present disclosure with an acceptable ordinary carrier, excipient, binder, stabilizer and the like. When the transplantation aid according to the present disclosure is used as an injection, an acceptable buffer, dissolution aid, isotonic agent and the like can be added.
  • the transplantation aids according to the present disclosure may improve survival, colonization, and / or survival of post-transplant neurons in a subject in one or more embodiments. Therefore, the transplantation aid according to the present disclosure can be used for transplantation of an organ (organ), tissue, or cell for regenerative medicine in one or more embodiments.
  • the transplantation aid according to the present disclosure in one or more embodiments, includes cerebral infarction, spinal cord infarction, cerebral bleeding, spinal bleeding, facial nerve palsy, limb nerve palsy, Levy body dementia, Down's disease, depression, nerve. It can be used for transplantation in surgery (treatment) of neurological diseases such as degenerative diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Huntington's disease showing progressive neurological loss.
  • the present disclosure in other embodiments, administers an effective amount of the transplantation aid according to the present disclosure to a recipient prior to, simultaneously with, or after transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons.
  • the present invention relates to a method for improving the viability of the transplanted cells, including.
  • the present disclosure also comprises administering an effective amount of the transplantation aid according to the present disclosure to a recipient before, at the same time, or after transplantation in other embodiments, that is, neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and /. Or related to the method of transplanting neurons.
  • Nrf2 stabilizer is a pharmaceutical composition for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells, which comprises, in one embodiment, a compound having an inhibitory ability on the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a substance (hereinafter, also referred to as an Nrf2 stabilizer according to the present disclosure).
  • the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure can promote stabilization of Nrf2 protein in glial cells in one or more embodiments.
  • the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure can suppress excessive activation of glial cells by promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells in one or more embodiments. Since activation of microglia is the starting point of neuroinflammation, the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure can suppress the activation of glial cells and suppress neuroinflammation in one or more embodiments.
  • the administration form, dosage form, dosage, etc. of the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure can be the same as that of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure.
  • the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure may be administered to a subject suffering from a disease associated with neuroinflammation.
  • Diseases associated with neuroinflammation include frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and multiple sclerosis in one or more embodiments.
  • Targets include humans and non-human animals.
  • the present disclosure relates to a method for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells, which comprises administering an effective amount of the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure relates to a method for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells and suppressing neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure relates to a method for improving, suppressing progression, and / or treating a disease associated with neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the Nrf2 stabilizer according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure in one embodiment, is a pharmaceutical composition for protecting nerve cells from neuroinflammation, which comprises, in one aspect, a compound having an inhibitory ability on the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. , Also referred to as the neuroprotective agent according to the present disclosure).
  • the neuronal protective agent according to the present disclosure can suppress excessive activation of glial cells by promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells in one or more embodiments. Since activation of microglia is the starting point of neuroinflammation, it is possible to suppress neuroinflammation by suppressing activation of glial cells and achieve protection of nerve cells.
  • the administration form, dosage form, dose, etc. of the neurocellular protective agent according to the present disclosure can be the same as that of the neuroinflammation inhibitor according to the present disclosure.
  • the neuronal protective agent according to the present disclosure may be administered to a subject suffering from a disease associated with neuroinflammation.
  • Diseases associated with neuroinflammation include frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and multiple sclerosis in one or more embodiments.
  • Targets include humans and non-human animals.
  • the present disclosure relates to a method for protecting nerve cells from neuroinflammation, which comprises, in other embodiments, administering an effective amount of the nerve cell protective agent according to the present disclosure to a subject.
  • the present disclosure relates to a method for protecting nerve cells by suppressing neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the nerve cell protective agent according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the present disclosure protects nerve cells by suppressing activation of glial cells and suppressing neuroinflammation, including administration of an effective amount of the nerve cell protective agent according to the present disclosure to a subject in another embodiment. Regarding how to do it.
  • the present disclosure relates to a method for ameliorating, suppressing the progression, and / or treating a disease associated with neuroinflammation, which comprises administering an effective amount of the neuronal protective agent according to the present disclosure to a subject in another aspect.
  • the active ingredient (also referred to as the active ingredient according to the present disclosure) of the pharmaceutical composition (neuroinflammation inhibitor, transplantation aid, Nrf2 stabilizer and neuron protectant) according to the present disclosure inhibits the phosphorylation activity of the DYRK1A protein.
  • the compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein those disclosed in WO2018 / 043674 and WO2015 / 107945 can be used in one or more embodiments. The contents of these documents are incorporated as part of this disclosure.
  • DYRK1A promotes the decomposition of cyclin D1 and p21 by phosphorylating cyclin D1.
  • the compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein in the present disclosure includes at least one selected from the group consisting of the compounds represented by the following formulas (I) to (III) in one or more embodiments. Be done.
  • R 1 and R 2 are independently hydrogen atoms or hydrocarbon chains having 1 to 6 carbon atoms
  • R 4 is a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are independently hydrogen atoms, halogen atoms, carboxyl groups, amino groups, hydroxyl groups, and alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms. , Or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms substituted with a halogen atom.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in one or more embodiments, and a methyl group, an ethyl group, or a propyl group in one or more embodiments. ..
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in one or more embodiments and a methyl group in one or more embodiments.
  • R 4 is a hydrogen atom in one or more embodiments.
  • the compound represented by the general formula (I) may be used in one or more embodiments. It is a compound represented by.
  • R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are hydrogen atoms in one or more embodiments.
  • the compounds represented by the general formulas (II) and (III) are used in one or more embodiments. It is a compound represented by.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” contains a pharmacologically and / or pharmaceutically acceptable salt, and includes, for example, an inorganic acid salt, an organic acid salt, an inorganic base salt, an organic base salt, an acid or a base. Examples include sex amino acid salts.
  • Preferred examples of the inorganic acid salt include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like
  • preferred examples of the organic acid salt include, for example, acetate, succinate, and the like. Examples thereof include fumarate, maleate, tartrate, citrate, lactate, stearate, benzoate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate and the like.
  • Preferred examples of the inorganic base salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
  • Preferred examples of the organic base salt include, for example, diethylamine salt, diethanolamine salt, meglumine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt and the like.
  • Preferred examples of the acidic amino acid salt include, for example, aspartate and glutamic acid.
  • Preferred examples of the basic amino acid salt include, for example, an arginine salt, a lysine salt, an ornithine salt and the like.
  • the "salt of a compound” may include a hydrate that can be formed by absorbing water when the compound is left in the air.
  • the “salt of a compound” may also include a solvate in which the compound can be formed by absorbing certain other solvents.
  • the alkyl group may be a linear, branched or cyclic alkyl group in one or more embodiments.
  • the "alkyl group having 1 to 4 carbon atoms” means, in one or more embodiments, a straight chain or a branch having 1, 2, 3 or 4 carbon atoms, or a cyclic group having 3 or 4 carbon atoms.
  • Examples thereof include a sec-butyl group and a tert-butyl group.
  • Examples of the cyclic alkyl group having 3 or 4 carbon atoms include a cyclopropyl group and a cyclobutyl group in one or more embodiments.
  • the "hydrocarbon chain having 1 to 6 carbon atoms” is derived by removing one arbitrary hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms.
  • the basis of value may be derived by removing one arbitrary hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms.
  • the hydrocarbon chain may have a linear structure, a branched chain structure or a cyclic structure, and examples thereof include an alkyl group, an alkenyl group, a phenyl group, and a cycloalkyl group.
  • alkyl group having 1 to 6 carbon atoms means, in one or more embodiments, a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, a 2-propyl group, a 2-methyl-1-propyl group, 2-.
  • Methyl-2-propyl group 1-butyl group, 2-butyl group, 1-pentyl group, 2-pentyl group, 3-pentyl group, 2-methyl-1-butyl group, 3-methyl-1-butyl group, 2-Methyl-2-butyl group, 3-methyl-2-butyl group, 2,2-dimethyl-1-propyl group, 1-hexyl group, 2-hexyl group, 3-hexyl group, 2-methyl -1-Pentyl group, 3-Methyl-1-Pentyl group, 4-Methyl-1-Pentyl group, 2-Methyl-2-Pentyl group, 3-Methyl-2-Pentyl group, 4-Methyl-2-Pentyl group , 2-Methyl-3-pentyl group, 3-methyl-3-pentyl group, 2,3-dimethyl-1-butyl group, 3,3-dimethyl-1-butyl group, 2,2-dimethyl-1-butyl Examples thereof include
  • the present disclosure may relate to one or more embodiments: [1] A compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of DYRK1A protein or a pharmaceutically acceptable salt thereof is contained as an active ingredient. A pharmaceutical composition for suppressing neuroinflammation. [2] The pharmaceutical composition according to [1], for assisting the transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons. [3] The pharmaceutical composition according to [1] for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells. [4] The pharmaceutical composition according to [1] for protecting nerve cells from nerve inflammation.
  • the compound having an ability to inhibit the phosphorylation activity of the DYRK1A protein is at least one selected from the group consisting of the compounds represented by the following formulas (I) to (III).
  • R 1 and R 2 are independently hydrogen atoms or hydrocarbon chains having 1 to 6 carbon atoms
  • R 4 is a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are independently hydrogen atoms, halogen atoms, carboxyl groups, amino groups, hydroxyl groups, and alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms. , Or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms substituted with a halogen atom.
  • the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] is administered to the recipient in an effective amount before, simultaneously with, or after transplantation of neural progenitor cells, pluripotent stem cells, and / or neurons.
  • a method for promoting stabilization of Nrf2 protein in glial cells which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] to a subject.
  • a method for protecting nerve cells from nerve inflammation which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] to a subject.
  • Compound 1 The following compound 1 was synthesized by the method disclosed in WO2018 / 043674.
  • the IC 50 of compound 1 in the in vitro kinase activity against DYRK1A is 76.95 nM.
  • Compound 2 The following compound 2 was synthesized by the method disclosed in WO2015 / 083750.
  • the IC 50 of compound 2 in the in vitro kinase activity against DYRK1A is 32.95 nM.
  • Image analysis cells were seeded on 96-well pure coat amine coated plates and treated as needed for each specific experiment. After the immunolabeling was completed, images were automatically acquired using Opera Penix (manufactured by Perkin Elmer) equipped with Harmony software (20 times magnification of the objective lens, 2x2 CCD binning, 25 fields per well) and analyzed. A fluorescence microscope (BZ-9000, manufactured by Keyence) or a confocal microscope (SP-8, manufactured by Leica) was also used for image acquisition.
  • Opera Penix manufactured by Perkin Elmer
  • Harmony software 20 times magnification of the objective lens, 2x2 CCD binning, 25 fields per well
  • LPS reagent lipopolysaccharide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • siRNA was purchased from Ambion or Dharmacon.
  • BV-2 Cell culture Microglial cell line BV-2 was maintained in high glucose Dulbecco modified Eagle's medium (DMEM) (Nakaraitesque) supplemented with 10% fetal bovine serum (Nichirei Bioscience), 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin. .. Primary hippocampal and cortical neuron cultures were prepared from embryonic day 18 mice and supplemented with 2% B27 supplement, 100 U / mL, penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, and 0.5 mM L-glutamine in Neurobasal medium (Life Technologies). Maintained.
  • DMEM Dulbecco modified Eagle's medium
  • Dopaminergic neuron cultures were prepared from the ventral midbrain of day 13 embryonic mice and supplemented with 10% fetal bovine serum, 2% B27 supplement, 10 ng / mL GDNF, 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin. It was maintained in Neurobasal medium (Life Technologies). To remove glial cells, 5 ⁇ M cytosine ⁇ -D-arabinofuranoside, 10 ⁇ M 5-fluorouracil, and 10 ⁇ M uridine (all manufactured by Sigma-Aldrich) were added on the second day of culture. Mixed glial cultures were obtained from neonatal mouse pups (P1-P4) and maintained in T75 or T175 flasks.
  • Microglia were obtained either by vigorous shaking or by Cd11b positive selection (Invitrogen).
  • mouse glial cell cultures were prepared from embryonic day 13 MGE (Medical Ganglionic efficiency) and cultured in a PLL-coated dish. The culture was passaged twice with trypsin and used in a co-culture assay with iPSC-derived neurons. 1039A1iPS cells were established and maintained as previously described (Nakagawa et al., Sci Rep 4, 3594, 2014).
  • hiPS cells 1039A1 were seeded on Laminin 511 and differentiated in GMEM medium containing 8% KSR, Y27632 (Wako), A-83-01 (Wako) and LDN193178 (STEMGENT). Purmorphamine (Wako), FGF8 (Wako, days 1-7), and CHIR99021 (Wako, days 3-12) were added.
  • Corin + cells After cell selection of Corin + cells, the cells were reseeded into a low-adhesion 96-well plate for neurosphere culture, B27 supplement, 2 mM L-glutamine (Invitrogen), 10 ng / mL GDNF, 200 ⁇ M ascorbic acid, 20 ng / mL BDNF (all). Wako) and neurobasal medium supplemented with 400 ⁇ M dbcAMP (Sigma-Aldrich) were maintained for an additional 2 weeks. To avoid apoptosis, 30 ⁇ M Y27632 (Wako) was added in the first plating.
  • RNA extraction and quantitative RT-PCR After total RNA was extracted with the RNeasy kit (Qiagen), cDNA was synthesized using iScript (Bio-Rad). Quantitative PCR was performed using SYBRgreenExTaq (TaKaRa). Gene primers were designed using PrimerBank (Wang et al., 2012).
  • Total protein was extracted from cell culture samples using a RIPA buffer (Wako) containing an immunobrotting protease inhibitor cocktail (Nakalitesque) and a phosphatase inhibitor cocktail (Nakalitesque). After centrifugation at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was collected and the protein concentration was measured using the Pierce 660 nm Protein Assay Kit (Thermo Scientific). The proteins were then separated on a 5-20% gradient SDS / PAGE gel (ATTO) and transferred to polyvinylidene fluoride membrane (Millipore) by electroblotting. Membranes were blocked with Blocking One (Nacalai Tesque) and then probed with the indicated antibody. Detection was performed using Immunostar chemiluminescence (Wako) and ChemiDoc imaging system (Bio-Rad).
  • Drug Treatment Research Compound 1 was first dissolved in DMSO at a concentration of 100 mg / mL, diluted with 10% Tween 80 (Polysorbate 80 (HX2), manufactured by HOF Corporation) in physiological saline to the desired concentration, and 0.05 mL. It was delivered subcutaneously in an amount of / kg.
  • Compound 2 was suspended in 0.5% carboxymethyl cellulose (Nacalai Tesque) and orally administered at a desired concentration in an amount of 0.1 mL / kg.
  • Drug-treated animals were anesthetized with isoflurane for blood sampling and then perfused with saline. Brain homogenates were prepared using the Beads Crusher ⁇ T-12 system (TAITEC) in 5-fold saline.
  • FIG. 1A shows the results of Western blot analysis when microglial cells BV-2 were treated with Compound 1.
  • BV-2 cells were treated with Compound 1 at a specified concentration and for a specified period of time.
  • the treated sample was Western blot analyzed with the indicated antibody.
  • FIG. 4A in BV-2 cells, compound 1 up-regulated cyclins D1, p21, and Nrf2 in a time- and volume-dependent manner.
  • FIG. 1B is a representative image of glial cells treated with compounds 1 and 2.
  • FIG. 1C is an example of quantification of the signal intensity of Nrf2 in the nucleus of Cd11b-positive cells. Glial cells were treated with compounds 1 and 2 at concentrations for the indicated period. From FIGS. 1B and C, it was confirmed that compound 1 or 2 induces the expression of Nrf2 in Cd11b-positive microglial cells.
  • Nrf2 expression did not increase in cells treated with p21 siRNA when treated with compound 1 or 2, but Nrf2 expression increased when treated with compound 1 or 2 in cells treated with control siRNA (data not shown). ). From these facts, it is considered that the treatment of compound 1 or 2 mediates the induction of Nrf2 by stabilizing the cyclin D1 / p21 complex.
  • FIG. 2A shows the results of qPCR evaluation of cytokine, chemokine, and iNOS mRNA production during LPS treatment. * P ⁇ 0.05.
  • FIG. 2B shows the results of ELISA quantification of cytokines produced by LPS stimulation. * P ⁇ 0.05.
  • LPS stimulation dramatically induces pro-inflammatory cytokine gene expression, but these upregulations were effectively suppressed by compound 1 or 2 treatment.
  • induction of some chemokine and iNOS mRNA expression was also suppressed (Fig. 2A).
  • 2C is the result of qPCR analysis of compound 1 for the production of the indicated cytokines in the presence or absence of Nrf2. No inhibition of cytokine production was observed in cells treated with Nrf2 siRNA. * P ⁇ 0.05. These results indicate that treatment with compound 1 or 2 can effectively suppress neuroinflammation. Furthermore, these results strongly indicate that the suppression of neuroinflammation (suppression of cytokine production) by compounds 1 and 2 was mediated by Nrf2.
  • FIG. 3A is an experimental scheme. Recipients (mice) were administered Compound 2 1 hour prior to surgery for transplantation of hiPSC-derived DA neurons. Drug administration was continued for 4 consecutive days until 4 days after surgery, where strong glial activation was expected, leaving the animals untreated for 4 weeks.
  • FIG. 3B is a representative image of cells transplanted into the striatal tissue.
  • FIG. 4A is an experimental scheme. Neuroinflammation is induced by intraperitoneal administration of LPS to mice. The drug (Compound 2) was administered 1 hour prior to LPS injection into mice. The drug was orally administered once daily at the specified dose. Glia activation and cytokine production were evaluated 1 day after administration. Dopaminergic neurodegeneration was assessed on days 7 and 14 (FIGS. 4B and 4C).
  • FIG. 4B is a representative image of the substantia nigra of the treated animal.
  • FIG. 4D is the result of a quantitative analysis of glia activation by qPCR of striatal tissue one day after the last LPS injection.
  • FIG. 5B is a quantitative analysis of the number of hNuclei. The data was normalized to control conditions without H 2 O 2 processing.
  • FIG. 5C is a quantification by qPCR.
  • Nurr1 and TH were used as markers for dopaminergic neurons in early differentiation and maturation, respectively.
  • oxidative stress due to H 2 O 2 treatment reduces the survival of DA neurons, but the survival increases depending on the amount of compound 2 added.
  • protection of neurons by this compound 2 does not occur in the absence of glia, only in co-culture with glia.

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Abstract

神経炎症を抑制するための医薬組成物、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための医薬組成物、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための医薬組成物、及び神経炎症から神経細胞を保護するための医薬組成物の提供。 ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。

Description

神経炎症の抑制、そのための組成物及び方法
　本開示は、神経炎症の抑制、そのための組成物及び方法に関する。本開示は、一又は複数の態様において、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植の補助、そのための組成物及び方法に関する。本開示は、一又は複数の態様において、グリア細胞におけるＮｒｆ２（NF-E2-related factor 2）タンパク質の安定化の促進、そのための組成物及び方法に関する。本開示は、一又は複数の態様において、神経炎症から神経細胞の保護、そのための組成物及び方法に関する。
　パーキンソン病は、進行性の神経変性疾患であり、黒質線条体のドーパミン作動性神経（ドーパミン作動性ニューロン）の喪失を特徴とする。これまでの臨床研究から、胎生期中脳細胞の移植よって、パーキンソン病患者の運動症状の改善が確認されている。このような事実から、パーキンソン病の治療方法として細胞補充療法が考えられる。
　多能性幹細胞、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣ）は、ドーパミン作動性神経を大量に供給できる可能性を有している。そのため多能性幹細胞は、新しいドナー細胞源として考えられる。しかしながら、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化した神経前駆細胞及びドーパミン作動性神経細胞は、脳内への移植後の残存率（生存率）が極めて低い（特許文献１）。
　ミクログリアは、中枢神経系（脳や脊髄）に存在するグリア細胞の一種である。ミクログリアは、小膠細胞やＨｏｒｔｅｇａ細胞とも呼ばれる。
　ミクログリアは、マクロファージのような免疫担当細胞であると考えられている。ミクログリアは、免疫反応の起点となる抗原提示作用、異物に対する自然免疫作用、異物や老廃物に対する食作用、神経回路の形成補助、周囲の細胞に影響を与える各種物質の産生といった様々な作用や役割を有する。
　ミクログリアは、外的刺激やストレス等により活性状態となり、抗酸化物質や栄養因子等、有用な物質を産生する。しかし、ミクログリアは、病的な活性化により、炎症性サイトカインやケモカイン、核酸、グルタミン酸等の興奮性アミノ酸、活性酸素種、プロテアーゼ等を分泌し、周囲の細胞を傷害することで、神経炎症の起点となる。このため、ミクログリアは、中枢神経系の神経変性の原因にもなりうる（特許文献２）。
　タンパク質リン酸化酵素であるＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性に対して阻害能を有する化合物は、神経新生又は神経細胞増殖に効果があることが報告されている（特許文献３及び４）。ＤＹＲＫは、dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinaseを意味する酵素の総称である。
特開２０１８－７６３８５号公報 ＷＯ２０１８／０２９７９３ ＷＯ２０１５／０８３７５０ ＷＯ２０１８／０４３６７４
　本開示は、一態様において、神経炎症を抑制するための医薬組成物を提供する。
　本開示は、一態様において、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための医薬組成物を提供する。
　本開示は、一態様において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための医薬組成物を提供する。
　本開示は、一態様において、神経炎症から神経細胞を保護するための医薬組成物を提供する。
　本開示は、一態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経炎症を抑制するための医薬組成物に関する。
　本開示は、その他の態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための医薬組成物に関する。
　本開示は、その他の態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための医薬組成物に関する。
　本開示は、その他の態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経炎症から神経細胞を保護するための医薬組成物に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示に係る医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、神経炎症を抑制する方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示に係る医薬組成物を、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植の前、同時、又は後にレシピエントに有効量投与することを含む、移植された前記細胞の生存率を向上させる方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示に係る医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進し、神経炎症から神経細胞を保護する方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示に係る医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、前頭側頭葉変性症、筋委縮性側索硬化症、及び多発性硬化症からなる群から選択される神経炎症を伴う疾患の、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
　本開示に係る医薬組成物によれば、一又は複数の実施形態において、神経炎症を抑制できる。
　本開示に係る医薬組成物によれば、一又は複数の実施形態において、移植する神経前駆細胞、幹細胞、及び／又はニューロンの移植後の生存率を向上できる。
　本開示に係る医薬組成物によれば、一又は複数の実施形態において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進向上できる。
　本開示に係る医薬組成物によれば、一又は複数の実施形態において、神経炎症から神経細胞を保護できる。
図１は、グリア細胞におけるｐ２１とＮｒｆ２の誘導に関する。図１Ａは、ミクログリア細胞を化合物１で処理したときのウエスタンブロット分析の結果である。図１Ｂは、化合物１及び２で処理されたグリア細胞の代表的な画像である。図１Ｃは、Ｃｄ１１ｂ陽性細胞の核におけるＮｒｆ２のシグナル強度の定量化の例である。 図２は、神経炎症（ミクログリアのサイトカイン産生）の抑制に関する。図２Ａは、リポ多糖（ＬＰＳ）処理時のサイトカイン、ケモカイン、及びｉＮＯＳのｍＲＮＡの産生をｑＰＣＲで評価した結果である。図２Ｂは、ＬＰＳ刺激により産生されたサイトカインをＥＬＩＳＡで定量化した結果である。図２Ｃは、Ｎｒｆ２の存在下又は非存在下での示されたサイトカインの産生に関するｑＰＣＲ分析の結果である。 図３は、ニューロンの移植効率の向上に関する。図３Ａは、実験スキームである。図３Ｂは、マウスの線条体組織に移植されたｉＰＳＣ由来ドーパミン作動性ニューロン（ＤＡニューロン）の代表的な画像である。図３Ｃは、移植細胞の定量分析の結果を示す。 図４は、神経炎症に起因する神経変性の抑制に関する。図４Ａは、実験スキームである。図４Ｂは、処理された動物の黒質の代表的な画像である。図４Ｃは、黒質緻密質（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞の数を定量化した結果である。図４Ｄは、最後のＬＰＳ注射から１日目の線条体組織のｑＰＣＲによるグリア活性化の定量分析の結果である。図４Ｅ及びＦは、Ｄａｙ１の線条体組織から示されたサイトカインとケモカインのレベルをｑＰＣＲ（Ｅ）とＥＬＩＳＡ（Ｆ）で分析した結果である。 図５は、神経保護機能（ｉＰＳ細胞由来ニューロンの移植効率向上及び細胞炎症による細胞変性の抑制効果）のメカニズムに関する。図５Ａは、ｈｉＰＳＣ由来ドーパミン作動性神経前駆細胞の代表的な画像である。図５Ｂは、ｈＮｕｃｌｅｉの数の定量分析である。図５Ｃは、ＰＣＲによる定量である。
　本開示は、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、神経炎症を抑制しうるという知見に基づく。
　本開示は、また、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、脳に移植されるニューロンの定着率（生存率、残存率）を向上できるという知見に基づく。
　本開示は、また、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進して、神経炎症から神経細胞を保護できるという知見に基づく。
　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、神経炎症を抑制しうる効果を発揮するメカニズムは、詳細は明らかではないが、以下のように推察される。
　通常時には、神経を支える役割を果たしているミクログリアは、損傷や神経炎症などのストレスを受けると、活性化し、炎症性サイトカインや活性酸素腫を放出し、ニューロンを変性させる。このとき、ＤＹＲＫ１Ａを阻害すると、サイクリンＤ１及びｐ２１が安定化され、Ｎｒｆ２の分解が停止し、Ｎｒｆ２が安定化する。このＮｒｆ２は炎症誘発性サイトカインを産生する遺伝子の発現を抑制し、ミクログリアの過剰な活性化が抑制される。神経炎症の起点となるミクログリアの活性化が抑制されることで、神経炎症が抑制され、移植効率の向上及び／又は神経細胞保護の効果が発揮されると考えられる。
　但し、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
　［神経炎症抑制剤］
　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経炎症を抑制するための医薬組成物（以下、本開示に係る神経炎症抑制剤ともいう）に関する。
　本開示に係る神経炎症抑制剤は、一又は複数の実施形態において、ミクログリアの過剰な活性化を抑制することで神経炎症を抑制できる。
　本開示に係る神経炎症抑制剤は、一又は複数の実施形態において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進することでミクログリアの過剰な活性化を抑制し、神経炎症を抑制できる。
　本開示においてグリア細胞とは、ニューロン（神経細胞）を支える非ニューロン細胞をいい、一又は複数の実施形態において、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデドロサイトが挙げられ、好ましくはミクログリアである。
　Ｎｒｆ２は、生体の恒常性維持に重要な転写因子である。
　本開示において、Ｎｒｆ２タンパク質の安定化とは、一又は複数の実施形態において、Ｎｒｆ２タンパク質の分解が抑制され、Ｎｒｆ２タンパク質の細胞内量が増加することをいう。Ｎｒｆ２の安定化は、一又は複数の実施形態において、実施例を参照して確認できる。
　本開示に係る神経炎症抑制剤は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、及び希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。本開示の医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、さらに、医薬的に許容される担体、防腐剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、希釈剤、上記の添加剤、又はその他の医薬的に許容される成分を含んでよい。
　前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記滑沢剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
　液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
　本開示に係る神経炎症抑制剤は、神経炎症を伴う疾患に罹患した対象に投与することが挙げられる。神経炎症を伴う疾患としては、一又は複数の実施形態において、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、及び、多発性硬化症が挙げられる。
　対象は、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。前記動物としては、一又は複数の実施形態において、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル等の哺乳類が挙げられる。
　本開示に係る神経炎症抑制剤の投与量は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分の化合物の体内濃度が１００ｎＭ～１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。
　限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、有効成分の化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
　よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経炎症抑制剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症を抑制する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経炎症抑制剤を対象に有効量投与することを含む、ミクログリアの過剰な活性化を抑制し、神経炎症を抑制する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経炎症抑制剤を対象に有効量投与することを含む、Ｎｒｆ２タンパク質の安定化を促進することでミクログリアの過剰な活性化を抑制し、神経炎症を抑制する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経炎症抑制剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症を伴う疾患の改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
　［移植補助剤］
　本開示は、一態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための医薬組成物（以下、本開示に係る移植補助剤ともいう）に関する。
　本開示において、細胞の移植とは、一又は複数の実施形態において、移植対象（レシピエント）の特定部位に細胞を移植し、移植した部位及び／又はその周辺部位に生着（定着）させること、ならびに／あるいは、周辺環境に応じて適切に分化させるこという。
　移植される特定部位としては、一又は複数の実施形態において、神経系、中枢神経系（例えば、脳、脊髄）、末梢神経系、又は、これらの組織が挙げられる。
　本開示において、「移植の補助」とは、一又は複数の実施形態において、移植後の移植された細胞の生存率、定着率、及び／又は、残存率の向上をいう。細胞の生存率、定着率、及び／又は、残存率の向上は、一又は複数の実施形態において、実施例を参照して確認できる。
　本開示において、「神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植」は、一又は複数の実施形態において、これらの細胞そのものの移植であってもよく、他の細胞を含む形態で移植であってよく、器官（臓器）、組織、集合体の一部に神経前駆細胞、幹細胞、及び／又はニューロンが含まれる形態の移植であってもよい。
　本開示において、「神経前駆細胞」とは、神経細胞に分化しうる細胞をいい、その分化段階は特に制限されない。
　本開示で用いられる神経前駆細胞は、一又は複数の実施形態において、神経幹細胞であってもよい。本開示で用いられる神経前駆細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト等の哺乳動物の脳組織から単離した細胞であってもよい。本開示で用いられる神経前駆細胞は、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導させて得られた細胞（それぞれ、ＥＳ細胞由来の細胞、ｉＰＳ細胞由来の細胞という場合がある。）であってもよい。
　本開示で用いられる多能性幹細胞は、一又は複数の実施形態において、神経細胞に分化しうる多能性幹細胞、神経幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては、一又は複数の実施形態において、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、核移植によって得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、培養線維芽細胞及び骨髄幹細胞由来の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）等が含まれる。
　ニューロン（神経細胞）としては、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、神経前駆細胞から分化誘導されたニューロンが挙げられる。
　移植される神経前駆細胞及びニューロンとしては、一又は複数の実施形態において、多能性幹細胞から分化誘導されたドーパミン作動性ニューロン前駆体細胞及び多能性幹細胞から分化誘導されたドーパミン作動性ニューロンが挙げられる。
　本開示に係る移植補助剤は、移植対象（レシピエント）に移植する前、移植と同時、又は、移植した後にレシピエントに投与されるように用いることができる。
　あるいは、移植補助剤は、移植前に移植される細胞に添加されてもよい。
　レシピエントとしては、ヒト又はヒト以外の動物が挙げられる。前記動物としては、一又は複数の実施形態において、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル等の哺乳類が挙げられる。
　移植する細胞も、上述のヒト又はヒト以外の動物の細胞とすることができる。
　レシピエントと移植する細胞の種は同じでもよく、異なってもよい。
　本開示に係る移植補助剤の投与量は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、ヒトに対して投与される場合、一又は複数の実施形態において、有効成分が、１日当り、１０～１２００ｍｇ、又は１００～１２００ｍｇ投与されるように用いられてもよい。あるいは、上述の本開示に係る神経炎症抑制剤と同様でもよい。
　本開示に係る移植補助剤の投与経路としては、移植部又は移植細胞に直接接触させる、あるいは、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内への投与とすることができる。通常用いられる投与形態としては、例えば、溶剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、舌下錠、シロップ剤、懸濁液等が挙げられる。液剤の形にした移植補助剤を注射剤として非経口的に投与してもよい。上記投与剤形は許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤等に、本開示に係る有効成分を配合することによって製造することができる。本開示に係る移植補助剤を注射剤として用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
　本開示に係る移植補助剤を用いると、一又は複数の実施形態において、移植後のニューロンの対象における生存率、定着率、及び／又は、残存率が向上しうる。
　そのため、本開示に係る移植補助剤は、一又は複数の実施形態において、再生医療のための器官（臓器）、組織、又は細胞の移植に使用できる。
　また、本開示に係る移植補助剤は、一又は複数の実施形態において、脳梗塞、脊髄梗塞、脳出血、脊髄出血、顔面神経マヒ、四肢神経マヒ、レビー小体型認知症、ダウン症、うつ病、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病等の進行性神経脱落を示す神経変性疾患といった神経疾患の手術（治療）における移植に使用できる。
　よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係る移植補助剤を、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植の前、同時、又は後にレシピエントに有効量投与することを含む、移植された前記細胞の生存率を向上させる方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る移植補助剤を、移植の前、同時、又は後にレシピエントに有効量投与することを含む、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植方法に関する。
　［Ｎｒｆ２安定化剤］
　本開示は、一態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための医薬組成物（以下、本開示に係るＮｒｆ２安定化剤ともいう）に関する。
　本開示に係るＮｒｆ２安定化剤は、一又は複数の実施形態において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進できる。本開示に係るＮｒｆ２安定化剤は、一又は複数の実施形態において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進することで、グリア細胞の過剰な活性化を抑制できる。ミクログリアの活性化は、神経炎症の起点となることから、本開示に係るＮｒｆ２安定化剤は、一又は複数の実施形態において、グリア細胞の活性化を抑制でき、神経炎症を抑制できる。
　本開示に係るＮｒｆ２安定化剤の投与形態、剤型、投与量等は、本開示に係る神経炎症抑制剤と同様とすることができる。
　本開示に係るＮｒｆ２安定化剤は、神経炎症を伴う疾患に罹患した対象に投与することが挙げられる。神経炎症を伴う疾患としては、一又は複数の実施形態において、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、及び、多発性硬化症が挙げられる。
　対象は、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。
　よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係るＮｒｆ２安定化剤を対象に有効量投与することを含む、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係るＮｒｆ２安定化剤を対象に有効量投与することを含む、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進し、神経炎症を抑制する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係るＮｒｆ２安定化剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症を伴う疾患の改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
　［神経細胞保護剤］
　本開示は、一態様において、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、神経炎症から神経細胞を保護するための医薬組成物（以下、本開示に係る神経細胞保護剤ともいう）に関する。
　本開示に係る神経細胞保護剤は、一又は複数の実施形態において、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進することで、グリア細胞の過剰な活性化を抑制できる。ミクログリアの活性化は、神経炎症の起点となることから、グリア細胞の活性化を抑制することで神経炎症を抑制し、神経細胞の保護が達成できる。
　本開示に係る神経細胞保護剤の投与形態、剤型、投与量等は、本開示に係る神経炎症抑制剤と同様とすることができる。
　本開示に係る神経細胞保護剤は、神経炎症を伴う疾患に罹患した対象に投与することが挙げられる。神経炎症を伴う疾患としては、一又は複数の実施形態において、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、及び、多発性硬化症が挙げられる。
　対象は、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。
　よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経細胞保護剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症から神経細胞を保護する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経細胞保護剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症を抑制することにより神経細胞を保護する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経細胞保護剤を対象に有効量投与することを含む、グリア細胞の活性化を抑制して神経炎症を抑制することにより神経細胞を保護する方法に関する。
　また、本開示は、その他の態様において、本開示に係る神経細胞保護剤を対象に有効量投与することを含む、神経炎症を伴う疾患の改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
　［有効成分］
　本開示に係る医薬組成物（神経炎症抑制剤、移植補助剤、Ｎｒｆ２安定化剤及び神経細胞保護剤）の有効成分（本開示に係る有効成分ともいう）は、ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩である。
　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物は、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１８／０４３６７４及びＷＯ２０１５／１０７９４５に開示されているものが使用できる。これらの文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
　ＤＹＲＫ１Ａは、サイクリンＤ１をリン酸化することで、サイクリンＤ１及びｐ２１の分解を促進する。
　本開示におけるＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物は、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）から（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　式（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１から６の炭化水素鎖であり、Ｒ3は、－ＣＨ2－ＣＨ2－又は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ4は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６のアルキル基であり、
　式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、炭素数１から４のアルキル基、又はハロゲン原子で置換された炭素数１から４のアルキル基である。
　一般式（Ｉ）中、Ｒ1は、一又は複数の実施形態において、炭素数１から６のアルキル基であり、さらなる一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、又はプロピル基である。一般式（Ｉ）中、Ｒ2は、一又は複数の実施形態において、炭素数１から６のアルキル基であり、さらなる一又は複数の実施形態において、メチル基である。一般式（Ｉ）中、Ｒ4は、一又は複数の実施形態において、水素原子である。
　前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表される化合物である。
　一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、一又は複数の実施形態において、水素原子である。
　前記一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される化合物である。
　本開示において「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
　前記無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
　前記無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。前記有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
　前記酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。前記塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
　本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
　本開示においてアルキル基は、一又は複数の実施形態において、直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基が挙げられる。本開示において「炭素数１から４のアルキル基」とは、一又は複数の実施形態において、炭素数１、２、３又は４個の直鎖若しくは分枝若しくは、炭素数３又は４個の環状のアルキル基である。炭素数１、２、３又は４個の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が挙げられる。炭素数３又は４個の環状のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル基、シクロブチル基などが挙げられる。
　本開示において「炭素数１から６の炭化水素鎖」とは、炭素数１、２、３、４、５又は６個の脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基をいう。炭化水素鎖は、一又は複数の実施形態において、直鎖構造でも分岐鎖構造でも環状構造でもよく、アルキル基、アルケニル基、フェニル基、又はシクロアルキル基が挙げられる。本開示において「炭素数１から６のアルキル基」は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、２－メチル－１－プロピル基、２－メチル－２－プロピル基、１－ブチル基、２－ブチル基、１－ペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、２－メチル－１－ブチル基、３－メチル－１－ブチル基、２－メチル－２－ブチル基、３－メチル－２－ブチル基、２，２－ジメチル－１－プロピル基、１－へキシル基、２－へキシル基、３－へキシル基、２－メチル－１－ペンチル基、３－メチル－１－ペンチル基、４－メチル－１－ペンチル基、２－メチル－２－ペンチル基、３－メチル－２－ペンチル基、４－メチル－２－ペンチル基、２－メチル－３－ペンチル基、３－メチル－３－ペンチル基、２，３－ジメチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－１－ブチル基、２，２－ジメチル－１－ブチル基、２－エチル－１－ブチル基、３，３－ジメチル－２－ブチル基、又は２，３－ジメチル－２－ブチル基等が挙げられる。
　本開示においてハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子が挙げられる。
　本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
　［１］　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、
　神経炎症を抑制するための医薬組成物。
　［２］　神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための、［１］に記載の医薬組成物。
　［３］　グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための、［１］に記載の医薬組成物。
　［４］　神経炎症から神経細胞を保護するための、［１］に記載の医薬組成物。
　［５］　前頭側頭葉変性症、筋委縮性側索硬化症、及び多発性硬化症からなる群から選択される神経炎症を伴う疾患の、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、［１］に記載の医薬組成物。
　［６］　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、下記式（Ｉ）から（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１つであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　式（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１から６の炭化水素鎖であり、Ｒ3は、－ＣＨ2－ＣＨ2－又は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ4は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６のアルキル基であり、
　式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、炭素数１から４のアルキル基、又はハロゲン原子で置換された炭素数１から４のアルキル基である、
［１］から［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［７］　［１］から［６］のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、神経炎症を抑制する方法。
　［８］　［１］から［６］のいずれかに記載の医薬組成物を、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植の前、同時、又は後にレシピエントに有効量投与することを含む、移植された前記細胞の生存率、定着率、及び／又は、残存率を向上させる方法。
　［９］　［１］から［６］のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進する方法。
　［１０］　［１］から［６］のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、神経炎症から神経細胞を保護する方法。
　［１１］　［１］から［６］のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、前頭側頭葉変性症、筋委縮性側索硬化症、及び多発性硬化症からなる群から選択される神経炎症を伴う疾患の、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。
　化合物１
　下記化合物１は、ＷＯ２０１８／０４３６７４に開示される方法で合成された。なお、ＤＹＲＫ１Ａに対するin vitroキナーゼ活性における化合物１のＩＣ50は、７６．９５ｎＭである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　化合物２
　下記化合物２は、ＷＯ２０１５／０８３７５０に開示される方法で合成された。なお、ＤＹＲＫ１Ａに対するin vitroキナーゼ活性における化合物２のＩＣ50は、３２．９５ｎＭである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　統計
　３回以上の実験から得られた結果は、平均値±ＳＥＭとして表される。統計的に有意な差は、両側の対応のないスチューデント検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ比較検定を使用して決定された。０．０５未満のＰ値を有意差があるとみなし、単一のアスタリスク（*）で、０．０１未満のＰ値は、二重アスタリスク（**）で示す。
　画像解析
　細胞を９６ウェルのピュアコートアミンコーティングプレートに播種し、特定の実験ごとに必要に応じて処理した。免疫標識が完了した後、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアを備えたＯｐｅｒａ　Ｐｈｅｎｉｘ（Perkin Elmer社製）を用いて自動で画像を取得し（対物レンズの２０倍の倍率、２ｘ２ＣＣＤビニング、ウェルあたり２５フィールド）、分析した。画像取得には、蛍光顕微鏡（BZ-9000、Keyence社製）又は共焦点顕微鏡（SP-8、Leica社製）も使用した。
　動物モデル
　８～９週齢のＣ５７ｂｌａｃｋ／６Ｊマウスに、ＬＰＳ（Ｏ５５：Ｂ５）（Sigma社製、Ｌ２８８０）を１日１回、４日間１ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。ｈｉＰＳＣ由来のドーパミン（ＤＡ）作動性神経前駆細胞は、４週齢のＳＣＩＤマウスの線条体に移植した。薬物処理は、ＬＰＳ又はｉＰＳＣ移植の１時間前に行われた。
　試薬
　リポ多糖（ＬＰＳ）はSigma-Aldrichから入手した。小分子化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ナカライテスク社製）に溶解して、in vitroアッセイ用に５０ｍＭのストック溶液とした。ｓｉＲＮＡはAmbion又はDharmaconから購入した。ウエスタンブロット用のウサギポリクローナル抗Ｎｒｆ２（MBL）、免疫細胞化学用のウサギポリクローナル抗Ｎｒｆ２（abcam）、マウスモノクローナル抗ｐ２１（abcam）及びウサギポリクローナル抗サイクリンＤ１（Cell Signaling）、ラット抗Ｃｄ１１ｂ（abcam）、ニワトリポリクローナル抗ＴＨ（abcam）、ウサギポリクローナル抗Ｉｂａ１（Wako）、ヤギポリクローナル抗ＧＦＡＰ（Millipore）、ラット抗Ｎｕｒｒ１（KAN研究所から提供）、マウスモノクローナル抗ｈＮｕｃｌｅｉ（abcam）、及びウサギポリクローナルＨＲＰ結合抗ＧＡＰＤＨ（MBL）を使用した。
　細胞培養
　ミクログリア細胞株ＢＶ－２は、１０％ウシ胎児血清（ニチレイバイオサイエンス）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ナカライテスク）で維持した。初代海馬及び皮質ニューロン培養物は、胎生１８日マウスから調製し、２％Ｂ２７サプリメント、１００Ｕ／ｍＬ、ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．５ｍＭ　Ｌ－グルタミンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies）で維持した。ドーパミン作動性ニューロン培養は、胎生１３日目マウスの腹側中脳から調製し、１０％ウシ胎児血清、２％Ｂ２７サプリメント、１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies）で維持した。グリア細胞除去のため、５μＭシトシンβ－Ｄ－アラビノフラノシド、１０μＭ　５－フルオロウラシル、及び１０μＭウリジン（すべてSigma-Aldrich製）を培養２日目に添加した。混合グリア培養物は、新生児マウス仔（Ｐ１～Ｐ４）から得て、Ｔ７５又はＴ１７５フラスコで維持した。細胞がコンフルエントになるまで、３～４日ごとに培地を交換した。ミクログリアは、激しく振盪するか、Ｃｄ１１ｂ陽性選択（Invitrogen）のいずれかによって得られた。共培養実験のために、マウスのグリア細胞培養を胎生１３日目のＭＧＥ（Ｍｅｄｉａｌ　Ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ　ｅｍｉｎｅｎｃｅ）から調製し、ＰＬＬ被覆皿で培養した。培養物をトリプシンで２回継代し、ｉＰＳＣ由来ニューロンとの共培養アッセイに使用した。１０３９Ａ１ｉＰＳ細胞は、以前に記載されているように確立及び維持された（Nakagawa et al., Sci Rep 4, 3594, 2014）。ドーパミン作動性前駆細胞の誘導は、以前に説明されているように実行された（Doi et al., Stem Cell Reports 2, 337-350, 2014、Kikuchi et al., Nature 548, 592-596, 2017）。簡単には、ｈｉＰＳ細胞１０３９Ａ１は、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１上に播種し、８％ＫＳＲ、Ｙ２７６３２（Wako）、Ａ－８３－０１（Wako）及びＬＤＮ１９３１７８（STEMGENT）を含むＧＭＥＭ培地中で分化させた。プルモルファミン（Wako）、ＦＧＦ８（Wako、１日目から７日目）、及びＣＨＩＲ９９０２１（Wako、３日目から１２日目）を添加した。Ｃｏｒｉｎ＋細胞の細胞選別後、細胞をニューロスフェア培養用の低接着９６ウェルプレートに再播種し、Ｂ２７サプリメント、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２００μＭアスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ（すべてWako製）、及び４００μＭ　ｄｂｃＡＭＰ（Sigma-Aldrich）を添加したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地でさらに２週間維持した。アポトーシスを避けるために、３０μＭのＹ２７６３２（Wako）を最初のプレーティングで添加した。
　免疫細胞化学
　細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１０分間透過処理した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５％正常ロバ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories）／１％ＢＳＡ（SIGMA A7906）／ＰＢＳでブロックし、各一次抗体で標識した。ＰＢＳで洗浄した後、一次抗体を対応する蛍光標識二次抗体で標識した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を使用して核を検出した。
　ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）で全ＲＮＡを抽出した後、ｉＳｃｒｉｐｔ（Bio－Rad）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＥｘＴａｑ（TaKaRa）を用いて定量ＰＣＲを実施した。遺伝子のプライマーは、ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋを使用して設計した（Wang et al., 2012）。
　免疫ブロッティング
　プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）を含むＲＩＰＡバッファー（和光）を使用して、細胞培養サンプルから総タンパク質を抽出した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離後、上清を収集し、Ｐｉｅｒｃｅ　６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Thermo Scientific）を使用してタンパク質濃度を測定した。次に、タンパク質を５～２０％勾配ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（ATTO）で分離し、エレクトロブロッティングによりポリフッ化ビニリデン膜（Millipore）に転写した。膜はＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロックされ、その後、示された抗体でプローブされた。Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ化学発光（Wako）及びＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Bio－Rad）を使用して検出を行った。
　インビトロ酵素活性アッセイ
　インビトロキナーゼ活性アッセイは、以前に記載されたように実施された（Ogawa et al., Nat Commun 1, 86, 2010）。
　薬物処理研究
　化合物１は、最初にＤＭＳＯに１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、生理食塩水中の１０％Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０（ＨＸ２）、HOF Corporation社製）で所望の濃度に希釈し、０．０５ｍＬ／ｋｇの量で皮下に送達された。化合物２は、０．５％カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク）に懸濁し、所望の濃度で０．１ｍＬ／ｋｇの量で経口投与した。薬物処理動物を採血のためにイソフルランで麻酔し、その後生理食塩水で灌流した。脳ホモジネートは、５倍量の生理食塩水でＢｅａｄｓ　Ｃｒｕｓｈｅｒ　μＴ－１２システム（TAITEC）を使用して調製した。血清及び脳ホモジネート中の標的化合物、ドーパミンの濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０ナノフローＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ　６４２０　Ｑ－ＴＯＦ質量分析計を使用したＬＣ／ＭＳで分析した。ドーパミンの測定には、酸化を防ぐために５０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加した。
　免疫組織化学
　成体マウスの脳をＰＢＳで灌流し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、３０％スクロース／ＰＢＳで平衡化した後、４０μｍ切片をビブラトーム（ライカ）又はクリオスタット（ライカ）で２０μｍ切片に切断した。ＨｉｓｔｏＯｎｅ（ナカライテスク）を使用して抗原を回収した後、組織を指定の抗体で染色した。
　［実験例１：ｐ２１とＮｒｆ２の誘導］
　化合物１及び２は、グリア細胞において、ｐ２１とＮｒｆ２を誘導することを確認した。
　図１Ａは、ミクログリア系細胞ＢＶ－２を化合物１で処理したときのウエスタンブロット分析の結果である。ＢＶ－２細胞を、指定濃度、指定期間、化合物１で処理した。処理後の試料を、示された抗体を用いてウエスタンブロット分析した。図４Ａに示すとおり、ＢＶ－２細胞において、化合物１により、時間依存的及び容量依存的に、サイクリンＤ１、ｐ２１、及びＮｒｆ２がアップレギュレートされていた。
　図１Ｂは、化合物１及び２で処理されたグリア細胞の代表的な画像である。細胞は、抗Ｎｒｆ２（疑似色）、Ｃｄ１１ｂ（マゼンタ、ミクログリア）及びＧＦＡＰ（緑、星状細胞）抗体で視覚化された。スケールバー＝２５μｍ。
　図１Ｃは、Ｃｄ１１ｂ陽性細胞の核におけるＮｒｆ２のシグナル強度の定量化の例である。グリア細胞は、示された期間、濃度の化合物１、２で処理された。
　図１Ｂ及びＣから、化合物１又は２により、Ｃｄ１１ｂ陽性ミクログリア細胞でＮｒｆ２の発現が誘導されることが確認された。
　さらに、ｐ２１　ｓｉＲＮＡで処理した細胞では化合物１又は２で処理してもＮｒｆ２発現が増加しなかったが、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞では化合物１又は２で処理するとＮｒｆ２発現が増加した（データ示さず）。
　これらのことから、化合物１又は２の処理は、サイクリンＤ１／ｐ２１複合体を安定化することでＮｒｆ２の誘導を媒介すると考えられる。
　［実験例２：化合物１及び２は、Ｎｒｆ２の安定化を通し、神経炎症を抑制する］
　化合物１及び２がミクログリアのサイトカイン産生を抑制するかどうかを調べた。
　図２Ａは、ＬＰＳ処理時のサイトカイン、ケモカイン、及びｉＮＯＳのｍＲＮＡの産生をｑＰＣＲで評価した結果である。＊Ｐ＜０．０５。
　図２Ｂは、ＬＰＳ刺激により産生されたサイトカインをＥＬＩＳＡで定量化した結果である。＊Ｐ＜０．０５。
　これらに示されるように、ＬＰＳ刺激は炎症誘発性サイトカイン遺伝子発現を劇的に誘導するが、これらのアップレギュレーションは、化合物１又は２処理によって効果的に抑制された。さらに、いくつかのケモカイン及びｉＮＯＳ　ｍＲＮＡ発現の誘導も抑制された（図２Ａ）。
　図２Ｃは、化合物１による、Ｎｒｆ２の存在下又は非存在下での示されたサイトカインの産生に関するｑＰＣＲ分析の結果である。Ｎｒｆ２　ｓｉＲＮＡで処理した細胞では、サイトカイン産生抑制は観察されなかった。＊Ｐ＜０．０５。
　これらの結果は、化合物１又は２の処理が神経炎症を効果的に抑制できることを示している。
　さらに、これらの結果は、化合物１及び２による神経炎症の抑制（サイトカイン産生の抑制）が、Ｎｒｆ２を介して媒介されたことを強く示している。
　［実験例３：ｉＰＳＣ由来細胞の移植効率の向上効果(in vivo)］
　ヒトｉＰＳＣからドーパミン作動性ニューロン（ＤＡニューロン）を作製し、マウス脳に移植して、化合物２の処理によりｉＰＳＣ由来ＤＡニューロンの定着の効率が向上することを確認した。その概要を図３に示す。
　図３Ａは、実験スキームである。レシピエント（マウス）は、ｈｉＰＳＣ由来ＤＡニューロンの移植手術の１時間前に化合物２が投与された。薬物投与は、強力なグリアの活性化が予想される手術後４日後まで４日間連続して行われ、動物は４週間未処置のままにされた。
　図３Ｂは、線条体組織に移植された細胞の代表的な画像である。矢印は、ＴＨ又はＮｕｒｒ１（いずれもドーパミン作動性マーカー）で共標識されたｉＰＳＣ由来細胞を示す。スケールバー＝５０μｍ。移植されたＤＡニューロンはｈＮｕｃｌｅｉ染色により同定され、生存したｉＰＳＣ由来ＤＡニューロンはＴＨ及びＮｕｒｒ１ドーパミン作動性マーカーの共染色で定量化された。
　図３Ｃは、移植細胞の定量分析の結果を示す。ｈＮｕｃｌｅｉとＴＨ又はＮｕｒｒ１との二重陽性細胞の数は、ｈＮｕｃｌｅｉ陽性細胞の数に対して正規化された。各条件に対してＮ＝７及び５。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
　図３の結果から、化合物２による処置は、4週間の移植後のｉＰＳＣ由来ＤＡニューロンの生存率を改善できることが示された。
　［実験例４：神経炎症による神経変性を抑制する効果（in vivo）］
　神経炎症によって引き起こされる神経変性を化合物２が低減できることを確認した。その概要を図４に示す。
　図４Ａは、実験スキームである。マウスにＬＰＳを腹腔投与することで神経炎症を誘導する。マウスへのＬＰＳ注射の１時間前に薬物（化合物２）を投与した。薬物は指定された用量で１日１回経口投与された。
　投与後１日目にグリアの活性化とサイトカイン産生を評価した。７日目と１４日目にドーパミン作動性神経の変性を評価した（図４Ｂ及び４Ｃ）。
　図４Ｂは、処理された動物の黒質の代表的な画像である。ＴＨ（緑）、Ｉｂａ１（グレースケール）、及びＧＦＡＰ（マゼンタ）は、それぞれＤＡニューロン、ミクログリア、及び星状細胞のマーカーとした。スケールバー＝２００μｍ。
　図４Ｃは、黒質緻密質（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞の数を定量化した結果である。Ｎ＝５～６匹の動物が各条件について分析された。エラーバーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。
　化合物２の投与により、グリアの活性化（図４Ｄ）及びサイトカイン産生（図４Ｅ及びＦ）が抑制されることが確認された。
　図４Ｄは、最後のＬＰＳ注射から１日目の線条体組織のｑＰＣＲによるグリア活性化の定量分析の結果である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。
　図４Ｅ及びＦは、Ｄａｙ１の線条体組織から示されたサイトカインとケモカインのレベルをｑＰＣＲ（Ｅ）とＥＬＩＳＡ（Ｆ）で分析した結果である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。
　重要なことに、ドーパミン作動性ニューロンの損失は、化合物２の投与により救助された（図４Ｂ及びＣ）。すなわち、神経炎症によって引き起こされる神経変性を化合物２が低減できた。
　［実験例５：グリア細胞を介した神経保護メカニズム（in vitro）］
　実験例１及び２で示した、神経保護機能（ｉＰＳ細胞移植の効果向上及び細胞炎症による細胞変性の抑制効果）の作用点がグリア細胞であることを化合物２で確認した。
　グリア細胞を介して神経を保護することを確認するため、共培養システムをセットアップした。ｈｉＰＳＣ由来ドーパミン作動性神経前駆細胞と、１３日胚のマウス脳から分離したグリア培養液とを混合して共培養した。混合グリア培養液には、ＧＦＡＰ陽性及びＩｂａ１陽性細胞が含まれていたが、ＴＨ陽性細胞は含まれていなかった。
　混合グリア培養液に、Ｈ2Ｏ2処理によって酸化ストレスを誘導した（図５）。
　神経細胞の生存を、免疫染色（図５Ａ及びＢ）によってヒト核の数で評価した。
　Ｎｕｒｒ１及びＴＨのドーパミン作動性マーカーは、ｑＰＣＲによって評価した（図５Ｃ）。
　図５Ａは、ｈｉＰＳＣ由来ドーパミン作動性神経前駆細胞の代表的な画像である。ｈｉＰＳＣ由来ＤＡニューロンを、抗ｈＮｕｃｌｅｉ（緑）、抗Ｎｕｒｒ１（赤）、及び抗ＴＨ（グレースケール）の抗体を用いて視覚化した。スケールバー＝５０μｍ。
　図５Ｂは、ｈＮｕｃｌｅｉの数の定量分析である。データは、Ｈ2Ｏ2処理なしのコントロール条件に正規化された。＊Ｐ＜０．０５。
　図５Ｃは、ｑＰＣＲによる定量である。Ｎｕｒｒ１及びＴＨは、それぞれ初期分化及び成熟におけるドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして使用された。
　図５に示すように、Ｈ2Ｏ2処理による酸化ストレスにより、ＤＡニューロンの生存を低減させるが、化合物２の添加量に依存して生存量が増加する。しかしながら、この化合物２によるニューロンの保護は、グリアがない場合には起こらず、グリアとの共培養のときにのみ起こる。
　これらのことは、化合物２による神経保護機能の発揮がグリア細胞を介することを、強く示す。

Claims (11)

  1. 　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、
    　神経炎症を抑制するための医薬組成物。
  2. 　神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植を補助するための、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進するための、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　神経炎症から神経細胞を保護するための、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 　前頭側頭葉変性症、筋委縮性側索硬化症、及び多発性硬化症からなる群から選択される神経炎症を伴う疾患の、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 　ＤＹＲＫ１Ａタンパク質のリン酸化活性の阻害能を有する化合物が、下記式（Ｉ）から（ＩＩＩ）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１つであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式（Ｉ）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１から６の炭化水素鎖であり、Ｒ3は、－ＣＨ2－ＣＨ2－又は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ4は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６のアルキル基であり、
    　式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、炭素数１から４のアルキル基、又はハロゲン原子で置換された炭素数１から４のアルキル基である、
    請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、神経炎症を抑制する方法。
  8. 　請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を、神経前駆細胞、多能性幹細胞、及び／又はニューロンの移植の前、同時、又は後にレシピエントに有効量投与することを含む、移植された前記細胞の生存率、定着率、及び／又は、残存率を向上させる方法。
  9. 　請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、グリア細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の安定化を促進する方法。
  10. 　請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、神経炎症から神経細胞を保護する方法。
  11. 　請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を、対象に有効量投与することを含む、前頭側頭葉変性症、筋委縮性側索硬化症、及び多発性硬化症からなる群から選択される神経炎症を伴う疾患の、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015083750A1 (ja) 2013-12-05 2015-06-11 国立大学法人京都大学 神経新生に関する化合物及び医薬組成物
WO2015107945A1 (ja) 2014-01-17 2015-07-23 ソニー株式会社 スイッチ素子および記憶装置
WO2018029793A1 (ja) 2016-08-09 2018-02-15 株式会社Ａｏｂ慧央グループ Ｉｌ－６産生抑制剤、抗炎症剤、抗神経変性疾患剤、抗精神神経疾患剤、医薬品及び食品
WO2018043674A1 (ja) 2016-08-31 2018-03-08 国立大学法人京都大学 神経新生を活性化するための組成物
JP2018076385A (ja) 2013-05-16 2018-05-17 大日本住友製薬株式会社 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5910976B2 (ja) * 2012-07-30 2016-04-27 国立大学法人京都大学 精神神経疾患又は悪性腫瘍に関する化合物及び医薬組成物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018076385A (ja) 2013-05-16 2018-05-17 大日本住友製薬株式会社 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤
WO2015083750A1 (ja) 2013-12-05 2015-06-11 国立大学法人京都大学 神経新生に関する化合物及び医薬組成物
WO2015107945A1 (ja) 2014-01-17 2015-07-23 ソニー株式会社 スイッチ素子および記憶装置
WO2018029793A1 (ja) 2016-08-09 2018-02-15 株式会社Ａｏｂ慧央グループ Ｉｌ－６産生抑制剤、抗炎症剤、抗神経変性疾患剤、抗精神神経疾患剤、医薬品及び食品
WO2018043674A1 (ja) 2016-08-31 2018-03-08 国立大学法人京都大学 神経新生を活性化するための組成物

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOI ET AL., STEM CELL REPORTS, vol. 2, 2014, pages 337 - 350
KIKUCHI ET AL., NATURE, vol. 548, 2017, pages 592 - 596
LEE, HYUN-JU ET AL.: "The novel DYRK1A inhibitor KNV93 regulates cognitive function, amyloid-beta pathology, and neuroinflammation", FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDCINE, vol. 160, 20 November 2020 (2020-11-20), pages 575 - 595, XP086368216, DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2020.08.030 *
MELCHIOR, BENOIT ET AL.: "ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS OF SM07883, A NOVEL, POTENT, AND SELECTIVE ORAL DYRK1A INHIBITOR IN NEURODEGENERATIVE MOUSE MODELS", ALZHEIMAER'S AND DEMENTIA, vol. 15, no. 7, 2019, pages P216, XP085869764, DOI: 10.1016/j.jalz.2019.06.4563 *
NAKAGAWA ET AL., SCI REP, vol. 4, 2014, pages 3594
OGAWA ET AL., NAT COMMUN, vol. 1, 2010, pages 86
See also references of EP4129340A4
SUN, YUXIANG ET AL.: "Dyrk2 involved in regulating LPS-induced neuronal apoptosis", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES, vol. 104, 2017, pages 979 - 986, XP085163502, DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.06.087 *
WOO HAN-WOONG, JI-HYE KWON, JU-YOUNG LEE, JIN HAN NAM, WONIL LEE, JEONGYEON KIM, RI-JIN KANG, KA-YOUNG RYU, HYUN-JU LEE, YOO JOO J: "The novel DYRK1A inhibitor KD03 alters neuroinflammation in BV2 microglial cells, wild-type, and Alzheimer's transgenic mice.", IBRO REPORTS, vol. 6, 1 September 2019 (2019-09-01), pages S130, XP055924191, ISSN: 2451-8301, DOI: 10.1016/j.ibror.2019.07.412 *

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