KR101665846B1

KR101665846B1 - Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101665846B1
Application number: KR1020150010771A
Authority: KR
Inventors: 강건욱; 이경; 양진원
Original assignee: 동국대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2016-10-12
Also published as: KR20150088204A; US20170049773A1

Abstract

본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항당뇨 치료제로서만 개발되고 있는 GPR119 리간드가 비알콜성 지방간의 치료에 우수한 효과를 나타내고, 이를 위한 간 세포 내 신호 전달 체계가 항당뇨 효과를 나타내는 소장 및 췌장 내 신호 전달 체계와 상이함을 밝힘으로써, GPR119 리간드가 비알콜성 지방간 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

Description

GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of nonalcoholic fatty liver disease comprising G protein coupled receptor 119 ligand as an active ingredient}

본 발명은 GPR119(G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

지방간은 간세포 내에 비정상적으로 지방이 축적된 상태를 말하며, 의학적으로 중성지질 함량이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태를 의미한다. 일반적으로 지방간은 지속적이고 과다한 음주에 의해 유발되는 알콜성 지방간 (Alcoholic fatty liver disease, ALD)과 알콜 섭취력은 거의 없지만 알콜성 지방간과 유사한 간 조직소견을 나타내는 비알콜성 지방간의 두 가지로 구분할 수 있다.

알콜성 지방간은 우리나라에 흔하며, 알콜 섭취로 인해 간에서 지방합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않음으로써 발병하며, 알콜 섭취 정도에 따라 간염이나 간경변으로 발전될 수 있다.

비알콜성 지방간은 음주와 관계없이 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등의 원인에 의해 발병될 수 있으며, 진행 경과에 따라 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간 (steatosis)와 간세포의 염증반응(hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 진행 섬유화증 (advanced fibrosis) 및 간경변(cirrhosis)까지 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다.

비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 현대 사회의 고지방 및 고열량 식이 섭취에 따른 성인병의 증가로 선진국 기준 성인 인구의 20-30%가 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)을 나타내며 그 중 2-3%가 비알코올성 지방간염(NASH) 환자로 이행된다고 보고되고 있을 뿐 아니라, 특히, 조직학적으로 섬유화와 염증을 동반한 지방간염 소견을 보여 간경변, 간부전 및 간암으로 발전할 위험이 매우 높아지게 된다.

현재 지방간염이 비만, 인슐린저항성, 2형 당뇨병 등과 밀접한 관계가 있다는 것은 밝혀졌으나, 명확한 발병기전은 현재 활발한 연구가 진행 중에 있으며, 최근 'two-hit' hypothesis가 제안되면서 지방간염은 간세포 안에 지방이 쌓이면서 시작되며 비만, 당뇨병 등과 연관되어 나타나는 인슐린저항성이 주된 발병기전으로 여겨지고 있다. 또한 증가된 간세포 내 유리지방산(free fatty acid,FFA)이나 콜레스테롤에 의한 lipotoxicity와 증가된 염증성 사이토카인(cytokine) 및 이들 수용체가 지방간에서 지방간염으로 진행하는 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.

2009년 국내 통계청 발표에 따르면 간질환으로 인한 사망률이 경제협력개발기구 (OECD) 국가 중 간암 발생률이 1위로 사회적/경제적으로 손실이 크고, 국내 간질환 전문의약품 시장 규모는 2003년 기준 725억 원으로, 2010년 직전해 대비 4%가 성장한 754억 원에 육박하였으며, 향후 꾸준한 성장이 예상되고 있다. 또한, 간장 보호제 해외 시장 규모는 2003년 6.2억 달러였으며, 5년 뒤에는 약 10~35% 성장할 것으로 예상되었다. 국내 건강기능식품 시장 규모도 2003년 1조2000억 원에서 2004년 1조5000억 원으로 성장했고, 2010년 2조원에 달할 것으로 추정되었으며, 글로벌 컨설팅 기업인 BCC Research의 조사에 따르면 2007년 비알콜성 지방간 치료제 시장은 연간 80억불로 추산되었다.

현재 알콜성 또는 비알콜성 지방간환자에게 사용되고 있는 치료제는 크게 두 가지로 분류되며, 1) 비만치료제 (orlistat), 인슐린저항치료제 (metformin, pioglitazone, rosiglitazone), 고지혈증치료제 (clofibrate, gemfibrozil, bezafibrate, atorvastatin, simvastatin)등과 같이 위험인자의 교정을 통해 지방간을 치료 및 개선하는 약제, 2) 지방간의 위험인자 교정과는 독립적으로 이미 손상된 간세포 및 간기능 회복을 위한 약물로서 간세포 보호제 (ursodeoxycholic acid 및 taurine), 항산화제 (vitamine E) 및 nutritional supporter (lectin, betaine, N-acetylcystein)등이 여기에 해당된다. 그러나 이러한 위에서 언급한 기존에 사용되는 치료제들은 효능 면에서 볼 때 본질적인 치료제가 아닌 증상 개선제로 이용되는 약물이므로 표적 효과로 볼 수 없고, 따라서 현재까지 약물학적으로 지방간을 치료할 수 있는 제제는 거의 없는 실정이므로, 적절한 치료제 개발 시 엄청난 파급효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.

현대 신약 개발에서 가장 핵심적인 개념이라고 할 수 있는 것은 바로 target protein으로, target protein은 치료 약물들의 작용에 의해 그 기능이 변화되어 질병의 발전에 영향을 줄 수 있는 것을 의미하고, 타겟 단백질에 선택적으로 작용할 수 있는 화합물을 발굴하는 것이 신약개발의 기본적인 첫 단계라고 할 수 있다. 하지만 현재까지 비알콜성 지방간 치료의 여러 후보물질은 동물 또는 세포실험의 결과에 근거하여 진행되므로 명확한 작용점을 설정하지 못한 경우가 많을 뿐 아니라, 천연물을 활용하는 경우에는 내재된 화학성분이 불명확한 경우가 많아서 개발에 한계가 있었다.

인간의 GPR119 유전자는 X 염색체상에 위치하고 단일엑손으로 이루어지며, 마우스나 랫드의 유전자 구성과는 차이를 보이지만 발현된 단백질은 인간과 마우스가 많은 유사성을 가진다. 다른 G Protein coupled receptor family와 마찬가지로 7 transmembrane domain을 가지며 세포 내에서 상호작용하는 G protein 은 아직 확실하지 않다.

GPR119 수용체는 췌장의 베타세포, 소장의 장내분비세포인 K-세포 및 L-세포에 주로 존재하는 것으로 알려져 있다. 췌장에서 GPR119의 활성화는 세포 내 adenylate cyclase를 second messenger로 cAMP level을 증가시켜 외부 글루코스 자극에 대한 인슐린 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 인슐린 촉진작용은 글루코스 의존적인 반응이며, 따라서 GPR119 수용체는 기존의 당뇨병 치료제가 갖는 저혈당 유발효과가 없다는 장점이 있다. 소장에서 GPR119의 활성화는 L-세포에서 GLP-1, GLP-2, peptide YY의 분비를 촉진하고 K-세포에서 insulinotropic peptide(GIP)의 분비를 촉진하는 것으로 보고되어 있으며, 상기와 같은 GPR119의 작용은 모두 혈당강하를 촉진하는 신호와 연계되어 항당뇨 효능의 기전을 예상할 수 있다. 실제로 마우스를 이용한 in vivo 실험에서 GPR119 리간드의 투여는 ITT (insulin tolerance test)와 GTT (glucose tolerance test)를 효과적으로 개선시키는 것으로 보고되어 있다.

내인성 GRP119 리간드로는 인체 지질 유사물질 [OEA, PEA, LEA 등의 N-acylathanolamine(NAE)]이 있으며 이들은 GPR119 이외에도 PPAR alpha, TRPV1 등의 수용체에 친화성이 있는 것으로 보고되어져 있다. Arena Pharmaceuticals, GlaxoSmithKline(GSK) 등의 거대 제약회사에서 합성 GPR119 리간드를 제작하였으며, 그 종류는 하기 그림에서 보는 바와 같다. 이러한 합성 GPR119 리간드들은 대부분 당뇨병의 차세대 치료제로 상당한 기대를 모으고 있으며, 특히, MBX2982와 GSK1292263은 임상 2상에 진입한 물질들로 가장 앞서가고 있는 현황이다.

기존 연구결과에서 GPR119의 간 내 발현이 거의 관찰되지 않았고, 따라서 현재까지 지방간에 대한 GPR119 리간드의 효능에 대해서는 평가되지 않았다(Odori S et al., Metabolism,in press). 또한, GPR119 유전자결손 마우스의 혈중 자유지방산과 중성지방 양이 정상 마우스에 비하여 높지 않다는 사실은 비알콜성 지방간에 대한 GPR119 수용체 리간드의 효능을 평가하지 않은 이유가 되었다(Lan et al., 2009 J. Endocrinol.).

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, GPR119 수용체에 작용하는 리간드가 비알콜성 지방간에 대한 치료 효과가 있음을 밝힘으로써, GPR119 리간드를 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료에 적합하게 적용할 수 있음을 제시하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 4-((4-(1H-tetrazol-1-yl)phenoxy)methyl)-2-(1-(5-ethylpyrimidin-2-yl)piperidin-4-yl)thiazole (MBX2982) 또는 3-isopropyl-5-(4-(((6-(4-(methylsulfonyl)phenyl)pyridin-3-yl)oxy)methyl)piperidin-1-yl)-1,2,4-oxadiazole (GSK1292263)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 간 내 중성지방 축적을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 Sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 fatty acid synthase (FAS)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 acetyl CoA carboxylase (ACC)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 Stearoyl-CoA desaturase (SCD)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 비알콜성 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드의 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

현재 당뇨병 치료제로 임상시험중인 GPR119 리간드는 미래 핵심의약품으로 글로벌제약사들의 막대한 투자가 이루어지는 분야이다. 하지만, GPR119 수용체가 간에 그 발현이 거의 나타나지 않는다는 보고와 GPR119 유전자결손 마우스에서 지방산 함량이 변화가 없다는 이유로 GPR119 수용체와 비알콜성 지방간과의 연관성에 대한 연구는 이루어지고 있지 않았다.

본 발명에서는 GPR119의 선택적 리간드로 현재 임상 2상에서 시험중인 두 약물(MBX2982, GSK1292263)의 처치에 의하여 마우스 간 및 간 세포주에서 GPR119의 발현이 증가하고, 지방산 및 중성지방의 간 내 합성효소인 fatty acid synthase (FAS), acetyl CoA carboxylase (ACC) 및, Stearoyl-CoA desaturase (SCD)의 발현이 억제되었을 뿐 아니라, 이들 지방산 합성 효소계의 발현을 조절하는 핵심전사인자인 SREBP-1c의 활성이 두 리간드에 의하여 억제됨을 밝히고, 더 나아가 8주 고지방식이 모델에서 두 리간드의 투약이 지방간 생성을 완벽하게 억제함을 밝혔다.

따라서, GPR119 리간드는 지방간 생성 억제 효과가 우수하므로, 비알콜성 지방간의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 인간 간암 세포에서 GPR119 리간드 처리에 의해 GPR119 수용체가 상향조정됨을 확인한 결과이다.
도 2는 지방간 생성[Triglyceride(TG)합성]에 관여하는 효소계를 나타낸 그림이다.
도 3은 GPR119 리간드에 의한 SREBP-1c 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 GPR119 리간드에 의한 LXR reporter 활성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 GPR119 리간드에 의한 SCD-1 및 FAS mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 고당/고인슐린 노출 시 GPR119 리간드에 의한 SREBP-1C 및 FAS 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 고지방식이에 의한 체중 및 조직 지방 축적에 미치는 GPR119 리간드의 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 고지방식이에 의한 지방간 형성, 간무게 증가, 혈중 총콜레스테롤, 당, ALT 수치 증가에 미치는 GPR119 리간드의 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 고지방식이에 의한 간 내 SREBP-1C, FAS 및 GPR119 mRNA 발현에 미치는 GPR119 리간드의 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 HepG2 세포에서 GPR119 리간드에 의한 AMPK 활성화 및 SREBP-1C 활성과의 연관성을 확인한 결과이다.
도 11은 PKA 억제제인 H-89를 처리하였을 때, SREBP-1C에 미치는 GPR119 리간드의 작용에는 영향을 미치지 않음을 확인한 결과이다.
도 12는 GPR119 리간드의 항당뇨 효능과 항지방간 효능의 신호 전달 체계 차이를 모식도로 나타낸 그림이다.
도 13은 콜린결핍, 아미노산고정 고지방식이 마우스 지방간 모델에서 GPR119 리간드의 효과를 확인한 결과이다.

본 발명자들은 항당뇨 치료제로 개발되고 있는 GPR119 리간드가 비알콜성 지방간의 치료에 우수한 효과를 나타내고, 이를 위한 간 세포 내 신호 전달 체계가 항당뇨 효과를 나타내는 소장 및 췌장 내 신호 전달 체계와 상이함을 밝힘으로써, GPR119 리간드가 비알콜성 지방간 치료에 적합하게 이용할 수 있다는 사실을 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 GPR119 리간드는 4-((4-(1H-tetrazol-1-yl)phenoxy)methyl)-2-(1-(5- ethylpyrimidin-2-yl) piperidin-4-yl)thiazole (MBX2982) 또는 3-isopropyl-5-(4- (((6-(4-(methylsulfonyl)phenyl)pyridin-3-yl)oxy)methyl)piperidin-1-yl)-1,2,4-oxadiazole (GSK1292263)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 시중에서 판매되거나 합성된 것일 수 있고, GPR119 수용체에 결합하여 수용체의 발현을 증가시키는 물질이면 어느 것이든 가능하다.

상기 GPR119 리간드는 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시키고, Sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)의 활성을 억제시키며, fatty acid synthase (FAS), acetyl CoA carboxylase (ACC) 또는 Stearoyl-CoA desaturase (SCD)의 발현을 억제시킴으로써, 간 내 중성지방 축적을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 비알콜성 지방간 질환은 원발성과 속발성에 따른 비알콜성 지방간 질환을 모두 포함한, 바람직하게는 원발성 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 비알콜성 지방간 질환을 의미한다. 예를 들어, 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 비알콜성 지방간염, 간섬유화 및 간경화를 포함한다.

본 발명의 조성물은 GPR119 리간드와 함께 비알콜성 지방간 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 GPR119 리간드는 1일 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

아울러, 본 발명의 약학적 조성물은 비알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 방법]

A. 동물실험

실험동물의 사육

본 발명에서 사용한 비만 유도 식이는 고지방 대조 식이(high fat diet, HFD: 60% 지방 칼로리(fat calorie), Research diets, D12492, 미국)이다.

6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(중앙실험동물, 서울)를 고형사료로 1주일 간 실험실 환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized block design)에 따라 고지방식이 대조군과 실험군으로 임의 배치하여, 12주간 투여함으로써 지방간 동물모델을 확립하였다. 지방간 생성은 혈액생화학적 및 조직학적 분석 방법에 의하여 확인하였다. 마우스에 고지방식이를 투여하고 6주 후에 GPR119 리간드(10 mg/kg)를 40 % PEG400에 현탁하여 고지방식이와 병행하면서 1일 1회 매주 5일 경구로 투여하였다. 콜린 결핍, 아미노산 고정 고지방식이 지방간염 모델은 60 KCal 지방과 0.1% 메티오닌을 함유한 식이를 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(중앙실험동물, 서울)에 4주간 섭취시켜서 제작하였다. 실험 종료 시 실험동물을 12시간 이상 금식시킨 후, 디에틸 에테르로 마취한 상태에서 혈액, 간 및 내장지방조직(부고환지방, 신장주변지방)을 채취하여 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)으로 세척한 후, 무게를 측정하였다. 복부대동맥으로부터 채혈한 혈액은 SST tube를 사용하여 3000 x RPM에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.

혈액 및 간조직의 생화학분석 방법

상기에서 12주간 사육된 실험 동물을 대상으로 혈청 총콜레스테롤, 포도당 농도를 다음과 같이 측정하였다. 혈청 총콜레스테롤 및 포도당 농도는 상업용 측정키트(Bio Clinical system)를 이용하여 각각 2회 반복 측정하였다. 간기능지표로 사용되는 혈중 ALT(alanine aminotransferase)의 양은 상업용 분석키트(Bio Clinical System, 한국)를 사용하여 측정하였다.

H&E( Hematoxylin and eosin ) 염색

상기에서 채취한 간 조직을 10 % 중성포르말린 용액으로 고정하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 ㎛의 두께로 조직 절편을 하여 H&E로 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

웨스턴 블롯 ( western blot ) 분석을 이용한 조직 내 단백질 발현 확인

막자 사발에 일정량의 간조직을 액체질소 및 세포 용해 버퍼와 함께 균질화 시킨 후, 조직액을 새 튜브에 옮겨 볼텍싱하였다. 14,000 rpm, 4 ℃에서 20분간 원심분리한 후 가운데 층을 취하고 브래드포드법에 의해 단백질을 정량하였다. 30 ㎍의 단백질량을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동 시킨 후 FAS 및 SREBP-1c 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 측정하였다.

트리졸 방법( Trizol method )을 이용한 조직 내 RNA 분리 및 확인

간조직 0.1 g당 트리졸 용액 1 mL을 첨가하여 조직을 분쇄한 후, 4℃, 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 클로로포름(chloroform) 200 ㎕을 첨가하고, 볼텍스(vortex) 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올(isoprophanol)과 상층액을 1:1 비율로 첨가하였다. 15초 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 방치한 후, 12,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70 % 에탄올 1 ㎖을 가한 후, 7,500×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 5분 동안 건조시키고, 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)를 사용하여 RNA 펠릿(pellet)을 용해시켰다. UV/VIS 분광분석기(Nanodrop, Thermo, 미국)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 RT kit를 이용하여 cDNA를 합성한 후 Real time PCR를 이용하여 SCD-1 및 FAS의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.

Real time - PCR ( Real time - polymerase chain reaction ) 을 이용한 mRNA 발현 분석

간조직에서 추출된 RNA 시료를 대상으로 cDNA 합성 PCR kit을 이용하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. 역전사를 통해 얻은 cDNA를 주형(template)으로 하고 증폭하고자 하는 유전자 cDNA의 5'과 3' 플링킹 시퀀스(flanking sequence)를 하기 [표 1]의 프라이머를 사용하여 real time PCR(mini-opticon, bio-rad, 미국)을 수행하였으며 mRNA의 발현양을 확인하였다.

유전자	프라이머	서열(5'- 3')	어닐링 온도 (℃)	서열번호	PCR 생성물(bp)
GPR119	F	TGCAGCTGCCTCTGTCCTCA	64.2	1	252bp
GPR119	R	GCACAGGAGAGGGTCAGCAC	61.8	2	252bp
β-actin	F	CCACAGCTGAGAGGGAAATC	58.2	3	193bp
β-actin	R	AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC	58.5	4	193bp

B. 마우스로부터 간세포 분리, 배양

세글렌 등의 방법 (Seglen et al., Exp Cell Res., 82, pp 391-398, 1973)에 따라 웅성 C57BL/6 마우스(C57BL/6 mouse, 중앙실험동물, 서울)로부터 간세포를 분리하였다. C57BL/6 마우스를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5 % CO₂ 및 95 % O₂의 혼합기체를 불어넣고, 37℃의 칼슘 이온과 마그네슘 이온이 없는 행크의 균형염 용액(Ca² ⁺, Mg² ⁺ -free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그 후, 0.1 % Ⅳ형 콜라게나아제 (collagenase type IV, Sigma, 미국) 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 후 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리하고 침전된 간세포를 취해 칼슘 이온과 마그네슘 이온이 없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 후 1형 콜라겐 (collagen type I, Sigma, 미국)으로 코팅된 배양용기에 10 %(v/v) 우태아 혈청 (FBS; fetal bovineserum, GibcoBRL), 10-8M 인슐린, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 (Sigma)이 첨가된 윌리암배지 E (WME; WilliamsMedium E, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포 수가 5×10⁶ 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5 % CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 1시간 배양 후 세포를 Ca² ⁺, Mg² ⁺이 첨가되어 있는 행크의 균형염 용액 (HBSS)으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 후 5 % CO₂, 37℃의 조건에서 4시간 동안 배양시킨 후 FBS가 첨가되지 않은 배양액으로 바꿔 18시간 동안 배양한 후 실험에 사용하였다.

C. 인간간세포주 ( HepG2 ) 배양

인간간세포주(HepG2,ATCC, 미국)인 HepG2를 6-웰 플레이트에 분주하고 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Hyclone, 미국), 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone, 미국)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 콘플루언트(confluent) 한 상태로 자랄 때까지 배양시켰다. 콘플루언트 한 상태로 자란 간세포주를 10 %가 첨가된 배양액 대신 FBS가 첨가되지 않은 배양액으로 바꿔 18시간 동안 배양한 후 실험에 사용하였다.

D. 웨스턴 블롯( Western blot )

램리의 방법(Laemmli UK, Nature 227, 680-685, 1970)에 따라 겔 전기영동 장치(Mighty Small SE 250,Hoefer Scientific Instruments, San Francisco)를 사용하여 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)를 수행하였다. 세포의 용해분획을 시료 희석 완충용액[63 mM Tris(pH.6.8), 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 0.0013 % 브로모페놀 블루, 5 % β-머캅토에탄올]에 희석한 후 8 %, 10 % 겔을 사용하여 전극 완충용액(1 ℓ 용액 중 Tris 15 g, 글리세린 72 g, SDS 5 g 함유) 내에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔을 전이용 전기영동 장치를 이용하여 전이완충용액(25 mM Tris, 192 mM 글리세린, 20 % v/v 메탄올(pH.8.3)] 내에서 40 mAmps로 3시간 동안 나이트로셀룰로오즈 막에 단백질을 전이시켰다. 항-FAS(anti-fattyacid synthase), 항-GPR119, 항-SRBP-1c, 항-인산 AMPK-α, 항-인산 ACC, 항-인산 SREBP-1c 각각을 1차 항체로서 상기 나이트로셀룰로오즈 막에 반응시킨 후 여기에 2차 항체로 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼IgG(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)와 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스(anti-mouse) IgG를 1시간 동안 반응시키고 ECL 검출 시스템(ECL chemiluminecence system, Amersham,Gaithesberg, MA)을 사용하여 발색하였다. 시료 중 단백질 함량의 동질성은 항-β-액틴(anti-β-actin) 항체, 항-LaminA/C을 사용하여 확인하였다. 단백질 발현량 변화는 블럿 중 발색강도를 농도계측기(densitometry)를 이용하여 도출하였는데, 농도계측기 스캔은 이미지 스캔 & 분석 시스템(Image Scan &Analysis System, Alpha-Innotech Co.)을 사용하였다. 각 레인은 AlphaEase^TM 버전 5.5 소프트웨어를 사용하여 배경의 강도를 제하고 계산하였다.

E. 트리졸 방법( Trizol method )을 이용한 세포 내 RNA 분리 및 확인

세포에 트리졸 용액 1 mL을 첨가하여 조직을 분쇄한 후, 4 ℃, 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 클로로포름(chloroform) 200 ㎕을 첨가하고, 볼텍스(vortex) 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올(isoprophanol)과 상층액을 1:1 비율로 첨가하였다. 15초 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 방치한 후, 12,000 x g, 4 ℃에서 10분간 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70 % 에탄올 1 ㎖을 가한 후, 7,500 x g, 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 5분 동안 건조시키고, 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)를 사용하여 RNA 펠릿(pellet)을 용해시켰다. UV/VIS 분광분석기(Nanodrop, Thermo, 미국)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 RT kit를 이용하여 cDNA를 합성한 후 Real time PCR를 이용하여 SCD-1 및 FAS의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.

F. Real time - PCR ( Real time - polymerase chain reaction ) 을 이용한 세포 내 mRNA 발현 분석

세포에서 추출된 RNA시료를 대상으로 cDNA 합성 PCR kit을 이용하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. 역전사를 통해 얻은 cDNA를 주형(template)으로 하고 증폭하고자 하는 유전자 cDNA의 5'과 3' 플링킹 시퀀스(flanking sequence)를 하기 [표 2]의 프라이머를 사용하여 real time PCR(mini-opticon, bio-rad, 미국)을 수행하였으며 mRNA의 발현양을 확인하였다.

유전자	프라이머	서열(5'-3')	어닐링 온도 (℃)	서열번호	PCR 생성물(bp)
SCD1	F	GCTGCTCGGATCACTAGTGAA	61.1	5	281bp
SCD1	R	TTCTGCTATCAGTCTGTCCAG	65.4	6	281bp
FAS	F	AGTACACACCCAAGGCCAAG	65	7	125bp
FAS	R	GGATACTTTCCCGTCGCATA	62	8	125bp
β-actin	F	GATGAGATTGGCATGGCTTT	61	9	102bp
β-actin	R	GTCACCTTCACCGTTCCAGT	65	10	102bp

[ 실시예 ]

실시예 1. 인간간세포주에서 GPR199 리간드에 의한 수용체 발현 증가

기존의 연구결과에서 GPR119의 간 내 발현이 거의 관찰되지 않음에 따라, 지방간에 대한 GPR119 리간드의 기능은 평가되지 않았었다(Odori S et al., Metabolism,in press).

이에, 본 발명자들은 GPR119의 선택적인 리간드 2종(MBX2982, GSK1292263)의 처리를 통한 HepG2 (인간 간암 세포주) 세포에서의 GPR119의 발현 변화를 확인하였다.

이를 위해, 상기 B와 C의 방법에서와 같이 배양한 인간간세포주(HepG2)에 GPR119 리간드(MBX-2982, GSK-1292263A) 3 μM를 시간 의존적으로 처리하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 3] 및 [표 4]에서 보는 바와 같으며, GPR119 단백질의 발현 변화는 상기 D의 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 이용하여 측정하였다.

인간간세포주(HepG2)
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	GPR119 리간드(MBX-2982) 3 μM 함유 배양액 1시간 처리
3군	GPR119 리간드(MBX-2982) 3 μM 함유 배양액 3시간 처리
4군	GPR119 리간드(MBX-2982) 3 μM 함유 배양액 6시간 처리
5군	GPR119 리간드(MBX-2982) 3 μM 함유 배양액 9시간 처리

인간간세포주(HepG2)
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	GPR119 리간드(GSK-1292263A) 3 μM 함유 배양액 0.5시간 처리
3군	GPR119 리간드(GSK-1292263A) 3 μM 함유 배양액 1시간 처리
4군	GPR119 리간드(GSK-1292263A) 3 μM 함유 배양액 3시간 처리
5군	GPR119 리간드(GSK-1292263A) 3 μM 함유 배양액 6시간 처리
6군	GPR119 리간드(GSK-1292263A) 3 μM 함유 배양액 9시간 처리

그 결과, GPR119의 선택적인 리간드 2종 모두 HepG2 세포에서 GPR119 발현을 증가시켰다(도 1).

실시예 2. 인간간세포주 및 1차 배양 마우스 간세포에서 GPR199 리간드에 의한 SREBP -1c 활성 및 지방간 합성 효소 발현 억제

지방간을 일으키는 데 관여하는 지방산의 합성은 도 2에서 도시된 바와 같이, 일련의 효소계의 발현 증가가 관여하게 되고, 이들 중 Acety-CoA carboxylase (ACC), Fatty acid synthase (FAS) 및 Stearoyl-CoA desaturase (SCD)의 발현은 전사인자인 Sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)에 의해서 조절되며, SREBP-1c의 활성화는 상기 효소계를 발현시킴으로써 간 내 중성지방의 축적을 촉진하게 된다.

2-1. T0901317 처리에 따른 SREBP -1c의 발현 변화 확인

이에, 본 발명자들은 간 세포주에서 GPR119 리간드 처리에 의한 간 내 지방축적 저해 효과를 확인하기 위하여, 먼저 SREBPP-1c 활성화 신호로 잘 알려진 Liver X receptor(LXR) 리간드인 T0901317(N-(2,2,2-Trifluoroethyl)-N-[4-[2,2,?2-trifluoro-1-hydroxy-1-(trifluoromethyl) ethyl] phenyl] benzenesulf- onamide)을 이용하였다.

이를 위해, 상기 B의 방법에서와 같이 분리·배양한 간세포, 및 상기 C의 방법에서와 같이 배양한 인간간세포주(HepG2)에 GPR119 리간드(MBX-2982, GSK-1292263A)를 함유한 배양액을 가하고 30분 후 10 μM T0901317를 9시간 동안 처리하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 5] 및 [표 6]에서 보는 바와 같으며, SREBP-1c 단백질의 발현 변화는 상기 D의 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 이용하여 측정하였다.

1차 배양 간세포
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	10 μM T0901317 함유 배양액 처리
3군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 0.3 μM 함유 배양액 처리
4군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 1 μM 함유 배양액 처리
5군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리
6군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 10 μM 함유 배양액 처리

인간간세포주(HepG2)
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	10 μM T0901317 함유 배양액 처리
3군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 0.1 μM 함유 배양액 처리
4군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 0.3 μM 함유 배양액 처리
5군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 1 μM 함유 배양액 처리
6군	10 μM T0901317 및 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리

그 결과, HepG2 및 1차 배양 간세포(primary hepatocyte)에 SREBP-1c의 활성화 신호로 잘 알려진 Liver X receptor(LXR) 리간드인 T0901317을 단독으로 처리할 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 SREBP-1c의 발현이 크게 증가하였으나, GPR119 리간드 두 종을 함께 처리할 경우 농도의존적으로 억제함을 확인하였다(도 3).

또한, LXR 활성을 특이 reporter gene assay로 평가하였을 경우에도 GPR119 리간드 두 종을 함께 처리할 때 그 활성이 모두 억제됨을 확인하였다(도 4).

2-2. T0901317 처리에 따른 SCD -1 및 FAS 의 mRNA 발현 변화 확인

상기 C의 방법에서와 같이 배양한 인간간세포주(HepG2)에 GPR119 리간드(MBX-2982, GSK-1292263A)를 함유한 배양액을 가하고 30분 후 10 μM T0901317를 9시간 동안 처리하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 7]에서 보는 바와 같으며, SCD-1 및 FAS mRNA 발현 변화는 상기 E의 방법에서와 같이 RNA 분리 및 cDNA를 합성하여 상기 F의 Real time-PCR 방법을 이용하여 mRNA를 측정하였다.

그 결과, 실제 간 내 중성지방 합성에 관여하는 효소인 SCD-1 및 FAS의 mRNA 발현에 있어서, T0901317을 처리함으로써 증가된 SCD-1 및 FAS의 mRNA 발현이 GPR119 리간드 두 종을 처리할 경우 농도의존적으로 모두 억제됨을 확인하였다(도 5).

2-3. 고당/ 고인슐린 노출에 따른 SREBP -1c 및 FAS 발현 변화 확인

LXR 리간드 노출 이외에 실제 비알콜성 지방간을 일으키는 신호로 잘 알려진 고당/고인슐린 노출에 따른 SREBP-1c 및 FAS 발현 변화를 확인하기 위하여, HepG2 및 1차 배양 인간 간세포에 고당/고인슐린을 노출시킨 상태에서, GPR119 리간드 두종을 처리하였다.

이를 위해 인간간세포주(HepG2)에 고당(glucose 30 mM)을 함유한 배양액을 가하고 GPR119 리간드를 농도 의존적으로 처리하였다. 30분 후 200 nM 인슐린(Insulin)를 24시간 동안 처리하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 8] 및 [표 9]에서 보는 바와 같으며, 단백질의 발현 변화는 상기 D의 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 이용하여 측정하였다.

1차 배양 간세포
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리
3군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 0.3 μM 함유 배양액 처리
4군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 1 μM 함유 배양액 처리
4군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리
4군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 10 μM 함유 배양액 처리

인간간세포주(HepG2)
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리
3군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 1 μM 함유 배양액 처리
4군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리

그 결과, HepG2 및 1차 배양 인간 간세포에 고당/고인슐린을 노출시켰을 때 각 세포에서 SREBP-1c의 발현 및 핵 이동형 (활성형) SREBP-1C의 양이 현저히 증가함을 확인하였고, 이렇게 증가된 SREBP-1c의 발현 양이 GPR119 리간드인 MBX2982를 처리할 경우 완벽하게 억제됨을 확인하였다(도 6). 또한, HepG2 세포에서 고당/고인슐린 노출에 의해 증가된 FAS 발현도 MBX2982 처리에 의하여 억제됨을 확인하였다(도 6).

실시예 3. 고지방식이에 의한 지방간 유도 모델에서 GPR199 리간드의 효능

GPR119 리간드들이 지방간 생성을 실제로 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 A의 동물실험 방법을 토대로 고지방식이에 의한 지방간 유도 모델에서 GPR119 리간드의 효과를 확인하였다.

구체적으로, 4주간 고지방식이를 투여하고, 4주간의 추가 고지방식이 조건에서 10 mg/kg 용량으로 두 약물을 2일에 한 번씩 경구 투약하였으며, 구체적 실험 스케줄은 도 7의 상단에서 기재한 바와 같다.

3-1. 체중 감소 효과 확인

고지방식에 의한 지방간 유도 모델에서 GPR119 리간드 처리에 의해 체중 감소가 유발되는 지를 관찰하였다.

그 결과, 실제 고지방식이군에서는 현저한 체중증가가 관찰되었고, GPR119 리간드를 처리한 군의 경우, 유의성있는 체중 감소가 관찰되었다(도 7). 또한, 조직 내 지방 무게(fat weight)도 MBX2982 처리군에서 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

3-2. H&E 염색을 통한 지방축적 정도 확인

간 조직을 적출한 후 H&E 염색을 진행하여 지방축적 정도를 관찰하였다.

그 결과, 고지방식이군의 간은 거의 대부분의 간세포 내에서 지방 축적이 관찰된 반면, GPR119 리간드 투여군에서는 이의 현저한 개선이 관찰되었다(도 8). 또한, 고지방식이군에서 증가된 간 무게, 총콜레스테롤 양, 혈당 및 ALT 수치 또한GPR119 리간드 투여군에서 현저하게 개선됨을 확인하였으며, 이를 통해 GPR119 리간드의 항지방 효능을 입증하였다(도 8).

3-3. 간 조직 내 SREBP -1C 및 FAS 발현 확인

고지방식이에 의한 지방간 유도 모델의 간 조직 내 SREBP-1C 및 FAS의 발현을 확인하였다.

그 결과, GPR119 리간드를 투여한 군에서 고지방식이군에 비해 모두 SREBP-1C의 발현과 FAS 발현을 억제시키는 경향이 나타남을 확인하였다(도 9).

또한, 두 종의 GRP119 리간드를 마우스에 투약시 실제 GPR119 mRNA 양의 증가가 관찰되었으며, 특히 MBX2982를 투여한 경우 대조군에 비해 GPR119 mRNA의 발현이 7배 증가하였다.

실시예 4. AMPK 활성화제로서 GPR119 리간드의 작용

본 발명자들은 상기 결과들을 토대로 GPR119 리간드에 의한 SREBP-1C의 활성화가 기존 GPR119의 2차 신호계로 알려진 cAMP/PKA (cyclic AMP/Protein kinase A) 활성화와는 관련이 없음을 유추하였고, 실제로 PKA 억제제인 H-89을 처리하였을 때 SREBP-1C에 미치는 GPR119 리간드의 작용에는 영향을 미치지 않음을 확인하여 이를 입증하였다(도 11).

이를 위해 하기의 실험을 수행하였으며, 구체적으로 인간간세포주(HepG2)에 고당(glucose 30 mM)을 함유한 배앵액을 가한 후 AMPK 억제제를 처리하고 30분 후 GPR119 리간드 3 μM을 처리하였다. 30분 후 200 nM 인슐린(Insulin)를 처리한 후 24시간 배양하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 10]에서 보는 바와 같으며, 단백질의 발현 변화는 상기 D의 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 이용하여 측정하였다.

	인간간세포주(HepG2)
구분	처리방법
1군	정상 배양액 처리
2군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리
3군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리
4군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 AMPK 억제제와 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리
5군	고혈당 함유 및 고인슐린 배양액 처리 및 PKA 억제제와 GPR119 리간드 3 μM 함유 배양액 처리

최근 보고에 의하면, SREBP-1C는 AMPK(AMP-activated protein kinase)에 의해 Ser-372 region에 인산화가 일어남으로써 불활성형으로 변화됨이 보고된 바 있다. 이에, 본 발명자들은 간 세포 내에서 GPR119 리간드들이 AMPK 활성화 작용과 SREBP-1C 인산화에 미치는 영향을 평가하였다.

이를 위해, 상기 B와 C의 방법에서와 같이 배양한 인간간세포주(HepG2)에 GPR119 리간드(MBX-2982, GSK-1292263A) 3 μM를 시간 의존적으로 처리하였다. 이때 각 실험군에서 GPR119 리간드의 처리 조건은 하기 [표 11] 및 [표 12]에서 보는 바와 같으며, 단백질의 발현 변화는 상기 D의 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 간 세포 내에서 두 종의 GPR119 리간드는 모두 AMPK를 강력하게 활성화(AMPK 인산화 및 ACC 인산화)시키고, 이때 SREBP-1C의 Ser-372 인산화도 증가시킴을 확인하였다(도 10). 더 나아가, AMPK의 억제제인 compound C 처리할 경우, GPR119 리간드인 MBX2982에 의한 SREBP-1C 발현 억제가 회복됨을 확인하였다(도 10).

실시예 5. 콜린 결핍, 아미노산 고정 고지방식이 지방간염 모델에서 GPR199 리간드의 효능

GPR119 리간드들이 비알콜성 지방간염에 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 A의 동물실험 방법을 토대로 콜린 결핍, 아미노산 고정 고지방식이 지방간염 모델에서 GPR119 리간드의 효과를 확인하였다.

구체적으로, 4주간 고지방식이를 투여하고, 4주간의 추가 고지방식이 조건에서 10 mg/kg 용량으로 MBX2982를 2일에 한 번씩 경구 투약하였으며, 구체적 실험 스케줄은 도 7의 상단에서 기재한 바와 같다.

간 조직을 적출한 후 H&E 염색을 진행하여 지방축적 정도를 관찰하였다. 그 결과, 아미노산 고정 고지방식이 마우스 비알콜성 지방간염 모델에서 GPR 119 리간드 투여가 지방축적을 억제시켰다(도 13). 또한, 지방간염의 대표 염증성 표지인자인 MCP-1과 Pro-IL-1beta의 mRNA 발현을 확인하였고, 그 결과 GPR 119 리간드 투여가 MCP-1과 Pro-IL-1beta의 mRNA 발현을 억제한다는 것을 확인하였다(도 13).

이를 통해, 기존에 알려진 GPR119 리간드의 cAMP 증가 작용에 의한 GLP-1 및 인슐린 분비와는 별개의 작용으로, 이들 리간드들이 간 세포내에서 AMPK를 활성화시키고, 이를 통해 지방간 생성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한, GPR 119 리간드가 비알콜성 지방간 뿐만 아니라 질환의 진행형인 지방간염도 억제한다는 것도 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 핵심적 기술은 GPR119 수용체가 리간드 노출에 의하여 간에서 그 발현이 증가하고, 리간드 처치에 의해 지방산 및 중성지방 합성효소의 발현을 억제하여, 지방간 치료 효능을 갖는다는 점이다. 이때, 그 약리기전은 기존의 cAMP 증가에 따르는 PKA 신호 활성화와 달리 AMPK활성화와 관여하며, 도 12에서 이를 모식도로 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, GPR119 리간드의 지방간 억제 신호 전달 체계와 항당뇨 신호 전달 체계에는 명백한 차이가 있으며, 본 발명에서는 이러한 GPR119 리간드의 지방간 억제 효과를 최초로 확인한 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating of nonalcoholic fatty liver disease comprising G protein coupled receptor 119 ligand as an active ingredient <130> PB14-12444 <150> KR 10-2014-0008368 <151> 2014-01-23 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPR119 forward primer <400> 1 tgcagctgcc tctgtcctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPR119 reverse primer <400> 2 gcacaggaga gggtcagcac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 3 ccacagctga gagggaaatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 4 aaggaaggct ggaaaagagc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1 forward primer <400> 5 gctgctcgga tcactagtga a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1 reverse primer <400> 6 ttctgctatc agtctgtcca g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS forward primer <400> 7 agtacacacc caaggccaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS reverse primer <400> 8 ggatactttc ccgtcgcata 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer(in Table 2) <400> 9 gatgagattg gcatggcttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer(in Table 2) <400> 10 gtcaccttca ccgttccagt 20

Claims

GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드인 4-((4-1H-테트라졸-1-일)페녹시)메틸)-2-(1-5-에틸피리미딘-2-일)피페리딘-4-일)티아졸(MBX2982) 또는 3-이소프로필-5-(4-(((6-(4-(메틸설포닐)페닐)피리딘-3-일)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-1,2,4-옥사디아졸(GSK1292263)을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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