KR101946516B1 - Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 collagen I, transforming growth factor β(TGFβ) 및 α-smooth muscle actin (α-SMA) 발현을 유의적으로 억제하여 간 성상세포의 활성화가 억제할 뿐만 아니라, 간 성상세포의 증식도 유의적으로 억제하는 효능을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 간 섬유화의 개선, 예방, 억제 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of cirrhosis of liver comprising G protein coupled receptor 119 ligand as an active ingredient}

본 발명은 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

간 섬유화는 독성 물질 또는 다양한 감염성, 면역성, 대사성 질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서, 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되지 않고 콜라겐과 같은 섬유 조직으로 변형된 상태를 말한다. 특히 근섬유아세포 (myofibroblast) 형태로 전이된 간 성상세포(hepatic stellate cells : HSCs)가 증식, 이동하여 과도한 결합조직을 생성함으로써 이러한 간의 섬유화 과정을 진행시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 간 섬유화는 조직손상의 복구과정에서 발생하는 생체 적응 반응이지만 생체 내 물질의 대사 및 담즙분비 등 간의 고유기능을 전혀 수행할 수 없는 섬유 조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하가 필연적으로 나타난다. 간 섬유화 현상이 지속적으로 반복될 때에는 간 경화로 발전되어 사망에까지 이르게 된다는 점에서 적절한 치료제의 개발은 신약개발의 중요한 과제가 된다.

현재 간 섬유화 치료제의 개발은 약물이 성상 세포의 활성을 억제할 수 있느냐에 초점이 맞추어지고 있으며, 종래 이러한 약물로는 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2, 비페닐 디메틸 디카르복실산, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마 인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸) 아미드 등이 알려져 있다(국내등록특허 10-1086040 참조). 하지만, 이들 약물들은 임상에 적용시 작용이 미약하거나 부작용이 심하기 때문에, 현재로서는 효과적인 간 섬유화 치료제는 없다고 할 수 있다.

한편, 인간의 GPR119 유전자는 X 염색체상에 위치하고 단일엑손으로 이루어지며, 마우스나 랫드의 유전자 구성과는 차이를 보이지만 발현된 단백질은 인간과 마우스가 많은 유사성을 가진다. 다른 G Protein coupled receptor family와 마찬가지로 7 transmembrane domain을 가지며 세포 내에서 상호작용하는 G protein은 아직 확실하지 않다.

GPR119 수용체는 췌장의 베타세포, 소장의 장내분비세포인 K-세포 및 L-세포에 주로 존재하는 것으로 알려져 있다. 췌장에서 GPR119의 활성화는 세포 내 adenylate cyclase를 second messenger로 cAMP level을 증가시켜 외부 글루코스 자극에 대한 인슐린 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 인슐린 촉진작용은 글루코스 의존적인 반응이며, 따라서 GPR119 수용체는 기존의 당뇨병 치료제가 갖는 저혈당 유발효과가 없다는 장점이 있다. 소장에서 GPR119의 활성화는 L-세포에서 GLP-1, GLP-2, peptide YY의 분비를 촉진하고 K-세포에서 insulinotropic peptide(GIP)의 분비를 촉진하는 것으로 보고되어 있으며, 상기와 같은 GPR119의 작용은 모두 혈당강하를 촉진하는 신호와 연계되어 항당뇨 효능의 기전을 예상할 수 있다. 실제로 마우스를 이용한 in vivo 실험에서 GPR119 리간드의 투여는 ITT (insulin tolerance test)와 GTT (glucose tolerance test)를 효과적으로 개선시키는 것으로 보고되어 있다.

내인성 GRP119 리간드로는 인체 지질 유사물질 [OEA, PEA, LEA 등의 N-acylathanolamine(NAE)]이 있으며 이들은 GPR119 이외에도 PPAR alpha, TRPV1 등의 수용체에 친화성이 있는 것으로 보고되어져 있다. Arena Pharmaceuticals, GlaxoSmithKline(GSK) 등의 거대 제약회사에서 합성 GPR119 리간드를 제작하였다. 이러한 합성 GPR119 리간드들은 대부분 당뇨병의 차세대 치료제로 상당한 기대를 모으고 있으며, 특히, MBX2982와 GSK1292263은 임상 2상에 진입한 물질들로 가장 앞서가고 있는 현황이다.

기존 연구결과에서 GPR119의 간 내 발현이 거의 관찰되지 않았고, 따라서 현재까지 간 섬유화에 대한 GPR119 리간드의 효능에 대해서는 전혀 평가되지 않았다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, GPR119 수용체에 작용하는 리간드가 간 섬유화에 대한 치료 효과가 우수함을 밝힘으로써, GPR119 리간드를 간 섬유화의 예방 또는 치료에 적합하게 적용할 수 있음을 제시하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 4-((4-(1H-tetrazol-1-yl)phenoxy)methyl)-2-(1-(5-ethylpyrimidin-2-yl)piperidin-4-yl)thiazole (MBX2982) 또는 3-isopropyl-5-(4-(((6-(4-(methylsulfonyl)phenyl)pyridin-3-yl)oxy)methyl)piperidin-1-yl)-1,2,4-oxadiazole (GSK1292263)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 간 성상세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 간 성상세포의 활성화를 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 collagen I의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 transforming growth factor β(TGFβ)의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GPR119 리간드는 α-smooth muscle actin (α-SMA)의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명에 따른 GPR119 리간드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 collagen I, transforming growth factor β(TGFβ) 및 α-smooth muscle actin (α-SMA) 발현을 유의적으로 억제하여 간 성상세포의 활성화가 억제할 뿐만 아니라, 간 성상세포의 증식도 유의적으로 억제하는 효능을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 간 섬유화의 개선, 예방, 억제 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1a는 마우스의 간 성상세포(HSCs)에서 GPR119의 mRNA 발현을 확인한 결과이다.
도 1b는 인간 간암 조직에서 유래한 간 섬유화 조직에서 GPR119 발현을 확인한 결과이다.
도 2a는 마우스의 간 성상세포(HSCs)에서 GPR119 리간드 처리에 따른 col1A1의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 2b는 마우스 배아섬유세포(MEF)에서 GPR119 리간드 처리에 따른 collagen I 및 α-SMA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 2c는 인간 간세포주인 LX-2 세포에서 GPR119 리간드 처리에 따른 TGFβ1 유도성 collagen I 및 TGFβ의 단백질과 mRNA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 2d는 인간 간세포주인 LX-2 세포에서 GPR119 리간드(GSK1292263) 처리에 따른 콜라겐 합성 및 TGFβ 발현억제를 확인한 결과이다.
도 2e는 인간 간세포주인 LX-2 세포에서 GPR119 리간드 처리에 따른 Smad2/Smad3 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 3a는 간 섬유화 동물 모델에서 GPR119 리간드 처리에 따른 α-SMA 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 3b는 간 섬유화 동물 모델에서 Collagen의 주요 생체 분해 산물인 hydroxyproline을 정량한 결과이다.
도 3c는 간 섬유화 동물 모델에서 GPR119 리간드 처리에 따른 collagen I, TGFβ 및 α-SMA의 단백질 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4a는 PKA 저해제인 H-89를 처리하였을 때 GPR119 리간드의 작용 변화를 확인한 결과이다.
도 4b는 인간 간 성상세포주인 LX-2에서 GPR119 리간드를 처리에 의한 AMPK 활성화를 확인한 결과이다.
도 4c는 AMPK 저해제인 compound C 처리 및 DN-AMPK를 형질 도입하고, TGFβ1 유도성 간 섬유화 유도 인자(collagen I, TGFβ)의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4d는 MPK 저해제인 compound C 처리 및 DN-AMPK를 형질 도입하고, TSmad3의 인산화에 대한 GPR119 리간드의 억제 작용 변화를 확인한 결과이다.
도 4e는 인간 간 성상세포주인 LX-2에서, GPR119 리간드 처리에 따른 Smad3과 p300간의 상호작용 및 Smad3의 아세틸화(acetylation)를 확인한 결과이다.
도 4f는 ChIP 분석을 통해 col1A1 유전자의 프로모터와 p300의 결합이 GPR119 리간드 처리에 의해서 억제됨을 확인한 결과이다.
도 4g는 인간 간 성상세포주인 LX-2에 GPR119 리간드를 단독으로 처리할 때, 활성화된 AMPK가 p300과 직접 결합하여 AMPK의 활성화가 p300과 Smad간의 상호작용에 영향을 미친다는 것을 확인한 결과이다.
도 4h는 인간 간 성상세포주인 LX-2에서 GPR119 리간드 처리에 따른 p300의 mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4i는 GPR119 리간드에 의한 p300의 단백질 발현 감소가 프로테아좀 분해에 의한 것임을 확인한 결과이다.
도 5a는 PDGF를 도입하여 세포 증식이 유도된 간 성상세포에서, GPR119 리간드 처리에 따른 세포 증식 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5b는 인간 간 성상세포주인 LX-2에서 GPR119 리간드 처리에 따른 Pin1의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5c는 인간 간 성상세포주인 LX-2에 Pin1 adenovirus를 형질 도입하여 TGFβ1 유도성 collagen I 및 TGFβ 발현에 대한 GPR119 리간드의 억제 효과를 확인한 결과이다.

본 발명자들은 항당뇨 치료제로 개발되고 있는 GPR119 리간드가 간 성상세포의 활성화 및 증식을 억제하여 간 섬유화의 치료에 우수한 효과를 나타내고, 이에 대한 신호 전달 체계를 밝힘으로써, GPR119 리간드가 간 섬유화 치료에 적합하게 이용할 수 있다는 사실을 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 GPR119 리간드는 4-((4-(1H-tetrazol-1-yl)phenoxy)methyl)-2-(1-(5- ethylpyrimidin-2-yl) piperidin-4-yl)thiazole (MBX2982) 또는 3-isopropyl-5-(4- (((6-(4-(methylsulfonyl)phenyl)pyridin-3-yl)oxy)methyl)piperidin-1-yl)-1,2,4-oxadiazole (GSK1292263)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 시중에서 판매되거나 합성된 것일 수 있고, GPR119 수용체에 결합하여 수용체의 발현을 증가시키는 물질이면 어느 것이든 가능하다.

본 발명자들은 간 섬유화 유도 시 활성화되는 간 성상세포에서 GPR119 발현을 확인하고, GPR119의 간 성상세포에서의 기능적 역할을 규명하고자 간 성상세포의 활성화에 대한 GPR119 리간드의 효과를 관찰하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 간 성상세포에 GPR119 리간드를 처리하는 경우, collagen I, transforming growth factor β(TGFβ) 및 α-smooth muscle actin (α-SMA) 발현이 유의적으로 억제하여 간 성상세포의 활성화가 억제됨을 확인하였다(실시예 2 및 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, GPR119 리간드의 간 섬유화 억제 효과에 대한 신호체계를 규명하고자, GPR119 신호 전달 경로인 cAMP/PKA (cyclic AMP/Protein kinase A) 활성화를 관찰한 결과, GPR119 리간드가 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시킴을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, GPR119 리간드의 간 성상세포의 증식 억제능을 확인한 결과, GPR119 리간드를 처리하는 경우, 간 성상세포의 증식이 억제됨을 확인하였다(실시예 5 참조).

따라서, 상기 GPR119 리간드는 간 성상세포의 활성화를 억제할 뿐만 아니라, 간 성상세포의 증식을 억제함으로써, 간 섬유화를 개선, 예방, 억제 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 GPR119 리간드와 함께 간 섬유화 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 GPR119 리간드는 1일 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

아울러, 본 발명의 약학적 조성물은 간 섬유화의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 방법]

A. 시약 및 재료 준비

AMP-activated protein kinase (AMPK), phospho-AMPK, p-Smad2, p-Smad3, Smad2, Smad3, acetylated lysine, lamin A/C, Horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG, 및 Horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-mouse IgG 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구매하였다. Anti-collagen I 항체는 Abcam plc. (Cambridge, MA, USA)에서 제공받았다. p300, c-Myc, 및 anti-goat IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. Smooth muscle Ab-1 항체는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. Anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 항체, H-89, 및 compound C는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 제공받았다. MBX-2982는 medchem express (Monmouth County, NJ, USA) 제품을 이용하였다.

B. 동물실험

실험동물의 사육

6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(중앙실험동물, 서울)를 고형사료로 1주일 간 실험실 환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized block design)에 따라 대조군과 실험군으로 임의 배치하여 6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(중앙실험동물, 서울)를 3주 동안 사염화탄소(1ml/kg)를 주당 2회 투여하여 간 섬유화를 유발하였고 동시에 GPR119 리간드(10 mg/kg)를 40 % PEG400에 현탁하여 1일 1회 매주 5일 경구로 투여하였다. DMN에 의한 간 섬유화 유도 모델은 DMN (10mg/kg)을 주당 3회 투여하여 간 섬유화를 유발하였다. 대조군으로는 Vehicle 투여군을 사용하였다. 실험 종료 시 실험동물을 12시간 이상 금식시킨 후, 졸레틸로 마취한 상태에서 혈액, 간을 채취하여 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)으로 세척한 후, 무게를 측정하였다. 복부대동맥으로부터 채혈한 혈액은 SST tube를 사용하여 3000 x RPM에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.

혈액 및 간조직의 생화학분석 방법

상기의 실험동물을 대상으로 혈청의 alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), total bilirubin (T-BIL)과 direct bilirubin (D-BIL)은 자동 혈액 분석기인 Spectrumㆁ[(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)]를 사용하여 분석하였다.

Sirius red 염색

상기에서 채취한 간 검체를 절편으로 만들었고 조직 절편은 10% buffered neutral formalin 으로 고정하고 파라핀에 매몰하였다. 이후 4μm 두께로 절단하여 슬라이드에 표본을 고정시키고 sirius red 염색하여 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.

웨스턴 블롯 (western blot) 분석을 이용한 조직 내 단백질 발현 확인

막자 사발에 일정량의 간조직을 액체질소 및 세포 용해 버퍼와 함께 균질화 시킨 후, 조직액을 새 튜브에 옮겨 볼텍싱하였다. 14,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 가운데 층을 취하고 브래드포드법에 의해 단백질을 정량하였다. 30 μg의 단백질량을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동 시킨 후 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 측정하였다.

트리졸 방법( Trizol method)을 이용한 조직 내 RNA 분리 및 확인

간조직 0.1 g당 트리졸 용액 1 mL을 첨가하여 조직을 분쇄한 후, 4℃, 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 클로로포름(chloroform) 200 μl을 첨가하고, 볼텍스(vortex) 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 이소프로판올(isoprophanol)과 상층액을 1:1 비율로 첨가하였다. 15초 세게 흔든 다음 실온에서 10분 동안 방치한 후, 12,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ml을 가한 후, 7,500×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 5분 동안 건조시키고, 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)를 사용하여 RNA 펠릿(pellet)을 용해시켰다. UV/VIS 분광분석기(Nanodrop, Thermo, 미국)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 RT kit를 이용하여 cDNA를 합성한 후 Real time PCR를 이용하여 mRNA 발현 변화를 확인하였다.

C. 마우스로부터 간 성상세포 분리, 배양

수컷 C57BL/6 마우스 및 수컷 GPR119 WT 마우스와 GPR119 KO 마우스로부터 간 성상세포를 분리하였다. 보다 구체적으로, 각각의 마우스를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣고, 37℃의 칼슘 이온과 마그네슘 이온이 없는 행크의 균형염 용액(Ca^{2 +}, Mg^{2 +} -free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그 후, 0.1% Ⅳ형 콜라게나아제 (collagenase type IV, Sigma, 미국) 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 후 간세포 현탁액을 만들어 1000×g에서 10분간 원심분리하고 침전된 세포층을 Nycodenz를 이용한 density gradient방법으로 간 성상세포를 부유시켜 분리하는 방법으로 획득하였다. 분리한 간 성상세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 50 U/ml 페니실린(penicillin) 및 50 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배양액으로 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다.

D. 인간간성상세포주 ( LX -2) 배양

인간간성상세포주(LX-2, milipore, 미국)인 LX-2를 6-웰 플레이트에 분주하고, 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Hyclone, 미국), 2% 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone, 미국)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 콘플루언트(confluent) 한 상태로 자랄 때까지 배양시켰다. 콘플루언트 한 상태로 자란 간성상세포주를 2%가 첨가된 배양액 대신 FBS가 첨가되지 않은 배양액으로 바꾼 후 실험에 사용하였다.

E. 인체 조직 시료

조선대학교 병원(Gwangju, South Korea)에서 외과적 수술에 의한 암 제거 수술을 받은 간암 환자로부터 기증받은 간암 조직과 주변 정상 조직 시료를 사용하였다. 실험 프로토콜은 1975 헬싱키 선언의 윤리 가이드라인을 준수하였고, 모든 환자의 동의서를 받았으며 IRB 승인을 획득하였다(CHOSUN 2013-04-005).

F. 세포 분획법

전세포 추출액 (whole cell lysate) 및 핵 분획 (nuclear fraction)은 기존 방법에 따라 분리하였다. 보다 구체적으로, 전세포 추출액은 인산완충용액 (phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척한 세포에 용해완충액 [10 mM Tris-HCl, pH 7.1, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol 및 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]을 넣고 30분 동안 4℃에서 용해한 후, 14,000×g에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 핵 분획을 얻기 위해, 세포에 10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT 및 0.5 mM PMSF를 포함하는 저삼투압 완충용액을 넣고 4℃에서 10 분간 반응시켰다. 10% Nonidet P-40을 넣고 10초간 볼텍싱(vortexing)한 후, 13,000rpm에서 3 분간 원심분리하여 취한 상등액을 제거하고 저삼투압완충용액으로 3회 세척한 후, 침전물에 고삼투압 완충용액 [20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT 및 1 mM PMSF]을 넣은 후 다시 4℃에서 10분간 볼텍싱(vortexing) 후 20분 동안 반응시켰다. 13,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 취해 핵 분획으로 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford assay 방법에 따라 PRO-MESURETM protein measurement solution (iNtRON Biotechnology, South Korea)의 단백질 정량 키트를 사용하여 정량 하였다.

G. Total RNA의 분리 및 RT- PCR 과 Real-time RT- qPCR 분석

트리졸(TRIZOL)을 사용하여 세포에서 추출한 총 RNA(1mg)와 Maxime RT PreMix Kit (intron biotechnology, Gyeonggi-do, korea)를 사용하여 cDNA를 얻었다. RT-PCR의 경우 제조사의 방법에 따라서 Maxime™ PCR PreMix Kit를 사용하여 타겟 유전자를 PCR 법에 의해 증폭한 후 2% agrose gel에 전기영동하여 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. 이때, 사용한 프라이머의 구체적인 서열정보는 하기 표 1에 나타내었다.

구분		서열(5'-3')
mouse GPR119	F	TGTCCTAACCATCCTCATCA (서열번호 1)
	R	ATAGCCACGCCAATCAAG (서열번호 2)
mouse S18 ribosomal protein (mouse S18r)	F	GTAACCCGTTGAACCCCATT (서열번호 3)
	R	CCATCCAATCGGTAGTAGCG (서열번호 4)
human GPR119	F	GGCTGTGGTTAGTGTCTTAC (서열번호 5)
	R	ACGAAGTGAGGGTGAAATAC (서열번호 6)
human S16 ribosomal protein (human S16r)	F	TCCAAGGGTCCGCTGCAGTC (서열번호 7)
	R	CGTTCACCTTGATGAGCCCATT (서열번호 8)

한편, Real-time RT-qPCR의 경우 합성된 cDNA를 SYBR green dye (Bio-rad)를 사용하여 CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) 기계에서 측정하였다. 유전자의 CP 값을 S18r 유전자의 CP 값으로 보정하였다. 또한 melting curve 분석을 통하여 증폭된 PCR 산물의 특이성을 확인하였다. 이때, 사용한 프라이머의 구체적인 서열정보는 하기 표 2에 나타내었다.

구분		서열(5'-3')
mouse S18 ribosomal protein (S18r)	F	GTAACCCGTTGAACCCCATT (서열번호 3)
	R	CCATCCAATCGGTAGTAGCG (서열번호 4)
mouse col1A1	F	ACTGCAACATGGAGACAGGTCAGA (서열번호 9)
	R	ATCGGTCATGCTCTCTCCAAACCA (서열번호 10)
mouse TGFβ1	F	CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC (서열번호 11)
	R	CACGATCATGTTGGACAACT GCTCC (서열번호 12)
human TGFβ1	F	CCCAGCATCTGCAAAGCTC (서열번호 13)
	R	GTCAATGTACAGCTGCCGCA (서열번호 14)
human col1A1	F	AACATGACCAAAAACCAAAAGTG (서열번호 15)
	R	CATTGTTTCCTGTGTCTTCTGG (서열번호 16)
rat TGFβ1	F	TCGGGAGAGAGGAGGACTTTG (서열번호 17)
	R	GGCTTGCGACCCACGTAGTA (서열번호 18)
rat GAPDH	F	AGATCCACAACGGATACATT (서열번호 19)
	R	TCCCTCAAGATTGTCAGCAA (서열번호 20)

H. 웨스턴 블롯 (Western blot)

본 연구실의 확립된 방법에 따라 겔 전기영동 장치(Mighty Small SE 250, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco)를 사용하여 SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)를 수행하였다. 세포의 용해분획을 시료 희석 완충용액[63 mM Tris(pH.6.8), 10% 글리세롤, 2% SDS, 0.0013 % 브로모페놀 블루, 5% β-머캅토에탄올]에 희석한 후 8~12 % 겔을 사용하여 전극 완충용액(1 ℓ 용액 중 Tris 15 g, 글리세린 72 g, SDS 5 g 함유) 내에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔을 전이용 전기영동 장치를 이용하여 전이완충용액(25 mM Tris, 192 mM 글리세린, 20% v/v 메탄올(pH.8.3)] 내에서 40 mAmps로 3시간 동안 나이트로셀룰로오즈 막에 단백질을 전이시켰다. 1차 항체로 상기 나이트로셀룰로오즈 막에 반응시킨 후 여기에 2차 항체로 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG (horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)와 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스(anti-mouse) IgG를 1시간 동안 반응시키고 ECL 검출 시스템(ECL chemiluminecence system, Amersham, Gaithesberg, MA)을 사용하여 발색하였다.

I. 형질도입

세포 배양 용기에서 약 50-70% 배양된 세포를 TOM (hyclone) 배지에서 FuGENE HD reagent (Roche, Nutley, NJ)를 사용하여 플라스미드를 세포 내 도입하였다. 형질도입은 플라스미드 1 mg당 3 ml의 FuGENE HD reagent와 1 ml의 TOM 배지에서 반응시켜서 세포에 넣어주고 약 6시간 반응시켜 형질 도입하였다. 형질 도입되는 플라스미드의 총량을 보정하기 위하여 대조군 세포에 과발현 플라스미드의 backbone만을 가지는 플라스미드(mock-transfection)를 형질도입하였다. 형질도입 후 배양배지에 18시간 정도 안정화시킨 후 약물을 처치하였다.

J. 리포터 유전자 분석

리포터 유전자 분석은 dual-luciferase reporter assay system (Promega, Madison, WI)을 사용하였다. 세포주를 배양하여 luciferase construct를 주입한 세포를 Fugene HD reagent와 함께 형질도입 시켰다. 실험 종료 후 세포를 용해시키고 루미노스캔 (Luminoscan)을 사용하여 활성도를 측정하였다.

K. 면역침강법

총분획 단백과 해당 항체를 4℃에서 12시간 이상 반응하였다. 항원-항체 결합체를 protein G-agarose와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 침천시켜 2XLaemmli 완충액과 반응시켰다. 추출된 단백질을 면역화학적 방법으로 관찰하였다.

L. ChIP (Chromatin Immunoprecipitation ) 분석

Chromatin 단편은 EZ-ChIP^TMkit Merck Millipore Corporation(Darmstadt,Germany)을 이용하여 추출하였다. 처치된 세포의 배양 용기에 직접 최종 1% 농도가 되게 포름알데히드(formaldehyde)를 상온에서 10분간 처치하여 세포를 고정시킨 후, 세포를 인산완충용액으로 세척하였다. 세포를 1% SDS와 10mM EDTA가 포함된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.1)에서 초음파 파쇄하여 용해시킨 후, 10,000g에서 10분간 원심분리하여 세포 추출액을 얻었다. 세포 추출액에 10배의 ChIP dilution buffer [Tris-HCl (16.7 mM, pH 8.1), 167mM NaCl, 1.2mM EDTA, 0.01% SDS 및 1.1% Triton X-100]를 사용하여 희석한 후, protein A-agarose를 가하여 비특이적 반응물을 제거하였다. 10%의 용액을 input control로 사용하기 위하여 따로 분주하여 보관하였다. 1 mg의 항체 또는 preimmune IgG를 넣어 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 protein A-agarose bead를 넣어 추가로 2시간 동안 면역침강(immunoprecipitation)시켰다. 침전시킨 항원-항체 결합체를 세척한 후, 5M NaCl을 최종 200mM이 되도록 가하여 65℃에서 4시간 동안 고정되었던 chromatin-항원-항체 복합체를 해리시켰다. DNA를 phenol-chloroform 추출법에 의해 추출하고, chromatin 단편을 Real time-qPCR법에 의해 증폭하였다. Human col1a1 프로모터 내의 p300의 결합부위를 위한 특이적 프라이머로서 하기 표 3에 기재한 프라이머를 사용하였다.

구분		서열(5'-3')
p300	F	CATTCCCAGCTCCCCTCTCT (서열번호 21)
	R	AGTCTACGTGGCAGGCAAGG (서열번호 22)

[ 실시예 ]

실시예 1. 간 성상세포에서 GPR119의 발현 확인

자유지방산 및 지질 유도체들의 다양한 수용체가 간 내 존재하는 세포들에서 발현하고 있다는 점에 착안하여, 간 섬유화 유도 시 활성화되는 간 성상세포에서 GPR119 발현을 관찰하였다.

보다 구체적으로, 상기 C의 방법을 통해 분리 배양한 마우스의 간 성상세포(HSCs)에 대하여 상기 G의 방법에 따른 Conventional PCR을 수행한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 마우스의 간 성상세포의 in vitro 배양에 의한 활성화 단계인 1, 3, 7일 날짜 별로 확인하였을 때 1일부터 GPR119의 mRNA 발현을 확인하였다. 또한, GPR119가 발현되어 있다고 보고된 인간 유방암 세포주 MCF7과 상기 D의 방법을 통해 배양한 인간 간 성상세포주인 LX-2에서도 PCR을 수행한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 모두 GPR119의 mRNA 발현을 확인하였다.

추가적으로, 상기 E의 방법에 의해 획득한 인간 간암 조직에서 유래한 간 섬유화 조직에서 면역조직화학염색을 통하여 GPR119 발현을 관찰한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, GPR119가 섬유화 조직 내 간 성상세포에서 발현됨을 확인하였다.

실시예 2. GPR119 리간드의 간 성상세포 활성화 억제 효과 확인

GPR119의 간 성상세포에서의 기능적 역할을 규명하고자 간 성상세포의 활성화에 대한 GPR119 리간드의 효과를 관찰하였다.

먼저, 상기 C의 방법을 통해 마우스 간에서 분리한 1차 배양 간 성상세포에 대하여 in vitro 배양에 의한 활성화 단계에서 유도되는 교원질 col1A1의 mRNA 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 간 성상 세포를 in vitro 배양하고 동시에 GPR119 리간드(MBX-2982)를 1일, 3일, 5일간 반복적으로 처리할 경우 교원질 col1A1 mRNA의 발현이 현저히 억제됨을 확인하였다.

다음으로, GPR119 리간드(MBX-2982)를 처리하였을 때 마우스 배아섬유세포(MEF)에서 기본적으로 발현되는 교원질 collagen I 및 활성화된 간 성상세포의 지표인 α-smooth muscle actin (α-SMA)의 단백질 발현 변화를 상기 H에 기재된 방법을 통해 확인한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)를 처리하였을 때 마우스 배아섬유세포(MEF)에서 collagen I 및 α-SMA의 발현이 억제됨을 확인하였다.

다음으로, 간 섬유화 유도에 영향을 미치는 주된 사이토카인(cytokine)인 TGFβ1은 간 성상세포의 강력한 섬유화 촉진 인자이다. 이에, 상기 D의 방법을 통해 배양한 인간 간세포주인 LX-2 세포에 TGFβ1을 처리하였을 때 증가하는 간 섬유화 유도 인자의 발현에 대하여, GPR119 리간드(MBX-2982, GSK1292263) 처리에 따른 발현 변화를 상기 G 및 H에 기재된 방법을 통해 확인함으로써 GPR119 리간드의 효과를 관찰하였다. 그 결과, 도 2c 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982, GSK1292263)를 처리하였을 때, TGFβ1 유도성 collagen I 및 TGFβ의 단백질과 mRNA 발현이 억제됨을 확인하였다.

다음으로, 인간 간세포주인 LX-2 세포에서 TGFβ1에 의하여 증가되는 섬유화 유도 신호 전달 경로인 Smad2/Smad3 발현에 대하여 GPR119 리간드(MBX-2982) 처리에 따른 발현 변화를 상기 H에 기재된 방법을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)를 처리하였을 때, TGFβ1에 의하여 증가되는 섬유화 유도 신호 전달 경로인 Smad2/Smad3의 인산화 및 핵 내 이동이 억제됨을 확인하였다.

실시예 3. GPR119 리간드의 간 섬유화 억제 효과 확인

GPR119 리간드가 간 섬유화를 개선하는지 여부를 확인하기 위하여 사염화탄소(carbon tetrachloride, CCl4)에 의하여 유도되는 간 섬유화 동물 모델에서 GPR119 리간드의 간 섬유화 억제 효과를 관찰하였다.

먼저, 사염화탄소 1 ml/kg를 주 2회 복강 내 투여하고 동시에 GPR119 리간드(MBX-2982)를 20 및 40 mg/kg 용량으로 1일 1회 매주 5일간 경구 투여하였다. 3주 후 간 조직을 적출하여 collagen의 생성을 확인할 수 있는 Sirius red 염색 및 간 성상세포의 활성화 지표인 α-SMA 발현을 면역조직화학염색을 통해 관찰하여 이를 대조군과 사염화탄소만을 투여한 군과 비교하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소 투여에 의해 증가된 collagen 생성 및 α-SMA의 발현 증가가 GPR119 리간드(MBX-2982)를 40 mg/kg 투여한 군에서 유의적으로 감소함을 확인하였다.

다음으로, 각 군의 실험동물에서 Collagen의 주요 생체 분해 산물인 hydroxyproline을 정량하였고, 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소 투여에 의하여 증가된 hydroxyproline의 양이 GPR119 리간드(MBX-2982)를 40 mg/kg 투여한 군에서 통계학적으로 유의성 있게 감소함을 확인하였다.

다음으로, 각 군의 실험동물의 혈액에서의 ALT, AST, T-BIL 및 D-BIL를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소 투여로 인해 증가된 혈중 ALT 수치가 GPR119 리간드 투여에 의하여 감소함을 확인하였다.

다음으로, 각 군의 실험동물의 간 조직에서 collagen I, TGFβ 및 α-SMA의 단백질 발현 변화를 상기 H에 기재된 방법을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소 투여에 의한 섬유화 군에서 collagen I, TGFβ 및 α-SMA의 단백질 발현이 증가되었으나, GPR119 리간드(MBX-2982) 40 mg/kg를 투여한 군에서 collagen I, TGFβ 및 α-SMA의 발현이 통계학적으로 유의성 있게 억제됨을 확인하였다.

실시예 4. GPR119 리간드의 AMPK 활성화 효과 확인

GPR119 리간드의 간 섬유화 억제 효과에 대한 신호체계를 규명하고자, GPR119 신호 전달 경로인 cAMP/PKA (cyclic AMP/Protein kinase A) 활성화를 관찰하였다.

먼저, PKA 저해제인 H-89를 처리하였을 때 GPR119 리간드의 작용 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)에 의한 cAMP 활성화는 관찰되었으나, PKA 저해제인 H-89를 처리하였을 때 collagen I 및 TGFβ 발현을 억제하는 GPR119 리간드의 작용을 상쇄하지는 못함을 확인하였다.

다음으로, AMPK 활성화는 간 성상세포의 분화 및 교원질 축적을 억제함이 보고된 바 있다. 이에, 상기 D의 방법을 통해 배양한 인간 간 성상세포주인 LX-2에서 GPR119 리간드를 처리하고, 시간에 따른 단백질 발현 변화를 상기 H에 기재된 방법을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)를 시간 의존적으로 처리할 경우 AMPK를 강력하게 활성화(AMPK 인산화 및 ACC 인산화)시킴을 확인하였다.

다음으로, AMPK 저해제인 compound C 처리 및 DN-AMPK를 형질 도입하고, TGFβ1 유도성 간 섬유화 유도 인자(collagen I, TGFβ)의 발현 변화를 상기 H에 기재된 방법을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)에 의한 발현 억제 효과가 회복됨을 확인하였다. 하지만, 도 4d에 나타낸 바와 같이, TGFβ1에 의하여 활성화되는 Smad3의 인산화에 대한 GPR119 리간드(MBX-2982)의 억제 작용은 AMPK 억제에 의하여 부분적으로 회복되는 경향은 관찰하였으나 완전히 상쇄되지는 않았다.

다음으로, 기존 보고에 의하면, 간성상세포에서 AMPK 활성화는 전사보조활성인자(transcriptional coactivator) p300의 프로테아좀 분해(proteasomal degradation) 증가를 통하여 Smad3와 p300의 상호작용을 저해하고 간 섬유화 유도 인자 발현을 억제시킨다. 이에, GPR119 리간드가 Smad2/ Smad3와 p300간의 상호 작용에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 이를 위해, 상기 D의 방법을 통해 배양한 인간 간 성상세포주인 LX-2에서, GPR119 리간드 처리에 따른 Smad3와 p300간의 상호작용 및 Smad3의 아세틸화(acetylation)를 확인한 결과, 도 4e에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)를 처리하였을 때, TGFβ1에 의하여 증가된 Smad3와 p300간의 상호작용 및 Smad3의 아세틸화(acetylation)가 현저히 억제됨을 확인하였다.

다음으로, 상기 L의 방법을 통해 ChIP 분석을 수행한 결과, 도 4f에 나타낸 바와 같이, TGFβ1 처리 시, col1A1 유전자의 프로모터와 p300의 결합이 GPR119 리간드 처리에 의해서 억제됨을 확인하였다.

다음으로 AMPK 활성화를 통한 Smad-p300간의 상호작용 억제에 대한 기전을 밝히고자 하였다. 이를 위해, LX-2 세포에 GPR119 리간드(MBX-2982)를 단독으로 처리할 경우, 도 4g에 나타낸 바와 같이, 활성화된 AMPK가 p300과 직접 결합함을 확인하였다. 상기 결과로부터, AMPK의 활성화가 p300과 Smad간의 상호작용에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

다음으로 GPR119 리간드의 p300의 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다. 이를 위해, LX-2 세포에 GPR119 리간드(MBX-2982)를 단독 처리하였을 때, 도 4h에 나타낸 바와 같이, p300의 단백질 발현이 GPR119 리간드(MBX-2982) 농도 의존적으로 감소하였으나 p300의 mRNA의 발현에는 영향이 없음을 확인하였다. 상기 결과로부터, GPR119 리간드에 의한 p300의 단백질 발현 감소가 프로테아좀 분해에 의하여 일어 날 수 있음을 가정하고, 프로테아좀 저해제인 MG132를 사용하여 p300의 단백질 발현을 관찰하였다. 그 결과, 도 4i에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982) 처리에 의하여 감소되는 p300의 단백질 발현이 MG132 처리 시 회복됨을 확인하였다.

실시예 5. GPR119 리간드의 간 성상세포 증식 억제 효과 확인

GPR119 리간드가 간 섬유화를 개선하는지 여부를 확인하기 위하여 간 섬유화 과정에서 관찰되는 간 성상세포 증식(proliferation)에 대한 GPR119 리간드의 효과를 평가 하였다.

우선, 간 성상세포의 강력한 증식인자로 알려진 platelet derived growth factor (PDGF)를 도입하여 간 성상세포의 증식을 유도하고 그에 대한 GPR119 리간드(MBX-2982)의 억제 효과를 관찰하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 간 성상세포주인 LX-2에서 GPR119 리간드(MBX-2982)를 처리할 경우 PDGF로 유도한 간 성상세포의 증식이 억제됨을 확인하였다.

다음으로, 기존 보고에 따르면 PDGF에 의한 세포 증식에 관여하는 핵심 인자로서 peptidyl prolyl isomerase (Pin1)이 알려져 있다. 이에, GPR119 리간드 작용에 대한 Pin1의 관련성을 평가하였다. 이를 위해, LX-2 세포에서 GPR119 리간드(MBX-2982) 처리에 따른 Pin1의 발현 변화를 확인한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, Pin1의 발현이 시간 의존적으로 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 GPR119의 간 성상세포의 증식 억제 효과가 Pin1 발현 조절을 매개하여 나타날 수 있는 가능성을 시사한다.

다음으로, Pin1은 생성된 TGFβ1에 의하여 활성화되는 Smad2/3 단백질 안정화에 관여하고 TGFβ1 유도에 의한 전립선 암의 전이 및 침윤에 관여함이 보고되어 있다. 이에, 간 성상세포주인 LX-2에 Pin1 adenovirus를 형질 도입하여 TGFβ1 유도성 collagen I 및 TGFβ 발현에 대한 GPR119 리간드의 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, GPR119 리간드(MBX-2982)에 의한 collagen I 및 TGFβ 발현 억제 효과가 Pin1을 과발현 시켰을 경우 반전됨을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation Seoul National University R&DB Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating of cirrhosis of liver comprising G protein coupled receptor 119 ligand as an active ingredient <130> MP16-506 <150> KR 10-2015-0162521 <151> 2015-11-19 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GPR119 forward primer <400> 1 tgtcctaacc atcctcatca 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GPR119 reverse primer <400> 2 atagccacgc caatcaag 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse S18r forward primer <400> 3 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse S18r reverse primer <400> 4 ccatccaatc ggtagtagcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GPR119 forward primer <400> 5 ggctgtggtt agtgtcttac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GPR119 reverse primer <400> 6 acgaagtgag ggtgaaatac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human S16r forward primer <400> 7 tccaagggtc cgctgcagtc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human S16r reverse primer <400> 8 cgttcacctt gatgagccca tt 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1A1 forward primer <400> 9 actgcaacat ggagacaggt caga 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1A1 reverse primer <400> 10 atcggtcatg ctctctccaa acca 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TGFbeta1 forward primer <400> 11 cttcagctcc acagagaaga actgc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TGFbeta1 reverse primer <400> 12 cacgatcatg ttggacaact gctcc 25 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TGFbeta1 forward primer <400> 13 cccagcatct gcaaagctc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TGFbeta1 reverse primer <400> 14 gtcaatgtac agctgccgca 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human col1A1 forward primer <400> 15 aacatgacca aaaaccaaaa gtg 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human col1A1 reverse primer <400> 16 cattgtttcc tgtgtcttct gg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat TGFbeta1 forward primer <400> 17 tcgggagaga ggaggacttt g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat TGFbeta1 reverse primer <400> 18 ggcttgcgac ccacgtagta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat GAPDH forward primer <400> 19 agatccacaa cggatacatt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat GAPDH reverse primer <400> 20 tccctcaaga ttgtcagcaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p300 forward primer <400> 21 cattcccagc tcccctctct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p300 reverse primer <400> 22 agtctacgtg gcaggcaagg 20

Claims (8)

1. GPR119 (G protein coupled receptor 119) 리간드인 4-((4-1H-테트라졸-1-일)페녹시)메틸)-2-(1-5-에틸피리미딘-2-일)피페리딘-4-일)티아졸 (MBX2982) 또는 3-이소프로필-5-(4-(((6-(4-(메틸설포닐)페닐)피리딘-3-일)옥시)메틸)피페리딘-1-일)-1,2,4-옥사디아졸 (GSK1292263)을 유효성분으로 포함하고, collagen I, transforming growth factor β(TGFβ), 및 α-smooth muscle actin(α-SMA) 발현을 유의적으로 억제하여 간 성상세포의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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