DE69734670T2 - Zubereitungen zur verwendung als therapeutische und nachweismittel - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, welche als therapeutische Agenzien und als Prüfagenzien brauchbar sind. Genauer ausgedrückt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Methode der gezielten Pharmakotherapie und insbesondere auf eine neuartige Methode der Zuführung von therapeutisch aktiven Agenzien an Tumorzellen, insbesondere Melanomzellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Ein bösartiges Melanom ist eine ernstzunehmende Krebserkrankung mit einer ansteigenden Zahl von Neuerkrankungen weltweit, welche Menschen aller Altersgruppen, besonders aber die relativ junge Bevölkerung, betrifft. Während auf dem Gebiet der Vorbeugung und der Früherkennung Fortschritte erzielt werden, bleibt das Hauptproblem die Schwierigkeit der Behandlung der Krankheit im streuenden Zustand. Wenn die Anzahl der Todesfälle durch ein bösartiges Melanom gesenkt werden soll, werden therapeutische Agenzien mit verbesserter Wirksamkeit dringend benötigt. Ein Melanom hat das Potential von sich rapide ausbreitenden Metastasen und bleibt ein schwer zu behandelndes Geschwür. Die konventionellen antineoplastischen Agenzien spielen weiterhin in der Behandlung des bösartigen Tumors eine wichtige Rolle, jedoch können verbesserte klinische Resultate erzielt werden, wenn bereits bekannte oder neu entdeckte Agenzien so modifiziert werden, dass sie selektiver wirken. Die Zuführung von zytotoxischen Agenzien auf die Tumorzellen ist dringend erwünscht, da eine systemische Verabreichung dieser Agenzien häufig die Zerstörung der normalen Zellen im Körper sowie der Tumorzellen, welche beseitigt werden sollen, zufolge hat.
  • Leider ist die Behandlung eines streuenden Melanoms zum aktuellen Zeitpunkt unzureichend – es bleibt unheilbar. Gezielte Chemotherapie scheint ein durchführbarer Ansatz für ein solches Geschwür zu sein, da die erwachsene menschliche Melanogenese nur von einer Art von Melanozyten abhängig ist. Frühere Ansätze unter Verwendung des melanogenetischen Weges, um Pro-Drugs zu aktivieren, haben von reaktiven Chinonen-Zwischenprodukten Gebrauch ge macht, deren toxischer Effekt auf einem Thiolabbau beruht. Anfängliche Versuche einer klinischen Behandlung eines Melanoms blieben aufgrund einer ungünstigen Pharmakokinetik, niedriger Wirksamkeit und systemischer Toxizität ohne Erfolg.
  • Die Entwicklung der erfindungsgemäßen Verbindungen beruht auf der Erkenntnis, dass das Tyrosinaseenzym auf verschiedene Arten mit bestimmten Targetzellen, insbesondere Melanomzellen, gekoppelt ist.
  • Daher ist Tyrosinase (Monophenol, 3,4-Dihydroxyphenylalanin: Sauerstoffoxidoreductase, EC 1.14.18.1) ausschließlich in Pigment-produzierenden Zellen (Melanozyten) zu finden und ist häufig in Melanomen unkontrolliert. Auf die Verwendung des katalytischen Potentiales von Tyrosinase zur Bildung einer höchst-toxischen Verbindung aus einem nicht-toxischen Substrat oder einer „Pro-Drug" wurde hingewiesen [vgl. Riley PA (1991) Eur J Cancer, 27: 1172–1177] und bis jetzt wurden eine Reihe von potentiellen Melanom Pro-Drugs untersucht, jedoch mit begrenztem Erfolg. Beispiele für solche Agenzien beinhalten Tyrosinanaloge, welche durch Tyrosinase oxidiert werden, um zytotoxische Chinone zu bilden [vgl. z.B. Naish S, Cooksey CJ & Riley PA (1988) Pig. Cell Res., 1: 379–381; Naish S, Holden JL, Cooksey CJ & Riley PA (1988) Pig. Cell Res, 1: 382–385], welche Mechanismen beinhalten, die zu einem Thiol-Abbau führen [vgl. z.B. Alena F, Iwashina T, Gili A & Jimbow K (1994) Cancer Res., 54(10): 2661–2666; Alena F, Dixon W, Thomas P & Jimbow K (1995) J. Invest. Dermatol., 104(5): 792–797; Riley PA, Cooksey CJ, Johnson CI, Land EJ, Latter AM & Ramsden CA (1996) Eur. J. Canc. (befindet sich im Druck)].
  • Anfängliche Untersuchungen ergaben, dass Verbindungen wie 4-Hydroxyanisol bei der gezielten Melanom Chemotherapie vielversprechend waren [vgl. Morgan BDG, O'Neill T, Dewey DL, Galpine AR & Riley PA (1981) Clin. Oncol., 7: 227–234], aber man stieß auf eine Reihe von ernsthaften Schwierigkeiten bei der Therapie, besonders die ziemlich begrenzte Zytotoxizität der daraus entstehenden zytotoxischen Chinonen, die die Verwendung hoher Dosen des Pro-Drug erforderlich machten und Komplikationen bei den systemischen Vorgängen [vgl. Rustin GJ, Stratford MR, Lamont A, Bleehen N, Philip PA, Howells N, Wafta RR & Slack JA (1992) Eur: J. Canc. I, 28A, 1362–1364; Belcher HJ, Nizam M & O'Neill TJ (1992) Br. J. Plast. Surg., 45: 208–210] aufgrund von Alternativmetabolismen insbesondere hepatische und renale Toxizität [vgl. Schiller CD, Gesher A & Jheeta P (1991) Eur. J. Canc., 27: 1017–1022: Stolze K & Nohl N (1991) Free Rad. Comm., II: 321–327. Refs. 17, 18)].
  • Daher müssen, damit aus der Tyrosinase-abhängigen Aktivierung für zytotoxische Pro-Drugs eine effektive und realistische chemotherapeutisch gezielte Strategie zur Behandlung des Melanoms wird, Agenzien entwickelt werden, welche durch einen Mechanismus aktiviert werden, der zur Erzielung seines zytotoxischen Effekts nicht auf dem Thiol-Abbau beruht.
  • Die Grundlage unseres neuen Ansatzes bei der letalen Synthese in melanogenesen Zellen, welche gemäß unserer Kenntnis bisher noch nicht untersucht worden ist, liegt in der Verwendung des reduktiven Zyklisierungsprozesses verbunden mit dem Tyrosinaseenzym, um die spezifische intrazelluläre Freisetzung von zytotoxischen Agenzien anzuregen. Durch diese Methode haben wir es geschafft, in einer Pro-Drug bekannte zytotoxische Verbindungen aufzunehmen, deren Verhalten bei Freisetzung bestens bekannt sind und welche sich als wirksame Inhibitoren beim Tumorwachstum erwiesen haben. Die Modifizierung der chemischen Struktur des aktiven Agens durch die Aufnahme in das Pro-Drug wurde entwickelt, um seine Zytotoxizität zu mäßigen während es sich in der Form des Pro-Pharmakons befindet, indem seine Reaktivität verringert wird und indem die systemische Bioverfügbarkeit durch Auswirkungen auf Halbwertzeit oder geänderte zelluläre Aufnahmecharakteristika reduziert wird. Der vorgeschlagene gezielte Abgabemechanismus zielt darauf ab, das Arzneimittel von diesen Einschränkungen gezielt zu befreien.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Kategorie von Verbindungen gegen Melanome zu entwickeln und zu überprüfen. Ein weiterer Gegen stand ist es, Verbindungen bereitzustellen, die als Prüf- oder diagnostische Agenzien verwendet werden können. Unser angewendeter Ansatz basiert auf dem Verständnis, dass die strukturellen Anforderungen für Verbindungen, um als Substrate für Tyrosinase fungieren zu können, bei der Synthese der Pro-Drugs berücksichtigt werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Verbindungen bereit, die durch Einwirken der Tyrosinase in die gewünschten Produkte umgewandelt werden und beinhaltet auch therapeutisch aktive Substanzen und solche, die zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Melanomen verwendet werden können.
  • Gemäß eines Aspekts der Erfindung wird daher ein Pro-Drug bereitgestellt, welches in der Lage ist, ein therapeutisch aktives Agens an einer gewünschten Stelle freizusetzen, dadurch gekennzeichnet, dass das Pro-Drug ein Substrat für Tyrosinase ist, wobei in Gegenwart von Tyrosinase die Verbindung zu Chinon oxidiert wird, welches zyklisiert und hydrolysiert wird und als therapeutisch aktives Agens freigesetzt wird.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem in der Lage, sich in eine Prüfsubstanz wie z.B. ein Indikatormolekül umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Substrat für Tyrosinase ist, worin in Gegenwart von Tyrosinase die Verbindung zu Chinon oxidiert wird, welches zyklisiert und hydrolysiert wird und als besagte Prüfsubstanz freigesetzt wird.
  • Genauer gesagt stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, insbesondere ein Pro-Drug, welches in der Lage ist, ein therapeutisch aktives Agens oder eine Prüfsubstanz (ThrAg) an einer gewünschten Stelle freizusetzen, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Substrat für das Tyrosinaseenzym ist und die Formel TyrX-B-ThrAg* hat,
    worin TyrX- ein Rest eines wahlweise substituierten Tyrosinanalogons der Struktur
    Figure 00050001
    ist,
    worin =Z- unabhängig ausgewählt wird aus =CH-, =C-,
    =N-, und -N+=O,
    B eine verbindende Gruppe darstellt, die TyrX und ThrAg* verbindet und ausgewählt wird aus:
    Figure 00050002
    worin ThrAg* einen Rest eines therapeutisch aktiven Agens ThrAg darstellt
    R1 und R2 unabhängig Wasserstoff und Halogen (z.B. F, Cl, Br oder I) oder -OH darstellen,
    und worin in Gegenwart von Tyrosinase, die Verbindung TyrX-B-ThrAg* zu einem Chinon oxidiert wird, welches einer Zyklisierung und einer Hydrolyse unterliegt, um ThrAg freizusetzen.
  • R1 und R2 werden vorzugsweise aus H und OH ausgewählt.
  • Ein neues Merkmal der Pro-Drugs gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Mechanismus, durch welchen das therapeutisch aktive Agens oder die Prüfsubstanz ThrAg freigesetzt wird, was, wenn die Verbindung der Erfindung eine Pro-Drug ist, die gezielte Abgabe eines therapeutisch aktiven Agens ermöglicht. Dies basiert auf dem Anfügen des ausgewählten Agens an das Stickstoffatom der Struktur TyrX-. Dieses Stickstoffatom ist an der Zyklisierung beteiligt, die der Oxidierung durch das Tyrosinaseenzym folgt und in der Bildung einer Gruppe endet, die eine Hydrolyse erlaubt. Bei der Tyrosinase-katalytischen Oxidierung der Pro-Drug zu dem Chinon produziert die Zyklisierung eine positiv aufgeladene Spezies, welche hydrolysiert wird und dabei den Wirkstoff freisetzt.
  • Der Mechanismus ist analog der anfänglichen Phase der Melanogenese, welche die Tyrosinase-katalytische Oxidierung von Tyrosin beinhaltet, wobei Tyrosin zu dem entsprechenden Orthochinon oxidiert wird, welches für nukleophile Angriffe empfänglich ist. Eine Hauptroute beinhaltet die endogene Zyklisierung durch reduktive Addition zum Ring, welche durch die Gegenwart der nukleophilen Aminofunktion in der Seitenkette hervorgerufen wird und die Bildung von Cyclodopa zur Folge hat.
  • Die Art und Weise, in welcher das therapeutisch aktive Agens chemisch mit dem Rest des wahlweise substituierten Tyrosinanalogons TyrX- verbunden ist, hängt von der Struktur des ThrAg und insbesondere von der Verfügbarkeit der darin enthaltenen chemischen reaktiven Gruppen ab.
  • Daher kann z.B., wenn das therapeutisch aktive Agens ThrAg eine Carboxylgruppe -COOH enthält, ThrAg mit dem wahlweise substituierten Tyrosin Rest TyrX- verbunden werden, indem eine Amidverbindung, TyrX-NH·CO-ThrAg* gebildet wird. Beispiele für therapeutisch aktive Agenzien, welche Carboxylgruppen enthalten, sind Betulinsäure und Retinolsäure.
  • Alternativ dazu kann, wenn das therapeutisch aktive Agens ThrAg eine Hydroxylgruppe -OH enthält, ThrAg durch die Bildung einer Urethanbindung, TyrX-NH·CO·O-ThrAg* mit dem wahlweise substituierten Tyrosin Rest TyrX- verbunden werden.
  • Beispiele von therapeutisch aktiven Agenzien, welche Hydroxylgruppen enthalten, beinhalten Oxaliplatin Derivate, Vinca Alkaloid S12363, Quercitin, Genistein, Calcipotriol und 4-Hydroxyanisol.
  • Als weiteres Beispiel, sofern das therapeutisch aktive Agens ThrAg eine primäre oder sekundäre Aminogruppe -NH2 oder -NH- enthält, kann ThrAg an einen wahlweise substituierten Tyrosin Rest TyrX- unter Bildung von sekundären oder tertiären Aminoverbindungen TyrX-NH-ThrAg* oder TyrX-N=ThrAg* gebunden werden. Beispiele für therapeutisch aktive Agenzien, welche primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, beinhalten Dacarbazin, Nifedipin, Staurosporin und N-Methylarginin.
  • Ganz allgemein kann sich die Abkürzung „ThrAg" auf jedes therapeutisch aktive Agens (z.B. ein zytotoxisches Agens) beziehen, welches chemisch in das Pro-Drug TyrX-B-ThrAg* umgewandelt werden kann. Weitere Klassen therapeutisch aktiver Agenzien und Prüfsubstanzen ThrAg sind:
    • – Chemosensible Agenzien, z.B. Chemikalien, welche Tumorzellen auf zytotoxische Agenzien sensibilisieren
    • – Resistenz oder Multidrug Resistenz (MDR) Modifizierer, d.h. Chemikalien, welche den Effekt einer Multidrug Resistenz in refraktären Tumorzelllinien umkehren können, was zu einer Re-Sensibilisierung der Tumorzellen auf MDR Arzneimittel führt
    • – immunstimulierende Agenzien, d.h. Chemikalien, welche das Immunsystem verbessern können und somit das Immunsystem gegenüber den Tumor triggern, entweder durch direkte oder indirekte Einführung von Zytokinen in eine Pro-Drug Struktur, die eine immunregulierende Aktivität oder andere direkt/indirekt hemmende Einflüsse auf Krebszellen haben
    • – Signaltransduktionsinhibitoren, d.h. Chemikalien, die selektiv entscheidende Schritte in den Signalwegen in der normalen Funktion der Krebszelle hemmen können, was zu Apoptose führt
    • – Differenzierende Agenzien, welche das aktive Metabolit von Vitamin D3 und seinen neuen Analogonen, Retinolsäure und sein Analogonen beinhalten kann
    • – Reparaturhemmende Arzneimittel, welche die Behebung von Schäden, verursacht durch chemotherapeutische Arzneimittel oder Bestrahlung, hemmen
    • – Pro-Drugs, welche, wenn sie aktiviert werden, zu einer Reduktion des zellulären Thiol/Sulfhydryl Levels, führen
    • – Pro-Drugs, welche, wenn sie aktiviert werden, direkt oder indirekt auf Onkogene oder Tumor unterdrückende Gene oder deren Genprodukte einwirken, um das Tumorwachstum zu beeinflussen
    • – Prüfsubstanzen oder Indikator Moleküle, inklusive farbige oder fluoreszierende Substanzen, wie z.B. Fluorescein, radiomarkierte Agenzien, Substanzen, die in verschiedenfarbigen Formen existieren, wenn sie frei oder chemisch gebunden sind (z.B. Farbstoffe in farbiger Form und Leukoform), Antigenmarker etc.
  • Erfindungsgemäße Pro-Drugs werden entweder alleine oder in verschiedenen Kombinationen oder Sequenzen zur Feststellung der effektiveren Arzneimittelzusammensetzung eingesetzt.
  • Die Erfindung ermöglicht die selektive Zuführung des therapeutisch aktiven Agens vorzugsweise an die Zellen, welche Tyrosinase enthalten. Die Erfindung hat den Vorteil, dass sie nicht auf Antikörper angewiesen ist, um ein Enzym gezielt an die Tumorstelle zu führen, wie es in der Targetstrategie, welche als ADEPT (Anfibody directed enzyme prodrug therapy) bezeichnet wird, der Fall ist.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bietet eine selektive Methode zur Behandlung von einem bösartigen Melanom, einem aggressiven Tumor, welcher das Tyrosinaseenzym enthält. Die Erfindung kann auch bei der Behandlung von anderen bösartigen Tumoren verwendet werden, bei denen Tyrosinase in den Tumorzellen vorhanden ist, insbesondere bei Brustkarzinomen. Die rapide Ausbreitung des Gebietes der Molekularbiologie und speziell die Verwendung von Retroviren zur Umwandlung von Zellen in tyrosinaseproduzierende Arten würden breitgefächerte Möglichkeiten von zukünftigen Anwendungen für unser neuartiges Drug-Delivery System ermöglichen.
  • Die Erfindung kann bei solchen Therapien angewendet werden, wo selektive Expression von Tyrosinase erfolgreich induziert werden kann. Darüber hinaus kann der Gebrauch von Tyrosinaseenzyminhibitoren, als kleine Moleküle oder auf Polymerträgern zusammen mit dem erfindungsgemäßen Zuführsystem zur Inaktivierung von zirkulierender Tyrosinase, wie es bei Melanompatienten vor Verabreichung von Pro-Drugs vorgefunden wurde, verwendet werden. Solche Maßnahmen werden ergriffen, um den Grad an Selektivität für Melanomzellen in massiven Tumoren zu erhöhen.
  • Es ist von Wert, dass die erfindungsgemäß bereitgestellten Pro-Drugs im Wesentlichen aus chemisch veränderten Arzneimitteln bestehen, worin die biologische Aktivität des Arzneimittels wesentlich eliminiert wurde. Nach der Verabreichung wird das unveränderte Arzneimittel durch das Tyrosinaseenzym freigesetzt. Der Freisetzungsmechanismus des Arzneimittels hängt von dem Tyrosinaseenzym ab und im Allgemeinen wird das unveränderte Arzneimittel durch eine post Enzymoxidation, Zyklisierung und Hydrolyse freigesetzt.
  • Der Einfluss auf Tumorzellen hängt von der Tatsache ab, dass bestimmte Krebszellen das Tyrosinaseenzym enthalten, entweder naturgemäß, wie bei bösartigen Melanomen, oder aus einer spontanen Genmutation resultierend, wie aus der Entdifferenzierung von Krebszellen oder aus der Transfektion von Krebszellen, wie bei der Verwendung von Retroviren zur Expression von Tyrosinase in nicht Pigmente produzierenden Krebszellen, bekannt ist.
  • Die neuartige Methode der Krebstherapie gemäß der Erfindung basiert daher auf einem Tyrosinase-aktivierten Drug-Delivery-Mechanismus, welcher sich auf die spontane reduktive Zyklisierung von Dopachinon (und Analoga) stützt, um eine mögliche hydrolysierbare Verbindung zwischen einer stickstoffhaltigen Gruppe in dem Pro-Drug der Formel TyrX-B-ThrAg* zu schwächen. Dies ermöglicht die spezifische Freisetzung des Arzneimittels in bösartigen Zellen, wie die hierin dargelegten Angaben beweisen.
  • Wie vorher angegeben, kann eine große Anzahl von therapeutisch aktiven Substanzen chemisch verändert werden, um erfindungsgemäße Pro-Drugs zu bilden. Vorzugsweise beinhalten diese anti-neoplastische Agenzien, welche bereits in der Behandlung von Melanomen eingesetzt werden. „Combination chemotherapy for disseminated malignant melanoma", KL Abbott & GS Harman. Anti-cancer drugs 6: 489–497). Jedoch kann die Synthese von neuartigen Pro-Drugs zu einer Verwendung von verfügbaren anti-neoplastischen Agenzien führen, welche als wirkungslos gegen diese Krankheit angesehen werden.
  • Beispiele beinhalten:
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Vinca Alkaloid, S12363. Ein Beispiel für Agens welches für die klinische Verwendung zu aktiv ist. Die Modifizierung/Einführung dieses Typs von Molekül kann ein wirksames aktives Agens hervorbringen, welches an dem Tumorort freigesetzt wird.
  • Figure 00120002
    Analog von Dacarbazin 5-(3,3-dimethyl-1-triazinyl)-1-H-imidazol-4-Carboxamid (DTIC)
  • Darüber hinaus kann sich das therapeutisch aktive Agens auch beziehen auf:
    Ein chemosensibilisiertes Agens, eine Chemikalie, die Tumorzellen für zytotoxische Agenzien sensibilisiert, wie z.B. Resistenz oder Multidrug Resistenz (MDR) Modifizierer wie z.B. Nifedipin und S9788-2. Wobei letzteres ein Triazin-Derivativ ist, welches chemische Merkmale enthält die bekannterweise wichtig sind für die MDR Umkehraktivität, planare aromatische Domäne und zwei Aminogruppen, wobei eine davon eine kationische Ladung bei physiologischem pH hat. Diese Agenzien können den Effekt der Multidrug Resistenz Expession in refraktären Tumorzelllinien umkehren, was zu einer Resensibilisierung der Tumorzellen auf MDR Arzneimittel führt:
  • MDR MODULATOREN
    Figure 00130001
  • Ein Apoptose-veranlassendes Agens, wie z.B. Staurosporin, welches die Kalzium-abhängige Phosphorylierung hemmt, was zu einer Apoptose bei den meisten Zellarten führt.
  • Figure 00140001
  • Ein Signaltransduktionsinhibitor wie z.B. Quercetin oder Genistein, eine Chemikalie, welche den Signalweg hemmt, wie z.B. die Phosphorylierung von Tyrosin und Threonin, welche essentiell für die normale Zellfunktion ist.
  • TYROSIN-KINASE INHIBITOREN
    Figure 00140002
  • Ein immunstimulierendes Agens, eine Verbindung, welche das Immunsystem stützt und daher das Immunsystem gegen den Tumor triggert, entweder direkt oder indirekt. Dies kann beispielsweise durch die Reduzierung der Stickoxidwerte durch Inhibition des Enzyms Stickoxidsynthetase mit N-Methylarginin erzielt werden, was den immununsuppressiven Effekt hoher Stickstoffwerte beseitigt.
  • Figure 00150001
    NG-monomethyl-L-arginine
  • Die Aufnahme von Zytokinen (TNF-α, IFN-α, IFN-γ oder Fragmente von immunogenen Chemikalien) in eine Pro-Drug Struktur, welche eine immunregulierende Aktivität oder andere direkt/indirekt hemmende Wirkungen auf Krebszellen haben kann.
  • Ein differenzierendes Agens, welches den aktiven Metaboliten von Vitamin D3 und neuen Analoga wie z.B. Calcipotriol, Retinolsäure und ihre Analoga beinhalten kann.
  • Figure 00150002
  • Ein DNA Reparaturenzym Inhibitorarzneimittel wie O6-Benzyl-Guanin, das das Enzym, welches verantwortlich ist für die Reparatur von durch chemotherapeutische Arzneimittel oder Bestrahlung verursachten nuklearen DNA Schädigungen, inhibieren kann.
  • Eine Chemikalie wie p-Hydroxyanisol, welche, wenn zum Chinon aktiviert, zu einer Reduktion des zellulären Thiol/Sulfhydryl Werts führt und die Zellen anfälliger für durch chemische Agenzien verursachte Schädigungen macht. Die Verwendung von Buthionin Sulfoximin Analogona (BSO), eine Glutamylcysteinsynthetase, zur Reduktion des Levels der zellulären Glutathinonsynthese (Kable et al. [1989] Cancer Res, 49: 2327–2331)
  • Figure 00160001
    4-Hydroxyanisol
  • Ein Antisense-Molekül, welches, wenn aktiviert, direkt oder indirekt auf Onkogene oder Tumorsupressorgene oder ihre Genprodukte zur Beeinflussung des Tumorwachstums, einwirkt.
  • Die Pro-Drugs der Erfindung werden synthetisiert indem ein anfängliches Gebilde aus aktivierten gemischten Anhydriden der ausgewählten Agenzien durch nukleophilen Angriff durch Tyrosin in das mögliche Pro-Drug umgewandelt wird. Die allgemeine systemische Zytotoxizität der Pro-Drugs wird durch die Aufnahme der reaktiven funktionalen Gruppen in die kovalente Bindung an das Tyrosin verringert.
  • Die Verbindungen der Erfindung können zu einer prüfbaren Substanz in diagnostischen Prüfverfahren umgewandelt werden. Diese beinhalten Prüfverfahren, um das Vorhandensein von Tyrosinaseenzymen in Gewebeproben und Körperflüssigkeiten zu prüfen. Bei solchen Prüfungen kann die zu überprüfende Probe mit der Verbindung der Erfindung vereint werden und im Anschluss an eine angemessene Inkubationszeit kann die Freisetzung der prüfbaren Substanz nachgewiesen werden. Solche Prozeduren sind vor allem bei der Diagnose von Krankheitsstadien notwenig, bei der sich der Tyrosinaseenzymwert ver ändert, wie z.B. bei Melanomen, die mit erhöhten Tyurosinasewerten einhergehen.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Es folgt eine genauere Beschreibung der Erfindung mit Bezug auf die Figuren im Anhang sowie auf die nachfolgenden Beispiele und Beschreibungen von Versuchsstudien sowie chemischen und biologischen Tests. Die Synthesebeispiele veranschaulichen die Zubereitung von Pro-Drugs gemäß der Erfindung.
  • In den Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Reaktionsschema (Schema 1) zur Herstellung von Pro-Drug A
  • 2 zeigt ein Reaktionsschema (Schema 2) zur Herstellung von Pro-Drug A
  • 3 zeigt ein Reaktionsschema zur Herstellung von Pro-Drug B
  • 4 zeigt ein Reaktionsschema zur Herstellung von Pro-Drug C
  • 5 zeigt die Ergebnisse von Oxymetrie Messungen der dargestellten Verbindungen
  • 6 zeigt die Ergebnisse von MTBH Nachweisverfarhen an fünf Zelllinien
  • 7 zeigt die Ergebnisse von Zytotoxizitätstests
  • 8 & 9 zeigen die Ergebnisse von Experimenten, welche die Freisetzung eines Arzneimittels aus dem Pro-Drug beschreiben
  • BEISPIELE
  • A. Versuchsstudie
  • Um die Ausführbarkeit des Tyrosinase-aktivierten Arzneimittelfreisetzungsmechanismus zu testen, wurde ein Pro-Drug Analogon durch kovalente Addition von 4-Nitrophenylisothiozyanat und Dopamin synthetisiert. Dieses gelbe Pro-Drug Analogon wurde untersucht, um festzustellen, ob durch Oxidation und Zyklisierung gemäß unseres vorgeschlagenen Mechanismus das orangefarbene Hydrolyseprodukt 4-Nitroanilin entsteht.
  • Das Pro-Drug Analogon war in Lösung bei pH Wert 6,5 bis zu 12 Stunden lang stabil, aber nach Zugabe von Tyrosinase entstand ein orangefarbenes Produkt. Eine Extraktion mit Ethylacetat ergab eine zu der Pro-Drug unterschiedliche Verbindung mit einer starken Absorption bei 365 nm und mit Eigenschaften vergleichbar mit 4-Nitroanilin.
  • B. Synthesebeispiele 1. Synthese von N-(N-Bis-chlorethyl-4-amino-phenyloxycarbonyl)-3-hydroxy-tyramin (Pro-Drug A- Schema 1)
    Figure 00180001
    Pro-Drug A
  • 1,0 g, 5,27 mmol von 3-Hydroxytyramin Hydrochlorid wurden mit 20 ml trockenem Dichloromethan vermischt. Zu der gerührten Lösung wurde 1 ml Triethylamin hinzugefügt, danach folgte 1 ml Pyridin. Die Lösung wurde 5 Min. lang gerührt und dann mit 2,32 g, 5,27 mmol N-Bis-chloroethyl-aminophenyloxy-p-nitro-phenyloxycarbonat vermischt. Die Lösung wurde 4 Tage lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die tiefgelbe Lösung wurde mittels Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst und mit 0,1 M Salzsäure, 0,5 M Natriumhydrogencarbonat Lösung und destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mittels Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde auf Silikagel mit einer Gradienteneluierung aus Ethylacetat und Ethanol chromatografiert, was 490 mg gelben Feststoff ergab. Rf = 0,7 (1 : 1 Ethylacetat : Ethanol), SmP = 80°C (dec.),
    1HNMR (D6DMSO): –
  • 2. Modifizierte Synthese von p-N,N-Bis-chloroethyl-amino-phenoxy-carbonyl-p-nitrophenoxid (Pro-Drug A – Schema 2)
  • Zu einer refluxierenden Lösung von p-Nitrophenolchloroformiat (4 g, 0,002 mol) in Benzol (50 ml), wurde eine Lösung von N,N-Bis-chloroethyl-aminophenoxid triethylammoniumsalz (5.4 g, 0,02 mol) in Benzol (60 ml) tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Min. hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde in inerter Atmosphäre 2 Stunden lang refluxiert. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde mittels Vakuum konzentriert und unter Verwendung von Dichloromethan auf Silika chromatografiert. Das Produkt wurde von den ersten Fraktionen (1–6) getrennt und dann mit Hexan verfestigt. Das gewünschte Produkt wurde aus Benzol/Hexan auskristallisiert und resultierte in 7 g p-N,N-Bis-chloroethyl-aminophenoxy-carbonyl-p-nitrophenolat (80% Ausbeute, Rf = 0,63 (CH2Cl2).
  • C. Die Silberoxid Oxidation
  • Da das erste Experiment den postulierten Reaktionsmechanismus belegte, wurde ein Pro-Drug synthesiert (Verbindung A oben), welches ein Alkylierungsmittel enthält. Chemische Untersuchungen zeigten, dass nach einer Silberoxid oxidation zwei Verbindungen bei pH Wert von 6,0 freigesetzt werden, eine polare mit Eigenschaften des Indols, welches während der Zyklisierung und Hydrolysereaktion entsteht und eine weniger polare mit einem Rf unter Dünnschichtchromatographie ähnlich des Senfgases (Verbindung C).
  • Figure 00200001
    Verbindung C
  • D. Biologische Methoden
  • 1. Oximetrie
  • Um die Selektivität des Tyrosinase-aktivierten Zuführungssystemes zu untersuchen, wurde die Befähigung der Pilztyrosinase, die Oxidation verschiedener Substraten zu katalysieren, durch Oximetrie weiter untersucht. Die getesteten Substrate waren Tyrosin (das normale Enzymsubstrat), Verbindung A, 4-Hydroxyanisol und N-Acetyltyrosin.
  • Die verwendete Oximetrie-Methode wurde bereits früher beschrieben (Naish-Byfield & Riley 1992, Biochem J. 288: 763–67; Naish-Byfield et al 1994, Biochem J. 304: 155–162). Die Pilztyrosinase wurde von Sigma, UK, erhalten. Die spezifische Aktivität des Enzyms war 2200 Einheiten/mg Protein. Die Standardreaktionsmischung wurde zusammengesetzt aus 2 ml 100 μM Substraten (200 nmol/Reaktion) und 165 Einheiten Tyrosinase/ml in einem Volumen von 200 μl. Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur in einer Sauerstoffelektrodenkammer durchgeführt. Die Verwendung von Sauerstoff mit Bezug auf die Zeit wurde durch die Verwendung einer Standardsauerstoffprobe überwacht.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die Verbindung A von Tyrosinase oxidiert wird, obwohl die Reaktionszeit kürzer war als bei normalen Substraten. 4-Hydroxyanisol und N-Acetyltyrosin wurden ebenfalls oxidiert, jedoch mit einer kürzeren Reaktionszeit als Tyrosin.
  • 2. Tyrosinaseaktivität der Zelllinien
  • Die Tyrosinaseaktivität von fünf Zelllinien wurde während der logarithmischen Wachstumsphase gemessen. Die Tyrosinaktivität wurde mittels der MBTH Probe gemessen, welche bereits früher beschrieben wurde (Pifferi & Baldassari 1973, 52: 325–335). In aller Kürze gesagt, wird die Tyrosinaseaktivität durch die Verwendung von Besthorn's Hydrazon abgeschätzt, welche die Bildung der Chinonform angibt.
  • Die vergleichende Tyrosinaseaktivität der fünf Zelllinien, wie von der MBTH Probe abgeschätzt, wird in 6 gezeigt. Es wird gezeigt, dass die drei Melanom Zelllinien, C32, G361 und StMI11a einen hohen Tyrosinaseaktivitätswert aufweisen. Die Zelllinie Caki-1 (eine renale Karzinom-Zelllinie) zeigte einen geringen, aber nichtsdestotrotz messbaren, Wert an Tyrosinaseaktivität. Die CHO Zelllinie zeigte keine nachweisbare Tyrosinaseaktivität.
  • 3. Messung der Wachstumshemmung (Zytotoxizität)
  • Die Aktivitäten der Pro-Drug A, Verbindung B und des Referenzarzneimittels C wurden nach ihrer Fähigkeit verglichen, eine Wachstumshemmung von Human-Melanomen (C32, G361 und STMI11a) und nicht melanomen abgeleiteten Zelllinien (Caki-2 und CHO), in vitro zu produzieren.
  • Figure 00220001
  • Die Wachstumshemmung wurde mittels Sulphorhodamin B (SRB) Probe gemessen, wie bereits beschrieben (Skehan et al 1990; J. Natl Cancer Inst 82: 1107–1112; Houghton et al. 1994; Planta Medica. 60: 430–433). Die Zelllinien C32 und Caki-2 wurden erhalten von der ETCC (PHLS, Porton Down, UK). StM111a wurde freundlicherweise von Dr. Zouboulis, Abteilung der Dermatologie, Freie Universität Berlin, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Die CHO Zellen wurden überlassen von Dr. Smith, Richard Dimbleby, Dept of Cancer Research, St Thomas Hospital, London. Die Zellen wurden aufbewahrt in RPMI-1640, welches 10% Hitze-inaktiviertes FCS, 2 mM L-Glutamin, 50 IU/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B, (Hyclone, UK) enthält. Die Kulturen wurden bei 37°C in 5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Bei der SRB Probe wird die Anzahl der Zellen indirekt durch Messung der gesamten basischen Aminosäuren abgeschätzt.
  • Bestimmte Kriterien waren vor Verwendung dieser Technik festzusetzen. Erstens wurde festgelegt, dass die optische Dichte direkt proportional zur Anzahl der Zellen ist bis zu der Dichte, die am Ende der Untersuchung erreicht wird. Zweitens wurde eine optimale Anfangsdichte gefunden, wodurch es den Zellen ermöglicht wurde, während und nach des gesamten Behandlungszeitraumes in einer log-Phase zu bleiben. Die Kulturen wurden einen Tag nachdem sie ausplattiert worden waren den Testsubstanzen eine Stunde lang ausgesetzt. Die Untersuchungen wurden 6 Tage nach der Behandlung beendet, ein Zeitraum, der 4–5 Verdopplungszeiten entspricht.
  • Die Aktivität der Testsubstanzen A, B & C wurden durch die Bestimmung des IC50 Wertes verglichen (nötige Konzentration, um 50% des Wachstums zu hemmen).
  • Die relative Toxizität der Verbindungen A, B und C in jeder Zelllinie (ausgedrückt als Umkehrfunktion von IC50, bestimmt durch die Sulphorhodaminprobe nach vierstündiger Einwirkung auf das Agens) wird veranschaulicht durch das Säulendiagramm in 7. Die Daten zeigen, dass Verbindung B im Wesentlichen nicht toxisch ist, verglichen mit der Referenzverbindung C, welche einen IC50 zwischen 1–2 μM in allen Zelllinien aufweist.
  • Als Kontrast dazu ist Verbindung A (eine Pro-Drug gemäß unserer Erfindung) in nicht-melanogenen Zellen im Wesentlichen nicht toxisch, jedoch weist sie eine zunehmende Toxizität mit der Tyrosinaseaktivität in den Melanom Zelllinien auf.
  • Diese Daten stehen völlig im Einklang mit dem postulierten Mechanismus der Pro-Drugs der Erfindung und die zytotoxischen Befunde sind ermutigend, da sie eine selektive Toxizität gegenüber melanogenen Zellen zeigen.
  • E. FREISETZUNG DES ARZNEIMITTELS AUS DEM PRO-DRUG (1) DURCH BEHANDLUNG MIT TYROSINASE
    Figure 00230001
  • Das Pro-Drug (1) (2 mg; 5.1 × 106 mol) wurde in DMSO (0,2 cm3) aufgelöst und mit einer Tyrosinaselösung (2 mg, von Sigma) in Phosphat-Puffer (0,2 cm3, pH 7,2, von Aldrich) versetzt. Die entstandene Lösung wurde bei 25°C eine Stunde lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mittels Dünnschichtchromatographie analysiert, was zeigte, dass während des Prozesses ein Bestandteil entstand, der einen Rf identisch zu authentischem Senfgas aufweist. Die Lösung wurde durch GCMS (Fisons GC 8000 und Trio 1000 Mass Spectrometer unter EI Bedingungen) durch Verwendung einer anfänglichen Ofentemperatur von 150°C für 5 Minuten weiter analysiert. Die Temperatur wurde dann über 5 Minuten von 150°C auf 250°C angehoben, und dann bei 250°C gehalten. Unter diesen Bedingungen hatten sowohl die authentische Senfgasverbindung als auch die Verbindung, welche während des Enzym Pro-Drug Experimentes freigesetzt wurde, eine Retentionszeit von 10,2 Minuten. Darüber hinaus war das erhaltene Massenspektrum sowohl von der authentischen als auch der freigesetzten Senfgasverbindung identisch und wiesen das erwartete Isotopmuster/Schema für Verbindungen, die Chlor enthalten, auf.
    m/z (EI) 235 (M+), 233 (M+), 186 (M-CH2Cl), 184 (M-CH2Cl), 148 (M-CH2-2Cl) und 120.
  • F. ZUSAMMENFASSUNG
  • Zusammenfassend, die ersten Ergebnisse der Versuchsstudie unterstützen die Durchführbarkeit des neuartigen Medikamentenzuliefermechanismus der Erfindung und diese ersten Ergebnisse wurden durch die biologische Testreihe wie hierin beschrieben bestätigt.
  • Es ist vorgesehen, dass eine Anzahl von Agenzien mit verschiedenen Wirkungsmodi in die zielgerichteten Pro-Drugs, basierend auf diesem Freisetzungsmechanismus der Erfindung, aufgenommen werden können, inklusive bewährter zytotoxischer Agenzien mit Anti-Melanom-Wirkung so wie Senfgase, Nitrosoharnstoffe, Vinca-Alkaloide und Taxane, neue pflanzliche Produkte (Betulinsäure, welche Melanomen gegenüber eine gewisse Selektivität hat) sowie Agenzien, welche das Verhalten oder die Sensibilität gegenüber Tumorzellen verändern. [vgl. z.B. Abbott KL & Harman GS (1995) Anfi-Cancer Drugs, 6: 489–497). Diese können P170-Multidrug Resistance Modifizierer, DNA Reparaturinhibitoren und Modifikatoren des intrazellulären Glutathionwertes beinhalten. Wir haben festgestellt, dass ein Melanom auf MDR-Stoffe bei Nicht-vorhandensein jeglicher Verfärbung des MDR Phänotypus sensibilisiert werden kann, was normalerweise nicht durch die Immunhistochemie und den Western-Blot nachgewiesen werden kann. Unsere ersten Untersuchungen konzentrierten sich auf Agenzien mit bekannten Aktionsmodi und relativ einfachen Strukturen wie Senfgas und Nitrosoharnstoffe, welche wenige synthetische Hindernisse haben sollten. Der Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, analoge synthetische Schemen zu entwickeln.

Claims (8)

  1. Verwendung einer Verbindung welche geeignet ist, ein therapeutisch aktives Agens (ThrAg) an einer gewünschten Stelle abzugeben, wobei besagte Verbindung ein Substrat für ein Tyrosinaseenzym ist und die Formel hat: TyrX-B-ThrAg* worin TyrX- ein Rest eines optional substituierten Tyrosinanalogons ist mit der Struktur:
    Figure 00260001
    worin =Z- unabhängig ausgewählt wird aus =CH-, =C-, =N- und =N+(O–)-, und R1 und R2 ausgewählt werden aus H, Halogen (das heißt F, Cl, Br oder I) und -OH, worin B eine Verbindungsgruppe darstellt, die TyrX- und ThrAg* verbindet und ausgewählt wird aus:
    Figure 00260002
    und worin ThrAg* einen Rest eines therapeutisch aktiven Agens ThrAg darstellt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Melanom.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R1 und R2 ausgewählt werden aus H und OH.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin R1 und R2 Wasserstoff sind.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin B -CO-NH- darstellt.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das therapeutisch aktive Agens die Formel NH2ThrAg* hat.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das therapeutisch aktive Agens die Formel HO-ThrAg* hat.
  7. Die Verwendung einer Verbindung, welche geeignet ist, ein therapeutisch aktives Agens (ThrAg) an einer gewünschten Stelle abzugeben, wobei besagte Verbindung ein Substrat für ein Tyrosinaseenzym ist, worin die Verbindung eine der folgenden Formeln hat
    Figure 00280001
    worin ThrAg* einen Rest eines therapeutisch aktiven Agens ThrAg darstellt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Melanom.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin ThrAg ein cytotoxisches Arzneimittel ist
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