DE602004002584T2

DE602004002584T2 - Verwendung von 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-derivaten zur behandlung von krebserkrankungen

Info

Publication number: DE602004002584T2
Application number: DE602004002584T
Authority: DE
Inventors: Anna Maria Via Orazio Raimondo 18 CACCURI; Giorgio Via Orazio Raimondo 18 RICCI
Original assignee: Universita degli Studi di Roma Tor Vergata; Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Current assignee: Universita degli Studi di Roma Tor Vergata; Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2024-04-20
Also published as: WO2004093874A1; SI1615638T1; ES2274449T3; ATE340573T1; PT1615638E; DE602004002584D1; ITRM20030194A1; US8796317B2; EP1615638A1; US20060247284A1; PL1615638T3; EP1615638B1; DK1615638T3; ITRM20030194A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten für die Antikrebstherapie. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Derivaten der heterocyclischen Verbindung, die als 7-Nitrobenzofuran oder 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol bekannt ist, als Mittel mit einer starken inhibitorischen Aktivität gegenüber der umfangreichen Familie der Glutathion-S-Transferasen (GSTs), die in Krebszellen sehr stark exprimiert werden und solche Zellen gegenüber vielen Stressfaktoren besonders resistent machen. Somit sind diese Verbindungen bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Antikrebstherapie geeignet und können entweder allein oder in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln verwendet werden.
Bekanntlich bestehen die meisten bei der onkologischen Behandlung im 20. Jahrhundert eingesetzten Antikrebsarzneimittel aus Molekülen, die nicht-selektiv für Krebszellen und somit für den Körper äußerst toxisch sind. Die typischen Antikrebsarzneimittel umfassen als weit verbreitete Mitglieder die Alkylierungsmittel, die DNA und RNA nicht-selektiv modifizieren können, und die Metaboliten, die durch Mimiking der Basen von DNA und von anderen natürlichen Molekülen in die Synthese von Nukleinsäuren, Proteinsäuren und in andere vitale metabolische Prozesse eingreifen, und als Antagonisten und Inhibitoren wirken.
Die Krebsforschung hat bereits versucht, Arzneimittel, die das Wachstum von Krebszellen möglichst selektiv hemmen könnten, ohne die normalen Zellen zu beeinträchtigen, zu finden. Aus diesem Grund hat sich die Krebsforschung beispielsweise auf die Moleküle konzentriert, die Schlüsselenzyme für das Überleben von transformierten Zellen hemmen.
Diese Moleküle umfassen die Inhibitoren von Telomerase, ein Enzym, dessen Aktivität es den Krebszellen erlaubt, sich für eine längere Zeitspanne fortlaufend zu teilen, im Vergleich zu der Überlebensdauer von normalen Zellen, und sie somit „unsterblich" macht. Weitere wichtige Zielenzyme sind die Thyrosinkinase, die beim Einsetzen von Krebs und von anderen proliferativen Krankheiten, wie Psoriasis und Atherosklerose, beteiligt ist. Ein weiterer bedeutender Forschungszweig konzentriert sich auf die Entwicklung spezifischer Inhibitoren der Farnesyltransferase, ein essentielles Enzym zum Triggern von Protein p21, das an der Zellproliferation und an der neoplastischen Transformation beteiligt ist.
Ein weiteres Schlüsselenzym bei der Signaltransduktion ist die Proteinkinase C (PKC), die direkt an den Proliferations- und Differenzierungsprozessen und an der Regulierung des MDR-Phänotyps beteiligt ist. Verschiedene natürliche Inhibitoren der PKC sind bekannt, und sie sind das Grundprinzip bei der Entwicklung neuer Arzneimittel.
Eine weitere Klasse von Zielenzymen betrifft die Enzyme, die den Zellcyclus regulieren, insbesondere die Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), deren Inhibitoren in vielen Krebszelllinien eine Zellcyclusblockade hervorrufen und die somit als Cytostatika und Cytotoxika verwendet werden können.
Ein Enzym, das während der letzte Jahre auf dem Gebiet der Onkologie großes Interesse hervorgerufen hat, ist Glutathion-S-Transferase (GST, EC 2.5.1.18). Es ist in Wirklichkeit eine Familie von Isoenzymen, die in der Natur weit verbreitet sind und die den nukleophilen Angriff des Schwefelatoms von Glutathion (GSH) auf elektrophile Gruppen von Substratmolekülen katalysieren. Wie bekannt, ist Glutathion ein aus Glutaminsäure, Cystein und Glycin bestehendes Tripeptid und ist die wichtigste niedermolekulare Verbindung, die in tierischen oder pflanzlichen Zellen, die die Thiolgruppe enthalten, festgestellt wird. Die Glutathion-S-Transferasen katalysieren die Konjugation von Glutathion mit vielen verschiedenen Typen von Xenobiotika und verringern somit ihre Reaktivität drastisch und machen diese Verbindungen wasserlöslicher, sodass sie ihre Entfernung begünstigen.
Auf der Grundlage dieses Mechanismus wurde davon ausgegangen, dass die GST-Aktivität einer der Faktoren ist, die für das Phänomen der Arzneimittelresistenz, die in Krebszellen festgestellt wird, verantwortlich sind, da viele Antikrebsarzneimittel als Substrate dieses Enzyms erkannt werden (Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, (1990), 47–70; Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30, (1995), 445–600; Cancer Cells Mon. Rev. 2, (1990), 15–22; Cancer Res. 54, 4313–4320; Eur. J. Cancer 32A, (1996), 967–978). GST wird in vielen menschlichen Krebsen stark exprimiert und spielt bei der Detoxifizierung von verschiedenen Antikrebsarzneimitteln oder ihren Metaboliten, die bei der onkologischen Behandlung eingesetzt werden, eine Schlüsselrolle. Das Enzym führt die Glutathion-Konjugation von Antikrebsarzneimitteln, wie Nitrogen Mustards, Chlorambuzil, Cyclophosphamid, Mitoxantron und Anthrachinon, durch und könnte andere Arzneimittel detoxifizieren, indem es nicht direkt auf die Moleküle sondern auf einen Metaboliten davon einwirkt.
Die GSTs stellen eine multigenische Familie von Isoenzymen dar, die je nach ihrer Immunogenizität und Primärstruktur in mindestens zehn Klassen unterteilt werden, einschließlich Alpha, Pi und Mu. Die Enzym-Klasse, die in größeren Mengen in Krebsen hyperexprimiert ist, ist Pi (GST-Pi), wie bei verschiedenen humanen kanzerösen und präkanzerösen Geweben festgestellt (Mol. Pharmacol. 50, (1996), 149–159). Diese Zunahme in der Enzymexpression wurde sowohl in Zelllinien, die gegenüber Alkylierungsmitteln resistent sind (Cancer Res. 49, (1989), 6185–6192; Br. J. Cancer, 74, (1996), S93–S98), als auch in Krebszelllinien, die gegenüber Doxorubicin und Cisplatin resistent sind (Cancer Res. 49, (1989), 7020–7025; Cancer 78, 1996; 416–421; J. Biol. Chem. 261, (1986), 15544–15549), festgestellt, und es wurde auch die Verwendung der Pi-Klassen-GST-Enzyme als Krebsmarker für seine Frühdiagnose nahegelegt.
Ferner zeigen viele Studien eindeutig, dass die GST-Hyperexpression im Tumor Antikrebsarzneimittel nicht nur durch Konjugation mit Glutathion resistent macht, sondern auch durch andere, noch nicht vollkommen aufgeklärte Mechanismen. Eine Korrelation wurde neuerdings zwischen der Menge an Pi-Klassen-GST, die in den Nucleus von Krebszellen transferiert wurde, und der Resistenz festgestellt, die von diesen Zellen gegenüber Arzneimitteln, wie Doxorubicin und Cisplatin, erworben wurde, und es wurde die Hypothese aufgestellt, das die Pi-Klassen-GST im Nucleus die DNA vor einer durch Chemotherapie verursachten Beschädigung schützt (Faseb J. 15, (2001), 2702–2714).
Es spricht sehr viel dafür, dass die GSTs auch bei der Kontrolle des Prozesses des programmierten Zelltodes (Apoptose) eine aktive Rolle spielen. Unter Zellstressbedingungen, wie nach Behandlung mit UV-Strahlung oder mit Oxidationsmitteln, wird die c-Jun N-terminal Proteinkinase (JNK), die an der Säugerzellantwort auf Stress durch Regulierung des Zellcyclus, Reparatur der DNA oder Auslösung der Apoptose teilnimmt, aktiviert. Neuerdings wurde ein Proteininhibitor der JNK aufgereinigt, der als Pi-Klassen GST identifiziert wurde (J. Biol. Chem. 276, (2001), 20999–21003). Dieses Protein knüpft sich über die Region, die die Reste 194 bis 204 einschließt, an den C-terminalen Teil der Proteinkinase JNK an, und es ist es bekannt, dass Faktoren, die einen Zellstress hervorrufen, die Dissoziation des GST Pi/JNK-Komplexes und somit die Kinaseaktivierung einschließen.
Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen wurde auch festgestellt, dass spezifische Inhibitoren von GST-Pi, wie die Glutathion-Peptidomimetika TER-117 [Terrapin 117: γ-L-Glutamyl-S-(benzyl)-L-cysteinyl-R-(–)-phenilglycin] und TER-293, die Proteinkinase JNK triggern, da sie die Dissoziation von GST Pi aus dem GST Pi/JNK-Komplex begünstigen (EMBO J. 18, 1999, 1321–1334; J. Biol. Chem. 276, (2001), 20999–121003).
Es wurde auch festgestellt, dass GSTM1-1, eine der Mu-Klasse angehörende Glutathion-S-Transferase, an den N-terminalen Teil einer anderen Kinase bindet, die das apoptotische Signal reguliert und ASK1 (Apoptosesignal-regulierende Kinase) genannt wird und die dabei seine Aktivität hemmt. Es wurde gezeigt, dass ein Wärmeschock, der die Dissoziation des GSTM1-1/ASK1-Komplexes verursacht, das Triggern von ASK1 ermöglicht. Diese Kinase wiederum ist an einer Kaskade von Aktivierungsreaktionen anderer Proteine und Phosphorylate JNK und Kinase p38 beteiligt, die bekanntlich Mediatoren der Zellreaktion gegenüber Stressfaktoren sind (J. Biol. Chem. 276, 2001, 12749–12755; J. Biol. Chem. 277, (2002), 30792–30797).
Schlussfolgernd ist eine der Hauptrollen der GST anscheinend diejenige der Abregulierung der Kaskade von Signalen, die mit JNK verknüpft sind, über mehrere Mechanismen: das GST-Mu-Enzym wirkt auf die ASK1-Kinase und somit indirekt auf JNK, während das GST-Pi-Enzym direkt auf JNK wirkt.
Die zuvor genannten Beobachtungen zeigen, dass die Überexpression von GST in Krebszellen einen Schutzmechanismus Letzterer gegen Stressfaktoren endogener Art und gegen diejenigen, die durch Antikrebs-Arzneimittel verursacht werden, darstellt. Daher können Krebszellen eine Resistenz gegen diese Arzneimittel erwerben und antworten möglicherweise nicht mehr auf apoptotische Stimuli.
Hinsichtlich des Obigen wurde die Forschung nach wirksamen GST-Inhibitoren zu einem der primären Ziele, um die Krebszellen gegenüber Antikrebs-Arzneimitteln resistent zu modulieren.
Einer der ersten Inhibitoren der GSTs, der verwendet wurde, war Ethacrynsäure, ein seit langem als Diuretika verwendeter Wirkstoff (der neuerdings für diese Indikation durch Furosemid ersetzt wurde), der Krebszellen gegenüber der cytotoxischen Wirkung von Alkylierungsmitteln sensibilisiert. Obwohl sie als Substrat für einige Isoenzyme von GST erkannt wurde, verhält sich Ethacrynsäure auch als Inhibitor dieser Enzyme. In diesem Zusammenhang wurden schätzenswerte Ergebnisse durch die Verwendung von Ethacrynsäure zur Senkung der Resistenz von Krebszellen gegenüber Melfalan, Carmustin, Mitomycin C, Doxorubicin und zu einem geringeren Ausmaß gegenüber Chlorambucil bei Patienten, die an chronischer lymphoblastischer Leukämie litten, erhalten (Advanced Drug Delivery Reviews 26, (1997), 91–104).
Die mangelnde Spezifität hinsichtlich GST-Isoformen, die in malignen Zellen hyperexprimiert werden, sowie eine bestimmte Anzahl von beträchtlichen Nebenwirkungen, wie eine deutliche Diurese, haben die Verwendung von Ethacrynsäure in der klinischen Praxis eingeschränkt, und somit wurden einige selektive Inhibitoren für spezielle enzymatische GST-Klassen als Alternative eingeführt (Advanced Drug Delivery Reviews, loc. cit.).
Diese sind die zuvor genannten Glutathion-Peptidomimentika, einschließlich beispielsweise TER 199 [γ-Glutamyl-S-(benzyl)-cysteinyl-R(–)-phenylglicindiethylester], welcher schnell in die Zeilen eintritt und, als Prodrug, durch die intrazellulären Esterasen aktiviert wird. In der aktiven Form hemmt das zuvor genannte Arzneimittel TER-117 selektiv die Pi-Klassen GSTs und verstärkt die Wirkung der Nitrogen Mustards und allgemein von Alkylierungsmitteln in verschiedenen Krebszelllinien, wie diejenige des Kolon-HT29- und diejenige des Eierstockkarzinoms SKOV-3, welches das Isoenzym GST Pi hyperexprimiert (Cancer Chemother. Pharmacol. 37, (1996), 363–370).
Sowohl im Falle von Ethacrynsäure als auch im Falle von TER 199 besteht die gesuchte Einwirkung in der Verstärkung der Wirkung der anderen cytotoxischen Mittel (Alkylierungsmitteln) auf resistente Krebszellen. Eine unterschiedliche Klasse von cytotoxischen Mitteln, die auf Substanzen beruhen, die Glutathion gleichwertig sind (Advanced Drug Delivery Reviews, bereits zitiert), besteht aus Molekülen, die die GST nicht hemmen, sondern ihre katalytische Kraft ausnutzen, um aktiviert zu werden. Diese Prodrugs unterscheiden sich aufgrund ihrer Selektivität gegenüber den verschiedenen Isoenzymen und in den verschiedenen aktivierten Mitteln, die sich von ihnen ableiten. Ein Beispiel ist TER 286, dessen Struktur die GST-bindende Kapazität einer GSH-peptidomimetischen Substanz und die Cytotoxizität eines alkylierenden Nitrogen Mustard aufweist. Bei Aktivierung durch Isoenzyme der Pi- und Alpha-Klassen setzt das latente Cytotoxin TER 286, ein Cyclophosphamid-Analoges mit inhärenter cytotoxischer Aktivität, frei.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung den Bereich der Forschung nach neuen selektiven Inhibitoren für die enzymatischen Klassen der Glutathion-S-Transferase, die in Krebszellen hyperexprimiert wird, um Derivate bereitzustellen, die als Antikrebsmittel aktiv sind, sowohl aufgrund ihrer von Natur aus vorhandenen cytotoxischen Kraft als auch aufgrund ihrer Fähigkeit, die Detoxifizierungsaktivität der GSTs gegenüber anderen chemotherapeutischen Mitteln zu hemmen.
Wie bereits angegeben, werden einige GST-Klassen in vielen Krebszellen so stark hyperexprimiert, sodass einige Isoformen, wie GSTP1-1, die der GST-Pi-Klasse angehört, als Tumormarker verwendet werden können. Diese enzymatische Hyperexpression, die für die meisten Krebse dokumentiert ist, macht die Krebszellen arzneimittelresistent, nicht nur aufgrund der detoxifizierenden Aktivität, welche diese Enzyme katalysieren, sondern auch durch die anti-apoptotische Aktivität, die sie zeigen, die die Signaltransduktionsmechanismen, die die Apoptose regulieren, beeinträchtigt.
Bei den untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führen, wurde festgestellt, dass einige spezielle Derivate von 7-Nitro-2,1,3-benzoxydiazol – in verschiedenen Krebszelllinien – eine beträchtliche selektive inhibitorische Aktivität gegenüber den betrachteten GST-Isoformen sowie eine hohe cytotoxische Kraft zeigen. Diese Moleküle binden selektiv an die hydrophoben Stellen der GSTs (wo das Co-Substrat, das mit Glutathion konjugiert werden muss, bindet) und hemmen die Aktivität dieser Isoenzyme stark.
Die 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate, die erfindungsgemäß in Erwägung gezogen wurden, können leicht ausgehend von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol, ein fluorogenes, aus der Biochemie gut bekanntes Molekül, welches zur Markierung von Thiol- und Aminverbindungen verwendet wird (FEBS Lett. 6, (1970), 346–348; Eur. J. Biochem. 54, (1975), 117–126; Eur. J. Biochem. 54, (1975), 127–133), hergestellt werden. 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol wird von der GST der Klasse Alpha gut als Co-Substrat erkannt, aber es wird auch von den Pi- und Mu-GST als Substrat verwendet, die das Produkt, d. h. (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)glutathion erzeugen (Anal. Biochem. 218, (1994), 463–465; J. Biol. Chem. 271, (1996), 16193–16198). Letzeres Molekül ist ein guter GST-Inhibitor, dringt jedoch schwer in die Zellen ein und wird aus ihnen schnell ausgeschieden.
Den 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten (auch 4-Nitrobenzofuran genannt) wurde aufgrund ihrer möglichen klinischen Anwendungen als Antikrebsarzneimittel bereits früher Aufmerksamkeit zuteil. Die ersten Studien an Verbindungen dieser Familie reichen bis in die späten 60er Jahre zurück, mit einigen Veröffentlichungen, die ihre potentielle leukämiehemmende Aktivität betonen (Biochemical Pharmacology 17, (1968), 158–161; J. med. Chem. 11, (1968), 305–311). Diese Veröffentlichungen betreffen eine begrenzte Anzahl von 7-Nitro-2,1,3-Benzoxadiazol-Derivaten und berichten über ihre Aktivität bei der Hemmung des Uridin-5^3H-Einbaus in Schaf-Lymphozyten-RNA in vitro, d. h. bei der Hemmung des Lymphozyten-Metabolismus. Spätere Studien haben festgestellt, dass 7-Phenylthio- und 7-Purin-6-thio-4-nitrobenzofurazan in einigen normalen und Krebs-Säugerzelllinien starke Inhibitoren der Synthese von Nukleinsäuren und Proteinen sind (Chem. Biol. Interactions 42, (1982), 195–207). Die bei diesen Arbeiten erhaltenen Gesamtergebnisse sind widersprüchlich, und dieser Forschungszweig wurde offenbar nicht weiter verfolgt.
Andererseits schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung von spezifischen Derivaten von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol, die nicht als mögliche Antikrebsmittel in den früheren Studien erwähnt sind, als Inhibitoren von GST und Antikrebsmitteln vor.
Die 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sind durch die Gegenwart einer Thioetherbrücke in Position –4 und durch das Vorliegen einer aliphatischen Gruppe mit Merkmalen einer schlechten, damit verknüpften Abgangsgruppe gekennzeichnet. Letztere enthält vorzugsweise auch mindestens eine -OH-Gruppe. Die Derivate verfügen über das Vermögen des schnellen Eindringens in Krebszellen, wo sie eine bemerkenswerte cytotoxische Aktivität ausführen. Diese Wirkung beruht wahrscheinlich auf der Hemmung der detoxifizierenden Wirkung (wie durch die spezielle experimentelle Beweisführung, die in vitro an gereinigten Isoenzymen erhalten wird, gezeigt) und der anti-apoptotischen Aktivität der GSTs, insbesondere der Isoform GSTP1-1, die in Krebszelllinien überexprimiert wird. Somit macht es die Verwendung der erfindungsgemäßen Derivate möglich, eine Behandlung durchzuführen, die darauf ausgerichtet ist, eine cytotoxische Wirkung auf Krebszellen – die primären Ziele dieser hoch selektiven Verbindungen – zu erhalten, wobei sie in die Physiologie von normalen Zellen weniger wirksam eingreifen.
Hinsichtlich der chemischen Struktur der erfindungsgemäßen Verbindungen muss angemerkt werden, dass die Natur der in ihrem Grundgerüst vorhandenen Abgangsgruppen zu geringen oder keinen Austauschreaktionen mit endogenen Thiolen, wie Glutathion, und zur Bildung eines stabilen σ-Addukts mit GSH führt, wie im experimentellen Abschnitt hier gezeigt. Die Austauschreaktionen mit endogenen Thiolen stellen im Falle von anderen Derivaten des 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazols, die in der zuvor genannten früheren Forschungszweig untersucht wurden, ein dokumentiertes Phänomen dar. Im Verlauf der zuvor genannten früheren Experimente wurden einige der -O-, -NR- und -S-Derivate von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol getestet, und insbesondere unter den -S-Derivaten wurden Verbindungen getestet, wobei die Gruppe, die mit Schwefel in Position -4 bindet, alternativ eine Phenyl-, Benzyl-, Acetyl oder eine Cyanogruppe ist. Die moderaten und widersprüchlichen Ergebnisse, die beschrieben wurden, sind der Gegenwart – in diesen Verbindungen – von guten Abgangsgruppen, wie Chlor-, Thiocyanat-, Phenoxy-, Phenylthio- und Benzylthio- zuzuschreiben. Diese Gruppen begünstigen Austauschreaktionen mit Glutathion, was zu der Bildung von Addukten mit Letzeren führt. Diese Addukte werden vorzugsweise von den Zellen über spezifische Membranglycoproteine, die der Familie von Proteinen angehören, die bei dem Prozess der Arzneimittelresistenz gegen mehrere Mittel (Multidrug Resistance Protein, MRP) (Free Rad. Biol. Med. 27, (1999), 985–991) beteiligt sind, ausgeschieden.
Wie bereits erwähnt, bereiten ferner einige der in der zitierten Literatur beschriebenen Verbindungen insofern beträchtliche Löslichkeitsprobleme, als sie die Möglichkeit der in vivo Verabreichung beeinträchtigen. Andererseits trägt bei 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten die Gegenwart von mindestens einer -OH-Gruppe erfindungsgemäß dazu bei, diese Verbindungen mit einer guten Löslichkeit in einem wässrigen Medium auszustatten, während immer noch ein solcher Apolaritätsgrad beibehalten wird, dass eine Wechselwirkung mit der hydrophoben Bindungsstelle des GSTs-Substrats und die Expression ihrer starken enzymatischen Hemmaktivität möglich sind.
Außerhalb des onkologischen Gebiets sind bereits einige Anwendungen von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten, die in -4 über eine Thioether-Brücke funktionalisiert sind, bekannt, beispielsweise als fluoreszierende reaktive Mittel beim Studium des Metabolismus von einigen Thiol-Inhibitoren bei der Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II (US-Patentschriften Nrn. 4395556 und 4469870), und allgemein als fluoreszierende Sonden zur Herstellung von Nukleinsäuren oder Proteinen. Andere 4-S-Derivate von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol sind in der US-Patentanmeldung Nr. 2002/0189032 und EP-A-1261591 beschrieben, wo sie zur Verwendung als Farbmittel von Keratinfasern und insbesondere für Haare vorgeschlagen werden. Darum stellt die vorliegende Erfindung speziell die Verwendung von Derivaten von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol der allgemeinen Formel
wobei:
R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkenyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkinyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wobei ein Wasserstoffatom von R₁ gegebenenfalls mit einer Gruppe substituiert ist, die aus den Gruppen ausgewählt ist, die aus OR₂, NO₂, NR₂R₃ bestehen,
wobei R₂ und R₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, und wobei die beschriebene S-R₁-Gruppe keine gute Abgangsgruppe ist,
zur Herstellung eines GST-hemmenden Medikaments zur Behandlung von Krebsformen bereit. Erfindungsgemäß können die obigen GST-selektiven Inhibitoren vorteilhafterweise bei antineoplastischen Therapien durch ihre Verabreichung allein als cytotoxische Mittel oder in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln eingesetzt werden, um die therapeutische Wirkung davon durch Herabsetzung der Arzneimittelresistenzwirkung zu verstärken.
Nach einigen speziellen Ausführungsformen davon betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten der allgemeinen Formel (I), wobei R₁ eine lineares oder verzweigtes Hydroxyalkyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist und vorzugsweise aus 4-Hydroxybutyl und 6-Hydroxyhexyl ausgewählt ist.
Die bevorzugten Wirkstoffe für die vorgeschlagene erfindungsgemäße Verwendung entsprechen einem der folgenden:
4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol
6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol.
Nach einem weiteren Aspekt davon betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere die Verwendung von Derivaten von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol der allgemeinen Formel (I) zur Behandlung von verschiedenen Krebsformen und insbesondere derjenigen Formen, die durch eine GST-Überexpression gekennzeichnet sind. Die zuvor genannten Enzym-Isoformen, die in soliden Tumoren, Lymphomen und in Leukämien überexprimiert werden, können den Klassen GST-Pi, GST-Mu und GST-Alpha von Glutathion-S-Transferase angehören, und insbesondere können sie die Isoformen GSTP1-1, GSTM2-2 und GSTA1-1 sein.
Ein weiterer spezieller Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von Krebs einschließlich – als Wirkstoff – von mindestens einem der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate der allgemeinen Formel (I), zusammen mit einem oder mehreren pharmakologisch verträglichen Adjuvantien und/oder Vehikeln.
Die erfindungsgemäßen geeigneten pharmazeutischen Zubereitungen zur therapeutischen Verabreichung von GST-Inhibitoren können auf der Grundlage von herkömmlichen, den Fachleuten bekannten Techniken durch Verwendung pharmazeutisch verträglicher Exzipientien und Vehikel formuliert werden, um Präparate zu erhalten, die zur parenteralen Injektion (intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion), zur oralen Verabreichung in fester oder flüssiger Form, zur transdermalen, rektalen, intravaginalen oder lokalen Verabreichung, beispielsweise in die Oronasaltrakt-Schleimhautmembranen und dergleichen, geeignet sind.
Der Prozentsatz an Wirkstoff in der Zusammensetzung und bei der Antikrebs-Behandlungsmethode kann zum Erhalt einer optimalen Dosierung variiert werden. Die zu verabreichende Dosis berücksichtigt die folgenden Faktoren: Verabreichungsweg, Dauer der Behandlung, Gewicht und den Zustand des Patienten, Aktivität des Wirkstoffs und Reaktion des Patienten.
Nach Bestimmung der entsprechenden Dosierung des Wirkstoffs können die Formulierung und die Wahl von geeigneten Exzipientien und Adjuvantien für jeden Bedarf auf der Grundlage des allgemeinen Wissens auf dem Gebiet vorgenommen werden.
Einige experimentelle Ergebnisse, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhalten werden und die die Messwerte bezüglich der biologischen Aktivität und der Merkmale – als GST-Inhibitoren – von einigen 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten, deren Synthese ebenfalls beschrieben ist, umfassen, sind nachstehend als Beispiele angegeben. Einige der experimentellen Ergebnisse sind auch in den Graphen der beigefügten Zeichnungen gezeigt, wobei:
1 einen Scatchard-Plot für das Binden des 7-Nitro-2,1,3-benzofurazan-Derivats, das im Folgenden als Nr. 2 bezeichnet wird (6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol) an GSTP1-1 zeigt; in dem Graph bedeutet ν das Verhältnis zwischen der bei einer gegebenen Ligandenkonzentration festgestellten Fluoreszenzänderung und der bei der gesättigten Ligandenkonzentration festgestellten Fluoreszenzänderung; L ist die freie Ligandenkonzentration;
2 das Spektrum von 15 μM 7-Nitrobenzofurazan-Derivats Nr. 2 in 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 6,5 (Bilder A und B, durchgezogene Linien) und das Spektrum von 15 μM 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2, gebunden an stöchiometrische Mengen von GSTP1-1 in Gegenwart entweder von 1 mM GSH (Bild A, gestrichelte Linie) oder 1 mM S-Methylglutathion (Bild B, gestrichelte Linie) zeigt;
3 die Caspase-3-Aktivität in CEM1.3- und K562-Zelllinien nach Behandlung mit dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 (∎) und die Caspase-3-Aktivität in Kontrollzellen (•); den Prozentsatz an Apoptose in CEM1.3- und K562-Zelllinien nach Behandlung mit dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 (☐) und in Kontrollzellen (O) zeigt; die Aktivität wurde als pro Minute pro Anzahl von Zellen festgestellte Fluoreszenzänderung ausgedrückt; die Apoptose wurde durch Auswertung der Kernfragmentierung nach Zellfärbung mit Hoechst-33342-Farbstoff bestimmt;
4 die Ergebnisse der Durchflusscytometrie-Analyse, die mit K562- und CEM1.3-Zelllinien, behandelt mit 10 μM bzw. 2 μM Derivat Nr. 2, durchgeführt wurden, zeigt; nach 12 h und 24 h Behandlung wurden die Zellen gewaschen und sowohl mit Annexin V-FITC und PI gefärbt, die die Diskriminierung intakter Zellen, früher apoptotischer und später apoptotischer oder nekrotischer Zellen erlauben;
5 (A, B und C) die Western-Blot-Analysen von K562- und CEM1.3-Zelllinien, behandelt mit 10 μM bzw. 2 μM Derivat Nr. 2; GSTP1-1, c-Jun, JNK, zeigt; die Phosphoraktivierten c-Jun- und JNK-Isoformen wurden durch spezifische Antikörper nachgewiesen; (β-Actin wurde als Ladungskontrolle (Bilder A und C) verwendet; die Dissoziation des GST/JNK-Komplexes wurde durch Immunpräzipitationsanalyse bewertet; die Lysate wurden unter Verwendung von anti-JNK-polyklonalem Antikörper immunpräzipitiert, und mit ihnen wurden sodann Western-Blot-Analysen durchgeführt; GST und JNK wurden durch spezifische Antikörper (Bild B) nachgewiesen; und
6 die Gewichtsschwankungen von Mäusen in einem akuten in vivo Toxizitätstest, der die Wirkung parenteraler Verabreichung verschiedener Dosierungen der erfindungsgemäßen Testverbindung Nr. 2 im Vergleich mit Kontrollen, die physiologische Lösung oder nur Vehikel erhielten, vergleicht, zeigt.
Hinsichtlich der Synthese können, wie bereits erwähnt, die Derivate, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, sowie die zum Vergleich zu verwendenden Verbindungen ausgehend von einer bereits verfügbaren Ausgangsverbindung, 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), ohne alternative Syntheseverfahren auszuschließen, hergestellt werden.
BEISPIEL 1
4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol
Ein Lösungsgemisch von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) und 4-Mercapto-1-butanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmol) wurde hergestellt, zur Umsetzung in 20 ml Ethanol: 1:1 Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0 für 6 Stunden in einem graduierten Becherglas bei 25°C. Der pH wurde kontinuierlich überwacht, um ihn durch Zugabe kleiner Mengen von KOH neutral zu halten. Am Ende der Umsetzung wurde der Überschuss von 4-Mercapto-1-butanol mit 1,5 mmol 3-Brompyruvat reagieren gelassen.
Das Reaktionsprodukt, 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol, ist eine dunkelgelbe unlösliche Verbindung, die durch Filtrieren und zweimaliges Waschen mit 15 ml kaltem destilliertem Wasser gesammelt wird. Das Endprodukt wird gemäß HPLC-Analyse als 98% rein angesehen.
Das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der Verbindung beträgt 269 Da.
Das UV/VIS-Spektrum in Wasser ist durch ein Absorptionsmaximum bei 431 nm (ε = 15 mM^–1 cm^–1) gekennzeichnet, und das Fluoreszenzspektrum in Wasser zeigt ein Emissionsmaximum bei 525 nm.
BEISPIEL 2
6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol
Ein Lösungsgemisch von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) und 6-Mercapto-1-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmol) wurde hergestellt, zur Umsetzung in 20 ml Ethanol: 1:1 Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0 für 6 Stunden in einem graduierten Becherglas bei 25°C. Der pH wurde kontinuierlich überwacht, um ihn durch Zugabe kleiner Mengen von KOH neutral zu halten. Am Ende der Umsetzung wurde das überschüsige 6-Mercapto-1-hexanol mit 1,5 mmol 3-Brompyruvat reagieren gelassen. Das Reaktionsprodukt, 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol, ist eine dunkelgelbe unlösliche Verbindung, die durch Filtrieren und zweimaliges Waschen mit 15 ml kaltem destilliertem Wasser gesammelt wird.
Das Endprodukt wird gemäß HPLC-Analyse als 98% rein betrachtet. Das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der Verbindung beträgt 298 Da.
Das UV/VIS-Spektrum ist durch ein Absorptionsmaximum bei 432 nm (ε = 15 mM^–1 cm^–1) gekennzeichnet, und das Fluoreszenzspektrum zeigt ein Emissionsmaximum bei 525 nm.
VERGLEICHSBEISPIEL 3
2-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)imidazol
Eine Lösung von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) und 2-Mercaptoimidazol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmol) wurde in 6 ml Ethanol:Wasser 0,3:1, enthaltend 2,5 mmol Pyridin (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), reagieren gelassen. Nach 1 h Inkubation bei 25°C wurde die Lösung filtriert, zweimal mit 10 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Das unlösliche Produkt, 2-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)imidazol, ist orangefarben und gemäß HPLC-Analyse zu 98% rein. Das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der Verbindung beträgt 264 Da.
Die Verbindung besitzt ein UV/VIS-Spektrum, das durch einen maximalen Absorptionspeak bei 401 nm (ε = 11,5 mM^–1 cm^–1) gekennzeichnet ist, und kein Fluoreszenzemissionsspektrum.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)phenol
Ein Lösungsgemisch von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) und 4-Mercaptophenol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmol) wurde hergestellt, zur Umsetzung in 20 ml Ethanol: 1:1 Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0 für 6 Stunden in einem graduierten Becherglas bei 25°C. Der pH wurde kontinuierlich überwacht, um ihn durch Zugabe kleiner Mengen von KOH neutral zu halten. Am Ende der Umsetzung wurde der Überschuss von 4-Mercaptophenol mit 1,5 mmol 3-Brompyruvat reagieren gelassen.
Das Reaktionsprodukt, 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)phenol, wurde durch Filtrieren gesammelt, zweimal mit 15 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Endprodukt ist eine braune unlösliche Verbindung und wird gemäß HPLC-Analyse als 98% rein angesehen. Das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der Verbindung beträgt 289 Da.
Die Verbindung besitzt ein UV/VIS-Spektrum in Wasser, das durch ein Absorptionsmaximum bei 428 nm (ε = 11,5 nM^–1 cm^–1) gekennzeichnet ist, und kein Fluoreszenzemissionsspektrum.
VERGLEICHSBEISPIEL 5
3-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)propionsäure
Eine Lösung von 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (1 mmol) und 3-Mercaptopropionsäure (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmol) wurde in 6 ml Ethylalkohol:Wasser 0,3:1, enthaltend 2,5 mmol Pyridin, reagieren gelassen.
Nach 1 h Inkubation bei 25°C wurde die Lösung filtriert, zweimal mit 10 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen und anschließend unter Vakuum getrocknet. Das unlösliche Reaktionsprodukt, 3(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)propionsäure, ist dunkelgelb und wird gemäß HPLC-Analyse als 98% rein betrachtet. Das Molekulargewicht beträgt 270 Da.
Die Verbindung besitzt ein UV/VIS-Spektrum in Wasser, das durch ein Absorptionsmaximum bei 428 nm (ε = 12 mM^–1 cm^–1) gekennzeichnet ist, und das Fluoreszenzspektrum zeigt ein Emissionsmaximum bei 525 nm.
Studium der biologischen Aktivität der Glutathion-S-Transferasehemmung durch die 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate
Experimentelles Verfahren – Die 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate der Beispiele 1 und 2 wurden verwendet, die nach den in den Beispielen beschriebenen Vorgehensweisen hergestellt wurden. Zum Vergleich wurde auch das Verhalten der folgenden Verbindungen bewertet:

– die Verbindungen der Beispiele 3 und 4, gekennzeichnet durch mäßige Abgangsgruppen;
– die Verbindung von Beispiel 5, gekennzeichnet durch eine im Grunde genommen schlechte Abgangsgruppe, modifiziert durch die Substitution von einem Wasserstoff mit einer COOH-Gruppe;
– das Derivat 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol, wobei S durch NH in der Formel substituiert und die NHR₁-Gruppe keine Abgangsgruppe ist.

Letzteres wirkte als Kontrolle, um zu gewährleisten, dass die Cytotoxizität mit der GST-Hemmung verknüpft ist. 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol wurde durch Umsetzung von 1 mmol 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol mit 1 mmol 6-Amino-1-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) in 6 ml Ethylalkohol:Wasser 0,3:1, enthaltend 2,5 mmol Pyridin, erhalten.
Die Verbindungen wurden als Inhibitoren der Aktivität der Isoenzyme GSTP1-1, GSTA1-1 und GSTM2-2, die den besonders repräsentativen GST-Klassen, die Klassen Pi, Mu und Alpha, angehören, getestet.
GSTA1-1, M2-2 und P1-1, die in Escherichia coli exprimiert wurden, wurden gereinigt, indem sie auf ein Affinitätschromatographieharz aufgegeben wurden, das die GST selektiv zurückzuhalten vermochte (J. Biol. Chem. 270, (1995), 1249–1253).
Die GST-Aktivität wurde bei 25°C mit einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei pH 6,5 in Gegenwart der Substrate, d. h. Glutathion (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), in einer Konzentration von 1 mM, und von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), 1 mM, getestet (Methods Enzymol. 77, 1981, 398–405).
Während der Testung zur Bestimmung der IC₅₀ (inhibitorische Konzentration, bei der eine Hemmung der enzymatischen Aktivität von 50% festgestellt wird) wurden dem Aktivitätsgemisch verschiedene Mengen der zu testenden 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate zugesetzt.
Die enzymatische Aktivität wurde spektralphotometrisch bei 340 nm bewertet, eine Wellenlänge, bei der sie das Reaktionsprodukt S-(2,4-Dinitrobenzol)-glutathion (GS-DNB) (ε = 9,6 mM^–1 cm^–1) absorbiert.
Ergebnisse – Die IC₅₀-(μM)-Werte der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate sind in Tabelle 1 nachstehend angegeben. Die Tabelle zeigt die IC₅₀-Werte für die verschiedenen getesteten Inhibitoren bezüglich der drei repräsentativen Isoenzyme von jeder GST-Klasse.
Jede Verbindung ist in der Tabelle mit einer Anzahl von entsprechenden relativen Synthesebeispielen angegeben, während das Amin-Vergleichsderivat mit der Nummer 6 angegeben ist. Tabelle 1 Hemmung der GST-Aktivität – IC₅₀-Werte (μM)

(1) 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol
(2) 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol
(3) 2-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)imidazol
(4) 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)phenol
(5) 3-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)propionsäure
(6) 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol

Wie bereits angegeben, wurde auch die inhibitorische Kapazität des 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol-Derivats gegenüber den verschiedenen GST-Isoenzymen getestet. Das Schwefelatom in letzterer Formel wird durch eine Amingruppe ersetzt, um zu bewerten, ob die Cytotoxizität mit der GST-Hemmung zusammenhängt ist.
Die Analyse dieser ersten Messwerte zeigt, dass die Verbindung praktisch ihr Vermögen zur Hemmung von GSTP1-1 (IC₅₀ ≥ 100 μM) verloren hat, jedoch eine höhere inhibierende Kapazität hinsichtlich GSTM2-2 mit einer IC₅₀ von 1,8 μM beibehält.
Für den analogen Inhibitor, dessen Formel Schwefel einschließt, bestand eine viel geringere IC₅₀ (größeres Hemmvermögen) bezüglich der Kontrolle, nämlich 0,80 μM für GSTP1-1 und 0,01 μM für GSTM2-2.
Wechselwirkungsmechanismus zwischen 7-Nitro-2,1,3-benzoxfuran-Derivaten und GSTs
Bindung von 7-Nitro-benzofuran-Derivaten an GSTs
Experimentelles Verfahren – Die Affinität von 7-Nitro-benzofuran-Derivaten gegenüber menschlichen GSTs wurde durch Messung des Quenchings der intrinsischen Fluoreszenz des Proteins erhalten, die nach dem Binden der Inhibitoren auftritt (die Anregung erfolgte bei 295 nm, und die Emission wurde bei 340 nm aufgezeichnet).
Die intrinsische Fluoreszenz wurde in einem Single Photon Counting Spektrofluorometer (Fluoromax, S. A. Instruments, Paris, Frankreich) gemessen. Bei einen typischen Experiment wurde die Fluoreszenz bei 340 nm vor und nach der Zugabe von verschiedenen Mengen eines ausgewählten Inhibitors zu 4 μM GST in 0,1 K-Phosphatpuffer pH 6,5, enthaltend 1 mM GSH, aufgezeichnet.
Ergebnisse – Repräsentative Messwerte, die mit GSTP1-1 und dem 7-Nitro-benzofuran-Derivat Nr. 2 (Synthesebeispiel 2) erhalten wurden, sind als Scatchard-Plot in 1 dargestellt. Die Dissoziationskonstante, die für den Inhibitor-GSTP1-1-Komplex erhalten wurde, ist K_D = 0,8 μM, die den IC₅₀-Wert überlagert, der kinetisch erhalten wurde und in Tabelle 1 angegeben ist. Bemerkenswert ist, dass GSH für eine gute Affinität zwischen dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat und GST essentiell ist: in der Tat nimmt in Abwesenheit von GSH die Affinität um etwa zwei Größenordnungen ab.
Spektroskopischer Beweis für die σ-Adduktbildung an der aktiven Stelle
Experimentelles Verfahren – Das UV/VIS-Spektrum von 15 μM 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 in Gegenwart von stöchiometrischen Mengen GSTP1-1 und GSH, 1 mM, wurde bei 25°C in 0,1 M K-Phosphatpuffer bei pH 6,5 erhalten.
Ergebnisse – In Gegenwart von GSTP1-1 und GSH werden ein sofortiges Verschwinden der 432-nm-Bande, die für das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat typisch ist, und eine gleichzeitige Zunahme einer Bande mit dem Zentrum bei 348 nm festgestellt (2, Bild A). Die Thiolgruppe von GSH ist essentiell, um diese Spektraländerung zu erhalten. In der Tat wird in dem UV-sichtbaren Spektrum keine Änderung festgestellt, wenn das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat (50 μM) mit stöchiometrischen Mengen von GSTP1-1 und 1 mM S-Methylglutathion inkubiert wird (2, Bild B).
Dieses Verhalten kann durch die früheren Beschreibungen erklärt werden, die zeigen, dass 7-Nitrobenzofurazane ausgezeichnete Elektrophile sind, die mit vielen Nukleophilen leicht -Addukte bilden (J. Chem. Soc., Perkin Trans 2, (2002), 257–261). Das übliche Verhalten, das festgestellt wird, ist ein kinetisch bevorzugter Angriff des Nukleophils an der 6-Position des 7-Nitrobenzofurazan-Rings und eine anschließende langsame Isomerisierung in Richtung des stabileren 4-Addukts, das zwischen 300 und 400 nm absorbiert. Bei den obigen experimentellen Bedingungen kann das σ-Addukt durch eine kovalente Wechselwirkung zwischen dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat und der Thiolgruppe von GSH, die an die GSTP1-1-aktive Stelle gebunden ist, wie in Schema A dargestellt, gebildet werden.
Diese Hypothese stimmt mit dem Docking-Versuch überein, der durchgeführt wurde, um die Ligandenorientierung an der GST-Bindungsstelle vorherzusagen. Der Vergleich zwischen den Bindungsenergien des σ-Addukts an der 6-Position und an der 4-Position ergibt eine Stabilisierung in der Größenordnung von zwei der 4-substituierten Verbindung.
Aus den obigen Messwerten geht hervor, dass die reale Inhibitorspezies, die GSTP1-1 hemmt, das zwischen dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat und GSH gebildete σ-Addukt ist. Die GSTs sind bei der Katalyse der σ-Adduktbildung zwischen 7-Nitrobenzofurazan-Derivaten und GSH sehr wirksam. Schlechte Abgangsgruppen, wie Alkylthiogruppen, können das σ-Addukt durch Verhinderung der Bildung des monosubstituierten 4-Glutathionyl-7-nitro-Derivats stabilisieren. Außerdem sind diese σ-Addukte durch eine an der 7-Nitrogruppe liegende negative Ladung gekennzeichnet, die durch das Enzym spezifisch stabilisiert werden kann. In der Tat werden in Abwesenheit von GSTP1-1 nachweisbare Mengen des σ-Addukts in Lösung nur bei GSH-Konzentrationen von höher als 5 mM erhalten, und die für diese Reaktion berechnete Gleichgewichtskonstante beträgt K = 20 mM. Auf der Grundlage dieser Gleichgewichtskonstante beträgt die Menge an σ-Addukt, die mit 1 mM GSH (eine GSH-Konzentration, die in unseren Experimenten eingesetzt wird) und in Abwesenheit von GSTP1-1 gebildet wird, etwa 5% der 7-Nitrobenzofurazan-Konzentration. Darum wird die Affinität der GSTP1-1 gegenüber der realen Inhibitorspezies zu 4 × 10^–8 M. Diese starke Affinität gibt an, dass GSTP1-1 ein für dieses Molekül im Inneren der Zelle sehr selektives Ziel ist.
Tests der Antikrebs Aktivität von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten an Zelllinien
Experimentelles Verfahren – Vier Krebszelllinien, K562 (menschliche myeloide Leukämie), HepG2 (menschliches Leberkarzinom), CEM1.3 (menschliche T-lymphoblastische Leukämie) und GLC-4 (menschliches kleinzelliges Lungenkarzinom), wurden zum Testen der Antikrebs-Aktivität der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate verwendet.
Die menschlichen Krebszelllinien wurden in RPMI 1640 (enthaltend L-Glutamin 2 mM und 0,1 g/l Penicillin-G/Streptomycinsulfat), angereichert mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), bei 37°C, 5% CO₂ und 98% Feuchtigkeit gehalten.
Die Zellen wurden in 96-Well-Platten in einer Dichte von 15000 Zellen pro Vertiefung in einem Kulturmediumvolumen von 100 μl vorgelegt. Nach 24 Stunden wurde jedes der zu testenden 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate dem Kulturmedium in der erforderlichen Konzentration zugesetzt. Gleichzeitig wurden einige Kontrollversuche durch Zugabe zu den Vertiefungen des Lösungsmittels, in dem die Verbindung gelöst war (% Vol./Vol. DMSO in PBS) veranlasst. Sämtliche Messungen wurden viermal durchgeführt.
Die Zellen wurden 48 h bei 37°C bei 5% CO₂ inkubiert.
Um ein Dosis-Antwortprofil für jedes 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivat unter Untersuchung zu erhalten, wurde ein Evaluierungsverfahren auf der Grundlage des von Shekan et al. (J. Natl. Cancer. Inst. 82, (1990), 1107–1112) beschriebenen Evaluierungsverfahrens eingesetzt.
Nach Inkubation wurde das prozentuale Zellwachstum durch ein in situ Zellfixierungsverfahren und anschließenden SRB-Test unter Verwendung eines Färbeverfahrens mit Sulforodamin B, das spezifisch an Proteine zu binden vermag, evaluiert. Das gefärbte Produkt wurde anschließend solubilisiert und spektralphotometrisch quantitativ bestimmt, um das Wachstum der mit der Verbindung bei der Untersuchung behandelten Zellen bezüglich derjenigen zu bestimmen, die nur mit dem Lösungsmittel behandelt wurden.
Um auch die Aktivität der endogenen GSTs, die in den eingesetzten Zellen vorhanden waren, zu messen, wurden die gleichen Krebszelllinien verwendet: K562, HepG2, CEM1.3 und GLC-4. In diesem Fall wurden die Kulturzellen, wenn notwendig, trypsinisiert, durch Zentrifugation gesammelt und zweimal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in zwei Volumina PBS resuspendiert und durch Ultraschall lysiert. Das Zelllysat wurde 15 min bei 15000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und zur enzymatischen Testung der GSTs verwendet, die in dem früheren Beispiel beschrieben wurde.
Eine GST-Einheit ist als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1 μmol Produkt (GS-DNB) pro Minute bei 25°C katalysiert.
Die Proteinkonzentration wurde unter Anwendung des Bicinconinsäure-Verfahrens (Pierce) bestimmt.
Ergebnisse – Die IC₅₀-Werte (die Konzentration der Verbindung, bei der eine 50%-Hemmung des Zellwachstums bezüglich unbehandelter Zellen festgestellt wird), ausgedrückt in μM, von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten, sind in Tabelle 2 angegeben.
Den in Tabelle 2 aufgeführten Verbindungen wurde die gleiche Nummerierungsreihenfolge wie diejenigen gegeben, die in dem vorstehend beschriebenen Experiment verwendet wurden. Wie bei dem früheren Experiment sind die Verbindungen (3)–(6) zum Vergleich mit den beanspruchten Verbindungen (1) und (2) angegeben. Tabelle 2 Aktivitätsversuche an Zelllinien – IC₅₀-Werte (μM)

(1) 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol
(2) 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol
(3) 2-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)imidazol
(4) 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)phenol
(5) 3-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)propionsäure
(6) 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-amino)hexanol

Auf der Grundlage des SRB-Test zeigen die 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate gemäß Formel (1) eine ausgezeichnete cytotoxische Aktivität. Die an den Zelllinien erhaltenen IC₅₀-Werte sind von der gleichen Größenordnung wie die IC₅₀-Werte, die mit der gereinigten Enzym-Isoform GSTP1-1 erhalten wurden.
Um diese Entsprechung zu stützen, wurde die Verbindung 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexenol an den verschiedenen Zelllinien getestet, und es wurde festgestellt, dass sie bezüglich der Enzym-Isoform GSTP1-1 keine Hemmwirkung aufwies, sondern für die enzymatische Isoform GSTM2-2 eine IC₅₀ von etwa 2 μM zeigte. Diese Verbindung vermag es, leicht in die Zellen einzudringen, wie es durch die intensive Fluoreszenz, die nach 6 Stunden Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen an 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol aufgezeichnet wurde, abgeleitet werden kann. Alle getesteten Krebszelllinien waren nach 48 Stunden Inkubation mit 50 μM 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylamino)hexanol immer noch lebensfähig.
Tabelle 3 gibt die Werte der spezifischen Aktivität für GST (Proteineinheit/mg), berechnet in den Zelllinien, die bei dem Cytotoxizitätsversuch verwendet wurden, an.
Tabelle 3 Spezifische Aktivität von GST (Proteineinheit/mg)
Die Krebszelllinie, die mehr Resistenz gegenüber der Behandlung mit den 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten zeigt, ist diejenige des Leberzellenkarzinoms HepG2. Diese Krebszelllinie zeigt auch die niedrigste GST-spezifische Aktivität, wie in Tabelle 3 gesehen werden kann, sowie einen GST-Isoenzymaufbau, der von demjenigen der anderen Krebszelllinien verschieden ist.
In der Tat bestätigen an einer großen Anzahl von Zelllinien durchgeführte Charakterisierungsstudien, dass GSTP1-1 in den meisten Krebszelllinien die dominante Enzym-Isoform (1–30 μg/mg Protein) ist und dass die höchsten Expressionsniveaus dieses Isoenzyms anscheinend mit der proliferativen Kapazität und mit der Immortalisierung dieser Krebszelllinien korreliert sind (Mol. Pharmacol. 50, 1996, 149–159).
Stattdessen ist in der HepG2-Krebszelllinie die GSTP1-1-Konzentration sehr niedrig, und die dominante Enzym-Isoform ist GSTA1-1, deren Konzentration absolut immer noch 1% der Konzentration an GSTP1-1 beträgt, welche in den meisten Krebszelllinien vorkommt (Biochim Biophys Acta 1225, 1994, 223–230).
Schließlich ist es interessant festzustellen, wie die höchste Cytotoxizität der getesteten Antikrebs-Verbindungen für die CEM1.3- und K562-Leukämiezelllinien festgestellt wurde, die offenbar gegenüber dieser Art des Eingreifens bezüglich solider Krebszelllinien empfindlicher sind.
Die Fähigkeit von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivaten zur Steigerung der Cytotoxizität von Antikrebs Arzneimitteln in resistenten Zellen
In Krebszellen ist die Resistenz gegen viele Antikrebs-Arzneimittel oft mit einer hohen Expression von P-Glycoprotein, ein der Gesamtfamilie der ABC-Transporter (ATP-Bindungskassette) angehörendes Membranprotein, verknüpft. Dieses Experiment betrifft das Testen der Wirkung von 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol auf die Toxizität des Vinblastin-Arzneimittels für CEMVBL100, eine Leukämielinie, die gegenüber Vinblastin resistent ist (Hyperexpression des P-Glycoproteins).
Experimentelles Verfahren – Die Zellen wurden in 96-Well-Streifen in einer Dichte von 15000 Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von Kulturmedium von 100 μl vorgelegt. Nach 24 Stunden wurde dem Kulturmedium eine geeignete Konzentration zwischen 25 nM und 1000 nM Vinblastin zugesetzt. Der Test wurde sowohl in Abwesenheit als auch Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol im Bereich zwischen 0,1 μM und 1 μM durchgeführt. Gleichzeitig wurden einige Kontrollversuche durch Zugabe zu den Vertiefungen des Lösungsmittels, in dem die Verbindung gelöst war (%- Vol./Vol. DMSO in PBS), vorgenommen. Sämtliche Messungen wurden viermal durchgeführt. Nach 48 h Inkubation wurde ein Dosis-Reaktionsprofil durch Verwendung des SRB-Tests erhalten (J. Natl. Cancer. Inst. 82, (1990), 1107–1112, loc. cit.). Die Toxizität von 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol allein wurde für die resistente Leukämielinie CEMVBL100 getestet.
Ergebnisse – Wie Tabelle 4 zeigt, verursacht 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol (0,5 μM) eine deutliche Zunahme der Empfindlichkeit von Leukämiezellen gegenüber dem Vinblastin-Arzneimittel.
Tabelle 4 Wirkung von 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol auf die Cytotoxizität von Vinblastin (IC₅₀ nM)
Es sollte auch festgestellt werden, dass die CEMVBL100-Zelllinie keine deutliche Zunahme der Resistenz, im Hinblick auf IC₅₀, bezüglich anderer Zelllinien, die das P-Glycoprotein nicht stark exprimieren, zeigt. Diese Feststellung legt nahe, dass die Hyperexpression des P-Glycoproteins nicht die cytotoxische Wirkung der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate beeinflusst.
Analyse von Apoptose in K562- und CEM1.3-Zellinien
Die Auslösung der Apoptose in Zellen durch das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 wurde durch Messen der Caspase-3-Aktivierung und sowohl durch morphologische Analyse als auch Durchflusscytometrie-Analyse bestimmt.
Caspase-3-Aktivierung
Experimentelle Vorgehensweise – Die Caspase-3-Aktivierung spielt bei der Auslösung der aktiven Phase der zum Zelltod führenden Apoptose eine kritische Rolle. Somit kann die Caspase-3-Proteaseaktivität zur Überwachung der Apoptose eingesetzt werden.
Pellets von Zellen zu verschiedenen Zeiten der Inkubation mit dem 7-Nitro-2,1,3-benzofuranzan-Derivat Nr. 2 (10 μM und 2 μM mit K562 bzw. CEM1.3) wurden mit Lysispuffer (100 mM Hepes, pH 7,6, 0,1% Chaps, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid und 10 mM DTT) 20 min auf Eis resuspendiert, und die Zellen wurden durch 10 s Ultraschall aufgebrochen. Nach der Zentrifugation wurden die Lysate zur Messung der Caspase-3-Aktivität verwendet. Das verwendete Substrat war das fluoreszierende Modellpeptid Ac-DEVD-AFC (Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluormethylcumarin), das durch Caspase 3 proteolysiert wurde, was zu einer Fluoreszenzemission bei 505 nm (Anregung bei 400 nm) führt. Als Kontrolle wurden die Lysate 30 min bei 30°C mit dem Caspase-Inhibitor DEVD-CHO vor der Bewertung der Enzymaktivität inkubiert. Die Caspase-Aktivität wurde als Fluoreszenzänderung ausgedrückt, die pro Minute pro Anzahl von Zellen festgestellt wurde.
Ergebnisse – Die Inkubation mit dem 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 triggert die Aktivierung von Caspase 3 sowohl in CEM1.3- als auch K562-Zellinien. Wie in 3 gezeigt, wurde eine starke Zunahme von Caspase 3 in K562 nach 24 h Behandlung mit Derivat Nr. 2 festgestellt. Ein ähnliches Ergebnis wurde mit CEM1.3-Zellen festgestellt.
Morphologische Analyse
Experimentelles Verfahren – K562- und CEM1.3-Zelllinien wurden 24 h mit 10 μM bzw. 2 μM Derivat Nr. 2 behandelt. Apoptotische Zellen wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop durch Analyse der Kernfragmentierung nach Färben mit Hoechst-33342-(Calbiochem-Novabiochem)-Farbstoff nachgewiesen.
Ergebnisse – Die repräsentativen Messwerte mit K562-Zellen zeigen eine Chromatin-Kondensation und eine Kernfragmentierung, die die Endstufen der Apoptose darstellen.
Durchflusscytometrie-Analyse
Experimentelles Verfahren – Die Zellen wurden in PBS gewaschen und mit Propidiumiodid und mit dem undurchdringlichen Farbstoff Annexin V-FITC (Bender MedSystems, Wien, Österreich) gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden unter Verwendung des FAC-Scan-Flow-Cytometers (Becton-Dickinson, CA) analysiert. Die Messwerte wurden aufgezeichnet und mit der WinMDI-Software, Version 2.8, statistisch ausgewertet. Das gleichzeitige Anfärben von Zellen mit Annexin V-FITC und PI gestattet die Diskriminierung intakter Zellen, früher apoptotischer Zellen und später apoptotischer oder nekrotischer Zellen.
Ergebnisse 4 zeigt die Ergebnisse der sowohl an K562- als auch CEM1.3-Zelllinien durchgeführten Durchflusscytometrie-Analyse. Eine progressive Zunahme von apoptotischen Zellen wurde bis 24 Stunden Inkubationsdauer festgestellt. 12 h Behandlung mit dem Derivat Nr. 2 löst 30% bzw. 34% der Apoptose in K562- bzw. CEM1.3-Zellinien aus, während nach 24 h die Apoptose in K562- bzw. CEM1.3-Zelllinien auf 41 bzw. 47% ansteigt.
Schlussfolgernd zeigen die mit den drei verschiedenen experimentellen Wegen erhaltenen Ergebnisse eindeutig die pro-apoptotische Fähigkeit des 7-Nitrobenzofurazan-Derivats in der CEM- und K562-Leukämiezelllinie.
Definition des intrazellulären Mechanismus
Der Mechanismus, durch den der GST-Inhibitor die Apoptose auslöst, ist nachstehend teilweise ausgeführt, wobei die Wechselwirkung des Derivats Nr. 2 mit dem intrazellulären JNK-vermittelten Weg in lymphoblastoider CEM und in myelogenen K562-Leukämiezelllinien beschrieben ist.
Western-Blot-Analyse und Immunpräzipitationsexperiment
Experimentelles Verfahren – Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellpellets wurden in Lysispuffer resuspendiert, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL CA-630 und Protease-Inhibitoren (Sigma Co.) enthielt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen durch 10 s Ultrabeschallung aufgebrochen. Die Lysate wurden anschließend zentrifugiert, und die Überstände wurden auf 12% Polyacrylamidgel geladen und auf eine Nitrocellulosemembran übergeführt. Polyklonale Anti-GSTP1-1 (1:1000); Anti-c-Jun- und Anti-JNK (1:200)-Antikörper oder monoklonale Anti-Phosphor-aktivierte c-Jun- und JNK-Isoformen (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruy, CA); und β-Actin (1:5000; Sigma Co.) wurden als primäre Antikörper verwendet. β-Actin wurde als Ladungskontrolle verwendet.
Für die Immunpräzipitationsanalyse wurden die Pellets in Lysispuffer resuspendiert, und die Zellen wurden durch 10 s Ultrabeschallung aufgebrochen. Anschließend wurden die Lysate 15 min bei 4°C zentrifugiert. Die Proteine wurden in Lysispuffer 2 h bei 4°C mit Anti-JNK-Antikörper inkubiert. Die Immunkomplexe wurden 30 min bei 4°C mit Protein-A-Sepharose absorbiert. Nach drei Waschungen mit Lysispuffer wurden die Immunpellets in SDS-Probenpuffer gekocht. Die Proteine wurden auf 15% SDS-Polyacrylamid-Gel geladen und auf Nitrocellulose übergeführt. GST, JNK und Phospho-JNK wurden durch spezifische Antikörper nachgewiesen.
Ergebnisse 5 (A, B und C) zeigt die Western-Blot-Analysen von mit 10 μM bzw. 2 μM Derivat Nr. 2 behandelten K562- und CEM1.3-Zelllinien.
Die Western-Blot-Analyse zeigt die basalen und phosphorylierten Formen sowohl von JNK als auch c-Jun. In beiden Zelllinien ist Phospho-JNK nach einer halben Stunde Inkubation mit Derivat Nr. 2 eindeutig erhöht und bleibt bis zu 24 Stunden auf hohen Niveaus. Die Phosphor-Aktivierungsneigung von c-Jun in der K562-Zelllinie entspricht der Aktivierung von JNK; sie wird schnell nach einer halben Stunde Inkubation mit Derivat Nr. 2 nachgewiesen und bleibt bis zu 12 h (Bild A) auf hohen Niveaus. Die Phosphor-Aktivierung von c-Jun in der CEM1.3-Zelllinie folgt einer unterschiedlichen Neigung; nach einer halben Stunde nach der Derivat Nr. 2-Zugabe wird eine schnelle Zunahme von Phospho-C-Jun festgestellt, allerdings nimmt sie schnell ab und erreicht nach 12 h Behandlung den basalen Wert (Bild C).
Diese Messwerte legen nahe, dass die Apoptose-Induktion von der Aktivierung des JNK/c-Jun-Reaktionswegs abhängig ist, auch wenn die Modalität der Zellantwort unterschiedlich zu sein scheint. Insbesondere könnte eine Histo-Typ-abhängige Auslösung des Mitogenactiviertzen Protein-(MAP)-Kinase-Reaktionswegs vermutet werden.
Zur Bewertung, ob die Zellbehandlung mit dem Derivat Nr. 2 die Menge an GST-JNK-Komplex beeinflusst, wurden K562-Zelllysate mit einem Anti-JNK-Antikörper immunpräzipitiert und zur Western-Blot-Analyse verwendet. 5, Bild B, zeigt, dass die Menge an GSTP-1-1, das mit JNK co-präzipitiert, schnell in den mit Derivat Nr. 2 behandelten Zellen abnimmt und nur nach 3 h leicht zunimmt.
Somit tritt die Aktivierung des JNK/c-Jun-Reaktionswegs über die durch Derivat Nr. 2 getriggerte Dissoziation von GSTP1-1 aus dem GST-JNK-Komplex ein.
Durch das Vorgenannte lässt sich die folgende Schlussfolgerung ziehen. Als Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli, die oxidativen Stress auslösen, einschließlich UV-Bestrahlung und Antikrebs-Arzneimittel, ist die Aktivierung der MAP-Kinasefamilie zur Aktivierung von Genen und zur post-translationalen Modifikation von Proteinen notwendig, die zur Induktion der Apoptose notwendig sind. Abgesehen von der Redox-Aktivierung dieses Signalwegs verursacht die Zugabe der GSH-peptidomimentischen Verbindung (TER117) und ihres Diethylesters (TER199), ein spezifischer Inhibitor des GSTP1-1-Isoenzyms, eine Dissoziation des GSTP1-1-JNK-Komplexes, was zu einer JNK-Aktivierung führt. Die Aktivierung von JNK löst die Phosphorylierung des Substrats c-Jun aus, das die Transkription von an der Zellapoptose beteiligten Genen reguliert (J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, (2001), 1–6).
Gleichermaßen sind die erfindungsgemäßen 7-Nitrobenzofurazan-Derivate sehr wirksame GST-Inhibitoren, die die Zellen durch Auslösen der Dissoziation des GSTP1-1 von JNK auf Apoptose primen könnten. Es wurde gezeigt, dass sich das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 für die GSTs wie ein Suizidsubstrat verhält: Es ist mit GHS an der GST-aktiven Stelle konjugiert, führt zu einem σ-Addukt-Zwischenprodukt, welches das Enzym sehr stark hemmt (K_D = 4 × 10^–8 M mit GSTP1-1). Diese besondere Wechselwirkung legt nahe, dass GSTP1-1 für dieses Molekül ein sehr selektives Ziel ist. Im Inneren der Zelle löst das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 die Dissoziation des GSTP1-1 von JNK aus, was zu der Phosphor-Aktivierung sowohl von JNK als auch c-Jun führt. Das 7-Nitrobenzofurazan-Derivat Nr. 2 löst in K562- und CEM1.3-Zellen einen typischen Apoptoseprozess aus, der Zellschrumpfung, Phospholipid-Phosphatidyl-Serin-Translokation zur Zelloberfläche, Caspase-Aktivierung und Chromatin-Kondensation einschließt.
Test auf akute Toxizität in vivo
Der Test verwendete 25 weibliche Mäuse des BDF1-Maus-Stamms (18–20 g Charles River Lab. Lecco, Italien), eingeteilt in 5 Gruppen von jeweils 5 Mäusen. Drei Gruppen wurden mit einer einzigen Verabreichung durch intraperitoneale Injektion (i. p.) mit 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol in den folgenden Konzentrationen behandelt: a) 125 mg/kg, b) 25 mg/kg, c) 5 mg/kg. Die restlichen beiden Gruppen wurden als Kontrollen verwendet, und die folgenden Verabreichungen wurden beabsichtigt: d) ein Olivenölvehikel, enthaltend 2,5% DMSO und e) eine physiologische Lösung.
Die Mäuse wurden bis zu 15 Tagen überwacht, es wurde ihnen reichlich Futter und Wasser bereitgestellt, und die Gewichtschwankungen jeder Maus wurden dokumentiert. Der dokumentierte Gewichtstrend ist in dem als 6 beigefügten Diagramm angegeben, wilches zeigt, dass die Mäuse auch nach 15 Tagen Behandlung nur leichte Gewichtschwankungen aufwiesen. Ferner wurde das Gewicht jeder Mausleber und -milz überprüft, um zu sehen, ob es innerhalb der Norm blieb, was somit die fehlende Toxizität von 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol auch bei der maximalen verwendeten Konzentration (125 mg/kg) nahelegt.
Sämtliche erhaltenen Messwerte tragen zur Bestätigung bei, dass die beträchtliche cytotoxische Aktivität der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate auf Krebszellen auf der Hemmung der Detoxifizierung und der anti-apoptotischen Aktivität von GSTP1-1 beruht, und dass die Krebszellen das primäre Ziel dieser Verbindungen sind, da sie GSTP1-1 überexprimieren.
Die erfindungsgemäßen 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate finden somit eine vielversprechende mögliche Anwendung als Antikrebsmittel. Ferner können sie in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln verwendet werden, um die Arzneimittelresistenzwirkung, die in Patienten, die eine Chemotherapie gegen Krebs erfahren, gezeigt wird, zu verhindern, zu reduzieren oder zu beseitigen.

Claims

Verwendung von Derivaten von 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol der allgemeinen Formel (I)
wobei R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkenyl bis zu 12 Kohlenstoffatomen, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkinyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wobei ein Wasserstoffatom von R₁ gegebenenfalls mit einer Gruppe substituiert ist, die aus den Gruppen ausgewählt ist, die aus OR₂, NO₂, NR₂R₃ bestehen, wobei R₂ und R₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen und wobei die S-R₁-Gruppe keine gute Abgangsgruppe ist, zur Herstellung eines GST-hemmenden Medikaments zur Behandlung von Krebsformen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R₁ ein lineares oder verzweigtes Hydroxyalkyl mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei R₁ aus 4-Hydroxybutyl und 6-Hydroxyhexyl ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das 7-Nitro-2,1,3-benzoadiazol-Derivat einem der folgenden entspricht: 4-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)butanol 6-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol.
Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von Krebs, umfassend als Wirkstoff mindestens eines der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate der allgemeinen Formel (I) zusammen mit einem oder mehreren pharmakologisch verträglichen Adjuvantien und/oder Vehikeln.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5, umfassend in Kombination mit mindestens einem der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate der allgemeinen Formel (I) ein oder mehrere weitere chemotherapeutische Mittel.
Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von Krebs, die zur Verhinderung, Reduzierung oder Beseitigung von Arzneimittelresistenz geeignet ist, welche als Wirkstoff mindestens eines der 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-Derivate der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit einem oder mehreren anderen chemotherapeutischen Mitteln umfasst.