DE69924500T2 - Chinazolinderivate - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Signaltransduktoren und Aktivatoren der Transkription („Signal Transducers and Activators of Transcription", STATs) sind eine Familie DNA-bindender Proteine, die sich im Zytoplasma befinden, bis sie durch Tyrosinphosphorilierung aktiviert werden. Dieses Phosphorylierungsereignis wird durch Mitglieder der Janus-Familie von Tyrosinkinasen, einschließlich JAK3 katalysiert (Ihle, J. N., Adv. Immunol. 60: 1-35, 1995; Witthuhn, B. A., et al., Leukemia and Lymphoma 32: 289-297, 1999).
  • Die Doppelrolle der STATs als Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren spiegelt sich in ihrer Struktur wider. Alle STAT-Proteine enthalten eine DNA-bindende Domäne, eine SH2-Domäne und eine zur Transkriptionsinduktion notwendige Transaktivierungsdomäne. In unstimulierten Zellen befinden sich latente Formen von STATs vorwiegend im Zytoplasma. Durch Ligandenbindung werden STAT-Proteine veranlasst, sich mit ihren SH2-Domänen an die Tyrosinphosphorylierten Motive in den intrazellulären Domänen verschiedener Transmembran-Zelloberflächenrezeptoren zu binden (Horvath, C. M. und Darnell, J. E., Curr. Opin. Cell. Biol. 9(2): 233-239, 1997; Levy, D. E., Cytokine Growth Factor Rev. 8(1): 81-90, 1997).
  • Sobald STATs an Rezeptoren gebunden sind, phosphorylieren rezeptorassoziierte Janus-Kinasen (JAKs) STATs an einem einzelnen Tyrosin-Rest, welcher sich in den Nähe der SH2-Domäne befindet. Zwei STATs dimerisieren dann über spezifische, wechselseitige SH2-Phosphotyrosin-Interaktionen. Die dimerisierten STAT-Proteine können auch Komplexe mit anderen DNA-bindenden Proteinen bilden. Die STAT-Dimere/-Komplexe verlagern sich dann zum Nukleus und verwenden ihre DNA-bindende Domäne zur Interaktion mit DNA-Response-Elementen in Promotoren von Zielgenen (Demoulin, J. B., et al., Mol. Cell. Biol. 16: 4710-6, 1996). STATs interagieren dann direkt oder indirekt über ihre Transaktivierungsdomäne mit Komponenten des RNA-Polymerase II Komplexes, um die Transkription von Zielgenen zu aktivieren. Verschiedene Liganden verwenden spezifische Mitglieder der JAK- und STAT-Familien, so dass die Verwendung dieses Weges Signalkaskaden Spezifität verleiht, und zu einem vielfältigen Spektrum an zellulären Antworten beiträgt. Janus-Kinasen, einschließlich JAK3, werden reichlich in primären leukämischen Zellen von Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), der häufigsten Krebsform bei Kindern, exprimiert, und neuere Untersuchungen haben die Aktivierung von STATs in ALL-Zellen mit Signalen zur Regulierung der Apoptose in Zusammenhang gebracht (Demoulin, J. B., et al., Mol. Cell. Biol. 16: 4710-6, 1996; Jurlander, J., et al., Blood 89: 4146-52, 1997; Kaneko, S., Suzuki, et al., Clin. Exp. Immun. 109: 185-193, 1997; und Nakamura, N., et al., J. Biol. Chem. 271: 19483-8, 1996).
  • Daher ist JAK-3 ein wichtiges Enzym, das eine essentielle Rolle bei der Funktion von Lymphozyten, Macrophagen und Mastzellen spielt. Es wäre zu erwarten, dass Verbindungen, die JAK-3 inhibieren, nützlich bei der Behandlung oder Prävention von Erkrankungen oder Zuständen sind, welche die Funktion von Lymphozyten, Macrophagen oder Mastzellen implizieren, wie Leukämie, Lymphome, Transplantatabstoßung (z.B. Abstoßung von Pankreasinsel-Transplantaten), Anwendungen von Knochenmarkstransplantationen (z.B. Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit), Autoimmunerkrankungen (z.B. Diabetes), und Entzündungen (z.B. Asthma, Entzündungen in Zusammenhang mit Sonnenbrand, und Hautkrebs). Es besteht anhaltender Bedarf an Verbindungen und Verfahren, welche nützlich bei der Behandlung und/oder Prävention derartiger Zustände und Erkrankungen sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Behandlung oder Prävention einer Transplantatabstoßung bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Prävention oder Herabsetzung einer durch UVB-Strahlung induzierten entzündlichen Reaktion bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Inhibierung der Freisetzung von Prostaglandin E2 bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Hautödem oder Änderungen der Gefäßdurchlässigkeit bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Schaden an Epithelzellen oder der Mutationshäufigkeit in der Haut bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zum Schutz eines Säugetiers vor den Tumor-erzeugenden Wirkungen von UVB-Licht ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Vermittlung der T-Zellaktivität bei einem Säugetier ist.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines JAK-3-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments, welches nützlich zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Säugetier ist.
  • Es hat sich auch herausgestellt, dass erfindungsgemäße JAK-3-Inhibitoren eine signifikante proliferierungshemmende Aktivität gegenüber T-Zellen zeigen, und die IL-2-abhängige Zellproliferation hemmen. Daher können die Verbindungen zur Behandlung oder Prävention von Transplantationskomplikationen (z.B. der Abstoßung von Spenderorganen durch das Immunsystem des Wirtes) und Komplikationen in Zusammenhang mit Knochenmarkstransplantationen wie der Ausbildung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit („graft versus host disease", GVHD) verwendet werden.
  • Nützliche JAK-3-Inhibitoren gemäß der Erfindung sind gewählt aus:
    4-(4'-Hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin
    4-(3'-Hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin
    4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin
    4-(3'-Brom-4'-hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin
    oder pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
  • Ein weiterer nützlicher, spezifischer JAK-3-Inhibitor gemäß der Erfindung ist eine Verbindung der Formel:
    Figure 00040001
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1. [A] Modell von JAK3, welches die molekulare Oberfläche des Proteins (blau) und das katalytische (ATP-bindende) Zentrum (gelb) zeigt. [B] Banddarstellung (Cα-Rückgrat) des Homologiemodells der JAK3-Kinase-Domäne. Das WHI-P131-Molekül ist als Kalottenmodell im katalytischen Zentrum von JAK3 gezeigt. [C] Nahansicht des katalytischen Zentrums des JAK3-Modells mit angekoppeltem Chinazolin-Inhibitor WHI-P131 (grün). Reste und Inhibitor sind als Kalottenmodell gezeigt. Die lösungsmittelexponierte Öffnung des katalytischen Zentrums besitzt Abmessungen, die es einem relativ planaren Inhibitor erlauben, einzudringen und an JAK3 zu binden. Die Öffnung der Tasche ist durch die Reste Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 und Tyr904 definiert (blaue Reste). Die entfernt liegende Wand tief in der Tasche ist von Leu905 (Ca-Rückgrat), Glu903, Met902, Lys905 und Asp967 ausgekleidet (rosa Reste), und der Grund der Tasche ist von Leu905 (Seitenkette), Val884, Leu956 und Ala966 ausgekleidet (gelbe Reste). Die Reste, welche die Decke der Tasche definieren, schließen Leu828, Gly829, Lys830 und Gly831 ein (obere blaue Reste). Erstellt mit dem Programm InsightII.
  • 2. [A] Modell des unbesetzten Raums im katalytischen (ATP-bindenden) Zentrum eines JAK3-Homologiemodells. In Grün sind die Bindungsstelle für ATP und die wahrscheinlichste Bindungsstelle für Dimethoxychinazolin-Inhibitoren gezeigt. Die grün dargestellte Region des aktiven Zentrums der Kinase entspricht einem Gesamtvolumen von ca. 530 Å3. Modellierungsstudien haben gezeigt, dass ein Inhibitor oder ein Teil eines Inhibitors mit signifikanter Bindung an diese Region ein Volumen von weniger als 530 Å3 belegen würde und mit der Form der Bindungsstelle kompatible molekulare Abmessungen besitzen würde. Andere Regionen in der Nähe der Bindungsstelle, die messbares unbesetztes Volumen zeigen, sind in Königsblau, Rosa, Gelb und Hellblau gezeigt. Diese Bindungsstellen sind entweder nicht zugänglich für Inhibitormoleküle (königsblau) oder repräsentieren Regionen, die gerade groß genug sind, um Lösungsmittelmoleküle aufzunehmen (rosa, gelb, hellblau). Ein Modell von WHI-P131 – an das katalytische Zentrum angekoppelt – ist in Weiß, der grünen Region überlagert gezeigt. [B] Modell des katalytischen Zentrums von JAK3 mit den Chinazolinen WHI-P131 (mehrfarbig), WHI-132 (rosa) und WHI-P154 (gelb). Jede der Verbindungen passt in die Bindungsstelle, aber WHI-P132 (von dem in biologischen Assays gezeigt wurde, dass es inaktiv gegenüber JAK3 ist) fehlt eine OH-Gruppe, die so positioniert ist, dass sie mit Asp967 binden kann. WN1-P131 und WN1-P154, mit OH-Gruppen an der C4'-Position des Phenylrings, sind in der Lage, eine günstige Interaktion mit Asp967 von JAK3 auszubilden, was zu ihrer gesteigerten Hemmungsaktivität beitragen kann. [C] Eigenschaften von Dimethoxychinazolin-Derivaten, von denen vorhergesagt wird, dass sie bei der Bindung an das katalytische Zentrum von JAK3 helfen.
  • 3. [A] Strukturvergleich nichtkonservierter Reste im katalytischen Zentrum von 5 verschiedenen Proteintyrosinkinasen: JAK3 (rosa), BTK (rot), SYK (hellblau), IRK (dunkelblau) und HCK (gelb). Reste innerhalb von 5 Å des angekoppelten JAK3-Inhibitors WHI-P131 (weiß) sind als stabförmige Seitenketten gezeigt. Das Ca-Rückgrat von JAK3 ist als perspektivische Hilfe in Form dünner rosafarbener Linie gezeigt. Die Regionen A bis F entsprechen Bereichen, welche nichtkonservierte Reste im katalytischen Zentrum enthalten (siehe B, sowie Ergebnisse und Diskussion). Kristallstrukturkoordinaten von HCK und IRK sowie Homologiemodelle von JAK3, BTK und SYK wurden zur Strukturanalyse verwendet. [B] Nichtkonservierte Reste in den katalytischen Zentren von 8 verschiedenen Tyrosinkinasen. Die Regionen A bis F beziehen sich auf Stellen des katalytischen Zentrums, welche in A dargestellt sind.
  • 4. Effekte von WHI-P131 auf die Tyrosinkinaseaktivität von JAK3. [A] – [D] JAK3, JAK1 und JAK2, immunpräzipitiert aus mit den geeigneten Baculovirus-Expressionsvektoren transfizierten Sf21-Insekten-Ovarzellen, wurden mit WHI-P131 behandelt, und dann in vitro Kinaseassays unterzogen, wie unter Methoden beschrieben. Die enzymatische Aktivität der JAKs wurde durch Messung der Autophosphorylierung in einem 10 min Kinaseassay bestimmt, wie unter Methoden beschrieben. Das Niveau der Kinaseaktivitäten (KA) wurde als prozentualer Anteil der Grundaktivität (%KON) ausgedrückt. [E] EMSAs von 32Dc22-IL-2Rß-Zellen. WH1-P131 (10 μg/ml = 33,6 μM) und WHI-P154 (10 μg/ml = 26,6 μM) (aber nicht WH1-P132; 10 μg/ml = 33,6 μM) hemmten IL-2-ausgelöste JAK3-abhängige STAT-Aktivierung, aber nicht die IL-3-ausgelöste JAK1/JAK2-anhängige STAT-Aktivierung bei 32Dc11-IL-2Rβ-Zellen.
  • 5. Spezifität von WHI-P131. JAK3, SYK und BTK, immunpräzipitiert aus mit den geeigneten Baculovirus-Expressionsvektoren transfizierten Sf21-Insekten-Ovarzellen, LYN, immunpräzipitiert aus menschlichen NALM-6 ALL-Zellen der B-Linie, und IRK, immunpräzipitiert aus HepG2 Hepatomzellen, wurden mit WHI-P131 behandelt und dann in vitro Kinaseassays wie unter Methoden beschrieben unterzogen.
  • 6. WHI-P131 depolarisiert mitochondriale Membranen auf konzentrationsabhängige Weise ohne die Mitochondrienmasse zu beeinflussen. Menschliche NALM-6 Leukämiezellen wurden für 48 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von WHI-P131 inkubiert, mit DiIC1 gefärbt, um das mitochondriale Membranpotential (Δψm) zu bewerten, oder mit NAO gefärbt, um die Mitochondrienmasse zu bestimmen, und dann mit einem Cell Sorter analysiert, welcher mit einem HeNe-Laser ausgestattet war. WHI-P131 verursachte mit zunehmenden Konzentrationen eine fortschreitende Zunahme an depolarisierten Mitochondrien (wie durch M1 in A dargestellt). Bei entsprechenden Konzentrationen wurde keine signifikante Änderung der Mitochondrienmasse [B] festgestellt. [C]: Zellen wurden zur gleichzeitigen Analyse der Mitochondrienmasse (grüne Fluoreszenz) und des mitochondrialen Transmembranpotentials (rote/orangefarbene Fluoreszenz) mit JC-1 gefärbt. Unbehandelte NALM-6-Zellen [D.1] sowie für 24 h mit 50 μM WHI-P131 behandelte NALM-6-Zellen [D.2] wurden mit JC-1 inkubiert und durch konfokale Laserscanningmikroskopie analysiert. Mitochondrien von Kontrollzellen zeigten ein höheres Membranpotential (Δψm), wie durch eine hellere rote JC-1-Fluoreszenz angezeigt wurde. Behandlung von Zellen mit WH1-P131 reduzierte das mitochondriale Membran Δψm, wie durch eine deutlichen Abnahme der roten JC-1-Fluoreszenz angezeigt wurde.
  • 7. Inhibierender Effekt der Verbindung 6 auf die UVB-induzierte Hautdicke bei skh-1-Mäusen. Weibliche skh-1-Mäuse wurden vor jeder Bestrahlung mit UVB-Licht (35 mj/cm2) topisch mit 1 mg/cm2 der Verbindung 6 behandelt. Die Hautfaltendicke jeder Maus wurde zweimal wöchentlich aufgezeichnet und das Mittel der beiden Messungen wurde bei Berechnungen verwendet. Die Daten repräsentieren das Mittel +/- SEM (n = 5-14). * P ≤ 0,05 und ** P ≤ 0,005 im Vergleich zu trägersubstanzbehandelten Kontrollen.
  • 8. Inhibierender Effekt der Verbindung 6 auf die mittlere Anzahl an Läsionen pro Maus. Weibliche skh-1-Mäuse wurden vor jeder Bestrahlung mit UVB-Licht (35 mj/cm2) topisch mit 1 mg/cm2 der Verbindung 6 behandelt. Die Anzahl der Läsionen wurde zweimal wöchentlich aufgezeichnet und das Mittel der beiden Messungen wurde bei Berechnungen verwendet. Die Daten repräsentieren das Mittel +/- SEM (n = 5-14). * P ≤ 0,05 im Vergleich zu trägersubstanzbehandelten Kontrollen.
  • 9. Inhibierender Effekt der Verbindung 6 auf das mittlere Volumen der Läsionen pro Maus. Weibliche skh-1-Mäuse wurden vor jeder Bestrahlung mit UVB-Licht (35 mj/cm2) topisch mit 1 mg/cm2 der Verbindung 6 behandelt. Die Läsionen, welche einen Durchmesser größer oder gleich 1 mm besaßen, wurden zweimal pro Woche gemessen und aufgezeichnet und ein Mittel der beiden Messungen wurde bei Berechnungen verwendet. Das Läsionsvolumen wurde unter Verwendung der in Material und Methoden beschriebenen Formel berechnet. Die Daten repräsentieren das Mittel +/- SEM (n = 5-14). * P ≤ 0,05 im Vergleich zu trägersubstanzbehandelten Kontrollen.
  • 10. Morphologische Erscheinung der dorsalen Oberfläche von Mäusen nach 20 Wochen UVB-Bestrahlung. Weibliche skh-1-Mäuse wurden vor jeder Bestrahlung mit UVB-Licht (35 mj/cm2) topisch mit 1 mg/cm2 der Verbindung 6 behandelt. Die Mäuse wurden dreimal pro Woche für insgesamt 20 Wochen bestrahlt. Nach 20 Wochen wurden die Mäuse betäubt, und ein Bild ihrer dorsalen Oberfläche wurde aufgenommen. Tafel A, unbestrahlte trägersubstanzbehandelte Kontrolle. Tafel B, UVB-bestrahlte trägersubstanzbehandelte Maus. Tafel C, UVB-bestrahlte und mit Verbindung 6 behandelte Maus. Vergrößerung 2X.
  • 11. Verbindung 6 hemmt die UVB-induzierte PGE2-Synthese. HaCaT-Zellkulturen wurden entweder mit UVB bestrahlt (25 mj/cm2) oder scheinbestrahlt. Verbindung 6 (3-30 (M) wurde 60 min vor der Bestrahlung zugegeben und nach der UVB-Exposition erneut zugegeben. Das kumulierte während der darauffolgenden sechsstündigen Inkubation freigesetzte PGE2 wurde durch EIA bestimmt. Die Daten repräsentieren das Mittel (SEM (n = 3).
  • 12. Verbindung 6 hemmt die EGF-stimulierte PGE2-Freisetzung in epidermalen Zellen. 50 ng/ml EGF wurden verwendet, um konfluente HaCaT-Zellkulturen sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart der Verbindung 6 zu stimulieren und die Zellen wurden für 6h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde der Überstand gesammelt und das während der Inkubation freigesetzte PGE2 wurde durch EIA bestimmt. Die Daten repräsentieren das Mittel (SEM (n = 5).
  • 13. Effekt der Verbindung 6 auf die Hautfaltendicke von skh-1-Mäusen nach Verletzung durch UVB-Licht. Skh-1-Mäuse wurden mit der Verbindung 6 (16 mg/kg; i.p. Bolusinjektion) für 2 Tage vorbehandelt. Am Tag der UVB-Bestrahlung wurden die Mäuse betäubt, 15 Minuten vor der UVB-Exposition auf der dorsalen Oberfläche mit 1,5 mg/cm2 der Verbindung 6 bestrichen und mit UVB-Licht (250 mj/cm2) bestrahlt. Die Hautfaltendicke wurde an den Tagen 1 bis 5 nach der Bestrahlung gemessen. Die Daten sind als Mittel dargestellt (SEM (n = 5-34).
  • 14. Hemmung der UVB-induzierten Plasma-Exsudation in der Haut von skh-1-Mäusen. Die Plasma-Exsudation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten nach UVB-Exposition (250 mj/cm2) bewertet, indem die Extinktion von Evansblau in Hautextrakten nach der in Material und Methoden beschriebenen Methode gemessen wurde. Die Daten repräsentieren das Mittel (SEM (n = 5-17).
  • 15. Effekt der Verbindung 6 auf die Hautmorphologie am 4. Tag nach UVB-Bestrahlung. Skh-1-Mäuse wurden mit der Verbindung 6 (16 mg/kg; i.p. Bolusinjektion) für 2 Tage vorbehandelt, 15 Minuten vor der UVB-Exposition auf der dorsalen Oberfläche mit 1,5 mg/cm2 der Verbindung 6 bestrichen und mit UVB-Licht (250 mj/cm2) bestrahlt. Am 4. Tag wurden die Mäuse betäubt und ein Bild ihrer dorsalen Oberfläche wurde aufgenommen. Vergrößerung 2X.
  • 16. Hemmung UVB-induzierter histologischer Veränderungen in der Haut von skh-1-Mäusen durch die Verbindung 6. Mäuse wurden gemäß dem in der Legende zu 3 beschriebenen Verfahren mit Wirkstoff behandelt und UVB-exponiert (250 mj/cm2). 48 Stunden nach der Bestrahlung wurden die Mäuse getötet, Hautproben wurde entnommen und Paraffinschnitte der Gewebe wurden mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. (a) Kontrolle, (b) UVB (25 mj/cm2) und (c) Verbindung 6 + UVB (250 mj/cm2). Vergrößerung 40X.
  • 17. Apoptose epidermaler Zellen in UVB-bestrahlter Haut von skh-1-Mäusen und deren Hemmung durch Verbindung 6. Hautproben von den bestrahlten und scheinbestrahlten Mäusen mit oder ohne Wirkstoffbehandlung wurden 48 Stunden nach UVB-Bestrahlung entnommen und die erhaltenen Paraffinschnitte wurden auf apoptotische Zellen hin angefärbt. Die Abbildung zeigt Bilder, welche mit einem konfokalen Mikroskop bei 60-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Grüne Färbung im Bild zeigt apoptotische Zellen an.
  • 18. Dosis-abhängige Suppression von MLR (A), PHA-induzierter (B) und ConA-induzierter (C) Proliferation von Splenozyten durch WHI-P131. WHI-131 wurde in Konzentrationen von 0,1, 1,0, 10 und 50 μl/ml während der 5-tägigen (MLR) oder 3-tägigen Kultivierungsperiode (PHA und ConA) zugegeben. Die Proliferation wurde durch kolorimetrischen WST-1-Assay gemessen. Die Ergebnisse sind als mittlere OD +/- SEM von 3-7 separaten Experimenten gezeigt. Die statistische Differenz zwischen den Gruppen wurde durch den Student's-t-Test analysiert.
  • 19. Durchflußzytometrie-Analysen des prozentualen Anteils apoptotischer Splenozyten (TUNEL-positiv), die nach der 24-stündigen Kultivierungsperiode mit Zugabe von 0,1, 1, 10, und 100 μg/ml WN1-P131 erhalten wurden. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt. Die statistische Differenz zwischen den Gruppen wurde durch den Student's-t-Test analysiert.
  • 20. Der prophylaktische in vivo Effekt der WHI-P131-Verabreichung auf GVHD, induziert über die Haupthistokompatibilitäts-Barriere in C57BL6 (N-2b) Empfängern mit BALB/c (H-2d) BM/Splenozyten-Transplantaten. Bestrahlten Empfängern (7,5 Gy) wurden BM und Splenozyten (jeweils 25 × 106) gegeben. Manche Empfänger erhielten syngenetische BM, während andere täglich mit 25 mg/kg WHI-P131, 50 mg/kg WHI-P132, 3 mg/kg Cyclosporin A, 10 mg/m2 Methotrexat oder einer Trägersubstanzkontrolle behandelt wurden, wie im Abschnitt Material und Methoden beschrieben. Differenzen in der Überlebensrate zwischen den Gruppen wurden durch die Sterblichkeitstabellen-Analyse, Mantel-Cox-Test analysiert.
  • 21. Der prophylaktische in vivo Effekt der Verabreichung der in 23 gezeigten Wirkstoffkombinationen auf GVHD, induziert über die Haupthistokompatibilitäts-Barriere in C57BL6 (H-2b) Empfängern mit BALB/c (H-2d) BM/Splenozyten-Transplantaten. WHI-P131 (25 mg/kg), Cyclosporin A (3 mg/kg) oder eine Kombination von Cyclosporin A und WHI-P131 (A) wurden i.p. verabreicht. Differenzen in der Überlebensrate zwischen den Gruppen wurden durch die Sterblichkeitstabellen-Analyse, Mantel-Cox-Test analysiert.
  • 22. Der prophylaktische in vivo Effekt der Verabreichung der in 23 gezeigten Wirkstoffkombinationen auf GVHD, induziert über die Haupthistokompatibilitäts-Barriere in C57BL6 (H-2b) Empfängern mit BALB/c (H-2d) BM/Splenozyten-Transplantaten. WHI-P131 (25 mg/kg) und WHI-P131 und Methotrexat (10 mg/m2) oder eine Kombination von Methotrexat und WHI-P131 wurden i.p. verabreicht. Differenzen in der Überlebensrate zwischen den Gruppen wurden durch die Sterblichkeitstabellen-Analyse, Mantel-Cox-Test analysiert.
  • 23. Zeigt die Effekte der Verbindung 6 (60 mg/kg/Tag) auf die GVHD-Entwicklung.
  • 24. Kumulative Diabeteshäufigkeit (A) bei LDSTZ-behandelten Jak3-Mangel- und Wildtyp-(WT)-Männchen, welche während der Experimentdauer von 25 Tagen nach der Verabreichung der ersten STZ-Injektion untersucht wurden. Die statistische Differenz wurde durch Sterblichkeitstabellen-Analyse erhalten.
  • 25. Blutzuckerspiegel (mg/dl) (B) bei LDSTZ-behandelten Jak3-Mangel- und Wildtyp-(WT)-Männchen, welche während der Experimentdauer von 25 Tagen nach der Verabreichung der ersten STZ-Injektion untersucht wurden. Die statistische Differenz wurde durch ANOVA erhalten.
  • 26. Kumulative Diabeteshäufigkeit (A) bei LDSTZ-behandelten C57BL/6-Männchen, welche während der Experimentdauer von 25 Tagen nach der Verabreichung der ersten STZ-Injektion untersucht wurden. Die statistische Differenz wurde durch Sterblichkeitstabellen-Analyse (Mantel-Cox-Test) erhalten.
  • 27. Blutzuckerspiegel (mg/dl) bei LDSTZ-behandelten C57BL/6-Männchen, welche während der Experimentdauer von 25 Tagen nach der Verabreichung der ersten STZ-Injektion untersucht wurden. Die statistische Differenz wurde durch ANOVA erhalten.
  • 28. Diabeteshäufigkeit bei NOD-Weibchen, die von der 5. bis zur 25. Alterswoche mit 20 und 50 mg/kg WHI-P131 behandelt wurden (A). Statistisch signifikante Differenzen zwischen WHI-P131-behandelten und Kontrollmäusen wurden durch Sterblichkeitstabellen-Analyse (Mantel-Cox-Test) erhalten.
  • 29. Diabeteshäufigkeit bei NOD-Weibchen, die von der 5. oder 10. bis zur 25. Alterswoche mit 100 mg/kg WN1-P131 behandelt wurden; Statistisch signifikante Differenzen zwischen WHI-P131-behandelten und Kontrollmäusen wurden durch Sterblichkeitstabellen-Analyse (Mantel-Cox-Test) erhalten.
  • 30. IPGTT-Test, an C57BL/6-Weibchen (20 Wochen alt), nichtdiabetischen Kontroll-NOD-Weibchen (25 Wochen alt) und NOD-Weibchen (25 Wochen alt) durchgeführt, die für 15 oder 20 Wochen mit 100 mg/kg WHI-P131 behandelt wurden; Statistisch signifikante Differenzen wurden durch den Student's-t-Test erhalten: *, **, ***, **** p < 0,05, 0,01, 0,005 und 0,0001 jeweils im Vergleich zu NOD-Trägersubstanz-Kontrollgruppen.
  • 31. Verzögerter adoptiver Transfer von Diabetes in NOD-scid-Weibchen durch WHI-P131-Behandlung. NOD-scid-Weibchen wurden 10 × 106 diabetische Splenozyten übertragen, und sie wurden täglich bis zum Diabetes-Ausbruch i.p. mit 50 mg/kg WHI-P131 behandelt. Statistisch signifikante Differenzen wurden durch Sterblichkeitstabellen-Analyse (Mantel-Cox-Test) erhalten.
  • 32. Jak3-I--Mäuse stoßen Insel-Allotransplantat nicht ab (A); Hämatoxilin- und Eosin- (B) und Immunfärbung auf Insulin (C) allogener Inseltransplantate, die unter die Nierenkapsel diabetischer Jak3-I- Empfänger transplantiert wurden, welche 100 Tage nach der Transplantierung getötet wurden. Die Daten sind repräsentativ für >30 Schnitte/Transplantat und 6 Mäuse/Gruppe; x10
  • 33. WHI-P131 unterdrückt die MLR-Reaktion. Antwortgeber-Splenozyten (4 × 106/ml) wurden mit Stimulator-Splenozyten (1,6 × 106/ml) gemischt und Wirkstoffe wurden in Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 50 g/ml während der 5-tägigen Kultivierungsperiode zugegeben. Die Proliferation wurde durch kolorimetrischen WST-1-Assay gemessen. Die Ergebnisse sind als mittlere OD +/- SEM von 6 getrennten Experimenten dargestellt. p = 0,0095 im Vergleich zu der Proliferation von Kontrollzellen, die nicht WHI-P131-exponiert waren.
  • 34. Durchflußzytometrie-Analysen von apoptotischen Splenozyten (TUNEL-positiv). TUNEL-Färbung wurden nach 20-stündiger Inkubierung von Splenozyten (1,5 × 106) mit 0,1, 1, 10, und 100 μg/ml WHI-P131 durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt. Die statistische Differenz zwischen den Gruppen wurde durch den Student's-t-Test analysiert.
  • 35. Effekt der WHI-P131- (50 und 75 mg/kg), WHI-P132-(50 mg/kg) und Cyclosporin A-Behandlung (20 mg/kg) auf das Überleben allogener Inseltransplantate. Die p-Werte wurden durch Sterblichkeitstabellen-Analyse (Mantel-Cox-Test) erhalten.
  • 36. Durchflußzytometrie-Analysen von C57BL/6-Splenozyten nach Behandlung mit 130 mg/kg WHI-P131 für 10 Tage. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt. Die statistische Differenz zwischen den Gruppen wurde durch den Student's-t-Test analysiert.
  • 37. Nichtnüchtern-Blutzucker (mg/dl) bei Empfängern syngenetischer Inseltransplantate, welche während des Zeitraums von 180 Tagen nach der Transplantation mit 50 mg/kg/Tag WHI-P131 oder einer Trägersubstanzkontrolle behandelt wurden (A). Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SD dargestellt.
  • 38. IPGTT derselben Empfänger wie in 39 und nicht-transplantierter Kontrollmäuse, am Tag 70 (B) nach der Transplantation nach der Hungerperiode von 8 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt (B, C).
  • 39. IPGTT derselben Empfänger wie in 39 und nicht-transplantierter Kontrollmäuse, am Tag 180 (C) nach der Transplantation nach der Hungerperiode von 8 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es wird den mit dem Handwerk Vertrauten erkennbar sein, dass erfindungsgemäße Verbindungen, die ein Chiralitätszentrum besitzen, in optisch aktiven und racemischen Formen vorkommen und isoliert werden können. Manche Verbindungen können Polymorphismus zeigen. Es sollte verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung jegliche racemische, optisch aktive, polymorphe oder stereoisomere Form einer erfindungsgemäßen Verbindung oder Mischungen daraus einschließt, welche die hierin beschriebenen nützlichen Eigenschaften besitzt, wobei es im Handwerk wohlbekannt ist, wie optisch aktive Formen hergestellt werden können (z.B. durch Trennung der racemischen Form durch Umkristallisierungstechniken, durch Synthese aus optisch aktiven Ausgangsmaterialien, durch chirale Synthese, oder durch chromatographische Auftrennung unter Verwendung einer chiralen stationären Phase) und wie die Prostaglandin E2 Inhibierungsaktivität unter Verwendung der hierin beschriebenen Standardtests, oder anderer ähnlicher Tests, welche im Handwerk wohlbekannt sind, bestimmt werden kann.
  • Nützliche erfindungsgemäße Verbindungen sind gewählt aus:
    4-(4'-Hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin WHI-P131; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon,
    4-(3'-Hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin WHI-P180; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon,
    4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin WHI-P97; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon,
    4-(3'-Brom-4'-hydroxyl-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinalozin WHI-P154; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, oder
  • Figure 00150001
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert und einem Säugetierwirt, wie einem menschlichen Patienten in einer Vielzahl von Formen, welche an den gewählten Verabreichungsweg angepasst sind, verabreicht werden, d.h. oral oder parenteral, durch intravenöse, intramuskuläre, topische oder subkutane Wege.
  • Daher können die Substanzen in Kombination mit einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz, wie einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren essbaren Träger, systemisch verabreicht werden, z.B. oral. Sie können in Gelatinkapseln mit harter oder weicher Hülle eingeschlossen, in Tabletten gepresst oder direkt mit der Nahrung des Patienten aufgenommen werden. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die Substanz mit einem oder mehreren Trägerstoffen kombiniert und in Form einnehmbarer Tabletten, Buccaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und derartigem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Aufbereitungen sollten wenigstens 0,1 % der Substanz enthalten. Der prozentuale Anteil der Zusammensetzungen und Aufbereitungen kann natürlich variiert werden und kann geeignet zwischen 2 und etwa 60% des Gewichts einer gegebenen Dosierungseinheit liegen. Die Substanzmenge in derartigen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass eine effektives Dosierungsniveau erreicht wird.
  • Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und derartiges können auch folgendes enthalten: Bindemittel wie Traganthgummi, Gummiarabicum, Maisstärke oder Gelatine; Trägerstoffe wie Dicalciumphosphat; ein Zerfallmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und derartiges; ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat; und einen Süßstoff wie Saccharose, Fruktose, Laktose oder Aspartam oder einen Aromastoff wie Pfefferminze, Wintergrünöl oder Kirscharoma können zugegeben werden. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obengenannten Typs ein flüssiges Trägermittel wie pflanzliches Öl oder ein Polyethylenglykol enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen oder zur anderweitigen Modifizierung der physischen Form der festen Dosierungseinheiten vorhanden sein. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Gelatine, Wachs, Schellack oder Zucker und derartigem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elexir kann die aktive Verbindung, Saccharose oder Fruktose als Süßstoff, Methyl und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und Aromastoffe wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Selbstverständlich sollte jedes Material, das bei der Herstellung jeglicher Dosierungseinheit verwendet wird, pharmazeutisch akzeptabel und im wesentlichen nichttoxisch in den verwendeten Mengen sein. Zusätzlich kann die Substanz in Präparationen und Vorrichtungen zur verzögerten Freisetzung eingebracht werden.
  • Die Substanz kann auch intravenös oder intraperitoneal durch Infusion oder Injektion verabreicht werden. Lösungen der Substanz können in Wasser, optional mit einer nichttoxischen oberflächenaktiven Verbindung gemischt, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglykolen, Triacetin und Mischungen daraus und in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lager- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
  • Die zur Injektion oder Infusion geeigneten pharmazeutischen Dosierungsformen können sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen oder sterile Pulver einschließen, welche die Substanz umfassen, und die zur unvorbereiteten Herstellung steriler injizierbarer oder infusierbarer Lösungen oder Dispersionen angepasst sind, optional in Liposomen verkapselt. In jedem Fall muss die endgültige Dosierungsform steril, flüssig und unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein. Der flüssiger Träger oder die Trägersubstanz kann ein Lösungsmittel oder ein flüssiges Dispersionsmittel sein, umfassend z.B. Wasser, Ethanol, ein Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol, flüssige Polyethylenglykole und derartiges), pflanzliche Öle, nichttoxische Glycerylester und geeignete Mischungen davon. Die geeignete Fluidität kann z.B. durch die Bildung von Liposomen, im Falle von Dispersionen durch das Aufrechterhalten der benötigten Partikelgröße oder durch die Verwendung von oberflächenaktiven Verbindungen aufrechterhalten werden. Die Vorbeugung gegen die Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Wirkstoffe, wie z.B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und derartiges bewirkt werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, isotonische Wirkstoffe, wie z.B. Zucker, Puffer oder Natriumchlorid einzubeziehen.
  • Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von absorptionsverzögernden Wirkstoffen, wie z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen bewirkt werden.
  • Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen der Substanz in der benötigten Menge, je nach Bedarf zusammen mit verschiedenen der anderen oben aufgezählten Inhaltsstoffe, in das geeignete Lösungsmittel gefolgt von Sterilfiltration hergestellt. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknen und die Gefriertrocknungstechniken, welche ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs zusammen mit jedem weiteren gewünschten Inhaltsstoff, der in den zuvor sterilfiltrierten Lösungen vorhanden war, ergeben.
  • Zur topischen Verabreichung können die Substanzen in Reinform appliziert werden, d.h. sofern sie Flüssigkeiten sind. Es wird jedoch im Allgemeinen wünschenswert sein, sie als Zusammensetzungen oder Formulierungen in Kombination mit einem dermatologisch akzeptablen Träger, welcher ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein kann, auf die Haut aufzubringen.
  • Nützliche feste Träger schließen fein verteilte Feststoffe wie Talkum, Ton, mikrokristalline Zellulose, Silika, Tonerde und derartiges ein. Nützliche flüssige Träger schließen Wasser, Alkohole oder Glykole und Wasser-Alkohol/Glykol-Mischungen ein, in denen die Substanzen in effektiven Mengen gelöst oder dispergiert werden können, optional mit Hilfe nichttoxischer oberflächenaktiver Verbindungen. Hilfsmittel wie Aromastoffe und zusätzliche antimikrobielle Wirkstoffe können zugegeben werden, um die Eigenschaften für eine gegebene Anwendung zu optimieren. Die resultierenden flüssigen Zusammensetzungen können aus saugfähigen Pads aufgebracht, zur Imprägnierung von Bandagen und anderen Verbandstoffen verwendet oder unter Verwendung von Pump- oder Aerosolsprühern auf den betroffenen Bereich aufgesprüht werden.
  • Verdickungsmittel wie synthetische Polymere, Fettsäuren, Fettsäuresalze und Ester, Fettalkohole, modifizierte Zellulosen oder modifizierte mineralische Materialen können ebenfalls zusammen mit flüssigen Trägern verwendet werden, um verstreichbare Pasten, Gele, Salben, Seifen und derartiges zur direkten Applikation auf die Haut des Anwenders herzustellen.
  • Beispiele nützlicher dermatologischer Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, um die Substanzen der Haut zuzuführen, sind im Handwerk bekannt; Siehe zum Beispiel Jacquet et al. (U.S. Pat. Nr. 4.608.392), Geria (U.S. Pat. Nr. 4.992.478), Smith et al. (U.S. Pat. Nr. 4.559.157) und Wortzman (U.S. Pat. Nr. 4.820.508).
  • Nützliche Dosierungen der in der Erfindung verwendeten Verbindungen können durch Vergleichen ihrer in vitro-Aktivität und in vivo-Aktivität in Tiermodellen bestimmt werden. Verfahren zum Extrapolieren effektiver Dosierungen bei Mäusen und anderen Tieren auf Menschen sind im Handwerk bekannt; Siehe z.B. U.S. Pat. Nr. 4.938.949.
  • Im Allgemeinen wird die Konzentration der Substanz in einer flüssigen Zusammensetzung wie einer Lotion von etwa 0,1-25 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,5-10 Gew.-% betragen. Die Konzentration in einer halbfesten oder festen Zusammensetzung wie einem Gel oder einem Pulver wird etwa 0,1-5 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,5-2,5 Gew.-% betragen.
  • Die Menge der bei einer Behandlung notwendigen Substanz wird nicht nur mit dem jeweiligen ausgewählten Salz, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Art des zu behandelnden Zustands und dem Alter und Zustand des Patienten variieren, und wird letztendlich im Ermessen des zuständigen Mediziners oder Arztes liegen.
  • Im Allgemeinen wird eine geeignete Dosis jedoch im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg, z. B. von etwa 10 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag, wie 3 bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 6 bis 90 mg/kg/Tag, besonders bevorzugt im Bereich von 15 bis 60 mg/kg/Tag liegen.
  • Die Substanz wird geeignet in Dosierungseinheiten verabreicht; enthaltend zum Beispiel 5 bis 1000 mg, geeignet 10 bis 750 mg, besonders geeignet 50 bis 500 mg des aktiven Inhaltsstoffs pro Dosierungseinheit.
  • Idealerweise sollte die Substanz so verabreicht werden, dass Spitzen-Plasmakonzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 75 μM, bevorzugt etwa 1 bis 50 μM, am bevorzugtesten etwa 2 bis etwa 30 μM erreicht werden. Dies kann zum Beispiel durch die intravenöse Injektion einer 0,05 bis 5%-igen Lösung der Substanz, optional in physiologischer Kochsalzlösung, oder durch orale Verabreichung als Bolus mit etwa 1-100 mg der Substanz erreicht werden. Wünschenswerte Blutspiegel können durch kontinuierliche Infusion, die etwa 0,01-5,0 mg/kg/h liefert, oder durch intermittierende Infusionen, die etwa 0,4-15 mg/kg der Substanz enthalten, aufrechterhalten werden.
  • Die Substanz kann geeignet als Einzeldosis oder als unterteilte Dosen, welche zu geeigneten Intervallen verabreicht werden, zum Beispiel als zwei, drei, vier oder mehrere Sub-Dosen pro Tag, dargeboten werden. Die Sub-Dosen selbst können weiter unterteilt werden, z.B. in eine Anzahl einzelner, locker verteilter Verabreichungen, wie mehrere Inhalationen aus einem Insufflator oder Verabreichung einer Mehrzahl an Tropfen ins Auge.
  • Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht-limitierenden Beispiele illustriert.
  • Beispiele
  • Schmelzpunkte sind unkorrigiert. 1H NMR-Spektren wurden unter Verwendung eines Varian Mercury 300 Spektrometers in DMSO-d6 oder CDCl3 aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen sind als „parts per million" (ppm) mit Tetramethylsilan (TMS) als interner Standard bei null ppm angegeben. Die Kopplungskonstanten (J) sind in Hertz angegeben und die Abkürzungen s, d, t, q und m beziehen sich jeweils auf Singulett, Dublett, Triplett, Quartett und Multiplett. Infrarotspektren wurden mit einem Nicolet PROTEGE 460-IR Spektrometer aufgenommen. Massenspektroskopiedaten wurden mit einem FINNIGAN MAT 95, VG 7070E-HF G.C. System mit einem HP 5973 Massenselektions-Detektor aufgenommen. UV-Spektren wurden mit einem BECKMANN DU 7400 unter Verwendung von McOH als Lösungsmittel aufgenommen. TLC wurde auf einer vorbeschichteten Silikagelplatte surchgeführt (Silica Gel KGF; Whitman Inc.). Silikagel (200-400 mesh, Whitman Inc.) wurde für alle säulenchromatographischen Auftrennungen verwendet. Alle Chemikalien waren analysenrein und wurden von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis) oder Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen.
  • Die Synthese einer repräsentativen in der Erfindung verwendeten Verbindung ist in Beispiel 1 beschrieben. Andere in der Erfindung verwendete Verbindungen können unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie dem in Beispiel 1 beschriebenen hergestellt werden.
  • Beispiel 1. Chemische Synthese und Charakterisierung von 4-(4'-Hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (6)
    Figure 00210001
  • 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoesäure (1) wurde mit Thionylchlorid behandelt und dann mit Ammoniak zur Reaktion gebracht, so dass 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzamid (2) erhalten wurde, wie von F. Nomoto et al. Chem. Pharm. Bull. 38: 1591-1595, 1990 beschrieben. Die Nitrogruppe in Verbindung (2) wurde mit Natriumtetrahydridoborat in Gegenwart von Kupfersulfat reduziert (siehe C.L. Thomas, Catalytic Processes and Proven Catalysts, Academic Press, New York (1970)), so dass 4,5-Dimethoxy-2-Aminobenzamid (3) erhalten wurde, welches durch Rückflußkochen mit Ameisensäure zyklisiert wurde, um 6,7-Dimethoxychinazolin-4(3H)-on (4) zu erhalten. Verbindung (4) wurde mit Phosphoroxytrichlorid unter Rückfluss gekocht, so dass Verbindung (5) erhalten wurde, welche eine nützliche Zwischenstufe ist, um Verbindungen nach Formel I herzustellen, wobei X NH ist. Die Reaktion der Verbindung (5) mit dem erforderlichen Anilin lieferte die folgenden Verbindungen gemäß Formel I:
    Figure 00220001
  • Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens, wie des oben beschriebenen, oder unter Verwendung von Verfahren, welche im Handwerk zur Herstellung anderer Chinazolin-Verbindungen bekannt sind, können Verbindungen gemäß Formel I hergestellt werden.
  • Beispiel 2. Identifizierung selektiver JAK3-Inhibitoren
  • Konstruktion eines Homologiemodells für die JAK3-Kinasedomäne. Ein Homologiemodell für JAK-3 wurde wie von E.A. Sudbeck, et al., Clinical Cancer Research, 5: 1569-1582, 1999 beschrieben konstruiert. Da die dreidimensionalen Koordinaten der JAK3-Kinasedomäne momentan nicht bekannt sind, war ein Strukturmodell von JAK3 zur Kopplungsanalyse von JAK3-Inhibitoren notwendig. Ein Homologiemodell von JAK3 wurde konstruiert (2), indem bekannte Koordinaten von homologen Kinasedomänen als Referenz verwendet wurden. Das JAK3-Homologiemodell wurde erstellt, indem zunächst die Proteinsequenz von JAK3 (Swiss-Prot #P52333, Univ. Genf, Genf, Schweiz) aus GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) bezogen wurde und das vernünftigste Sequenz-Alignment für die JAK3-Kinasedomäne bezüglich einiger Schablonenkoordinaten (bekannte Kinasestrukturen wie HCK, FGFR und IRK (Sicheri, F., et al., Nature 385: 602-9, 1997; Mohammadi, M., et al., Cell 86: 577-87, 1996; Mohammadi, M., et al., Science 276: 955-60, 1997; und Hubbard, S. R., et al., Nature 372: 746-54, 1994) bestimmt wurde. Dies wurde erreicht, indem zunächst die Cα--Koordinaten der Kinasedomänen von HCK, FGFR und IRK unter Verwendung des Programms InsightII überlagert wurden, um den besten Gesamtstrukturvergleich zu bieten (InsightII, Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, 1996). Die Sequenzen wurden dann basierend auf der Überlagerung ihrer Strukturen einem Alignment unterzogen (Aminosäuresequenzen wurden miteinander ausgerichtet, wenn ihre Cα-Positionen räumlich miteinander in Beziehung standen). Das Alignment war an Merkmale wie Schleifen in einem Protein, die sich von den anderen Proteinsequenzen unterschieden, angepasst. Die Strukturüberlagerung wurde unter Verwendung des Homologie-Moduls des Programms InsightII und eines Silicon Graphics INDIGO2 Rechners (Silicon Graphics, Mountain View, CA) durchgeführt. Das Sequenz-Alignment wurde manuell durchgeführt und ergab ein Sequenzvariationsprofil für jede überlagerte Cα-Position. Das Sequenzvariationsprofil diente als Basis für das folgende Sequenz-Alignment der JAK3-Kinase mit den anderen drei Proteinen. In diesem Vorgang wurde die Sequenz von JAK3 in das Programm eingebracht und auf Basis der oben beschriebenen Sequenzvariationsprofile einem Alignment mit den drei bekannten Kinaseproteinen unterzogen. Dann wurde der JAK3-Kinasesequenz unter Verwendung der 3D-Koordinaten von HCK als Schablone und des Homologie-Moduls im Programm InsightII ein Satz von 3D-Koordinaten zugewiesen. Die Koordinaten für einen Schleifenbereich, in dem (relativ zu HCK ohne die Schleife) eine Sequenzeinfügung auftritt, wurden aus einer begrenzten Anzahl von automatisch durch das Rechnerprogramm generierten Möglichkeiten ausgewählt, und manuell unter Verwendung des Programms CHAIN (Sack, J. S., J. Mol. Graphics 6: 244-245, 1988) auf eine idealere Geometrie angepasst. Schließlich wurde das konstruierte Modell der JAK3-Kinasedomäne einer Energieminimierung unter Verwendung des Programms X-PLOR unterzogen, so dass jegliche während des Modellbildungs-Vorgangs eingebrachte sterische Spannung entlastet werden konnte (Grünger, A. T., X-PLOR, A System für X-ray Crystallography and NMR). Das Modell wurde auf ungünstige sterische Kontakte hin untersucht und sofern notwendig wurden solche Seitenketten entweder unter Verwendung einer Rotamerbibliotheksdatenbank oder durch manuelles Rotieren der betreffenden Seitenketten neu modelliert. Das Verfahren zur Konstruktion eines Homologiemodells wurde für JAK1 (SWISS-PROT #P23458) und JAK2 (Genbank #AF005216) unter Verwendung des JAK3-Modells als Strukturvorlage wiederholt. Die energieminimierten Homologiemodelle von JAK1, JAK2 und JAK3 wurden dann in Zusammenhang mit energieminimierten Strukturmodellen von Dimethoxychinazolin-Verbindungen für Modellierungsstudien von JAK/Dimethoxychinazolin-Komplexen verwendet.
  • Kopplungsverfahren unter Verwendung eines Homologiemodells der JAK3-Kinasedomäne. Die Modellierung des JAK/Dimethoxychinazolin-Komplexes wurde unter Verwendung des Kopplung-Moduls im Programm InsightII und der „Affinity suite" von Programmen zur automatischen Kopplung eines Inhibitors in eine Proteinbindungsstelle erreicht (ein ähnliches Verfahren für EGFR und BTK wurde zuvor beschrieben; Siehe Ghosh, S., et al. Clin. Can. Res. 4: 2657-2668, 1998; Mahajan, S., et al. J. Biol. Chem. 274: 9587-9599, 1999). Die verschiedenen angekoppelten Positionen jeder Verbindung wurden unter Verwendung eines Ludi Bewertungsverfahrens (Bohm, H. J., et al. J. Comput. Aided Mol. Des. 8: 243-56, 1994) in InsightII bewertet, welches unter Berücksichtigung der vorhergesagten lipophilen, Wasserstoffbrückenbindungs- und Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen dem Inhibitor und dem Protein, eine Bindungskonstante Ki abschätzte Ein Vergleich der Reste des katalytischen Zentrums mehrerer verschiedener PTK wurde durch manuelle Überlagerung von Kristallstruktur-Koordinaten der Kinasedomänen von IRK und HCK und Modellen von JAK1, JAK2, JAK3, BTK und SYK und darauffolgender Identifizierung von Merkmalen im aktiven Zentrum, welche einzigartig bei JAK3 waren, durchgeführt (2 und 3).
  • Chemische Synthese von Chinazolin-Derivaten. Die in Tabelle 1 aufgelisteten Verbindungen wurden unter Verwendung von Verfahren aus der Literatur synthetisiert und charakterisiert (Rewcastle, G. W., et al. J. Med. Chem. 38: 3482-7, 1995).
  • Tabelle 1. Vorhergesagte Interaktionen protonierter Chinazoline mit dem aktiven Zentrum von JAK3 und gemessene Inhibierungswerte (IC50-Werte) aus JAK3-Kinaseassays
    Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Immunkomplex-Kinaseassays. Vom Ovargewebe des Heennrurms Spodotera frugiperda stammende Sf21 (IPLB-SF21-AE) Zellen (Vassilev, A., et al. J. Biol. Chem. 274: 1646-1656, 1999), wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA) bezogen und bei 26-28°C in Grace's Insektenzellmedium, versetzt mit 10% FBS und 1,0% Antibiotikum/Antimycotikum (GIBCO-BRL) gehalten. Zell-Stammkulturen wurden bei 0,2 – 1,6 × 106/ml in 600 ml Gesamtkulturvolumen in 1L Bellco Spinnerflaschen bei 60-90 rpm in Suspension gehalten. Die Zellviabilität wurde, durch Trypanblau-Farbausschluss bestimmt, bei 95-100% gehalten. Sf21-Zellen wurden mit einem Baculovirus-Expressionsvektor für BTK, SYK, JAK1, JAK2 oder JAK3 infiziert. Die Zellen wurden geerntet, lysiert (10 mM Tris pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40, 10% Glycerol, 50 mM NaF, 100 μM Na3VO4, 50 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 μg/ml Apronitin, 10 μg/ml Leupeptin), die Kinasen wurden aus den Lysaten immunpräzipitiert und ihre enzymatische Aktivität wurde wie beschreiben bestimmt (Vassilev, A., et al., J. Biol. Biochem. 274: 1646-1656, 1999; Uckun, F. M., et al., Science 22: 1096-1100, 1996; Goodman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273: 17742-48, 1998; Mahajan, S., et al., Mol. Cell. Biol. 15: 5304-11, 1995; und Uckun, F., M., et al., Science 267: 886-91, 1995). Die Immunpräzipitate wurden Westernblot-Analysen unterzogen, wie zuvor beschrieben (Vassilev, A., et al., J. Biol. Biochem. 274: 1646-1656, 1999; und Uckun, F. M., et al., Science 22: 1096-1100, 1996).
  • Für Insulinrezeptorkinase- (IRK)-Assays, wurden bis zu etwa 80%-iger Konfluenz angezogene menschliche HepG2 Hepatomzellen einmal mit serumfreiem DMEM gewaschen und bei 37°C in einem CO2-Inkubator einer 3-stündigen Hungerperiode unterzogen. Darauffolgend wurden die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Insulin (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, Kat# CP-410; 10 Units/ml/10 × 106 Zellen) stimuliert. Im Anschluss an diesen IRK-Aktivierungsschritt wurden die Zellen einmal mit serumfreiem Medium gewaschen, in NP-40-Puffer lysiert und IRK wurde aus den Lysaten mit einem Anti-IRβ-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Kat# sc-711, Polyklonales IgG) immunpräzipitiert. Vor der Durchführung der Immunkomplex-Kinaseassays wurden die Kügelchen mit dem Kinasepuffer (30 mM Hepes, pH 7,4, 30 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 4 mM MnCl2) äquilibriert. LYN wurde aus Gesamtzelllysaten von menschlichen NALM-6 Leukämiezellen immunpräzipitiert wie zuvor berichtet (Uckun, F., M., et al., Science 267: 886-91, 1995; und Uckun, F. M., et al., Journal of Biological Chemistry 271: 6396-6397, 1996).
  • Bei JAK3-Immunkomplex-Kinaseassays (17, 22) wurden KL-2 EBV-transformierte menschliche Lymphoblastoid B-Zellen (native JAK3-Kinaseassays) oder Insektenovarienzellen (rekombinate JAK3 Kinsaseassays) mit NP-40 Lysispuffer (50 mM Tris, pH8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % NP-40, 100 μM Natriumorthovanadat, 100 μM Natriummolybdat, 8 μg/ml Apronitin, 5 μg/ml Leupeptin und 500 μM PMSF) lysiert und 10 min bei 13000 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die Proben wurden mit Antiseren immunpräzipitiert, welche gegen JAK3 hergestellt wurden. Die Antiseren wurden verdünnt und Immunkomplexe wurden durch Inkubation mit 15 μl Protein-A-Sepharose gesammelt. Nach 4 Waschschritten mit NP-40 Lysepuffer wurden die Protein-A-Sepharose Kügelchen einmal in Kinasepuffer (20 mM MOPS, pH 7, 10 mM MgCl2) gewaschen und in demselben Puffer resuspendiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 25 μCi [γ-32P] ATP (5000 Ci/mMol) und unmarkiertem ATP auf eine Endkonzentration von 5 μM initiiert. Die Reaktionen wurden durch Kochen in SDS-Puffer für 4 Minuten gestoppt. Die Proben wurden dann auf 9,5% SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und markierte Proteine wurden mittels Autoradiographie detektiert. Im Anschluss an die Elektrophorese wurden die Kinasegele auf Whatman 3M Filterpapier getrocknet und Phosphorimaging auf einem Molecular Imager (Bio-Rad, Hercules, CA) sowie Autoradiographie auf Film unterzogen. Für jede Wirkstoffkonzentration wurde ein Kinase-Aktivitätsindex (KA) bestimmt, indem die Kinaseaktivität in Phosphorimager-Units (PIU) mit derjenigen der Grundlinienprobe verglichen wurde. In manchen Experimenten wurden kalte Kinaseassays wie von (Uckun, F. M., et al., Clin. Can. Res. 4: 901-912, 1998) beschrieben durchgeführt.
  • „Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSAs). EMSAs wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Goodman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273: 17742-48, 1998), um die Effekte von Dimethoxychinazolin-Verbindungen auf Cytokin-induzierte STAT-Aktivierung in 32Dc11/IL2Rβ-Zellen (Geschenk von Dr. James Ihle, St. Jude Children's Research Hospital) zu untersuchen.
  • Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials. Zur Messung der Veränderungen in Mitochondrien wurden Zellen für 24 h oder 48 h bei Konzentrationen im Bereich von 7,4 μg/ml (25 μM) bis 30 μg/ml (200 μM) mit WHI-P131 inkubiert, mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und mit einem Durchflußzytometer analysiert. Das mitochondriale Membranpotential (Δψm) wurde unter Verwendung zweier Farbstoffe gemessen, einschließlich eines lipophilen Kations 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid (JC-1) und eines Cyaninfarbstoffs 1,1', 3, 3, 3', 3'-Hexamethylindodicarbocyaniniodid (DiIC1 (27-29)), bezogen von Molecular Probes (Eugene, OR). JC-1 ist ein Monomer bei 527 nm nach Anregung bei 490 nm; Mit Polarisierung von (Δψm) werden J-Aggregate gebildet, welche die Emission auf 590 nm verschieben (30). Dies kann mit einem Durchflußzytometer nachgewiesen werden, indem das grüne Signal (bei 527 nm) und das grün-orangefarbene Signal (bei 590 nm) gleichzeitig bewertet werden, wodurch ein Index der Anzahl an polarisierten und depolarisierten Mitochondrien der Zellen erstellt wird. DiIC1, ein amphipathischer und kationischer Cyaninfarbstoff, konzentriert sich in energetisierten Mitochondrien und wurde in einer Vielzahl von Untersuchungen zur Messung des mitochondrialen Membranpotentials verwendet (Fujii, H., et al., Histochem. J. 29: 571-581, 1997; Mancini, M., et al., J. Cell Biol. 138: 449-469, 1997; und Petit, P. X., et al., J. Cell Biol. 130: 157-167, 1995). Zellen wurden auch mit DiIC1 bei einer Konzentration von 40 nM für 30 min im Dunkeln gefärbt, wie für JC-1 beschrieben. Die Zellen wurden unter Verwendung eines mit einem HeNe-Laser ausgestatteten Vantage Becton Dickinson (San Jose, CA) Cell Sorters mit einer Anregung bei 635 nm analysiert und die Fluoreszenz wurde bei 666 nm aufgenommen.
  • Bestimmung der Mitochondrienmasse. Die relative Mitochondrienmasse wurde unter Verwendung der Becton Dickinson Calibur Durchflußzytometrie und des Fluoreszenzfarbstoffs 10-n-Nonyl-acridinorange (NAO) gemessen, welcher das mitochondriale Phospholipid Cardiolipin bindet, das extensiv zur Lieferung eines Index der Mitochondrienmasse verwendet wurde (Maftah, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 185-190, 1989).
  • Ergebnisse und Diskussion zu Beispiel 2.
  • Homologiemodell der JAK3-Kinasedomäne. Die in den Protein/Inhibitor-Modellierungsstudien verwendeten dreidimensionalen Koordinaten von JAK3 wurden auf Basis eines Struktur-Alignments mit den Sequenzen bekannter Kristallstrukturen der Kinasedomänen dreier Proteintyrosinkinasen (PTKs) (Kinasedomänen von HCK (9), FGFR (11) und IRK (37)) konstruiert, wie in Material und Methoden detailliert dargestellt. 1A und 1B zeigen das Homologiemodell der JAK3-Kinasedomäne, welche aus einem N-terminalen Flügel und einem C-terminalen Flügel besteht, die über eine Gelenkregion in der Nähe des katalytischen (ATP-bindenden) Zentrums verbunden sind. Das katalytische Zentrum ist eine Tasche, die sich in dem zentralen Bereich der Kinasedomäne befindet, welcher durch zwei β-Faltblätter am Grenzbereich zwischen den N- und C-Flügeln definiert ist. Die Öffnung zum katalytischen Zentrum ist lösungsmittelzugänglich und erleichtert die Bindung von ATP. Kleine Molekül-Inhibitoren können ebenfalls an das katalytische Zentrum binden, was eine Abschwächung der PTK-Aktivität durch Hemmung der Bindung von ATP bewirkt. Eine Analyse des JAK3-Modells ließ spezifische Merkmale des katalytischen Zentrums erkennen, welches als vierseitig geformte Tasche beschrieben werden kann (1C). Die Öffnung der Tasche ist durch die Reste Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 und Tyr904 definiert (blaue Reste, 1C). Die entfernt liegende Wand tief in der Tasche ist von Leu905 (Ca-Rückgrat), Glu903, Met902, Lys905 und Asp967 ausgekleidet (rosa Reste, 1 C), und der Grund der Tasche ist von Leu905 (Seitenkette), Val884, Leu956 und Ala966 ausgekleidet (gelbe Reste, 1C). Die Reste, welche die Decke der Tasche definieren, schließen Leu828, Gly829, Lys830 und Gly831 ein (obere blaue Reste, 1C). 1C und 2A illustrieren, dass das katalytische Zentrum des JAK3-Modells annäherungsweise die Dimensionen 8 × 11 × 20 Å und ein zur Bindung verfügbares Volumen von etwa 530 Å3 besitzt. Dem Modell nach würde die lösungsmittelexponierte Öffnung zur Bindungsregion es Inhibitoren erlauben, einzudringen und zu binden, wenn das Molekül eine gewisse Planarität besitzt.
  • Während die meisten der Reste im katalytischen Zentrum der JAK3-Kinasedomäne relativ zu anderen PTKs konserviert waren, wurden einige spezifische Variationen beobachtet (3). Diese Unterschiede schließen einen Alanin-Rest in BTK, IRK und HCK/LYN (Region A, 3A) ein, der zu Glu in SYK und Pro906 in JAK3 verändert ist. An der Region B ist ein Tyrosin-Rest in JAK3 (Tyr904), BTK und LYN konserviert, der sich aber zu Phe in HCK (was der einzige offensichtliche Unterschied zwischen HCK und LYN mit Relevanz für die Inhibitorbindung ist), Met in SYK und Leu in IRK ändert. Region C zeigt einen Methionin-Rest, der in BTK, IRK und HCK/LYN konserviert ist, sich aber zu Leu905 in JAK3 und zu Ala in SYK ändert. Region D zeigt Met902 in JAK3, das in SYK und IRK konserviert ist, aber zu Thr in BTK und zu einem viel kleineren Rest, Ala, in LYN und HCK geändert ist. Dieser Met902-Rest in JAK3, der sich an der Rückwand der Tasche befindet und zum Zentrum des Taschenvolumens hinragt, kann die Form der Bindungstasche signifikant beeinflussen. An dieser Position kann die ausgedehnte Konformation der Met902-Seitenkette im Vergleich zu anderen Kinasen mit kleineren Resten an diese Stelle, wie BTK (Thr) und HCK/LYN (Ala), den nahen Kontakt von Inhibitoren mit Resten, welche die Rückwand der Tasche auskleiden, und mit der Gelenkregion behindern. Ala966 in Region E ist in HCK/LYN konserviert, aber ändert sich zu Gly in IRK und zum hydrophileren Rest Ser in BTK und SYK. Region F, welche sich weiter entfernt von der Inhibitor-Position befindet, ist die am wenigsten konservierte Region des katalytischen Zentrums und enthält Asp912 in JAK3, Asn in BTK, Lys in SYK, Ser in IRK und Asp in HCK/LYN (3). Diese Identitätsunterschiede der Reste zwischen Tyrosinkinasen bieten die Basis zum Entwurf selektiver Inhibitoren der JAK3-Kinasedomäne.
  • Strukturbasierter Entwurf und Synthese von JAK3-Inhibitoren. Ein rechnergestütztes Kopplungsverfahren wurde verwendet, um vorherzusagen, wie gut potentielle Inhibitoren in das katalytische Zentrum von JAK hineinpassen, an es binden, und in der Hemmung der Kinase resultieren könnten (2B). Die Dimethoxychinazolin-Verbindung WHI-P258 (4-(Phenyl)-Amino-6,7-dimethoxychinazolin) enthält zwei Methoxygruppen an der Chinazolineinheit, aber keine anderen Ringsubstituenten. Molekulare Modellierungsstudien unter Verwendung des Homologiemodells der JAK3-Kinasedomäne legten nahe, dass WHI-P258 in das katalytische Zentrum von JAK3 passen würde, aber wahrscheinlich aufgrund beschränkter Wasserstoffbrücken-Interaktionen nicht sehr fest binden würde. Asp967, ein Schlüsselrest im katalytischen Zentrum von JAK3 kann eine Wasserstoffbrückenbindung mit Molekülen ausbilden, die an das katalytische Zentrum binden, wenn derartige Moleküle eine Wasserstoffbrücken-Donorgruppe wie eine OH-Gruppe enthalten. WHI-P258 enthält jedoch keine OH-Gruppe und würde daher nicht besonders vorteilhaft mit Asp967 interagieren. Wir postulierten, dass die Anwesenheit einer OH-Gruppe an der 4'-Position des Phenylrings von WHI-P258 aufgrund zusätzlicher Interaktion mit Asp967 in einer stärkeren Bindung an JAK3 resultieren würde. Eine Reihe von Dimethoxychinazolin-Verbindungen wurde entworfen und synthetisiert, um diese Hypothese zu überprüfen.
  • Eine Abschätzung des molekularen Volumens der Verbindungen ist in Tabelle 1 dargelegt.
  • Eine Zusammenfassung von strukturellen Merkmalen der entworfenen Dimethoxychinazolin-Verbindungen, die als relevant für die Bindung an das katalytische Zentrum von JAK3 beobachtet wurden, ist in 2C gezeigt. Die ungefähren molekularen Volumina der Verbindungen in Tabelle 1 liegen im Bereich von 252 Å bis 307 Å, was klein genug ist, um in die 530 Å3 Bindungsstelle der JAK3-Kinase zu passen. Tabelle 1 listet weiter die Ergebnisse molekularer Modellierungsstudien einschließlich der geschätzten Bindungskonstanten (d.h. Ki-Werte) der Verbindungen auf, welche in das katalytische Zentrum von JAK3 gekoppelt wurden. Die Verbindungen, welche in Kopplungsstudien ausgewertet wurden, enthalten Substitutionen ähnlicher funktioneller Gruppen an verschiedenen Positionen des Phenylrings.
  • Die Konformationen der energieminimierten gekoppelten Modelle der in Tabelle 1 aufgezählten Verbindungen waren relativ planar, mit Diederwinkeln von etwa 4-18° zwischen dem Phenylring und dem Chinazolin-Ringsystem. Diese Konformation erlaubt es dem Molekül, leichter in das katalytische Zentrum von JAK3 hineinzupassen. Alle aufgelisteten Verbindungen enthalten einen Ringstickstoff (N1), der eine Wasserstoffbrücke mit NH von Leu905 in der Gelenkregion von JAK3 ausbilden kann. Wenn N1 protoniert vorliegt, kann die NH-Gruppe stattdessen mit der Carbonylgruppe in Leu905 von JAK3 interagieren. Das Vorhandensein einer OH-Gruppe an der 4'-Position des Phenylrings wurde als besonders wichtig für die Bindung an das katalytische Zentrum von JAK3 angenommen. Für WN1-P131 (geschätzte Ki=2,3 μM), WHI-P154 (geschätzte Ki=1,4 μM) und WHI-P97 (geschätzte Ki=0,6 μM) – in Tabelle 1 gezeigt – wurde vorhergesagt, dass sie günstige Bindungen an JAK3 und wirksame inhibitorische Aktivität besitzen würden, da sie eine 4'-OH-Gruppe am Phenylring besitzen, die eine Wasserstoffbrücke mit Asp967 von JAK3 ausbilden kann, was zu verstärkter Bindung beiträgt. Die 2'-OH-Gruppe von WHI-P132 ist jedoch nicht in der richtigen Orientierung für die Interaktion mit Asp967, und sie würde wahrscheinlich eine intramolekulare Wasserstoffbrücke mit dem Stickstoff des Chinazolinrings ausbilden, was zu einer signifikant niedrigeren Affinität von WHI-P132 zum katalytischen Zentrum von JAK3 beitragen würde. Die relativ großen Brom-Substituenten (WHI-P97, WHI-P154) können die molekulare Oberfläche, welche in Kontakt mit Resten der Bindungsstelle steht, vergrößern, wenn das Molekül in die Bindungsstelle hineinpasst. Modellierung von WHI-P154 und WHI-P97 zeigte, dass es genug Raum zur Aufnahme der Brom-Gruppen gibt, wenn der Phenylring im Verhältnis zu der kondensierten Ringgruppe des Moleküls leicht gekippt ist. Die Ergebnisse der Modellierungsstudien ergaben die Hypothese, dass WHI-P131, WHI-P154 und WHI-P97 wirksame JAK3-hemmende Aktivität zeigen würden. Um diese Hypothese und den Vorhersagewert des beschriebenen JAK3-Homologiemodells zu testen, haben wir WHI-P131, WHI-P154, WHI-P97 und 5 andere in Tabelle 1 aufgelistete Dimethoxychinozalin-Verbindungen synthetisiert.
  • Hemmung von JAK3 durch rational entworfene Dimethoxychinozalin-Verbindungen. Wir verwendeten zunächst Immunkomplex-Kinaseassays, um die Effekte der synthetisierten Dimethoxychinazolin-Verbindungen auf die enzymatische Aktivität von menschlichem JAK3 zu testen, welches aus der KL2 EBV-transformierten menschlichen Lymphoblastoid B-Zelllinie immunpräzipitiert wurde. WHI-P131, WHI-P154 und WHI-P97, die sehr ähnliche geschätzte Ki-Werte im Bereich von 0,6 μM bis 2, 3 μM besaßen, und von denen vorhergesagt wurde, dass sie in mikromolaren Konzentrationen signifikante JAK3-hemmende Aktivität zeigen würden (was für die anderen Verbindungen mit geschätzten Ki-Werten im Bereich von 25 μM bis 72 μM nicht der Fall war), hemmten JAK3 in konzentrationsabhängiger Weise. Die gemessenen IC50-Werte waren 9,1 μM für WHI-P131, 11,0 μM für WHI-P97 und 27,9 μM WHI-P154, aber >300 μM für alle anderen Dimethoxychinazolin-Verbindungen (Tabelle 1). WN1-P131 und WHI-P154 wurden weiterhin gegenüber rekombinantem murinen JAK3 getestet, welches in einem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert wurde, und sie hemmten JAK3 in konzentrationsabhängiger Weise mit einem IC50-Wert von jeweils 23,2 μg/ml (~78 μM, 4A) und 48,1 μg/ml (~128 μM, 4B). Die Fähigkeit von WHI-P131 und WHI-P154, rekombinantes JAK3 zu hemmen, wurde in 4 unabhängigen Experimenten bestätigt. Diese Ergebnisse der Kinaseassays sind konsistent mit unseren oben beschriebenen Modellierungsstudien.
  • Wichtigerweise zeigten WHI-P131 und WHI-P154 keine nachweisbare inhibitorische Aktivität gegenüber rekombinantem JAK1 oder JAK2 in Immunkomplex-Kinaseassays (4C und 4D). „Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSAs) wurden ebenfalls durchgeführt, um die JAK3-Spezifität dieser Dimethoxychinazolin-Verbindungen durch Untersuchung ihrer Effekte auf Cytokin-induzierte STAT-Aktivierung in 32Dc11/IL2Rβ-Zellen zu bestätigen. Wie in 4E gezeigt, hemmten sowohl WHI-P131 (10 μg/ml = 33,6 μM) als auch WHI-P154 (10 μg/ml = 26,6 μM) (aber nicht die Kontrollverbindung WHI-P132, 10 μg/ml = 33,6 μM) die JAK3-abhängige STAT-Aktivierung nach Stimulation mit IL-2, aber sie beeinflussten die JAK1/JAK2-abhängige STAT-Aktivierung nach Stimulation mit IL-3 nicht. Modellierungsstudien legen nahe, dass diese ausgezeichnete JAK3-Spezifität zum Teil einem Alanin-Rest (Ala966) zuzuschreiben ist, welcher im katalytischen Zentrum von JAK3 vorhanden ist, aber in JAK1 und JAK2 zu Glycin geändert ist. Die Alanin-Gruppe, welche in der Nähe des Phenylrings der gebundenen Dimethoxychinazolin-Verbindungen positioniert ist, kann einen größeren hydrophoben Kontakt mit der Phenylgruppe bieten, und daher zu erhöhter Affinität im Vergleich zum kleineren Glycin-Rest in dieser Region der Bindungsstelle bei JAK1 und JAK2 beitragen. Eine genaue Interpretation dieser bemerkenswerten Unterschiede in der Sensitivität von JAK3 verglichen mit JAK1 und JAK2 gegenüber WHI-P131 und WHI-P154 muss jedoch die Bestimmung der Röntgenkristallstruktur dieser Kinasen abwarten, da einfache Aminosäure-Diskrepanzen in ihren katalytischen Zentren in ausgeprägten Strukturunterschieden resultieren könnten.
  • Spezifität von WHI-P131 als Tyrosinkinase-Inhibitor. Die Verbindung WHI-P131 wurde für weitere Experimente ausgewählt, die zur Untersuchung der Sensitivität von Proteintyrosinkinasen, welche nicht der Janus-Familie angehören, gegenüber dieser neuen Dimethoxychinazolin-Klasse von JAK3-Inhibitoren entworfen wurden. Die inhibitorische Aktivität von WHI-P131 gegenüber JAK3 war spezifisch, da es die enzymatische Aktivität anderer Proteintyrosinkinasen, einschließlich der Tyrosinkinase SYK aus der ZAP/SYK-Familie (5C), der Tyrosinkinase BTK aus der TEC-Familie (5D), der Tyrosinkinase LYN aus der SRC-Familie (5E) und der Tyrosinkinase IRK aus der Rezeptor-Familie (5F), sogar bei so hohen Konzentrationen wie 350 μM nicht beeinflusste (Tabelle 1, 5).
  • Eine Strukturanalyse dieser PTKs wurde unter Verwendung der Kristallstrukturen von HCK (die als Homologiemodell für LYN diente) und IRK, sowie konstruierter Homologiemodelle von JAK3, BTK und SYK durchgeführt. Diese Analyse offenbarte einige nichtkonservierte Reste in den katalytischen Zentren der verschiedenen Tyrosinkinasen, welche zur Spezifität von WHI-P131 beitragen können (3). Ein solcher Rest, der sich am nächsten zu den angekoppelten Inhibitoren befindet, ist Ala966 in JAK3 (in Region E in 3 gezeigt), der den günstigsten Moleküloberflächenkontakt mit dem hydrophoben Phenylring von WHI-P131 bieten kann. Die Tatsache, dass WHI-P131 LYN nicht inhibierte, obwohl LYN den in JAK3 konservierten Ala-Rest (Ala966) enthält, legt nahe, dass andere Faktoren (Unterschiede von Resten) zu dieser Selektivität beitragen. Andere nichtkonservierte Reste in den katalytischen Zentren von Tyrosinkinasen sind in den Regionen A bis F (3) gezeigt. Alle diese Unterschiede von Resten, besonders von Resten, die direkt mit dem gebundenen Inhibitor in Kontakt treten, können eine wichtige Rolle bei der beobachteten Spezifität von WN1-P131 für JAK3 spielen.
  • Beispiel 2 demonstriert, dass ein neues Homologiemodell der JAK3-Kinasedomäne für strukturbasierten den Entwurf und die Synthese von wirksamen und spezifischen Inhibitoren von JAK3 verwendet werden kann.
  • Letztlich zeigt das Homologiemodell eindeutig, dass das aktive Zentrum von JAK3 etwa 8 Å × 11 Å × 20 Å misst, wobei etwa ein Volumen von 530 Å3 zur Inhibitorbindung zur Verfügung steht. Unsere Modellierungsstudien unter Verwendung des konstruierten Homologiemodells der JAK3-Kinase zeigten auch, dass es signifikante Möglichkeiten zur Verbesserung der Chinazolin-Inhibitoren gibt. Das JAK3-Modell zeigt dass es zusätzliches Volumen in der ATP-bindenden Stelle gibt, welches besser durch Chinazolin-Derivate genutzt werden kann. Das mittlere molekulare Volumen unserer Chinazolin-Verbindungen beträgt 277 Å3, was deutlich unter dem geschätzten Gesamtvolumen der Bindungsstelle – 530 Å3 – liegt. Dies lässt Möglichkeiten zum Entwurf neuer Inhibitoren offen, welche etwas größere funktionelle Gruppen an der 2'- und 3'-Position des Phenylrings besitzen. Strukturelle und chemische Merkmale der Dimethoxychinazolin-Verbindungen, von denen vorhergesagt wird, dass sie deren Bindung an das katalytische Zentrum von JAK3 erleichtern, schließen die folgenden Merkmale ein, die in 2C illustriert sind: 1) Das Vorhandensein einer 4'-OH-Gruppe am Phenylring, 2) das Vorhandensein eines Wasserstoffbrücken-Akzeptors (N, Carbonyl, OH) in der Nähe des Leu905-NH, oder eines Wasserstoffbrücken-Donors (NH, OH) in der Nähe des Leu905-Carbonyls, 3) eine relativ planare Molekülform, um den Zugang zur Bindungsstelle zu erlauben, 4) die Fähigkeit, in einen Raum von 530 Å3 zu passen, welcher von den Resten definiert wird, die das katalytische Zentrum von JAK3 auskleiden. Diese vorhergesagten Bindungspräferenzen an JAK3-Reste im katalytischen Zentrum können zum Entwurf neuer und wirksamerer Inhibitoren von JAK3 verwendet werden.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, Hautkrebs zu verhindern oder zu behandeln, kann unter Verwendung von Assays, die im Handwerk bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die den in Beispiel 4 beschriebenen ähnlich sind, bestimmt werden.
  • Beispiel 4. Hautkrebs-Assays
  • Weibliche, 6-7 Wochen alte, haarlose Albinomäuse (skh-1) wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erworben und in einer kontrollierten Umgebung gehalten (Photoperiode: 12 h Licht / 12 h Dunkelheit, 22+/-1 °C, 60+/-10% relative Luftfeuchtigkeit), welche vollständig vom USDA (United States Department of Agriculture) akkreditiert ist. Die Tiere wurden in Fünfergruppen in einer pathogenfreien Umgebung in Übereinstimmung mit den Bestimmungen und Regelungen des U.S. Animal Welfare Act und den National Institutes of Health (NIH) gehalten. Alle Mäuse wurden in Mikroisolator-Käfigen (Lab Products, Inc. NJ) gehalten, welche autoklaviertes Streu enthielten. Die Mäuse hatten während der gesamten Experimente freien Zugang zu autoklaviertem Pelletfutter und Leitungswasser. Die Tierhaltung und die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Institutsrichtlinien durchgeführt.
  • Gepufferes Formalinphosphat (10%) wurde von Fisher Scientific (Springfield, NJ) bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO) und phosphatgepufferte Salzlösung („phosphate buffered saline", PBS) wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen.
  • Ultraviolette Lampen (8-FSX24T12/HO/UVB), die vorrangig Licht im UVB-Bereich abstrahlen (280 – 320 nm) wurden von National Biological Corporation, (Twinsburg, OH) bezogen. Die Bestrahlungsstärke der UVB-Lampen wurde vor jeder Bestrahlung unter Verwendung eines UVB-Meters (Modell 5000 von National Biological Corporation, Twinsburg, OH) bestimmt. Zur UV-Licht-Exposition wurden drei Mäuse in eine offene Plastikbox von 28 cm × 10 cm gesetzt, die in drei Abschnitte unterteilt war (eine Maus pro Abschnitt). Die Plastikbox wurde mittig unter die UVB-Lichtbank gestellt, und die Mäuse wurden mit einer Dosis von 35 mj/cm2 UVB bestrahlt. Die Expositionszeit für eine Dosis von 35 mj/cm2 UVB variierte zwischen 30 – 34 s. Der Abstand zwischen den UVB-Lampen und der Oberfläche, die bestrahlt wurde, betrug 20 cm.
  • Tumorgeneseprotokoll: Mäuse wurden in drei Gruppen zu 5-14 Mäusen pro Gruppe aufgeteilt wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Mäuse wurden vor jeder UVB-Exposition topisch mit einer einzelnen Applikation der Verbindung 6 (1,0 mg/cm2, gelöst in DMSO) über eine 2 cm2 große Fläche auf der dorsalen Oberfläche behandelt. 15 min nach der Applikation der Verbindung 6 wurden die Mäuse mit UVB (35 mj/cm2) bestrahlt. Die UVB-Exposition der Mäuse wurde dreimal wöchentlich für eine Gesamtdauer von 20 Wochen durchgeführt. Kontrollmäuse wurden vor der UVB-Lichtexposition mit Trägersubstanz behandelt.
  • Tabelle 1: Experimentgestaltung und Behandlungsregime
    Figure 00380001
  • Die Hautdicke der Mäuse und papilläre Hautläsionen mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm wurden zweimal wöchentlich gemessen und verzeichnet, und das Mittel der zwei Messungen wurde bei den Berechnungen verwendet. Messungen der Hautdicke, der Läsionen-Anzahl und des Läsionen-Durchmessers waren auf die 2 cm2-Fläche an der dorsalen Oberfläche der Mäuse beschränkt, die entweder mit der Verbindung 6 oder der Trägersubstanz behandelt wurde. Das Läsionen-Volumen wurde berechnet unter Verwendung der Formel: Volumen = 4/3 πr3
  • Am Ende der Studie wurden von 5 – 19 Läsionen aus jeder Gruppe zufällig Gewebeproben entnommen und in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Formalinfixierte Proben wurden in Paraffinblöcke eingebettet, mit einer Dicke von 4 μm geschnitten und in Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die pathologische Bewertung der Hautschnitte wurde durch einen zertifizierten Veterinärpathologen durchgeführt, der keine Kenntnis von der Identität der Proben hatte.
  • Pathologische Klassifizierung von Tumoren: Die pathologische Klassifizierung von Tumoren war wie folgt: 1) Kutanes Papillom: Ein tumorpapillomatöses Wachstum akanthotischer Epidermis ohne invasives Wachstum von Tumorzellen in die Dermis. Tumorzellen erscheinen nicht atypisch. 2) Aktinische Keratose: Ein hyperplastisches, orthokeratotisches, leicht bis mäßig akanthotisches Epithel. 3) Floride aktinische Keratose: Aktinische Keratose mit leichten bis mäßigen akanthotischen Leisten, die sich in die oberflächliche Dermis erstrecken. An oberflächliches invasives Plattenepithelkarzinom erinnernd. 4) Keratoakanthom: Ein papilläres Wachstum mit einem zentralen keratingefüllten Krater, der von hyperplastischem, akanthotischen Plattenepithel umgeben ist. Der äußere Rand des Tumors drückt in die darunterliegende Dermis. 5) Plattenepithelkarzinom („squamous cell carcinoma", SCC): Ein Tumor mit atypischen Zellennestern, der in die oberflächliche und mittlere Dermis eindringt.
  • Ergebnisse zu Beispiel 4.
  • Sonnenbrand ist eine UV-induzierte entzündliche Reaktion, die durch eine kutane Gefäßerweiterung (Erythem) und eine Zunahme der Gefäßdurchlässigkeit mit Flüssigkeits-Exsudation (Ödem) in der betroffenen Haut gekennzeichnet ist. Die UVB-induzierte Zunahme der Plasma-Exsudation kann als Zunahme der Hautfaltendicke 24 Stunden nach der Bestrahlung festgestellt werden (Berg, R. J., et al., J. Invest. Dermatol. 110: 405-9, 1998). UVB-Licht-Exposition von Mäusen (Gruppe B) erzeugte eine Zunahme der Hautfaltendicke im Vergleich zur Hautdicke von Mäusen der Kontrollgruppe (7). Bei der mit Verbindung 6 behandelten Gruppe (Gruppe C) bestand eine Zunahme der Hautdicke im Vergleich zur Kontrolle (Gruppe A); Die Zunahme der Hautdicke war jedoch signifikant geringer als im Vergleich zu der UVB-bestrahlten und trägersubstanzbehandelten Gruppe von Mäusen, was auf den entzündungshemmenden Effekt der Verbindung 6 hindeutet. Da die Mäuse dauerhaft dreimal wöchentlich bestrahlt wurden, war während der Dauer der Studie bei UVB-bestrahlten Mäusen (Gruppen B & C) eine aufrechterhaltene Zunahme an Hautödemen zu beobachten. Zu jedem Zeitpunkt war die Zunahme an Hautödemen bei den wirkstoffbehandelten Mäusen jedoch teilweise durch Verbindung 6 gehemmt.
  • Dauerhafte Exposition der Haut gegenüber UVB-Strahlungen führt primär zur Ausbildung feiner Hautläsionen, die mit weiteren Expositionen gegenüber derartigen Strahlungen sowohl in der Anzahl als auch der Größe anwachsen können. Wie in 8 gezeigt ist, induzierte die dauerhafte UVB-Exposition der Mäuse das Auftreten feiner Läsionen in der betroffenen Haut, welche zuerst nach etwa 10 Wochen Bestrahlung bei der trägersubstanzbehandelten und UVB-bestrahlten Gruppe von Mäusen auftraten (Gruppe B). Die Gesamtzahl der Hautläsionen stieg bei der UVB-bestrahlten Gruppe von Mäusen (Gruppe B) exponentiell mit steigender Anzahl der UVB-Expositionen an. Bei den mit Verbindung 6 behandelten Mäusen (Gruppe C) war das Auftreten von Läsionen jedoch verzögert; Die erste Läsion wurde nach 14 Wochen UVB-Bestrahlung beobachtet. Obwohl die mittlere Anzahl der Läsionen pro Maus in dieser Gruppe ebenfalls mit steigender Anzahl der UVB-Expositionen anstieg wie bei Gruppe B, war die mittlere Anzahl der Läsionen pro Maus im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle (Gruppe B) zu jedem Zeitpunkt niedriger.
  • Diese Daten deuten darauf hin, dass die Applikation der Verbindung 6 vor UV-Exposition (a) das Auftreten von Tumoren von 10 Wochen UVB-Behandlung (Gruppe B) auf 14 Wochen verzögert, und (b) die Gesamtzahl der aus wiederholter UVB-Exposition resultierenden Läsionen hemmt.
  • Im Anschluss an das erste Auftreten um 10-14 Wochen UVB-Bestrahlung herum nahmen die Hautläsionen mit steigender Anzahl der UVB-Expositionen sowohl in der Anzahl als auch der Größe zu. Um die Größe der Hautläsionen zu vergleichen, wurde der Läsions-Durchmesser unter Verwendung der in Material und Methoden beschriebenen Formel zum Läsions-Volumen umgerechnet, und das mittlere Läsions-Volumen pro Maus wurde verglichen. 9 zeigt den Effekt der Behandlung mit Verbindung 6 auf das mittlere Läsions-Volumen pro Maus. An der Abbildung kann abgelesen werden, dass das mittlere Läsions-Volumen mit der Zeit in beiden UVB-bestrahlten Gruppen von Mäusen (Gruppen B & C) zunahm, aber die Behandlung von Mäusen mit Verbindung 6 hemmte die Zunahme des Läsions-Volumens (Gruppe C, 9 und Tabelle 2). Zusätzlich haben wir ebenfalls das mittlere Läsions-Volumen bei mit Verbindung 6 behandelten und unbehandelten Gruppen von Mäusen nach 20-wöchiger Bestrahlung verglichen. Wie zuvor beim mittleren Hautläsions-Volumen pro Maus beobachtet, wurde das mittlere Volumen pro Läsion ebenfalls durch die Behandlung mit der Verbindung 6 gehemmt (Tabelle 2).
  • Tabelle 2: Hemmender Effekt der topischen Verabreichung von Verbindung 6 auf die UVB-induzierte Tumorgenese bei skh-1-Mäusen
    Figure 00410001
  • Morphologische und histopathologische Daten. Das morphologische Aussehen der Haut der Mäuse aller drei Gruppen nach 20-wöchiger Bestrahlung wurde verglichen. 10 zeigt dass eine wiederholte UVB-Licht-Exposition das Wachstum einer Anzahl von Läsionen auf der betroffenen Haut induzierte (10, Tafel B), während die Behandlung mit der Verbindung 6 das Wachstum derartiger Läsionen hemmte.
  • Histopathologische Befunde von Hautgewebe von Mäusen nach 20-wöchiger UVB-Bestrahlung sind in Tabelle 3 dargestellt.
  • Tabelle 3: Hemmender Effekt der topischen Verabreichung von Verbindung 6 auf UVB-induzierte Keratoakanthome und Plattenepithelkarzinome bei skh-1-Mäusen
    Figure 00410002
  • Eine leichte bis mäßige Dermatitis wurde bei allen drei Gruppen, einschließlich der nichtbestrahlten Gruppe von Mäusen (Gruppe A) beobachtet, was durch die topische Applikation der Trägersubstanz (DMSO) dreimal wöchentlich während der Dauer der Studie induziert worden sein könnte. Eine aktinische Keratose, welche eine hyperplastische und leicht bis mäßig akanthotische Epidermis repräsentiert, war in den meisten der Gewebeproben von beiden UVB-bestrahlten Gruppen (Gruppen B & C) vorhanden. Eine einzelne Keratoakantom-Läsion wurde bei der UVB-bestrahlten und der trägersubstanzbehandelten Gruppe von Mäusen (Gruppe B) beobachtet. Keine einzige derartige Läsion wurde bei den 14 Mäusen in der mit Verbindung 6 behandelten Gruppe (Gruppe C) beobachtet. Das Auftreten eines oberflächlichen, invasiven Plattenepithelkarzinoms (floride aktinische Keratose und eine Vorstufe von SCC) sowie SCC wurde in beiden UVB-bestrahlten Gruppen (Gruppen B & C) beobachtet, aber bei den mit Verbindung 6 behandelten Mäusen (Gruppe C) war dies um etwa 23% gehemmt (Tabelle 3). Entsprechend war auch das Auftreten von kutanen Papillomen teilweise durch die Verbindung 6 gehemmt.
  • Die Ergebnisse des Beispiels 4 zeigen, dass die topische Applikation der Verbindung 6 vor UVB-Bestrahlung die Haut vor den schädlichen Folgen von Hautkrebs bei dauerhafter Bestrahlung schützt. Insbesondere hemmte die topische Applikation der Verbindung 6 auf die Haut vor UVB-Exposition deutlich die Bildung von Hautläsionen, verringerte die Größe von Tumoren und hemmte die Entwicklung von Tumoren bei skh-1-Mäusen. Die Rolle von UVB-Strahlungen bei der Bildung von Hauttumoren wurde durch extensive Dokumentation validiert (Devary, Y., et al., Cell 71: 1081-91, 1992; Ley, R. D., et al., Photochem. Photobiol. 50: 1-5, 1989; Hall, E. J., et al., Am. J. Clin. Oncol. 11: 220-52, 1988; und Marks, R., Cancer 75: 607-12, 1995). UVB-Bestrahlung von Hautzellen löst die Freisetzung erhöhter Mengen an Arachidonsäure und ihrer Metaboliten frei (Konger, R. L., et al., Biochim. Biophys. Acta 1401: 221-34, 1998 (12-15). Prostaglandine, welche das Oxygenierungsprodukt von Arachidonsäure sind, werden in Folge von UVB-Bestrahlung von Hautzellen reichlich produziert (Hawk, J. L. M., und J. A. Parrish, 1993, Responses of Normal Skin to Ultraviolet Radiations. Plenum Medical Book Publishers, New York; Hruza, L. L., und Pentland, A. P., J. Invest. Dermatol. 100: 35S-41 S, 1993; Kang-Rotondo, et al., Am. J. Physiol. 264: C396-401, 1993; und Grewe, M. U., et al., J. Invest. Dermatol. 101: 528-31, 1993) und wurden in verschiedenen Modellen zur Tumorgenese impliziert (Vanderveen, E. E., et al., Arch Dermatol 122: 407-12, 1986; Cerutti, P. A. und Trump, B. F., Cancer Cells 3: 1-7, 1991). Anzeichen deuten ebenfalls darauf hin, dass Prostaglandine zusätzlich zur Stimulation des Tumorwachstums eine Tendenz zur Unterdrückung der Immunüberwachung des Wirtes besitzen (Plescia, O. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1848-51, 1975; Goodwin, J. S., Am. J. Med. 77: 7-15, 1984) und daher bei der Tumorförderung mitwirken. Erhöhte PGE2-Spiegel wurden bei Plattenepithel- und Basalzellenkarzinomen der Haut beobachtet und können mit der gesteigerten metastatischen Aktivität und dem invasiven Verhalten dieser Tumoren korreliert sein (Vanderveen, E. E., et al., Arch Dermatol 122: 407-12, 1986; Klapan, I., V., et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 118: 308-13, 1992). Bei verschiedenen chemischen Verbindungen, welche die Bildung von Prostaglandinen hemmen, wurde eine Hemmung des Wachstums von Tumoren beobachtet (Snyderman, C. H., et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 121: 1017-20, 1995; Hial, V., et al., Eur. J. Pharmacol. 37: 367-76, 1976; Lynch, N. R., et al., Br. J. Cancer 38: 50312, 1978).
  • Die Fähigkeit der Verbindung 6, die UVB-induzierte Tumorgenese der Haut zu hemmen, in Kombination mit unseren vorhergehenden Beobachtungen, dass sie die akute Hautentzündung hemmt, deuten an, dass die Verbindung 6 ein nützlicher chemopräventiver Wirkstoff gegen einige menschliche Krebsformen ist, die von Umwelteinwirkungen wie ultraviolettem Licht induziert werden.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, Hautkrebs zu verhindern oder zu behandeln, kann unter Verwendung von Assays, die im Handwerk bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die den in Beispiel 5 beschriebenen ähnlich sind, bestimmt werden.
  • Beispiel 5. Assays für UVB-induzierte Hautkarzinogenese
  • Die Verbindung 6 besitzt die Fähigkeit, die Freisetzung von UVB-Licht-induzierten Entzündungsmediatoren in epidermalen Zellen signifikant zu hemmen, und daher verhindert sie die Entzündungsantworten UVB-exponierter Haut.
  • Weibliche, 6-7 Wochen alte, haarlose Albinomäuse (skh-1) wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) bezogen. Die transgenen BigBlue-Mäuse, welche mehrere Kopien des BigBlue (LIZ)-Shuttlevektors, der ein Substrat zum in vivo-Nachweis von Mutationen enthält, wurden von Stratagene (La Jolla, CA) bezogen. Die Mäuse wurden in Fünfergruppen in einer pathogenfreien Umgebung in Übereinstimmung mit den mit den Bestimmungen und Regelungen des U.S. Animal Welfare Act und den National Institutes of Health (NIH) gehalten. Die Tierhaltung und die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Institutsrichtlinien durchgeführt.
  • Epidermale Zellinie: HaCaT, eine spontan transformierte menschliche epidermale Zellinie (16), wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), versetzt mit 10% fötalem Rinderserum (Summit Biotech, Ft. Collins, CO) gehalten.
  • Bestrahlungsverfahren: Eine Bank mit 8-FSX24T12/HO/UVB-Lampen, (National Biological Corporation, Twinsburg, OH), die vorwiegend Licht im UVB-Bereich ausstrahlen, 280-320 nm, wurde zur Bestrahlung von Mäusen und Zellkulturen verwendet. Die Bestrahlungsstärke der UVB-Lampen wurde unter Verwendung eines UVB-Meters (Modell 5000, bezogen von National Biological Corporation, Twisburg, OH) vor jeder Bestrahlung gemessen. Die zur Bestrahlung von Kulturen verwendete UVB-Lichtdosis betrug 25 mj/cm2. Betäubte Mäuse erhielten UVB-Bestrahlungen auf eine 2,0 cm2-Fläche an ihrer dorsalen Oberfläche. Dieser Bereich wurde 15 Minuten vor der Bestrahlung entweder mit der Testverbindung (1,5 mg/cm2) bei wirkstoffbehandelten Mäusen oder mit der Trägersubstanz bei Kontrollmäusen bestrichen. Die Entfernung zwischen den UVB-Lampen und der zu bestrahlenden Oberfläche betrug 20 cm. Die endgültige Bestrahlungsdosis, welche von skh-1 haarlosen Mäusen erhalten wurde, betrug 250 mj/cm2, was etwa siebenmal höher ist, als die minimale Erythemdosis (MED) (17) bei diesen Mäusen. BigBlue-Mäuse wurden vor der Bestrahlung am Rücken rasiert und dann entweder in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung 6 UVB-Licht exponiert (400 mj/cm2).
  • Prostaglandin E2-Assay. In Kulturplatten mit 24 Vertiefungen kultivierte konfluente HaCaT-Zellen wurden dreimal mit serumfreiem DMEM, versetzt mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit 3 – 30 μM der Verbindung 6 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und entweder 25 mj/cm2 UVB-Licht exponiert oder mit 50 ng/ml rhEGF stimuliert, und mit serumfreiem DMEM, versetzt mit 1 % BSA, gefüttert. Die Verbindung 6 wurde erneut zugegeben, und die Zellen wurden für 6 h bei 37°C inkubiert. 6 h nach der Stimulierung wurde der Zellüberstand gesammelt und in die Zellüberstände freigesetztes PGE2 wurde durch einen kompetetiven EIA unter Verwendung eines Acetylcholinesterase-PGE2-Tracers und Anti-PGE2-Antikörpern gemessen, welche mit dem ELISA-Kit (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) geliefert wurden. Zelluläres Protein wurde unter Verwendung des Pierce's BCA Protein-Assay-Verfahrens (Smith, P. K. et al., Alan. Biochem. 150 (1): 76-85, 1985) bestimmt.
  • Die Verbindung 6 wurde zunächst in einer Konzentration von 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO) gelöst und vor der Injektion mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Die Mäuse wurden vom Tag -2 an (d.h. 2 Tage vor der UVB-Exposition) bis zum Ende des Experiments täglich mit einer 16 mg/kg i.p. Bolusinjektion der Verbindung 6 behandelt. Ferner wurden die wirkstoffbehandelten Mäuse 15 min vor der Bestrahlung mit 1,5 mg/cm2 der Verbindung 6 bestrichen. Die Kontrollmäuse empfingen nur die Trägersubstanz.
  • Einer der Haupt-Arachidonsäuremetaboliten in UVB-bestrahlten Keratinozyten ist Prostaglandin E2, das schon nach 6 h nachgewiesen werden kann, zwischen 24-48 h nach der UVB-Exposition seinen Höhepunkt erreicht, und Ödeme und Erhytheme in der Haut verursacht (Gilchrest, B. A., et al., J. Am.
  • Acad. Dermatol. 5 (4): 411-22, 1981; Konger R. L., et al., Biochim. et Biophys. Acta (1401): 221-34, 1998; Woodward, D. F., et al., Agents Actions. 11 (6-7): 711-7, 1981; Snyder, D. S., und Eaglstein, W. H., Br. J. Dermatol. 90 (1): 91-93, 1974; Snyder, D. S., und Eaglstein, W., J. Invest. Dermatol. 62: 47-50, 1974; und Gupta, N., und Levy, L., Br. J. Pharmacol. 47 (2): 240-8, 1973). Wir bestimmten den Effekt der Verbindung 6 auf die PGE2-Freisetzung in UVB-bestrahlten epidermalen Zellen. Die menschlichen epidermalen Zellen, HaCaT, wurden UVB-Licht exponiert, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit der Verbindung 6 inkubiert und das kumulative, während der 6-stündigen Inkubation in die Zellüberstände freigesetzte PGE2 wurde bestimmt. Die Analyse der PGE2-Freisetzung (11) zeigte, dass eine UVB-Exposition von HaCaTs bei 25 mj/cm2 im Vergleich zur nicht-UVB-bestrahlten Kontrolle etwa einen elffachen (11,11 (4,23) Anstieg des PGE2-Spiegels 6 h nach der Bestrahlung induzierte. Die UVB-Licht induzierte Prostaglandinfreisetzung wurde durch die Verbindung 6 in konzentrationsabhängiger Weise gehemmt und eine etwa 90%-ige Hemmung der Prostaglandinfreisetzung wurde bei einer Dosis von 30 μM der Verbindung 6 beobachtet. Diese Daten deuteten an, dass die Verbindung 6 in der Lage ist, die Prostaglandin E2-Freisetzung in mit UVB-Licht stimulierten epidermalen Zellen zu hemmen.
  • Primäre menschliche Keratinozyten sowie HaCaTs exprimieren eine signifikant hohe Anzahl an funktionalen EGF-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche. Bei einer Stimulierung nehmen die auf den epidermalen Zellen vorhandenen EGF-Rezeptoren an der Transmembran-Signalleitung teil und induzieren die Bildung von Prostaglandinen. Um zu bestimmen, dass die zuvor beobachtete Hemmung der Prostaglandinfreisetzung durch die Verbindung 6 auf der Hemmung der EGF-R-Aktivierung beruht, untersuchten wir den Effekt der Verbindung 6 auf EGF-stimulierte Prostaglandinbildung in epidermalen Zellen. Stimulierung der HaCaT-Zellen mit 50 ng/ml rhEGF für 6 h induzierte einen etwa 4-fachen Anstieg der Prostaglandinfreisetzung im Vergleich zu nichtstimulierten Kontrolle (12) und der beobachtete Anstieg der Prostaglandinfreisetzung wurde in Gegenwart von 30 μM der Verbindung 6 inhibiert, was darauf hindeutet, dass (i) Rezeptoren für epidermale Wachstumsfaktoren die Prostaglandinbildung in epidermalen Zellen vermitteln, und (ii) die Verbindung 6 die Prostaglandinfreisetzung in UVB-Licht-stimulierten Zellen durch die Hemmung der EGF-R-Aktivierung hemmen.
  • Morphologie und Hautödem-Messung. Das morphologische Aussehen der UVB-bestrahlten Haut wurde visuell überwacht und mit der Haut von Kontrollmäusen verglichen. Die Hautfaltendicke der dorsalen Oberfläche der Mäuse wurde vor und für fünf Tage jeden Tag nach der UVB-Exposition mit einem digitalen Dickenmessgerät (Mitutoyo, So. Plainfield, NJ) aufgezeichnet, welches die Dicke im Bereich von 0-10 mm mit einer Genauigkeit von 0,015 mm misst.
  • Wie oben erwähnt, ist Prostaglandin E2 ein wirksamer Entzündungsmediator und wohlbekannt dafür, in der Haut nach Verletzung Gefäßerweiterung zu induzieren und Ödeme zu verstärken. Da unsere in vitro-Untersuchungen mit epidermalen Zellen gezeigt hatten, dass die Verbindung 6 die Freisetzung von PGE2 in UVB-stimulierten Zellen hemmt, waren wir daran interessiert, zu bestimmen, ob die Verbindung 6 in der Lage ist, die schädlichen Entzündungsantworten der Haut in Folge von UVB-Exposition in vivo zu hemmen. Für diese Untersuchungen verwendeten wir weibliche, haarlose, skh-1-Albinomäuse und exponierten ihre dorsale Oberfläche 250 mj/cm2 UVB-Licht. Die Hautfaltendicke der dorsalen Oberfläche der Mäuse wurde als Maß für Hautödeme vom 1. Tag bis zum 5. Tag nach Bestrahlung bestimmt. 13 zeigt, dass eine einzelne Exposition der Mäuse von 250 mj/cm2 UVB eine zeitabhängige Zunahme der Hautfaltendicke induzierte. Die Verbindung 6 war nicht in der Lage, die Hautödeme 24 h nach der Bestrahlung effektiv zu hemmen. Sie blockierte jedoch eine weitere Zunahme der Hautdicke 48 h nach der UVB-Exposition bei der bestrahlten Gruppe von Mäusen. Dagegen nahm die Hautdicke auf etwa 70% der Hautdicke der Kontrollmäuse zum gleichen Zeitpunkt zu. 72 h nach der Bestrahlung wurde eine signifikante Abnahme der Hautödeme bei mit der Verbindung 6 behandelten Mäusen beobachtet und am 5. Tag nach der Bestrahlung war die Hautfaltendicke der wirkstoffbehandelten Mäuse wieder fast bis auf das Kontrollniveau gesunken. Dagegen nahm die Hautdicke bei der trägersubstanzbehandelten Gruppe über fünf Tage insgesamt bis auf das 2,5- fache der Hautdicke der Kontrollmäuse zu. Ähnliche Ergebnisse wurden mit in Polyethylenglycol-200 (PEG-200) gelöstem P131 erhalten (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass die Verbindung 6 in der Lage ist, UVB-Licht-induzierte Hautödeme bei Mäusen zu hemmen.
  • Wir überwachten ebenfalls die morphologischen Veränderungen des Hautaussehens im Anschluss an UVB-Licht-Exposition bei mit Verbindung 6 behandelten und trägersubstanzbehandelten Gruppen von Mäusen. Sonnenbrandschäden der Haut in den ersten 24-48 h nach UVB-Exposition war als „Elephantenhaut"-Aussehen der Hautoberfläche erkennbar. Die UVB-Lichtbestrahlte Haut der Mäuse erschien rosafarben, lederartig und dick. An den Tagen 1 und 2 nach der Entzündungsinduktion wurde kein signifikanter Unterschied des Hautaussehens der wirkstoffbehandelten und trägersubstanzbehandelten Mäuse bemerkt. Bei UVB-bestrahlten, trägersubstanzbehandelten Mäusen wurden jedoch vom 3. Tag an viele sich von der Hautoberfläche abschälende Hautfetzen beobachtet und am 5. Tag war die Haut dieser Gruppe von Mäusen fest und lederartig geworden und hatte Narben auf der Oberfläche gebildet. Dagegen verbesserte sich das Hautaussehen der Mäuse in der mit Verbindung 6 behandelten Gruppe nach dem 3. Tag und am 5. Tag nach UVB waren die Anzeichen der Hautentzündung vermindert und das Hautaussehen war dem der Mäuse aus der Kontrollgruppe ähnlich (15).
  • UVB-Licht-induzierte histologische Veränderungen der Haut wurden ebenfalls untersucht. Die normale Epidermis besitzt typischerweise eine Schicht aus 2-3 Zellen und enthält verteilte Entzündungszellen, insbesondere um Haarfollikel herum (16). Die UVB-bestrahlte Haut zeigte eine verdickte Epidermis mit einer Schicht aus 3-5 Zellen. Weiterhin war eine hohe Anzahl an Neutrophilen in der Dermis angesammelt (16). Dagegen hatte die Haut von Mäusen, die mit der Verbindung 6 behandelt wurden, große Ähnlichkeit mit der Haut von nicht bestrahlen Kontrollen (16), mit einer Epidermisschicht von 1-2 Zellen und normaler Dermis. Daher verhinderte die Verbindung 6 die Entwicklung von Ödemen und den Zustrom von Neutrophilen in UVB-bestrahlter Haut von Mäusen.
  • Gefäßdurchlässigkeit. Die Gefäßdurchlässigkeit wurde quantitativ über das Austreten eines albumingebundenen, anionischen Farbstoffs, Evansblau (Sigma, St. Louis, MO), aus Gefäßen untersucht. Evansblau (1 %, 200 μl/Maus) wurde über die Schwanzvene injiziert. 4 h später wurden die Mäuse getötet und Gewebeproben der dorsalen bestrahlten Haut wurden entnommen. Aus den Gewebeproben wurde der Farbstoff in Formamid (Sigma, St. Louis, MO) extrahiert, indem die Proben für 2 h bei 80°C erwärmt wurden und die Extinktion des Formamids bei 620 nm gemessen wurde.
  • Da Ödeme mit gesteigerter Plasma-Exsudation assoziiert sind, bestimmten wir den Effekt der Verbindung 6 auf die UVB-induzierte Gefäßdurchlässigkeit der Haut. Die Daten zu Veränderungen der Gefäßdurchlässigkeit in Folge von UVB-Bestrahlung wurde in 14 dargestellt. Konsistent mit den Erkenntnissen zu Hautödemen gab es eine Zunahme der Gefäßdurchlässigkeit der Haut bei UVB-bestrahlten Mäusen. Der Effekt der Verbindung 6 war 24 h und 48 h nach der Bestrahlung minimal. Am Tag 5 nach UVB lag die Gefäßdurchlässigkeit in der mit Verbindung 6 behandelten Gruppe jedoch wieder auf dem Kontrollniveau, während bei der UVB-exponierten, trägersubstanzbehandelten Gruppe von Mäusen eine Zunahme auf das Fünffache beobachtet wurde.
  • Sonnenbrand-Zellfärbung und histologische Untersuchungen. Nachdem die Mäuse durch Zervixdilatation getötet wurden, wurde die Haut gelöst und auf einer Schicht aus Zahnwachs ausgebreitet. Ein Stück wurde ausgestanzt (8 mm) und in gepuffertem Formalin fixiert. 4-5 μm dicke Schnitte wurden von Paraffinblöcken geschnitten. Sonnenbrand-Zellfärbung wurde unter Verwendung des ApopTag Plus In Situ Nachweis-Kits (Oncor, Gaithersburg, MD) durchgeführt, welches Sonnenbrand-Zellen mittels direkter Fluoreszenz Digoxigenin-markierter genomischer DNA nachweist. Kurzgefasst, wurden die Reste von Digoxigenin-Nukleotiden katalytisch an die 3'-OH-Enden von doppel- oder einzelsträngiger DNA in Gegenwart des Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase-Enzyms angefügt, und die gebundenen Nukleotide wurden unter Verwendung eines mit Fluoreszein konjugierten Anti-Digoxygenin-Antikörpers nachgewiesen.
  • Um die histologischen Veränderungen nach Bestrahlung zu untersuchen, wurden die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und die gefärbten Objektträger wurden mikroskopisch untersucht.
  • Eine akute Exposition gegenüber UVB-Licht induziert Sonnenbrand in Hautzellen. Die Anwesenheit von Sonnenbrand-Zellen in UVB-bestrahlter Haut von Mäusen wurde unter Verwendung des In Situ Apoptose-Nachweis-Kits wie oben beschrieben nachgewiesen. Eine signifikante Anzahl an Sonnenbrand-Zellen (17) wurde in der Haut UVB-bestrahlter Mäuse 48 h nach der Licht-Exposition beobachtet. Dagegen wurden bei mit der Verbindung 6 behandelten Mäusen zum selben Zeitpunkt signifikant weniger oder gar keine Sonnenbrand-Zellen beobachtet. Daher legen die Daten nahe, dass die Verbindung 6 den UVB-induzierten Zelltod in der Haut vom Mäusen hemmt.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, Transplantations-Komplikationen zu verhindern oder zu behandeln, kann unter Verwendung von Assays, die im Handwerk bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die den in Beispiel 6 beschriebenen ähnlich sind, bestimmt werden.
  • Beispiel 6. Transplantations-Komplikationen
  • Proliferations-Assays. Splenozyten (4 × 105/100μl) von 9 Wochen alten C57BL6-Männchen wurden als Antwortgeber in Assays für Phytohämagglutinin (PHA)- und Concanavalin A (Con A)-induzierte Proliferation verwendet. Die Zellen wurden pro Gruppe dreifach in eine Mikroplatte mit 96-Vertiefungen in einem Endvolumen von 200 μl RPMI 1640 Medium, versetzt mit 10% fötalem Kälberserum gegeben. PHA oder Con A (Sigma, St. Louis, MO) wurden jeweils in den Konzentrationen 5 oder 2 μl/ml zugegeben. Verbindung 6 wurde in Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 50 μg/ml zugegeben. Die Zellen wurden für 3 Tage bei 37°C in 5% CO2 mit befeuchteter Luft in einem Inkubator kultiviert. Dann wurde ein kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung der Zellproliferation auf Basis der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen in lebenden Zellen (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Extinktion wurde bei 450/690 nm mit einem Multiskan MS Mikroplattenscanner gemessen. Der Zellproliferations-Wert wurde erhalten, indem der OD-Wert der PHA- oder Con A-stimulierten Zellproliferation um den OD-Wert nicht-stimulierter Zellen (Negativkontrolle) verringert wurde.
  • Gemischte Lymphozyten Reaktion („mixed lymphocyte reaction", MLR). Für den MLR-Assay wurden Antwortgeber-Zellen (von 9 Wochen alten C57BL6-Männchen gewonnene Splenozyten) dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 4 × 105/100 μl plattiert und Mitomycinbehandelte Stimulatoren (von 10-12 Wochen alten BALB/c-Männchen gewonnene Splenozyten) wurden in einer Konzentration von 8 × 104 in 50 μl zugegeben. Die Verbindung 6 wurde in den oben beschriebenen Konzentrationen zu einem Endvolumen von 200 μl zugegeben. Die Zellen wurden für 5 Tage kultiviert und ein kolorimetrischer WST-1-Assay wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Apoptosenachweis. C57BL6-Splenozyten (3 × 106/ml) wurden in Platten mit 24 Vertiefungen für 24 h in 500 μl RPMI 1640 unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert. Die Verbindung 6 wurde in den Konzentrationen 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml zugegeben. Apoptotischer Zelltod wurde mittels TUNEL unter Verwendung des In Situ Zellnachweis-Kits, Fluoreszein (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) nachgewiesen. Nach der Kultivierungsperiode wurden die Zellen nach den Anweisungen des Herstellers gewaschen, fixiert, permeabilisiert und gefärbt und die Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung eines FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
  • Mäuse. Empfänger von Knochenmarkstransplantationen waren 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6 (H-2b) Mäuse und Donoren waren 6-8 Wochen alte BALB/c (H-2d) Männchen (beide Stämme wurden bei Taconic, Germantown, NY bezogen). Die Mäuse wurden in der Tierpflegeeinrichtung am The Hughes Institute unter den spezifischen pathogenfreien Bedingungen („specific-pathogenfree condition", SPF) gehalten. Freier Zugang zu Standard-Mäusenahrung (Harlan Teklad LM-485) und Wasser war möglich. Den Empfängern wurde ab dem Tag vor der Transplantation mit Antibiotika versetztes Wasser gegeben (Sulfamethoxazol/Trimethoprim, Hi-Tech Pharmacal, Amityvill, NY).
  • Bestrahlung. In einem tortenstückförmigen Plexiglas-Behälter positionierte Empfängermäuse, wurden einen Tag vor der Knochenmarkstransplantation mit einer letalen Dosis (7,5 Gy) Cäsium bestrahlt (JL Sheppard Labs, 47,08 rad/min).
  • Knochenmarkstransplantation („bone marrow transplantation", BMT). Donor BALB/c Knochenmark wurde in RPMI 1640 mit L-Glutamin (Cellgro), (Mediatech, Hendon, VA) gesammelt, indem die Schäfte der Fimur und Tibia gespült wurden. Zur gleichen Zeit wurden auch Donor-Einzelzellsuspensionen von Splenozyten hergestellt, welche mittels Lysispuffer (ACK Lysispuffer – 0,15 M NH4Cl, 0,1 M KHCO3, 0,01 M Na2EDTA) von roten Blutzellen befreit wurden. BM-Zellen wurden durch Agitation mit einer Pasteurpipette suspendiert und mittels Passage durch einen feinenporigen Nylon-Zellseiher von Debris getrennt. Rote Blutzellen wurden durch Lysispuffer entfernt und Debris-Klumpen wurden absetzen gelassen. Die Zellen wurden gewaschen und zur i.v. Injektion über die kaudale Vene resuspendiert. Das Standardinokulum bestand aus 25 × 106 BM-Zellen und 25 × 106 Splenozyten in 0,5 ml RPMI 1640.
  • Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit („graft-versus-host disease", GVHD) Überwachung. BMT-Empfänger wurden während der 90-tägigen Überwachungsdauer täglich auf erste klinische Anzeichen von GVHD (bestimmt durch Gewichtsverlust, Manifestation von Hauterythemen, Allopecia, Buckelbildung, Diarrhöe) und die Überlebensrate hin überwacht. Die Überlebenszeiten wurden vom Tag der BMT an (Tag 0) gemessen. Todesfälle innerhalb von 11 Tagen nach der Transplantation wurden als durch die Bestrahlung verursacht eingestuft, und ausgeschlossen.
  • Wirkstoffbehandlungen. Es wurde Mäusen zur GVHD-Prophylaxe beginnend mit dem Tag vor der BMT (-1) oder dem Tag der BMT (0) tägliche intraperitoneale (i.p.) Injektionen der Verbindung 6 (WHI-P131), 4-(3'-Hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin (WHI-P132, Verbindung 7), Cyclosporin (Sandimmune®, Sandoz Pharmaceuticals Ltd., Basel, Schweiz), Methylprednisolon (Depo-Medrol®, Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan), Methotrexat (Immunex Corporation, Seattle, Washington) und der Trägersubstanzkontrolle verabreicht. Verbindung 6 wurde in Dosen zu 25 mg/kg/Tag und 60 mg/kg/Tag (aufgeteilt auf drei Dosen) verabreicht – Verbindung 7 zu 50 mg/kg/Tag (aufgeteilt auf drei Dosen), vom Tag 0 der BMT an; Cyclosporin, Methylprednisolon und Methotrexat wurden in Dosen gemäß dem Protokoll der Children Cancer Group (CCG) verabreicht: jeweils 3 mg/kg/Tag (aufgeteilt auf zwei Dosen), 10 mg/kg/Tag (aufgeteilt auf zwei Dosen) und 10 mg/m2/Tag (einmal täglich). Die Behandlungen mit Cyclosporin und Methylprednisolon begannen am Tag vor der BMT (-1) und dauerten bis zu Ende des Experimentes, während Methotrexat an den Tagen 1, 3, 6 und 11 nach der BMT verabreicht wurde.
  • Statistische Analyse. Die statistische Analyse der in Proliferations-Assays erhaltenen Daten, der MLR und der Apoptose-Daten wurde unter Verwendung des Student's-t-Tests durchgeführt, während Überlebensdaten mit Sterblichkeitstabellen-Verfahren unter Verwendung des Mantel-Cox-Tests analysiert wurden.
  • Die Daten der oben beschriebenen Assays sind in den 18–23 gezeigt.
  • 18. Dosisabhängige Suppression der MLR (A), PHA-induzierten (B) und ConA-induzierten (C) Proliferation von Splenozyten durch WHI-P131. WHI-P131 wurde während der 5-tägigen (MLR) oder 3-tägigen Kultivierungsdauer (PHA und ConA-Assays) in Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 50 μg/ml zugegeben. Die Proliferation wurde durch den kolorimetrischen WST-1 Assay gemessen. Die Ergebnisse sind als mittlere OD +/- SEM aus 3-7 getrennten Experimenten dargestellt. Die statistische Differenz zwischen den Gruppen wurde durch den Student's-t-Test analysiert.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, Autoimmunerkrankungen (z.B. autoimmuninduzierter Diabetes) zu verhindern oder zu behandeln, kann unter Verwendung von Assays, die im Handwerk bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die den in Beispiel 7 beschriebenen ähnlich sind, bestimmt werden.
  • Beispiel 7. Autoimmunerkrankungen
  • C57BL/6- und NOD-Mäuse wurden von Taconic (Germantown, NY) bezogen, und unter pathogenfreien Bedingungen in der Tierpflegeeinrichtung am Hughes Institute gehalten. Jak3-I- (C57BL/6 × 129/Sv)-Mäuse, homolog in Bezug auf das gestörte Jak3-Gen, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. J. N. Ihle, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN. Eine homozygote Jak3-I--Maus wurde mit C57BL/6-Mäusen gekreuzt und die Nachkommen der F1-Generation wurden mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt. Nach drei Generationen des Rückkreuzens mit C57BL/6, wurden die Nachkommen untereinander gekreuzt, so dass Jak3-I- und Wildtyp (WT)Jak3+/+-Mäuse entstanden, welche in unseren Experimenten verwendet wurden.
  • Induktion des LDSTZ-Modells für Diabetes. Männlichen C57BL/6-Mäusen oder Jak3-Mangel- und Wildtyp-Mäusen (8-10 Wochen alt) wurde zur Induktion von experimentellem Autoimmun-Diabetes (LDSTZ) an 5 aufeinanderfolgenden Tagen täglich intraperitoneal eine niedrige Dosis (40 mg/kg) STZ (Sigma, St. Louis, MO) injiziert. STZ wurde in Citratpuffer pH 4,0 auf Eis gelöst und innerhalb von 10 min nach der Zubereitung injiziert. Von der zweiten Woche (Tag 7) nach der STZ-Verabreichung an wurden die Mäuse auf die Entwicklung von Diabetes hin überwacht, indem der Blutzucker mit dem „One Touch Profile" Diabetes-Meßsystem (Lifescan, Milpitas, CA) getestet wurde. Mäuse mit einem Blutzucker über 220 mg/dl bei drei aufeinanderfolgenden Tests wurden als diabetisch angesehen, wobei der erste Nachweis der chronischen Glykämie als Beginn des Diabetes angenommen wurde. Eine Gruppe von C57BL/6-Mäusen wurde mit WHI-P131 – 100 mg/kg/Tag, i.p., in zwei gleiche Dosen aufgeteilt, vom Beginn des Experiments bis zum 25. Tag behandelt. Da WHI-P131 in 10% DMSO in PBS gelöst war, wurden Kontrollmäuse unter denselben Bedingungen wie oben mit 10% DMSO in PBS behandelt.
  • Behandlung von NOD-Weibchen mit WHI-P131 und Bewertung der Diabetes-Entwicklung. NOD-Weibchen wurden ab einem Alter von 5 oder 10 Wochen täglich i.p. mit verschiedenen Dosen von WHI-P131 behandelt. Kontrollmäuse wurden mit 10% DMSO in PBS behandelt. Die Mäuse wurden ab einem Alter von 10 Wochen auf die Entwicklung von Diabetes hin überwacht, indem der Blutzucker mit dem „One Touch Profile" Diabetes-Meßsystem wie oben beschrieben getestet wurde.
  • Intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT). Der intraperitoneale Glukosetoleranztest (IPGTT) wurde am Ende der Experimentdauer (Alter der NOD-Mäuse: 25 Wochen) in der Gruppe der nicht-diabetischen WHI-P131-behandelten und der trägersubstanzbehandelten Kontroll-NOD-Weibchen durchgeführt. Die Mäuse wurden einer 10-stündigen Hungerperiode unterzogen und die Glukoselösung (1,5 g/kg Körpergewicht) wurde i.p. injiziert. Vor und nach der Glukoseinjektion wurden Blutproben genommen und der Blutzuckerspiegel wurde (wie oben beschrieben) zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 und 120 min gemessen.
  • Histologie. Die Gruppen der Kontroll- und WHI-P131-behandelten nichtdiabetischen NOD-Weibchen wurden am Ende der Experimentdauer (im Alter von 25 Wochen) getötet und die charakteristischen histopathologischen Läsionen der Inseln (Insulitis) wurden bei jeder Maus ausgewertet, wobei mindestens 25 Inseln pro Maus bewertet wurden. Kurzgefasst wurde die Pakreas entfernt, in 10% Fomalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und für lichtmikroskopische Untersuchungen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Alle Inseln, von drei nicht-überlappenden Pankreasebenen entnommen, wurden wie folgt einer Insulitis-Maßzahl zugewiesen: 0 – keine sichtbaren Läsionen; 1 – Peri-Insulitis ohne Insel- Penetration; 2 – < 25% der Insel infiltriert; 3 – > 25% der Insel infiltriert; 4 – Endstadium.
  • Adoptiver Transfer diabetischer Splenozyten auf NOD-scid/scid-Weibchen und Bewertung der Diabetes-Entwicklung.
  • Einzelzellsuspensionen von Milzleukozyten, gesammelt von 8-10 diabetischen NOD-Weibchen, wurden durch Passage durch einen Nitext 110 Filter präpariert und rote Blutzellen wurden in 10x Gey's-Lösung lysiert. Aliquots zu 1 × 107 Splenozyten wurden intravenös in 4 Wochen alte NOD/Lt-scid/scid-Weibchen (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) adoptiv transferiert. Die Behandlung mit WHI-P131 (50 mg/kg) oder die Kontrollbehandlung (10% DMSO in PBS) der NOD-scid-Mäuse begann zur gleichen Zeit. Die Mäuse wurden auf die Entwicklung von Diabetes hin beobachtet, indem von der zweiten Woche nach dem Transfer an jede Woche der Harnzucker mit Chemstrip uGK-Streifen (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) getestet wurde. Mäuse mit einem Harnzucker über 500 mg/dl (+++) bei aufeinanderfolgenden wöchentlichen Tests wurden als diabetisch angesehen, wobei der erste Nachweis der chronischen Glykosurie als Beginn des Diabetes angenommen wurde.
  • Statistische Analyse. Die statistische Analyse wurde mittels des ungepaarten Student's-t-Tests (IPGTT und Insulitis-Daten) und des ANOVA-Tests (Unterschiede des Blutzuckerspiegels zwischen den experimentellen Gruppen) durchgeführt. Experimentelle Unterschiede der Untersuchungen zur Häufigkeit von IDDM bei WHI-P131-behandelten und Kontroll-NOD, sowie LDSTZ-behandelten Mäusen oder bei adoptiv transferierten scid Mäusen wurden mittels der Kaplan-Meier Sterblichkeitstabellen-Analyse unter Verwendung des Mantel-Cox-Tests analysiert. Der p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
  • Ergebnisse zu Beispiel 7.
  • Entwicklung von LDSTZ-Diabetes ist bei Mäusen mit JAK3-Mangel gehemmt.
  • 24 zeigt die kumulative Diabetes-Häufigkeit (A) und den Blutzuckerspiegel (B) bei JAK3-Mangel- und WT-Mäusen, die mit niedrigdosiertem STZ behandelt wurden. Während 13/13 (100%) der WT-Mäuse bis zum 14. Tag nach der ersten STZ-Injektion eine Hyperglykämie entwickelten, wurde nur 1/12 (8,3%) der JAK3-Mangel-Mäuse während der gesamten Experimentdauer von 25 Tagen diabetisch (p < 0,0001) (24). WT-Mäuse zeigten vom 7. Tag an einen Anstieg des Blutzuckers, wobei das hyperglygämische Niveau (> 220 mg/dl) am 9. Tag nach der ersten STZ-Injektion erreicht wurde (25). Dagegen blieben JAP3-Mangel-Mäuse während der gesamten Experimentdauer normoglykämisch (p < 0,0001 im Vergleich zum glykämischen Niveau des WT mit ANOVA) (25).
  • Hemmung der Diabetes-Entwicklung im LDSTZ-Krankheitsmodell durch den JAK3 Kinaseinhibitor WHI-P131. Tägliche Behandlung von C57BL/6-Männchen mit 100 mg/kg WHI-P131 (2 Dosen) i.p., vom ersten Tag der STZ-Injektionen an, hemmte die Entwicklung von LDSTZ-Diabetes (26). Während 20/38 (52,6%) der Kontrollmäuse am siebten Tag Diabetes entwickelten, gefolgt von 32/38 (84,2%) diabetischer Mäuse am 9. Tag und 36/38 (97,4%) diabetischer Mäuse am 11. Tag nach der ersten STZ-Injektion, wurden lediglich 4/20 (20%) der WHI-P131 behandelten Mäuse am 7. Tag diabetisch, gefolgt von 10/20 (50%) am 9. Tag und 13/20 (65%) am 11. Tag (26). 27 zeigt, dass WHI-P131-behandelte Mäuse während der gesamten Experimentdauer einen signifikant niedrigeren Blutzuckerspiegel (p = 0,027) im Vergleich zu den Kontrollmäusen aufwiesen.
  • Prävention der IDDM-Entwicklung bei NOD-Weibchen durch WHI-P131-Behandlung. Die Diabeteshäufigkeit bei NOD-Weibchen, welche täglich mit: a) 20 und 50 mg/kg WHI-P131 ab einem Alter von 5 Wochen bis zum Alter von 25 Wochen (24), und b) 100 mg/kg WHI-P131 ab einem Alter von 5 bis 8, 5 bis 25 und 10-25 Wochen (25) behandelt wurden, wurde untersucht. Während Diabetes bei DMSO-behandelten Mäusen (Kontrolle) mit einem Alter von 13 Wochen auftrat, begannen die WHI-P131-behandelten Mäuse (50 mg/kg) mit einem Alter von 22 Wochen Diabetes zu entwickeln (24). Mit 25 Wochen wurden 22/37 (60%) der Kontrollmäuse diabetisch, während nur 2/11 (18%) der NOD-Weibchen, welche mit 50 mg/kg WHI-P131 behandelt wurden, Diabetes entwickelten (p = 0,017). Tägliche Behandlung mit 20 mg/kg WHI-P131 zeigte keinen Schutzeffekt auf die Diabetes-Entwicklung – 5/9 (56%) der behandelten Mäuse entwickelten bis zum Alter von 18 Wochen Diabetes (24). Wir fragten uns, ob eine kurzzeitige Behandlung mit 100 mg/kg WHI-P131 im Alter von 5 bis 9 Wochen einen anhaltenden Schutzeffekt haben könnte. 25 zeigt, dass eine solche Behandlung nicht im Schutz vor der Diabetes-Entwicklung resultierte – Diabetes begann im Alter von 10 Wochen und bis zum Alter von 25 Wochen wurden 10/12 (83%) der NOD-Weibchen diabetisch. Dann wurde untersucht, ob eine Behandlung mit 100 mg/kg WHI-P131 zu einem späteren Zeitpunkt (ab einem Alter von 10 Wochen) effektiv bei der Vorbeugung vor Diabetes sein könnte. 25 zeigt, dass eine Behandlung mit 100 mg/kg WHI-P131, die im Alter von 10 Wochen beginnt, ebenso effektiv ist, wie eine früher, im Alter von 5 Wochen, begonnene Behandlung – die Diabeteshäufigkeit erreichte im Alter von 25 Wochen 9% (1/11) unter der ersten Behandlung (p = 0,007 im Vergleich zu den Kontrollen) und 18% (4/22) unter der späteren (p = 0,025 im Vergleich zu den Kontrollen).
  • Eine Gruppe normoglykämischer NOD-Weibchen, die mit DMSO (n = 3) oder mit 100 mg/kg WHI-P131 für 20 (n = 6) oder 15 Wochen (n = 7) behandelt wurden, wurde am Ende der Experimentdauer (im Alter von 25 Wochen) einer Hungerperiode unterzogen, und ein IPGTT wurde durchgeführt. Nicht-diabetische, nichtbehandelte C57BL/6-Mäuse (n = 5) wurden als Kontrolle ebenfalls im IPGTT-Test verwendet. Die Ergebnisse – die Blutzuckerspiegel waren bei den C56BL/6-Mäusen und beiden Gruppen von WHI-P131-behandelten NOD-Mäusen während einer 120-minütigen Zeitdauer nach der Glukosestimulation ähnlich. Dagegen zeigten normolykämische, DMSO-behandelte Mäuse zu jedem beobachteten Zeitpunkt einen signifikant höheren Blutzuckerspiegel als jede der WHI-P131-behandelten Gruppen.
  • Weiterhin wurde eine histologische Untersuchung des Insulitis-Grads der Bauchspeicheldrüsen durchgeführt, welche von den im IPGTT untersuchten Mäusen gewonnen wurden. Die Insulitis-Maßzahl der Kontrollen (n = 3) betrug 1,43 +/- 0,15, während die Insulitis-Maßzahl der NOD-Weibchen, welche im Alter von 5-25 Wochen mit WHI-P131 behandelt wurden, mit 0,86 +/- 0,12 signifikant niedriger lag (p = 0,026). Die Insulitis-Maßzahl der NOD-Weibchen, welche im Alter von 10-25 Wochen mit WHI-P131 behandelt wurden, unterschied sich jedoch nicht von den Kontrollen (1,42 +/- 0,24).
  • Vorbeugung gegen Diabetes-Entwicklung bei adoptiv transferierten NOD-scid/scid-Weibchen durch Behandlung mit WN1-P131. Da WHI-P131 die Fähigkeit zur Vorbeugung gegen die Diabetes-Entwicklung bei NOD-Weibchen während der prädiabetischen Phase der spontanen Entwicklung von Typ I Diabetes zeigte, wollten wir als Nächstes bestimmen, ob WHI-P131 in der Lage ist, Effektoren von bereits diabetischen Mäusen bei der Übertragung der Krankheit auf NOD-scid-Mäuse zu unterdrücken. Zwei Gruppen von NOD-scid-Weibchen wurden adoptiv 1 × 107 Splenozyten von diabetischen NOD-Weibchen transferiert und eine Gruppe wurde vom Tag des Transfers an täglich mit 50 mg/kg WHI-P131 behandelt (n = 12), während eine andere mit 10% DMSO behandelt wurde (n = 11) (31). Während 6/11 (55%) der NOD-scid-Kontrolle nach 4 Wochen diabetisch wurden, gefolgt von 8/11 (73%) diabetischer Mäuse 5 Wochen nach dem adoptiven Transfer, wurde lediglich 1/12 (8%) der WN1-P131-behandelten NOD-scid-Weibchen während derselben Experimentdauer diabetisch (28). Offensichtlich wurde die Diabetes-Entwicklung nach dem adoptiven Transfer durch die Behandlung mit WHI-P131 signifikant verhindert (p < 0,002).
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, das Überleben eines Allotransplantats zu verlängern, kann unter Verwendung von Assays, die im Handwerk bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die den in Beispiel 8 beschriebenen ähnlich sind, bestimmt werden.
  • Beispiel 8. Verlängerung des Überlebens von Allotransplantaten, ohne die Inselzell-Funktion zu stören.
  • Männliche, 8-12 Wochen alte C57BL/6-Mäuse (H-2b) wurden als Empfänger genutzt und BALB/c (H-2d)-Männchen desselben Alters wurden als Donoren verwendet. Beide Mäusestämme wurden von Taconic (Germantown, NY) bezogen und unter pathogenfreien Bedingungen in der Tierpflegeeinrichtung am Hughes Institute gehalten. Jak3-I- (C57BL/6 × 129/Sv H-2b)-Mäuse, homolog in Bezug auf das gestörte Jak3-Gen, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. J. N. Ihle, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN. Eine homozygote Jak3-I--Maus wurde mit C57BL/6-Mäusen gekreuzt und die Nachkommen der F1-Generation wurden mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt. Nach drei Generationen des Rückkreuzens mit C57BL/6, wurden die Nachkommen untereinander gekreuzt, so dass Jak3-I- und Wildtyp (WT)Jak3+/+-Mäuse entstanden. 10-12 Wochen alte Jak3-I- und WT-Männchen wurden als Empfänger von BALB/c-Inseln verwendet.
  • Gemischte Lymphozyten Reaktion („mixed lymphocyte reaction", MLR). Für den MLR-Assay wurden Antwortgeber-Zellen (von 10 Wochen alten C57BL/6-Männchen gewonnene Splenozyten) dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 4 × 105/100 μl RPMI (Life technologies, Grand Island, NY), mit Zugabe von 10% fötalem Rinderserum (Laboratories Inc., Logan, UT), plattiert. Mitomycin-behandelte Stimulatoren (von 10-12 Wochen alten BALB/c-Männchen gewonnene Splenozyten) wurden in einer Konzentration von 8 × 104 in 50 μl zugegeben. WHI-P131 wurde in verschiedenen Konzentrationen zu einem Endvolumen von 200 μl zugegeben und die Zellen wurden für 5 Tage bei 37°C in 5% CO2 mit befeuchteter Luft in einem Inkubator kultiviert. Dann wurde ein kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung der Zellproliferation auf Basis der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen in lebenden Zellen (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Extinktion wurde bei 450/690 nm mit einem Multiskan MS Mikroplattenscanner gemessen. Der Zellproliferations-Wert wurde erhalten, indem der OD-Wert der Proliferation stimulierter Zellen um den OD-Wert nicht-stimulierter Zellen verringert wurde (die OD-Werte nicht stimulierter Zellen lagen im Bereich von 0,370 – 0,450).
  • Apoptosenachweis. C57BL6-Splenozyten (3 × 106/ml) wurden in Platten mit 24 Vertiefungen für 20 h in 500 μl RPMI-1640 unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert. WHI-P131 wurde in den Konzentrationen 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml zugegeben. Apoptotischer Zelltod wurde mittels TUNEL unter Verwendung des In Situ Zellnachweis-Kits, Fluoreszein (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) nachgewiesen. Nach der Kultivierungsperiode wurden die Zellen nach den Anweisungen des Herstellers gewaschen, fixiert, permeabilisiert und angefärbt und die Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung eines FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
  • Durchflußzytometrische (FACS)-Analyse. Eine Einzelzellsuspension von Splenozyten wurde von WN1-P131- (130 mg/kg/Tag) oder trägersubstanzbehandelten C57BL/6-Mäusen hergestellt, rote Blutzellen wurden mit Lysis-Puffer lysiert und die Splenozyten (1 × 106) wurden mit einer 1:100 Verdünnung der folgenden monoklonalen Anti-Maus-Antikörper (Ak) angefärbt: Anti-CD3-FITC Ak (Klon 145-2C11), Anti-CD4-FITC Ak (Klon GK.5), Anti-CD8-PE Ak (Klon 53-6.7) und Anti-CD19-PE Ak (Klon 1 D3). Alle Antikörper wurden von Pharmingen (San Diego, CA) bezogen. Die angefärbten Splenozyten wurden unter Verwendung eines FACS Calibur wie oben beschrieben analysiert.
  • Insel-Isolierung. Langerhanssche Inseln wurden mittels Gallengangsperforation mit 3-4 ml Kollagenase P (3 mg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und Desoxyribonuclease (0,1 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) aus BALB/c-Männchen isoliert, wie zuvor von Cetkovic-Cvrlje, M., et al., Diabetes 46: 1975-1982, 1997) beschrieben. Die Inseln wurden von Hand 3-4 Mal unter dem Präpariermikroskop abgezupft, bis sie frei von exokrinem Gewebe, Gefäßen, Lympfknoten und -gefäßen und bereit zur Transplantation waren.
  • Transplantation allogener Inseln und Wirkstoffbehandlung. Vierhundert Inseln wurden in eine Hamiltonspritze gegeben und unter die linke Nierenkapsel jeder diabetischen Empfänger-Maus transplantiert. Die Empfänger wurden eine Woche vor der Transplantation mit einer einzelnen i.p. Dosis Streptozotocin (200 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO) diabetisch gemacht. Der Blutzuckerspiegel wurde mit dem „One Touch Profile" Glukose-Meßsystem (Lifescan, Milpitas, CA) gemessen. Nur diabetische Mäuse mit einem erhöhten Blutzuckerspiegel über 350 mg/dl wurden als Transplantat-Empfänger verwendet. Die Funktion der Allotransplantate wurde durch Serienmessungen des Blutzuckerspiegels überwacht. Primäre Transplantatfunktion wurde als Blutzuckerspiegel unter 200 mg/dl am 3. Tag nach der Transplantation definiert und Transplantatabstoßung wurde als Anstieg des Blutzuckerspiegels über 250 mg/dl bei zwei aufeinanderfolgenden Messungen nach einer Zeit der primären Transplantatfunktion definiert. Die Empfänger wurden vom Tag der Transplantation bis zum Tag der Abstoßung täglich mit hochdosiertem Cyclosporin A (20 mg/kg, Sigma, St. Louis, MO), WHI-P131 (50 und 75 mg/kg, aufgeteilt auf drei Dosen), WHI-P132 (50 mg/kg, aufgeteilt auf drei Dosen) oder mit der Trägersubstanzkontrolle behandelt. Alle Injektionen wurden i.p. verabreicht.
  • Intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT) bei syngenetischen Inseltransplantat-Empfängern. Der IPGTT wurde bei C57BL/6-Empfängern durchgeführt, denen syngenetische Inseltransplantate (400 C57BL/6 Inseln) transplantiert wurden, und die für zwei Wochen mit WHI-P131 oder der Trägersubstanzkontrolle behandelt wurden. Die Mäuse wurden einer 10-stündigen Hungerperiode unterzogen und die Glukoselösung (1,5 g/kg Körpergewicht) wurde i.p. injiziert. Vor und nach der Glukoseinjektion wurden Blutproben genommen und der Blutzuckerspiegel wurde (wie oben beschrieben) zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 und 120 min gemessen.
  • Histopathologische Untersuchungen. Die Trägersubstanzkontrolle (n = 3) und die WHI-P131-behandelten C57BL/6-Empfänger (n = 5) der Inseltransplantate wurden am Tag 14 nach der Transplantation getötet; Jak3-I--Empfänger (n = 6) wurden am Tag 100 nach der Transplantation getötet; Die C57BL/6-Empfänger syngenetischer Inseln – Trägersubstanzkontrolle – (n = 4) und WHI-P131-behandelt (n = 5) wurden am Tag 180 nach der Transplantation getötet. Nieren mit Transplantaten wurden entfernt, in 10% Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Serienschnitte des Transplantatbereichs wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Zur Insulinfärbung wurden Schnitte mit dem Immunperoxidase-Verfahren unter Verwendung einer 1:100 Verdünnung von polyklonalen Meerschweinchen-Anti-Insulin-Antikörpern (Gpx Insulin, Dako, Carpineteria, CA) und einer 1:100 Verdünnung eines sekundären, mit Meerettichperoxidase konjugierten Antikörpers (Guinea Pig Immunoglobulins HRP, Dako, Carpinteria, CA) angefärbt. Die Schnitte wurden kurz mit Hämatoxylin gegengefärbt und zur lichtmikroskopischen Untersuchung befestigt.
  • Statistische Analyse. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des ungepaarten Student's-t-Tests durchgeführt (MLR- und FACS-Daten). Experimentelle Unterschiede bei den Allotransplantat-Abstoßungen zwischen den wirkstoffbehandelten und den Kontrollgruppen wurden mittels der Kaplan-Meier-Analyse unter Verwendung des Mantel-Cox-Tests bewertet. Der p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
  • Ergebnisse zum Beispiel 8.
  • Jak3-I--Mäuse stoßen ein Insel-Allotransplantat nicht ab. Männchen mit JAK3-Mangel (n = 6) und ihren WT-Geschwistern aus dem selben Wurf (n = 7) – durch STZ diabetisch gemacht – wurden BALB/c-Inseln unter die Nierenkapsel transplantiert und der Blutzuckerspiegel wurde für 100 Tage nach der Transplantation beobachtet. Während die Insel-Allotransplantate der WT-Kontrollen mit einer MST von 12,9 +/- 1,1 Tagen abgestoßen wurden, überlebten alle Insel-Allotransplantate der Jak3-I--Empfänger 100 Tage nach der Transplantation (32). Histologische Analyse der Transplantate zeigte keine Infiltration (Daten nicht gezeigt) bis leichte mononukleare Infiltration des Transplantatbereichs mit vollständig bewahrter Insel-Morphologie.
  • WHI-P131-induzierte Hemmung der MLR-Antwort. WHI-P131, in den Konzentrationen 0,1, 1, 10 und 50 μg/ml zugegeben, hemmte die Proliferation alloreaktiver Splenozyten in MLR in dosisabhängiger Weise (33). Während die WHI-P131-Konzentration 0,1 g/ml eine statistisch signifikante Reduktion (p = 0,0095) der MLR-Antwort induzierte, wurde die vollständige Aufhebung der Antwort (die erhaltenen OD-Werte lagen unter dem OD-Wert der nicht stimulierten Kontrolle) mit Zugabe von 1 μg/ml WHI-P131 erhalten (33). Als nächstes testeten wir, ob WHI-P131-induziertes Absterben von Lymphozyten der Grund für die gehemmte MLR-Antwort war. Dazu wurden apoptotische Splenozyten (TUNEL-positiv) nach der 20-stündigen Kultivierungszeit unter Zugabe verschiedener Konzentrationen von WHI-P131 bestimmt. 34 zeigt, dass der apoptotische Zelltod von Splenozyten bei Kultivierung unter Zugabe von 0,1 und 1 μg/ml WHI-P131 sich nicht von Kontrollzellen unterscheidet, während die Zugabe von 10 und 100 μg/ml den apoptotischen Zelltod im Vergleich zum Kontroll-Zelltod während der beobachteten Kultivierungszeit signifikant steigerte (jeweils p = 0,008 und p < 0,0001). Daher scheinen die mit niedrigeren Konzentrationen des Wirkstoffs (0,1 und 1 μg/ml) erhaltenen Effekte von WHI-P131 auf die MLR-Suppression nicht durch eine Induktion des Zelltods verursacht zu sein.
  • WHI-P131-Behandung von Empfängern verlängerte das Überleben von Insel-Allotransplantaten. Die C57BL/6-Kontrollmäuse (n = 39) stießen ein BALB/c-Insel-Allotransplantat mit einer mittleren Überlebenszeit („mean survival time", MST) von 14,1 +/- 0,9 Tagen ab. Tägliche Behandlung der Empfänger (n = 10) mit hochdosiertem – 20 mg/kg – CsA (18) steigerte das Transplantat- Überleben signifikant (MST = 27,9 +/- 4,6 Tage) (p = 0,0005) (35). Behandlungen mit 50 mg/kg (n = 14) oder 75 mg/kg (n = 14) WHI-P131 waren im Vergleich zu den Kontrollen (jeweils p = 0,0002 und 0,001) ebenso effektiv wie die CsA-Behandlung bei der Verlängerung des Transplantat-Überlebens (jeweils MST = 24,7 +/- 3,4 und 25,3 +/- 3,8) (35).
  • Histologische Untersuchung der Insel-Allotransplantate, die 14 Tage nach der Transplantation normoglykämischen Empfängern entnommen wurden, welche mit der Trägersubstanzkontrolle behandelt wurden (n = 3), zeigte Lymphozyten-Invasion und massive Zerstörung von Inseln, was durch Immunfärbung gegen Insulin deutlich zu erkennen war. Diese Erkenntnis steht in deutlichem Kontrast zu Allotransplantaten von Empfängern, welche mit 50 mg/kg WHI-P131 behandelt wurden (n = 5), bei denen Lymphozyten-Invasion auftrat, aber keine extensive Zerstörung von Inseln stattfand. Die hyperglykämischen trägersubstanzbehandelten Allotransplantate (n = 4), zum selben Zeitpunkt entnommen, waren vollständig von Lymphozyten invasiert, und es blieben keine insulinproduzierende Zellen zurück.
  • Das nächste Experiment wurde im Hinblick auf die Untersuchung der Effekte von WHI-P131 auf Splenozyten-Populationen in vivo durchgeführt. C57BL/6-Männchen wurden für 10 Tage mit 130 mg/kg WN1-P131 (n = 7) und mit der Trägersubstanzkontrolle (n = 5) behandelt. Die Gesamtzahl der Splenozyten betrug 154 +/- 8,5 × 106 bei den trägersubstanzbehandelten Kontrollen, während eine reduzierte Anzahl an Splenozyten – 119 +/- 9,4 × 106 – bei den WHI-P131-behandelten Mäusen gefunden wurde (p = 0,025). Es bestanden keine Unterschiede bei den prozentualen Anteilen an CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen zwischen den WHI-P131- und trägersubstanzbehandelten Mäusen (Daten nicht gezeigt). 5 zeigt jedoch, dass leichte Unterschiede in der Anzahl der untersuchten Zellpopulationen zwischen den WHI-P131-behandelten und den Kontrollgruppen gefunden wurden. Demgemäss wurde die Anzahl der CD3+-Splenozyten (wenn auch nicht statistisch signifikant, p = 0,0617) bei den WHI-P131-behandelten Mäusen auf 37,7 +/- 3,2 × 106 im Vergleich zu 46,9 +/- 2,6 × 106 bei den Kontrollen reduziert. Die Anzahl der CD4+ T-Zellen – 16,8 +/-1,2 × 106 (p = 0,0416), sowie der B-Zellen – 57,1 +/- 5,3 × 106 (p = 0,0267) war bei den WHI-P131-behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen – jeweils 20,5 +/- 0,6 × 106 und 78,2 +/- 6,1 × 106 reduziert (36).
  • Die Funktion transplantierter syngenetischer Inseln wird nach der Langzeitbehandlung mit WHI-P131 aufrechterhalten. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um den Effekt einer Langzeitbehandlung (180 Tage) mit 50 mg/kg WHI-P131 auf die Funktion syngenetischer Inseltransplantate zu testen. Wie aus der 37 ersichtlich war, unterschied sich der nicht-nüchtern gemessene Blutzuckerspiegel zwischen der Trägersubstanzkontrolle (n = 4) und den WHI-P131-behandelten syngenetischen Empfängern (n = 5) während der gesamten Experimentdauer von 180 Tagen nach der Transplantation nicht. Ein IPGTT wurde am Tag 70 nach der Transplantation durchgeführt. Der nichtnüchtern gemessene Blutzucker der Kontrollen und der P131-behandelten Empfänger zu diesem Zeitpunkt betrug jeweils 102,0 +/- 6,7 und 124,6 +/- 10,8 mg/dl. Der IPGTT-Test zeigte, dass kein signifikanter Unterschied der Inselfunktion zwischen nichttransplantierten, nichtbehandelten C57BL/6-Männchen, transplantierten, trägersubstanzbehandelten Empfängern (Kontrollen) und transplantierten WHI-P131-behandelten Empfängern bestand (38). Ein weiterer IPGTT-Test wurde am Ende der Experimentdauer (180 Tage nach der Transplantation) durchgeführt. Der nicht-nüchtern gemessene Blutzuckerspiegel zu diesem Zeitpunkt betrug 120,9 +/- 12,5 bei den trägersubstanzbehandelten Kontrollen und 115,2 +/- 9,2 mg/dl bei den WHI-P131-behandelten Empfängern. Der IPGTT-Test zeigte erneut, dass die Inselfunktion bei WHI-P131-behandelten Empfängern sich weder von der Inselfunktion der Kontroll-Empfänger noch von jener der nichttransplantierten C57BL/6-Mäuse unterschied.
  • Repräsentative Beispiele aus der lichtmikroskopischen Bewertung der Trägersubstanzkontrolle und der WHI-P131-behandelten syngenetischen Inseltransplantate sind in 7 gezeigt. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung der Trägersubstanzkontrolle und der WHI-P131-behandelten Transplantate zeigte, dass keine signifikanten morphologischen Veränderungen zwischen ihnen bestanden. Immunhistochemische Analyse bestätigte, dass die Insulinexpression der WHI-P131-behandelten Transplantate mit jener vergleichbar war, die Transplantate von Empfängern zeigten, die mit der Trägersubstanzkontrolle behandelt worden waren.
  • Alle Veröffentlichungen, Patente, und Patentdokumente sind per Referenz hierin eingeschlossen, als ob sie einzeln per Referenz eingeschlossen worden wären. Die Erfindung wurde mit Verweis auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Verfahren beschrieben.

Claims (18)

  1. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Organtransplantatabstoßung bei einem Säugetier.
  2. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00680001
    zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Organtransplantatabstoßung bei einem Säugetier.
  3. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung einer durch UVB-Strahlung induzierten entzündlichen Reaktion bei einem Säugetier.
  4. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00690001
    zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung einer durch UVB-Strahlung induzierten entzündlichen Reaktion bei einem Säugetier.
  5. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutischen akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Freisetzung von Prostaglandin E2 bei einem Säugetier.
  6. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00690002
    zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Freisetzung von Prostaglandin E2 bei einem Säugetier.
  7. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Schaden an Epithelzellen oder der Mutationshäufigkeit in der Haut bei einem Säugetier.
  8. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00700001
    zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Schaden an Epithelzellen oder der Mutationshäufigkeit in der Haut bei einem Säugetier.
  9. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Hautödem oder Änderungen der Gefäßdurchlässigkeit bei einem Säugetier.
  10. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00700002
    zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Herabsetzung von durch UVB-Strahlung induziertem Hautödem oder Änderungen der Gefäßdurchlässigkeit bei einem Säugetier.
  11. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz eines Säugetiers vor den Tumor-erzeugenden Wirkungen von UVB-Licht.
  12. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00710001
    zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz eines Säugetiers vor den Tumor-erzeugenden Wirkungen von UVB-Licht.
  13. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der T-Zellaktivität bei einem Säugetier.
  14. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00720001
    zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der T-Zellaktivität bei einem Säugetier.
  15. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Säugetier.
  16. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00720002
    zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Säugetier.
  17. Verwendung einer Verbindung gewählt aus: 4-(4'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-5'-Dibrom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, 4-(3'-Brom-4'-hydroxy-phenyl)-amino-6,7-dimethoxychinazolin, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit nach einer Knochenmarktransplantation bei einem Säugetier.
  18. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00730001
    zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit nach einer Knochenmarktransplantation bei einem Säugetier.
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