DE69918089T2

DE69918089T2 - Btk inhibitoren und verfahren zur identifizierung und verwendung

Info

Publication number: DE69918089T2
Application number: DE69918089T
Authority: DE
Inventors: M. Fatih UCKUN; Yaguo Zheng; Sutapa Ghosh
Original assignee: Parker Hughes Institute
Current assignee: Parker Hughes Institute
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-19
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2019-04-20
Also published as: HUP0102661A2; DE69918089D1; MXPA00010150A; IL139080A0; EP1071658B1; WO1999054286A3; CA2328962A1; NO20005224D0; ATE269295T1; AU3653099A; KR20010042804A; EP1071658A2; NO20005224L; JP2002512216A; ES2222705T3; WO1999054286A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibitoren der Tyrosinkinase-Familie und insbesondere auf Inhibitoren der Brutons-Tyrosinkinase (BTK).
Hintergrund der Erfindung
Apoptose ist eine gängige Art des eukaryontischen Zelltods, der durch eine induzierbare Kaskade biochemischer Events ausgelöst wird, die zu einer Aktivierung von Endonukleasen führen, welche die Kern-DNA in Fragmente mit Oligonukleosom-Länge spalten. Einige der biochemischen Events, die zum apoptotischen Zelltod beitragen, wie auch positive und negative Regulatoren der Apoptose wurden kürzlich identifiziert (Whyllie, A. et al., (1980), Int. Rev. Cytol. 68, 251-305; Steller, H. (1995), Science 267, 1445-1449; Fraser, A., Evan, G. (1996), Cell 85, 781-784; und Korsmeyer, S.J. (1995), Trends Genet. 11, 101-105). Apoptose spielt in der Entwicklung und der Aufrechterhaltung eines funktionierenden Immunsystems eine zentrale Rolle, indem sie die rechtzeitige Selbstzerstörung von autoreaktiven unreifen und reifen Lymphozyten wie auch von auftretenden neoplastischen Zielzellen durch cytotoxische T-Zellen sicherstellt.
Zusätzlich zu den vorteilhaften Wirkungen, die mit einer Apoptose verbunden sind, trägt eine unpassende Apoptose zur Pathogenese und Arzneimittelresistenz humaner Leukämie und Lymphome bei (Cohen, J.J. et al. (1992), Annu. Rev. Immunol. 10, 267-293; Linette, G.P. und Korsmeyer, S.J. (1994), Curr. Opin. Cell Biol. 6, 509-815 und Thompson, C.B. (1995), Science 367, 1456-1462). Somit sind Agenzien, die zum Modulieren der Apoptose nützlich sind, potentiell als therapeutische Agenzien zur Behandlung von Krankheiten einsetzbar, bei denen eine unpassende Apoptose impliziert ist. Als Resultat gibt es einen beträchtlichen Umfang an laufenden Forschungen, die sich mit der Identifizierung von molekularen Regulatoren der Apoptose beschäftigen, und es besteht ein fortdauernder Bedarf an neuen Agenzien (z.B. chemische oder biologische) und neuen therapeutischen Verfahren, die zur Modulierung der Apoptose einsetzbar sind. Solche Agenzien und Verfahren können zur Behandlung von Krebs (z.B. Leukämie und Lymphom) oder Immunkrankheiten bei Säugetieren nützlich sein. Sie können auch als pharmakologische Werkzeuge zur Verwendung in in vitro- oder in vivo-Studien einsetzbar sein, um das Verständnis der molekularen Apoptose-Basis zu verstärken (z.B. das pro-apoptotische gegenüber dem anti-apoptischen Regulatorsignal) sowie das Verständnis für die Pathogenese von humanen lymphoiden Malignitäten zu verstärken.
WO-A-9117748 offenbart die Verwendung von Isoxazol-4-carboxamid-Derivaten und Hydroxyalkyliden-cyanoacetamid für die Behandlung von Krebserkrankungen und rheumatischen Erkrankungen. DE-A-2555685 beschreibt Cyansäureanilid-Derivate und die Herstellung derselben. EP-A-537742 offenbart Styrol-Derivate, die Inhibitoraktivität auf Tyrosinspezifische Proteinkinase und Inhibitoraktivität auf die Krebszellproliferation haben. Ghosh et al., Clinical Cancer Research, November 1998, Bd. 4, 2657-68 offenbaren α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(trifluormethoxy)phenyl]propenamid zur Inhibierung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinase mit wirksamer cytotoxischer Aktivität gegen Brustkrebszellen.
BTK ist ein Apoptose-Regulator mit zweifacher Funktion, der eine strahlungsinduzierte Apoptose fördert, aber eine Fasaktivierte Apoptose in B-Zellen inhibiert (Uckum, F.M. Commentary: Burton's Tyrosin Kinase (BTK) as a Dual-Function Regulator of Apoptosis; siehe auch Uckun, F.M. et al., BTK as a Mediator of Radiation-induced Apoptosis in DT-40 Lymphoma B-Zellen, Science 273: 1096-1100 (1996)). BTK wirkt in pro-apoptotischer Weise, wenn B-Zellen reaktiven Sauerstoffzwischenprodukten ausgesetzt sind, und zwar mindestens teilweise durch "Downregulierung" der anti-apoptotischen Aktivität des STAT3-Stranskriptionsfaktors. Dagegen assoziiert BTK mit dem Todesrezeptors Fas, verschlechtert seine Wechselwirkung mit FADD, das für die Rekrutierung und Aktivierung von FLICE durch Fas während des apoptotischen Signals essentiell ist, wodurch der Zusammenbau eines pro-apoptotischen Tod-induzierenden Signalkomplexes (DISC = death inducing signaling complex) nach Fas-Ligation verhindert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) bereit:
in der:
R₁ für (C_1-3)-Alkyl, (C_3-6)-Cycloalkyl, Phenyl oder NR_aR_b steht;
R₂ für Hydroxy, (C_1-6)-Alkoxy, (C_1-6)-Alkanoyloxy, Amino-(C_2-5)-alkoxy, Hydroxy-(C_2-5)-alkoxy, Amino-(C_2-5)-alkanoyloxy oder Hydroxy-(C_2-5)-alkanoyloxy steht;
R₃ für Cyano oder (C_1-3)-Alkanoyl steht;
R₄ für Hydrogen, (C_1-3)-Alkyl, Hydroxy-(C_2-5)-alkyl oder Amino-(C_2-5)-alkyl steht;
R₅ für durch -S(O)₂R_c oder Halogen und mindestens einen anderen Substituenten substituiertes Phenyl steht;
R_a und R_b jeweils unabhängig voneinander für Hydrogen oder (C_1-3)-Alkyl stehen oder R_a und R_b zusammen mit dem Stickstoff, mit welchem sie verbunden sind, für Pyrrolidino, Piperidino, Morpholino oder Thiomorpholino stehen;
wobei Aryl oder Heteroaryl für R₁ und R₅ gegebenenfalls mit einem oder mehreren (z.B. 1, 2 oder 3) Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, (C_1-3)-Alkoxy, (C_1-3)-Alkyl, (C_1-3)-Alkanoyl, -S(O)₂R_c oder NR_aR_b, wobei R_c für (C_1-3)-Alkyl oder Aryl steht, substituiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist.
Die Verbindungen der Erfindung sind so entwickelt, daß sie in ein zusammengesetztes Bindungstaschenmodell der BTK-Domäne passen, ein Molekülvolumen haben, das kleiner ist als das Volumen der Bindungstasche (z.B. weniger als etwa 600 Å³) und vorzugsweise ein Volumen haben, das etwa 2/3 des Volumens der Tasche, z.B. etwa 400 Å³, haben. Am vorteilhaftesten sind die Inhibitoren der Erfindung so entwickelt, daß sie den Raum der Bindungstasche ausfüllen und mit den Resten der Tasche für eine verstärkte Bindung wechselwirken.
Die Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines pathologischen Zustandes oder einer Erkrankung bei einem Säuger, z.B. einem Menschen, der/die mit BTK-Aktivität in Verbindung steht, bereit. Diese Zustände oder Erkrankungen sind unter Störungen der B-Zell-Lymphozytenproliferation/Autoimmunerkrankungen, Mastzellenstörungen, Zuständen, die mit einer ungeeigneten Blutplättchenaggregation einhergehen, und Abstoßung von Xenoplantaten ausgewählt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: BTK ist ein Inhibitor für die Fasvermittelte Apoptose in DT-40-Lymphom-B-Zellen. FACS korrelierter Zwei-Parameter-Display von Wildtyp (WT)-, BTK-defizienten (BTK-)-, LYN-defizienten (LYN-)-DT-40-Zellen wie auch von BTK-defizienten DT-40-Zellen, die mit humanem Wildtyp btk-Gen (BTK; rBTK[WT]) rekonstituiert waren, gefärbt mit MC540 und PI 24 Stunden nach Behandlung mit der Kontrolle Maus-IgG MsIgG (μg/ml) oder anti-Fas (1 μg/ml). Die Prozentangaben geben die Zellfraktion in einer frühen Apoptosestufe, wie sie durch einzelne MC540-Fluoreszenz gemessen wird, und die Zellfraktion in einer fortgeschrittenen Stufe der Apoptose, wie sie durch duale MC540/PI-Fluoreszenz gemessen wird, an (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100).
2A–2C: Fas-Protein-Expressionslevel in Wildtyp- und BTK-defizienten DT-40-Zellen. 2A zeigt die Expressionslevel von BTK und ACTIN in Wildtyp-, BTK-difizienten und mit humanem btk-Gen-rekonstituierten, BTK-defizienten DT-40-Zellen, gemessen durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung geeigneter monoklonaler Antikörper und des ECL-Chemilumineszenz-Detektionssystem (Amersham Life Sciences, verwendet nach den Empfehlungen des Herstellers) (Dibirdik, I. et al. (1998), J. Biol. Chem., 273, 4035-4039; Uckun, F.M. et al. (1997), Blood, 89, 3769-3777). 2B zeigt Membranen nach Immunblotting mit Anti-BTK- und Anti-ACTIN-Antikörper, die abgestreift worden waren und mit dem monoklonalen Anti-Fas-Antikörper erneut geblottet wurden, um die Fas-Protein-Expressionslevel in den einzelnen Klonen zu vergleichen. 2C zeigt Fas-Expressionslevel von WT- und BTK-defizienten DT-40-Zellen, die durch konfokale Mikroskopie untersucht worden waren. Grün: Anti-Fas-Markierung; Blau: Toto-3-gefärbte DNA im Kern; Meßbalken = 10 mm.
3A–3D: BTK-inhibiert eine Fas-vermittelte Apoptose. 3A ist eine Photographie, die Wildtypzellen (WT) und BTK-defiziente (BTK-)DT-40-Zellen zeigt, welche für 24 Stunden mit 1 μg/ml Anti-Fas behandelt worden waren, mit polyklonalem Kanichen-Anti-Tubulin-Antikörper (grüne Fluoreszenz) und dem DNA-spezifischen Farbstoff Toto-3 (blaue Fluoreszenz) co-gefärbt worden waren und mit einem konfokalen Laserrastermikroskop untersucht worden waren, wie es in den Beispielen beschrieben wird. Anders als die WT-Zellen zeigt die Mehrzahl der BTK-Zellen apoptotische Veränderungen, einschließlich einer nukleären Fragmentierung (a, b, d) und einer Schrumpfung (c). Balken = 10 mm. 3B ist ein DNA-Gel, das WT- und BTK-DT-40-Zellen zeigt, welche Anti-Fas-Antikörper ausgesetzt waren, wie es in den Beispielen detailliert beschrieben ist, geerntet wurden, und DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde auf Fragmentierung untersucht, wie es beschrieben wurde (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Die 3C und 3D zeigen BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit Wildtyp (rWT)-, Kinasedomänenmutanten (rK-)-, SH2-Domänenmutanten (rmSH2)- oder PH-Domänenmutanten (rmPH)-Formen des humanen btk-Gens rekonstituiert worden waren, und auf Empfindlichkeit gegenüber einer Anti-Fas-Antikörper-induzierten Apoptose untersucht wurden, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Kontrollen wurden mit PBS in Kulturmedium für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO₂ vor dem Ernten behandelt.
4A–4C: Anti-apoptotische Eigenschaften von BTK, bestätigt durch BTK-Proteinrekonstitution von BTK-DT-40-Zellen. Maltose-Bindungsprotein (MBP) oder MBP-BTK wurde vor Behandlung mit Anti-Fas-Antikörper in BTK-DT-40-Zellen elektroporiert, wie es in den Beispielen beschrieben ist. 4A ist eine Photographie, die MBP-BTK-elektroporierte, BTK-defiziente DT-40-Zellen und nicht-elektroporierte, BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit einem Antikörper gegen MBP markiert sind, zeigt. Der sekundäre Antikörper war ein FITCkonjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Bio-Rad MRC-1024 konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops analysiert; digitale Bilder wurden unter Verwendung von Adobe Photoshop-Software bearbeitet und unter Verwendung eines Fuji Pictography-Druckers gedruckt. Es gab keine signifikante Färbung gegenüber dem Hintergrund in nicht-elektroporierten Kontrollzellen (4A.1). Pfeilspitzen zeigen MBP-Antikörper-reaktives Material im Cytoplasma von Zellen an, die mit dem MBP-BTK-Fusionsprotein elektroporiert sind (4A.2). In den MBP-BTK-elektroporierten Zellen wurden zwei Populationen beobachtet. Einige Zellen hatten eine sehr helle Markierung an der Peripherie der Zelle, während andere Zellen eine große punktierte Fleckenbildung im Inneren des Cytoplasmas hatten. Grün = MBP, Balken = 10 mm. 4B zeigt einen western-Blot. Lysate wie auch Überstände von BTK-defizienten DT-40-Zellen, die entweder mit MBP oder MBP-BTK elektroporiert waren, wurden einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-BTK- und Anti-MBP-Antikörpern unterworfen, wie es in "Experimentelle Verfahren" beschrieben ist. Das 115 kDa-MBP-BTK-Fusionsprotein, das mit beiden Antikörpern reaktiv ist, wurde nur in Lysaten (nicht aber in Überständen) von MBP-BTK-elektroporierten Zellen detektiert. 4C ist ein Gel. Zellen wurden 24 Stunden nach Behandlung mit Anti-Fas- Antikörper geernetet und DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde auf Fragmentierung analysiert, wie es in Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 und Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91 beschrieben ist. Eine Anti-Fas-Behandlung induzierte eine Apoptose in BTK-defizienten Zellen, nicht aber in WT-Zellen oder BTK-defizienten Zellen, in die MBP-BTK elektroporiert worden war. Eine Elektroporation von MBP (negative Kontrolle) hatte keinen Effekt auf die Apoptose.
5A–5D: BTK-assoziiert mit FAS und beeinflußt FAS-FADD-Wechselwirkungen. Die Fas-, FLICE-, FADD- und TRADD-Immunkomplexe, die aus Nonidet P-40-Lysaten von unbehandelten Wildtyp-DT-40-Lymphom-B-Zellen immunpräzipitiert worden waren, wurden gesammelt, gewaschen, in 2× SDS-Probenpuffer gekocht, an 12,5 % Polyacrylamidgelen fraktioniert, auf eine Immobilon-PVDF-Membran transferiert und auf das Vorliegen von BTK-Protein durch Immunblotting untersucht, wie es in den Beispielen beschrieben ist und in 5A dargestellt ist. Die BTK- und FADD-Immunkomplexe (wie auch die positiven Kontroll-FAS-Immunkomplexe) immunopräzipitierten aus unbehandelten, gegen Fas-aktivierten, BTK-defizienten DT-40-Lymphom-B-Zellen, die mit humanem Wildtyp-btk-Gen rekonstituiert worden waren, und wurden gesammelt, gewaschen, in 2× SDS-Probenpuffer gekocht, an 12,5 % Polyacrylamidgel fraktioniert, auf eine Immobilon-PVDF-Membran übertragen und einem Immunblotting mit einem monoklonalen Anti-Fas-Antikörper unterworfen, wie es unten beschrieben wird und in 5B dargestellt ist. FAS-, FLICE-, FADD-, TRADD- und BTK-Immunkomplexe aus Lysaten BTK-positiver, humaner NALM-6-UM1-B-Zellen-Vorläuferleukämiezellen wurden einer Anti-Fas-Westernblot-Analyse unterworfen, wie es in 5C gezeigt ist. FADD wurde aus Nonidet-P-40-Lysaten von unbehandelten, gegen Fas-aktivierten (Anti-Fas 1 μg/ml × 1 Stunde), BTK-defizienten DT-40-Zellen immunpräzipitiert, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Die Immunkomplexe wurden gesammelt, gewaschen, in 2× SDS-Probenpuffer gekocht, an 12,5 % Polyacrylamidgelen fraktioniert, auf eine Immobilon-PVDF-Membran transferiert und mit einem molekularen Anti-Fas-Antikörper einem Immunblotting unterzogen (5D). In ähnlicher Weise wurden die FAS-Immunkomplexe aus denselben Zellen durch Immunblotting auf die Anwesenheit von FADD untersucht.
6A–6D: Apoptotische Reaktionen von humanen Leukämiezellen der B-Linie auf Fas-Ligation in Beziehung zur BTK-Expression und Funktion. Eine duale Antikörper-Western-Blot-Analyse von Lysaten ganzer Zellen aus BTK-positiven NALM-6-UM1 (N6-U1)- und BTK-defizienten RAMOS-1-Zellen gegen BTK und gegen Aktin (5A). Anti-Fas-Western-Blot-Analyse derselben Zelllysate. [B]-Zellen wurden 24 Stunden nach der Einwirkung von Anti-Fas-Antikörper in Konzentrationen von 0,1 μg/ml oder 1,0 μg/ml geerntet und DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde auf Fragmentierung analysiert, wie es von Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 und Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91 beschrieben ist. Eine Anti-Fas-Behandlung induzierte eine Apoptose in BTK-defizienten RAMOS-1-Zellen, nicht aber in BTK-positiven N6-U1-Zellen. [C.1] und [C.2] Anti-BTK- und Anti-Fas-Western-Blot-Analyse von Lysaten ganzer Zellen aus N6-U1-Zellen, die mit dem BTK-Inhibitor LMA-13 behandelt worden waren (10 μM × 4 Stunden). [C.3] Anti-Fas- und Anti-BTK-Western-Blot-Analyse von mit Anti-BTK-Antikörper immunpräzipitierten BTK-Immunkomplexen aus unbehandelten (= –Inhibitor) und LMA-13-behandelten (10 μM × 4 Stunden) (= +Inhibitor) N6-U1-Zellen. [D] N6-U1-Zellen wurden 24 Stunden nach Behandlung mit Anti-Fas-Antikörper in Konzentrationen von 0,1 μg/l oder 1,0 μg/l geerntet; und DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde auf Fragmentierung analysiert, wie es von Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 und Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91 beschrieben wird. Eine Anti-Fas-Behandlung induzierte eine Apoptose in LMA-13-vorbehandelten (10 μM × 4 h) (= Inhibitor+)N6-U1-Zellen. Dagegen wurde keine Apoptose in N6-U1-Zellen beobachtet, die nicht mit diesem BTK-Inhibitor vorbehandelt waren (= Inhibitor-). Ein ECL-Detektionssystem (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois, Kat.-Nr. RPN2106) wurde für die Western-Blot-Analyse in [A.1], [A.2], [C.1], [C.2] und [C.3] verwendet.
7A–7B: Kinase-inaktive BTK assoziiert nicht mit Fas. Anti-BTK (A.1)- und Anti-Fas (A.2)-Western-Blot-Analyse von Ganzzelllysaten aus BTK-defizienten DT-40-Zellen (7A), rekonstituiert mit humaner Wildtyp-BTK (BTK-, rBTK[WT]) (Bahn 1) oder Kinasedomäne-mutanter inaktiver humaner BTK (BTK-, rBTK[K-] (Bahn 2). Die Expressionslevel von BTK und Fas wurden durch Immunblotting unter Verwendung geeigneter Antikörper und des ECL-Chemilumineszenz-Detektionssystems gemessen. 7B zeigt eine Anti-BTK (B.1)- und Anti-Fas (B.2)-Western-Blot-Analyse von Fas-Immunkomplexen aus BTK-, rBTK[WT]-Zellen mit (Bahn 1) oder ohne (Bahn 2) Anti-Fas-Antikörper-Vorbehandlung und aus BTK-, rBTK[K-]-Zellen mit (Bahn 3) oder ohne (Bahn 4) Anti-Fas-Antikörpervorbehandlung. Die Immunkomplexe, die aus Nonidet P-40-Ganzzelllysaten immunpräzipitiert worden waren, wurden gesammelt, gewaschen, in 2 × SDS-Probenpuffer gekocht, an 12,5 % Polyacrylamidgelen fraktioniert, auf eine Immobilon-PVDF-Membran transferiert und auf das Vorliegen von BTK- und Fas-Proteinen durch Immunblotting untersucht, wie es im Abschnitt "Verfahren" beschrieben ist.
8A–8F: Bindung von BTK-Fusionsproteinen an Fas-Protein in Hühner- und humanen Lymphzellen der B-Linie. 8A zeigt schematische Diagramme von Vollängen- und gekürzten MBP- und GST-Fusionsproteinen, die verschiedenen BTK-Domänen entsprechen. Die einschließlich Aminosäure (AA)-Sequenz ist für jede Trunkationsmutante angegeben. BTK 1-659, BTK 408-659, BTK 2-137 wie auch BTK 519-567, die innerhalb der katalytischen Domäne die Y551-Transphorylierungsstelle enthalten (als Kontrolle verwendet), wurden an MBP fusioniert. BTK 219-377, BTK 281-377 und BTK 219-268 wurden an GST fusioniert. 8B zeigt MBP-BTK- und GST-BTK-Fusionsproteine (7,5 μg/Bahn), die durch SDS-PAGE unter Verwendung von 12 % Polyacrylamidgelen analysiert wurden und durch Färben der Gele mit Coomassie R-250-Blau sichtbar gemacht wurden. 8C ist eine Western-Blot-Analyse von gereinigter BTK aus Proteinen, die den Kinase (BTK 408-659)-, PH-(BTK 2-137) und SH2-SH3-Domänen (BTK 219-377) von BTK entsprechen, wobei Domänen-spezifische Antikörper verwendet werden, wie es im Abschnitt "Experimentelle Verfahren" beschrieben wird. 8D–8F zeigen funktionelle Rollen für die Kinase- und PH-Domänen von BTK in BTK-Fas-Wechselwirkungen. [8D] BTK-defiziente DT-40-Hühner-Lymphom-B-Zellen; [8E] humane NALM-6-pre-B-Leukämiezellen; [8F]: KL2-humane-EBV-transformierte-Lymphoblastoidzellen. MBP-BTK- und GST-BTK-Fusionsproteine wurden in "Pull-Down"-Bindungsassay verwendet, um ihre Fähigkeit, mit Fas in BTK-defizienten DT-40-Zellen wechselzuwirken, zu untersuchen, wie es in den Beispielen beschrieben wird. Fusionsprotein-Adsorbate und Kontrollproben C1-C5 (C1(=CON): Zelllysat + Amyloseperlen (kein zugesetztes Fusionsprotein); C2: Zelllysat + Glutathion-Agarose-Perlen (kein zugesetztes Fusionsprotein); C3: MBP-BTK 1-659 + Amyloseperlen (kein Zelllysat); C4: GST-BTK 219-268 + Glutathion-Agaroseperlen (kein zugesetztes Zelllysat); C5: MBP-BTK 519-567 + Amyloseperlen + Zelllysat) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, mit dem monoklonalen Anti-Fas-Antikörper einem Immunblotting unterworfen und mit ECL entwickelt.
9A–9B: Die anti-apoptotische Funktion von BTK. Wildtyp- und BTK-defiziente (BTK-) DT-40-Lymphom-B-Zellen (9A) wie auch BTK-DT-40-Zellen, die mit Wildtyp- oder mutanter humaner BTK rekonstituiert waren (9B), wurden mit C2-CER, Vincristin (VCR) oder Anti-Fas-Antikörper behandelt, wie es in den Beispielen beschrieben wird. BTK-defiziente DT-40 (BTK-)-Zellen, die Wildtyp-BTK, BTK(Arg^525®Gln), BTK(Arg^28®Cys) und BTK(Arg^307®Ala) exprimieren, wurden als BTK-, rBTK(WT), BTK-, rBTK(K-), BTK-, rBTK(mPH) und BTK-, rBTK(mSH2) bezeichnet. Vehikel (0,1 % DMSO in PBS) behandelte wie auch Arzneimittel-behandelte Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO₂ in Kulturmedium gehalten, bevor sie geerntet wurden. DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde wie oben beschrieben auf Fragmentierung analysiert. Uckun, F.M. et al (1996), Science 22, 1096-1100.
10A–10B: Homologiemodell der BTK-Kinase-Domäne. 10A ist eine Banddarstellung des Homologiemodells der BTK-Kinasedomäne. Das LFM-A13-Molekül ist als raumfüllendes Modell in der katalytischen Stelle von BTK dargestellt. Hergestellt unter Verwendung von Molscript and Raster 3D-Programmen (Bacon, D.J. und Anderson, W. F. (1988), J. Molec. Graphics 6, 219-20; Kraulis, P. (1991), J. Appl. Cryst. 24, 946-50 und Merritt, E.A. und Murphy, M.E.P. (1994), Acta Cryst. D50, 869-73). 10B ist eine raumfüllende Darstellung der Hauptkette der Reste der katalytischen Stelle der BTK-Kinasedomäne. Die C-alpha-Kette von BTK ist als blaues Band dargestellt. In Gelb, Grün, Pink und Blau sind die Reste an den vier Ecken der rechteckig geformten Bindungstasche dargestellt. Ein Kugel- und Stabmodell des BTK-Inhibitor LFM-A13 ist mehrfarbig gezeigt und stellt die günstige Orientierung dieses Moleküls in der aktiven Kinasestelle von BTK dar. Hergestellt unter Verwendung des Insight II-Programms ((1996), Molecular Simulations Inc., San Diego, CA).
11: Bindungsposition des LFM-A13-Moleküls (mehrfarbig) an der katalytischen Stelle (blaues Band) der Kinasedomäne von BTK. Die gestrichelten Linien stellen Wasserstoffbindungen zwischen LFM-A13 und den Kinasedomänenresten von BTK dar.
12: Übereinandergelegte Docking-Positionen von LFM (purpurfarben), LFM-A12 (rot) und LFM-A13 (mehrfarbig) in der katalytischen Stelle (blaues Band) der Kinasedomäne von BTK. Anbindungspositionen von LFM und LFM-A12 sind nur zu Vergleichszwecken gezeigt.
13: ORTEP-Bild der Kristallstruktur des BTK-Inhibitors LFM-A13.
14A–14C: Wirkungen von LFM-A13 auf die Tyrosinkinase-Aktivität von BTK: Ein hochgereinigtes (> 90 %) Präparat von BTK, das in einem Baculovirus-Vektor-Expressionssystem produziert worden war, wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit LFM-A13 bei den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die in 14A angegebene enzymatische Aktivität von BTK wurde bestimmt, indem die Autophosphorylierung in einem 10-Minuten-Kinaseassay gemessen wurde, wie es in den Beispielen beschrieben ist. BTK wurde aus B18.2-Zellen (d.h. BTK-DT-40-Zellen, die mit humaner Wildtyp-BTK-rekonstituiert worden waren) immunpräzipitiert, mit LFM-A13 oder Vehikel (0,1 % DMSO in PBS) für 1 Stunde behandelt und dann auf PTK-Aktivität analysiert, durch Autophosphorylierung wie auch Phosphorylierung von GST-Iga, das als exogenes Kinasesubstrat verwendet wurde, gemessen. Die Kinasedaten sind in 14B angegeben. B18.2-Lymphom-B-Zellen wurden mit LFM-A13 behandelt, dann lysiert und es wurden BTK-Immunkomplex-Kinase-Assays und Western-Blots durchgeführt, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Die Daten sind in 14C dargestellt. PIU: Phosphoimager-Einheiten; DSU: densitometrische Scanningeinheiten; CON: Kontrolle.
15: Wirkungen von LFM-A13 auf die Tyrosinkinase-Aktivität von JAK1, JAK3, HCK und IRK. JAK1 und JAK3, die aus Sf21-Insekteneierstockzellen, die mit den geeigneten Baculovirus-Expressionsvektoren transfiziert waren, immunpräzipitiert waren, HCK, die aus COS-7-Zellen, die mit dem pSV7c-HCK-Plasmid transfiziert waren, immunpräzipitiert worden war und IRK, die aus HepG2-Hepatomzellen immunpräzipitiert worden waren, wurden mit LFM-A13 behandelt, dann in vitro-Kinaseassays unterworfen, wie es in "Experimentelle Verfahren" beschrieben ist.
16: Strukturelle Basis für die Selektivität von LFM-A13 für BTK. In hellem Blau ist eine Spur des BTK-Homologiemodells mit ausgewählten Resten an den Positionen A, B und C zusammen mit der Verknüpfungsposition des Leflunomid-Metabolitenanalogon LFM-A13 (mehrfarbig) dargestellt. Rot ist die Verbindungsposition von LFM-A13 mit einem EGFR-Modell und die Restedifferenz zwischen EGFR und BTK in Position B dargestellt. In Gelb ist die Verknüpfungsposition von LFM-A13 mit der Kristallstruktur von HCK und die Restedifferenz zwischen HCK und BTK in Position C dargestellt. In Pink ist die Verknüpfungsposition von LFM-A13 mit JAK3/JAK1-Modellen und die Restedifferenz zwischen JAK3/JAK1 und BTK in Position A dargestellt. In Dunkelblau ist die Verknüpfungsposition von LFM-A13 mit der Kristallstruktur von IRK und den Restdifferenzen zwischen IRK und BTK in den Positionen A und B dargestellt.
17: Wirkungen von LFM-A13 auf die Ceramid-Empfindlichkeit von humanen Leukämiezellen. Drei FACS-korrelierte Parameter (FSC, Vorwärtsstreuung = Größe; Fluoreszenz aus Pl, Propidiumiodid-Fluoreszenz aus MC540-Färbung)-Anzeige von ALL-1 Ph/t (9; 22)⁺ humanen ALL-Zellen, gefärbt mit MC540 und PI 24 Stunden nach Behandlung mit Vehikel (0,1 % DMSO in PBS), C2-Ceramid (C2-CER) (10 μM), LFM-A13 (200 μM) oder LFM-A13 + C2-CER. Die Prozentangaben bezeichnen die Zellfraktion in einem frühen Stadium der Apoptose, gemessen durch Einzel-MC540-Fluoreszenz, und die Zellfraktion bei fortgeschrittenen Apoptosestadium, gemessen durch duale MC540/PI-Fluoreszenz.
18A–18C: Chemosensibilisierende Wirkungen von LFM-A143. BTK-defiziente DT-40-Zellen, rekonstituiert mit humanem Wildtyp-BTK-Gen (d.h. B18.2-Klon) (18A), humane NALM-6-pre-B-ALL-Zellen (18B) und humane ALL-1-Ph⁺-ALL-Zellen (18C) wurden mit LFM-A13 (100 μM), Vincristin (VCR) (10 ng/ml), C2-Ceramid (C2-CER) (10 μM), LFM-A13 (100 μM) + VCR (10 ng/ml), LFM-A13 (100 μM) + C2-CER (10 μM) für 24 Stunden bei 37°C behandelt. DNA aus Triton-X-100-Lysaten wurde so, wie es von Uckun, F.M. et al., (1996) Science 22, 1096-1100, beschrieben wurde, auf Fragmentierung analysiert.
19: Veranschaulicht die Synthese von LFM-13 und anderen verwandten Verbindungen. LFM, LFM-A1 bis LFM-A12 und LFM-A14 sind lediglich zu Vergleichszwecken enthalten.
20A–20C: Erläutern die Bindungswechselwirkungen von LFM-13 mit der BTK-Bindungstasche.
21: Bindungsmerkmale von 5,7-Dihydroxy-8-propanoyl-4-propyl-2H-1-benzopyran-2-on und LFM-A13. Basierend auf Docking-Studien passen diese Verbindungen in die ATP-Bindungsstelle von BTK. Beide Verbindungen enthalten Wasserstoffbindungsgruppen, die mit Arg 525 und Asp 539 wechselwirken. Bindungsmerkmale von 5,7-Dihydroxy-8-propanoyl-4-propyl-2H-1-benzopyran-2-on sind lediglich zu Vergleichszwecken dargestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Fas/APO-1 (CD95)-Zelloberflächenrezeptor, eine Mitglied der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptorfamilie, ist einer der Hauptregulatoren der Apoptose in einer Vielzahl von Zelltypen. Funktionelle Fas-Abnormalitäten waren mit pathologischen Zuständen der Immunsystemhomöostase verbunden, einschlließlich lymphoproliferativer Störungen, Immundefekten und Autoimmunität (Rieux-Laucat et al. (1995), Science 268, 1347-1349; und Fischer, G.H. (1995), Cell 81, 935-946). Eine Ligation des Zelloberflächen-Fas-Moleküls induziert rasch und dramatisch in vielen, aber nicht in allen Fas-positiven Zelltypen eine Apoptose (Nagata, S. (1997), Cell 88, 355-365). DT-40 ist eine Hühner-Lymphom-B-Zellinie, die verwendet wurde, um den molekularen Mechanismus von durch Strahlung induzierter Apoptose zu klären (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Trotz ihrer reichlichen Oberflächenexpression von Fas sind DT-40-Zellen ähnlich wie humane B-Zellen-Vorläufer-Leukämiezellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen einer Fas-Ligation resistent, was die Existenz von wirksamen negativen Regulatoren der Fas-vermittelten Apoptose anzeigt. Bruton-Tyrosin-Kinase (BTK), ein Mitglied der BTK/Tec-Familie von Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs), ist eine cytoplasmische PTK, die bei Signaltransduktionswegen involviert ist, welche Wachstum und Differenzierung von Lymphzellen der B-Zellinie regulieren (Rawlings, D.J. und Witte, O.N. (1994), Immunol. Rev. 138, 105-119; Kurosaki, T. (1997), Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318; und Uckun, F.M. (1998), Biochemical Pharmacology et al., 56, 683-691). BTK ist an Signaltransduktionswegen beteiligt, die durch Bindung einer Vielzahl extrazellulärer Liganden an ihre Zelloberflächenrezeptoren initiiert werden: nach Ligation von B-Zell-Antigenrezeptoren (BCR) ist ein BTK-Aktivierung durch die gemeinsame Wirkung der PTKs Lys und Syk (Kurosaki, T. (1997), Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318) zur Induzierung einer Phospholipase C-γ2-vermittelten Calcium- Mobilisierung notwendig (Kurosaki, T. (1997), Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318). Mutationen in humanen BTK-Gen sind der Grund für X-verknüpfte Agammaglobulinämie (XLA), eine männliche Immundefizienzkrankheit, die durch Fehlen von reifen, Immunglobulin-produzierenden, peripheren B-Zellen charakterisiert ist (Tsukada, S. et al. (1993), Cell 72, 279-290; und Vetrie, D. et al. (1993), Nature 361, 226-233). Bei Mäusen wurden Mutationen im BTK-Gen als Grund für murine X-verknüpfte Immundefizienz (Xid) identifiziert (Rawlings, D.J. et al. (1993), Science 261, 358-361).
BTK hat sich als Inhibitor des Fas/APO-1 Tod-induzierenden Signalkomplexes (DISC) in B-Lymphozyten bzw. Lymphzellen erwiesen (Vassilev, A., et al. (1998), J. Biol. chem., 274, 1646-1656). Außerdem wurde derzeit festgestellt, daß BTK Ceramid- und Vincristin-induzierte Apoptose verhindert (vorliegende Studie). Das Schicksal von Leukämie/Lymphom-Zellen kann im Gleichgewicht zwischen den entgegengesetzten pro-apoptotischen Wirkungen von Kaspasen, die durch DISC aktiviert werden, und einem "upstream" wirkenden anti-apoptotischen Regulationsmechanismus, der BTK und/oder ihre Substrat involviert, liegen (Vassilev, A. et al. (1998), J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). Inhibitoren von BTK verstärken wahrscheinlich die Arzneimittelempfindlichkeit der Zellen der B- (z.B. Leukämie/Lymphom)-Zellinie. Auf diese Weise können pharmakologische Agenzien mit BTK-Modulatoraktivität als chemosensibilisierende Modulatoraktivität als chemosensibilisierende Agenzien zur Behandlung von BTK-exprimierenden Malignitäten oder Krankheiten, die durch Proliferation und Antikörperproduktion von BTK-exprimierenden B-Zellen verursacht werden, und als B-Zellen rekonstituierende Mittel bei humoralen Immundefekten mit verringerter Anzahl oder mit Fehlen von B-Zellen eingesetzt werden. Außerdem wären BTK-modulierende Agenzien als immunsupprimierende Agenzien zur Verhinderung einer hyperakuten Organabstoßung bei Transplantation, welche durch B-Zellen gesteuert wird, Autoimmunkrankheiten und Konversion der Immunität auf Arzneimittel (z.B. Antikörper oder biologische Präparate) oder Blutprodukten (z.B. Koagulationsfaktoren, z.B. Faktor VIII) bei Patienten, die Antikörper gegen solche Agenzien entwickeln, nützlich.
Identifizierung von Inhibitoren für BTK
Der wirksame und selektive BTK-Inhibitor LFM-13 und andere BTK-Inhibitoren wurden unter Verwendung des dreidimensionalen Homologiemodells der in Beispiel 2 beschriebenen Kinasedomäne identifiziert. Unter Verwendung dieses Modells und der Größe und der Kontaktinformation, die in Beispielen 1 und 3 bereitgestellt wird, wurden zusätzliche BTK-Inhibitoren entwickelt und untersucht. Unter Verwendung dieses Modells und dieser Methode können andere Verbindungen, die günstigerweise mit der Bindungstasche wechselwirken, identifiziert werden, ebenso wie Verbindungen, die über andere verwandte Kinasen selektiv an BTK binden werden. Eine feste Bindung oder eine gute Einpassung in das Bindungstaschenmodell korreliert mit wirksamer BTK-Inhibitoraktivität.
Die Fähigkeit eines Agenzes, die anti-apoptischen Wirkungen von BTK zu inhibieren, kann unter Verwendung von Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, oder unter Verwendung von Assays, die in den hierin angeführten Beispielen offenbart sind, gemessen werden. Unter Verwendung der Modellierungsinformation und der hierin beschriebenen Screens wie auch anderer Informationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, kann man Agenzien identifizieren, die BTK-inhibierende Eigenschaften besitzen.
Inhibitoren von BTK können auch solche Inhibitoren umfassen, die durch rekombinante DNA-Verfahren produziert werden, z.B. Antisense-Moleküle und Transkriptionsinhibitoren. Anfängliche Untersuchungen über btk-Transkription haben bewiesen, daß eine Expression des btk-Gens durch die kombinierte Wirkung von Transkriptionsfaktoren der Sp1- und PU.1-Familie reguliert wird (S. Muller et al. Oncogene, 1996, 13, 1955-1964; und A. Himmelmann et al. Blood, 1996, 87, 1036-1044). Transkriptionsregulatorelemente wurden innerhalb des ersten und des zehnten Introns des btk-Gens identifiziert und jüngere Untersuchungen zeigen, daß eine Regulation der btk-Genexpression mehrere Transkriptionsfaktoren involviert (J. Rohrer, M.E. Conley, Blood, 1998, 91, 214-221). Neue Agenzien, die die Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren beeinträchtigen, wären auch als Modulatoren apoptotischer Signale in Behandlungsprogrammen einsetzbar. Die Machbarkeit einer Regulierung der btk-Genexpression in humanen hämatopoetischen Zellen wurde bereits durch die Fähigkeit von Retinsäure, eine brk-Expression in myeloischen Zellen zu erhöhen, und die Fähigkeit von Phorbolester wie auch von TGF-1, die btk-Expression in B-Zellen zu verringern, bewiesen (C.I.E. Smith et al., J. Immunol. 1994, 152, 557-565).
Somit kann eines oder mehrerer der rekombinanten DNA-Verfahren verwendet werden, um eine BTK-Expression zu inhibieren und die hierin diskutierten therapeutischen Wirkungen zu induzieren. Solche Verfahren umfassen zum Beispiel Antisense-Sequenzen von Transkriptionsinhibitoren.
Beispielsweise können BTK-Antisense-Konstrukte direkt gegen eine BTK-Expression gerichtet sein. Alternativ kann das Antisense-Konstrukt gegen BTK-Regulationssequenzen, z.B. Antisense-Sequenzen zur Sp1- und PU.1-Familie von Transkriptionsfaktoren, gerichtet sein. Vorzugsweise zielen die Antisense-Konstrukte auf Tumorzellen.
Verbindungen
Verbindungen der Formel (I) sind spezifische BTK-Inhibitoren, die bevorzugt an die BTK-Modelltasche, die in den Beispielen beschrieben wird, binden und die wirksame BTK-Inhibitoraktivität haben.
Die Verbindungen der Formel (I) sind:
in der:
R₁ für (C_1-3)-Alkyl, (C_3-6)-Cycloalkyl, Phenyl oder NR_aR_b steht;
R₂ für Hydroxy, (C_1-6)-Alkoxy, (C_1-6)-Alkanoyloxy, Amino-(C_2-5)-alkoxy, Hydroxy-(C_2-5)-alkoxy, Amino-(C2-5)-alkanoyloxy oder Hydroxy-(C_2-5)-alkanoyloxy steht;
R₃ für Cyano oder (C_1-3)-Alkanoyl steht;
R₄ für Wasserstoff, (C_1-3)-Alkyl, Hydroxy-(C_2-5)-alkyl oder Amino-(C_2-5)-alkyl steht;
R₅ für durch -S(O)₂R_c oder Halogen und mindestens einen anderen Substituenten substituiertes Phenyl steht;
R_a und R_b jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff (bzw. Hydrogen) oder (C_1-3)-Alkyl stehen; oder R_a und R_b zusammen mit dem Stickstoff, mit welchem sie verbunden sind, für Pyrrolidino, Piperidino, Morpholino oder Thiomorpholino stehen;
wobei Aryl oder Heteroaryl als R₁ und R₅ gegebenenfalls substituiert ist durch einen oder mehrere (z.B. 1, 2 oder 3) Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, (C_1-3)-Alkoxy, (C_1-3)-Alkyl, (C_1-3)-Alkanoyl, -S(O)₂R_c oder NR_aR_b, wobei R_c für (C_1-3)-Alkyl oder Aryl steht;
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Besonders nützliche Verbindungen der Formel (I) umfassen:
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dibromphenyl)propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-brom-4-(trifluormethoxy)phenyl]-propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-dibromphenyl)propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-dichlorphenyl)propenamid;
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dichlorphenyl)propenamid; oder
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3,4-dichlorphenyl)propenamid; oder
pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Definitionen:
Die folgenden Definitionen werden, soweit nichts anderes beschrieben wird, hierin verwendet: Halogen ist Fluor, Chlor, Brom oder Iod. Alkyl, Alkoxy, usw. bezeichnen sowohl geradkettige als auch verzweigte Gruppen; Bezugnahme auf ein einzelnes Isomer, z.B. "Propyl", umfaßt nur das geradkettige Isomer, ein verzweigtkettiges Isomer, z.B. "Isopropyl" wird spezifisch bezeichnet. Aryl bezeichnet eine Phenyl-Gruppe oder eine bicyclische oder tricyclische carbocyclische Gruppe, die etwa 9 bis 12 Ringatome hat, wobei mindestens ein Ring aromatisch ist.
Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, daß Verbindungen der Formel (I), die ein chirales Zentrum haben, in optisch aktiven und racemischen Formen existieren können und isoliert werden können. Einige Verbindungen können Polymorphismus aufweisen. Es ist einzusehen, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung einer beliebigen racemischen, optisch aktiven, polymorphen oder stereoisomeren Form oder Gemischen davon, einer Verbindung der Formel (I), die die nützlichen hierin beschriebenen Eigenschaften besitzt, umfaßt, wobei es auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie optisch aktive Formen hergestellt werden (zum Beispiel durch Trennung der racemischen Form durch Umkristallisationstechniken, durch Synthese aus optisch aktiven Ausgangsmaterialien, durch chirale Synthese oder durch chromatographische Trennung unter Verwendung einer chiralen stationären Phase) und wie die BTK-inhibierende Aktivität zu bestimmen ist, wobei die hierin beschriebenen Standardassays verwendet werden oder andere ähnliche Assays, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, verwendet werden.
Spezifische und bevorzugte werte, die unten für Substituenten und Bereiche aufgelistet sind, dienen lediglich der Erläuterung; sie schließen andere definierte Werte oder andere Werte innerhalb definierter Bereiche für die Reste und Substituenten nicht aus.
Spezifischerweise kann (C_1-3)-Alkyl Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl sein; (C_3-6)-Cycloalkyl kann Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl sein; (C_1-3)-Alkoxy kann Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropropoxy sein; (C_1-6)-Alkoxy kann Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropropoxy, Butoxy, Isobutoxy, sek-Butoxy, Pentoxy, 3-Pentoxy oder Hexyloxy sein.
Spezifische und bevorzugte Bedeutungen
Eine spezifische Bedeutung für R₁ ist (C_1-3)-Alkyl oder (C_3-6)-Cycloalkyl.
Eine spezifische Bedeutung für R₂ ist Hydroxy.
Eine spezifische Bedeutung für R₃ ist Cyano.
Eine spezifische Bedeutung für R₄ ist Wasserstoff.
Eine spezifische Bedeutung für R₅ ist Phenyl, substituiert mit Halogen und substituiert mit 1, 2 oder 3 anderen Substituenten, die unabhängig aus Halogen, Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, (C_1-3)-Alkoxy, (C_1-3)-Alkyl, (C_1-3)-Alkanoyl und NR_aR_b ausgewählt sind.
Eine spezifischere Bedeutung für R₁ ist (C_1-3)-Alkyl.
Eine spezifischere Bedeutung für R₅ ist Phenyl, substituiert mit Halogen und substituiert mit 1, 2 oder 3 anderen Substituenten, die unabhängig aus Halogen, Trifluormethyl, Trifluormethoxy und (C_1-3)-Alkoxy ausgewählt sind.
Eine spezifischere Bedeutung für R₅ ist Phenyl, das mit 2 oder 3 Halogenen substituiert ist.
Eine spezifischere Bedeutung für R₅ ist Phenyl, das mit zwei Brom substituiert ist.
Eine bevorzugt Verbindung der Formel (I) ist α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dibromphenyl)propenamid oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Therapeutische Verwendung
B-Zellen und B-Zellvorläufer, die BTK exprimieren, sind in der Pathologie einer Reihe von Krankheiten und Zuständen impliziert; diese umfassen B-Zell-Malignitäten (z.B. akute Lymphoblastenleukämie, chronische lymphatische Leukämie, Nicht-Hodgkins-Lymphom, EBV-Lymphom und Myelom), andere Krebsarten, lymphoproliferative B-Zell- Störungen/Autoimmunkrankheiten (z.B. Lupus, Crohn-Krankheit und chronische oder Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion), Mastozytose (z.B. Allergien und anaphylaktischer Schock), Zustände, die mit unpassenden Thrombozytenaggregation in Verbindung stehen und Abstoßung von Xenotransplantaten (z.B. Herztransplantate von Schwein zu Menschen).
Zusätzlich können die selektiven BTK-Inhibitoren verwendet werden, um andere Krankheiten zu identifizieren, in denen BTK eine Rolle spielt, und insbesondere um eine Genexpression, die durch BTK moduliert ist, zu identifizieren. Dies kann unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. unter Verwendung von Gen-Profilierungstechniken, die ähnlich denen sind, die von A. Sehgal et al., Journal of Surgical Oncology, 1998, 67, 234-241, beschrieben werden, erfolgen. Eine Inkubation von Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit eines BTK-Inhibitors, gefolgt von einer Profilierung der Gen-Expression in den Zellen, ist einsetzbar, um eine BTK-regulierte Gen-Expression zu identifizieren. Materialien, die zur Profilierung der Gen-Expression unter Verwendung von Atlas-cDNA-Membranen einsetzbar sind, können von CLONTECH Laboratories, Inc. 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303 erhalten werden. cDNA-Mikroarrays können von handelsüblichen Quellen bestellt werden oder selbst hergestellt werden.
Unter Verwendung solcher Materialien nach den Anweisungen des Herstellers wurde auch entdeckt, daß BTK die Expression spezifischer Gene, z.B. MAKPAP-Kinase-Gen und c-myc-Onkogen, moduliert. Diese Aktivität legt nahe, daß BTK bei der Pathologie aller Krebsformen involviert sein kann.
BTK ist ein Glied der Tec-Familie von Tyrosinkinasen. Tec-Kinase wird zum Beispiel in T-Zellen exprimiert. Die BTK-Inhibitoren der Erfindung sind auch einsetzbar, um die Aktivität anderer Glieder der Tec-Kinasefamilie zu inhibieren.
BTK-Inhibitoren (einschließlich Verbindungen der Formel (I), wie sie hier beschrieben sind) können verwendet werden, um Störungen zu behandeln, bei denen die Inhibierung oder Prävention einer Kinase der Tec-Familie, einschließlich BTK-Aktivität, indiziert ist. Es wurde auch festgestellt, daß BTK-Inhibitoren als chemosensibilisierende Agenzien einsetzbar sind und somit in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Arzneimitteln, insbesondere Arzneimitteln, die eine Apoptose induzieren, einsetzbar sind. Beispiele für andere chemotherapeutische Arzneimittel, die in Kombination mit chemosensibilisierenden BTK-Inhibitoren verwendet werden können, umfassen Topoisomerase I-Inhibitoren (Camptothesin oder Topotecan), Topoisomerase II-Inhibitoren (z.B. Daunomycin und Etoposid), Alkylierungsmittel (z.B. Cyclophosphamid, Melphalan und BCNU), Tubulin-gesteuerte Mittel (z.B. Taxol und Vinblastin) und biologische Agenzien (z.B. Antikörper wie Anti-CD209-Antikörper, IDEC 8, Immuntoxine und Cytokine).
Konjugation an eine Targeting-Gruppierung
Die Verbindungen der Formel (I) können zur spezifischen Abgabe an einen zu behandelnden Zelltyp durch Konjugation des BTK-Inhibitors an eine Targeting-Gruppierung targetiert werden. Targeting-Gruppierungen, die zur Konjugation mit BTK-Inhibitoren einsetzbar sind, umfassen Antikörper, Cytokine und Rezeptorliganden, die für die zu behandelnde Zelle spezifisch sind.
Der Ausdruck "Konjugat" meint eine Verbindung, die als Composite zwischen zwei oder mehr Molekülen gebildet wird. Spezifischer ausgedrückt, in der vorliegenden Erfindung ist das Chinazolin-Derivat an zellspezifische Targeting- Gruppierungen, die eine Konjugatverbindung bilden, zur effizienten und spezifischen Abgabe des Agenzes an die interessierende Zelle gebunden, z.B, kovalent gebunden.
Der Ausdruck "Targeting-Gruppierung" meint ein Molekül, das dazu dient, die erfindungsgemäße Verbindung für die gewünschte Aktivität an eine spezifische Stelle abzugeben. Targeting-Gruppierungen umfassen z.B. Moleküle, die Moleküle spezifisch eine spezifische Zelloberfläche binden. Solche Targeting-Gruppierungen, die in der Erfindung einsetzbar sind, umfassen Anti-Zelloberflächen-Antigen-Antikörper. Cytokine, einschließlich Interleukine und Faktoren, wie z.B. Granulozyten/Makrophagen-stimulierender Faktor (GMCSF) sind ebenfalls spezifische Targeting-Gruppierungen, von denen bekannt ist, daß sie an spezifische Zellen binden, welche hohe Level ihrer Rezeptoren exprimieren.
Besonders nützliche Targeting-Gruppierungen zum Targeting der BTK-Inhibitorverbindungen der Erfindung auf Zellen zur therapeutischen Aktivität umfassen solche Liganden, die an Tec-Kinase exprimierenden Zellen vorliegen. Zum Beispiel können Antigene, die an B-Zellen und Krebszellen der B-Zellinie, z.B. CD19, vorliegen, mit Anti-CD19-Antikörpern, z.B. B43, targetiert werden. Antikörper-Fragmente, einschließlich Einzelkettenfragmente, können verwendet werden. Natürliche Liganden für die Oberflächenantigene, z.B. CD19, können ebenfalls eingesetzt werden. Tec-Kinase exprimierende T-Zellen können z.B. auf das CD7-Antigen mit Anti-CD7-Antikörpern, beispielsweise TXU, targetiert werden. Mastzellen können über das CD48-Antigen mit Anti-CD48-Antikörpern targetiert werden. Diese und andere Zelloberflächen Antigen-Antikörper sind z.B. von Pharmingen im Handel erhältlich.
Cytokine sind ebenfalls nützliche Targeting-Gruppierungen. T-Zellen können mit IL2 und IL7 targetiert werden; B-Zellen können mit IL-4 targetiert werden; Mastzellen können mit C-KIT, MGH, GMCSF und IL3 targetiert werden. Krebszellen, die Tec-Kinase exprimieren, können z.B. mit EGF und IGF targetiert werden.
Verbindungen als Salze
In Fällen, in denen ein Agens ("Verbindung") ausreichend basisch oder sauer ist, um stabile, nicht-toxische Säure- oder Basensalze zu bilden, kann eine Verabreichung der Verbindung als Salz geeignet sein. Beispiele pharmazeutisch annehmbarer Salze sind Additionssalze mit organischen Säuren, die z.B. mit Säuren gebildet werden, welche ein physiologisch akzeptables Anion bilden, z.B. Tosylat, Methansulfonat, Acetat, Citrat, Malonat, Tartrat, Succinat, Benzoat, Ascorbat, α-Ketoglutarat und α-Glycerophosphat. Geeignete anorganische Salze können ebenfalls gebildet werden; diese umfassen Hydrochlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Bicarbonat- und Carbonatsalze.
Pharmazeutisch akzeptable Salze können unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet gutbekannt sind, erhalten werden. Beispielsweise indem eine ausreichend basische Verbindung, z.B. ein Amin, mit einer geeigneten Säure, die ein physiologisch akzeptables Anion liefert, umgesetzt wird. Alkalimetall (z.B. Natrium, Kalium oder Lithium)- oder Erdalkalimetall (z.B. Calcium)-Salze von Carbonsäuren können ebenfalls hergestellt werden.
Prodrug-Derivate
Die Verbindungen der Formel (I) haben daran funktionelle Gruppen gebunden, um ein Prodrug-Derivat bereitzustellen. Das Prodrug-Derivat erleichtert eine Verwendung des Arzneimittels im Körper, in dem es z.B. den Eintritt in Zellen erleichtert. Der Ausdruck "Prodrug-Gruppierung" ist eine Substitutionsgruppe, die die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung erleichtert, z.B. indem sie den Eintritt des Arzneimittels in Zellen oder die Verabreichung der Verbindung erleichtert. Die Prodrug-Gruppierung kann in vivo z.B. durch Spaltung mit Enzymen von der Verbindung abgespalten werden. Beispiele für Prodrug-Gruppierungen umfassen Phosphat-Gruppen, Peptidlinker und Zucker, wobei die Gruppierungen in vivo hydrolysiert werden können.
Pharmazeutische Formulierungen
Eine Verbindung kann als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden und einem Säugerwirt, z.B. einem menschlichen Patienten, in einer Vielzahl von Formen, die an die gewählte Verabreichungsroute, z.B. oral oder parenteral, auf intravenösen, intramuskulären, topischen oder subkutanen Wegen, angepaßt sind, verabreicht werden.
So können Verbindungen systemisch verabreicht werden, z.B. oral in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel, beispielsweise einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren eßbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln mit harter oder weicher Schale eingeschlossen sein, können zu Tabletten verpreßt sein oder können direkt in das Lebensmittel der Patientennahrung eingearbeitet sein. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die Verbindung mit einem oder mehreren Exzipientien kombiniert werden und in Form von einnehmbaren Tabletten, bukkalen Tabletten, Lutschbombons, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Wafern und dgl. verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 0,1 % aktive Verbindung enthalten. Der Prozentgehalt der Zusammensetzungen und Präparate kann verändert werden und kann zweckdienlicherweise zwischen etwa 2 und 60 % des Gewichts einer gegebenen Einheitsdosierungsform betragen. Die Menge der aktiven Verbindung in derartigen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, daß ein wirksamer Dosierungslevel erhalten wird.
Die Tabletten, Lutschtabletten, Pillen, Kapseln und dgl. können auch folgendes enthalten: Bindemittel, z.B. Tragacanthgummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; Exzipientien, z.B. Dicalciumphosphat; ein Zerfallsmittel, z.B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dgl.; ein Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, und ein Süßungsmittel, wie z.B. Saccharose, Fructose, Lactose oder Aspartam, oder ein Aromamittel, z.B. Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirscharoma können zugesetzt werden. Wenn die Einheitsdosierungsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger, z.B. ein Pflanzenöl oder ein Polyethylenglykol, enthalten. Es können verschiedene andere Materialien als Beschichtungen oder zur anderweitigen Modifizierung der physikalischen Form der festen Einheitsdosierungsform vorliegen. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Gelatine, Wachs, Schellack, Zucker oder dgl. überzogen sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Saccharose oder Fructose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und ein Aromamittel, z.B. Kirsch- oder Orangenaroma, enthalten. Jedes Material, das bei der Herstellung einer Einheitsdosierungsform verwendet wird, sollte pharmazeutisch akzeptabel sein und in den verwendeten Mengen im wesentlichen nicht toxisch sein. Außerdem kann die aktive Verbindung in Präparate und Vorrichtungen mit verzögerter Freisetzung eingearbeitet sein.
Die Verbindung kann auch intravenös oder intraperitoneal durch Infusion oder Injektion verabreicht werden. Lösungen der Verbindung oder ihres Salzes können in Wasser, gegebenenfalls mit einem nicht-toxischen oberflächenaktiven Mittel vermischt, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen, Triacetin und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Dosierungsformen, die zur Injektion oder Infusion geeignet sind, können sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen oder sterile Pulver, die die aktive Verbindung enthalten, und die für die außerplanmäßige Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen oder Infusionslösungen oder -dispersionen, gegebenenfalls in Liposome eingekapselt, angepaßt sind, umfassen. In allen Fällen sollte die endgültige Dosierungsform unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung steril, flüssig und stabil sein. Der flüssige Träger oder das flüssige Vehikel können ein Lösungsmittel oder ein flüssiges Dispersionsmedium sein, das z.B. Wasser, Ethanol, ein Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglykol, flüssige Polyethylenglykole und dgl.), Pflanzenöle, nicht-toxische Glycerylester und geeignete Gemische davon umfaßt. Die geeignete Fluidität kann z.B. durch Bildung von Liposomen, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall von Dispersionen oder durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, z.B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dgl., erreicht werden. In vielen Fällen wird es vorteilhaft sein, daß isotonische Mittel, z.B. Zucker, Puffer oder Natriumchlorid enthalten sind. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine, erreicht werden.
Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die aktive Verbindung in der erforderlichen Menge im geeigneten Lösungsmittel mit verschiedenen der oben aufgezählten anderen Ingredienzien nach Bedarf eingearbeitet wird, worauf eine Filtersterilisierung folgt. Im Fall steriler Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknungstechniken, die zu einem Pulver der aktiven Verbindung plus einem zusätzlichen gewünschten Ingrediens, das in den vorher steril filtrierten Lösungen vorlag, führen.
Für eine topische Verabreichung können die Verbindungen in reiner Form, d.h. wenn sie Flüssigkeiten sind, angewendet werden. Allerdings wird es im allgemeinen wünschenswert sein, sie als Zusammensetzungen oder Formulierungen in Kombination mit einem dermatologisch akzeptablen Träger, der ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein kann, an die Haut zu verabreichen.
Verwendbare feste Träger umfassen feinverteilte Feststoffe, z.B. Talk, Ton, mikrokristalline Cellulose, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und dgl. Verwendbare flüssige Träger umfassen Wasser, Alkohole oder Glykole oder Wasser-Alkohol/Glykol-Mischungen, in denen die erfindungsgemäßen Verbindungen in wirksamen Konzentrationen gelöst oder dispergiert werden können, gegebenenfalls mit Hilfe nicht-toxischer oberflächenaktiver Mittel. Adjuvantien, z.B. Duftstoffe und zusätzliche antimikrobielle Agenzien, können zugesetzt werden, um die Eigenschaften für eine vorgegebene Verwendung zu optimieren. Die resultierenden flüssigen Zusammensetzungen können mit Absorbens-Pads aufgetragen werden, welche verwendet werden, um Verbände und andere Umschläge zu imprägnieren, oder sie können auf den betroffenen Bereich unter Verwendung von Sprühvorrichtungen des Pump-Typs oder Aerosol-Sprühvorrichtungen aufgesprüht werden.
Verdickungsmittel wie z.B. synthetische Polymere, Fettsäuren, Fettsäuresalze und -ester, Fettalkohole, modifizierte Cellulosen oder modifizierte Mineralmaterialien können ebenfalls mit flüssigen Trägern eingesetzt werden, um verteilbare Pasten, Gele, Salben, Seifen und dgl. zur direkten Aufbringung auf die Haut des Verwenders zu bilden.
Beispiele für verwendbare dermatologische Zusammensetzungen, die verwendet werden können, um die erfindungsgemäßen Verbindungen an die Haut abzugeben, sind auf dem Fachgebiet bekannt; siehe z.B. Jacquet et al. (US-Pat. Nr. 4 608 392), Geria (US-Pat. Nr. 4 992 478), Smith et al. (US-Pat. Nr. 4 559 157) und Wortzman (US-Pat. Nr. 4 820 508).
Nützliche Dosierungen der erfindungsgemäßen Verbindungen können bestimmt werden, indem ihre in vitro-Aktivität und in vivo-Aktivität in Tiermodellen verglichen wird. Verfahren zur Extrapolation wirksamer Dosierungen bei Mäusen und anderen Tieren bis zum Menschen sind auf dem Fachgebiet bekannt; siehe z.B. US-Patent Nr. 4 938 949.
Im allgemeinen wird die Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindung(en) in einer flüssigen Zusammensetzung, z.B. einer Lotion, etwa 0,1 bis 25 Gew.%, vorzugsweise etwa 0,5 bis 10 Gew.% sein. Die Konzentration in einer halbfesten oder festen Zusammensetzung, z.B. einem Gel oder einem Pulver, wird etwa 0,1 bis 5 Gew.%, vorzugsweise etwa 0,5 bis 2,5 Gew.% sein.
Die Menge der Verbindung oder eines aktiven Salzes oder Derivats davon, die zur Verwendung in einer Behandlung erforderlich ist, wird nicht nur mit dem besonderen Salz, das ausgewählt wurde, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Natur des zu behandelnden Zustands und dem Alter und dem Zustand des Patienten variieren und wird letztlich in der Entscheidung des behandelnden Arztes oder Klinikers liegen.
Im allgemeinen wird allerdings eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg, z.B. von etwa 10 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht, pro Tag liegen, z.B. 3 bis etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 6 bis 90 mg/kg pro Tag, am vorteilhaftesten im Bereich von 15 bis 60 mg/kg/Tag sein.
Die Verbindung wird zweckdienlicherweise in Einheitsdosierungsform, die z.B. 5 bis 1000 mg, zweckdienlicherweise 10 bis 750 mg, am vorteilhaftesten 50 bis 500 mg aktive Verbindung pro Einheitsdosierungsform enthält, verabreicht.
Idealerweise sollte die aktive Verbindung so verabreicht werden, daß sie Peakplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,5 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 1 bis 50 μM, am vorteilhaftesten etwa 2 bis etwa 30 μM erreicht. Dies kann z.B. durch intravenöse Injektion einer 0,05- bis 5 %-Lösung des aktiven Ingrediens, gegebenenfalls in Salzlösung, oder oral verabreicht als Bolus, der etwa 1 bis 100 mg des aktiven Ingrediens enthält, erreicht werden. Wünschenswerte Blutkonzentrationen können durch kontinuierliche Infusion unter Zuführung von etwa 0,01 bis 5,0 mg/kg/h oder durch intermittierende Infusionen, die etwa 0,4 bis 15 mg/kg des aktiven Ingrediens (der aktiven Ingredienzien) enthalten, aufrechterhalten werden.
Die gewünschte Dosis kann zweckdienlicherweise in einer einzelnen Dosis oder als aufgeteilte Dosen, die in geeigneten Intervallen verabreicht werden, z.B. als zwei, drei, vier oder mehr Unterdosen pro Tag, vorliegen. Die Unterdosis selbst kann weiter aufgeteilt werden, z.B. in eine Reihe diskreter, lose beabstandeter Verabreichungen; zum Beispiel als mehrere Inhalationen aus einem Insufflator oder durch Einbringen einer Vielzahl von Tropfen in das Auge.
Wie hierin offenbart wurde, wurde festgestellt, daß BTK-Inhibitoren als chemosensibilisierender Agenzien einsetzbar sind und damit zur Erhöhung der Empfindlichkeit einer Krebszelle für andere chemotherapeutische Mittel, die eine Apoptose begünstigen, nützlich sind. Als solche können BTK-Inhibitoren zweckdienlicherweise in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln verabreicht werden. Zusätzlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein Agens umfassen, welches BTK inhibiert, außerdem ein oder mehrere anderen chemotherapeutische Agenzien, welche eine Apoptose begünstigen, umfassen.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele erläutert.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: BTK inhibiert FAS/APO-1 DISC
Das folgende Beispiel liefert einen biochemischen und genetischen Beweis, daß BTK in Inhibitor des Fas/APO-1 death inducing signaling complex (DISC) in Lymphozyten bzw. Lymphzellen der B-Zellinie ist. BTK assoziiert mit Fas-FADD assoziiert mit Fas über seine Kinase- und PH-Domänen und verhindert die FAS-FADD-Wechselwirkung, die für die Rekrutierung und Aktivierung des Tod-induzierenden proteolytischen Enzyms FLICE durch Fas während des apoptotischen Signals essentiell ist. Eine Behandlung von humanen Leukämie-B-Zellen mit einem wirksamen Inhibitor für BTK setzt die BTK-Fas-Assoziierung außer Kraft und sensibilisiert die Zellen gegenüber einer Fas-vermittelten Apoptose.
Zellinien, Reagenzien und biochemische Assays.
Die Entwicklung von BTK-defizienten DT-40-Lymphom-B-Zellklonen wurde bereits früher von Uckum, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 beschrieben. Um das btk-Gen zu unterbrechen, wurden Targetingkonstrukte, die eine Neomycin-Resistenzgen-Kassette (d.h. pcBTK-neo) oder eine Histidinol-Resistenzgen-Kassette (d.h. pcBTK-hisD) enthalten, sequenziell in DT-40-Zellen transfiziert. Die Targetingvektoren, pcBTK-neo und pcBTK-hisD, wurden konstruiert, indem das 0,75 kb genomischer BglII-BamHI-Fragment, das Exons enthält, welche den humanen BTK-Aminosäureresten 91-124 entsprechen, mit einer neo- oder his-D-Kassette ersetzt wurden. pcBTK-neo wurde linearisiert und durch Elektroporation in Wildtyp-DT-40-Zellen eingeführt. Mittels Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer 3'-flankierenden Sonde (0,5 kb, BglII-Bgl-II-Fragment) erfolgte ein Screening. Der neo-targetierte Klon wurde erneut mit pcBTK-hisD transfiziert und mit G418 (2 mg/ml) und Histidinol (1 mg/ml) selektiert. Eine Southern-Blot-Analyse des BTK-defizienten DT-40-Klons bestätigte die homologe Rekombination an beiden btk-Loci und eine Hybridisierung mit einer neo- und hisD-Sonde zeigte an, daß der targetierte Klon eine einzelne Kopie jedes Konstrukts eingebaut hatte. Das Fehlen einer BTK-Expression in BTK-defizienten DT-40-Zellen wurde sowohl durch Immunkomplex-Kinase-Assays als auch durch Westernblot-Analyse bestätigt (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Mutationen in der humanen btk-cDNA wurden durch PCR eingeführt, wobei Pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla, Californien, #600153) verwendet wurde, und durch Sequenzierung bestätigt. Wildtyp- und mutante btk-cDNAs wurden in pApuro-Expressionsvektor subkloniert und in BTK-defiziente Zelle elektroporiert. Die PTK-Aktivität von BTK-Immunkomplexen, wie sie durch in vitro-Autophosphorylierung gemssen wurde, wurde durch die Mutation der katalytischen Domäne aufgehoben, durch die Mutation der PH-Domäne reduziert, durch die Mutation in der SH2-Domäne allerdings nicht beeinträchtigt. Gleiche Mengen an BTK-Protein wurden durch Western-Blot-Analyse in allen BTK-defizienten DT-40-Klonen detektiert, die mit Wildtyp- oder mutierten humanen btk-Genen transfiziert waren, allerdings war kein BTK-Protein in nicht-transfizierten BTK-defizienten DT-40-Zellen nachweisbar (Uckun, F.M., et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Die Entwicklung und Charakterisierung von LYN-defizienten-DT-40-Klonen war bereits von Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 beschrieben worden. Zusätzlich zu diesen Hühner-Lymphom-B-Zellen wurden die folgenden humanen B-Lymphozyten-Linien verwendet: NALM-6-UM1, BTK-positive, humane B-Zell-Vorläufer (pre-B-akute Lymphoblastenleukämie)-Zellinie; RAMOS-1, BTK-defiziente, humane Burkitt's/B-Zell-Leukämielinie und KL2-BTK-positive, humane EBV-transformierte, normale B-Lymphoblastoid-Zellinien.
Antikörper, die gegen BTK, SYK und LYN gerichtet sind, wurden früher beschrieben (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100; Dibirdik, I. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 4035-4039 und Uckun, F.M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397. Polyklonale Antikörper gegen BTK wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteinen (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois), die die ersten 150 Aminosäuren von BTK enthalten, erzeugt. Zusätzlich wurden die folgenden Anti-BTK-Antikörper in Western-Blots gereinigter Fusionsproteine verwendet: polyklonaler Ziege-Anti-BTK-Carboxyl-Terminus (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Ca. Kat.# SC1107), polyklonaler Ziege-Anti-BTK-Amino-Terminus (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Ca. Kat.# SC1108) und polyklonales Kaninchenserum gegen die Btk-SH2-SH3-Domänen (aa219-377). Polyklonaler Anti-MBP-Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen erzeugt. Die polyklonalen Kaninchen-Anti-Fas-Antikörper (sc-715, 1:1 mit sc-714 vermischt), die sowohl mit humanen wie auch mit Hühner-Fas-Proteinen kreuzreagieren, polyklonaler Ziegen-Anti-FADD (sc-1171)-Antikörper, polyklonaler Ziege-Anti-TRADD (sc-1163)-Antikörper, polyklonaler Ziege-Anti-FLICE (sc-6135) wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc. bezogen und entsprechen den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Der molekulare Anti-Fas-Antikörper (F22120) wurde von Transduction Laboratories, Inc. (Lexington, KY, USA) erhalten. Immunpräzipitationen, Immunkomplex-Proteinkinase-Assays und Immunblotting unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz (ECL)-Detektionssystems (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois) wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100; Dibirdik, I. et al. (1998), J. Biol. Chem., 273, 4035-4039; Uckun, F.M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397; Mahajan, S., et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-5311; Uckun, F.M. et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 21172-21184; Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91 und Uckun, F.M. et al. (1997), Blood, 89, 3769-3777). Der BTK-Inhibitor α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dibromphenyl)propenamid (LMA-13) wurde hergestellt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
Expression und Reinigung von MBP-BTK- und GST-BTK-Fusionsproteinen
cDNAs, die für die Vollängen-BTK und ihre Kinase- oder PH-Domänen mit PCR-erzeugten 5'- und 3'-BamHI-Stellen codieren, wurden in den E. coli-Expressionsvektor pMAL-C2 mit dem IPTG-induzierbaren Ptac-Promotor kloniert, um eine Rasterfusion zwischen diesen codierenden Sequenzen und dem 3'-Ende des E. coli-malE-Gens, welches für das Maltose-Bindungsprotein (MBP) codiert, zu schaffen. cDNAs, die für die SH2-, SH3- oder SH2+SH3-Domänen mit PCR-erzeugten 5'- und 3'-BamHI-Stellen codieren, wurden in den E. coli-Expressionsvektor pGEX-2t mit dem IPTG-induzierbaren Ptac-Promotor kloniert, um eine "im Raster"-Fusion zwischen diesen codierenden Sequenz und dem 3'-Ende des E. coli-Glutathion-S-Transferase (GST)-Gen zu schaffen. Die gebildeten rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli-Stamm DH5a transformiert. Einzelne Transformanten wurden in 5 ml Luria-Burtain (LB)-Medium (1 % Trypton, 1 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt), das Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, durch Übernachtkultur bei 37°C vermehrt. Die Expression der Fusionsproteine wurde mit 10 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 4 500 g in einer Sorvall RC5B-Zentrifuge für 10 Minuten bei 4°C geerntet, in Saccharose-Lysozym-Puffer (20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 % Saccharose. 1 mM EDTA, 20 mM Lysozym) lysiert und durch Beschallung weiter zerstört. Nach Entfernung der Zellpellets durch Zentrifugation bei 35 000 g für 1 Stunde bei 4°C, wurden GST-BTK-Fusionsproteine durch Glutathion-Sepharose-Chromatographie gereinigt (Uckun, F.M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397), während MBP-BTK-Fusionsproteine durch Amylose-Affinitätschromatographie aus den Kulturüberständen gereinigt wurden (Hsu, D. et al. (1996), Biochemistry 35, 13871-77).
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Wildtyp- und BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml, 24 h bei 37°C) behandelt worden waren, wurden an mit Poly-l-Lysin überzogene Deckgläschen angeheftet und in eiskaltem (–20°C) Methanol für 15 Minuten fixiert. Nach der Fixierung wurden die Deckgläschen für 15 Minuten in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) + 0,1 % Triton X-100 gewaschen. Die Zellen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers (Sigma, St. Louis, MO) mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-Tubulin-Antikörper gefärbt, um ihr Cytoplasma sichtbar zu machen. DNA wurde für 10 Minuten mit Toto-3, einem DNA-spezifischen Farbstoff, (Molecular Probes, Eugene OR) markiert, um die apoptotischen Veränderungen in den Nuclei sichtbar zu machen. BTK-MBP-elektroporierte, BTK- defiziente DT-40-Zellen und nicht-elektroporierte, BTK-defiziente DT-40-Zellen wurden mit einem Antikörper gegen Maltose-Bindungsprotein markiert. Der sekundäre Antikörper war ein Fluorescein-konjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper. In einigen Experimenten wurden Zellen durch konfokale Mikroskopie auf Fas-Expression untersucht. Kurz ausgedrückt, Zellen wurden an mit Poly-L-Lysin überzogen Deckgläschen angeheftet und für 40 Minuten in 2 % Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) fixiert. Die Zellen wurden mit PBS + 115 mM Glycin gespült, um den Formaldehyd abzuschrecken und dann in PBS, die 2 % Rinderserumalbumin enthielt, (PBS+BSA) blockiert. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen die extrazelluläre Fas-Domäne gebildet worden war, (Transduction Labs, Lexington, KY, Katalog #F22120) wurde in PBS+BSA gegeben und die Deckgläschen wurden für 40 min bei 37°C inkubiert, bevor sie wieder in PBS gespült wurden. Ein Fluorescein-markierter sekundärer Antikörper (Ziege-Anti-Maus-FITC H+L, Zymed, South San Francisco, CA, Katalog-Nr. 62-6511), verdünnt in PBS+BSA, wurde dann zu den Deckgläschen gegeben und diese wurden erneut für 40 min bei 37°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschen wurde zelluläre DNA durch Inkubation in 1 mM TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR) für 20 min bei Raumtemperatur markiert. Deckgläschen wurden umgedreht und auf Objektträgern in Vectashield (Vector Labs, Burlinghame, CA) montiert, um eine Lichtbleichung zu verhindern, und mit Nagellack versiegelt. Die Objektträger wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Bio-Rad MRC 1024, montiert an ein Nikon Eclipse E-800 Standmikroskop, das zur Epifluoreszenz mit Objektiven mit hoher numerischer Blende ausgestattet war, untersucht (Uckun, F.M. et al. (1998), Clinical Cancer Research, 4, 901-912). Es wurden optische Schnitte erhalten und diese wurden unter Verwendung der Lasersharp-Software (Bio-Rad, Hercules, CA) in Stereo-Mikrophotographien umgewandelt. Repräsentative digitale Bilder wurden auf Jaz-Platten gesichert und unter Verwendung der Photoshop-Software (Adobe Systems, Mountain View CA) bearbeitet. Bilder wurden mit einem thermischen Transferdrucker von Fuji Pictography (Fuji Photo, Elmsford, NY) gedruckt. Digitale Daten wurden archiviert und auf CD-ROM gespeichert.
Apoptose-Assays
Um eine Apoptose zu induzieren wurden Zellen mit einem agonistischen Anti-Fas/APO-1-Antikörper (Biosource International, Camarillo, Ca., lot. 04/1295) bei Endkonzentrationen von 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml oder 1,0 μg/ml behandelt. Eine MC540-Bindung (als früher Marker der Apoptose) und die PI-Permeabilität (als Marker für das fortgeschrittene Apoptosestadium) wurden 24 Stunden nach Behandlung mit Anti-Fas-Antikörper, wie es früher beschrieben wurden, in DT-40-Zellen gleichzeitig gemessen (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Ganze Zellen wurden mit FAC-Star Plus-Strömungscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Alle Analysen wurden unter Verwendung einer 488 nm-Anregung durch einen Argonlaser durchgeführt. MC540- und PI-Emissionen wurden mit einem 600 nm "Short Pass"-Kaltlichtspiegel aufgespalten und ein 575 nm-Bandpaßfilter wurde vor einem Photovervielfacher angeordnet, um die MC540-Emission zu messen, und es wurde ein 635 nm-Bandpaßfilter zur PI-Emission verwendet.
Um eine apoptotische DNA-Fragmentierung zu detektieren, wurden DT-40-, NALM-6-UM1- und RAMOS-1-Zellen 24 Stunden nach Behandlung mit Anti-Fas geernetet. DNA wurde auf Triton-X-100-Lysaten zur Fragmentierungsanalyse hergestellt (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100); (Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91 und Uckun, F.M. et al. (1998) Clinical Cancer Research, 4, 901-912). Zellen wurden in hypotonischem 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4), 1 mmol/l EDTA, 0,2 % Triton-X-100-Detergens lysiert und anschießend mit 11 000 g zentrifugiert. Um eine mit Apoptose assoziierte DNA-Fragmentierung zu detektieren, wurden Überstände an einem 1,2 % Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und die DNA-Fragmente wurden nach Färbung mit Ethidiumbromid mit ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. In einigen Experimenten wurden MBP-BTK-Fusionsproteine (100 μg/2,5 × 108 Zellen) in BTK-defiziente DT-40-Zellen elektroporiert (420V elektrisches Feld, 125 μF), wobei ein BioRad-Elektroporator zum Transfer sowie die Verfahren von Bergland und Starkey (Berland, D. und Starkey, J. (1991), Cytometry 12, 64-67) mit leichten Modifikationen 4 Stunden vor einer Fas-Ligation und Apoptose-Assays angewendet wurden.
"Pull Down"-Assays mit MBP-BTK- und GST-BTK-Fusionsproteinen
GST-BTK-Fusionsproteine wurden nicht-kovalent an Glutathion-Agarose-Perlen (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, MO) gebunden und MBP-BTK-Fusionsproteine wurden nicht-kovalent an Amyloseperlen gebunden, und zwar unter Sättigungsproteinbedingungen, wie es früher bereits beschrieben worden war (Uckun, F.M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397 und Hsu, D. et al. (1996), Biochemistry 35, 13871-77). Kurz ausgedrückt, 50 μg jedes Proteins wurden mit 50 μl der Perlen für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Perlen wurden dreimal mit 1 % Nonidet P-40-Puffer gewaschen. Nonidet P-40-Lysate von BTK-defizienten DT-40-Zellen, humanen Leukämie-B-Zellen-NALM-6-UM1-Vorläufern und humanen EBV-transformierten lymphoblastoiden KL2-Zellen wurden hergestellt, wie es beschrieben wurde (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100 und Uckun, F.M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397) und 500 μg des Lysats wurden mit 50 μl Fusionsprotein-gekoppelter Perlen für 2 Stunden auf Eis inkubiert. Dies Fusionsproteinadsorbate wurden mit eiskaltem 1 % Nonidet P-40-Puffer gewaschen und in reduzierendem SDS-Probenpuffer resuspendiert. Proben wurden für 5 Minuten gekocht und dann an SDS-PAGE fraktioniert.
Proteine wurden auf Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA)-Membranen transferiert und die Membranen wurden mit Anti-Fas (Transduction Laboratories, Inc., Lexington, KY, Kat.# F22120) einem Immunblotting nach früher beschriebenen Verfahren unterzogen (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100; Dibirdik, I. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 4035-4039; Uckun, F.M. et al (1996), J. Biol. Chem. 271, 6389-6397 und Uckun, F.M. et al. (1997), Blood, 89, 3769-3777).
In einer Reihe von Experimenten, die entwickelt wurden, um die potentielle negative Regulationsrolle von BTK in Fas-vermittlerter Apoptose zu untersuchen, verglichen wir zuerst die Effekte einer Fas-Ligation an Wildtyp-DT-40-Zellen mit den Effekten einer Fas-Ligation an einen BTK-defizienten Subklon von DT-40-Zellen, der durch homologes Rekombinations-"Knockout" entwickelt worden war (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Zu diesem Zweck verwendeten wir zuerst einen quantitativen strömungscytometrischen Apoptose-Detektionsassay (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Die MC540-Bindung und die Propidiumiodid (PI)-Permeabilität wurde gleichzeitig vor und nach Behandlung mit dem agonistischen Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml × 24 h) gemessen. Während nur 5,0 % der Wildtyp-DT-40-Zellen, die mit dem Anti-Fas-Antikörper behandelt worden waren, apoptotische Veränderungen zeigten, machten 96,3 % der BTK-defizienten DT-40-Zellen eine Apoptose durch, wie es durch MC540-Einezlfluoreszenz (frühe Apoptose) oder MC540/PI-Doppelfluoreszenz (fortgeschrittene Apoptose) nach 24 Stunden bestimmt wurde (1). Bemerkenswert war, daß BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit einem humanen Wildtyp-btk-Gen rekonstituiert worden waren, einen sehr schwachen strömungscytometrischen Beweis für Apoptose zeigten, was einen formalen Beweis darstellt, daß BTK bei der Verhinderung des apoptotischen Todessignals, das durch Fas-Ligation ausgelöst wird, eine zentrale Rolle spielt. In Übereinstimmung mit den früher veröffentlichten Informationen bezüglich der pro-apoptotischen Funktion der Src-Familie-PTK (Waddick, K.G. et al. (1993), Radiation Research, 136, 313-319; Schlottmann, K.E. et al., Leukocyte Biology 60, 546-554; und Atkinson, E.A. et al(1996), J. Biol. Chem. 271, 5968-5971) und der Beeinträchtigung der Fas-vermittelten Apoptose in B-Zellen aus LYN-defizienten Mäusen (Wang, J., et al. (1996), J. Exp. Med. 184, 831-838) wurde in einem Anti-Fas-behandelten LYN-defizienten Subklon von DT-40-Zellen, der als Kontrolle in diesen Experimenten eingeschlossen war, sehr geringe Apoptose festgestellt (1). Wie in 2A gezeigt ist, war durch Western Blot-Analyse in den Ganzzellysaten von BTK-defizienten DT-40-Zellen kein BTK-Protein nachweisbar, während BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit einem humanen Wildtyp-btk-Gen rekonstituiert worden waren, höhere Level an BTK exprimierten als die Wildtyp-DT-40-Zellen. Allerdings waren die Fas-Protein-Expressionslevel in diesen drei B-Zellklonen tatsächlich identisch (2B). Diese Feststellungen wurden durch konfokale Mikroskopie weiter bestätigt. Wie in C.1 bis C.3 gezeigt wird, wiesen alle drei Zellinien ähnliche Level einer punktuierten Fas-Färbung auf. Dreidimensionale Rekonstruktionen von optischen Reihenschnitten bestätigten die Expression von Fas sowohl im Cytoplasma als auch an der Oberflächenmembran aller drei Zellinien ohne detektierbare Unterschiede bezüglich der Expressionslevel oder des Expressionsmusters. Somit war die Resistenz der Wildtyp-DT-40-Zellen oder der BTK-defizienten DT-40-Zellen, die mit Wildtyp-BTK rekonstituiert worden waren, gegenüber einer Fas-vermittelten Apoptose nicht in niedrigeren Expressionsleveln an Fas-Protein begründet und die Empfindlichkeit von BTK-defizienten DT-40-Zellen gegenüber einer Fas-Apoptose wurde nicht durch eine erhöhte Fas-Proteinexpression verursacht.
Die vergleichende Untersuchung der morphologischen Merkmale von Wildtyp- gegenüber BTK-defizient DT-40-Zellen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie zeigte keinen Apoptosebeweis für Wildtypzellen nach Behandlung mit dem agonistischen Anti-Fas-Antikörper, wohingegen BTK-defiziente Zellen eine Schrumpfung und Kernfragmentierung zeigten, die mit Apoptose übereinstimmt (3A). Auf Agarosegelen zeigte DNA aus Triton-X-100-Lysaten von Anti-Fas-behandelten BTK-defizienten DT-40-Zellen ein leiterartiges Fragmentierungsmuster, das Apoptose entspricht, wohingegen bei Wildtyp-DT-40-Zellen keine DNA-Fragmentierung beobachtet wurde (3B). Diese Resultate liefern einen direkten Beweis dafür, daß BTK eine Fas/APO-1-vermittelte Apoptose inhibieren kann.
BTK hat eine einzigartige N-terminale Region, die Pleckstrin-Homologie (PH)- und Tec-Homologie (TH)-Domänen, eine einzelne Src-Homologie-3 (SH3)-Domäne, welche die Autophosphorylierungsstelle am Tyrosin 223 hat, eine einzelne SH2-Domäne und eine katalytische Kinase-Domäne, welche die Transphosphorylierungsstelle am Tyrosin 551 enthält, enthält (Rawlings, D.J., Witte, O.N. (1994) Immunol. Rev. 138, 105-119 und Kurosaki, T. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318). Die PH-Domäne von BTK wechselwirkt mit verschiedenen Isoformen der Proteinkinase C, heterotrimeren G-Proteinen wie auch dem BAP-135-Protein (Rawlings, D.J., Witte, O.N. (1994), Immunol. Rev. 1380 105-119; Kurosaki, T. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318; Tsukada, S. (1994), J. Biol. Chem. 269, 10217-10220 und Yang, W., Desiderio, S. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 604-609). Es hat sich gezeigt, daß SH3-Domänen mit prolinreichen Sequenzen anderer Proteine wechselwirken, wohingegen SH2-Domänen mit Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wechselwirken (Yang, W, Desiderio, S. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 604-609). Allerdings wurden keine spezifischen Proteine beschrieben, die mit den BTK-SH2- oder -SH3-Domänen in B-Lymphozyten wechselwirken. Mutationen in der katalytischen Domäne, der SH2-Domäne wie auch der PH-Domäne der BTK führen erwiesenermaßen zu maturationalen Blöcken in frühen Stadien der B-Zell-Ontogenie in humanem XLA (Pawson, T., Gish, G.D. (1992), Cell 71, 359-362 und Vihinen, M., et al. (1995) Immunol. Today 16, 460-465). BTK-defiziente Mäuse, die durch Einführung von PH-Domänen- oder katalytischen Domänen-Mutationen in Embryostammzellen erzeugt worden waren, zeigten eine fehlerhafte B-Zellen-Entwicklung und -Funktion (Kerner, J.D., et al. (1995), Immunity 3, 301-312). Demnach sind verschiedene Regionen von BTK für ihre physiologischen Funktionen wichtig. Um die Beteiligung der verschiedenen BTK-Domänen bei der negativen Regulierung der Fas-vermittelten Apoptose zu untersuchen, führten wird humanes Wildtyp-btk-Gen wie auch humane btk-Gene, die Mutationen entweder in der katalytischen Domäne (Arg⁵²⁵ zu Gln), der SH2-Domäne (Arg³⁰⁷ zu Ala) oder der PH-domäne (Arg²⁸ zu Cys) beherbergten, in die BTK-defizienten DT-40-Zellen ein (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 273, 1096-1100). Wie in 3C und 3D bewiesen wurde, erlitten BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit humanem Wildtyp-btk-Gen (rWT) rekonstituiert worden waren, nach Behandlung mit dem agonistischen Anti-Fas-Antikörper keine Apoptose, wohingegen eine Fas-Aktivierung von rekonstituierten BTK-defizienten DT-40-Zellen, die humane BTK mit Mutationen in der Kinase (rK-)-, SH2 (rmSH2)- oder PH (rmPH)-Domäne exprimieren, eine Apoptose induzierte, wie es in nicht-rekonstituierten BTK-defizienten DT-40-Zellen der Fall ist, was in 3B dargestellt ist. Demnach sind die Kinase-, SH2- und PH-Domänen von BTK alle wichtig und offensichtlich für ihre Funktion als negativer Regulator der Fas-vermittelten Apoptose unverzichtbar.
Um die anti-apoptotische Funktion von BTK weiter zu charakterisieren, führten wir ein MBP-Fusionsprotein, das Vollängen-Wildtyp-BTK enthält, 4 Stunden vor Behandlung mit dem Anti-Fas-Antikörper durch Elektroporation in BTK-defiziente Zellen ein. Eine Untersuchung dieser Zellen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (4A) wie auch durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-BTK- und Anti-MBP-Antikörpern (4B) bestätigte das Vorliegen des elektroporierten MBP-BTK-Proteins. Wie in 4C gezeigt ist, machte eine Einführung von Wildtyp-BTK-Protein durch Elektroporation die BTK-defizienten DT-40-Zellen gegenüber den apoptotischen Effekten einer Fas-Ligation resistent, was direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen BTK und Gliedern des Fas-Signaltransducktionswegs als möglichen Mechanismus für die Anti-apoptotische Funktion von BTK nahelegt.
Die pro-apoptotischen "Downstream"-Events, die durch die Ligation von Fas oder TNF-Rezeptor-1 initiiert werden, werden derzeit belichtet (Fraser, A., Evan, G. (1996), Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincenz, et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 17255-17257; Deveraux, Q.L., et al. (1997), Nature 388, 300-304; Thome, M., et al. (1997), Nature 386, 517-521; Boldin, M.P. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; Los, M. et al. (1995), Nature 375, 81-83; Boldin, M.P., et al. (1996), Cell 85, 803-815; und Chinnaiyan, A.M., et al. (1995), Cell 81, 505-512). Sowohl Fas als auch TNF-Rezeptor-1 enthält eine homologe intrazelluläre "Todesdomäne", die im ligandenabhängigen Zusammenbau eines pro-apoptotischen "death inducing signaling"-Komplexes (DISC) eine zentrale Rolle spielt (Kischkel, F.C. et al. (1995), EMBO J. 14, 5579-5588). Die Todesdomänen von p55-TNF-Rezeptor-1 und Fas/CD95 dienen als Docking-Stellen, die eine ligandenabhängige Rekrutierung von und eine Heteroassoziierung mit einer anderen Todesdomäne, die mehrwertige Adapterproteine enthält, vermitteln: Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD) und mit Rezeptorwechselwirkendes Protein (RIP) im Fall von CD95; und TNF-Rezeptor-1-assoziiertes Todesdomänenprotein (TRADD) und RIP im Fall von TNF-Rezeptor-1 (Fraser, A., Evan, G. (1996), Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C. et al. (1995), EMBO J. 14, 5579-5588; und Chinnaiyan, A.M. et al. (1995) Cell 81, 505-512).
FADD ist der Konvergenspunkt zwischen den Fas/CD95- und TNF-Rezeptor-1-verknüpften apoptotischen Signaltransduktionspfaden. Während Fas/CD95 direkt FADD heranzieht, bindet TNF-Rezeptor-1 TRADD, welches dann als Adapter-Protein wirkt, um FADD zu rekrutieren. Die Bildung von CD95-FADD- oder TNF-Rezeptor-1-TRADD-FADD-Komplex nach Ligandenbindung ist für die Induktion einer Apoptose wichtig. Die Aneinanderfügung eines pro-apoptotischen DISC wird durch die Rekrutierung und begleitende Aktivierung der cytosolischen Caspase FLICE, einem Glied der ICE-Proteasefamilie, vervollständigt (Fraser, A., Evan, G. (1996), Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C. et al. (1995), EMBO J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincenz et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 17255-17257; Deveraux, Q.L. et al. (1997), Nature 388, 300-304; Thome, M. et al. (1997), Nature 386, 517-521; Boldin, M.P. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; Los, M. et al. (1995), Nature 375, 81-83; Boldin, M.P. et al. (1996), Cell 85, 803-815; und Chinnaiyan, A.M., et al. (1995) Cell 81, 505-512). Kürzlich wurde eine Reihe von Proteinen als Inhibitoren sowohl einer Fas- wie auch TNF-Rezeptor-1-induzierten Apoptose identifiziert (Fraser, A., Evan, G. (1996), Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C. et al. (1995), EMBO J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincenz et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 17255-17257; Deveraux, Q.L. et al. (1997), Nature 388, 300-304; Thome, M. et al. (1997), Nature 386, 517-521). Diese Proteine wechselwirken direkt mit FADD oder FLICE, wodurch sie einen DISC-Zusammenbau und dessen Funktion stören. Die Todesdomäne von Fas enthält bemerkenswerterweise ein konserviertes YXXL-Motiv ähnlich den Sequenzen des Immunrezeptor-Aktivierungsmotiv auf Tyrosin-Basis (ITAM) als potentielle Bindungsstelle für SH2 enthaltende Proteine; von Fas wurde kürzlich gezeigt, daß es mit Fyn- und Lck-Kinasen als pro-apoptotische Regulatoren, die zur Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose erforderlich sind, assoziiert (Schlottmann, K.E. et al., Leukocyte Biology 60, 546-554; und Atkinson, E.A. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 5968-5971).
Wir haben daher postuliert, daß BTK mit Fas wechselwirken könnte und den Zusammenbau eines proapoptotischen DISC nach Fas-Ligation verhindern könnte.
Wir untersuchten zuerst, ob BTK zu einer physikalischen Assoziierung mit Fas und anderen DISC-Gliedern fähig ist, indem wir die Fas-, FLICE-, FADD- und TRADD-Immunkomplexe aus den Nonidet P-40-Lysaten von unbehandelten DT-40-Zellen auf das Vorliegen von BTK untersuchten. BTK wurde durch Western-Blot-Analyse in Fas (aber nicht in den anderen) Immunkomplexen durch Anti-BTK-Immunblotting detektiert (5A). In ähnlicher weise wurde Fas durch Anti-Fas-Immunblotting in BTK-Immunkomplexen aus Wildtyp-DT-40-Zellen wie auch aus BTK-defizienten DT-40-Zellen, die mit humanem Wildtyp-btk-Gen rekonstituiert worden waren, detektiert (5B). Die konstitutive Assoziierung von BTK mit Fas-Protein wurde auch in der humanen B-Zellvorläufer-Leukämie-Zellinie NALM-6-UM1 gefunden (5C). Zusammengenommen bewiesen diese Resultate, daß BTK zur Assoziierung mit Fas-Protein fähig ist und daß diese physikalische Assoziierung kein vorheriges Eingreifen des Fas-Rezeptors erfordert. Wie in 5D gezeigt ist, ist Fas in BTK-defizienten DT-40-Zellen mit FADD assoziiert, wie es durch Detektion von Fas in FADD-Immunkomplexen bewiesen wird; diese physikalische Wechselwirkung war nach Fas-Ligation deutlich verstärkt. In Fas-aktivierten, BTK-defizienten DT-40-Zellen konnten Fas-assoziierte FADD-Moleküle durch Anti-FADD-Immunblotting detektiert werden (5D). Im Gegensatz zu BTK-defizienten DT-40-Zellen wurde eine sehr schwache Fas-FADD-Assoziierung in unbehandelten oder anti-Fas-behandelten, BTK-defizienten DT-40-Zellen, die mit humaner Wiltyp-BTK rekonstituiert waren, festgestellt (5B). In ähnlicher Weise konnte eine Fas-Ligation die Fas-FADD-Assoziierung in humanem NALM-6-UM1-Leukämiezellen nicht verstärken (5C). Demnach assoziiert BTK mit Fas und verschlechtert seine Wechselwirkung mit FADD, einem Protein, welches für die Rekrutierung und Aktivierung von FLICE durch Fas während des apoptotischen Signals essentiell ist. Obgleich diese Resultate die Möglichkeit nicht ausschließen, daß BTK das Schicksal des apoptotischen Signals, das durch Fas-Ligation ausgelöst wird, durch mehrere Mechanismen, einschließlich Modulation der Funktion positiver oder negativer Regulatoren der apoptotischen Signaltransduktion, verändern kann, liefern sie mindestens eine plausible Erklärung für die anti-apoptotische Funktion von BTK.
Um die physiologische Bedeutung der beobachteten BTK-Fas-Assoziierung in humanen Leukämie-B-Zell-Vorläufern zu klären, verglichen wir die Empfindlichkeiten der BTK-positiven, humanen NALM-6-UM1-pre-B-Leukämie-Zellinie und der BTK-defizienten humanen RAMOS-1-B-Zell-Leukämiezellinie gegenüber Fas-vermittelter Apoptose. Wie in 6A gezeigt ist, exprimieren diese zwei Zellinien ähnliche Level an Fas-Protein. BTK-defiziente RAMOS-1-Zellen machten nach Fas-Ligation mit dem agonistischen Anti-Fas-Antikörper eine Apoptose durch, allerdings war dies bei BTK-positiven NALM-6-UM1-Zellen nicht der Fall (6B). Wir untersuchten als nächstes die Wirkung des Leflunomid-Metabolitenanalogon α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dibromphenyl)propenamid (LMA-13), ein starker Inhibitor für BTK auf die BTK-Fas-Assoziierung und Resistenz gegenüber Fas-vermittelter Apoptose in NALM-6-UM1-Zellen. Anti-BTK- und Anti-Fas-Western-Blot-Analysen von Ganzzellysaten von LMA-13-behandelten NALM-6-UM1-Zellen zeigten keine Verringerung beim BTK (6.C.1)- oder Fas-Protein (6.C.2)-Expressionslevel. In den BTK-Immunkomplexen war wesentlich weniger Fas-Protein, was einen direkten Beweis dafür darstellt, daß eine BTK-Inhibierung durch LMA-13 die BTK-Fas-Assoziierung außer Kraft setzt (6C.3). Beachtenswerterweise induziert ein Vierstundenbehandlung mit LMA-13 in NALM-6-UM1-Zellen keine Apoptose, sondern macht diese hochresistenten humanen Leukämiezellen gegenüber Fas- vermitteltert Apoptose empfindlich (6D). Die bereitgestellten Resultate zeigen außerdem, daß BTK ein physiologisch wichtiger, negativer Regulator der Fas-vermittelten Apoptose ist.
Die Fähigkeit des BTK-Inhibitors LFM-A13, die BTK-Fas-Assoziierung außer Kraft zu setzen, lieferte den Beweis, daß die Kinaseaktivität von BTK eine wichtige Rolle für die Bildung der BTK-Fas-Komplexe liefert. Um weiter zu klären, ob die Assoziierung von BTK mit Fas von ihrer Kinaseaktivität abhängt oder nicht, untersuchten wir als nächstes BTK-Fas-Wechselwirkungen in BTK-defizienten DT-40-Zellen, die entweder mit humaner Wildtyp-BTK (BTK-, rBTK[WT]) oder Kinase-inaktiver mutanter (Arg⁵²⁵ zu Gln), humaner BTK (BTK-, rBTK[K-]) rekonstituiert worden waren. Wie in 7A dargestellt ist, zeigte eine Western-Blot-Analyse von Ganzzellysaten dieser zwei Zellinien mit Anti-BTK- oder Anti-Fas-Antikörpern keine wesentlichen Differenzen (d.h. in beiden der zwei unabhängigen Experimenten beobachteten wir eine etwas höhere BTK und Fas-Expression in BTK, rBTK[K-]-Zellen). Fas-Immunkomplexe aus Lysaten von BTK-, rBTK[WT]-Zellen, die BTK-Protein und diese BTK-Fas-Assoziierung enthielten, wurden durch Behandlung der Zellen mit dem Anti-Fas-Antikörper weiter verstärkt (7B, Bahnen 1 und 2). Dagegen war in Fas-Immunkomplexen aus BTK-, rBTK[K-]-Zellen ungeachtet einer Behandlung mit dem Anti-Fas-Antikörper kein BTK-Protein nachweisbar (7B, Bahnen 3 und 4). Diese Resultate liefern einen bestätigenden Beweis dafür, daß die Assoziierung von BTK mit Fas von der Kinaseaktivität von BTK abhängt.
Als nächstes führten wir Bindungsexperimente mit Vollängen-MBP-BTK- und verkürzten MBP-BTK- und GST-BTK-Fusionsproteinen, die verschiedenen BTK-Domänen entsprechen, (8A-C) durch, um die strukturellen Anforderungen für eine BTK-Assoziierung mit Fas zu klären. MBP-BTK 1-659 (Vollängen-BTK) wie auch MBP-BTK 408-659 ("BTK-Kinasedomäne") und MBP-BTK 2-137 ("BTK PH-Domäne") waren zum "pull down" und zum Binden von Fas aus Lysaten von BTK-defizienten DT-40-Zellen (8D), humanen NALM-6 pre-B-Leukämiezellen (8E) und humanen EBV-transformierten B-Lymphoblastenzellen KL2 (8F) fähig. Allerdings hat Fas nicht an das Kontroll-MBP-BTK 519-567-Fusionsprotein, das einer verkürzten Kinasedomäne entspricht, die die Y551-Transphosphorylierungsstelle enthält (C5 in 7D) entspricht, GST-BTK 219-377, das die SH3- plus SH2-Domäne enthält, GST-BTK 219-268, das der SH3-Domäne entspricht oder GST-BTK 281-377, das der SH2-Domäne entspricht, (die zwei letztgenannten wurden nur mit Lysaten von BTK-defizienten DT-40-Zellen verwendet) (8D–8F) gebunden.
Obgleich die Kristallstruktur von Vollängen-BTK nicht beschrieben worden war, liefern die kürzlich veröffentlichten Strukturen der PH-Domäne und des BTK-Motivs (Hyvonen, M., Saraste, M. (1997), EMBO J. 16, 3396-3404) nützliche Informationen, die auf die Bindungsfähigkeit von BTK und ihrer PH-Domäne anwendbar sind. Von FADD wurde berichtet, daß es mit der cytoplasmischen Fas-Domäne wechselwirkt, die zum großen Teil aus einer Todesdomäne besteht, welche aus sechs antiparallelen α-Helices besteht, die aus den Resten 230 bis 314 zusammengebaut sind (Huang, B. et al. (1996), Nature 384, 638-641). Es wurde spekuliert, daß die YXXL-Sequenz der Fas-Todesdomäne ITAMs ähnelt und durch eine SH2-Domäne nach Tyrosinphosphorylierung oder durch andere Mechanismen erkannt wird (Schlottmann, K.E., et al. Leukocyte Biology 60, 546-554; und Atkinson, E.A., et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 5968-5971). Eine Analyse der Konformation dieser YXXL-Sequenz zeigt, daß sie in der Mitte einer α-Helix lokalisiert ist; und wenn keine wesentliche Konformationsänderung dieser α-Helix erfolgen würde, um den Tyrosin-Rest zugänglicher zu machen, wäre sie für eine Wechselwirkung mit einer PTK zu stark. Somit würde die strukturelle Geometrie der YXXL- Sequenz wahrscheinlich verhindern, daß Fas und BTK einen solchen Bindungsmodus entwickeln, wie der von CD3-ε ITAM/ZAP-70, wie er von Atkinson, E.A. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 5968-5971 vorgeschlagen wurde. Die Unfähigkeit der BTK-SH2-Domäne zum "pull down" von Fas aus Ganzzellysaten unterstützt diese Meinung. Wie assoziiert dann BTK mit Fas? BTK und Fas können über komplementäre elektrostatische Anziehungen und Wasserstoff-Bindungswechselwirkungen, die die vorher beschriebenen geladenen Reste an den Oberfläche der α-Helices der Fas-Todesdomäne involvieren könnten, assoziieren. Diese Assoziierung könnte durch ein drittes Protein vermittelt werden, das eine Grenzfläche zwischen Fas und BTK bildet. die Bedeutung der SH2- und Kinasedomäne von BTK für ihre anti-apoptotische Funktion legt die Hypothese nahe, daß ein Tyrosin-phosphoryliertes Substrat von BTK eine solche Grenzfläche bereitstellen kann.
Die Fähigkeit von BTK, die pro-apoptotischen Effekte einer Fas-Ligation zu inhibieren weckt die Hypothese, daß eine Apoptose von sich entwickelnden B-Zellvorläufern während einer normalen humanen B-Zellontogenese durch Fas und BTK reziprok reguliert werden kann. Das Fehlen von BTK oder Mutationen in ihren Kinase-, PH- und SH2-Domänen könnte zu einem unpassenden apoptotischen Zelltod von pre-B-Zellen führen, was im XLA-Phänotyp resultiert (Rawlings, D.J., Witte, O.N. (1994), Immunol. Rev. 138, 105-119; Tsukada, S. et al. (1993), Cell 72, 279-290 und Vetrie, D. (1993) Nature 361, 226-233). Eine unpassende Apoptose kann der Pathogenese wie auch der Arzneimittelresistenz humaner Leukämie und Lymphomen zugrundeliegen, was die Apoptosekontrolle zu einem wichtigen potentiellen Ziel für eine therapeutische Intervention macht. Das Schicksal von Leukämie/Lymphom-Zellen, die chemotherapeutischen Mitteln (z.B. Vincristin, Daunorubicin oder Taxol) ausgesetzt sind, kann auf dem Gleichgewicht zwischen den entgegengesetzten pro-apoptotischen Wirkungen von durch DISC aktivierten Kaspasen und einem negativen "Upstream"-Regulationsmechanismus, der BTK und/oder seine Substrate involviert, basieren. Daher können BTK-Inhibitoren wahrscheinlich die Arzneimittelempfindlichkeit von Leukämie/Lymphom-Zellen der B-Linie verstärken.
Beispiel 2: Synthese spezifischer Leflunomid-Metabolitenanaloga
Chemie
Alle Chemikalien wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen und wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Außer, wenn es angegeben ist, war jeder Reaktionsbehälter mit einem Kautschukseptum gesichert und wurde die Reaktion unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurden an einem Varian Mercury 300-Spektrometer (Palo Alto, CA) bei Umgebungstemperatur in dem spezifizierten Lösungsmittel erhalten. Schmelzpunkte wurden unter Verwendung einer Fisher-Johns-Schmelzpunktapparatur bestimmt und sind unkorrigiert. FT-IR-Spektren wurden an einem Nicolet Protege 460-Spektrometer (Madison, WI) aufgezeichnet. GC/MS-Spektren wurden mit einem HP 6890-GC-System (Palo Alto, CA), das mit einem massenselektiven Detektor HP 5973 ausgestattet war, erhalten.
MS(EI)-Spektren wurden an einem HP Series 1100 LL/MSD erhalten.
Das allgemeine Syntheseschema für die Herstellung von LFM und LFM-A1 bis LFM-A14 ist in 19 dargestellt, wobei LFM, LFM-A1 bis LFM-A12 und LFM-A14 nur zu Vergleichszwecken angegeben sind. Cyanoessigsäure 1 wurde mit dem gewünschten Anilin 2 in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid (DIC) unter Bildung von 3 gekoppelt. Verbindung 3 wurde mit NaH behandelt und dann mit Acetylchlorid acyliert, wodurch LFM oder LFM-A1 bis LFM-A14 erhalten wurden.
Allgemeine Syntheseverfahren
1,3-Diisopropylcarbodiimid (1,75 g; 13,9 mmol) wurde zu einer Lösung von Cyanessigsäure 1 (1,70 g; 20,0 mmol) und dem gewünschten substituierten Anilin 2 (12,6 mmol) in Tetrahydrofuran (25 ml) bei 0°C gegeben. Das Gemisch wurde für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Harnstoffpräzipitat (Reaktionsnebenprodukt) wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zwischen Ethylacetat und 0,5 N HCl verteilt. Die organische Schicht wurde anschließend zweimal mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und durch Rotationsverdampfung konzentriert. Das rohe feste Produkt wurde aus Ethylalkohol umkristallisiert, wodurch reines 3 erhalten wurde. Siehe Kuo, E.A. et al. (1996), J. Med. Chem. 39(23), 4608-21 und Sjogren, E.R., et al. (1991), J. Med. Chem. 34, 3295-3301.
Natriumhydrid (0,93 g; 60 % in Mineralöl; 23,2 mmol) wurde langsam zu der Lösung von 3 (12,0 mmol) in Tetrahydrofuran (40 ml) bei 0°C gegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei 0°C wurde Acetylchlorid (1,04 g; 13,2 mmol) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt und durch Zusatz von Essigsäure (2 ml) abgeschreckt. Das Gemisch wurde in Eiswasser (100 ml), das 2,5 ml Salzsäure enthielt, gegossen, um das Rohprodukt auszufällen, welches durch Filtration gesammelt wurde und mit Wasser gewaschen wurde. Das rohe Endprodukt wurde durch Umkristallisation erhalten.
Physikalische Daten
In den folgenden Abschnitten werden die physikalischen Daten aller anderen Verbindungen als LFM-A13 (d.h. LFM, LFM-A1 bis LFM-A12 und LFM-A14) lediglich zu Vergleichszwecken aufgeführt:
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(trifluormethyl)phenyl]propenamid (LFM)

Smp.: 230-233°C;
IR (KBr): 3303, 2218, 1600 und 1555 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,01 (s, 1H, NH), 7,75 (d, J=8,4Hz, 2H, ArH), 7,64 (d, J=8,4Hz, 2H, ArH), 2,22 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 270 (M⁺), 161, 142, 111.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(4-bromphenyl)propenamid (LFM-A1)

Smp.: 213-214°C;
IR (KBr): 3288, 2228, 1615, 1555 cm^–1;
1H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,51 (s, 1H, NH), 7,49 (s, 4H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH₃);
MS (EI) m/z 280 (M⁺).

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(4-chlorphenyl)propenamid (LFM-A2)

Smp.: 209-211°C;
IR (KBr): 3298, 2223, 1598 und 1552 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,48 (s, 1H, NH), 7,54 (d, J=8,7Hz, 2H, ArH), 7,45 (s br, 1H, OH), 7,36 (d, J=8,7Hz, 2H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH₃);
MS (CI) m/z 236 (M⁺), 129, 127.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(4-fluorphenyl)propenamid (LFM-A3)

Smp.: 165-166°C;
IR (KBr): 3298, 2218, 1610 und 1560 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,33 (s, 1H, NH), 7,80 (s br, 1H, OH), 7,53 (m, 2H, ArH), 7,16 (m, 2H, ArH), 2,26 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 220 (M⁺), 111.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[2-(trifluormethyl)phenyl]propenamid (LFM-A4)

Smp.: 61-63°C;
IR (KBr): 3435, 2209, 1619, 1952 und 1548 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,99 (s, 1H, NH), 8,03 (d, J=7,5Hz, 1H, ArH), 7,67 (d, J=7,5Hz, 1H, ArH), 7,60 (dd, J=7,5, 7,5Hz, 1H, ArH), 7,29 (dd, J=7,5, 7,5Hz, 1H, ArH), 5,71 (s br, 1H, OH), 2,20 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 270 (M⁺), 161, 141, 114.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2-bromphenyl)propenamid (LFM-A5)

Smp.: 98-100°C;
IR (KBr): 3351, 2214, 1609, 1585 und 1536 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,76 (s, 1H, NH), 8,06 (dd, J=8,1, 1,5Hz, 1H, ArH), 7,62 (dd, J=8,1, 1,5Hz, 1H, ArH), 7,03 (m, 1H, ArH), 6,60 (s br, 1H, OH), 2,22 (s, 3H, CH₃);
MS (EI) m/z 280 (M⁺), 173, 171.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2-chlorphenyl)propenamid (LFM-A6)

Smp.: 93-94°C;
IR (KBr): 3372, 2208, 1644, 1621 und 1587 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,96 (s, 1H, NH), 8,16 (d, J=8,1Hz, 1H, ArH), 7,46 (dd, J=7,5, 1,5Hz, 1H, ArH), 7,29 (m, 1H, ArH), 7,08 (m, 1H, ArH), 2,22 (s, 3H, CH₃);
MS (CI) m/z 236 (M⁺), 129, 127.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2-fluorphenyl)propenamid (LFM-A7)

Smp.: 118-119°C;
IR (KBr): 3409, 2212, 1613, 1591 und 1532 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,70 (s, 1H, NH), 7,91 (m, 1H, ArH), 7,23 (m, 1H, ArH), 7,13 (m, 2H, ArH), 7,10 (s br, 1H, OH), 2,22 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 220 (M⁺), 111.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-(trifluormethyl)phenyl]propenamid (LFM-A8)

Smp.: 182-184°C;
IR (KBr): 3303, 2218, 1619 und 1572 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,79 (s, 1H, NH), 8,05 (s, br, 1H, OH), 8,04 (s, 1H, ArH), 7,75 (d, J=8,1Hz, 1H, ArH), 7,53 (dd, J=8,1, 7,5Hz, 1H, ArH), 7,42 (d, J=7,5Hz, 1H, ArH), 2,24 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 270 (M⁺), 161.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3-bromphenyl)propenamid (LFM-A9)

Smp.: 184-185°C;
IR (KBr): 3303, 2228, 1610, 1595 und 1550 cm 1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,56 (s, 1H, NH), 7,89 (m, 1H, NH), 7,89 (m, 1H, ArH), 7,47 (m, 1H, ArH), 7,28 (m, 2H, ArH), 6,37 (s br, 1H, OH), 2,26 (s, 3H, CH₃);
MS (EI) m/z 282 (M⁺+H, ⁸¹Br), 280 (M⁺+H, ⁷⁹Br), 173, 171.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3-chlorphenyl)propenamid (LFM-10)

Smp.: 184-187°C;
IR (KBr): 3293, 2221, 1610, 1595 und 1557 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) Δ: 10,61 (s, 1H, NH), 7,76 (m, 1H, ArH), 7,42 (m, 1H, ArH), 7,33 (dd, J=8,1, 8,4Hz, 1H, ArH), 7,16 (m, 1H, ArH), 6,84 (s br, 1H, OH), 2,25 (s, 3H, CH₃);
MS (CI) m/z 239 (M⁺+H, ³⁷Cl), 237 (M⁺+H ³⁵Cl), 129, 127.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3-fluorphenyl)propenamid (LFM-A11)

Smp.: 136-138°C;
IR (KBr): 3297, 2221, 1613, 1597 und 1567 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,54 (s, 1H, NH), 7,54 (m, 1H, ArH), 7,33 (m, 2H, ArH), 6,93 (m, 1H, ArH), 2,27 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 220 (M⁺), 111.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(trifluormethoxy)phenyl]propenamid (LFM-A12)

Smp.: 182-183°C;
IR (KBr): 3308, 2213, 1625 und 1580 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,57 (s, 1H, NH), 7,90 (s br, 1H, OH), 7,64 (d, J=8,7Hz, 2H, ArH), 7,32 (d, J=8,7Hz, 2H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH₃);
GC/MS m/z 286 (M⁺), 177, 108.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dibromphenyl)propenamid (LFM-A13)

Smp.: 148-150°C;
IR (KBr): 3353, 2211, 1648 und 1590 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,41 (s, 1H, NH), 8,57 (d, J=2,4Hz, 1H, ArH), 7,55 (d, J=8,7Hz, 1H, ArH), 7,14 (dd, J=8,7, 2,4Hz, 1H, ArH), 7,10 (s br, 1H, OH), 2,17 (s, 3H, CH₃);
MS (EI) m/z 362 (M⁺+4), 360 (M⁺+2), 358 (M⁺), 253, 251, 249, 150.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(phenyl)propenamid (LFM-A14)

Smp.: 134-135°C;
IR (KBr): 3281, 2214, 1605, 1579 und 1554 cm^–1;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,33 (s, 1H, NH), 7,51 (d, J=7,5Hz, 2H, ArH), 7,40 (s br, 1H, OH), 7,31 (dd, J=7,5, 7,5Hz, 2H, ArH), 7,11 (m, 1H, ArH), 2,26 (s, 3H, CH₃);
GM/MS m/z 202 (M⁺), 93.

Unter Verwendung von Verfahren ähnlich dem oben identifizierten allgemeinen Verfahren wurden auch die folgenden Verbindungen der Formel (I) hergestellt.
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid, hergestellt durch Oxidation der entsprechenden 4-Methylthio-Verbindung mit Peressigsäure in Essigsäure;
Smp.: 205-206°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,26 (s, 1), 7,81 (d, 2), 7,76 (d, 2), 3,15 (s, 3), 2,19 (s, 3);
IR (KBr): 3309, 2225, 1643 und 1586 cm^–1;
MS (EI) m/z 281,0 (M+H⁺), 172,1.
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid, hergestellt durch Oxidation der entsprechenden 3-Methylthio-Verbindung mit Peressigsäure in Essigsäure;
Smp.: 213-214°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,98 (s, 1), 8,18 (m, 1), 7,82 (m, 1), 7,60 (m, 2), 3,18 (s, 3), 2,23 (s, 3);
IR (KBr): 3278, 2231, 1607 und 1555 cm^–1;
MS (EI) m/z 281,0 (M+H⁺), 172,1.
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3-brom-4-(trifluormethoxy)phenyl]propenamid;

Smp.: 178-179°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,03 (s, 1), 8,12 (d, 1), 7,55 (dd, 1), 7,45 (m, 1), 5,53 (s, 1), 2,20 (s, 3);
IR (KBr): 3304, 2350, 1620 und 1602 cm^–1;
MS (EI) m/z 365,0 (M+H⁺), 255,9.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-dibromphenyl)propenamid;

Smp.: 181-181°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,03 (s, 1), 8,14 (m, 1), 7,84 (d, 1), 7,51 (dd, 1), 5,65 (s, 1), 2,20 (s, 3);
IR (KBr): 3360, 2205, 1591 und 1530 cm^–1;
MS (EI) m/z 361,0 (M+H⁺), 249,9.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-dichlorphenyl)propenamid;

Smp.: 143-144°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,23 (s, 1), 8,29 (m, 1), 7,60 (d, 1), 7,35 (dd, 1), 5,17 (s, 1), 2,18 (s, 3);
IR (KBr): 3371, 2210, 1601 und 1540 cm^–1;
MS (EI) m/z 271,0 (M+H⁺), 162,0.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dichlorphenyl)propenamid;

Smp.: 143-144°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,70 (s, 1), 8,51 (d, 1), 7,45 (d, 1), 7,05 (dd, 1), 4,97 (s, 1), 2,14 (s, 3);
IR (KBr): 3370, 2215, 1581 und 1528 cm^–1;
MS (EI) m/z 271,0 (M+H⁺), 162,0.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(3,4-dichlorphenyl)propenamid;

Smp.: 216-217°C;
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,74 (s, 1), 7,95 (m, 1), 7,54 (m, 1), 7,47 (m, 1), 5,64 (s, 1), 2,23 (s, 3);
IR (KBr): 3319, 2225 und 1612 cm^–1;
MS (EI) m/z 271,0 (M+H⁺), 162,0.

Unter Verwendung eines BTK-Inhibierungs-Assays ähnlich dem in Tabelle 1 beschriebenen, wurde festgestellt, daß die obigen Verbindungen als BTK-Inhibitoren wirken und im allgemeinen IC₅₀-Werte von 20 μm/ml oder weniger haben. Es wurde auch festgestellt, daß die Verbindungen Zellen für eine Apoptose mit Vincristin und Ceramid sensibilisieren, und zwar unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich dem in Beispiel 3 beschriebenen.
Beispiel 3:
Das folgende Beispiel liefert Informationen darüber, wie spezifische Inhibitoren für BTK entwickelt werden können. Es wird ein Homologiemodell für die Kinasedomäne von BTK offenbart, die für die Entwicklung und Bestätigung von BTK-Inhibitoren nützlich ist. Die Verwendung des Homologiemodells zur Identifizierung spezifischer Verbindungen, einschließlich eines neuen Leflunomid-Metabolitenanalogons, das ein wirksamer und selektiver BTK-Inhibitor ist, wird ebenfalls offenbart.
In einem Ansatz, wirksame Inhibitoren der anti-apoptotischen Tyrosinkinase BTK als Mittel gegen Leukämie mit Apoptosefördernden und chemosensibilisierenden Eigenschaften zu entwickeln, wurde ein dreidimensionales Homologiemodell der BTK-Kinasedomäne konstruiert, wie es nachfolgend vollständiger beschrieben wird. Modellierungsstudien zeigten eine deutliche rechteckige Bindungstasche in der Nähe der Hinge-Region der BTK-Kinasedomäne, wobei Leu⁴⁶⁰-, Tyr⁴⁷⁶-, Arg⁵²⁵- und Asp⁵³⁹-Reste die Ecken des Rechtecks besetzen. Die Abmessungen dieses Rechtecks sind etwa 18 Å × 8 Å × 9 Å × 17 Å und die Dicke der Tasche ist etwa 7 Å.
Es wurden weiterentwickelte Docking-Verfahren für die rationale Planung von Leflunomid-Metaboliten(LFM)-Analoga mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, günstigerweise an die katalytische Stelle in der Kinasedomäne von BTK zu binden, verwendet. Die Verbindung LFM-A13, für die wir einen K_i-Wert von 1,4 μM errechneten, inhibierte humane BTK in vitro mit einem IC₅₀-Wert von 17,2 ± 0,8 μM. Entsprechend inhibierte LFM-A13 rekombinante BTK, die in einem Baculovirus-Expressionsvektorsystem exprimiert wurde, mit einem IC₅₀-Wert von 2,5 μM. Die energetisch günstige Position von LFM-A13 in der Bindungstasche ist so, daß ihr aromatischer Ring nahe an Tyr⁴⁷⁶ ist und ihre Substituentengruppe zwischen den Resten Arg⁵²⁵ und Asp⁵³⁹ angeordnet ist. Außerdem ist LFM-A13 zu vorteilhaften Wasserstoff-Bindungswechselwirkungen mit BTK über Asp⁵³⁹- und Arg⁵²⁵-Reste fähig.
Es wurde auch entdeckt, daß LFM-A13 zusätzlich zu seiner deutlichen Wirksamkeit in BTK-Kinaseassays ein hochspezifischer Inhibitor für BTK ist. Selbst bei Konzentrationen in einer Höhe von 100 μg/ml (–278 μM) beeinträchtigt dieser neue Inhibitor die enzymatische Aktivität von anderen Proteintyrosinkinasen, einschließlich JAK1-, JAK3-, HCK-, EGF-Rezeptorkinase (EGFR) und Insulin-Rezeptorkinase (IRK) nicht.
Entsprechend der anti-apoptotischen Funktion von BTK verstärkt eine Behandlung von BTK⁺B-Linien-Leukämiezellen mit LFM-A13 ihre Empfindlichkeit gegenüber Ceramid- oder Vincristin-induzierter Apoptose.
Kristallstrukturen von Leflunomid-Metabolit und seinen Analoga
Der Leflunomid-Metabolit (LFM) und zwei seiner Analoga (LFM-A12, LFM-A13) wurden unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel durch Verdampfungs- oder Flüssigkeits-Flüssigkeits-Diffusion kristallisiert. LFM und LFM-A12 wurden kristallisiert und anschließend nur zu Vergleichszwecken analysiert. Röntgendaten von Einkristallen wurden unter Verwendung eines SMART-CCD-Flächendetektors (Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI) mit MoKI-Strahlung (F = 0,7107 Å) gesammelt. Die Raumgruppe wurde auf der Basis systematischer Absenzen und Intensitätsstatistiken bestimmt. Eine Lösung mit direkten Methoden lieferte die meisten der Nicht-Wasserstoffatome aus der Elektronendichtekarte. Mehrere Vollmatrix-kleinste Quadrate/Differenz-Fourier-Zyklen wurden durchgeführt, um die restlichen Nicht-Wasserstoffatome zu lokalisieren. Alle Nicht-Wasserstoffatome wurden mit anisotropen thermischen Parametern näher bestimmt. Wasserstoffatome wurden in idealen Positionen angeordnet und als "riding"-Atome mit relativen isotropen Temperaturfaktoren plaziert. Die Struktur wurde unter Verwendung von Vollmatrixkleinste Quadrate an F2 verfeinert. Die Kristallstrukturberechnungen wurden unter Verwendung eines Silicon Graphics INDY R4400-SC-Computers (Silicon Graphics Inc., Mountain View, CA) oder eines Pentium-Computers unter Verwendung der SHELXTL V 5.0-Programmfolge (Sheldrick, G., 5.0 Ed., Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI) durchgeführt.
Konstruktion des Homologiemodells für die Kinasedomäne von BTK
Ein Homologiemodell von BTK wurde konstruiert, indem die Kristallstrukturen homologer Kinasedomänen der Proteinkinasen HCK, FGFR, IRK und cAPK verwendet wurden (Sicheri, F., Moarefi, I. und Kuriyan, J. (1997), Nature 385 (6617), 602-9; Mohammadi, M., et al. (1997), Science 276 (5314), 955-60; Hubbard, S.R. (1997), The E. M. B. 0. Journal 16 (18), 5572-5581; und Zheng J. et al. (1993), Acta Cryst. D49, 362-365). Die Homologiemodellierung von BTK wurde durchgeführt, indem zunächst die Proteinsequenz von BTK (Swiss-Prot # Q06187, Univ. of Geneva, Genf, Schweiz) von GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) erhalten wurde. Als nächstes wurde die vernünftigste Sequenzorientierung zwischen der BTK-Kinase und einer Koordinatenmatrize bestimmt. Dies geschah, indem zuerst die CI-Koordinaten der Kinasedomänen von HCK, FGFR, IRK und cAPK unter Verwendung des InsightII-Programms ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) übereinandergelegt wurden, um den besten Gesamtstrukturvergleich bereitzustellen. Alle vier Sequenzen wurden dann auf der Basis des Übereinanderlegens ihrer Strukturen (Aminosäuresequenzen wurden zueinander ausgerichtet, wenn ihre CI-Positionen zueinander beabstandet waren) ausgerichtet bzw. orientiert. Die Sequenzorientierung trägt solchen Merkmalen wie Schleifen in einem Protein, das sich von den anderen Proteinsequenzen unterscheidet, Rechnung. Die strukturelle Übereinanderlagerung erfolgte unter Verwendung des Homology module of the Insight II ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA)-Programms und eines Silicon Graphics INDIGO2-Computers (Silicon Graphics Inc., Mountain View, CA). Die Sequenzorientierung wurde manuell auf der Basis der früher beschriebenen Betrachtungen eingestellt und produzierte für jede übereinandergelegte CI-Position ein Sequenzvariationsprofil. Das Sequenzvariationsprofil diente als Basis für den nächsten Arbeitsschritt, der eine Sequenzorientierung aller vier Proteine mit BTK-Kinase war. Bei diesem Arbeitsgang wurde die Sequenz der BTK-Kinase in das Programm eingelesen und manuell mit den vier bekannten Kinaseproteinen auf der Basis des vorstehend beschriebenen Sequenzvariationsprofils orientiert. Als nächstes wurde ein Satz von 3D-Koordinaten der BTK-Kinasesequenz zugeordnet, wobei die 3D-Koordinaten von HCK als Matrize verwendet wurden und das Homologiemodul innerhalb des Insight II-Programms ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) verwendet wurde. Die Koordinaten für eine Schleifenregion, in der eine Sequenzinsertion auftritt (für HCK ohne die Schleife) wurde aus einer begrenzten Anzahl von Möglichkeiten ausgewählt, die automatisch durch das Programm erzeugt wurden und manuell auf eine idealere Geometrie unter Verwendung des Programms CHAIN (Sack, J.S. (1988), J. Mol. Graphics 6, 244-245) eingestellt wurden. Schließlich wurde das konstruierte BTK-Modell einer Energieminimierung unter Verwendung des Xplor-Programms (Brunger, A.T. (1992), New Haven, CT) unterworfen, so daß eine sterische Spannung, die während des Modellbauprozesses eingeführt wurde, entspannt werden konnte. Das Modell wurde auf ungünstige sterische Kontakte durchgemustert und bei Bedarf wurden solche Seitenketten entweder durch Verwendung einer Rotamer-Bibliothek-Datenbank oder durch manuelles Drehen der entsprechenden Seitenketten remoduliert. Das fertige Homologiemodell der BTK-Kinasedomäne hatte nach Energieminimierung eine RMS-Abweichung von 0,01 Å von idealen Bindungslängen und von 2,2° von idealen Bindungswinkeln. Das Homologiemodell von BTK wurde dann in Verbindung mit Modellkoordinaten von LFM und seinen Analoga (die später mit Kristallstrukturen verglichen wurden) für Modellierungsstudien der BTK/Inhibitor-Komplexe verwendet.
Dockingverfahren unter Verwendung des Homologiemodells der BTK-Kinasedomäne
Eine Modellierung der BTK/LFM-Analogon-Komplexe erfolgte unter Verwendung des Dockingmoduls im Programm INSIGHT II und unter Verwendung der Affinitätsprogrammfolge für ein automatisches Docking eines Liganden an den Rezeptor. BTK im Komplex mit LFM oder LFM-A12 wurde lediglich zu Vergleichszwecken modelliert. Energie-minimierte Koordinaten wurden für jedes LFM-Molekül erzeugt und interaktiv in der ATP-Bindungsstelle von BTK auf der Basis der Quercetin-Position in HCK/Quercitin-Kristallstruktur verknüpft (Sicheri, F., et al., J. (1997), Nature 385 (6617), 602-9). Es wurden die Wasserstoffatome an der Kinasedomäne von BTK gebildet und vor Beginn des Dockingverfahrens wurden dem Rezeptor und dem Liganden Potentiale zugeordnet. Das Dockingverfahren im Insight II-Programm verwendete das CVFF-Kraftfeld und eine Monte Carlo-Suchstrategie, um nach verknüpften Strukturen zu suchen und diese zu beurteilen. Während die Koordinaten für die Masse des Rezeptors fixiert gehalten wurden, wurde eine definierte Region der Bindungsstelle relaxieren gelassen, wodurch das Protein sich auf die Bindung verschiedener Inhibitoren einstellen konnte. Innerhalb eines Abstands von 5 Å vom Inhibitor wurde ein Bindungssatz definiert, wobei sich Reste innerhalb dieses Abstands in energetisch günstige Positionen verschieben und/oder rotieren konnten, um den Liganden anzupassen. Es wurde eine Anordnung definiert, die aus dem Rezeptor- und Inhibitormolekül besteht und ein Docking wurde unter Verwendung des festgelegten Dockingmodus durchgeführt. Es wurden Berechnungen, die hydrophobe und hydrophile Wechselwirkungen nähern, verwendet, um die zehn besten Dockingpositionen für jedes LFM-Analogon in der katalytischen BTK-Stelle zu bestimmen. Die verschiedenen Docking-Positionen jedes LFM-Analogon wurden qualitativ beurteilt, wobei Ludi (Bohm, H.J. (1992), J. Comput. Aided. Mol. Des. (6(6), 593-606 und Bohm, H.J. (1994), J. Comput. Aided Mol. Des. 8(3), 243-56) in INSIGHT II verwendet wurde, das eingesetzt wurde, um eine Bindungskonstante (K_i) für jede Verbindung zu bestimmen, um ihre relativen Bindungsfähigkeiten und die vorausgesagte BTK-Inhibierung zu beurteilen. Die K_i-Trends für die LFM-Analoga wurden mit dem Trend der experimentell bestimmten Tyrosinkinase-Inhibierungs-IC₅₀-Werten für die Verbindungen verglichen, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) zu klären, welche die Wirksamkeit von LFM-Analoga bestimmen.
Rekombinante Baculovirus-Konstruktion und Protein-Expression
Sf21 (IPLB-SF2I-AE)-Zellen (Vassilev, A., et al. (1998), J. Biol. Chem., 274, 1646-1656), die aus dem Eierstockgewebe von Spodotera frugiperda stammen, wurden von Invitrogen erhalten und bei 26-28°C in Grace's-Insektenzellmedium, ergänzt mit 10 % FBS und 1,0 % Antibiotikum/Antimykotikum, (GIBCO-BRL) gehalten. Stammzellen wurden mit 0,2 bis 1,6 × 10⁶/ml in 600 ml Gesamtkulturvolumen in 1 l-Bellco-Zentrifugenkolben bei 60 bis 90 Upm gehalten. Die Zellebensfähigkeit wurde zu 95 bis 100 % aufrechterhalten, was durch Tryptanblau-Farbstoffausschluß bestimmt wurde.
Rekombinantes Baculovirus, das das murine BTK-Gen enthielt, wurde wie beschrieben konstruiert (Vassilev A., et al. (1998), J. Biol. Chem. 274, 1646-1656). Kurz ausgedrückt, das Gen, das für BTK codiert, wurde aus pBluescript SKII⁺-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA)-Verdau mit BamHI ausgeschnitten und dieses Fragment wurde dann in pFastBac1 (Gibco-BRL) ligiert. Der resultierende Vektor, pFastBacI-BTK, wurde dann verwendet, um das rekombinate Baculovirus durch ortsspezifische Transposition in E. coli-DH10Bac-Zellen (Gibco-BRL), die einen Baculovirus-Shuttle-Vektor beherbergen (bacmid), bMON14272, zu erzeugen. Die resultierende rekombinante bacmid-DNA wurde durch Transfektion nach dem Liposomen-vermittelten Standardverfahren unter Verwendung von Cellfectin-Reagens (Gibco-BRL) in Insektenzellen eingeführt. Vier Tage später wurden die Transfektionsüberstände für eine anschließende Plaque-Reinigung geerntet und wie oben analysiert. Kinase-tote BTK wurde gebildet wie es beschrieben ist (Vassilev, A. et al. (1998), J. Biol. Chem., 274, 1646-1656) und in den Baculovirus-Expressionsvektor kloniert, wie es oben für die Wildtyp-BTK beschrieben wurde. Baculovirus-Expressionsvektoren für JAK1- und JAK3-Kinase wurden konstruiert und in Insektenzellen eingeführt, wie es vorher beschrieben wurde (Goodman, P.A. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 17742-48).
Immunpräzipitation von rekombinanten Proteinen aus Insektenzellen
Sf21-Zellen wurden mit einem Baculovirus-Expressionsvektor für BTK, JAK1 oder JAK3 infiziert, wie es in der Kurzbeschreibung der Figuren angegeben ist. Zellen wurden geerntet, lysiert (10 mM Tris pH 6,7, 100 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40, 10 % Glycerin, 50 mM NaF, 100 mM Na3V04, 50 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 μg/ml aprotonin, μg/ml Leupeptin); und die Kinasen wurden aus den Lysaten immunpräzipitiert, wie es in der Literatur beschrieben ist (Vassilev, A., et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 1646-1656). Antikörper, die für Immunpräzipitationen aus Insektenzellen verwendet wurden, sind folgende: polyklonale Kaninchen-Anti-BTK-Serum-Antikörper (Mahajan, S. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11), polyklonale Kaninchen-Anti-JAK1 (HR-785)-Antikörper, Kat.# sc-277, polyklonales Kaninchen-IgG, affinitätsgereinigt, 0,1 mg/ml, Santa Cruz Biotechnology und polyklonaler Kaninchen-Anti-JAK3-Antikörper (C-21, Kat.# sc-513, polyklonales Kaninchen-IgG, affinitätsgereinigt, 0,2 mg/ml, Santa Cruz Biotechnology). Nachdem die immunpräzipitierten Tyrosinkinasen für 1 Stunde den Testverbindungen ausgesetzt worden waren, wurden Kinase-Assays, wie detailliert anderswo beschrieben, durchgeführt (Mahajan, S. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11 und Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Die Immunpräzipitate wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen, wie es vorher beschrieben wurde (Vassilev, A. et al. (1998), J. Biol. Chem. 274, 1646-1656).
Zellinien, Reagenzien und biochemische Assays Die Entwicklung und Charakterisierung der DT-40-Lymphom-B-Zellinie wie auch der BTK-defizienten DT-40 und ihrer Derivate, die mit Wildtyp- oder mutanter humaner BTK rekonstituiert worden waren, wurde bereits früher beschrieben (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Gleiche Mengen an BTK-Protein wurden in allen BTK-defizienten DT-40-Klonen, die mit Wildtyp- oder mutierten humanen BTK-Genen transfiziert worden waren, nachgewiesen, allerdings war kein BTK-Protein in den nicht-transfizierten BTK-defizienten DT-40-Zellen nachweisbar (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Alle Zellinien, die von der Hühner-B-Zellinie DT-40 stammten, wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1 % hitzeinaktiviertem Hühnerserum, 2 mM Glutamin, Penicillin und Streptomycin, gehalten. Zellen wurden bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre mit 5 % CO₂ wachsen gelassen. Die BTK-positiven, humanen B-Abstammungs-Leukämiezellinien NALM-6 und ALL-1 wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, gehalten (Uckun, F.M. et al. (1995), Science 267, 886-91). Die Affennieren-Zellinie COS-7 und die humane Hepatom-Zellinie HepG2 wurden von der ATCC erhalten.
Antikörper die gegen BTK, JAK1, JAK3 und HCK gerichtet sind, wurden früher bereits beschrieben (Mahajan, S. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11; Vassilev, A. et al. (1998), J. Biol. Chem , 274, 1646-1656: Goodman, P.A. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 17742-48; und Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Polyklonale Antikörper gegen BTK wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit Glutathion S- Transferase (GST)-Fusionsproteinen (Pharmacia Biotech Inc.), die die ersten 150 Aminosäuren von BTK enthalten, gebildet. Der monoklonale Anti-Fas-Antikörper (F22120) wurde von Transduction Laboratories, Inc. (Lexington, KY) erhalten. Immunpräzipitationen, Immunkomplex-Proteinkinase-Assays und Immunblotting unter Verwendung des ECL-Chemilumineszenz-Detektionssystems (Amersham Life Sciences) wurden durchgeführt, wie es in der Literatur beschrieben ist (Mahajan, S. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11; Vassilev, A. et al. (1998), J. Biol. Chem., 274, 1646-1656: Goodman, P.A. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 17742-48; und Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Nach der Elektrophorese wurden die Kinasegele auf Whatman 3M-Filterpapier getrocknet und einem Phosphoimaging an einem molekularen Bildgeber (Bio-Rad, Hercules, CA) sowie einer Autoradiographie auf Film unterzogen. In ähnlicher Weise wurden alle chemilumineszenten BTK-Western-Blots einem dreidimensionalem densitometrischen Scanning unterzogen, wobei der Molecular Imager und ein Imaging Densitometer unter Verwendung der Molecular Analyst/Macintosh-Version 2.1-Software nach den Beschreibungen des Herstellers (Bio-Rad) verwendet wurden. Für jede Wirkstoffkonzentration wurde ein BTK-Kinase-Aktivitätsindex bestimmt, in dem die Verhältnisse der Kinaseaktivität in Phosphorimager-Einheiten (PIU) und die Dichte der Proteinbanden in densitometrischen Scanningeinheiten (DSU) mit denen der Basislinienprobe verglichen wurden und die folgende Formel verwendet wurde: Aktivitätsindex = [PIU der Kinasebande/DSU der BTK-Proteinbande]_Testprobe: [PIU der Kinasebande/DSU der BTK-Proteinbande]_{Basislinienkontrollprobe}. GST-IGα wurde manchmal als exogenes Substrat für BTK-Immunkomplex-Proteinkinase-Assays verwendet, wie es beschrieben wurde. (Mahajan, S. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11). Meerrettichperoxidase-konjugierte Schaf-Anti-Maus-, Esel-Anti-Kaninchen-sekundärer Antikörper und ECL-Reagenzien wurden von Amersham (Oakbrook, IL) bezogen. Für Insulin- Rezeptorkinase (IRK)-Assays wurden humane HepG2-Hepatomzellen, die zu etwa 80 % Konfluenz gwachsen waren, einmal mit serumfreiem DMEM gewaschen und für 3 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator ausgehungert. Anschließend wurden die Zellen mit Insulin (Eli Lilly, Kat.# CP-410; 10 Einheiten/ml/10 × 10⁶ Zellen) für 10 Minuten bei Raumtemperatur stimuliert. Nach diesem IRK-Aktivierungsschritt wurden die Zellen einemal mit serumfreiem Medium gewaschen, in NP-40-Puffer lysiert und IRK wurde aus den Lysaten mit einem Anti-IRb-Antikörper (Santa Cruz, Kat.# sc-711, polyklonales IgG) immunpräzipitiert. Vor Durchführung der Immunkomplexkinase-Assays wurden die Perlen mit dem Kinasepuffer (30 mM Hepes pH 7,4, 30 mM NaCl, 8 mM MgCl₂ und 4 mM MnCl₂) äquilibriert.
Für HCK-Kinase-Assays verwendeten wir HCK-transfizierte COS-7-Zellen. Die Klonierung und Expression von HCK in COS-7-Zellen wurde früher beschrieben (Saouaf, S.J., et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 27072-8). Das pSV7c-HCK-Plasmid wurde in 2 × 10⁶ COS-7-Zellen transfiziert, wobei Lipofectamin (GIBCO/BRL) verwendet wurde; die Zellen wurden 48 Stunden später geerntet. Die Zellen wurden in NP-40-Puffer lysiert und HCK wurde aus den Ganzzelllysaten mit einem Anti-HCK-Antikörper immunpräzipitiert.
Apoptose-Assays
Um eine Apoptose zu induzieren, wurden Zellen mit einem agonistischen Anti-Fas/APO-1-Antikörper (Bender MedSystems, City/State, Lot. 04/1295) mit 0,1 μg/ml und 0,5 μg/ml Endkonzentrationen, mit Vincristin (Vincristinsulfat, USP; Pharmacia, NDC 0013-7466-86, Lot VCB019) mit 10 ng/ml und 100 ng/ml als Endkonzentrationen oder C2-Ceramid (Biomol, Lot M8107) mit 10 μM, 50 μM und/oder 100 μM als Endkonzentrationen behandelt. Die MC540-Bindung (als früher Marker für Apoptose) und die PI-Permeabilität (als Marker von Apoptose im fortgeschrittenen Stadium) wurden in DT-40-Zellen gleichzeitig 24 Stunden nach Behandlung mit C2-Ceramid, Anti-Fas oder Vincristin gemessen, wie es in der Literatur beschrieben ist (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Ganze Zellen wurden unter Verwendung eines FAC-Star Plus-Strömungs-Cytometers (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Alle Analysen wurden unter Verwendung einer 488 nm-Anregung auf einem Argonlaser durchgeführt. MC540- und PI-Emissionen wurden mit einem 600 nm-"Short Pass"-Kaltlichtspiegel aufgespalten und ein 575 nm-Bandpassfilter wurde vor einer Photomultiplier-Röhre angeordnet, um die MC540-Emission zu messen, und ein 635 nm-Bandpassfilter wurde für die PI-Emission verwendet. Um die Effekte des BTK-Inhibitors auf eine Ceramid-induzierte Apoptose in BCR-ABLpositive humane ALL-Zellinie ALL-1 zu untersuchen, wurden Zellen für 4 Stunden bei 37°C mit 10 μM C2-Ceramid in Gegenwart oder Abwesenheit des Inhibitors (200 μM LFM-A13) behandelt. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, mit PI und MC540 gefärbt und die apoptotischen Fraktionen wurden durch Multiparameter-Strömungscytometrie bestimmt, wie es in (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100) beschrieben ist.
Um eine apoptotische DNA-Fragmentierung zu detektieren, wurden DT-40-Zellen 24 Stunden nach Behandlung mit Anti-Fas, C2-Ceramid oder Vincristin geerntet. In ähnlicher Weise wurden B18.2-, NALM-6- und ALL-1-Zellen mit LFM-A13 (100 μM), Vincristin (VCR) (10 ng/ml), C2-Ceramid (C2-CER) (10 μM), LFM-A13 (100 μM) und VCR (10 ng/ml), LFM-A13 (100 μM) + C2-CER (10 μM) für 24 Stunden bei 37°C behandelt. DNA wurde aus Triton-X-100-Lysaten zur Fragmentierungsanalyse hergestellt (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Kurz ausgedrückt, Zellen wurden in hypotonischen 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4), 1 mmol/1 EDTA, 0,2 % Triton-X-100-Detergens lysiert und anschließend mit 11 000 g zentrifugiert. Um eine mit Apoptose assoziierte DNA- Fragmentierung zu detektieren, wurden Überstände an 1,2 Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und die DNA-Fragmente wurden nach Färben mit Ethidiumbromid durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
BTK ist ein anti-apoptotisches Enzym
Die anti-apoptotische Aktivität von BTK wurde beurteilt, indem die Effekte der Apoptose-induzierenden Agenzien C2-Ceramid, Vincristin und monoklonaler Anti-Fas-Antikörper auf Wildtyp-DT-40-Hüher-B-Lymphomzellen mit denen auf einen BTK-defizienten Subklon von DT-40-Zellen, die durch homologes Rekombinations-"Knockout"-entwickelt worden waren, verglichen wurden (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100). Es wurde gezeigt, daß Ceramid, das Produkt von Ceramidsynthase und Sphingomyelinase, als zweiter Messenger wirkt, der Membran-induzierte apoptotische Signale, einschließlich der Fas-vermittelten und TNF-Rezeptor-vermittelten Todessignale, zu stromabwärts gelegenen Effektoren überträgt (Enari, M., Hase, A. und Nagana, S. 81995), EMBO J. 14, 5201-5208). Die Verwendung von Vincristin, einem üblicherweise verwendeten Anti-Leukämie/Lymphom-Arzneimittel, führt zu einer zeitabhängigen Akkumulierung von Ceramid in behandelten Zellen, die zur Apoptose führt. An Agarosegelen zeigte DNA aus Triton-X-100-Lysaten von Anti-Fas-behandelten, BTK-defizienten DT-40-Zellen ein leiterartiges Fragmentierungsmuster, das mit Apoptose übereinstimmt, wohingegen in Wildtyp-DT-40-Zellen keine DNA-Fragmentierung beobachtet wurde (9A, Bahn 7 vs Bahn 14). So verursachte die Anti-Fas-Antikörper-Behandlung einen Apoptose in BTK-defizienten DT-40-Zellen, nicht aber in Wildtyp-DT-40-Zellen, was mit der Tatsache übereinstimmt, daß BTK ein Inhibitor des Fas-assoziierten "death inducing signaling"-Komplexes (DISC) ist (Vassilev A., et al. (1998), J. Biol. Chem. 274, 1646-1656). Die Behandlung von BTK-defizienten DT-40-Zellen mit C2-Ceramid (=N-Acetylspingosin; ein synthetisches, zellpermeables Ceramid-Analogon) oder Vincristin war fähig, die Effekte von Anti-Fas bei der Induzierung einer oligonukleosomalen DNA-Fragmentierung bei Agarosegelelektrophorese zu rekapitulieren, wohingegen Wildtyp-DT-40-Zellen gegenüber beiden Agenzien resistenz waren, was die Funktion von BTK als negativer Apoptoseregulator bestätigt (9A).
Um die Beiteiligung der verschiedenen Domänen von BTK bei ihrer anti-apoptotischen Funktion zu untersuchen, führten wird humanes Wildtyp-BTK-Gen wie auch humane BTK-Gene die Mutationen entweder in der katalytischen Domäne (Arg⁵²⁵ zu Gln), SH2-Domäne (Arg³⁰⁷ zu Ala) oder PH-Domäne (Arg²⁸ zu Cys) beherbergten, in die BTK-defizienten DT-40-Zellen ein (Enari, M. Hase, A. und Nagata, S. (1995), EMBO J. 14, 5201-5208). Wie in 9B bewiesen wurde, erleiden BTK-defiziente DT-40-Zellen, die mit humanem Wildtyp-BTK-Gen (WT) rekonstituiert waren, nach Behandlung mit C2-Ceramid (Bahnen 2-4) oder Vincristin (Bahnen 8-10) keine Apoptose, wohingegen DT-40-Subklone, die humane BTK mit Mutationen Inder Kinase (K-)- (Bahnen 5-7 und 11-13), SH2 (mSH2)- (Bahnen 15-17 und 21-23) oder PH (mPH)-Domänen (Bahnen 18-20 und 24-26) dies taten. Demnach sind die Kinase-, SH2- und PH-Domänen von BTK für ihre anti-apoptotische Funktion wichtig.
Homologiemodell der BTK-Kinase-Domäne
Die dreidimensionalen BTK-Koordinaten, die in den Protein/Inhibitor-Modellierungsstudien verwendet wurden, wurden auf der Basis einer strukturellen Orientierung mit den bekannten Kristallstrukturen für vier Proteinkinasedomänen (Kinasedomänen von HCK, FGFR, IRK und cAPK) konstruiert, wie es oben detailliert beschrieben wurde (Sicheri, F., Moarefi, I. und Kuriyan, J. (1997), Nature 385 (6617), 602-9; Mohammadi, M. et al. (1997), Science 276 (5314), 955-60; Hubbard, S.R. (1997), The E.M.B.O. Journal 16 (18), 5572- 5581; Zheng, J. et al. (1993), Acta Cryst. D-49, 362-365). Die modellierte BTK-Kinase-Domäne (10A) hat die erwartete Proteinkinasefaltung mit der katalytischen Stelle in der Mitte, die die Kinase-Domäne in zwei Lappen aufgeteilt. Sie besteht aus einem kleineren N-terminalen Lappen, der durch eine flexible Hinge-Region mit dem größeren C-terminalen Lappen verbunden ist. Der N-terminale Lappen ist reich an β-Strängen, während die C-terminale Region meist helikal ist. Die katalytische Stelle wird durch zwei β-Faltblätter definiert, die eine Grenzfläche an der Spalte zwischen den zwei Lappen bilden. In dieser katalytischen Region können kleine Molekülinhibitoren binden. Unsere Modellierungsstudien zeigten, daß die katalytische Stelle der BTK-Kinase-Domäne aus einer getrennten planaren, rechteckigen Bindungstasche nahe der Hinge-Region besteht. Die rechtwinklige Bindungsregion wird durch die Reste Leu⁴⁶⁰, Tyr⁴⁷⁶, Arg⁵²⁵ und Asp⁵³⁹ definiert, die die Ecken des Rechtecks besitzen. Die Abmessungen dieses Rechtecks sind etwa 18 Å × 8 Å × 9 Å × 17 Å und die Dicke der Tasche ist etwa 7 Å (10B). Die linke Ecke des Rechtecks kann sichtbar gemacht werden, da sie nahe an der Hinge-Region bei Leu⁴⁶⁰ (in 10B gelb gezeigt) beginnt und sich 8 Å nach oben rechts zu Asp⁵³⁹ (in 10B blau dargestellt) erstreckt. Dies ist die kürzeste Seite der Bindungstasche und befindet sich näher zum inneren Kern des Proteins. Die linke Seite der Tasche, die die längste ist, erstreckt sich von Leu⁴⁶⁰ und verläuft 18 Å entlang der Hinge-Region bis zu Tyr⁴⁷⁶ (in 10B grün dargestellt). Die rechte Seite der rechteckigen Tasche erstreckt sich gegenüber der Hinge-Region etwa 9 Å von Asp⁵³⁹ zu Arg⁵²⁵ (in 10B pink dargestellt), was unmittelbar zu den Bindungsunterstellen für die Zucker- und Triphosphat-Gruppen von ATP ist. Die Hinge-Region der Bindungsstelle besteht aus den Resten 472 bis 481. Das Lösungsmittel, das an der vierten Seite des Rechtecks freigelegt ist, erstreckt sich 17 Å entlang der schlitzförmigen Öffnung zur katalytischen Stelle von Tyr⁴⁷⁶ bis Arg⁵²⁵. Die Bindungstasche ist im Lösungsmittelzugangsbereich weiter, verengt sich in Richtung der innersten Region der Bindungsstelle und ist mit einer Dicke von etwa 7 Å insgesamt relativ flach. Das Volumen der Tasche ist etwa 500 Å³.
Während die meisten Reste der katalytischen Stelle der BTK-Kinase-Domäne im Vergleich zu anderen Tyrosinkinasen konserviert werden, wurden wenige spezifische Variationen beobachtet. Die Reste Asn⁵²⁶ und Asp⁵³⁹ (gegenüber der Hinge-Region) sind in EGFR, IRK, HCK und BTK konserviert. Der Rest Thr⁴⁷⁴ in der Hinge-Region ändert sich in IRK, JAK1 und JAK3 in Met und der Rest Tyr⁴⁷⁶ in der Hinge-Region ändert sich in EGFR und IRK in Leu. Der Rest Ser⁵³⁸ von BTK wird in anderen Kinasen nicht konserviert, sondern ändert sich in JAK1 und IRK zu Gly, in EGFR zu Thr und in FGF-Rezeptor, in JAK3 und HCK in Ala. Eine Region der Bindungsstelle enthält Cys481 in BTK, das hydrophober ist als der entsprechende Rest der PDGF-Rezeptors (Asp), des FGF-Rezeptors (Asn) und von IRK (Asp). Diese Reste identifizieren Differenzen, die eine Basis zur Entwicklung selektiver Inhibitoren der BTK-Kinase-Domäne liefern.
Konzept auf Strukturbasis und Synthese von LFM-Analoga mit starker BTK-Inhibitoraktivität
In Modellierungsstudien mit dem Ziel, LFM-Analoga mit hoher Wahrscheinlichkeit, günstigerweise an die katalytische Stelle der BTK-Kinase-Domäne zu binden, entschieden wir uns, die bestimmten K_i-Werte zu beurteilen, die die vorausgesagten Bindungswechselwirkungen zwischen dem Inhibitor und den Resten in der katalytischen Stelle von BTK quantitativ angeben. Jedes der kleinen Moleküle der LFM-Analoga wurde in der katalytischen Stelle der BTK-Kinase-Domäne einsezlen modelliert, wobei ein weiterentwickeltes Dockingverfahren angewendet wurde (siehe experimentelles Verfahren, das oben beschrieben wurde). Die Quercetin-Position in der HCK-Kristallstruktur (Sicheri et al., 1997, Nature 382:602) wurde als Matrize verwendet, um einen vernünftigen Ausgangspunkt für das Dockingverfahren zu erhalten. Die verschiedenen verknüpften Positionen jedes LFM-Analogon wurden quantitativ beurteilt, wobei ein Punktbewertungsverfahren verwendet wurde, danach wurden sie mit den IC₅₀-Werten der Verbindungen in zellfreien BTK-Inhibierungs-Assays verglichen. Tabelle 1 zeigt die Wechselwirkungspunktbewertungen, die berechneten K_i-Werte und gemessen IC₅₀-Werte für LFM und seine Analoga mit BTK, die Daten für LFM, LFM-A1 bis LFM-A12 und LFM-A14, die lediglich zu Vergleichszwecken angegeben sind.
Die Inhibitoren in unseren Moedllierungsstudien waren zwischen zwei Regionen der am stärksten hydrophoben Reste angeordnet. Die Region oberhalb des gebundenen Inhibitors bestand aus den Resten Leu⁴⁰⁸, Val⁴¹⁶ und Lys⁴³⁰ und die Reste unterhalb des gebundenen Inhibitors umfaßten die BTK-Reste Leu⁵²⁸, Ser⁵³⁸, Gly⁴⁸⁰ und Cys⁴⁸¹. Von allen beschriebenen Verbindungen, die in unseren Modellierungsstudien beurteilt wurden (Tabelle 1), sagten wir voraus, daß die Verbindung LFM-A13 die stärkste Bindung an BTK liefern würde. Die Positionen der kritischen Reste in der aktiven Stelle der BTK und die Docking-Position der Verbindung LFM-A13 ist in 11 gezeigt. Von allen möglichen Orientierungen dieses Moleküls, das an die katalytische Stelle gebunden ist, zeigte die in 11 dargestellt die höchste Wechselwirkungsbewertung mit BTK. Dieser hohe Wechselwirkungsbewertungswert ist für einen energetisch begünstigten Bindunsmodus mit entsprechend niedrigem berechneten K_i-Wert von 1,4 TM hinweisend. Diese Bindungsposition von LFM-A13 ist so, daß der aromatische Ring des Inhibitors dem Tyr⁴⁷⁶-Rest gegenüberliegt und sich die flexible Seitenkette in Richtung der Asp⁵³⁹- und Arg⁵²⁵-Reste erstreckt. Der aromatische Ring ist zwischen den hydrophoben Resten Leu⁴⁰⁸ und Val⁴¹⁶ oben und Gly⁴⁸⁰ und Leu⁵²⁸ unten angeordnet. Der Rest Ser⁵³⁸ liegt unter der flexiblen Seitenkette des Inhibitors und das Ende der Seitenkette liegt zwischen den Resten Asp⁵³⁹ und Arg⁵²⁵. Diese Position scheint der des ATP-Analogons sehr ähnlich zu sein, die in der IRK-Komplex-Kristallstruktur gefunden wurde (Hubbard, EMBO J, 16 (18): 5572-5581, 1977). Nach unseren Modellierungsstudien würde das O3-Atom in der Hydroxyl-Gruppe von LFM-A13 eine Wasserstoffbindung mit Asp⁵³⁹:O bilden und sein O4-Atom würde eine Wasserstoffbindung mit Arg⁵²⁵:N bilden.
12 stellt die übereinandergelegten verknüpften Positionen von LFM-A13 in der katalytischen Stelle von BTK zusammen mit den Verbindungen LFM und LFM-A12 zum Vergleich dar. Die Moleküle LFM und LFM-A12 sind so verknüpft, daß sie entlang der Hinge-Region liegen, was der Quercetin-Position in der HCK-Kristallstruktur entspricht. Der aromatische Ring dieser Moleküle befindet sich in der Nähe von Tyr⁴⁷⁶ und das Ende der Seitenkette liegt zwischen den Resten Asp⁵³⁹ und Thr⁴⁷⁴. Die CF₃-Gruppe in diesen Molekülen zeigt zu der Lösungsmittel-Zugangsregion und ist von Leu⁴⁰⁸ oben und G1y⁴⁸⁰ unten umgeben. Die OH-Gruppe von LFM ist an ein Sauerstoffatom von Asp⁵³⁹ Wasserstoff-gebunden und für LFM-A12 ist dieselbe Gruppe an ein Sauerstoffatom von Thr⁴⁷⁴ Wasserstoff-gebunden. Alle in Tabelle 1 aufgelisteten LFM-Analoga, ausgenommen LFM-A13, liegen entlang der Hinge-Region wie LFM oder LFM-A12 und ihren Seitenketten liegen zwischen Asp⁵²⁵ und Thr⁴⁷⁴.
Ein Vergleich von LFM, LFM-A12 und LFM-A13 bezüglich der aktiven BTK-Stelle zeigt, daß, obgleich der aromatische Teil der drei Moleküle grob in derselben Region ist (was auch für die anderen inaktiven LFM-Analoga gilt), ist die Seitenkette von LFM-A13 von denen der anderen weggeneigt und liegt zwischen den Resten Asp⁵³⁹ und Arg⁵²⁵. Diese Rotation resultiert wahrscheinlich aus einer günstigen Orientierung der 2,5-Dibrom-Gruppen von LFM-A13. Diese leicht geneigte Position und die größeren Br-Gruppen bieten zwei Vorteile für die Wechselwirkung von LFM-A13 mit der aktiven Stelle der Reste von BTK.
Der erste Vorteil ist der, daß LFM-A13 fähig ist, zwei Wasserstoffbindungen mit den Resten Asp⁵³⁹ und Arg⁵²⁵ der aktiven Stelle zu bilden, wohingegen die inaktiven LFM-Analoga nur eine Wasserstoffbindung mit jeweils Thr⁴⁷⁴ oder Asp⁵³⁹ von BTK bilden. Der zweite Vorteil für die Bindung ist der höhere Kontaktbereich von LFM-A13 mit den Resten der aktiven Stelle von BTK im Vergleich zu den anderen 12 inaktiven LFM-Analoga, was zu einer stärkeren hydrophoben Wechselwirkung für LFM-A13 führt. Diese Merkmal wird durch die entsprechend höhere lipophile Punktbewertung für LFM-A13 in Tabelle 1 wiedergegeben.
Die Resultate aus den oben diskutierten Modellierungsstudien stützten die Hypothese, daß LFM-A13 starke BTK-Inhibitor-Aktivität aufweisen würden. Um diese Hypothese zu untersuchen und den Voraussagewert des beschriebenen BTK-Homologiemodells zu bestätigen, synthetisierten wird LFM-A13, LFM und 11 andere LFM-Analoga, die in Tabelle 1 aufgelistet sind. Wiederum werden LFM und alle anderen Analoga als LFM-A13 lediglich zu Vergleichszwecken synthetisiert und analysiert. Die Strukturen von LFM, LFM-A12 und LFM-A13 wurden durch Einkristall-Röntgenbeugung bestimmt. Es wurde festgestellt, daß alle Strukturen eine planare Konformation haben und alle Bindungslängen und -winkel im erweiterten Bereich lagen.
13 zeigt eine ORTEP-Darstellung der Verbindung LFM-A13. Die Kristallstruktur von LFM-A13 zeigte, daß ihre Molekülkonformation sehr ähnlich zu den energieminimierten molekularen Koordinaten war, die für Docking-Studien mit BTK erzeugt und verwendet wurden. Die Konformationsähnlichkeit mit den Kristallstrukturen zeigt an, daß die zum Docking verwendeten Molekülmodelle für Modellierungsstudien geeignet waren.
Spezifische Inhibierung von BTK durch LFM-A13
Zellfreie Immunkomplex-Kinase-Assays wurden verwendet, um die Wirkungen von LFM und 12 LFM-Analoga auf die enzymatische Aktivität von humanter BTK, die aus B18-2-Zellen (Uckun, F.M. et al. (1996), Science 22, 1096-1100) (d.h. BTK-defizienten DT-40-Hühner-Lymphom-B-Zellen, die mit humanem Wildtyp-BTK-Gen rekonstituiert worden waren) immunpräzipitiert worden waren. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wies nur LFM-A13 deutliche BTK-Inhibitoraktivität mit einem IC₅₀-Wert von 6,2 ± 0,3 μg/ml (= 17,2 ± 0,8 μM) auf. Keine der anderen Verbindungen, die nur zum Vergleich enthalten sind, inhibierte BTK selbst bei hohen Konzentrationen wie 100 μg/ml (d.h. im Bereich von 349 μM für LFM-A12 bis 495 μM für LFM-A14).
LFM-A13 war ebenfalls gegen rekombinante BTK, exprimiert in einem Baculovirus-Vektor-Expressionssystem, mit einem IC₅₀-Wert von 0,9 Tg/ml (–2,5 TM, 14A) wie auch BTK, das aus Zelllysaten der humanen Zellinie NALM-6-B-ALL (14B) wirksam. Darüber hinaus resultierte eine Behandlung von B18.2-Zellen (14C) oder NALM-6-Zellen (Daten nicht gezeigt) mit LFM-A13 zu einer dosisabhängigen Inhibierung der zellulären BTK-Aktivität. Die Inhibitoraktivität von LFM-A13 gegen BTK war spezifisch, da sie die enzymatische Aktivität von anderen Protein-Tyrosinkinasen, einschließlich Janus-Kinasen JAK1 und JAK2, der Kinase HCK der Src-Familie und der Tyrosinkinase der Rezeptorfamilie IRK, bei Konzentrationen in einer Höhe von 100 μg/ml (–278 μM; Tabelle 2, 15) nicht beeinträchtigte.
Strukturelle Basis für die BTK-Spezifität von LFM-A13 Biologische Assays haben gezeigt, daß LFM-A13 ein selektiver Inhibitor von BTK ist, wohingegen es ein schlechter Inhibitor für EGFR, HCK, JAK1, JAK3 und IRK ist. Um diese Selektivität zu bewerten, konstruierten wir ein Homologiemodell für EGFR, JAK1 und JAK3 unter Verwendung der homologen Kristallstrukturkoordinaten der Proteinkinasen IRK, HCK und cAPK als Matrize. Die Modelle wurden dann verwendet, um die Bindung kleiner Moleküle, z.B. LFM-A13 in den katalytischen Stellen dieser Kinasen zu untersuchen und um besser zu verstehen, wie LFM-A13 BTK inhibieren kann, nicht aber EGFR, IRK, JAK1, JAK3 pder HCK inhibiert. Diese Studien identifizierten drei Faktoren, die zur Spezifität von LFM-A13 für BTK beitragen können.
Das kleine Molekül LFM-A13 wurde in den Kinase-Domänen von IRK, HCK, JAK3 und EGFR gebunden. Tabelle 2 zeigt die Wechselwirkungspunktbewertungen, berechnete K_i-Werte und gemessene IC₅₀-Daten für LFM-A13 mit diesen Kinasen. Wir pstulieren, daß die Selektivität von LFM-A13 für BTK aus günstigen Wechselwirkungen mit den Resten der katalytischen Stelle von BTK resultiert, welche in den anderen untersuchten Kinasen nicht vorliegen. Es gibt einige Reste in der aktiven BTK-Stelle, die sich von denen anderer PTKs unterscheiden. Diese Differenzen sind in 16 dargestellt, die die Hauptkette der katalytisch der BTK-Stelle, die Differenzen bei den Resten zwischen BTK und anderen Kinasen und die Docking-Positionen von LFM-A13 in den Kinase-Domänen von BTK, HCK, JAK3, JAK1, EGFR und IRK darstellt.
Es wird angenommen, daß die Unterschieden in den Resten, die in Positionen A, B und C in 16 gezeigt sind, zur Spezifität von LFM-A13 für BTK beitragen können. Kinasen, die durch LFM-A13 nicht inhibiert werden können, z.B. IRK (grau) und JAK1/JAK3 (pink) enthalten in Position A einen Methionin- Rest, der in die aktive Stelle hineinragt und den engen Kontakt von kleinen Molekülen wie LFM-A13 mit der Hinge-Region der Bindungsstelle verhindert. Als Resultat kann LFM-A13 einen günstigen hydrophoben Kontakt mit der Hinge-Region der Kinase-Domänen dieser Proteine verlieren und bindet nicht fest daran. Allerdings zeigten Docking-Untersuchungen, daß die günstige Position von LFM-A13 in der BTK-Kinase-Domäne so ist, daß die Seitenkette des kleinen Moleküls zwischen den Resten Asp⁵³⁹ und Arg⁵²⁵ lokalisiert ist und mit diesen Wasserstoffbindungen bildet.
Außerdem verstärkt ein hydrophober Rest in Position B von BTK die hydrophobe Wechselwirkung des LFM-A13-Moleküls mit dem Rezeptor, eine Wechselwirkung, die in EGFR (rot, 16) und IRK (dunkelblau, 16) verlorengegangen ist. Während die Lipo-Punktbewertungen zwischen 457 und 473 für andere Kinasen lagen, war die Lipo-Punktbewertung für BTK mit 517 höher (günstiger). Schließlich kann der Arg⁵²⁵-Rest in Position C von BTK eine Wasserstoffbindung zu LFM-A13 haben. Diese Wechselwirkung geht in HCK (gelb) verloren, welche ein Ala in der C-Position enthält. Die günstige Position von LFM-A13 an der HCK-Kinase-Domäne (in gelb dargestellt) ist so, daß das kleine Molekül entlang der Hinge-Region orientiert ist. In dieser Position bildet LFM-A13 keine Wasserstoffbindungen mit HCK, was im Fall für BTK nicht erfolgt. Die längere Seitenkette von Arg⁵²⁵ in BTK (Position C) ist bei der Wasserstoffbindung mit LFM-A13 involviert, wohingegen HCK ein Ala in dieser Position hat, das nicht fähig ist, dieselbe Wasserstoffbindung zu bilden.
LFM-A13 verstärkt die Empfindlichkeit akuter Lymphoblastenleukämie (ALL)-Zellen mit B-Abstammung für eine Ceramid- und Vincristin-induzierte Apoptose Patienten mit Philadelphia-Chromosom (Ph+)-ALL haben nach intensiven Multimodalitätsbehandlungsprogrammen ein schlechtes Ergebnis. Das Versagen einer Behandlung bei diesen Patienten könnte überwunden werden, wenn die apoptotische Schwelle ihrer Leukämiezellen gesenkt werden könnten. Wir versuchten zu bestimmen, ob LFM-A13 durch Inhibierung der anti-apoptotischen Tyrosinkinase-BTK die Empfindlichkeit der der Ph+ALL-Zellinie ALL-1 für C2-Ceramid ändern könnte. Wie in 17 gezeigt ist, erhöht eine Behandlung mit LFM-A13 die Chemosensitivität von ALL-1-Zellen gegenüber Ceramid-induzierter Apoptose deutlich, wie es durch eine größere prozentuale Anzahl von Zellen, die mit LFM-A13 plus C2-Ceramid behandelt worden waren, im Vergleich zu Zellen, die mit C2-Ceramid allein oder LFM-A13 allein behandelt worden waren, die eine duale PI/MC540 Fluoreszenz (dargestellt in blauer Farbe) zeigten, was einem fortgeschrittenen Apoptose-Stadium entspricht, bewiesen wurde. Außerdem zeigte DNA aus Triton-X-100-Lysaten von B18.2-Hühner-Lymphom-B-Zellen (d.h. BTK-defizienten DT-40-Zellen, die mit humanem Wildtyp-BTK-Gen rekonstituiert worden waren; siehe auch 9), human NALM-6-pre-B-ALL-Zellen und ALL-1-Zellen ein leiterartiges Fragmentierungsmuster, das Apoptose entsprach, nach Behandlung mit LFM-A13 plus Ceramid oder LFM-A13 plus Vincristin, wobei diese ausgeprägter war als nach Behandlung mit LFM-A13, Ceramid oder Vincristin allein (18). Diese Resultate bewiesen, daß LFM-A13 die Empfindlichkeit von Leukämie/Lymphom-B-Zellen gegenüber Ceramid-induzierte und Vincristin-induzierter Apoptose verstärkt.
Beispiel 4: Modifikationen an DDE LFM-A13 zur BTK-Inhibierung
Das folgende Beispiel beschreibt, wie das obige Homologiemodell und Informationen bezüglich Differenzen zwischen der Bindungsdomäne von BTK und anderen Proteintyrosinkinasen verwendet wurden, um zusätzliche Verbindungen der Formel (I), die spezifische BTK-Inhibitoren sind, zu identifizieren.
Strukturelle und chemische Merkmale von LFM-Analoga, die vorgeschlagen werden, um die Bindung an die katalytische BTK-Stelle zu unterstützen, werden unten beschrieben und sind in den 20A bis 20C dargestellt. Bindungsmodus 1 (20A)–20B zeigt den wahrscheinlichsten Bindungsmodus der Verbindungen LFM-A13 an der katalytischen Stelle von BTK. Auf der Basis von Modifikationen der Verbindung kann auch ein zweiter Bindungsmodus möglich sein, der in 20C dargestellt ist (Bindungsmodus 2).
Tabelle 3 zeigt die Differenzen bei dem Rest an der ATP-Bindungsstelle zwischen den zehn PTKs: EGFR, Btk, Hck, Jak1, Jak3, IR, FGFR1, PDGFR9, VEGFR2 und Src.
Tabelle 3
Ein Vergleich der Inhibitorbindungstasche von BTK mit der von EGFR, Hck, Jak1, Jak3, FGFR1, PDGFRβ, VEGVF2 und Src zeigt, daß SER 538 in der ATP-Bindungsspalte von BTK einzigartig ist (Tabelle 3) und ein Ziel für ein spezifisches BTK-Inhibitorenkonzept darstellt. Liganden, die so konzipiert sind, daß mit diesem Rest wechselwirken, sollten eine erhöhte Spezifität für BTK haben. 20B zeigt die Abstände (in Angström) der NH-, =O- und OH-Gruppe des angekoppelten LFM-13-Liganden aus SER 538. Beim Blick in die BTK-Bindungsspalte mit dem aromatischen Ring des Liganden nach außen gerichtet und der Kette nach Innen gerichtet, erkennt man, daß dieser Rest unter dem Liganden liegt. Nicht-planare, Einzelkettensubstitutionen, die mit O oder N enden und die geeigneten Längen (20B) an den NH-, =O- und OH-Gruppen haben, sollten die Bildung von Wasserstoffbindungen mit Ser 538 ermöglichen. Auf der Basis dieser Betrachtung und auf der Modulierung und der biologischen Daten für die 13 Leflunomid-Metabolitenanaloga, die oben beschrieben wurden, können zusätzliche Verbindungen der Formel (I) zur besseren Wechselwirkung mit der Bindungstasche entwickelt werden, von denen erwartet wird, daß sie Inhibitoren von BTK sind.
Beispiel 5: Zweite Generation an LFM-Analoga
Das folgende Beispiel beschreibt wie neue Verbindungen der Formel (I), die so konzipiert sind, daß sie auf SER 538 abzielen, geplant und hergestellt werden.
Unter Verwendung der in den 20A–20B beschriebenen Konzeptparameter wurden eine zweite Generation an LFM-Analoga (LFM-A15-20) konzipiert und synthetisiert. Die Verbindungen haben die folgenden Strukturformeln:
Das folgende Syntheseschema und das in 19 dargestellte wurden verwendet, um die Verbindungen herzustellen:
Syntheseverfahren A
1,3-Diisopropylcarbodiimid (1,75 g; 13,9 mmol) wurde zu einer Lösung von Cyanessigsäure 1 (1,70 g; 20,0 mmol) und des gewünschten substituierten Anilin 2 (12,6 mmol) in Tetrahydrofuran (25 ml) bei 0°C gegeben. Das Gemisch wurde für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harnstoffpräzipitat (Reaktionsnebenprodukt) wurde durch Filtration entfernt und zwischen Ethylacetat und 0,5 N HCl verteilt. Die organische Schicht wurde nacheinander zweimal mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und durch Rotationsverdampfung konzentriert. Schließlich wurde das feste Rohprodukt aus Ethylalkohol umkristallisiert, wobei reine 3 erhalten wurde. Natriumhydrid (0,93 g; 60%ige in Mineralöl; 23,2 mmol) wurde langsam zu der Lösung von 3 (12,0 mmol) in Tetrahydrofuran (40 ml) bei 0°C gegeben. Nach Rühren für 30 Minuten bei 0°C wurde Acetylchlorid (1,04 g; 13,2 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Die Reaktion wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt und wurde dann durch Zusatz von Essigsäure (2 ml) abgeschreckt. Das Gemisch wurde in Eiswasser (100 ml), das 2,5 ml Salzsäure enthielt, gegossen, um das Rohprodukt auszufällen, welches dann durch Filtration gesammelt wurde und mit Wasser gewaschen wurde. Das reine Produkt wurde durch Umkristallisation erhalten.
Syntheseverfahren B
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[(methylthio)phenyl]propenamid (2,48 g, 10,0 mmol) wurde in Essigsäure (150 ml) gelöst und Peressigsäure (8,6 ml einer 32 Gew.%igen Lösung in Essigsäure) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und Wasser (75 ml) wurde zugesetzt. Das Präzipitat wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Das reine Produkt wurde durch Umkristallisieren erhalten.
Physikalischen Daten für die synthetisierten Verbindungen:
α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[4-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid

Schmelzpunkt: 205-206°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,26 (s, 1H, NH), 7,81 (d, J=9,0Hz, 2H, ArH), 7,76 (d, 9,0Hz, 2H, ArH), 3,15 (s, 3H, SO₂CH₃).
IR (KBr): 3309, 2225, 1643 und 1586 cm^–1.
sMS (EI): m/z 281,0 (M+H⁺), 172,1.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-(methylsulfonyl)phenyl]propenamid

Schmelzpunkt: 213-21406°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,98 (s, 1H, NH), 8,18 (m, 1H, ArH), 7,82 (m, 1H, ArH), 7,60 (m, 2H, ArH), 3,18 (s, 3H, SO₂CH₃).
IR (KBr): 3278, 2231, 1607 und 1555 cm^–1.
MS (EI): m/z 281,0 (M+H⁺), 172,1.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-[3-brom-4-(trifluormethoxy)phenyl]propenamid

Schmelzpunkt: 178-179°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,03 (s, 1H, NH), 8,12 (d, J+2,4Hz, 1H, ArH), 7,55 (dd, J=2,4, 9,0Hz, 1H, ArH), 7,45 (m, 1H, ArH), 5,53 (s br, 1H, OH), 2,20 (s, 3H, CH₃).
IR (KBr): 3304, 2350, 1620 und 1602 cm^–1.
MS (EI): m/z 365,0 (M+H⁺), 225,9.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-dibromphenyl)propenamid

Schmelzpunkt: 181-182°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,03 (s, 1H, NH), 8,14 (m, 1H, ArH), 7,84 (d, J=2,4Hz, 1H, ArH), 7,51 (dd, J=2,4, 9,0Hz, 1H, ArH), 5,65 (s br, 1H, OH), 2,20 (s, 3H, CH₃).
IR (KBr): 3360, 2205, 1591 und 1530 cm^–1.
MS (EI): m/z 361,0 (M+H⁺), 249,9.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,4-Dichlorphenyl)propenamid

Schmelzpunkt: 143-144°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,23 (s, 1H, NH), 8,29 (m, 1H, ArH), 7,6 (d, J=2,4Hz, 1H, ArH), 7,35 (dd, J=2,4, 9,0Hz, 1H, ArH), 5,17 (s br, 1H, OH), 2,18 (s, 3H, CH₃).
IR (KBr): 3371, 2210, 1601 und 1540 cm^–1.
MS (EI): m/z 271,0 (M+H⁺), 162,0.

α-Cyano-β-hydroxy-β-methyl-N-(2,5-dichlorphenyl)propenamid

Schmelzpunkt: 143-144°C.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,70 (s, 1H, NH), 8,51 (d, J=3,0Hz, 1H, ArH), 7,45 (d, J=8,7Hz, 1H, ArH), 7,05 (dd, J=3,0, 8,7Hz, 1H, ArH), 4,97 (s br, 1H, OH), 2,14 (s, 3H, CH₃).
IR (KBr): 3402, 2205, 1627 und 1606 cm^–1.
MS (EI): m/z 271 (M+H⁺), 162,0.

Tabelle 4. Wechselwirkungs-Punktbewertungen, geschätzte K_i-Werte und gemessene IC₅₀-Daten für LFM-Analoga mit BTK
Die zweite Generation der LFM-Analoga wurde bezüglich der Wechselwirkung mit dem BTK-Bindungstaschenmodell beurteilt und auch bezüglich der Inhibitoraktivität gegenüber BTK beurteilt, wie es im Beispiel oben beschrieben ist. Die Daten sind in Tabelle 4 angegeben und beweisen, daß diese neuen Verbindungen starke Inhibitoren für BTK sind.
Beispiel 7: Neue BTK-Inhibitor-Konzepte
21 zeigt die Bindungsmerkmale, die 5,7-Dihydroxy-8-propanoyl-4-propyl-2H-1-benzopyran-2-on (nur zum Vergleich) und LFM-A13 gemeinsam sind, und zwar auf der Basis des Dockings der Verbindungen in die ATP-Bindungsstelle von BTK. Beide Inhibitoren enthalten Wasserstoff-bindende Gruppen (OH, CN), die so positioniert sind, daß sie mit Arg 525 und Asp 539 wechselwirken. Verbindungskonzepte, die die Bindungstasche besser füllen und günstig geeigneten Resten in der Tasche wechselwirken, werden entwickelt.
Von diesen Verbindungen wird infolge ihres erhöhten Volumens und der Gruppen, die dazu bestimmt sind, mit dem Bindungstaschenrest in Wechselwirkung zu treten, erwartet, daß sie eine starke BTK-Inhibitoraktivität haben.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung der Formel I:
in der: R₁ für (C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₆)-Cycloalkyl, Phenyl oder NR_aR_b steht; R₂ für Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkanoyloxy, Amino-(C₂-C₅)-alkoxy, Hydroxy-(C₂-C₅)-alkoxy, Amino-(C₂-C₅)-alkanoyloxy oder Hydroxy-(C₂-C₅)-alkanoyloxy steht; R₃ für Cyano oder (C₁-C₃)-Alkanoyl steht; R₄ für Hydrogen, (C₁-C₃)-Alkyl, Hydroxy-(C₂-C₅)-alkyl oder Amino-(C₂-C₅)-alkyl steht; R₅ für durch -S(O)₂R_c oder Halo und mindestens einen anderen Substituenten substituiertes Phenyl steht; R_a und R_b jeweils unabhängig voneinander für Hydrogen oder (C₁-C₃)-Alkyl stehen; oder R_a und R_b zusammen mit dem Stickstoff, mit welchem sie verbunden sind, für Pyrrolidino, Piperidino, Morpholino oder Thiomorpholino stehen; wobei etwaiges Phenyl als R₁ und R₅ wahlweise substituiert ist durch einen oder mehreren Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter Halo, Nitro, Cyano, Hydroxy, Trifluoromethyl, Trifluoromethoxy, (C₁-C₃)-Alkoxy, (C₁-C₃)-Alkyl, (C₁-C₃)-Alkanoyl, -S(O)₂R_c und NR_aR_b; wobei R_c für (C₁-C₃)-Alkyl oder Aryl steht; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon; für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung, worin Brutons Tyrosin-Kinase-Aktivität eine Rolle spielt, wobei der Zustand oder die Erkrankung ausgewählt ist unter Störungen der B-Zell-Lymphozytenproliferation/Autoimmunerkrankungen, Mastzellenstörungen, Zuständen verbunden mit einer unzweckmässigen Blutplättchenaggregation und Abstossung von Xeno-Transplantaten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zustand oder die Erkrankung, worin Brutons Tyrosin-Kinase-Aktivität eine Rolle spielt, eine Allergie ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zustand oder die Erkrankung, worin Brutons Tyrosin-Kinase-Aktivität eine Rolle spielt, anaphylaktischer Schock ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zustand oder die Erkrankung, worin Brutons Tyrosin-Kinase-Aktivität eine Rolle spielt, eine unzweckmässige Blutplättchenaggregation ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R₁ für C_1-3-Alkyl, R₂ für Hydroxy und R₃ für Cyano steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R₁ für Methyl steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung mindestens eine der folgenden

sowie ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon umfasst.