ES2222705T3

ES2222705T3 - Inhibidores btk y metodos para su identificacion y uso.

Info

Publication number: ES2222705T3
Application number: ES99918673T
Authority: ES
Inventors: Fatih M. Uckun; Yaguo Zheng; Sutapa Ghosh
Original assignee: Parker Hughes Institute
Current assignee: Parker Hughes Institute
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-19
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2019-04-19
Also published as: DE69918089D1; MXPA00010150A; EP1071658A2; NO20005224D0; CA2328962A1; ATE269295T1; WO1999054286A2; DE69918089T2; JP2002512216A; HUP0102661A2; IL139080A0; WO1999054286A3; KR20010042804A; NO20005224L; EP1071658B1; AU3653099A

Abstract

El uso de un compuesto de **fórmula** en donde: R1 es (C1-C3)alquilo, (C3-C6)cicloalquilo, fenilo, o NRaRb; R2 es hidroxilo, (C1-C6)alcoxilo, (C1- C6)alcanoiloxilo, amino(C2-C5)alcoxilo; hidroxi(C2-C5)alcoxilo, amino(C2- C5)alcanoiloxilo; o hidroxi(C2-C5)alcanoiloxilo; R3 es ciano o (C1-C3)alcanoilo; R4 es hidrógeno, (C1-C3)alquilo; hidroxi(C2- C5)alquilo; o amino (C2-C5)alquilo; R5 es fenilo sustituido por -S(O)2Rc, o por halo y al menos otro sustituyente; Ra y Rb son cada uno independientemente hidrógeno, o (C1-C3)alquilo; o Ra y Rb junto con el nitrógeno al que están unidos son pirrolidino, piperidino, morfolino, o tiomorfolino; en donde cualquier fenilo de R1 y R5 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados a partir de halo, nitro, ciano, hidroxilo, trifluorometilo, trifluorometoxilo, (C1- C3)alcoxilo, (C1-C3)alquilo, (C1-C3)alcanoilo, - S(O)2Rc, y NRaRb; en donde Rc es (C1-C3)alquilo, o arilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Inhibidores BTK y métodos para su identificación y uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de inhibidores de la familia de las tirosín quinasas, y particularmente, inhibidores de la Tirosín quinasa de Bruton (BTK).

Antecedentes de la invención

La apoptosis es un modo común de muerte de células eucariotas que se activa por una cascada inducible de sucesos bioquímicos conduciendo a la activación de endonucleasas que escinden el DNA nuclear en fragmentos de longitud de oligonucleosoma. Varios de los sucesos bioquímicos que contribuyen a la muerte celular apoptótica así como reguladores positivos y negativos de la apoptosis se han identificado recientemente (Whyllie, A., et al. (1980) Int Rev Cytol 68, 251-305; Steller, H., (1995) Science 267,1445-1449; Fraser, A., Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; y Korsmeyer, S.J. (1995) Trends Genet 11, 101-105). La apoptosis juega un papel esencial en el desarrollo y mantenimiento de un sistema inmune funcional asegurando la oportuna auto-destrucción de linfocitos auto-reactivos maduros e inmaduros así como cualquier célula neoplásica diana emergente mediante los linfocitos T citotóxicos.

Además los efectos beneficiosos asociados con la apoptosis, una apoptosis inapropiada contribuye a la patogénesis y una resistencia a fármacos de los linfomas y leucemias humanas (Cohen, J.J., et al. (1992) Annu Rev Immunol 10, 267-293; Linette, G.P. y Korsmeyer, S.J. (1994) Curr Opin Cell Biol. 6, 809-815; y Thompson, C.B. (1995) Science 367, 1456-1462). Así, los agentes que son útiles para modular la apoptosis son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades en que una apoptosis inapropiada está implicada. Como resultado, existe una cantidad considerable de investigaciones en marcha dirigidas a la identificación de reguladores moleculares de la apoptosis, y existe por lo tanto actualmente una necesidad de nuevos agentes (por ejemplo químicos o biológicos), y nuevos métodos terapéuticos, que son útiles para modular la apoptosis. Tales agentes y métodos pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer (por ejemplo leucemias y linfomas) o trastornos inmunes en mamíferos. También pueden ser útiles como herramientas farmacológicas para usarlas en estudios in vitro o in vivo para potenciar el entendimiento de las bases moleculares de la apoptosis (por ejemplo una señal reguladora pro-apoptótica versus la señal anti-apoptótica), así como la patogénesis de malignidades linfoides humanas.

WO-A-9117748 revela el uso de derivados de isoxazol-4-carboxamida e hidroxialquilideno-cianoacetamida para el tratamiento de enfermedades de cáncer y enfermedades reumáticas. DE-A-2555685 revela derivados de cianoacidanilida y la preparación de los mismos. PE-A-537742 revela derivados de estireno con una actividad inhibidora en la proteínquinasa específica de tirosina y la actividad inhibidora en la proliferación de células cancerígenas. Ghosh et al., Clinical Cancer Research, Noviembre 1998, vol. 4, 2657-68, revela \alpha-ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[4-(trifluorometoxi)-fenil]- propenamida para la inhibición de la tirosín quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, con actividad citotóxica potente, frente células cancerígenas de pecho.

BTK es un regulador con doble función de la apoptosis que promueve la apoptosis inducida por radiación pero inhibe la apoptosis activada por Fas en linfocitos B. (Uckun, F.M. Referencia: Burton's Tyrosine Kinase (BTK) as a Dual-Function Regulator of Apoptosis; ver también Uckun, F.M. et al., BTK a Mediator of Radiation-induced Apoptosis in DT-40 Lymphoma B-Cells, Science 273:1096-1100 (1996). Las funciones BTK de un modo pro-apoptótico cuando los linfocitos B están expuestos a intermediarios de oxígeno reactivos, al menos en parte, mediante regulación a la baja de la actividad anti-apoptótica del factor de transcripción STAT3. En contraposición, BTK asociado con el receptor de muerte Fas, deteriora la interacción con FADD, que es esencial para el reclutamiento y la activación de FLICE por Fas durante la señal apoptótica, previniendo así el ensamblaje de un complejo de señalización que induce la muerte pro-apoptótica (DISC) tras la ligación de Fas.

Resumen de la invención

La invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I:

1

en donde:

R_{1} es (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{3}-C_{6})cicloalquilo, fenilo, o NR_{a}R_{b};

R_{2} es hidroxilo, (C_{1}-C_{6})alcoxilo, (C_{1}-C_{6}) alcanoiloxilo, amino(C_{2}-C_{5})alcoxilo; hidroxi(C_{2}-C_{5})alcoxilo, amino (C_{2}-C_{5}) alcanoiloxilo; o hidroxi(C_{2}-C_{5})alcanoiloxilo;

R_{3} es ciano o (C_{1}-C_{3})alcanoilo;

R_{4} es hidrógeno, (C_{1}-C_{3})alquilo; hidroxi(C_{2}-C_{5})alquilo; o amino(C_{2}-C_{5})alquilo;

R_{5} es fenilo sustituido por -S(O)_{2}R_{c} o por halo y al menos otro sustituyente más;

R_{a} y R_{b} son cada uno independientemente hidrógeno, o (C_{1}-C_{3})alquilo; o R_{a} y R_{b} junto con el nitrógeno al que están unidos son pirrolidino, piperidino, morfolino, o tiomorfolino;

en donde cualquier arilo, o heteroarilo de R_{1} y R_{5} está opcionalmente sustituido con uno o más (pej. 1, 2, o 3) sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxilo, trifluorometilo, trifluorometoxilo, (C_{1}-C_{3})alcoxilo, (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{1}-C_{3})alcanoilo, -S(O)_{2}R_{c} o NR_{a}R_{b}; en donde R_{c} es (C_{1}-C_{3})alquilo, o arilo o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos tal como se describe en la reivindicación 1.

Los compuestos de la invención están diseñados para adaptarse a un modelo de bolsillo de unión compuesto del dominio BTK, con un volumen molecular menor al volumen del bolsillo de unión (pej, menos de 600\ring{A}^{3}) y preferiblemente un volumen que se aproxima a 2/3 del volumen del bolsillo, pej., aproximadamente 400\ring{A}^{3}. Más preferiblemente, los inhibidores de la invención están diseñados para rellenar el espacio del bolsillo de unión e interactuar con los residuos del bolsillo para potenciar la unión.

La invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad patológica o una enfermedad en un mamífero, como un humano, que está asociado con la actividad BTK. Estas enfermedades o trastornos se seleccionan de trastornos de linfocitos B linfoproliferativos o enfermedades autoinmunes, trastornos de mastocitos, enfermedades que se refieren a una agregación inadecuada de plaquetas, y rechazo de xenotransplantes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: BTK es un inhibidor de la apoptosis mediada por Fas en linfomas de linfocitos B DT-40. FACS correlaciona los dos parámetros mostrados células DT-40 de tipo salvaje (WT), BTK deficiente (BTK-), LYN deficiente (LYN-) así como células DT-40 BTK deficiente reconstituido con el gen btk humano de tipo salvaje (BTK; rBTK[WT]) teñido con MC540 y PI 24 horas después del tratamiento con el IgG MsIgG control de ratón (1 \mug/mL) o anti-Fas (1 \mug/mL). Los porcentajes indican la fracción de células en un estadío temprano de la apoptosis, tal como se mide por fluorescencia simple MC540, y la fracción de células en una etapa temprana de la apoptosis, tal como se mide por fluorescencia dual MC540/PI (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100).

Figuras 2A-2C: Los niveles de expresión de la proteína Fas en las células DT-40 salvajes BTK-deficientes. La Figura 2A muestra los niveles de expresión de BTK y ACTINA en células DT-40 de tipo salvaje, BTK-deficiente con el gen btk reconstituido humano medidos por análisis Western blot utilizando anticuerpos monoclonales apropiados y el sistema de detección quimioluminiscente ECL (Amersham Life Sciences, usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante) (Dibirdik, I., et al. (1998) J. Biol. Chem, 273, 40354039; Uckun, F.M., et al. (1997) Blood, 89, 3769-3777). La Figura 2B muestra las membranas con anticuerpos anti-BTK y anti-ACTINA que fueron eliminados y reutilizados con el anticuerpo monoclonal anti-Fas para comparar los niveles de expresión de la proteína Fas en los clones individuales. La Figura 2C muestra los niveles de expresión de Fas de células DT-40 de tipo salvaje BTK-deficientes examinadas mediante microscopía confocal. Verde: marcaje anti-Fas; Azul: DNA teñido con Toto-3 en el núcleo; Barra de escala = 10 mm.

Figuras 3A-3D: BTK inhibe la apoptosis mediada por Fas. La Figura 3A es una fotografía que muestra las células DT-40 de tipo salvaje (WT) y BTK-deficientes (BTK-) tratadas durante 24 horas con 1 \mug/ml de anti-Fas, co-teñido con un anticuerpo policlonal de conejo anti-tubulina (fluorescencia verde) y la tinción específica de DNA toto-3 (fluorescencia azul), y examinado mediante microscopía láser de barrido confocal, tal como se describe en los Ejemplos. A diferencia de las células de tipo salvaje, la mayoría de células BTK- muestran cambios apoptóticos incluyendo fragmentación nuclear (a,b,d) y contracción (c). Barra = 10 mm. La Figura 3B es un gel de DNA que muestra las células DT-40 de tipo salvaje y BTK- expuestas a un anticuerpo anti-Fas tal como se detalla en los Ejemplos, se cultivaron y el DNA de los lisados con Triton-X-100; se analizaron por fragmentación, tal como se describe (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). Las Figuras 3C y 3D muestran células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con formas del gen humano btk de tipo salvaje (rWT), mutante del dominio quinasa (rK-), mutante del dominio SH2 (rmSH2), o mutante del dominio PH (rmPH) se examinaron para la sensibilidad de apoptosis inducida por anticuerpo anti-Fas tal como se describe en los Ejemplos. Los controles se trataron con PBS en medio de cultivo durante 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} antes de cultivarlos.

Figuras 4A-4C: Las propiedades anti-apoptóticas de BTK confirmadas por la reconstitución de la proteína BTK de células DT40 BTK-. La proteína de unión a maltosa (MBP) o MBP-BTK se electroporaron en células DT40 BTK- antes del tratamiento con anticuerpo anti-Fas, tal como se describe en los Ejemplos. La Figura 4A es una fotografía que muestra células DT40 BTK-deficientes MBP-BTK-electroporadas y células DT40 BTK-deficientes no electroporadas marcadas con un anticuerpo dirigido contra MBP. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con FITC. Las células analizadas usando imágenes digitales de un Microscopio Láser confocal de barrido BioRad MRC-1024 se procesaron usando el programa Adobe Photoshop y se imprimieron usando una impresora Fuji Pictography. No hubo una tinción significativa sobre el fondo en las células control no electroporadas (Figura 4A.1). Las flechas indican material reactivo al anticuerpo MBP en el citoplasma de las células electroporadas con la proteína de fusión MBP-BTK (Figura 4A2). Se observaron dos poblaciones en las células MBP-BTK electroporadas. Algunas células tenían un marcaje muy brillante en la periferia de la célula, mientras otras células tenían grandes punteados de tinción dentro del citoplasma. Verde=MBP, Barra=10 mm. La Figura 4B muestra un Western blot. Los lisados así como los sobrenadantes de las células DT-40 BTK-deficiente electroporadas tanto con MBP o MBP-BTK se sometieron a un análisis Western blot usando anticuerpos anti-BTK y anti-MBP tal como se describe en los procedimientos Experimentales. Las proteínas de fusión MBP-BTK de 115 Kda reactivas con ambos anticuerpos se detectaron sólo en lisados (pero no en sobrenadantes) a partir de células MBP-BTK electroporadas. La Figura 4C es un gel de células que se cultivaron 24 horas tras la exposición a un anticuerpo anti-Fas y DNA lisados con Triton-X-100 se analizaron para ver la fragmentación, tal como se describe por Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100; y Uckun, F.M., et al. (1995) Science 267, 886-91). El tratamiento anti-Fas indujo la apoptosis en células BTK deficientes pero no en células de tipo salvaje o células BTK deficientes en las que MBP-BTK fue electroporado. La Electroporación de MBP (control negativo) no tiene efecto sobre la apoptosis.

Figuras 5A-5D: BTK se asocia con FAS e interfiere con las interacciones FAS-FADD. Los inmunocomplejos Fas, FLICE, FADD, y TRADD inmunoprecipitaron a partir de los lisados de Nonidet P-40 de linfomas de linfocitos B DT-40 sin tratar de tipo salvaje, se recogieron, lavaron, e hirvieron en tampón muestra 2x SDS, se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 12,5%, se transfirieron a una membrana Immobilon-PVDF, y se examinaron para la presencia de proteína BTK mediante inmunoblotting, tal como se describe en los Ejemplos y se muestra en la Figura 5A. Los inmunocomplejos BTK y FADD (así como el control positivo de los inmunocomplejos FAS) inmunoprecipitaron a partir de linfomas de linfocitos B DT-40 BTK-deficientes sin tratar versus Fas-activados, las cuales se reconstituyeron con el gen btk humano salvaje, se recogieron, lavaron, e hirvieron en tampón de muestra 2x SDS, se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 12,5%, se transfirieron a una membrana Immobilon-PVDF, y se realizó un inmunoblot con un anticuerpo monoclonal anti-Fas, tal como se ha descrito antes y se muestra en la Figura 5B. Los inmunocomplejos FAS, FLICE, FADD, TRADD, y BTK de los lisados de células de leucemia precursoras de linfocitos B humanos NALM-6-UM1 BTK-positivos, se sometieron a análisis Western blot anti-Fas tal como se muestra en la Figura 5C. FADD se inmunoprecipitó a partir de lisados de Nonidet-P-40 de células DT-40 BTK-deficientes sin tratar versus Fas-activadas (anti-Fas 1 \mug/ml x 1 hora), tal como se describe en los Ejemplos. Los inmunocomplejos se recogieron, lavaron, e hirvieron en tampón de muestra 2x SDS, se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 12,5%, se transfirieron a una membrana Immobilon-PVDF, y se realizó un inmunoblot con un anticuerpo monoclonal anti-Fas (Figura 5D). Similarmente, los inmunocomplejos FAS de las mismas células se examinaron para la presencia de FADD mediante inmunoblotting.

Figuras 6A-6D: Respuestas apoptóticas de Células de leucemia de línea B humana para la Ligación Fas en Relación a la Expresión BTK y Función. El análisis Western blot de anticuerpo dual Anti-BTK y anti-Actina de los lisados de células enteras de células BTK-positivas NALM-6-UM1 (N6-U1) y células BTK-deficientes RAMOS-1 (Figura 5A). El análisis Western blot Anti-Fas de los mismos lisados celulares. Los linfocitos [B] se recogieron 24 horas tras la exposición al anticuerpo anti-Fas a concentraciones de 0,1 \mug/ml o 1,0 \mug/ml y DNA de los lisados de Triton-X-100 se analizaron por fragmentación, tal como se describe por Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100; y Uckun, F.M., et al. (1995) Science 267, 886-91. El tratamiento Anti-Fas indujo la apoptosis en células BTK-deficientes RAMOS-1 pero no en células BTK-positivas N6-U1. Análisis Western blot Anti BTK y anti-Fas [C.1] y [C.2] de lisados de células enteras a partir de células N6-U1 tratadas con el inhibidor LMA-13 de BTK (10 \muM x 4 horas). Análisis Western blot Anti-Fas y Anti-BTK [C.3] de inmunocomplejos BTK de anticuerpo anti-BTK inmunoprecipitado a partir de células N6-U1 sin tratar (= - Inhibidor) y tratadas con LMA-13 (10 \muM x 4 horas) (= + Inhibidor). [D]. Las células N6-U1 se recogieron 24 horas tras la exposición al anticuerpo anti-Fas a concentraciones de 0,1 \mug/ml o 1,0 \mug/ml y DNA de los lisados con Triton-X-100 se analizó para fragmentación, tal como se describe por Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100; y Uckun, F.M., et al. (1995) Science 267, 886-91. El tratamiento Anti-Fas indujo la apoptosis en células N6-U1 LMA-13-pretratadas (10 \muM x 4 horas) (= Inhibidor +). En contraposición, no se observó apoptosis en células N6-U1 que no se pretrataron con este inhibidor de BTK (= Inhibidor -). Se utilizó un sistema de detección ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois, no. cat RPN2106) para los análisis de Western blot en [A.1], (A.2], [C.1], [C.2], y [C.3].

Figuras 7A-7B: La quinasa BTK inactiva no se asocia con Fas. Los análisis Western blot de AntiBTK (A.1) y anti-Fas (A.2) de lisados de células enteras a partir de células DT-40 BTK-deficientes (Figura 7A) reconstituidas con BTK humana de tipo salvaje (BTK-, rBTK[WT]) (Línea 1) o BTK humano inactivo mutante del dominio quinasa (BTK-, rBTK[K-] (Línea 2). Los niveles de expresión de BTK y Fas se midieron mediante inmunoblotting usando anticuerpos apropiados y el sistema de detección de quimioluminiscencia ECL. La Figura 7B muestra los análisis Western blot de anti-BTK (B.1) y anti-Fas (B.2) de los inmunocomplejos Fas a partir de células BTK-, rBTK[WT] con (Línea 1) o sin (Línea 2) pretratamiento con anticuerpo anti-Fas y a partir de células BTK-, rBTK[K-] con (Línea 3) o sin (Línea 4) pretratamiento de anticuerpo anti-Fas. Los inmunocomplejos inmunoprecipitados a partir de lisados de células enteras Nonidet P-40 se recogieron, lavaron, e hirvieron en tampón de muestras 2x SDS, se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 12,5%, se transfirieron a una membrana Immobilon-PVDF, y se examinaron para la presencia de proteínas BTK y Fas mediante immunoblotting, tal como se describe en los Métodos.

Figuras 8A-8F: Unión de proteínas de fusión BTK a proteína Fas en células linfoides de línea-B humana y de pollos. La Figura 8A muestra diagramas esquemáticos de proteínas de fusión MBP y GST de longitud total y truncadas correspondientes a varios dominios de BTK. La secuencia de aminoácidos inclusivos (AA) está indicada para cada mutante truncado. BTK 1-659, BTK 408-659, BTK 2-137, así como BTK 519-567 que contienen el sitio de transfosforilación Y551 dentro del dominio catalítico (usado como control) se fusionaron a MBP. BTK 219-377, BTK 281-377 y BTK 219-268 se fusionaron a GST. La Figura 8B muestra proteínas de fusión MBP-BTK y GST-BTK (7,5 \mug/línea) analizado por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 12% y visualizados por tinción de los geles con Coomassie R-250 Blue. La Figura 8C es un análisis Western blot de BTK purificado a partir de proteínas correspondientes a la quinasa-(BTK 408-659), PH-(BTK 2-137) y dominios SH_{2}-SH_{3} (BTK 219-377) de BTK usando anticuerpos de dominio específico, tal como se describe en los Procedimientos Experimentales. Las Figuras 8D-8F demuestran roles funcionales para los dominios quinasa y PH de BTK en las interacciones BTK-Fas. [Figura 8D] linfocitos B de linfoma de pollo DT-40 BTK-deficientes, [Figura 8E] células de leucemia pre-B NALM-6 humana; [Figura 8F]: células linfoblastoides transformadas EBV humanas KL2. Las proteínas de fusión MBP-BTK y GST-BTK se utilizaron en ensayos de unión de derribo para examinar su capacidad de interactuar con Fas en células DT-40 BTK deficientes, tal como se describe en los Ejemplos. Los adsorbatos de la proteína de fusión y muestras control C1-C5 (C1(=CON): lisado celular + cuentas de amilosa (sin añadir proteína de fusión); C2: lisado celular + cuentas de glutatión-agarosa (sin añadir proteína de fusión); C3: MBP-BTK 1-659 + cuentas de amilosa (sin lisado celular); C4: GST-BTK 219-268 + cuentas de glutatión-agarosa (sin añadir lisado celular); C5: MBP-BTK 519-567 + cuentas de amilosa + lisado celular) se resolvieron mediante SDS-PAGE, realizando un inmunoblot con el anticuerpo monoclonal anti-Fas, y desarrollado con ECL.

Figuras 9A-9B: Función anti-apoptótica de BTK. Linfocitos B de linfoma DT-40 de linfoma de tipo salvaje y BTK-deficientes (BTK-) (Figura 9A) así como células DT-40 BTK- reconstituidas con BTK humana salvaje o mutante (Figura 98) se trataron con C2-CER, vincristina (VCR), o anticuerpo anti-Fas, tal como se describe en los Ejemplos. Células (BTK-) DT-40 BTK-deficientes que expresan BTK salvaje, BTK(Arg^{525}®Gln), BTK(Arg^{28}®Cys), y BTK(Arg^{307}®Ala) se designaron como BTK-, rBTK(WT), BTK-, rBTK(K-), BTK-, rBTK(mPH) y BTK-, rBTK(mSH2), respectivamente. El vehículo (0,1% DMSO en PBS) tratado así como las células tratadas con fármaco se mantuvieron en medio de cultivo durante 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} antes de recogerlas. El DNA de los lisados con Triton-X-100 se analizaron para fragmentación tal como se ha descrito anteriormente. Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22,1096-1100.

Figuras 10A-10B: Modelo de homología del dominio BTK Quinasa. La figura 10A es una representación de cintas del modelo de homología del dominio quinasa BTK. La molécula LFM-A13 se muestra como un modelo de llenado de espacio en el sitio catalítico de BTK. Preparado usando los programas Molscript y Raster3D (Bacon, D.J., y Anderson, W. F. (1988) J Molec. Graphics 6, 219-20; Kraulis, P. (1991) J. Appl. Cryst 24, 94650; y Merritt, E. A., y Murphy, M. E. P. (1994) Acta Cryst. D50, 869-73). La Figura 10B es una representación de relleno del espacio de la columna de los residuos del sitio catalítico del dominio quinasa BTK. La cadena C-alfa de BTK está representada como una cinta azul. Se muestran en amarillo, verde, rosa y azul los residuos de las cuatro esquinas del bolsillo de unión rectangular conformado. Un modelo de bastones y bolas del inhibidor BTK LFM-A13 se muestra en multicolor y representa la orientación favorable de esta molécula en el sitio activo de la quinasa de BTK. Preparado usando el programa InsightII ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA).

Figura 11: La posición de anclaje de la molécula LFM-A 13 (multi-color) en el sitio catalítico (cinta azul) del dominio quinasa de BTK. Las líneas tachadas representan puentes de hidrógeno entre LFM-A 13 y los residuos del dominio quinasa de BTK.

Figura 12: Posiciones de anclaje superpuestas de LFM (púrpura), LFM-A 12 (rojo) y LFM-A13 (multi-color) en el sitio catalítico (cinta azul) del dominio quinasa de BTK. Las posiciones de anclaje LFM y LFM-A12 se muestran sólo para propósitos comparativos.

Figura 13: Dibujo ORTEP de la estructura cristalina del inhibidor de BTK, LFM- A13.

Figuras 14A-14C: Efectos de LFM-A13 sobre la Actividad Tirosinquinasa de BTK. Una preparación altamente purificada de BTK (>90%) producida en un sistema de expresión del vector baculovirus se trató durante 1 hora a temperatura ambiente con LFM-A 13 en las concentraciones indicadas. La actividad enzimática de BTK mostrada en la Figura 14A se determinó midiendo la autofosforilación en un ensayo quinasa de 10 minutos, tal como se describe en los ejemplos. BTK se inmunoprecipitó a partir de células B18.2 (es decir, células DT-40 BTK- reconstituidas con BTK salvaje humana), tratado con LFM-A13 o vehículo (0,1% DMSO en PBS) durante 1 hora, y luego se probó para actividad PTK, medida mediante autofosforilación así como fosforilación de GST-lga, que utilizó un sustrato quinasa exógeno. Los datos de quinasa se muestran en la Figura 14B. Linfocitos B de linfoma B18.2 se trataron con LFM-A 13, luego se lisaron, y se realizaron ensayos quinasa de inmunocomplejos BTK y Western blots tal como se describen en los ejemplos. Los datos se muestran en la Figura 14C. PIU: Unidades Phosphoimager; DSU, unidades densitométricas de barrido; CON, control.

Figura 15: Efectos de LFM-A13 sobre la Actividad Tirosina Quinasa de JAK1, JAK3, HCK, y IRK. Los inmunoprecipitados JAK1 y JAK3 de células de ovario de insecto Sf21 transfectadas con los vectores de expresión apropiados baculovirus, el inmunoprecipitado HCK de células COS-7 transfectadas con el plásmido pSV7c-HCK, e inmunoprecipitados IRK de células de hepatoma HepG2 se trataron con LFMA 13, después se sometieron a ensayos quinasa in vitro tal como se describe en los Procedimientos Experimentales.

Figura 16: Base Estructural para la Selectividad de LFM-A 13 para BTK. Mostrado en azul claro se ve un indicio del modelo de homología de BTK con residuos seleccionados en las posiciones A, B, y C, junto con la posición de anclaje del análogo de metabolito leflunomida LFM-A13 (multicolor). Mostrado en rojo está la posición de anclaje de LFM-A13 con un modelo de EGFR y la diferencia de residuo entre EGFR y BTK en la posición B. Mostrado en amarillo está la posición de anclaje de LFM-A 13 con la estructura cristalina de HCK y la diferencia de residuos entre HCK y BTK en la posición C. Mostrado en rosa está la posición de anclaje de LFM-A13 con modelos de JAK3/JAKI y la diferencia de residuos entre JAK3/JAK1 y BTK en la posición A. Mostrado en azul oscuro está la posición de anclaje de LFM-A13 con la estructura cristalina de IRK y la diferencia de residuos entre IRK y BTK en las posiciones A y B.

Figura 17: Efectos de LFM-A 13 en la Sensibilidad a Ceramida de Células Humanas de Leucemia. FACS correlaciona tres parámetros (FSC, dispersión frontal de tamaño; fluorescencia de P1, yoduro de propidio, y fluorescencia de tinción MC540) muestras de ALL-1 Ph/t(9;22); células ALL humanas teñidas con MC540 y P1 24 horas tras el tratamiento con un vehículo (0,1% DMSO en PBS), C2-Ceramida (C2-CER) (10 \muM), LFM-A13 (200 \muM) o LFM-A13 + C2-CER. Los porcentajes indican la fracción de células en un estadio inicial de apoptosis, medido mediante fluorescencia MC540 simple, y la fracción de células en un estado avanzado de apoptosis, medido mediante fluorescencia dual MC540/PI.

Figuras 18A-18C: Efectos Quimiosensibilizantes de LFM-A13. Células DT40 BTK-deficientes reconstituidas con el gen humano BTK salvaje (es decir, clon B18.2) (Figura 18A), células ALL pre-B humanas NALM-6 (Figura 18B), y células ALL-1 humanas Ph^{+} ALL (Figura 18C) se trataron con LFM-A13 (100 \muM), vincristina (VCR) (10 ng/ml), C2-Ceramida (C2-CER) (10 \muM), LFM-A13 (100 \muM) + VCR (10 ng/ml), LFM-A 13 (100 \muM) + C2-CER (10 \muM) durante 24 horas a 37ºC. DNA de los lisados con Triton-X100 se analizaron para fragmentación, tal como se describe por Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22,1096-1100.

Figura 19: Ilustra la síntesis de LFM-13 y otros compuestos relacionados. LFM, LFM-A1 a LFM-A 12, y LFM-A 14 están incluidos sólo para propósitos comparativos.

Figuras 20A-20C: Ilustran las interacciones de unión de LFM-13 con el bolsillo de unión BTK.

Figura 21: Características de unión de ambos 5,7-Dihidroxi-8-propanol-4-propil-2H-I-benzopiran-2-ona y LFM-A 13. Basado en estudios de anclaje estos compuestos se ajustan al sitio de unión ATP de BTK. Ambos compuestos contienen grupos de unión hidrógeno que pueden interactuar con Arg 525 y Asp 539. Las características de unión de 5,7-Dihidroxi-8-propanol-4-propil-2H-1-benzopiran-2-ona se muestran sólo para propósitos comparativos.

Descripción detallada de la invención

El receptor de superficie celular Fas/APO-1 (CD95), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), es uno de los mayores reguladores de la apoptosis en varios tipos celulares. Las anormalidades funcionales de Fas se han asociado a condiciones patológicas de la homeostasis del sistema inmune, incluyendo trastornos linfoproliferativos, inmunodeficiencias y autoinmunidad (Rieux-Laucat, et al. (1995) Science 268, 1347-1349; y Fischer, G.H. (1995) Cell 81, 935-946). La ligación de la molécula Fas de superficie celular rápidamente y drásticamente induce apoptosis en muchas pero no en todos los tipos celulares positivos en Fas (Nagata, S. (1997) Cell 88, 355365). DT-40 es una línea de linfocitos B de linfoma de pollos que se ha utilizado para elucidar el mecanismo molecular de la apoptosis inducida por radiación (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). A pesar de su abundante expresión de superficie de Fas, las células DT-40, similares a las células B humanas precursoras de leucemia, son resistentes a los efectos citotóxicos de la ligación Fas, indicando la existencia de potentes reguladores negativos de apoptosis mediada de Fas. La tirosina quinasa de Bruton (BTK), un miembro de la familia BTK/Tec de las proteínas tirosinquinasas (PTKs) es un PTK citoplásmico involucrado en las rutas de transducción de señales regulando el crecimiento y la diferenciación de células linfoides de la línea B (Rawlings, D. J., y Witte, O. N. (1994) Immunol Rev. 138, 105-119; Kurosaki, T. (1997) Curr Opin. Immunol 9, 309-318; y Uckun, F. M. (1998) Biochemical Pharmacology, et al., 56,693-691). BTK participa en rutas de transducción de señales iniciadas mediante la unión de una serie de ligandos extracelulares a sus receptores de superficie celular: tras la ligación de receptores de antígeno de células B (BCR), la activación de BTK mediante las acciones concertadas de los PTKs Lyn y Syk (Kurosaki, T. (1997) Curr Opin. Immunol. 9, 309-318) son necesarias para la inducción de la movilización mediada por calcio de la fosfolipasa C-2 (Kurosaki, T. (1997) Curr Opin. Immunol. 9, 309-318). Las mutaciones en el gen BTK humano son la causa de agammaglobulinemia X-cruzada (XLA), un trastorno inmunodeficiente masculino caracterizado por una falta de células B periféricas productoras de inmunoglobulina maduras (Tsukada, S., et al. (1993) Cell 72, 279-290; y Vetrie, D., et al. (1993) Nature 361, 226-233). En ratones, las mutaciones en el gen BTK se ha identificado como la causa de inmunodeficiencia X-cruzada en ratones (Xid) (Rawlings, D.1., et al. (1993) Science 261, 358-361).

BTK ha demostrado ser un inhibidor del complejo de señales que induce la muerte Fas/APO-1 (DISC) en células linfoides de línea B (Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). Además, en la actualidad se ha determinado que BTK previene la apoptosis inducida por ceramida y vincristina (presente estudio). El destino de las células leucémicas/linfoides puede residir en el equilibrio entre los efectos opuestos proapoptóticos de caspasas activadas por DISC y un mecanismo regulatorio corriente arriba anti-apoptótico que involucra BTK y/o sus sustratos (Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). Los inhibidores de BTK potencian probablemente la sensibilidad al fármaco de células de linaje B (pej., leucemia/linfoma). Así, los agentes farmacológicos con actividad BTK-modulatoria pueden utilizarse como agentes quimiosensibilizantes para tratar malignancias o enfermedades que expresan BTK causadas por la proliferación y producción de anticuerpos de células B que expresan BTK, y como agentes reconstituyentes de linfocitos B en inmunodeficiencias humorales con número decreciente o ausencia de linfocitos B. Además los agentes moduladores de BTK pueden ser útiles como agentes inmunosupresores para la prevención de rechazo hiperagudo de órganos en transplantes, que está dirigido por linfocitos B, enfermedades autoinmunes, y conversión de inmunidad a fármacos (pej., anticuerpos o biológicos) o productos sanguíneos (pej., factores de coagulación tales como el Factor VIII) en pacientes que desarrollan anticuerpos a tales agentes.

Identificación de inhibidores de BTK

El potente y selectivo inhibidor de BTK, LFM-13 y otros inhibidores de BTK se identificaron usando el modelo de homología tri-dimensional del dominio quinasa descrito en el Ejemplo 2. Usando este modelo y el tamaño e información de contacto proporcionado en los Ejemplos 1 y 3, se diseñaron y probaron inhibidores de BTK adicionales. Usando este modelo y método, pueden identificarse otros compuestos que interaccionan favorablemente con el bolsillo de unión, así como los compuestos que se unirán selectivamente a BTK sobre otras quinasas relacionadas. La unión fuerte o un buen ajuste en el modelo de unión al bolsillo se correlaciona con potente actividad BTK-inhibitoria.

La capacidad de un agente para inhibir los efectos anti-apoptóticos de BTK puede medirse usando ensayos que son conocidos en el campo, o usando los ensayos revelados en los ejemplos abajo mencionados. Así, usando la información de modelaje y los cribajes descritos en este punto, así como otra información conocida en el campo, uno puede identificar agentes que poseen propiedades inhibidoras de BTK.

Los inhibidores de BTK también incluyen aquellos inhibidores producidos por métodos de DNA recombinantes, tales como moléculas antisentido e inhibidores de transcripción. Los estudios iniciales en la transcripción de btk han demostrado que la expresión del gen btk está regulado por la acción combinada de Sp1- y los factores de transcripción de la familia PU.1 (S. Muller et al. Oncogene, 1996, 13, 1955-1964; y A. Himmelmann et al. Blood, 1996, 87, 1036-1044). Los elementos reguladores transcripcionales han sido identificados dentro del primer y décimo intrón del gen btk, y estudios recientes indicaron que la regulación de la expresión del gen btk involucra múltiples factores de transcripción (J. Rohrer, M.E. Conley, Blood, 1998, 91, 214-221). Nuevos agentes que afectan la actividad de estos factores de transcripción será también útil como moduladores de señales apoptóticas en programas de tratamiento. La viabilidad de regular la expresión del gen btk en células hematopoyéticas humanas ha sido ya demostrado por la habilidad del ácido retinoico para incrementar la expresión de btk en células mieloides, y mediante la capacidad de éster de forbol así como TGF-1 para disminuir la expresión de btk en células B (C.I.E. Smith et al., J. Immunol., 1994, 152, 557-565).

Así, uno o más de los métodos de DNA recombinante pueden utilizarse para inhibir la expresión de BTK e inducir los efectos terapéuticos discutidos en este punto. Tales métodos incluyen, por ejemplo, secuencias antisentido de inhibidores de la transcripción. Por ejemplo, construcciones BTK antisentido pueden dirigirse contra la expresión de BTK directamente. Alternativamente, la construcción antisentido puede dirigirse contra las secuencias regulatorias BTK, pej., secuencias antisentido hacia la familia Sp1 y PU.1 de factores de transcripción. Preferiblemente, las construcciones antisentido están dirigidas a células tumorales.

Compuestos

Compuestos of formula I son inhibidores específicos de BTK que se unen favorablemente al modelo de bolsillo BTK descrito en los ejemplos, y posee potente actividad inhibidora de BTK.

Los compuestos de fórmula I son:

2

donde:

R_{3} es ciano o (C_{1}-C_{3})alcanoilo;

R_{4} es hidrógeno, (C_{1}-C_{3})alquilo; hidroxi(C_{2}-C_{5})alquilo; o amino (C_{2}-C_{5})alquilo;

R_{5} es fenilo sustituido por -S(O)_{2}R_{c} o por halo y al menos otro sustituyente;

en donde cualquier arilo, o heteroarilo de R_{1} y R_{5} está opcionalmente sustituido con uno o más (pej. 1, 2, o 3) sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxilo, trifluorometilo, trifluorometoxilo, (C_{1}-C_{3})alcoxilo, (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{1}-C_{3})alcanoilo, -S(O)_{2}R_{c} o NR_{a}R_{b}; en donde R_{c} es (C_{1}-C_{3})alquilo, o arilo

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Compuestos particularmente útiles de formula I incluye:

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-dibromofenil)-propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-(metilsulfonil)fenil]-propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[3-(metilsulfonil)fenil]-propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3-bromo-4-(trifluorometoxi)-fenil)propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-dibromofenil)-propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-diclorofenil)-propenamida;

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-diclorofenil)-propenamida; o

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3,4diclorofenil)-propenamida; o

sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Definiciones

Las siguientes definiciones se usan aquí, a menos que se describa de otra manera: halo es flúor, cloro, bromo, o yodo. Alquilo, alcoxilo, etc. denotan ambos grupos lineales y ramificados; pero la referencia a un isómero individual tal como "propilo" abarca sólo al isómero de cadena lineal, un isómero de cadena ramificada tal como "isopropilo" deberá ser específicamente referido. Arilo denota un grupo fenilo o un grupo carbocíclico bicíclico o tricíclico con alrededor de nueve a doce átomos de anillo de en el que al menos un anillo es aromático.

Será apreciado por aquellos entendidos en el campo que los compuestos de Fórmula I con un centro quiral pueden existir y ser aislados en formas racémicas y ópticamente activas. Algunos compuestos pueden presentar polimorfismo. Deberá entenderse que la presente invención abarca el uso de formas racémicas, ópticamente activas, polimórficas, o estereoisoméricas, o mezclas de las mismas, de un compuesto de Fórmula I, que posee las propiedades útiles descritas aquí, siendo bien conocido en el campo cómo preparar formas ópticamente activas (por ejemplo, mediante resolución de la forma racémica mediante técnicas de recristalización, mediante síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, mediante síntesis quiral, o mediante separación cromatográfica usando fase quiral estacionaria) y cómo determinar la actividad inhibidora de BTK usando los ensayos estándar descritos aquí, o usando otros ensayos similares que son bien conocidos en el campo.

Los valores específicos y preferidos listados abajo por sustituyentes y puntuaciones, son sólo para ilustración; no se excluye otros valores definidos u otros valores dentro de las puntuaciones definidas para los radicales y sustituyentes.

Específicamente, (C_{1}-C_{3})alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, o isopropilo; (C_{3}-C_{6})cicloalquilo puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, o ciclohexilo (C_{1}-C_{3})alcoxilo puede ser metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo; (C_{1}-C_{6})alcoxilo puede ser metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, iso-butoxilo, sec-butoxilo, pentoxilo, 3-pentoxilo, o hexiloxilo;

Valores específicos y preferidos

Un valor específico para R_{1} es (C_{1}-C_{3})alquilo, o (C_{3}-C_{6})cicloalquilo.

Un valor específico para R_{2} es hidroxilo.

Un valor específico para R_{3} es ciano.

Un valor específico para R_{4} es hidrógeno.

Un valor específico para R_{5} es fenilo sustituido con halo, y sustituido con 1, 2, o 3 sustituyentes diferentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, trifluorometilo, trifluorometoxilo, (C_{1}-C_{3})alcoxilo, (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{1}-C_{3})alcanilo y NR_{a}R_{b}.

Un valor más específico para R_{1} es (C_{1}-C_{3})alquilo.

Un valor más específico para R_{5} es fenilo sustituido con halo, y sustituido con 1, 2, o 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halo, trifluorometilo, trifluorometoxilo, y (C_{1}-C_{3})alcoxilo.

Un valor más específico para R_{5} es fenilo sustituido con 2 ó 3 halo.

Un valor más específico para R_{5} es fenilo sustituido con dos bromo.

Un compuesto preferido de fórmula I es \alpha-ciano-p-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-dibromofenil)propenamida; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Uso terapéutico

Las linfocitos B y los precursores de células B que expresan BTK están implicados en la patología de varias enfermedades y condiciones incluyendo malignancias de linfocitos B (pej., leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma no-Hodgkin, linfomia EBV, y mieloma), otros cánceres, trastornos linfoproliferativos/ enfermedades autoinmunes de células B (pej., lupus, enfermedad de Crohn, y enfermedad crónica o injerto-versus-huésped), trastornos de mastocitos (pej., alergias, y choque anafiláctico), condiciones que se refieren a una agregación inadecuada de plaquetas, y rechazo de xenotransplantes (pej., trasplantes de corazón de cerdo a humano).

Adicionalmente, los inhibidores selectivos de BTK pueden utilizarse para identificar otras enfermedades en donde BTK juega un papel, y particularmente para identificar la expresión génica que está modulada por BTK. Esto puede realizarse usando técnicas que son conocidas en el campo, por ejemplo, usando técnicas de perfilado de genes similar a las descritas por A. Sehgal et al., Journal of Surgical Oncology, 1998, 67,234-241. Incubando células en presencia o ausencia de un inhibidor de BTK seguido por el perfilado de la expresión génica en las células es útil para identificar la expresión génica regulada por BTK. Los materiales útiles para el perfilado de la expresión génica usando membranas de cDNA Atlas pueden obtenerse a partir de CLONTECH Laboratories, Inc. 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303. Microarrays de cDNA pueden obtenerse de fuentes comerciales o crearse a gusto del
cliente.

Usando tales materiales de acuerdo con las instrucciones del fabricante, también se ha descubierto que BTK modula la expresión de genes específicos, por ejemplo, MAPKAP quinasa y oncogen c-myc. Esta actividad sugiere que BTK puede estar implicado en la patología de todas las formas de cáncer.

BTK es un miembro de la familia Tec de tirosinquinasas. La quinasa Tec se expresa, por ejemplo, en células T. Los inhibidores BTK de la invención son también útiles para inhibir la actividad de otros miembros de la familia de quinasa Tec.

Los inhibidores BTK (incluyendo compuestos de fórmula I tal como se ha descrito en este punto) puede utilizarse para tratar trastornos en donde la inhibición o prevención de una quinasa de la familia Tec, incluyendo actividad BTK está indicado. También se ha descubierto que los inhibidores BTK son útiles como agentes quimiosensibilizantes, y, así, útiles en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos, en particular, fármacos que inducen la apoptosis. Ejemplos de otros fármacos quimioterapéuticos que pueden utilizarse en combinación con inhibidores quimiosensibilizantes de BTK incluyen inhibidores de topoisomerasa I (camptotesina o topotecan), inhibidores de topoisomerasa II (pej., daunomicina y etoposido), agentes alquilantes (pej., ciclofosfamida, melfalan y BCNU), agentes dirigidos a tubulina (pej., taxol y vinblastina), y agentes biológicos (pej., anticuerpos como anticuerpo anti CD20, IDEC 8, inmunotoxinas, y citoquinas).

Conjugación en una porción diana

Los compuestos de fórmula I pueden ser dirigidos para una liberación específica en un tipo celular por conjugación del inhibidor BTK en una porción diana. Las porciones diana útiles para la conjugación a inhibidores de BTK incluyen anticuerpos, citoquinas, y ligandos de receptor que son específicos a la célula a ser tratada.

El término "conjugado" indica un compuesto formado como una composición entre dos o más moléculas. Más específicamente, en la presente invención, los derivados de quinazolina están unidos, por ejemplo, covalentemente unidos, a fracciones diana específicas de célula formando un compuesto conjugado para liberación eficiente y especifica del agente en una célula de interés.

La frase "porción diana" indica una molécula que sirve para liberar el compuesto de la invención en un lugar para la actividad deseada. Porciones diana incluyen, por ejemplo, moléculas que unen específicamente moléculas sobre una superficie celular específica. Tales porciones diana útiles en la invención incluyen anticuerpos anti antígeno de superficie celular. Citoquinas, incluyendo interleucinas y factores tales como factor estimulante de granulocitos/macrófagos (GMCSF) son también porciones diana específicas, conocidas por unirse a células específicas que expresan niveles altos de sus receptores.

Porciones diana particularmente útiles para apuntar los compuestos inhibidores de BTK de la invención a células para actividad terapéutica incluyen aquellos ligandos presentes en las células que expresan quinasa Tec. Por ejemplo, antígenos presentes en los linfocitos B y linfocitos de línea B cancerígenos, tal como CD19 puede ser una diana con anticuerpos anti-CD19 tales como B43. Pueden utilizarse los fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de cadena simple pueden utilizarse. Los ligandos naturales para los antígenos de superficie tales como CD19 también. Los linfocitos T que expresan la quinasa Tec pueden ser una diana, por ejemplo para el antígeno CD7 con anticuerpos anti-CD7 tales como TXU. Los mastocitos pueden ser dianas mediante el antígeno CD48 con anticuerpos anti-CD48. Éstos y otros anticuerpos de antígenos de superficie celular están disponibles comercialmente, por ejemplo, de
Pharmingen.

Las citoquinas son también porciones diana útiles. Las células T pueden ser dianas con IL2 e IL7; las células B pueden ser dianas con IL4; los mastocitos pueden ser dianas con C-KIT, MGF, GMCSF, e IL3. Células cancerígenas que expresan la quinasa Tec pueden ser dianas, por ejemplo, con EGF e IGF.

Compuestos como sales

En casos donde un agente ("compuesto") es suficientemente básico o acídico para formar un ácido estable no tóxico o sales básicas, la administración del compuesto como una sal puede ser apropiado. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son sales de adición ácida orgánicas formados con ácidos que forman un anión fisiológicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, \alpha-cetoglutarato, y \alpha-glicerofosfato. Sales inorgánicas adecuadas también pueden formarse, incluyendo sales de hidrocloruro, sulfato, nitrato, bicarbonato, y carbonato.

Sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse usando procedimientos estándar bien conocidos en el campo, por ejemplo reaccionando un compuesto suficientemente básico como una amina con un ácido adecuado proporcionando un anión fisiológicamente aceptable. También pueden realizarse sales de ácidos carboxílicos alcalino metálicos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metales alcalinotérreos (por ejemplo calcio).

Derivados de profármacos

Los compuestos de fórmula I pueden estar unidos a grupos funcionales para proporcionar un derivado de profármaco. El derivado de profármaco facilita el uso de un fármaco en el organismo, por ejemplo, facilitando la entrada en las células. El término "porción de profármaco" es un grupo de sustitución que facilita el uso de un compuesto de la invención, por ejemplo facilitando la entrada del fármaco en las células o la administración del compuesto. La porción de profármaco puede escindirse del compuesto, por ejemplo mediante enzimas de escisión in vivo. Ejemplos de porciones de profármaco incluyen grupos fosfato, enlazantes peptídicos, y azúcares, cuyas porciones pueden hidrolizarse in vivo.

Formulaciones farmacéuticas

Un compuesto puede formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un mamífero, como un paciente humano en varios tipos de formas adaptadas a las rutas de administración escogidas, es decir, oralmente o parenteralmente, mediante rutas intravenosas, intramusculares, tópicas, o subcutáneas.

Así, los compuestos pueden administrarse sistémicamente, pej., oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Estando incluido en cápsulas de gelatina dura o blanda, comprimidas en comprimidos, o incorporadas directamente en la comida del paciente. Para administración terapéutica oral, el compuesto puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones contendrán al menos el 0,1% del compuesto activo. El porcentaje de composiciones y preparaciones puede variar y puede convenientemente estar entre alrededor de 2 a alrededor del 60% del peso de una determinada dosis unitaria. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles se obtiene del nivel de dosis efectiva.

Los comprimidos, trociscos, pastillas, cápsulas, y similares pueden también contener lo siguiente: agregantes como la goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; un agente desintegrante como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante como estearato magnésico; y un agente endulzante como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo o un agente saborizante como menta, aceite de pirola, o sabor de cereza puede ser añadido. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros materiales pueden estar presentes como recubridores o de otra manera modificar la forma física de la forma de dosis unitaria. Por ejemplo, comprimidos, pastillas, o cápsula pueden estar recubiertos con gelatina, cera, laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente endulzante, metil y propilparaben como conservantes, un colorante y aromatizante tal como sabor de cereza o naranja. Cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosis unitaria será farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo podrá incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

El compuesto puede también administrarse intravenosamente o intraperitonealmente mediante infusión o inyección. Soluciones del compuesto o su sal pueden prepararse en agua, opcionalmente mezclada con un surfactante no tóxico. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas de dosis farmacéuticas adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones estériles acuosas o dispersiones o polvos estériles que comprenden el compuesto activo que está adaptado para la preparación improvisada de soluciones estériles inyectables o infundibles o dispersiones, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la última forma de dosis será estéril, fluida y estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. El transportador liquido o vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión líquida que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, propilenglicoles líquidos, y similares), aceites vegetales, gliceril ésteres no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones o mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Soluciones estériles inyectables pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados antes, cuando sea necesario, seguido por esterilización por filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y las técnicas de congelación seca, que proporcionan un polvo del compuesto activo además de cualquier ingrediente adicional presente deseado en las soluciones previamente filtradas estériles.

Para la administración tópica, los compuestos pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando son líquidos. No obstante, será generalmente deseable administrarlos en la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.

Vehículos sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, silicio, alúmina y similares. Vehículos líquidos útiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o mezclas de agua-alcohol/glicol, en que los presentes compuestos pueden disolverse o dispersarse a niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de surfactantes no tóxicos. Adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales pueden añadirse para optimizar las propiedades para un determinado uso. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse para almohadillas absorbentes, usadas para impregnar vendajes y otros apósitos, o rociadas sobre el área afectada utilizando rociadores de aerosol de tipo bomba.

Pueden también emplearse espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales de ácidos grasos y ésteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con vehículos líquidos para formar pastas diseminables, geles, ungüentos, jabones, y similares, para aplicar directamente en la piel del paciente.

Ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden utilizarse para liberar los compuestos de la invención en la piel son conocidos en el campo; por ejemplo, ver Jacquet et al. (Patente Estadounidense No. 4.608.392), Geria (Patente Estadounidense No. 4.992.478), Smith et al. (Patente Estadounidense No. 4.559.157) y Wortzman (Patente Estadounidense No. 4.820.508).

Dosis útiles de los compuestos de la invención puede determinarse mediante la comparación in vitro de su actividad, y la actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros animales, a humanos son conocidos en el campo; por ejemplo, ver Patente Estadounidense No. 4.938.949.

Generalmente, la concentración de los compuesto(s) de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de alrededor de 0,1-5% peso, preferiblemente de alrededor de 0,5-10% peso. La concentración en una composición sólida o semi-sólida tal como un gel o un polvo será de alrededor de 0,1-5% peso, preferiblemente alrededor de 0,5-2,5% peso.

La cantidad del compuesto, o una sal activa o derivado de las mismas, necesaria para el uso en el tratamiento variará no solo con la sal particular seleccionada sino también con la ruta de administración, la naturaleza de la enfermedad a ser tratada y la edad y condición del paciente y será ultimada a discreción del médico o clínico.

En general, no obstante, una dosis adecuada estará en el rango de alrededor de 0,5 a alrededor de 100 mg/kg, pej., de alrededor de 10 a alrededor de 75 mg/kg de peso corporal por día, tal como 3 a alrededor de 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en el rango de 6 a 90 mg/kg/día, más preferiblemente en el rango de 15 a 60 mg/kg/día.

El compuesto se administra convenientemente en forma de dosis unitaria; por ejemplo, conteniendo de 5 a 1000 mg, convenientemente de 10 a 750 mg, más convenientemente, de 50 a 500 mg de compuesto activo por forma de dosis unitaria.

Idealmente, el compuesto activo se administrará para alcanzar las concentraciones máximas en plasma del compuesto activo de alrededor de 0,5 a alrededor de 75 \muM, preferiblemente, alrededor de 1 a 50 \muM, más preferiblemente, desde alrededor de 2 a alrededor de 30 \muM. Éstas se pueden obtener, por ejemplo, mediante inyección intravenosa de una solución de 0,05 a 5% del ingrediente activo, opcionalmente en una solución salina, o se puede administrar oralmente como un bolus conteniendo alrededor de 1-100 mg del ingrediente activo. Los niveles sanguíneos deseados se pueden mantener mediante infusión continua para proporcionar alrededor de 0,01-5,0 mg/kg/hr o mediante infusiones intermitentes conteniendo alrededor de 0,4-15 mg/kg de ingrediente(s) activo(s).

La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una dosis simple o como dosis divididas administradas a unos intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La sub-dosis por si misma se puede además dividir, por ejemplo, en un número de administraciones discontinuas distribuidas holgadamente en el tiempo; tales como inhalaciones múltiples a partir de un insuflador o por aplicación de varias gotas en el ojo.

Tal como se revela aquí, se ha descubierto que los inhibidores BTK son útiles como quimiosensibilizantes, y así, son útiles para aumentar la sensibilidad de una célula cancerígena a otros agentes quimioterapéuticos para promover la apoptosis. Tal como, inhibidores BTK pueden administrarse convenientemente en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. Además, las últimas composiciones farmacéuticas que comprenden un agente que inhibe BTK, puede también comprender uno o más agentes quimioterapéuticos que promueven la apoptosis.

La invención ahora se ilustrará mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 BTK inhibe FAS/APO-I DISC

El siguiente ejemplo proporciona evidencias bioquímicas y genéticas que BTK es un inhibidor del complejo (DISC) de señalización de la inducción de la muerte Fas/APO-I en células linfoides de línea B. BTK asociado con Fas vía su quinasa y dominios PH y previene la interacción FAS-FADD, que es esencial para el reclutamiento y activación de las enzimas proteolíticas FLICE inductoras de la muerte por Fas durante la señal apoptótica_ Notablemente, el tratamiento de los linfocitos B leucémicos humanos con un potente inhibidor de BTK invalidó la asociación BTK-Fas y sensibilizó a las células para la apoptosis mediada por Fas.

Las líneas celulares, reactivos, y ensayos bioquímicos. El establecimiento de clones de los linfocitos B del linfoma DT-40 BTK-deficientes se han descrito previamente por Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100. Para romper el gen btk, las construcciones diana conteniendo el cassette de gen de resistencia a la neomicina (es decir, pcBTK-neo) o el cassette del gen de resistencia histidinol (es decir, pcBTK-hisD) se transfectaron secuencialmente en células DT-40. Los vectores diana, pcBTK-neo y pcBTK-hisD, se construyeron reemplazando el fragmento genómico de 0,7 kb Bgl II-Bam HI conteniendo exones que correspondían a los residuos de aminoácidos de BTK humano 91-124 con el cassette neo o hisD. pcBTK-neo se linearizó y se introdujo en células DT-40 de tipo salvaje por electroporación. El cribaje se hizo por análisis por Southern blot usando una sonda flanqueante 3' (fragmento 0,5 kb BglII-Bgl-II). El clon diana neo se transfectó de nuevo con pcBTK-hisD y se seleccionó con ambos G418 (2 mg/mL) e histidinol (1 mg/mL). El análisis por Southern blot del clón DT-40 BTK-deficiente confirmó la recombinación homóloga en ambos lugares btk y la hibridización con una sonda neo e his indicó que el clón diana había incorporado una copia simple de cada construcción. La pérdida de la expresión BTK en células DT-40 BTK-deficientes se confirmó por ambos ensayos quinasa de imunocomplejo y análisis por Western blot (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273,1096-1100). Las mutaciones en el cDNA btk humano introducido por PCR usando la Pfu polimerasa (Strategene, La Jolla, California, #600153) y confirmado por secuenciación. Los cDNAs btk naturales y de tipo salvaje se subclonaron en el vector de expresión pApuro y se electroporaron en células BTK-deficientes. La actividad PTK actividad de los complejos inmunes BTK, tal como se mide mediante autofosforilación in vitro, se invalidó mediante una mutación del dominio catalítico, se redujo por una mutación en el dominio PH pero no se afectó por la mutación en el dominio SH2. Cantidades iguales de proteína BTK se detectaron por análisis en Western blot en todos los clones DT-40 BTK-deficientes transfectados con genes btk humanos mutados o de tipo salvaje pero no con proteína BTK eran detectables en las células DT-40 BTK-deficientes sin transfectar (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). El establecimiento y caracterización de clones DT-40 LYN-deficientes se comunicaron previamente por Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100. Además de estos linfocitos B de linfoma de pollo, las siguientes líneas celulares linfoides de línea B humana: NALM-6-UM1, precursor de la línea celular de linfocitos B humanos BTK-positivos (leucemia linfoblástica aguda pre-B); RAMOS-1, línea de leucemia de linfocitos B de Burkitt humana BTK-deficiente; y se usaron líneas celulares linfoblastoides B normales EBV-transformadas positivas humanas.

Los anticuerpos dirigidos contra BTK, SYK, y LYN se han descrito previamente (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273,1096-1100; Dibirdik, 1., et al. (1998) J. Biol. Chem., 273,4035-4039; y Uckun, F.M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6389-6397. Los anticuerpos policlonales para BTK se generaron por inmunización de conejos con las proteínas de fusión glutatión S-transferasa (PST) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois) conteniendo los primeros 150 aminoácidos de BTK. Además, los siguientes anticuerpos anti-BTK se usaron en Western blots de proteínas de fusión purificadas: extremo carboxilo anti-BTK de cabra policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Ca, cat # SCI 107), extremo amino anti-BTK de cabra policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Ca. cat # SCI 108,), y suero de conejo policlonal dirigido contra los dominios Btk SH_{2}-SH_{3} (aa219-377). Los anticuerpos anti-MBP policlonales se generaron inmunizando conejos. El anti-Fas policlonal de conejo (sc-715 mezclado 1:1 con sc-714) que reacciona de forma cruzada con proteínas Fas de pollo y humanas, anti-FADD policlonal de cabra (sc-1171), anti-TRADD policlonal de cabra (sc-1163), anti-PUCE policlonal de cabra (sc-6135) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. y se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El anticuerpo monoclonal anti-Fas (F22120) se obtuvo de Transducción Laboratories, Inc. (Lexington, KY, USA). Las Inmunoprecipitaciones, ensayos de proteínquinasa inmuno-complejo, e inmunoblotting usando el sistema de detección (ECL) de quimioluminiscencia potenciado (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, Illinois) se llevaron a cabo tal como se describe previamente (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100; Dibirdik, l., et al. (1998) J., Biol. Chem., 273,4035-4039; Uckun, F.M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6389-6397; Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell Biol. 15, 5304-5311; Uckun, F.M., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21172-21184; Uckun, F.M., et al. (1995) Science 267, 886-91; y Uckun, FM., et al. (1997) Blood, 89, 3769-3777). E \alpha-ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-dibromofenilo)propenamida inhibidor de la BTK (LMA-13) se preparó tal como se describe en el Ejemplo 2.

La expresión y purificación de las proteínas de fusión MBP-BTK y GST-BTK. Los cDNAs que codifican BTK de longitud total y sus dominios quinasa o PH con sitios 5' y 3' BamH1 generados por PCR se clonaron en el vector de expresión de E. coli pMAL-C2 con el promotor Ptac IPTG-inducible para crear un marco de fusión entre estas secuencias codificantes y el extremo 3' del gen malE de E. coli, que codifica para la proteína de unión a la maltosa (MBP). Los cDNAs codificando los dominios SH2, SH3, o SH2+SH3 con sitios 5' y 3' BamHI generados por PCR se clonaron en el vector de expresión de E. coli pGEX-2t con el promotor Ptac IPTG-inducible para crear un marco de fusión entre estas secuencias codificantes y el extremo 3' del gen de la glutatión S-transferasa de E. coli (GST). Los plásmidos recombinantes generados se tranformaron en la cepa DH5a de E. coli. Los transformantes simples se expandieron en 5 ml de medio de Luria-Burtain (LB) (1% triptona, 1% NaCl, 0,5% extracto de levadura) conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) por cultivo durante toda la noche a 37ºC. La expresión de las proteínas de fusión se indujo con 10 mM IPTG. Las células se cultivaron por centrifugación a 4.500 g en una centrífuga Sorvall RCSB durante 10 minutos a 4ºC, se lisaron en tampón de lisozima-sacarosa (20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 10% sacarosa, 1 mM EDTA, 20 mM lisozima), y además se rompieron mediante ultrasonidos. Tras la eliminación de los pellets celulares por centrifugación a 35.000 g durante 1 hora a 4ºC, las proteínas de fusión GST-BTK se purificaron por cromatografía glutatión-Sefarosa (Uckun, F.M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6389-6397), mientras que las proteínas de fusión MBP-BTK se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante cromatografía de afinidad de amilosa (Hsu, D., et al. (1996) Biochemistry 35, 13871-77).

Microscopía de Escaneo láser confocal. Las células DT-40 BTK-deficientes y de tipo salvaje se trataron con anticuerpo anti-Fas (1 \mug/ml, 24 hrs a 37ºC) se unieron a poli-1-lisina con cubre-objetos y se fijaron en metanol frío helado (-20ºC) durante 15 minutos. Tras la fijación, los cubre-objetos se lavaron durante 15 min en tampón fosfato (PBS) + 0,1% triton X-100. Las células se tiñieron con un anticuerpo anti-tubulina policlonal de conejo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma, St. Louis, MO) para visualizar sus citoplasmas. El DNA se marcó durante 10 min con un tinte de DNA específico de toto-3 (Molecular Probes, Eugene OR) para visualizar los cambios apoptóticos en el núcleo. Las células DT-40 BTK-deficientes BTK-MBP electroporadas y las células BTK-deficientes no electroporadas se marcaron con un anticuerpo dirigido contra la proteína de unión a la maltosa. El anticuerpo secundario era un anticuerpo conjugado con fluoresceína anti-conejo de cabra. En algunos experimentos, las células se examinaron para la expresión de Fas por microscopía confocal. En breve, las células se unieron a cubre-objetos cubiertos de poli-L-lisina y se fijaron durante 40 min en 2% paraformaldehído en tampón fosfato salino (PBS). Las células se enjuagaron en PBS + 115 mm glicina para parar el formaldehído y entonces se bloqueó en PBS conteniendo 2% de albúmina de suero bovino (PBS+BSA). Un anticuerpo monoclonal dirigido contra el dominio extracelular de Fas (Transduction Labs, Lexington, KY, catálogo #F22120) se añadió en PBS+BSA y los cubre-objetos se incubaron durante 40 min a 37ºC antes de tratar de nuevo en PBS. Un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína (anti-ratón cabra - FITC H+L, Zymed, South San Francisco, CA, Nº catálogo. 62-6511) diluido en PBS+BSA entonces se añadió a los cubre-objetos y se incubaron de nuevo durante 40 min a 37ºC. Tras otro lavado, el DNA celular se marcó por incubación en 1 mM TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 20 min a temperatura ambiente. Los cubre-objetos se invirtieron y se montaron en los costados Vectashield (Vector Labs, Burlinghame, CA), para prevenir el fotoblanqueo y se selló con laca de uñas. Los costados se examinaron usando un Microscopio confocal de escaneo de láser Bio-Rad MRC 1024 montado en un microscopio vertical Nikon Eclipse E-800 equipado para epifluorescencia con elevados objetivos de apertura numérica (Uckun, F.M., et al. (1998) Clinical Cancer Research, 4, 901-912). Se obtuvieron las secciones ópticas y se convirtieron en estereomicrográfo usando software Lasersharp (Bio-Rad, Hercules, CA). Las imágenes digitales representativas se guardaron en un disco Jaz y se procesaron usando el software Photoshop (Adobe Systems, Mountain View CA). Las imágenes se imprimieron en una impresora de transferencia térmica Fuji Pictography (Fuji Photo, Elmsford, NY). Los datos digitalizados se guardaron y conservaron en un CD-ROM.

Ensayos de Apoptosis. Para inducir la apoptosis, las células se trataron con un anticuerpo anti-Fas/APO-1 agonístico (Biosource International, Camarillo, Ca., lot. 04/1295) a concentraciones finales de 0,1 \mug/ml, 0,5 \mug/ml, o 1,0 \mug/ml. La unión MC540 (como un marcador temprano de la apoptosis) y la permeabilidad PI (como un marcador de la apoptosis de estado avanzado) se midieron simultáneamente en células DT-40 24 horas tras la exposición al anticuerpo anti-Fas tal como se ha descrito previamente (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). Todas las células se analizaron con un citómetro de flujo FACStar Plus (Becton Dickinson, San Jose, CA). Todos los análisis se analizaron usando una excitación 488 nm a partir de un láser de argón. Las emisiones MC540 y PI se separaron con un espejo dicroico de pase corto 600 nm y un filtro de pase de banda 575 nm se puso en frente del tubo fotomultiplicador para medir la emisión MC540 y un filtro de pase de banda 635 nm se usó para la emisión P1.

Para detectar la fragmentación apoptótica de DNA, se cultivaron células DT-40, NALM-6-UM 1, y RAMOS- I durante 24 horas tras la exposición a anti-Fas. El DNA se preparó a partir de DNA de lisados Triton-X-100 para el análisis de fragmentación (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273,1096-1100; Uckun, F.M., et al. (1995) Science 267,886-91; y Uckun, F.M., et al. (1998) Cinical Cancer Research, 4, 901-912) las células se lisaron en Tris-HCl hipotónico 10 mmol/l (pH 7,4), 1 mmol EDTA, detergente 0,2% Triton-X-100; y a continuación se centrifugó a 11.000 g. Para detectar la fragmentación del DNA asociada a la apoptosis, los sobrenadantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1,2%, y los fragmentos de DNA se visualizaron por luz ultravioleta tras teñir con bromuro de etidio. En algunos experimentos, las proteínas de fusión MBP-BTK (100 \mug/2,5x10^{8} células) se electroporaron (campo eléctrico 420V, 125 \muF) células CT-40 BTK-deficientes utilizando un electroporador "Gene Pulser" de BioRad y los procedimientos de Bergland y Starkey (Bergland, D. y Starkey, J. (1991) Cytometry 12, 64-67) con pequeñas modificaciones 4 horas antes de los ensayos de apoptosis y de ligación Fas.

Ensayos de destrozo con proteínas de fusión MBP-BTK y GST-BTK. Las proteínas de fusión GST-BTK no se unieron covalentemente a las cabezas de glutatión-agarosa (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, MO) y las proteínas de fusión MBP-BTK se unieron de forma no covalente a las cabezas de amilosa bajo las condiciones de proteína saturante, tal como se describe previamente (Uckun, F.M., et al. (1996) J. Biol Chem. 271, 6389-6397; y Hsu, D., et al. (1996) Biochemistry 35, 13871-77). En breve, 50 \mug de cada proteína se incubaron con 50 \mul de las cabezas durante 2 horas a 4ºC. Las cabezas se lavaron tres veces con tampón 1% Nonidet P.40. los lisados Nonidet P-40 de células DT-40 BTK-deficientes, los precursores de linfocitos B leucémicos humanos NALM-6-UM1, y células linfoblastoides KL2 humanas EM-transformadas se prepararon tal como se describe (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100; y Uckun, F.M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6389-6397) y 500 \mug del lisado se incubaron con 50 \mul de cabezas de acoplamiento de proteínas de fusión durante 2 horas en hielo. Los adsorbatos de proteína de fusión se lavaron con tampón 1% Nonidet P-40 en hielo frío y se resuspendió en un tampón de muestra SDS reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 min y entonces se fraccionó en SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA), y las membranas se sometieron a inmunoblot con anti-Fas (Transduction Laboratories, Inc., Lexington, KY, cat. # F22120), de acuerdo con los procedimientos descritos previamente (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273,1096-1 100; Dibirdik, l., et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 4035-4039; Uckun, F.M., et al.(1996) J. Biol. Chem. 271, 6389-6397; y Uckun, F.M., et al. (1997) Blood, 89,3769-3777).

En una serie de experimentos diseñados para examinar el potencial papel regulador negativo de BTK en la apoptosis mediada por Fas, primero comparamos los efectos de la ligación Fas en las células DT-40 de tipo salvaje para los efectos de la ligación Fas en el subclon BTK-deficiente de células DT-40 que se establecieron por recombinación homóloga del knockout (Uckun, FM., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). Con este fin, primero usamos un ensayo de detección de la apoptosis por citometría de flujo cuantitativa (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). La unión MC540 y la permeabilidad de yoduro de propidio (PI) se midieron simultáneamente antes y después del tratamiento con el anticuerpo agonístico anti-Fas (1 \mug/mL x 24 horas). Mientras que sólo el 5,0% de células DT-40 de tipo salvaje tratadas con el anticuerpo anti-Fas mostraron cambios apoptóticos, 96,3% de células DT-40 BTK-deficientes sufrieron apoptosis, tal como se determinó mediante fluorescencia simple MC540 (apoptosis temprana) o fluorescencia doble MC540/Pl (apoptosis avanzada) a 24 horas (Figura 1). Particularmente, las células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con un gen btk humano de tipo salvaje mostraron una evidencia muy pequeña mediante citometría de flujo de apoptosis, lo que proporcionó una evidencia formal que BTK desarrolla un papel esencial en la prevención de la señal por muerte apoptótica activada por la ligación Fas. De acuerdo con la información previamente publicada recordando la función pro-apoptótica de la PTK de la familia Src (Waddick, K.G., et al. (1993) Radiation Research, 136, 313-319; Schlottmann, K.E., et al. Leukocyte Biology 60,546-554; y Atkinson, E.A., et al. (1996) J. Biol Chem. 271, 5968-5971) y el deterioro comunicado de apoptosis mediada por linfocitos B Fas a partir de ratones LYN-deficientes (Wang, J., et al. (1996) J. Exp. Med. 184, 831-838), se halló una apoptosis muy pequeña en un subclón LYN-deficiente tratado con anti-Fas de células DT-40 que se incluyó como un control en estos experimentos (Figura 1). Tal como se muestra en la Figura 2A, ninguna proteína BTK fue detectable mediante análisis de Western blot en los lisados celulares totales de células DT-40 BTK-deficientes, mientras que las células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con un gen btk humano de tipo salvaje expresando más altos niveles de BTK que las células DT-40 de tipo salvaje. No obstante, los niveles de expresión de proteína Fas en estos tres clones de linfocitos B fueron virtualmente idénticos (Figura 2B). Estos hallazgos además se circunscribieron mediante microscopía confocal. Tal como se muestra en de C.1 a C.3, todas las tres líneas celulares exhibieron niveles similares de tinción Fas punteada. Las reconstrucciones tridimensionales de las secciones ópticas en serie confirmaron la expresión de Fas tanto en el citoplasma y en la superficie de membrana de todas las tres líneas celulares sin ninguna diferencia detectable en relación al patrón o niveles de expresión. Así, la resistencia de las células DT-40 de tipo salvaje o células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con BTK de tipo salvaje frente la apoptosis mediada por Fas no fue debida a los bajos niveles de expresión de la proteína Fas y la susceptibilidad de células DT-40 BTK-deficientes a la apoptosis mediada por Fas no fue causada por un aumento de la expresión de la proteína Fas.

El examen comparativo de las características morfológicas de células DT-40 de tipo salvaje versus BTK-deficientes mediante microscopía confocal de escaneo láser no mostró evidencias de apoptosis para las células de tipo salvaje tras el tratamiento con el anticuerpo anti-Fas agonístico, mientras que las células BTK-deficientes mostraron una reducción y fragmentación nuclear consistente con la apoptosis (Figura 3A). En los geles de agarosa, el DNA de los lisados Triton-X-100 de células DT-40 BTK-deficientes tratadas con anti-Fas mostraron un patrón de fragmentación de tipo escalera consistente con la apoptosis, mientras que no se observó fragmentación de DNA en las células DT-40 de tipo salvaje (Figura 3B). Estos resultados proporcionaron una evidencia directa que BTK puede inhibir la apoptosis mediada por Fas/APO-1.

BTK tiene una única región N-terminal que contiene homología a dominios pleckstrin (PH) y homología a dominios Tec (TH), una homología al dominio Src 3 simple (SH3) que contiene el sitio de autofosforilación en la tirosina 223, un dominio SH2 simple, y una quinasa de dominio catalítico que contiene el sitio de transfosforilación en la tirosina 551 (Rawlings, DA, Witte, O.N. (1994) Immunol. Rev. 138, 105-119; y Kurosaki, T. (1997) Curr. Opin. Imnunol. 9, 309-318). El dominio PH de BTK interactúa con varias isoformas de la proteínquinasa C, proteínas G heterotriméricas, así como la proteína BAP-135 (Rawlings, DJ., Wine, O.N. (1994) Immunol. Rev. 138, 105-119; Kurosaki, T. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9, 309-318; Tsukada, S. (1994) J. Biol Chem. 269,10217-10220; y Yang, W., Desiderio, S. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 604-609). Los dominios SH3 han demostrado interactuar con secuencias ricas en prolina de otras proteínas mientras que los dominios SH2 interactúan con proteínas tirosina fosforiladas (Yang, W., Desiderio, S. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 604-609). No obstante, las proteínas específicas que interactúan con los dominios SH2 ó SH3 de BTK en las células linfoides de la línea B aún no se han encontrado Las mutaciones en el dominio catalítico, dominio SH2, así como el dominio PH de BTK se ha encontrado que llevan a bloqueos en la maduración en etapas tempranas de la ontogenia de los linfocitos B en XLA humana (Pawson,T., Gish, G.D. (1992) Cell 71,359-362; y Vihinen, M., et al. (1995) Immunol. Today 16,460-465). Los ratones BTK-deficientes generados mediante introducción de mutaciones en el dominio PH o catalítico en células madre embriónicas mostraron función y desarrollo de linfocitos B defectivos (Kerner, J.D., et al. (1995) Immunity 3, 301-312. Así, las diferentes regiones de BTK son importantes para sus fracciones fisiológicas. Para examinar la participación de varios dominios de BTK en la regulación negativa de la apoptosis mediada por Fas, se introdujo el gen btk humano de tipo salvaje así como genes btk humanos llevando mutaciones tanto en el dominio catalítico (Arg^{525} a Gln), dominio SH2 (Arg^{307} a Ala), o dominio PH (Arg^{28} a Cys) en las células DT-40 BTK-deficientes (Uckun, F.M., et al. (1996) Science 273, 1096-1100). Tal como se evidencia en la Figura 3C & 3D, las células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con el gen btk humano de tipo salvaje (rWT) no experimentaron apoptosis tras tratamiento con el anticuerpo anti-Fas agonístico, mientras que la activación Fas de las células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas expresando BTK humano con mutaciones en los dominios quinasa (rK-), SH2 (rmSH2), o PH (rmPH) indujo la apoptosis como lo hizo en las células DT-40 BTK-deficientes no reconstituidas mostradas en la Figura 3B. Así, los dominos quinasa, SH2, y PH de BTK son todos importantes y aparentemente indispensables para su función como un regulador negativo de la apoptosis mediada por Fas.

Para además caracterizar la función anti-apoptótica de BTK, se introdujo por electroporación una proteína de fusión MBP conteniendo la BTK de tipo salvaje de longitud total en células BM-deficientes 4 horas antes para el tratamiento con el anticuerpo anti-Fas. El examen de estas células mediante microscopía de escaneo láser (Figura 4A) así como análisis por Western blot usando anticuerpos anti-BTK y anti-MBP (Figura 4B) confirmó la presencia de la proteína MBP-BTK electroporada. Tal como se muestra en la Figura 4C, la introducción de la proteína BTK de tipo salvaje por electroporación proporcionó células DT-40 BTK-deficientes resistentes a los efectos apoptóticos de la ligación Fas, sugiriendo interacciones directas proteína-proteína entre BTK y los miembros de la vía de transducción de la señal Fas como un mecanismo posible para la función anti-apoptótica de BTK.

Los eventos pro-apoptóticos corriente abajo iniciados por la ligación de Fas o receptor-I de TNF se están empezando a dislumbrar (Fraser, A., Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO. J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincent, et al.(1997) J. Biol. Chem. 27.2, 17255-17257; Deveraux, Q., et al. (1997) Nature 388, 300-304; Thome, M., et al. (1997) Nature 386,517-521; Boldin, M.P., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; Los, M., et al. (1995) Nature 375, 81-83; Boldin, M.P., et al. (1996) Cell 85, 803-815; y Chinnaiyan, A.M., et al. (1995) Cell 81, 505-512). Tanto Fas como el receptor I de TNF contiene un "dominio de muerte" intracelular homólogo, que desarrolla un papel fundamental en el ensamblaje dependiente de ligando de un complejo de señalización de inducción de la muerte pro-apoptótica (DISC) (Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO J. 14, 5579-5588). Los dominios de muerte del receptor I de TNF p55 y Fas/CD95 sirven como sitios de anclaje que median el reclutamiento dependiente de ligando y la heteroasociación con otros dominios de muerte conteniendo proteínas adaptadoras multivalentes: la proteína asociada a Fas con la muerte celular (FADD) y la proteína que interacciona con el receptor (RIP) en el caso de CD95; y la proteína del dominio de muerte (TRADD) asociada con el receptor I de TNF y RIP en el caso del receptor-1 de TNF (Fraser, A., Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO J. 14, 5579-5588; y Chinnaiyan, A.M., et al. (1995) Cell 81, 505-512). FADD es el punto de convergencia entre las vías de transducción de la señal apoptótica unida al receptor I de TNF y Fas/CD95. Mientras que Fas/CD95 directamente recluta FADD, el receptor-1 de TNF une TRADD, que entonces actúa como una proteína adaptadora para reclutar FADD. La formación de complejos CD95-FADD o receptor I de TNF-TRADD-FADD siguiendo la unión de ligando son importantes para la inducción de la apoptosis. El ensamblaje de un DISC pro-apoptótico se completa mediante el reclutamiento y la activación concomitante de la caspasa citosólica FLICE, un miembro de la familia de la proteasa ICE (Fraser, A., Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincenz, et al.(1997) J. Biol. Chem. 272, 17255-17257; Deveraux, Q.L., et al (1997) Nature 388, 300-304; Thome, M., et al. (1997) Nature 396,517-521; Boldin, M.P., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7795-7798; Los, M., et al. (1995) Nature 375, 81-83; Boldin, M.P., et al. (1996) Cell 85, 803-815; y Chinnaiyan, A.M., et al. (1995) Cell 91, 505-512). Recientemente, se ha identificado un número de proteínas como inhibidoras de Fas así como de la apoptosis inducida por el receptor I de TNF (Fraser, A., Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Kischkel, F.C., et al. (1995) EMBO J. 14, 5579-5588; Hu, S., Vincenz, et al.(1997) J. Biol. Chem. 272, 17255-17257; Deveraux, Q.L., et al. (1997) Nature 388,300304; Thome, M., et al. (1997) Nature 386, 517-521). Estas proteínas interactúan directamente con FADD o FLICE, interfiriendo así con la función y el ensamblaje DISC. Especialmente, el dominio de muerte de Fas contiene un motivo YXXL conservado similar al motivo de activación basado en las secuencias de tirosina del inmunoreceptor (ITAM) como un sitio de unión potencial para las proteínas que contienen SH2 y Fas han demostrado recientemente asociarse con las quinasas Fyn y Lck como reguladores pro-apoptóticos que se requieren para la inducción de la apoptosis mediada por Fas (Schlottmann, KR, et al. Leukocyte Biology 60, 546-554; y Atkinson, E.A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 5968-5971). Nosotros por lo tanto postulamos que BTK podría interactuar con Fas y prevenir el ensamblaje de un DISC proapoptótico tras la ligación Fas.

Primero investigamos si BTK es capaz de una asociación física con Fas y otros miembros de DISC examinando los inmunocomplejos Fas, FLICE, FADD, y TRADD a partir de los lisados Nonidet P-40 de células DT-40 sin tratar para la presencia de BTK. BTK se detectó por análisis de Western blot en Fas (pero no el otro) inmunocomplejos mediante inmunoblotting anti-BTK (Figura 5A). De forma similar, Fas se detectó mediante inmunoblotting anti-Fas en inmunocomplejos BTK a partir de células DT-40 de tipo salvaje así como las células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con el gen btk humano de tipo salvaje (Figura 5B). La asociación constitutiva de BTK con la proteína Fas también se encontró en la línea celular NALM-6-UM1 de leucemia de precursores de linfocitos B humanos (Figura 5C). Cogidos juntos, estos resultados demuestran que BTK es capaz de asociarse con la proteína Fas y esta asociación física no requirió compromiso previo del receptor Fas. Tal como se muestra en la Figura 5D, Fas está asociado con FADD en células DT-40 BTK-deficientes, tal como se evidencia mediante la detección de Fas en inmunocomplejos FADD y esta interacción física se potenció marcadamente tras la ligación Fas. En células DT-40 BTK-deficientes activadas por Fas, las moléculas FADD asociadas a Fas podrían detectarse mediante inmunoblotting anti-FADD (Figura 5D). En contraposición a las células DT-40 BTK-deficientes, se encontró una asociación Fas-FADD muy pequeña en células DT-40 BTK-deficientes sin tratar o tratadas con Fas reconstituidas con BTK humano de tipo salvaje (Figura 5B). De forma similar, la ligación Fas falló para potenciar la asociación Fas-FADD en células de leucemia humana NALM-6-UM1 (Figura 5C). Así, BTK se asocia con Fas y deteriora su interacción con FADD, una proteína que es esencial para el reclutamiento y activación de PUCE por Fas durante la señal apoptótica. Mientras que estos resultados no excluyeron la posibilidad que BTK pueda alterar el destino de la señal apoptótica activada mediante ligación Fas por mecanismos múltiples incluyendo la modulación de la función de reguladores positivos o negativos de la transducción de la señal apoptótica, proporcionando al menos una explicación plausible para la función anti-apoptótica observada de BTK.

Para además elucidar el significado fisiológico de la asociación BTK-Fas observada en precursores de linfocitos B leucémicos humanos, comparamos las sensibilidades de la línea celular de leucemia pre-B humana NALM-6-UM1 BTK-positiva y línea celular de leucemia de linfocitos B humana BTK-deficiente RAMOS-1 para la apoptosis mediada por Fas. Tal como se muestra en la Figura 6A, estas dos líneas celulares expresan niveles similares de proteína Fas. Las células RAMOS-1 BTK-deficientes padecieron apoptosis tras la ligación Fas con el anticuerpo anti-Fas agonístico pero no las células BTK-positivas NALM-6-UM1 (Figura 6B). Nosotros a continuación examinamos los efectos del análogo del metabolito de leflunomida \alpha-ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-dibromofenilo)propenamida (LMA-13), un potente inhibidor de BTK en la asociación BTK-Fas y resistencia a la apoptosis mediada por Fas en células NALM-6-UM1. Los análisis anti-BTK y anti-Fas por Western blot de los lisados celulares totales a partir de células NALM-6-UM1 tratadas con LMA-13 no mostraron reducción en los niveles de expresión de BTK (Figura 6.C.1) o proteína Fas (Figura 6.C.2). Hubo sustancialmente menos proteína Fas en los inmunocomplejos BTK, proporcionando una evidencia directa que la inhibición de BTK por LMA-13 invalida la asociación BTK-Fas (Figura 6C.3). Notablemente, un tratamiento de cuatro horas con LMA-13 no indujo la apoptosis en células NALM-6-UM1 pero proporcionó estas células de leucemia humana altamente resistentes sensibles a la apoptosis mediada por Fas (Figura 6D). Estos resultados proporcionados además mostraron que BTK es un regulador negativo fisiológicamente importante de la apoptosis mediada por Fas.

La capacidad del inhibidor de BTK LFM-A13 para invalidar la asociación BTK-Fas aportó evidencias que la actividad quinasa de BTK desarrolla un papel importante para la formación de complejos BTK-Fas. Con el fin de establecer además si la asociación de BTK con Fas era o no dependiente de su actividad quinasa, a continuación examinamos las interacciones BTK-Fas en células DT-40 BTK-deficientes reconstituidas con BTK humana de tipo salvaje (BTK-,
rBTK[WT]) o quinasa inactiva mutante (Arg^{525} a Gln) BTK humana (BTK-, rBTK[K-]). Tal como se muestra en la Figura 7A, el análisis por Western blot de los lisados celulares totales a partir de estas dos líneas celulares con anticuerpos anti-BTK o anti-Fas no revelaron ninguna diferencia sustancial (es decir, en ambos de los dos experimentos individuales, observamos niveles de expresión ligeramente superiores de BTK y Fas en células BTK-, rBTK[K-]). Los inmunocomplejos Fas a partir de lisados de células BTK-, rBTK[WT] conteniendo proteína BTK esta asociación BTK-Fas se potenció además por tratamiento de las células con el anticuerpo anti-Fas (Figura 7B, carriles 1 y 2). En contraposición, ninguna proteína BTK fue detectable en inmunocomplejos Fas a partir de células BTK-, rBTK[K-] independientemente del tratamiento con el anticuerpo anti-Fas (Figura 7B, carriles 3 y 4). Estos resultados proporcionaron evidencias corroborantes que la asociación de BTK con Fas es dependiente de la actividad quinasa de BTK.

A continuación realizamos experimentos de unión con MBP-BTK de longitud total y las proteínas de fusión MBP-BTK y GST-BTK truncadas correspondientes a varios dominios de BTK (Figura 8A-C) para elucidar los requerimientos estructurales para la asociación BTK con Fas. MBP-BTK 1-659 (BTK de longitud total) así como MBP-BTK 408-659 ("dominio BTK quinasa") y MBP-BTK 2-137 ("dominio BTK PH") fueron capaces de unirse y destruir el Fas de los lisados de células DT-40 BTK-deficientes (Figura 8D), las células de leucemia pre-B humanas NALM-6 (Figura 8E), y células linfoblastoides-B KL2 humanas EBV-transformadas (Figura 8F). No obstante, Fas no se unió a la proteína de fusión control MBP-BTK 519-567 correspondiente al dominio quinasa truncado conteniendo el sitio de transfosforilación Y551 (C5 en la Figura 7D), GST-BTK 219-377 conteniendo los dominios SH3 más SH2, GST BTK 219-268 correspondientes al dominio SH3, o GST-BTK 281-377 correspondientes al dominio SH2 (los últimos dos se usaron sólo con lisados a partir de células DT-40 BTK-deficientes) (Figura 8D-F).

Aunque la estructura cristalina de BTK de longitud completa no se ha revelado, las estructuras recientemente publicadas del dominio PH y motivo BTK (Hyvonen, M., Saraste, M. (1997) EMBO J. 16, 3396-3404) proporcionaron información útil aplicable a la capacidad de unión de BTK y sus dominios PH. FADD se ha revelado que interactúa con el dominio citoplasmático de Fas, que está mayormente compuesto de un dominio de muerte consistente de seis \alpha-hélices anti-paralelas ensambladas a partir de los residuos 230-314 (Huang, B., et al. (1996) Nature 394,638-641). La secuencia YXXL del dominio de muerte de Fas se ha especulado que se asemeja a ITAMs y es reconocido por un dominio SH2 de un PTK una vez ha habido fosforilación de la tirosina o por otros mecanismos (Schlottmann, K.E., et al. Leukocyte Biology 60, 546-554; y Atkinson, E.A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 5968-5971). Un análisis de la conformación de esta secuencia YXXL muestra que está localizada en el medio de una \alpha-hélice y a menos que un cambio conformacional sustancial de esta \alpha-hélice tendría que hacer al residuo tirosina más accesible, esto puede ser demasiado rígido para la interacción con una PTK. Así, la geometría estructural de la secuencia YXXL prevendría de esta forma a Fas y BTK para adoptar un modo de unión tal que de CD3-\varepsilon ITAM/ZAP-70 fue sugerido por Atkinson, E.A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 5968-5971. La incapacidad del dominio SH2 de BTK para destruir Fas a partir de los lisados celulares totales además apoya esta noción. ¿Cómo entonces se asocia BTK con Fas? BTK y Fas pueden asociarse vía atracciones electroestáticas complementarias e interacciones de puentes de hidrógeno que podrían implicar los residuos cargados previamente publicados en las superficies de las \alpha-hélices del dominio de muerte de Fas. Esta asociación podría estar mediada por una tercera proteína que forma una interfície entre Fas y BTK. La importancia de los dominios SH2 y quinasa de BTK para su función anti-apoptótica impulsa la hipótesis que un sustrato fosforilado de tirosina de BTK puede proporcionar tal interfície.

La capacidad de BTK para inhibir los efectos pro-apoptóticos de la ligación Fas impulsa la hipótesis que la apoptosis de desarrollo de los precursores de linfocitos B durante la ontogenia de linfocitos B humanos normal puede estar regulada recíprocamente por Fas y BTK. La ausencia de BTK o mutaciones en su quinasa, dominios PH, y SH2 podría conducir a una muerte celular apoptótica inapropiada de los linfocitos pre-B conduciendo al fenotipo XLA (Rawlings, DJ., Witte, O.N. (1994) Immunol. Rev. 139,105-119; Tsukada, S., et al. (1993) Cell 72, 279-290; y Vetrie, D. (1993) Nature 361, 226-233). La apoptosis inapropiada puede encubrir la patogénesis así como la resistencia a fármacos de los linfomas y leucemias humanas, lo que hace al control de la apoptosis una importante diana potencial para la intervención terapéutica. El destino de las células de leucemia/linfoma expuestas a agentes quimioterapéuticos (pej., vincristina, daunorubicina, o taxol) puede residir en el equilibrio entre los efectos pro-apoptóticos opuestos de las caspasas activadas por DISC y un mecanismo regulador negativo corriente arriba implicando BTK y/o sus
sustratos.

Por lo tanto, los inhibidores de BTK son buenos para potenciar la sensibilidad a fármacos de células de leucemia/linfoma de la línea B.

Ejemplo 2 Síntesis de análogos del metabolito de leflunomida específicos

Química. Todos los reactivos químicos se obtuvieron de Aldrich (Milwaukee, WI) y se usaron sin más purificación. Excepto donde se apunte, cada matraz de reacción se aseguró con un septo de goma, y la reacción se realizó bajo atmósfera de nitrógeno. Los espectros ^{1}H y ^{13}C RMN se obtuvieron en un espectrofotómetro Varian Mercury 300 (Palo Alto, CA) a temperatura ambiente en el disolventes especificado. Los puntos de fusión se determinaron usando un aparato de punto de fusión Fisher-Johns y no se corrigieron. El espectro FT-JR se grabó en un espectrofotómetro Nicolet Protege 460 (Madison, WI). Los espectros GCJMS se obtuvieron en un Sistema HP 6890 GC (Palo Alto, CA) equipado con un Detector Selectivo de Masas HP 5973.

Los espectros MS (EI) se obtuvieron en un HP Series 1100 LL/MSD.

El esquema sintético general para las preparaciones de LFM, y LFM-A1 - LFM-A14 se ilustra en la Figura 19 con la inclusión de LFM, LFM A1 a LFM-A12 y LFM-A14 con propósitos tan sólo comparativos. El ácido cianoacético I se acopló con la anilina deseada 2 en la presencia de diisopropilcarbodiimida (DIC) para formar 3. El compuesto 3 se trató con NaH y entonces se aciló con cloruro de acetilo para obtener LFM o LFM-A 1 a LFM-A 14.

Procedimiento sintético general

1,3-Diisopropilcarbodiimida (1,75 g; 13,9 mmol) se añadió a una solución del ácido cianoacético 1 (1,70 g; 20,0 mmol) y la anilina sustituida deseada 2 (12,6 mmol) en tetrahidrofurano (25 mL) a 0ºC. La mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente. El precipitado de urea resultante (producto secundario de reacción) se eliminó mediante filtración y el filtrado se particionó entre acetato de etilo y HCl 0,5 N. La fase orgánica se lavó secuencialmente con salmuera dos veces, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, y se concentró en un rotavapor. El producto sólido bruto se recristalizó a partir de alcohol etílico para dar 3 puro. Ver Kuo, E. A., et al. (1996) J. Med. Chem. 39(23),4608-21; y Sjogren, E. R., et al. (1991) J. Med Chem. 34, 3295-3301.

Se añadió lentamente hidruro sódico (0,93 g; 60% en aceite mineral; 23,2 mmol) a la solución de 3 (12,0 mmol) en tetrahidrofurano (40 mL) a 0ºC. Tras agitar durante 30 minutos a 0ºC, se añadió cloruro de acetilo (1,04 g; 13,2 mmol) a la mezcla de reacción. La reacción se continuó durante otra hora a temperatura ambiente y se trató mediante la adición de ácido acético (2 mL). La mezcla se puso en agua helada (100 ml) conteniendo 2,5 mL de ácido clorhídrico para precipitar el producto bruto, que se recogió por filtración y se lavó con agua. El producto puro final se obtuvo por recristalización.

Datos físicos

En las siguientes secciones, los datos físicos de todos los demás compuestos que no sean LFM-A13, (esto es LFM, LFM-A1 a LFM-A12, y LFM-A14) se listan sólo con propósitos comparativos:

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-(trifluorometil)fenil]-propenamida (LFM). pf: 230-233ºC; IR (KBr): 3303, 2218, 1600 y 1555 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,01 (s, 1H, NH), 7,75 (d, J= 8,4 Hz, 2H, ArH), 7,64 (d, J= 8,4 Hz, 2H, ArH), 2,22 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 270 (M^{+}), 161, 142, 111.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-bromofenil)propenamida (LFM-A1). pf: 213-214ºC; IR (KBr): 3288, 2228, 1615, 1555 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,51 (s, 1H, NH), 7,49 (s, 4H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH_{3}); MS (EI) m/z 280 (M^{+}).

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-clorofenil)propenamida (LFM-A2). pf: 209-211ºC; IR (KBr): 3298, 2223, 1598 y 1552 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,48 (s, 1H, NH), 7,54 (d, J= 8,7 Hz, 2H, ArH), 7,45 (s ancho, 1H, OH), 7,36 (d, J= 8,7 Hz, 2H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH_{3}); MS (CI) m/z 236 (M^{+}), 129, 127.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-fluorofenil)propenamida (LFM-A3). pf: 165-166ºC; IR (KBr): 3298, 2218, 1610 y 1560 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,33 (s, 1H, NH), 7,80 (s ancho, 1H, OH), 7,53 (m, 2H, ArH), 7,16 (m, 2H, ArH), 2,26 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 220 (M^{+}), 111.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2-(trifluorometil)fenil]-propenamida (LFM-A4). pf: 61-63ºC; IR (KBr): 3435, 2209, 1619, 1952 y 1548 cm^{-1} ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,99 (s, 1H, NH), 8,03 (d, J= 7,5 Hz, 1H, ArH), 7,67 (d, J= 7,5 Hz, 1H, ArH), 7,60 (dd, J= 7,5, 7,5 Hz, 1H, ArH), 7,29 (dd, J= 7,5, 7,5 Hz, 1H, ArH) 5,71 (s ancho, 1H, OH), 2,20 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 270 (M^{+}), 161, 141, 114.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2-bromofenil)propenamida (LFM-A5). pf: 98-100ºC; IR (KBr) 3351, 2214, 1609, 1585 y 1536 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,76 (s, 1H, NH), 8,06 (dd, J= 8,1, 1,5 Hz, 1H, ArH), 7,62 (dd, J= 8,1, 1,5 Hz, 1H, ArH), 7,33 (m, 1H, ArH), 7,03 (m, 1H, ArH), 6,60 (s ancho, 1H, OH), 2,22 (s, 3H, CH_{3}); MS (CI) m/z 280 (M^{+}), 173, 171.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2-clorofenil)propenamida (LFM-A6). pf: 93-94ºC; IR (KBr): 3372, 2208, 1644, 1621 y 1587 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,96 (s, 1H, NH), 8,16 (d, J= 8,1 Hz, 1H, ArH), 7,46 (dd, J= 7,5, 1,5 Hz, 1H, ArH), 7,29 (m, 1H, ArH), 7,08 (m, 1H, ArH), 2,22 (s, 3H, CH_{3}); MS (CI) m/z 236 (M^{+}), 129, 127.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2-fluorofenil)propenamida (LFM-A7). pf: 118-119ºC; IR (KBr): 3409, 2212, 1613, 1591 y 1532 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,70 (s, 1H, NH), 791 (m, 1H, ArH), 7.23 (m, 1H, ArH), 7,13 (m, 2H, ArH), 7,10 (s ancho, 1H, OH), 2,22 (s, 3H, CH3); GC/MS m/z 220 (M^{+}), 111.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-\beta-(trifluorometil)fenil]-propenamida (LFM-A8). pf: 182-184ºC; IR (KBr): 3303,
2221, 1619 y 1572 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,79 (s, 1H, NH), 8,05 (s ancho, 1H, OH) 8,04 (s, 1H, ArH), 7,75 (d, J= 8,1 Hz, 1 H, ArH), 7,53 (dd, J= 8,1, 7,5 Hz, 1H, ArH), 7,42 (d, J= 7,5 Hz, 1H, ArH), 2,24 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 270 (M^{+}), 161.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3-bromofenilo)propenamida (LFM-A9). pf: 184-185ºC; IR (KBr): 3303, 2228, 1610, 1595 y 1550 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-\delta_{6}): \delta 10,56 (s, 1H, NH), 7,89 (m, 1H, ArH), 7,47 (m, 1H, ArH), 7,28 (m, 2H, ArH), 6,37 (s ancho, 1 H, OH), 2,26 (s, 3H, CH_{3}); MS (EI) m/z 282 (M^{+} + H, ^{81}Br), 280 (M^{+} + H, ^{79}Br), 173, 171.

\alpha-Ciano-[\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3-clorofenil)propenamida (LFM-A10). pf: 184-187ºC; IR (KBr): 3293, 2221, 1610, 1595 y 1557 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,61 (s, 1H, NH), 7,76 (m, 1H, ArH), 7,42 (m, 1H, ArH), 7,33 (dd, J= 8,1, 8,1 Hz, 1H, ArH), 7,16 (m, 1H, ArH), 6,84 (s ancho, 1H, OH), 2,25 (s, 3H, CH_{3}); MS (Cl) m/z 239 (M^{+} + H, ^{37}Cl), 237 (M^{+} + H, ^{35}Cl), 129, 127.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3-fluorofenil)propenamida (LFM-A11). pf: 136-138ºC; IR (KBr): 3297, 2221, 1613, 1597 y 1567 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,54 (s, 1H, NH), 7,54 (m, 1H, ArH), 7,33 (m, 2H, ArH), 6,93 (m, 1H, ArH), 2,27 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 220 (M^{+}), 111.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[4-(trifuorometoxi)fenil)-propenamida (LFM-A12). pf: 182-183ºC; IR (KBr): 3308, 2213, 1625 y 1580 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,57 (s, 1H, NH), 7,90 (s ancho, 1H, OH), 7,64 (d, J= 8,7 Hz, 2H, ArH), 7,32 (d, J= 8,7 Hz, 2H, ArH), 2,25 (s, 3H, CH_{3}); GC/MS m/z 286 (M^{+}), 177, 108.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-dibromofenil)-propenamida (LFM-A13). pf: 148-150ºC; IR (KBr): 3353, 2211, 1648 y 1590 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,41 (s, 1H, NH), 8,57 (d, J= 2,4 Hz, 1H, ArH), 7,55 (d, J= 8,7 Hz, 1H, ArH), 7,14 (dd, J= 8,7, 2,4 Hz, 1H, ArH), 7,10 (s ancho, 1H, OH), 2,17 (s, 3H, CH_{3}); MS (EI) m/z 362 (M^{+} + 4), 360 (M^{+} + 2), 359 (M^{+}), 253, 251, 249, 150.

\alpha-Ciano-hidroxi-\beta-metil-\beta-(fenilo)propenamida (LFM-A14). pf: 134-135ºC; IR (KBr): 3281, 2214, 1605, 1579 y 1554 cm^{-1}; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,33 (s, 1H, NH), 7,51 (d, J= 7,5 Hz, 214, ArH), 7,40 (s ancho, 1H, OH), 7,31 (dd, J= 7,5, 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,11 (m, 1H, ArH), 2,26 (s, 3H, CH_{3}); GM/MS m/z 202 (M^{+}), 93.

Usando procedimientos similares al procedimiento general identificado anteriormente, también se prepararon los siguientes compuestos de fórmula I.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(4-(metilsulfonil)fenil-propenamida; preparado por oxidación del correspondiente compuesto 4-metiltio con ácido peracético en ácido acético; pf: 205-206ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,26 (s, 1), 7,81 (d, 2), 7,76 (d, 2), 3,15 (s, 3), 2,19 (s, 3); IR (KBr): 3309, 2225, 1643 y 1586 cm^{-1}; MS (EI) m/z 281,0 (M + H^{+}), 172,1.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[3-(metilsulfonil)fenil]-propenamida; preparado por oxidación del correspondiente compuesto 3-metiltio con ácido peracético en ácido acético; pf: 213-214ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,98 (s, 1), 8,18 (m, 1), 7,82 (m, 1), 7,60 (m, 2), 3,18 (s, 3), 2,23 (s, 3); IR (KBr): 3278, 2231, 1607 y 1555 cm^{-1}; MS (EI) m/z 281,0 (M + H^{+}), 172,1.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[3-bromo-4-(trifluorometoxi)-fenil)propenamida; pf: 178-179ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,03 (s, 1), 8,12 (d, 1), 7,55 (dd, 1), 7,45 (m, 1), 5,53 (s, 1), 2,20 (s, 3); IR (KBr): 3304, 2350, 1620 y 1602 cm^{-1}; MS (EI) m/z 365,0 (M + H^{+}), 255,9.

\alpha-Ciano-4-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-dibromofenil)-propenamida; pf: 181-181ºC;^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,03 (s, 1), 8,14 (m, 1), 7,84 (d, 1), 7,51 (dd, 1), 5,65 (s, 1), 2,20 (s, 3); IR (KBr): 3360, 2205, 1591 y 1530 cm^{-1}; MS (EI) m/z 361,0 (M + H^{+}) 249,9.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-diclorofenil)-propenamida; pf: 143-144ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,23 (s, 1), 8,29 (m, 1), 7,60 (d, 1), 7,35 (dd, 1), 5,17 (s, 1), 2,18 (s, 3); IR (KBr): 3371, 2210, 1601 y 1540 cm^{-1}; MS (EI) m/z 271,0 (M + H^{+}), 162,0.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-diclorofenil)-propenamida; pf: 143-144ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,70 (s, 1), 8,51 (d, 1), 7,45 (d, 1), 7,05 (dd, 1), 4,97 (s, 1), 2,14 (s, 3); IR (KBr): 3370, 2215, 1581 y 1528 cm^{-1}; MS (EI) m/z 271,0 (M + H^{+}), 162,0.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(3,4-diclorofenil)-propenamida; pf: 216-217ºC; ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,74 (s, 1), 7,95 (m, 1), 7,54 (m, 1), 7,47 (m, 1), 5,64 (s, 1), 2,23 (s, 3); IR (KBr): 3319, 2225 y 1612 cm^{-1}; MS (EI) m/z 271,0 (M + H^{+}), 162,0.

Usando un ensayo de inhibición BTK similar al descrito en la Tabla 1, se encontró que los anteriores compuestos actuaban como inhibidores BTK, teniendo generalmente IC_{50} de 20 \mum/ml, o inferiores. Los compuestos también se encontró que sintetizaban células para apoptosis con vincristina y ceramida usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3

El siguiente ejemplo proporciona información de cómo se pueden diseñar inhibidores específicos de BTK. Se revela un modelo de homología para el dominio quinasa de BTK, que es útil para el diseño y confirmación de inhibidores de BTK. También se revela el uso del modelo de homología para identificar compuestos específicos, incluyendo un nuevo análogo del metabolito de leflunomida que es un inhibidor potente y selectivo de BTK también se revela.

En un esfuerzo para diseñar inhibidores potentes de la BTK tirosín quinasa anti-apoptótica como agentes anti-leucémicos con promoción de la apoptosis y propiedades quimiosensibilizantes, se construyó un modelo de homología tridimensional del dominio BTK quinasa, tal como se describe más completamente posteriormente. Los estudios de modelado revelaron un distinto paquete de unión rectangular cerca de la región bisagra del dominio BTK quinasa con residuos Leu^{460}, Tyr^{476}, Arg^{525} y Asp^{539} ocupando las esquinas del rectángulo. Las dimensiones de este rectángulo son aproximadamente 18\ring{A} x 8\ring{A} x 9\ring{A} x 17\ring{A} y el grosor de la bolsa es aproximadamente 7\ring{A}.

Se emplearon procedimientos de anclaje avanzados para el diseño racional de análogos del metabolito de leflunomida (LFM) con una elevada probabilidad de unirse favorablemente al sitio catalítico en el dominio quinasa de BTK. El compuesto LFM-A13, para el que se calculó un valor K_{i} de 1,4 \muM, inhibió la BTK humana in vitro con un valor de IC_{50} de 17,2 \pm 0,8 \muM. De forma similar, LFM-A13 inhibió el BTK recombinante expresado en un sistema de vector de expresión de baculovirus con un valor IC_{50} de 2,5 \muM. La posición energéticamente favorable de LFM-A13 en la bolsa de unión es tal que su anillo aromático está cerca de Tyr^{476}, y su grupo sustituyente está emparedado entre residuos Arg^{525} y Asp^{539}. Además, LFM-A13 es capaz de interacciones de unión a hidrógeno favorables con BTK vía residuos Asp^{539} y Arg^{525}.

Además de su remarcable potencia en ensayos BTK quinasa, LFM-A13 también se descubrió que era un inhibidor altamente específico de BTK. Aún a concentraciones tan altas como 100 \mug/ml (\sim278 \muM), este nuevo inhibidor no afectó a la actividad enzimática de otras proteína tirosín quinasas, incluyendo JAK1, JAK3, HCK, quinasa del receptor EGF (EGFR), y quinasa del receptor de insulina (IRK).

De acuerdo con la función anti-apoptótica de BTK, el tratamiento de células leucémicas de línea B BTK^{+} con LFM-A13 potenció su sensibilidad a la apoptosis inducida por ceramida o vincristina.

Estructuras cristalinas del metabolito de leflunomida y sus análogos

El metabolito leflunomida (LFM) y dos de sus análogos (LFM-A12, LFM-A13) se cristalizaron usando varios disolventes por evaporación o difusión líquido-líquido. LFM y LFM-A12 se cristalizaron y a continuación se analizaron con tan sólo propósitos comparativos. Los datos de los rayos X a partir de cristales simples se recogieron usando un detector de área SMART CCD (Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI) con radiación MoKI (E= 0,7107 \ring{A}). El grupo espaciador se determinó basándose en ausencias sistemáticas y estadísticas de intensidad. Una solución de métodos directos proporcionó la mayoría de los átomos que no son hidrógeno a partir del mapa de densidad electrónica. Se realizaron varios ciclos de Fourier de diferencia/cuadrados mínimos de matriz completa para localizar los átomos restantes que no fueran hidrógeno. Todos los átomos que no fueran hidrógeno se clarificaron mediante parámetros térmicos anisotrópicos. Los átomos de hidrógeno se pusieron en las posiciones ideales y se refinaron como átomos de arrastradores con factores de temperatura isotrópicos relativos. La estructura se afinó usando los cuadros mínimos de matriz total en F^{2}. Los cálculos de estructura cristalina se realizaron usando un ordenador Silicon Graphics INDY R4400-SC (Silicon Graphics Inc., Mountain View, CA) o un ordenador Pentium usando el paquete de programas SHELXTL V 5.0 (Sheldrick, G., 5.0 Ed., Bruker Analytical X-ray Systems, Madison, WI).

Construcción del Modelo de Homología para el dominio quinasa de BTK

Un modelo de homología de BTK se construyó usando las estructuras cristalinas de los dominios de quinasa homólogos de proteínquinasas HCK, FGFR, IRK, y cAPK (Sicheri, F., Moarefi, I., y Kuriyan, J. (1997) Nature 385(6617), 602-9; Mohammadi, M., et al. (1997) Science 276(5314), 955-60; Hubbard, S. R. (1997). The E. M. B. O. Journal 16(18), 5572-5581; y Zheng, I., et al. (1993) Acta Cryst. D49,362-365). El modelo de homología de BTK se llevó a cabo primero obteniendo la secuencia de proteína de BTK (Swiss-Prot # Q06187, Univ. of Geneva, Geneva, Switzerland) de GenBank (National Center for Biotechnology Información, Bethesda, MD). Después, se determinó la alineación de secuencia más razonable entre la BTK quinasa y un molde coordinado. Esto se hizo primero superponiendo los coordinados CI de los dominios quinasa de HCK, FGFR, IRK, y cAPK usando el programa InsightII ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) para proporcionar la mejor comparación estructural total. Todas las cuatro secuencias se alinearan basándose en la superposición de sus estructuras (secuencias de aminoácidos se alinearían juntas si sus posiciones CI estaban relacionadas espacialmente unas con las otras). La alineación de secuencias acomodaron tales características como lazos en una proteína que difiere de las otras secuencias de proteína. La superposición estructural se hizo usando el módulo de homología del programa InsightII ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) y un ordenador Silicon Graphics INDIG02 (Silicon Graphics Inc., Mountain View, CA). La alineación de la secuencia se ajustó manualmente basándose en las consideraciones mencionadas anteriormente, y produjo un perfil de variación de secuencia para cada posición CI superpuesta. El perfil de variación de secuencia sirvió como base para el próximo procedimiento, que fue la alineación de la secuencia de todas las cuatro proteínas con BTK quinasa. En este procedimiento, la secuencia de la BTK quinasa se leyó en el programa y se alineó manualmente con las cuatro proteínas quinasas conocidas basándose en el perfil de variación de secuencias descrito previamente. Después se asignó un equipo de coordinados 3D a la secuencia BTK quinasa usando los coordinados 3D de HCK como un molde, que empleó el módulo de Homología en el prograa InsightII ((1996), Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA). Los coordinados de la región lazo donde aparece una inserción de secuencia (en relación con HCK sin el lazo) se escogió de un número limitado de posibilidades automáticamente generadas por el programa y ajustadas manualmente a una geometría más ideal usando el programa CHAIN (Sack, J. S. (1988) J. Mot. Graphics 6,244-245). Finalmente, el modelo construido de BTK se sometió a una minimización de la energía usando el programa X-plor (Brunger, A. T. (1992), New Haven, CT) de modo que cualquier cadena estérica introducida durante el procedimiento de construcción del modelo podría ser mitigada. El modelo se cribó por contactos estéricos desfavorables y si fuera necesario tales cadenas laterales se podrían remodelar tanto usando una base de datos de librerías de rotameros o por rotación manual de las respectivas cadenas laterales. El modelo de homología final del dominio BTK quinasa tenía una desviación RMS de 0,01 \ring{A} de las longitudes de unión ideales y 2,2º de los ángulos de unión ideales tras la minimización de la energía. El modelo de homología de BTK entonces se usó, en conjunción con los coordinados modelos de LFM y sus análogos (que fueron después comparados con las estructuras cristalinas), para estudios de modelado de los complejos BTK/inhibidor.

Procedimiento de anclaje usando el modelo de homología del dominio btk quinasa

El modelado de los complejos análogos BTK/LFM se hizo usando el módulo de anclaje enel programa INSIGHTII y usando el programa de Afinidad de los programas usados para anclar automáticamente un ligando al receptor. BTK en complejo con LFM o LFM-A12 se modeló con tan sólo propósitos comparativos. Los coordinados minimizados de energía para cada molécula LFM se generaron y anclaron interactivamente en el sitio de unión de ATP de BTK basándose en la posición de la quercetina en la estructura cristalina HCK/quercetina (Sicheri, F., et al., J. (1997) Nature 385 (6617),602-9). Los átomos de hidrógeno en el dominio quinasa de BTK se generaron y los potenciales se asignaron a tanto el receptor como el ligando antes del inicio del procedimiento del anclaje. El método de anclaje del programa InsightII utilizó el campo de fuerza CVFF y una estrategia de búsqueda Monte Carlo para buscar y evaluar las estructuras de anclaje. Mientras los coordinados para la carga del receptor se mantuvieron fijados, una región definida del sitio de unión se dejó relajar, permitiendo así a la proteína ajustarse a la unión de diferentes inhibidores. Un equipo de unión se definió en una distancia de 5\ring{A} a partir del inhibidor, permitiendo a los residuos en esta distancia alternar y/o rotar a posiciones energéticamente favorables para acomodar el ligando. Un ensamblaje se definió como consistente del receptor y la molécula de inhibidor y se realizó el anclaje usando el modo de anclaje fijado.

Los cálculos que aproximan de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas se usaron para determinar las mejores posiciones de anclaje de cada análogo LFM en el sitio catalítico BTK. Varias posiciones ancladas de cada análogo LFM se evaluaron cualitativamente usando Ludi (Bohm, H. J. (1992) J. Comput. Aided. Mol. Des. 6(6), 593-606; y Bohm, H. J. (1994) J. Comput. Aided Mot Des. 8(3),243-56) en INSIGHTII que se usó para estimar una constante de unión (Ki) para cada compuesto con el fin de clasificar sus capacidades de unión relativas y predecir la inhibición de BTK. Las tendencias Ki para los análogos LFM se comparó con las características de los valores IC_{50} de inhibición de la tirosina quinasa determinada experimentalmente para los compuestos, con el fin de elucidar las relaciones estructura-actividad (SAR) determinando la potencia de los análogos LFM.

Expresión de proteínas y construcción de baculovirus recombinante

Sf21 (IPLB-SF21-AE) células (Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656) derivadas a partir de tejido ovárico del gusano de polilla del suelo Spodorera frugiperda, se obtuvieron a partir de Invitrogen y se mantuvieron a 26-28ºC en medio celular para insectos de Grace suplementado con 10% FBS y 1,0% antibiótico/antimicótico (GIBCO-BRL). Las células del estoc se mantuvieron en suspensión a 0,2 - 1,6 x 10^{6}/ml en 600 ml del volumen total del cultivo en matraces de agitación Bellco de 1 L a 60-90 rpm. La viabilidad celular se mantuvo a 95-100% tal como se determinó mediante la exclusión de la tinción azul tripan.

El baculovirus recombinante conteniendo el gen BTK murino se construyó tal como está descrito (Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). En breve, el gen que codifica BTK se escindió del vector pBluescript SKII^{+} (Stratagene, La Jolla, Ca.) digestión con BamHI y su fragmento entonces se ligó a pFastBacI (Gibco-BRL). El vector resultante, pFastBacI, entonces se utilizó para generar baculovirus recombinante mediante transposición específica de sitio en células E. coli DH10Bac (Gibco-BRL) que hospedan un vector lanzadera baculovirus (bacmido), bMON14272. El DNA bacmido recombinante resultante se introdujo en células del insecto mediante transfección con el método mediado por liposomas estándar utilizando el reactivo Cellfectin (Gibco-BRL). Cuatro días después de la transfección se recogieron sobrenadantes para la purificación en placa subsecuente y se analizaron tal como antes. La quinasa BTK agotada se generó tal como está descrito (Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656) y se clonó en el vector de expresión baculovirus tal como está descrito anteriormente para BTK de tipo salvaje. Los vectores de expresión Baculovirus para las quinasas JAK1 y JAK3 se construyeron e introdujeron en células de insectos, tal como se reportó previamente (Goodman, P. A., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 17742-48).

Inmunoprecipitación de proteínas recombinantes a partir de células de insectos

Las células Sf21 se infectaron con vector de expresión baculovirus para BTK, JAK1, o JAK3, tal como se indicó en la breve descripción de las figuras. Las células se recogieron, lisaron (10mM Tris pH7,6, 100mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glicerol, 50mM NaF, 100mM Na_{3}VO_{4}, 50\mug/ml fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 \mug/ml aprotonina, \mug/ml leupeptina), y las quinasas se inmunoprecipitaron a partir de los lisatos, tal como se reportó (Vassilev, A., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). Los anticuerpos utilizados para inmunoprecipitados a partir de células de insectos son tal como sigue: suero anti-BTK de conejo policlonal, (Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11) anti-JAK1 conejo policlonal (HR-785), cat# sc-277, IgG policlonal de conejo purificado por afinidad, 0,1 mg/ml, Santa Cruz Biotecnología, y anti-JAK\cdotde conejo policlonal (C-21, cat # sc-513, IgG conejo policlonal purificado por afinidad, 0,2 mg/ml, Santa Cruz Biotecnología). Los ensayos quinasa se realizaron siguiendo una exposición de 1 hora de tirosinquinasas inmunoprecipitadas a los compuestos probados, tal como se describe en detalle en otra parte (Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11; y Uckun, F.M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). Los inmunoprecipitados se sometieron a análisis Western blot tal como se describió anteriormente (Vassilev, A., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656).

Líneas celulares, reactivos, y ensayos bioquímicos

El establecimiento y caracterización de la línea celular B limfoma DT40 así como DT40 BTK-deficientes y sus derivados reconstituidas con BTK humano mutante o de tipo salvaje se han sido reportadas previamente (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). Cantidades iguales de proteína BTK se detectaron mediante análisis Western blot en todos de los colones CT-40 BTK-deficientes transfectados con genes BTK humanos mutados o de tipo salvaje pero ninguna proteína BTK fue detectable en las células DT-40 BTK-deficientes sin transfectar (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). Todas la líneas celulares derivadas a partir de la línea celular Bc de pollo DT40 se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% de suero de pollo inactivado por calor, 2 mM glutamina, penicilina, y estreptomicina. Las células crecieron a 37ºC bajo atmósfera saturada 5% CO_{2} acuoso. Las líneas celulares leucemia de línea B humanas BTK positivas NALM-6 y ALL-1 se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Uckun, F. M., et al. (1995) Science 267, 886-91). La línea celular de riñón de simio COS-7 y línea celular de hepatoma humano HepG2 se obtuvieron de ATCC.

Los anticuerpos dirigidos contra BTK, JAK1, JAK3, y HCK han sido descritos previamente (Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11; Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274,1646-1656; Goodman, P. A., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 17742-48; y Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). Anticuerpos policlonales a BTK se generaron mediante inmunización de conejos con glutatión S-transferasa (GST) proteínas de fusión (Pharmacia Biotech Inc.) conteniendo los primeros 150 aminoácidos de BTK. El anticuerpo anti-Fas monoclonal (F22120) se obtuvo a partir de Transducción Laboratories, Inc. (Lexington, KY). Las inmunoprecipitaciones, ensayos proteín quinasa complejo inmune, e inmunoblotting utilizando el sistema de detección quimioluminiscente ECL (Amersham Life Sciences) se condujeron tal como se ha descrito previamente (Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11; Vassilev, A., et al. (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656; Goodman, P. A., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 17742-48; y Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). Siguiendo a la electroforesis, los geles quinasa se secaron en filtros 3M Whatman y se someten a fosfoimagen en un "Molecular Imager" (Bio-Rad, Hercules, CA) así como a una autoradiografía en película. Similarmente, todos los Western blots BTK quimioluminiscentes se sometieron a escaneo densitométrico utilizando el "Molecular Imager" y el Densitómetro de Imagen utilizando la aplicación versión 2.1 Macintosh/Analista Molecular siguiendo las especificaciones del fabricante (Bio-Rad). Para cada concentración de droga, un índice de actividad quinasa BTK se determinó comparando los ratios de actividad quinasa en unidades de fosforimagen (PIU) y la densidad de las bandas de proteína en unidades de escaneo densitométricas (DSU) o aquellas de la muestra base y utilizando la fórmula: Índice de Actividad = [PIU de la banda quinasa/DSU de la banda de proteína BTK]_{muestra \ test}: [PIU de la banda quinasa/DSU de la banda de proteína BTK]_{muestra \ de \ control \ de \ base}. GST-Ig\alpha algunas veces se utilizó como un sustratro exógeno para los ensayos proteínquinasa de complejo inmune BTK, tal como se describe en (Mahajan, S., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5304-11). Anticuerpos secundarios de mula anti-conejo, de oveja anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante, y reactivos ECL se adquirieron a partir de Amersham (Oakbrook, IL). Para ensayos de quinasa de receptor insulina (IRK), las células de hepatoma humano HepG2 que crecieron a aproximadamente el 80% de confluencia se lavaron una vez con DMEM libre de suero y se agitó durante 3 horas a 37º en un incubador CO_{2}. A continuación, las células se estimularon con insulina (Eli Lilly, cat# CP-410;10 unidades/ml/l0x10^{6} células) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Siguiendo este paso de activación IRK, las células se lavaron una vez con medio libre de suero, se lisaron en tampón NP-40 e IRK se inmunoprecipitó a partir de los lisados con un anticuerpo anti-IRb (Santa Cruz, Cat.# sc-7l 1, policlonal IgG). Antes de llevar a cabo los ensayos de inmunocomplejos quinasa, las cabezas se equilibraron con el tampón quinasa (30mM Hepes pH 7.4, 30mM NaCl, 8mM MgCI2, 4mM MnCl2).

Para los ensayos HCK quinasa, se usaron células COS-7 transfectadas con HCK en células COS-7 se ha descrito previamente (Saouaf, S. J., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 27072-8). El plásmido pSV7c-HCK se transfectó en 2x10^{6} células COS-7 células usando Lipofectamina (GIBCO/BRL), y las células se cultivaron 48 horas después. Las células se lisaron en tampón NP-40 y HCK se inmunoprecipitó a partir de los lisados celulares totales con un anticuerpo anti-HCK.

Ensayos de apoptosis

Para inducir la apoptosis, las células se trataron con un anticuerpo anti-Fas/APO (Bender MedSystems, City/State, Lot. 04/1295) a 0,1 \mug/ml y 0,5 \mug/ml como concentraciones finales, vincristina (sulfato de vincristina, USP; Pharmacia, NDC 0013-7466-86, Lote VCB019) a 10 ng/ml y 100 ng/ml como concentraciones finales, o C2-ceramida (Biomol, Lote M8107) a 10 \muM, 50 \muM, y/o 100 \muM como concentraciones finales. La unión a MC540 (como un marcador temprano de apoptosis) y permeabilidad PI (como un marcador de un estadio de apoptosis avanzado) se midieron simultáneamente en las células DT-40 24 horas después de la exposición a C2-ceramida, anti-Fas, o vincristina, tal como se ha descrito anteriormente (Uckun, F. M, et al. (1996) Science 22,1096-1100). Todas las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACStar Plus (Becton Dickinson, San Jose, CA). Todos los análisis se realizaron utilizando una excitación de 488 nm a partir de un láser de argón. Las emisiones PI y MC540 se dividieron con un espejo dicroico de paso pequeño de 600 nm y un filtro de paso de banda de 575 nm que se situó en frente de un tubo fotomultiplicador para medir la emisión de MC540 y un filtro de paso de banda de 635 nm que se utilizó para la emisión de PI. Para examinar los efectos del inhibidor BTK principal en la apoptosis inducida por ceramida en ALL humana positiva por BCR-ABL de la línea celular ALL-1, las células se trataron durante 4 horas a 37ºC con 10 \muM de C2-ceramida en presencia o ausencia del inhibidor (200 \muM LFM-A 13). Posteriormente, las células se lavaron, se tiñeron con PI y MC540, y las fracciones apoptóticas se determinaron por citometría de flujo multiparámetro, tal como se describe en (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100).

Para detectar una fragmentación apoptótica de DNA, las células DT-40 se recogieron 24 horas después de la exposición a anti-Fas, C2-ceramida, o vincristina. De manera similar, las células B18.2, NALM-6, y ALL-1 se trataron con LFM-A13 (100 \muM), vincristina (VCR) (10 ng/ml), C2-Ceramida (C2-CER) (10 \muM), LFM-A13 (100 \muM) + VCR (10 ng/ml), LFM-A13 (100 \muM) + C2-CER (10 \muM) durante 24 horas a 37ºC. El DNA se preparó a partir de lisados Triton-X-100 para análisis de fragmentación (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22,1096-1100). En breve, las células se lisaron en 10 mmol/L de Tris-HCl hipotónico (pH 7,4), 1 mmol/L EDTA, detergente 0,2% Triton-X-100; y posteriormente se centrifugaron a 11.000 g. Para detectar la apoptosis asociada a la fragmentación del DNA, los sobrenadantes se electroforizaron en gel de agarosa al 1,2%, y los fragmentos de DNA se visualizaron mediante luz ultravioleta después de la tinción con bromuro de etidio.

BTK es un Enzima Anti-Apoptótico

La actividad anti-apoptótica de BTK se evaluó mediante la comparación de los agentes inductores de la apoptosis C2-ceramida, vincristina, y anticuerpo anti-Fas monoclonal sobre linfocitos B de linfoma de pollo DT-40 de tipo salvaje con aquellas de subclones deficientes de células DT-40 que se establecieron por eliminación de recombinación homóloga (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100). La ceramida, el producto de la ceramida sintasa y la esfingomielasa, se ha mostrado que funciona como un segundo mensajero que transmite las señales apoptóticas inducidas por membrana, incluyendo los señales de muerte mediados por el receptor TNF y Fas, para los efectores corriente abajo (Enari, M., Hase, A., y Nagata, S. (1995) EMBO J. 14, 5201-5208). El uso de vincristina, un fármaco normalmente utilizado como anti-leucemia /limfoma, resulta en una acumulación dependiente de tiempo de ceramida en células tratadas que lleva a la apoptosis. En geles de agarosa, el DNA de los lisados de Triton-X100 de células DT-40 deficientes BTK tratado con anti-Fas mostraron un patrón de fragmentación similar a una escalera consistente con la apoptósis, mientras que se observó la no fragmentación de DNA en las células DT-40 de tipo salvaje (Figura 9A, Línea 7 vs Línea 14). Por lo tanto, el tratamiento del anticuerpo anti-Fas causó apoptosis en las células DT-40 deficientes, pero no en células salvajes del tipo CT-40 consistente con el hecho que BTK es un inhibidor de la muerte asociada a Fas induciendo el complejo de señalización (DISC) (Vassilev, A., et al, (1998) J. Biol. Chem., 274, 1646-1656). Notablemente, el tratamiento de las células DT-40 deficientes BTK con C2-ceramida (= N-acetilespingosina; un análogo de la ceramida permeable celular sintética) o vincristina fue capaz de recapitular los efectos de anti-Fas a la hora de inducir la fragmentación de DNA oligonucleosómica en electroforesis en gel de agarosa, mientras que las células DT-40 del tipo salvaje fueron resistentes a ambos agentes, confirmando la función de DTK como un regulador negativo de apoptosis (Figura 9A).

Para examinar la participación de varios dominios de BTK en su función anti-apoptótica, introducimos un gen BTK humano de tipo salvaje así como genes BTK humanos albergando mutaciones tanto en el dominio catalítico (Arg^{525} a Gln), dominio SH2 (Arg^{307} a Ala), o dominio PH (Arg^{28} a Cys) en las células DT-40 deficientes BTK (Enari, M., Haw, A., y Nagata, S. (1995) EMBO J. 14, 5201-5208). Tal como se ha evidenciado en la Figura 9B, las células DT-40 deficientes BTK reconstituidas con el gen humano BTK del tipo salvaje (WT) no experimentan apoptosis después de tratamiento con C2-ceramida (Líneas 2-4) o vincristina (Líneas 8-10), mientras que los subclones DT-40 expresando BTK humano con mutaciones en la quinasa (K-) (Líneas 5-7 y 11-13), SH2 (mSH2) (Líneas 15-17 y 21-23), o dominios PH (mPH) (Líneas 18-20 y 24-26) lo hicieron. Por lo tanto, la quinasa, SH2, y los dominios PH de BTK son importantes para su función anti-apoptótica.

Modelo de homología para el dominio quinasa BTK

Las coordenadas tridimensionales de BTK utilizados en los estudios de modelización de proteína/inhibidor se construyeron basándose en una alineación estructural con las secuencias de estructuras cristalinas conocidas para cuatro dominios de proteínquinasa (dominios quinasa de HCK, FGFR, IRK, y cAPK), tal como se detalla anteriormente (Sicheri, F., Moarefi, I., y Kuriyan, J. (1997) Nature 385(6617), 602-9; Mohammadi, M., et al. (1997) Science 276(5314),955-60; Hubbard, S. R. (1997) The E. M. B. O. Journal 16(l8), 5572-5581; Zheng, J., et al. (1993) Acta Cryst. D49,362-365). El dominio quinasa BTK modelado (Figura 10A) tiene el plegamiento proteínquinasa esperado con el sitio catalítico en el centro dividiendo el dominio quinasa en dos lóbulos. Está compuesto de un lóbulo N-terminal pequeño conectado por una bisagra flexible a un lóbulo C-terminal más grande. El lóbulo N-terminal es rico en cadenas-\beta, mientras que la región C-terminal es mayoritariamente helicoidal. El sitio catalítico está definido por dos láminas- \beta que forman una interfase en la hendidura de dos lóbulos. Esto está en esta región catalítica donde se pueden unir moléculas pequeñas de inhibidores. Nuestros estudios de modelización revelaron que el sitio catalítico del dominio BTK quinasa está compuesto de un bolsillo de unión rectangular planar distinto cerca de la región de la hendidura. La región rectangular de unión está definida por residuos Leu^{460}, Tyr^{476}, Arg^{525} y Asp^{539} que ocupan las esquinas del rectángulo. Las dimensiones de este rectángulo son aproximadamente 18\ring{A} x 8\ring{A} x 9\ring{A} x 17\ring{A} y el grosor del bolsillo es aproximadamente de 7\ring{A} (Figura 10B). La esquina izquierda del rectángulo puede ser visualizada como un principio cercano a la región de la hendidura en Leu^{460} (mostrado en amarillo, Figura 10B) y extendiendo 8 \ring{A} hacia la derecha superior a Asp^{539} (mostrado en azul, Figura 10B). Este es el lado más corto del bolsillo de unión y está localizado cerca del núcleo interior de la proteína. El lado izquierdo del bolsillo, que es el más largo, se extiende a partir de Leu^{460} y traza 18 \ring{A} a lo largo de la región de la hendidura hasta Tyr^{476} (mostrado en verde, Figura 10B). El lado derecho del bolsillo rectangular, opuesto a la región de la hendidura, se extiende sobre 9 \ring{A} a partir de Asp^{539} a Arg^{525} (mostrado en rosa, Figura 10B), que es inmediatamente adyacente a los subsitios de unión para los grupos azúcar y trifosfato del ATP. La región de la hendidura del sitio de unión está compuesto de los residuos 472 a 481. El solvente expuesto del cuarto lado del rectángulo se extiende 17 \ring{A} a lo largo de la obertura en forma de ranura al sitio catalítico de Tyr^{476} a Arg^{525}. El bolsillo de unión es más ancho en la región accesible al solvente, y se va estrechando hacia la región interior del sitio de unión, y en conjunto es relativamente poco profundo con un grosor de aproximadamente 7 \ring{A}. El volumen del bolsillo es aproximadamente 500 \ring{A}^{3}.

Mientras que muchos de los residuos del sitio catalítico del dominio quinasa BTK se conservaron en relación a otras tirosinquinasas, se observaron unas cuantas variaciones específicas. Los residuos Asn^{526} y Asp^{539} (opuestos a la hendidura) se conservan en EGFR, IRK, HCK, y BTK. El residuo Thr^{474} en la región de la hendidura cambia a Met en IRK, JAK1 y JAK3 y el residuo Tyr^{476} en la región de la hendidura cambia a Leu en EGFR y IRK. El residuo Ser^{538} de BTK no está conservado en otras quinasas, pero cambia a Bly en JAK1 y IRK, a Thr en EGFR, y a Ala en FGF-Receptor, JAK3, y HCK. Una región del sitio de unión contiene Cys^{481} en BTK que es más hidrofóbico que el residuo correspondiente del Receptor-PDGF (Asp), Receptor-FGF (Asn), y IRK (Asp). Estas diferencias de identidad en el residuo proporcionan una base para diseñar inhibidores selectivos del dominio BTK quinasa.

Diseño y síntesis basado en la estructura de los análogos LFM con potente actividad inhibitoria BTK

En estudios de modelado dirigido a identificar los análogos LFM con una elevada probabilidad de unirse favorablemente al sitio catalítico del dominio quinasa de BTK, nosotros escogimos evaluar los valores K_{i} que predicen cuantitativamente interacciones de unión entre el inhibidor y residuos en el sitio catalítico de BTK. Cada uno de los análogos LFM de moléculas pequeñas se modeló individualmente en el sitio catalítico del dominio BTK quinasa utilizando un procedimiento de anclaje avanzado (ver Procedimiento Experimental descrito anteriormente). La posición de la quercetina en la estructura cristalina HCK (Sicheri et al., 1997, Nature 385:602) se utilizó como plantilla para obtener un punto de comienzo razonable para el procedimiento de anclaje. Las diferentes posiciones de anclaje de cada análogo LFM se evaluaron cualitativamente utilizando un procedimiento de puntuación y consecuentemente se compararon con los valores IC_{50} de los compuestos en ensayos de inhibición BTK libres de células. La tabla 1 muestra las puntuaciones de las interacciones, valores de K_{i} calculados y valores IC_{50} medidos para LFM y sus análogos con BTK, los datos para LFM, LFM-A12, y LFM-A14 siendo incluidos solamente para propósitos comparativos.

Los inhibidores en nuestros estudios de modelado se emparedaron por dos regiones de residuos mayoritariamente hidrofóbicos. La región superior del inhibidor del anclaje consistía en residuos Leu^{408}, Val^{416}, y Lys^{430}, y los residuos inferiores del inhibidor del anclaje incluyen residuos Leu^{528}, Val^{416}, y Lys^{430}, y los residuos inferiores del inhibidor incluyeron residuos BTK Leu^{528}, Ser^{538}, Gly^{480}, y Cys^{481}. De todos los compuestos descritos evaluados en nuestros estudios de modelado (Tabla 1), predecimos que el compuesto LFM-A13 proporcionaría la unión más fuerte a BTK. Las posiciones de los residuos críticos en el sitio activo de BTK y la posición anclada del compuesto CFM-A13 se muestra en la Figura 11. De todas las posibles orientaciones de esta molécula unida al sitio catalítico, la mostrada en la Figura 11 muestra el elevado grado de interacción con BTK. Este elevado grado de interacción es indicativo de un modo de unión energéticamente favorecido, con un valor K_{i} calculado correspondientemente bajo de 1,4 TM. Esta posición de unión de LFM-A13 es tal que el anillo aromático de las caras inhibitorias del residuo Tyr^{476} y la cadena lateral flexible se extiende hacia los residuos Asp^{539} y Arg^{525}. El anillo aromático también está emparedado entre los residuos hidrofóbicos Leu^{408} y Val^{416} anteriores, y Gly^{480} y Leu^{528} posteriores. El residuo Ser^{538} yace debajo de la cadena lateral del inhibidor y el final de la cadena lateral está localizado entre los residuos Asp^{539} y Arg^{525}. Esta posición se asemeja cercanamente a la posición análoga del ATP encontrada en la estructura cristalina del complejo IRK (Hubbard, EMBP J; 16(18):5572-5581, 1977). De acuerdo con nuestros estudios de modelado, el átomo O3 en el grupo hidroxilo de LFM-A13 formaría un enlace de hidrógeno con Asp539:O y su átomo O4 formaría enlace de hidrógeno con Arg525:N.

La figura 12 ilustra las posiciones ancladas sobrepuestas de LFM-A13 en el sitio catalítico de BTK, juntamente con compuestos LFM y LFM-A12 para comparación. Las moléculas LFM y LFM-A12 están ancladas de manera que yacen a lo largo de la región de la hendidura, correspondiendo a la posición quercetina en la estructura cristalina de HCK. El anillo aromático de estas moléculas es cercano a Tyr^{476}, y el final de la cadena lateral está emparedado entre las residuos Asp539 y Thr^{474}. El grupo CF_{3} en estos puntos moleculares hacia la región accesible al solvente está rodeada por Leu^{408} por arriba y Gly^{480} por debajo. El grupo OH de LFM está unido mediante hidrógeno a un átomo de oxígeno de Asp^{539}, y para LFM-A12, el mismo grupo está unido por hidrógeno a un átomo de oxígeno de Thr^{474}. Todos los análogos de LFM listados en la Tabla 1, excepto LFM-A13, yacen a lo largo de la región de la hendidura como LFM o LFM-A12 y sus cadenas laterales se emparedan entre Asp^{525} y Thr^{474}.

Una comparación de las posiciones ancladas de LFM, LFM-A12, y LFM-A13 en el sitio activo BTK muestra que aunque la porción aromática de las tres moléculas está aproximadamente en la misma región (que es así también para otros análogos LFM inactivos), la cadena lateral de LFM-A13 está inclinada alejándose de las de los otros y está emparedada entre los residuos Asp^{539} y Arg^{525}. Esta rotación es probablemente debida a una orientación más favorable de los grupos 2,5-dibromo de LFM-A13. Esta posición ligeramente inclinada y los grupos Br más grandes presentan dos ventajas para la interacción de LFM-A13 con los residuos del sitio activo BTK.

La primera ventaja es que LFM-A13 es capaz de formar dos enlaces de hidrógeno con los residuos del sitio activo Asp^{539} y Arg^{525}, mientras que los análogos LFM inactivos forman solo un enlace de hidrógeno cada uno con el Thr^{474} o Asp^{539} de BTK. La segunda ventaja para la unión es el área de contacto más elevada de LFM-A13 con residuos de sitio activo de BTK, relativo a los otros 12 análogos LFM inactivos que llevan a una interacción hidrofóbica más grande para LFM-A13. Esta característica está reflejada por el elevado grado de lipofilia correspondiente para LFM-A13. Esta característica está reflejada por el grado liofílico más elevado correspondiente para LFM-A13 en la Tabla I.

Los resultados a partir de los estudios de modelado discutidos anteriormente incitaron la hipótesis de que LFM-A13 presentaría una potente actividad inhibitoria de BTK. Para probar esta hipótesis y validar el valor predictivo del modelo homólogo BTK descrito, sintetizamos LFM-A13, y LFM, y otros 11 análogos listados en la Tabla 1. Otra vez, LFM y todos los análogos diferentes de LFM-A13 se sintetizaron y analizaron sólo para propósitos de comparación. Las estructuras de LFM, LFM-A12, y LFM-A13 se determinaron mediante difracción de rayos X por un cristal simple. Todas las estructuras se encontraron que tenían una conformación planar y todas las longitudes de enlace y ángulos estaban dentro del rango esperado.

La figura 13 muestra una representación ORTEP del compuesto LFM-A13. La estructura cristalina de LFM-A13 mostró que su conformación molecular era muy similar a la de los coordinados moleculares de energía minimizada que se generaron y utilizaron para estudios de anclaje con BTK. Esta similitud conformacional con las estructuras cristalinas indicó que los modelos moleculares utilizados para anclaje eran apropiados para estudios de modelado.

Inhibición específica de BTK mediante LFM-A13

Los ensayos quinasa del complejo inmune libre de células se utilizaron para comparar los efectos de LFM y 12 análogos LFM en la actividad enzimática del inmunoprecipitado de BTK humano a partir de las células B18-2 (Uckun, F. M., et al. (1996) Science 22, 1096-1100) (es decir, células B de limfoma de pollo deficientes en BTK DT-40 reconstituidas con el gen BTK humano de tipo salvaje). Tal como se muestra en la Tabla 1, sólo LFM-A13 exhibió actividad inhibitoria BTK significativa con un valor IC_{50} de 6,2 \pm 0,3 \mug/ml (= 17,2 \pm 0,8 \muM). Ninguno de los otros compuestos, que se incluyeron sólo por comparación, inhibieron BTK aún en concentraciones tan elevadas como 100 \mug/ml (es decir, en un rango de 349 \muM para LTM-A12 a 495 \muM para LTM-A14).

LFM-A13 también fue efectivo en contra de BTK recombinante expresado en un sistema de expresión del vector baculovirus con un valor IC_{50} de 0,9 Tg/ml (\sim 2.5 TM, Figura 14A), así como el inmuprecipitado BTK a partir de los lisados celulares ALL de la línea humana B de NALM-6 (Figura 14B). Además, el tratamiento de células B18.2 (Figura 14C) o células NALM-6 (datos no mostrados) con LFM-A13 resultó en una inhibición dosis dependiente de la actividad BTK celular. La actividad inhibitoria de LFM-A13 en contra de BTK fue específica debido a que no afectó a la actividad enzimática de otras tirosinquinasas de proteínas, incluyendo las quinasas Janus JAK1 y JAK2, la familia quinasa HCK Src, y el receptor de la familia tirosinquinasa IRK, a concentraciones tan elevadas como 100 \mug/ml (\sim278 \muM; Tabla 2, Figura 15).

Bases estructurales para la especifidad BTK de LFM-A13

Los ensayos biológicos han mostrado que LFM-A13 es un inhibidor selectivo de BTK, mientras que es un inhibidor pobre de EGFR, HCK, JAK1, JAK3 y IRK. Para evaluar esta selectividad construimos un modelo de homología de EGFR, JAK1 y JAK3 utilizando coordinados de estructura cristalina homóloga de proteinquinasas IRK, HCK, y cAPK como plantilla. Los modelos entonces se utilizaron para estudiar la unión de moléculas pequeñas tales como LFM-A13 en sitios catalíticos de estas quinasas, y para entender mejor como LFM-A13 puede inhibir BTK pero no EGFR, IRK, JAK1, JAK3 o HCK. Estos estudios identificaron tres factores que pueden contribuir a la especificidad de LFM-A13 para BTK.

La molécula pequeña LFM-A13 se ancló en los dominios quinasa de IRK, HCK, JAK3 y EGFR. La tabla 2 muestra los grados de interacción, los valores K_{i} calculados, y los datos IC_{50} medidos para LFM-A13 con estas quinasas. Postulamos que la selectividad de LFM-A13 para BTK resulta de interacciones favorables con los residuos del sitio catalítico BTK que no están presentes en otras quinasas estudiadas. Hay algunos residuos en el sitio activo BTK que difieren a partir de aquellos de otros PTKs. Estas diferencias están ilustradas en la Figura 16 que muestra la representación del esqueleto del sitio catalítico BTK, las diferencias de residuos entre BTK y otras quinasas, y las posiciones ancladas de LFM-A13 en los dominios quinasa de BTK, HCK, JAK3, JAK1, EGFR, y IRK.

Se cree que las diferencias de residuos mostradas en las posiciones A, B, y C en la Figura 16 pueden contribuir a la especificidad de LFM-A13 para BTK. Las quinasas que no están inhibidas por LFM-A13, tales como IRK (gris) y JAK1/JAK3 (rosa) contienen un residuo metionina en la posición A que se proyecta en el sitio activo y previene el contacto cercano de moléculas pequeñas tales como LFM-A13 con la región de la hendidura del sitio de unión. Como resultado, LFM-A13 puede perder contacto hidrofóbico favorable con la región de la hendidura de los dominios quinasa de estas proteínas y no se une a esta tan firmemente. Además, los estudios de anclaje indicó que la posición favorable de LFM-A13 en el dominio quinasa BTK es tal que la cadena lateral de la molécula pequeña está localizado entre los residuos Asp^{539} y Arg^{525}, y forma enlaces de hidrógeno con ellos.

Además, un residuo aromático en la posición B de BTK aumenta la interacción hidrofóbica de la molécula LFM-A13 con el receptor, una interacción que está perdida en EGFR (rojo, Figura 16) y IRK (azul oscuro, Figura 16). Mientras que la puntuación Lipo estaba dentro de un rango entre 457 y 473 para otras quinasas, la puntuación Lipo para BTK fue más elevado (más favorable) a 517. Finalmente, el residuo Arg^{525} en la posición C de BTK puede unirse mediante hidrógeno a LFM-A13. Esta interacción se pierde en HCK (amarillo), que contiene una Ala en la posición C. La posición favorable de LFM-A13 en el dominio quinasa HCK (mostrado en amarillo) es tal que la molécula pequeña está alineada a lo largo de la región de la hendidura. A esta posición LFM-A13 no forma enlaces de hidrógeno con HCK, que no es el caso para BTK. La cadena lateral más larga de Arg^{525} en BTK (posición C) está implicado en la unión mediante hidrógeno con LFM-A13, mientras que HCK tiene una Ala en esta posición que no es capaz de formar el mismo enlace de hidrógeno.

LFM-A13 potencia la sensibilidad de las células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) de la línea B a la apoptosis inducida por vincristina y ceramida

Los Pacientes con el Cromosoma Filadelfia (Ph+) ALL tienen un resultado deprimente después de programas de tratamiento multimodalidad intensivos. El fallo del tratamiento de estos pacientes podría superarse si el umbral apoptóticos de sus células leucémicas descendiera. Nosotros partimos para determinar si LFM-A13, mediante la inhibición de la tirosinquinasa BTK anti-apoptótica, podría alterar la sensibilidad de la línea celular ALL Ph+ ALL-1 a C2-ceramida. Tal como se muestra en la Figura 17, el tratamiento con LFM-A13 potenció significativamente la quimiosensibilidad de la células ALL-1 a la apoptosis inducida por ceramida, tal como se evidencia mediante un elevado porcentaje de células tratadas con LFM-A13 más C2-ceramida, comparadas con células tratadas sólo con C2-ceramida o LFM-A13, mostrando fluorescencia PI/MC540 dual (mostrada en color azul) consistente con estadio avanzado de apoptosis. Además, en geles de agarosa, el DNA de los lisados Triton-X-100 de células B de linfoma de pollo B18.2 (esto es, células DT40 deficientes BTK reconstituidas con gen BTK humano de tipo salvaje; ver también la Figura 9), las células ALL pre-B humanas NALM-6, y células ALL-1 mostraron un modelo de fragmentación similar a escalera consistente en apoptosis después del tratamiento con LFM-Al3 más ceramida o LFM-A13 más vincristina, que era más pronunciado que después del tratamiento con LFM-A13, ceramida, o vincristina solamente (Figura 18). Estos resultados demostraron que LFM-A13 potencia la sensibilidad de las células de la línea B linfoma/leucemia tanto hacia la apoptosis inducida por vincristina como la inducida por ceramida.

Ejemplo 4 Modificaciones en DDE LFM-A13 para la inhibición de BTK

El siguiente ejemplo describe cómo el modelo homólogo anterior y la información relacionada con las diferencias entre el dominio de unión de BTK y otras proteíntirosinquinasas se utilizó para identificar compuestos adicionales de fórmula I que son inhibidores BTK específicos.

Las características químicas y estructurales de los análogos LFM que son propuestos para ayudar a la unión al sitio catalítico BTK están descritos seguidamente e ilustrados en las Figuras 20A-20C. El modo de Unión 1, (Figuras 20A-20B) muestra el modo más probable de unión al compuesto principal LFM-A13 al sitio catalítico BTK. Basado en las modificaciones del compuesto principal, un segundo modo de unión puede también ser posible, ilustrado en la Figura 20C (Modo de Unión 2).

La tabla 3 muestra las diferencias de residuo que el sitio de unión del ATP entre los diez PTK's: EGFR, Btk, Hck, Jak1, Jak3, IR, FGFR1, PDGFR9, VEGFR2 y Src.

TABLA 3

3

La comparación del bolsillo de unión del inhibidor de BTK con el de EGFR, Hck, Jak1, Jak3, IR, FGFR1, PDGFR\beta, VEGFR2, y Src muestra que SER 538 en la hendidura de la unión a ATP de BTK es única (Tabla 3), y una diana para el diseño de inhibidores BTK específicos. Los ligandos diseñados para interactuar con este residuo deberían tener especificidad aumentada para BTK. La Figura 20B muestra las distancias (en angstroms) de los grupos NH, =O y OH del ligando LFM-13 anclado a partir de SER 538. Cuando miramos en la hendidura de unión BTK con el anillo aromático del ligando enfrentado y la cadena estando hacia dentro, este residuo está localizado debajo del ligando. Las sustituciones de cadena simple, no planar que acaban con O o N y que tienen las longitudes adecuadas (Figura 20B) en los grupos NH, =O, y OH debería permitir la formación de enlaces de hidrógeno con Ser 538. Basándonos en esta observación y datos biológicos y de modelados para los 13 análogos del metabolito leflunomida descritos arriba, los compuestos adicionales de fórmula I pueden estar diseñados para interactuar mejor con el bolsillo de unión que se espera que lo hagan los inhibidores de BTK.

Ejemplo 5 Análogos de segunda generación LFM

El siguiente ejemplo describe cómo los compuestos nuevos de fórmula I diseñados para apuntar a SER 538 están diseñados y preparados.

Utilizando los parámetros de diseño descritos en las Figuras 20A-20-B, una segunda generación de análogos LFM (LFM- A15-20) se diseñaron y sintetizaron. Los compuestos tienen la siguiente fórmula estructural:

4

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5

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9

10

El siguiente esquema sintético y el mostrado en la Figura 19 se utilizaron para generar los compuestos

Esquema

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Procedimiento Sintético A. 1,3-Diisopropilcarbodiimida (1,75 g; 13,9 mmol) se añadió a una solución de ácido cianoacético 1 (1,70 g; 20,0 mmol) y la anilina sustituida deseada 2 (12,6 mmol) en tetrahidrofurano (25 mL) a 0ºC. La mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente El precipitado de urea (producto secundario de reacción) se eliminó mediante filtración y se partió entre acetato de etilo y 0,5 N HCl. La fase orgánica se lavó secuencialmente con salmuera dos veces, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró mediante evaporación rotatoria. Finalmente, el producto sólido crudo se recristalizó a partir de alcohol etílico para dar 3 puro. El hidruro sódico (0,93 g; 60% en aceite mineral; 23,2 mmol) se añadió lentamente a la solución de 3 (12,0 mmol) en tetrahidrofurano (40 mL) a 0ºC. Después de agitar durante 30 minutos a 0ºC, se añadió cloruro de acetilo (1,04g; 13,2 mmol) se añadió a la mezcla de reacción. La reacción continuó durante otra hora y entonces se paró mediante la adición de ácido acético (2 mL). La mezcla se vertió en agua helada (100 mL) conteniendo 2,5 ml, de ácido clorhídrico para precipitar el producto crudo, que se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El producto puro se obtuvo mediante recristalización.

Procedimiento Sintético B. \alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[(metiltio)fenil]propenamida (2,48g, 10,0 mmol) se disolvió en ácido acético (150 mL), y se añadió ácido peracético (8,6 mL de 32% p solución en ácido acético). La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, y se le añadió agua (75 mL). El precipitado se filtró y lavó con agua. El producto puro se obtuvo mediante recristalización.

Datos físicos para compuestos sintetizados

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[4-(metilsulfonil)fenil]-propenamida. Punto de fusión: 205-206ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,26(s, 1H, NH), 7,81 (d, J= 9,0 Hz, 2H, ArH), 7,76 (d, 9,0 Hz, 2H, ArH). 3,15 (s, 3H, SO_{2}CH_{3}). IR (KBr): 3309, 2225. 1643 y 1586 cm^{-1}. MS (EI): m/z 281,0 (M + H^{+}), 172,1.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[3-(metilsulfonil)fenil]-propenamida. Punto de fusión: 213-214ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,98 (s, 1H, NH), 8,18 (m, 1H, ArH), 7,82 (m, 1 H, ArH), 7,60 (m, 2H, ArH), 3,18 (s, 3H, SO_{2}CH_{3}). IR (KBr): 3278, 2231, 1607 y 1555 cm^{-1}. Ms (EI): m/z 281,0 (M + H^{+}), 172,1.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-[3-bromo-4-(trifluoro-metoxi)fenil]propenamida. Punto de fusión: 178-179ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11.03 (s, 1H, NH), 8,12 (d, J + 2,4 Hz, 1H, ArH), 7,55 (dd, J= 2,4, 9,0 Hz, 1H, ArH). 7,45 (m, 1H, ArH), 5,53 (s br, 1H, OH). 2,20 (s, 3H, CH_{3}). IR (KBr): 3304, 2350, 1620 y 1602 cm^{-1}. MS (EI): m/z 365,0 (M+H^{+}), 225,9.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-dibromofenil)-propenamida. Punto de fusión: 181-182ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,03 (s, 1H, NH), 8,14 (m, 1H, ArH), 7,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H, ArH), 7,51 (dd, J= 2,4, 9,0 Hz, 1H, ArH), 5,65 (s br, 1H, OH), 2,20 (s, 3H, CH_{3}). IR (KBr): 3360, 2205, 1591 y 1530 cm^{-1}. MS (EI): m/z 361,0 (M + H^{+}), 249,9.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,4-diclorofenil)-propenamida. Punto de fusión: 143-144ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,23 (s, 1H, NH), 8,29 (m, 1H, ArH), 7,6 (d, J= 2,4Hz, 1H, ArH). 7,35 (dd, J= 2,4, 9,0 Hz, 1H, ArH), 5,17 (s br, 1H, OH), 2,18 (s, 3H, CH_{3}). IR (KBr): 3371, 2210, 1601 y 1540 cm^{-1}. MS (EI): m/z 371,0 (M^{+}), 162.0.

\alpha-Ciano-\beta-hidroxi-\beta-metil-N-(2,5-diclorofenil)-propenamida. Punto de fusión: 143-144ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 11,70 (s, 1H, NH), 8,51 (d,J= 3,0 Hz, 1H, ArH), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 1 H, ArH), 7,05 (dd, J= 3,0, 8,7 Hz, 1H, ArH), 4,97 (s br, 1H, OH), 2,14 (s, 3H, CH_{3}). IR (KBr): 3402, 2205, 1627 y 1606 cm^{-1}. MS (EI): m/z 271 (M^{+}), 162,0.

TABLA 4 Grados de interacción, valores K_{i} estimados y datos IC_{50} medidos para análogos LFM con BTK

12

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13

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm} ^{a} M.S., área de la superficie
molecular calculada utilizando el programa Connolly's MS. Definido
como un límite del volumen en cualquier esfera de sonda  (teniendo
la intención de representar una molécula de agua) de un radio dado
sin  compartir volumen con los átomos de la esfera duros que
constituyen la
molécula.\end{minipage} \cr}

La segunda generación de análogos LFM se evaluaron por interacción con el modelo de bolsillo de unión BTK, y se evaluaron para actividad inhibitoria contra BTK tal como se describe en el Ejemplo anterior. Los datos se muestran en la Tabla 4, y demuestran que estos compuestos nuevos son potentes inhibidores de BTK.

Ejemplo 7 Diseños de nuevo inhibidor BTK

La Figura muestra las características de unión comunes a 5,7-dihidroxi-8-propanoil-4-propil-2H-1-benzopiran-2-ona (sólo para comparar) y LFM-A13, basado en el anclaje de los compuesto en el sitio de unión ATP de BTK. Ambos inhibidores contienen grupos de unión a hidrógeno (OH, CN) posicionados para interactuar con Arg 525 y Asp 539. Se diseñaron diseños de compuestos que mejor ocupan el bolsillo de unión e interactúan favorablemente con residuos adecuados en el bolsillo.

Estos compuestos, debido a su volumen incrementado y grupos diseñados para interactuar con el residuo de bolsillo de unión, se espera que tengan potente actividad inhibitoria BTK.

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TABLA 1 Grados de interacción, valores K_{i} calculados y valores IC_{50} medidos para análogos LFM con BTK

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15

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm} ^{a} M.S., el área de superficie
molecular definida como un límite de volumen en cualquier esfera de
sonda (teniendo la intención de representar una molécula  de agua)
de un radio dado sin compartir volumen con átomos de esfera que
constituyen la molécula.  ^{b} B.S., superficie enterrada:
superficie molecular  en contacto con la proteína calculada por Ludi
basado en las posiciones  ancladas.  ^{c} Ludi  K_{i}  calculado
basado en la función de la puntuación  empírica en el programa
Ludi.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{145mm} ^{d} Los ensayos de inhibición BTK
libre de células se realizaron en 3 experimentos independientes en
BTK inmunoprecipitado a partir de células B18.2 y  se expusieron a
LFM y análogos de LFM durante 1 hora antes del ensayo quinasa en
caliente. A excepción de LFM-A13, ninguno de los
compuestos  inhibieron BTK en ninguno de los experimentos aún a
concentraciones tan elevadas  como 100  \mu g/ml
(349-495  \mu M), y la representación de los datos
de estos  compuestos sirve sólo para propósitos
comparativos.\end{minipage} \cr}

TABLA 2 Puntuación de interacción, valores K_{i} calculados y valores IC_{50} para LFM-13 con varios PTKs diferentes

16

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm} ^{a} M.S., área de superficie
molecular calculada como límite de volumen en cualquier esfera de
sonda (teniendo la intención de representar una molécula de  agua)
de un radio sin compartir volumen con átomos de esfera duros que 
constituyen la molécula.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{145mm} ^{b} B.S., superficie enterrada:
porcentaje de superficie molecular en contacto con proteína
calculado por Ludi basado en las posiciones
ancladas.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{145mm} ^{c} Ludi K _{i}  calculado basado
en la función de puntuación empírica en el programa de
Ludi.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{145mm} ^{d} Los ensayos de inhibición de la
tirosínquinasa libres de células se realizaron en
2-3 experimentos independientes, tal como se
describe en la  sección de Métodos. El LFM-A13 no
inhibió JAK1, JAK3, IRK, EGFR, o HCK en  ninguno de los experimentos
aún en concentraciones tan elevadas como 100   \mu g/ml (278
 \mu M). Los resultados de un experimento representativo están 
descritos en la Figura
15.\end{minipage} \cr}

Claims

1. El uso de un compuesto de fórmula I:

17

en donde:

: R_{1} es (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{3}-C_{6})cicloalquilo, fenilo, o NR_{a}R_{b};

: R_{2} es hidroxilo, (C_{1}-C_{6})alcoxilo, (C_{1}-C_{6})alcanoiloxilo, amino(C_{2}-C_{5})alcoxilo; hidroxi(C_{2}-C_{5})alcoxilo, amino(C_{2}-C_{5})alcanoiloxilo; o hidroxi(C_{2}-C_{5})alcanoiloxilo;

: R_{3} es ciano o (C_{1}-C_{3})alcanoilo;

: R_{4} es hidrógeno, (C_{1}-C_{3})alquilo; hidroxi(C_{2}-C_{5})alquilo; o amino (C_{2}-C_{5})alquilo;

: R_{5} es fenilo sustituido por -S(O)_{2}R_{c}, o por halo y al menos otro sustituyente;

: R_{a} y R_{b} son cada uno independientemente hidrógeno, o (C_{1}-C_{3})alquilo; o R_{a} y R_{b} junto con el nitrógeno al que están unidos son pirrolidino, piperidino, morfolino, o tiomorfolino;

: en donde cualquier fenilo de R_{1} y R_{5} está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados a partir de halo, nitro, ciano, hidroxilo, trifluorometilo, trifluorometoxilo, (C_{1}-C_{3})alcoxilo, (C_{1}-C_{3})alquilo, (C_{1}-C_{3})alcanoilo, -S(O)_{2}R_{c}, y NR_{a}R_{b};

: en donde R_{c} es (C_{1}-C_{3})alquilo, o arilo

: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

para la preparación de un medicamento para tratar una condición o enfermedad en la que la actividad de la Tirosínquinasa de Bruton está implicada, dicha condición o enfermedad siendo seleccionada a partir de enfermedades autoinmunes/trastornos linfoproliferativos de células B, trastornos de los mastocitos, condiciones relacionadas con la agregación plaquetaria inadecuada, y rechazo de xenotransplantes.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la condición o enfermedad en la que la actividad de la Tirosínquinasa de Bruton está implicada es alergia.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la condición o enfermedad en la que la actividad de la Tironsínquinasa de Bruton está implicada en choque anafiláctico.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la condición o enfermedad en la que la actividad de la Tirosínquinasa de Bruton está implicada es agregación plaquetaria inadecuada.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{1} es C_{1-3}alquilo, R_{2} es hidroxilo y R_{3} es ciano.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{1} es metilo.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto comprende al menos uno de:

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o

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y una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto comprende

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.