ES2251407T3 - Compuestos inhibidores dela pdfg-receptor-quinasa, su obtencion, purificacion y composicion farmaceuticas que los contienen. - Google Patents

Abstract

Un isómero de tirfostina sustancialmente purificado de la **fórmula** en la que 4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican posiciones del anillo aromático terminal de 6 eslabones; A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno; B es un carbono; la línea de puntos en el anillo de cinco eslabones significa que el enlace A--B o el enlace B--D es un doble enlace; cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno participa en el doble enlace, entonces R1 o R3, respectivamente, es un par de electrones; cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno no participa en el doble enlace, R1 o R3 se elige entre el grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbo nilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo; R5 y R7 se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C- carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones; y una sal fisiológicamente aceptable; mientras que dicho R6 ocupa la posición 6; con la condición de que, para el compuesto I, el isómero de tirfostina es capaz de inhibir la actividad de la PDGF- receptor-quinasa.

Description

Compuestos inhibidores de la PDGF-receptor-quinasa, su obtención, purificación y composición farmacéuticas que los contienen.

La presente invención se refiere a un isómero de tirfostina sustancialmente purificado según la reivindicación 1, a una composición farmacéutica según la reivindicación 4, al uso de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 8 y 18, a un método para enriquecer una tirfostina según la reivindicación 26, a un dispositivo de fijación (stent) según la reivindicación 32.

La presente invención se refiere a compuestos inhibidores de la PDGF-receptor-quinasa y a composiciones farmacéuticas tales como, pero sin limitarse a ellas, las composiciones de liberación lenta. La presente invención se refiere más en particular a isómeros geométricos enriquecidos o purificados de compuestos del grupo de la quinoxalina, conocidos como inhibidores de la PDGF-receptor-quinasa, a composiciones que los contienen, a métodos para sintetizarlos, purificarlos y formularlos y a su utilización para el tratamiento de enfermedades o trastornos malignos y no malignos, tales como, pero sin limitarse a ellos, la psoriasis, la cirrosis hepática, la diabetes, la arteriosclerosis, la restenosis, la restenosis de injerto vascular, la estenosis "in-stent", angiogénesis, enfermedades oculares, fibrosis pulmonar, bronquiolitis obliterativa, nefritis glomerular, artritis reumatoide y enfermedades malignas asociadas con el receptor de PDGF, por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, las leucemias y los linfo-
mas.

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un potente mitógeno para las células mesenquimales, gliales y endoteliales capilares (para la revisión del tema, véase [1] y [2]). Las tres isoformas del PDGF, la PDGF-AA, la PDGF-AB y la PDGF-BB, interaccionan de diferente manera con los receptores estructuralmente afines, denominados receptores \alpha y \beta del PDGF. Cada uno de estos receptores tiene una parte extracelular que posee cinco dominios de tipo inmunoglobulina, un dominio transmembrana lipófilo y una parte intracelular con un dominio tirosina-quinasa que contiene una secuencia de aminoácidos insertados característica [3-5]. La actividad de tirosina-quinasa de estos receptores es esencial para la transmisión de la señal mitogénica a la célula [6].

El PDGF y sus receptores participan en varios procesos fisiológicos, tales como el desarrollo embrionario y la curación de las heridas. Se cree que una actividad anormalmente alta del PDGF desempeña un papel fundamental en la etiología de ciertos estados patofisiológicos adversos, tales como la arteriosclerosis y la restenosis [7, 8], así como en otras enfermedades no malignas, por ejemplo la fibrosis pulmonar [9], la nefritis glomerular [10] y la artritis reumatoide [11]. Además, la cadena B del PDGF se detecta como el oncogén "sis" por transformación aguda del virus del sarcoma de los simios [12, 13]. La expresión de un factor de crecimiento similar al PDGF en células infectadas con el virus del sarcoma de los simios o transfectadas con el oncogén "sis" conduce a su transformación debida a la persistente estimulación autocrina de los receptores de PDGF residentes.

Además, ciertos tumores humanos poseen receptores PDGF y expresan los genes en el PDGF, lo cual sugiere que la estimulación autocrina del crecimiento mediante los receptores PDGF contribuye al fenotipo maligno de estos tumores [2, 14].

El hecho de que el PDGF sea capaz de intervenir en el desarrollo de ciertos trastornos ha propiciado la investigación de agentes que bloquean la acción del PDGF. Los intentos de interferir con la señalización inducida por el PDGF incluyen a péptidos que compiten con el PDGF por la fijación del receptor [15], mutantes negativos dominantes del PDGF [16, 17] o del receptor de PDGF [18] y bloqueadores de bajo peso molecular de la actividad de la receptor-tirosina-quinasa conocidos como tirfostinas [19, WO-A-99/07701].

Ya se han descrito ciertas tirfostinas que bloquean la proliferación dependiente del PDGF en las células de músculos lisos vasculares en el conejo [20] y de fibroblastos de médula ósea humana [21].

Kovalenko y col. [22] han descrito un nuevo grupo de bloqueadores de tirosina-quinasa representados por las tirfostinas AG1295 y AG1296. Estos compuestos inhiben selectivamente la quinasas del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la síntesis de DNA dependiente del PDGF en las células Swiss 3T3 y en las células endoteliales de aorta porcina (EC) con concentraciones inhibidoras del 50% por debajo de 5 y 1 \muM, respectivamente. Estos bloqueadores de receptores de PDGF no tienen efecto sobre la autofosforilación de receptores de factor de crecimiento epidérmico, leves efectos en la síntesis de DNA estimulada por la insulina, por el factor de crecimiento epidérmico o por una combinación de ambos y un efecto bloqueador más débil en un orden de magnitud sobre la síntesis de DNA dependiente del factor de crecimiento de fibroblastos.

La AG1296 inhibe potentemente la señalización de los receptores \alpha y \beta de PDGF humanos así como del receptor afín de factor celular germinal (c-Kit), pero no tienen efecto en la autofosforilación del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular KDR ni en la síntesis del DNA inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular en las células endoteliales aórticas porcinas. El tratamiento con la AG1296 invierte el fenotipo transformado de las células NIH 3T3 transfectadas "sis" pero no tiene efecto en las células NIH 3T3 transformadas "src" ni en la actividad de la quinasa p60c-src (F527) inmunoprecipitada a partir de estas células [22].

\newpage

En el documento US-A-5 932 580, presentado con fecha 1 de diciembre de 1997, se describen más inhibidores de PDGF-receptor-quinasa de peso molecular bajo, pertenecientes al grupo de las quinoxalinas. En concreto se indica que análogos sustituidos de la 1,2-dimetil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina inhiben selectivamente las autofosforilaciones del PDGFR y la proliferación de las células que expresan el PDGFR, por ejemplo las células de músculo liso arterial porcino (SMC), las células endoteliales porcinas y las SMC de arteria mamaria interna humana, en un intervalo de concentraciones del orden de \muM.

En Acta Pharmaceutica Turcia, vol. 40, pp. 193-6 (1998) se describe la síntesis de algunos derivados de la imidazo[4,5-g]quinoxalina sustituida en posiciones 6 y 7 como posibles agentes antimicrobianos.

En WO-A-99/07701 se describen compuestos tricíclicos de quinoxalina y sales y profármacos fisiológicamente aceptables de los mismos que modulan la actividad de proteína-tirosina-quinasas y por lo tanto podrían ser útiles para prevenir y tratar los trastornos celulares relacionados con la proteína-tirosina-quinasa, por ejemplo el cáncer.

En el WO-A-99/28304 se describen compuestos inhibidores de la PDGF-receptor-quinasa del grupo de las quinoxalinas, métodos para su síntesis y la incorporación de los mismos en preparaciones farmacéuticas de liberación lenta, así como su uso para el tratamiento de enfermedades y trastornos proliferantes malignos y no malignos mediante una aplicación local o sistémica. Un compuesto según la invención incluye una tirfostina de la fórmula general (I), en la que R1 y R2 se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por alquilo, halógeno, nitro y amina y Ar se elige entre el grupo formado por fenilo, ferroceno, tiofeno, furano, pirrol, indol, tiazol, imidazol y piridina.

La presente invención describe isómeros geométricos enriquecidos o purificados de compuestos del grupo de la quinoxalina, conocidos por ser inhibidores de la PDGF-receptor-quinasa, composiciones que incluyen los mismos, métodos para su síntesis, purificación y formulación y uso de los mismos para el tratamiento de trastornos o enfermedades proliferantes malignos y no malignos, que presentan una actividad diferencial con respecto a la PDGF-receptor-quinasa. Se ha puesto de manifiesto por primera vez que los isómeros geométricos de estos compuestos pertenecientes a las quinoxalinas son producibles, purificables isoméricamente y que tienen una afinidad diferencial con respecto a la PDGF-receptor-quinasa.

El isómero de tirfostina sustancialmente purificado se define en la reivindicación 1, la composición farmacéutica se define en la reivindicación 4, el uso de la composición farmacéutica se define en las reivindicaciones 8 y 18, el método para enriquecer la tirfostina se define en la reivindicación 26, el dispositivo de fijación (stent) se define en la reivindicación 32.

Es un objeto de la presente invención el proporcionar compuestos inhibidores de la PDGDF-receptor-quinasa pertenecientes al grupo de las quinoxalinas, métodos para la síntesis y purificación e incorporación de los mismos por ejemplo a composiciones farmacéuticas de liberación lenta y el uso de los mismos para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades y trastornos mediante la aplicación local o sistémica.

Según un aspecto de la presente invención se proporciona una preparación de una tirfostina que contiene un compuesto de las fórmulas generales:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(compuesto I)

o

\newpage

2

(compuesto II)

en las que

4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican las posiciones sobre el anillo terminal de 6 eslabones;

A, B, D, X e Y son en cada caso nitrógeno,

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5} y R_{7} se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones, o como alternativa, R_{1} y R_{2} o R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5-7 eslabones;

R_{6} se elige entre el grupo formado por alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y una sal fisiológicamente aceptable o un profármaco de los mismos;

R_{4} y R_{8} se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptables del mismo;

R_{10} y R_{11} se eligen con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable de los mismos;

mientras que dicho R_{6} ocupa la posición 6.

Según otras características de formas preferidas de ejecución de la invención que se describen a continuación, A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno; B es un carbono; R_{1} y R_{2} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo, alcoxi, halógeno, nitro y amino; R_{3}, R_{5} y R_{7} son en cada caso un par de electrones; R_{6} es un arilo elegido entre el grupo formado por fenilo, ferroceno, tiofeno, furano, pirrol, indol, tiazol, imidazol y piridina.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas

R_{1} y R_{2} son en cada caso metilo; R_{4} y R_{8} son en cada caso hidrógeno.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, la obtención está enriquecida en el compuesto I en el que R_{6} ocupa la posición 6.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, la preparación está enriquecida en el compuesto II en el que R_{6} ocupa la posición 6.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, la preparación descrita en esta memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas de la invención descritas a continuación, el excipiente farmacéuticamente aceptable es un excipiente de liberación lenta.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el excipiente de liberación lenta es un ácido poliláctico.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado con una proteína-tirosina-quinasa en un organismo, el método consiste en el paso de administrar al organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita en esta solicitud.

Según otras características de formas de ejecución preferidas de la invención descritas a continuación, el trastorno relacionado con la proteína-tirosina-quinasa se elige entre el grupo formado por un trastorno relacionado con el EGF, un trastorno relacionado con el PDGF, un trastorno relacionado con el IGF y un trastorno relacionado con las met.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el trastorno relacionado con la proteína-tirosina-quinasa se elige entre el grupo formado por un trastorno proliferante celular, un trastorno fibrótico y un trastorno metabólico.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el trastorno proliferante celular se elige entre el grupo formado por el papilloma, el blastoglioma, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovarios, el cáncer de próstata, el carcinoma celular escamoso, el astrocitoma, el cáncer de cabeza, el cáncer de cuello, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, el cáncer de tiroides, el cáncer de páncreas, el cáncer gástrico, el carcinoma hepatocelular, la leucemia, el linfoma, la enfermedad de Hodgkin, la enfermedad de Burkitt, la artritis, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la angiogénesis, la restenosis, la restenosis "in-stent", la restenosis de injerto vascular.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el trastorno fibrótico celular se elige entre el grupo formado por la fibrosis pulmonar, la cirrosis hepática, la arteriosclerosis, la glomerulonefritis, la nefropatía diabética, los síndromes de microangiopatía trombótica, el rechazo de trasplante.

Según otras características de formas de ejecución preferidas descritas, el trastorno metabólico celular se elige entre el grupo formado por la psoriasis, la diabetes, la curación de heridas, la inflamación y las enfermedades neurodegenerativas.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el organismo es un mamífero.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas descritas, el mamífero es una persona humana.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento o prevención local de un trastorno de un tejido de un organismo, que consiste en el paso de la aplicación local de la composición farmacéutica descrita a un tejido.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas de la invención descritas a continuación, el tejido se elige entre el grupo formado por un vaso sanguíneo, el pulmón y la piel.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para inhibir la proliferación celular que consiste en el paso de someter las células a la preparación de la tirfostina descrita en esta solicitud.

Según otras características de las formas de ejecución preferidas de la invención descritas a continuación, las células son de un organismo, mientras que someter las células a la preparación se efectúa "in vivo" o "in vitro".

Según otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de enriquecimiento de una preparación de tirfostina con un isómero geométrico específico, el método consiste en (a) el paso de cromatografiar la preparación a través de una matriz, con lo cual se separan los isómeros de la preparación; (b) el paso de recoger por lo menos un isómero específico. Opcionalmente, el método consta además del paso (c) de cristalizar por lo menos un isómero específico.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica de liberación lenta de una tirfostina que consiste en los pasos de (a) proporcionar una preparación enriquecida en un isómero descrita en esta solicitud; (b) disolver o dispersar un excipiente de liberación lenta y una preparación de tirfostina enriquecida en un isómero en un disolvente orgánico para obtener una solución orgánica que contiene el excipiente y la preparación de tirfostina enriquecida en un isómero; (c) añadir la solución orgánica a una solución acuosa para obtener una emulsión del tipo aceite en agua; y (d) evaporar el disolvente orgánico de la emulsión del tipo aceite en agua para obtener una suspensión coloidal de partículas que contienen el excipiente de liberación lenta y la preparación de tirfostina enriquecida en un isómero.

Según otras características de formas de ejecución preferidas de la invención descritas a continuación, el excipiente de liberación lenta es un ácido poliláctico.

Según otro aspecto de la presente invención se proporcionar un dispositivo de fijación (stent) que consiste en una estructura sustancialmente tubular, dicha estructura es un material diseñado para la liberación lenta de una preparación de tirfostina, descrita en esta solicitud.

La presente invención se dirige con éxito a soluciones a corto plazo de configuraciones ya conocidas actualmente mediante la aportación de tirfostinas y sistemas de liberación nuevos y potentes para el tratamiento de una gran variedad de trastornos y enfermedades.

La invención se describe solamente a título ilustrativo con referencia a las figuras que acompañan, en las que:

En la figura 1 se representan dos perspectivas de una estructura de unidad cristalina celular del isómero geométrico purificado AG2043 (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina);

En las figuras 2a-b se presenta la estructura molecular del isómero geométrico AG2043 (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina) según la presente invención;

En la figura 3 se representan dos perspectivas de una estructura de unidad cristalina celular del isómero geométrico purificado AG2044 (1,2-dimetil-7-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina);

En las figuras 4a-b se presenta la estructura molecular del isómero geómetrico AG2044 (1,2-dimetil-7-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina) según la presente invención;

En la figura 5 se presentan los radiogramas que demuestran la inhibición de la autofosforilación del PDGFR en un sistema exento de células, derivado de membranas de células Swiss 3T3 por acción de los isómeros purificados del AG2033 (1,2-dimetil-6-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina) y del AG2043 (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina);

En la figura 6 se presenta una curva de respuesta a la dosis del efecto inhibidor del AG2033 (1,2-dimetil-6-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina) en la autofosforilación del PDGFR;

En la figura 7 se presenta una curva de respuesta a la dosis del efecto inhibidor del AG2043 (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina) en la autofosforilación del PDGFR;

En la figura 8 se presentan radiogramas que demuestran la inhibición de la autofosforilación del PDGFR en células Swiss 3T3 intactas comparando cada par de isómeros, el AG2033 y el AG2034 (1,2-dimetil-6-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina) y (1,2-dimetil-7-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina); el AG2043 y el AG2044 (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina) y (1,2-dimetil-7-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina), respectivamente.

En la figura 9 se presenta curvas que demuestran los efectos inhibidores y de recuperación de los isómeros AG2043 y AG2044 purificados (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina) y (1,2-dimetil-7-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina), respectivamente, en la proliferación de las SMC porcinas;

En la figura 10 se presenta una gráfica de columnas que demuestra el efecto inhibidor del isómero AG2033 purificado, la (1,2-dimetil-6-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina), sobre las migración de las células SMC de la arteria coronaria humana (HCASMC); y

En la figura 11 se presenta una gráfica de columnas que demuestra el efecto inhibidor del isómero AG2043 purificado, la (1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)imidazolo[5,4-g]quinoxalina), sobre las migración de las células SMC de la arteria coronaria humana (HCASMC).

La presente invención se refiere a derivados de quinoxalina, isómeros de los cuales modulan la actividad de las proteína-tirosina-quinasas (PTK). Esta puede incluir trastornos asociados con los receptores de tirosina-quinasa, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, el PDGFR, el EGFR, el IGFR y el FGFR. La presente invención se refiere más específicamente a isómeros geométricos enriquecidos o purificados de los compuestos del grupo de las quinoxalinas conocidos como inhibidores de la PDGFR-receptor-quinasa, composiciones que los contienen, métodos para su síntesis, purificación y formulación y uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades proliferantes malignas y no malignas, trastornos metabólicos o fibróticos, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, la psoriasis, la cirrosis hepática, la diabetes, la arteriosclerosis, la restenosis, la restenosis de injerto vascular, la estenosis "in-stent", la angiogénesis, las enfermedades oculares, la fibrosis pulmonar, la nefritis glomerular y la artritis reumatoide, y loas enfermedades malignas asociadas con el receptor del PDGF, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, las leucemias y los linfomas, mediante la aplicación local o sistémica de las preparaciones y composiciones de la invención.

En el momento de concebir la presente invención se constató que como resultado del procedimiento de síntesis química de ciertas quinoxalinas se obtienen diversos productos isómeros del compuesto quinoxalina. Más específicamente, la sustitución en el anillo terminal de 6 eslabones puede dirigirse a dos posiciones alternativas. Por ello, se supone que puede haber diferencias potenciales entre las potencias y las selectividades de los isómeros específicos, que pueden dar lugar a un bloqueo diferencial de la activación del receptor del PDGF y a la consiguiente inhibición por ejemplo de la activación, migración y proliferación de las SMC.

Los ensayos descritos a continuación en la sección de los ejemplos ponen de manifiesto que se forman realmente los dos isómeros posibles y que son separables. Además, se constata que la inhibición mediada por la tirfostina de la autofosforilación del receptor de PDGF se traduce en una inhibición selectiva de la proliferación y de la migración de células SMC y de células PAEC que se expresan en el PDGFR "in vitro", con un efecto inhibidor mínimo en las células PAEC que se expresan en el KDR. Se pone de manifiesto además que los isómeros geométricos purificados de la tirfostina AG2033 y AG2043 poseen una potencia mayor bloqueando por completo la fosforilación del PDGF-\beta-R inducida por el PGDF-BB y su consiguiente proliferación, con respecto a sus isómeros opuestos, la AG2034 y la AG2044, respectivamente.

Preparaciones que contienen tirfostinas

Por consiguiente, una preparación según la presente invención incluye cualquier mezcla de productos sintéticos de la tirfostina de las fórmulas generales:

3

(compuesto I)

o bien

4

(compuesto II)

en las que

los números 4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican las posiciones sobre el anillo terminal de 6 eslabones;

las líneas de puntos indican un sistema aromático;

A, B, D, X e Y son en cada caso con independencia entre sí un átomo de carbono, de nitrógeno, de oxígeno o de azufre;

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5} y R_{7} son en cada caso con independencia entre sí hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones o, como alternativa, R_{1} y R_{2} o R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5-7 eslabones;

R_{6} es alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino o una sal fisiológicamente aceptable o un profármaco de los mismos;

R_{4} y R_{8} son en cada caso con independencia entre sí hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, nitro, azido, carbonilo, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptables del mismo;

R_{10} y R_{11} son en cada caso con independencia entre sí hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable de los mismos.

Ejemplos adicionales de sustituyentes R se encontrarán en el documento WO-A-99/07701 (ver tablas 1 y 2, páginas 20-27 y 34-35).

La preparación según la presente invención se enriquece con R_{6} en la posición 6 o con R_{6} en la posición 7 del compuesto I o bien la preparación se enriquece con R_{6} en la posición 6 o con R_{6} en la posición 8 del compuesto II.

Tal como se emplea en esta descripción y en la sección de las reivindicaciones que sigue, el término "profármaco" se refiere a un agente que se convierte "in vivo" en el fármaco activo original. Los profármacos son útiles a menudo porque en algunos casos pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco original. Por ejemplo, pueden ser biodisponibles por administración oral, mientras que el fármaco original no lo es. El profármaco puede tener además una solubilidad mejor que la del fármaco original en las composiciones farmacéuticas. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco sería un compuesto de la presente invención que se administre en forma de éster (el "profármaco") para facilitar la transmisión a través de la membrana celular, mientras que la solubilidad en agua no es beneficiosa, pero que se hidroliza metabólicamente para formar el ácido carboxílico una vez se halla en el interior de la célula, en la que la solubilidad en agua es beneficiosa.

Tal como se emplea en la descripción y en la sección de las reivindicaciones que sigue, el término "éster" indica un grupo -C-OO-R'', en el que R'' es alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono del anillo) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono del anillo).

Tal como se emplea en la descripción y en la sección de las reivindicaciones que sigue, la frase "sal fisiológicamente aceptable" significa una especie cargada del compuesto tirfostina y su contraión, de modo que no provoque una irritación significativa en el organismo y no merme la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado.

Tal como se emplea en la descripción y en la sección de las reivindicaciones que sigue, la frase "preparación enriquecida en un isómero" significa una preparación en la que un isómero se presenta en una proporción mayor que la proporción que resulta de la síntesis.

Tal como se emplea en la descripción y en la sección de las reivindicaciones que sigue, el término "alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena lineal o ramificada. El grupo alquilo tiene con preferencia de 1 a 20 átomos de carbono. Cuando se establece un margen numérico en esta descripción, p.ej. "1-20", se hace para significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo, pueden contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta incluir el caso de 20 átomos de carbono. Es con mayor preferencia un alquilo de talla media, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Es con preferencia especial un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser por ejemplo el cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, nitro, azido, carbonilo, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, halo, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxi, O-carboxi, nitro, sulfonamido, trihalometanosulfonamido, sililo, guanilo, guanidino, ureido, amino o NR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} con independencia entre sí son hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo, sulfonilo, trihalometanosulfonilo y, combinado, un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones.

Un grupo "cicloalquilo" significa un anillo monocíclico o fusionado exclusivamente carbonado (es decir, anillo que comparten un par de átomos de carbono adyacentes), en el que uno o varios de los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son el ciclopropano, el ciclobutano, el ciclopentano, el ciclopenteno, el ciclohexano, el ciclohexadieno, el cicloheptano, el cicloheptatrieno y el adamantano. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, un alquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, nitro, azido, carbonilo, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, halo, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, nitro, amino y NR_{10}R_{11}, ya definido antes.

Un grupo "alquenilo" significa un grupo alquilo que tiene por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Un grupo "alquinilo" indica un grupo alquilo que tiene por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un triple enlace carbono-carbono.

Un grupo "arilo" indica un grupo monocíclico o policíclico de anillos fusionados exclusivamente carbonados (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Son ejemplos, sin limitación, de grupos arilo el fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser por ejemplo halógeno, trihalometilo, alquilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, sulfinilo, sulfonilo, amino y NR_{10}R_{11}, ya definido antes.

Un grupo "heteroarilo" significa un anillo monocíclico o fusionado (es decir, anillos que comparten un parte adyacente de átomos) que tiene uno o varios átomos en el o en los anillos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno o azufre y, además, tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen el pirrol, el furano, el tiofeno, el imidazol, el oxazol, el tiazol, el pirazol, la piridina, la pirimidina, la quinolina, la isoquinolina y la purina. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, cicloalquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tiocarbonilo, sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, amino o NR_{10}R_{11}, ya definido
antes.

Un grupo "heteroalicíclico" significa un grupo monocíclico o de anillos fusionados que tiene en el o en los anillos uno o varios átomos tales como nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden tiene uno o varios dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. El heteroalicíclico puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el grupo sustituyente puede ser por ejemplo alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sulfinilo, sulfonilo, C-amido, N-amido, amino y NR_{10}R_{11}, ya definido antes.

Un grupo "hidroxi" indica un grupo -OH.

Un grupo "azido" indica un grupo -N=N.

Un grupo "alcoxi" indica tanto un grupo -O-alquilo como un grupo -O-cicloalquilo, definidos en la descripción.

Un grupo "ariloxi" indica un grupo -O-arilo o un grupo -O-heteroarilo, definidos en la descripción.

Un grupo "tiohidroxi" indica un grupo -SH.

Un grupo "tioalcoxi" indica un grupo -S-alquilo o bien un grupo -S-cicloalquilo, definidos en la descripción.

Un grupo "tioariloxi" indica un grupo -S-arilo o un grupo -S-heteroarilo, definidos en la descripción.

Un grupo "carbonilo" indica un grupo -C(=O)-R'', en el que R'' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono del anillo) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono del anillo), definidos en la descripción.

Un grupo "aldehído" significa un grupo carbonilo, en el que R'' es hidrógeno.

Un grupo "tiocarbonilo" significa un grupo -C(=S)-R'', en el que R'' tiene el significado definido.

Un grupo "C-carboxi" significa grupos -C(=O)-O-R'', en los que R'' tiene el significado definido.

Un grupo "O-carboxi" significa un grupo R''C(=O)-O-, en el que R'' tiene el significado definido.

Un grupo "ácido carboxílico" significa un grupo C-carboxilo, en el que R'' es hidrógeno.

Un grupo "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.

Un grupo "trihalometilo" significa un grupo -CX, en el que X es un grupo halógeno, ya definido.

Un grupo "trihalometanosulfonilo" significa un grupo X_{3}CS(=O)_{2}- en el que X es un grupo halógeno, ya definido.

Un grupo "sulfinilo" significa un grupo -S(=O)-R'', en el que R'' tiene el significado ya definido.

Un grupo "sulfonilo" significa un grupo -S(=O)_{2}-R'', en el que R'' tiene el significado ya definido.

Un grupo "S-sulfonamido" significa un grupo -S(=O)_{2}-NR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "N-sulfonamido" significa un grupo R_{10}(=O)_{2}-NR_{11}, en el que en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "trihalometanosulfonilo" significa un grupo X_{3}CS(=O)_{2}NR_{10}-, en el que R_{10} tiene el significado definido.

Un grupo "O-carbamilo" significa un grupo -OC(=O)-NR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "N-carbamilo" significa un grupo R_{11}OC(=O)-NR_{10}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "O-tiocarbamilo" significa un grupo -OC(=S)-NR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "N-tiocarbamilo" significa un grupo R_{11}OC(=S)NR_{10}-, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "amino" significa un grupo -NH_{2}.

Un grupo "C-amido" significa un grupo -C(=O)-NR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "N-amido" significa un grupo R_{11}C(=O)-NR_{10}, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "amonio cuaternario" significa un grupo -NHR_{10}R_{11}, en el que R_{10} y R_{11} con independencia entre sí son alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo.

Un grupo "ureido" significa un grupo -NR_{10}C(=O)-NR_{11}R_{12}, en el que en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos y R_{12} tiene el significado del R_{10} o el de R_{11}.

Un grupo "guanidino" significa un grupo -R_{10}NC(=N)-NR_{11}R_{12}, en el que R_{10}, R_{11} y R_{12} tienen los significados definidos.

Un grupo "guanilo" significa un grupo R_{10}R_{11}NC(=N)-, en el que R_{10} y R_{11} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "nitro" significa un grupo -NO_{2}.

Un grupo "ciano" significa un grupo -C\equivN.

Un grupo "sililo" significa un grupo -Si(R'')_{3}, en el que R'' tiene el significado ya definido.

Según una forma preferida de ejecución de la presente invención, A, D, X e Y son en cada caso nitrógeno; B es un carbono; R_{1} y R_{2} con independencia entre sí son alquilo, alcoxi, halógeno, nitro un grupo amina; R_{3}, R_{5} y R_{7} son en cada caso un par de electrones y R_{6} es un grupo arilo, por ejemplo fenilo, ferroceno, tiofeno, furano, pirrol, indol, tiazol, imidazol o piridina.

Según otra forma preferida de ejecución de la presente invención, R_{1} y R_{2} son en cada caso un metilo y R_{4} y R_{8} son en cada caso un hidrógeno.

El término "preparación de isómero purificado" significa en esta descripción una preparación que contiene sustancialmente el 100% de un isómero individual.

Enriquecimiento en un isómero

Según la presente invención se proporciona además un método para enriquecer la preparación de tirfostinas en un isómero geométrico específico tal como se describe en esta solicitud. El método comprende los pasos siguientes:

Primero, se cromatografía la preparación a través de una matriz, con lo cual se lograr separar los distintos isómeros.

Segundo, se recogen las fracciones de la cromatografía, de modo se obtiene por lo menos un isómero específico.

Tercero, puede efectuarse un paso opcional de cristalización de un isómero específico para lograr una pureza del 100% en la estructura cristalina.

Composiciones farmacéuticas

Según la presente invención se proporciona además una composición farmacéutica que contiene una preparación de tirfostina ya descrita anteriormente como ingrediente activo. La preparación según la presente invención puede administrarse a un organismo tal cual o en una composición farmacéutica, en la que se halla mezclada con excipientes o vehículos idóneos.

Tal como se emplea en esta descripción, una "composición farmacéutica" indica una preparación de uno o varios de los compuestos isómeros descritos, o sales o profármacos fisiológicamente aceptables de los mismos, junto con otros componentes químicos, tales como los vehículos y excipientes fisiológicamente idóneos. La finalidad de una composición farmacéutica consiste en facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

El término "ingrediente activo" significa una preparación de tirfostina o un compuesto capaz de producir un efecto biológico.

A continuación, los términos "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" que pueden utilizarse indistintamente indican un vehículo o diluyente que no provoca ninguna irritación significativa a un organismo y que no merma la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado.

El término "excipiente" indica una sustancia inerte que se añade a una composición farmacéutica para facilitar todavía más la administración de un compuesto. Los ejemplos de excipiente, no limitantes, incluyen el carbonato cálcico, el fosfato cálcico, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas de formulación y de administración de fármacos podrán encontrarse en el manual Remington, "Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora a esta como referencia.

Vías de administración

Las vías idóneas para la administración pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosal, intestinal o parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea e intramedular así como las inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal e intraocular.

Como alternativa, se puede administrar una preparación de tirfostina en una manera local con preferencia sobre la sistémica, por ejemplo mediante inyección de la preparación directamente a un tumor sólido, a menudo en una formulación "depot" o de liberación lenta, descrita a continuación.

Se puede administrar también el fármaco en un sistema de entrega dirigida, por ejemplo en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico del tumor. Los liposomas se dirigen y se absorben selectivamente en el tumor.

Composición - formulación

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse por procesos ya conocidos de la técnica, p.ej. mediante operaciones convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulado, oclusión y liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para utilizar con arreglo a la presente invención pueden formularse, pues, de modo convencional utilizando uno o varios vehículos y adyuvantes fisiológicamente aceptables que faciliten el procesado de los compuestos activos y su incorporación a las preparaciones, que puedan utilizarse farmacéuticamente. La formulación correcta dependerá de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los compuestos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, con preferencia en tampones fisiológicamente compatibles, por ejemplo en una solución de Hank, una solución de Ringer, o una solución salina fisiológica. Para la administración transmucosal pueden incorporarse a la formulación penetrantes idóneos para la barrera que se pretende atravesar. Tales penetrantes son conocidos en general en el ámbito técnico.

Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Tales vehículos facilitan que los compuestos de la invención puedan formularse en forma de tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral del paciente. Las preparaciones farmacológicas para el uso oral pueden fabricarse empleando un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla en forma de gránulos, añadiendo posteriormente los componentes auxiliares que se deseen, para obtener las tabletas o los núcleos de grageas. Los excipientes idóneos son, en particular, cargas de relleno, por ejemplo azúcares, incluidas la lactosa, la sucrosa, la manita y la sorbita; preparaciones de celulosa, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polímeros fisiológicamente aceptables, como son la polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden añadirse agentes desintegrantes, por ejemplo la polivinilpirrolidona reticulada, el agar o el ácido algínico o las sales del mismo, por ejemplo el alginato sódico.

Los núcleos de gragea se dotan de un recubrimiento apropiado. A tal fin se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de barniz y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes idóneos. Los colorantes o pigmentos pueden añadirse a las tabletas o al recubrimiento de las grageas para fines de identificación y de caracterización de las diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen las cápsulas resistentes a la presión, fabricadas con gelatina, así como las cápsulas selladas blandas, fabricadas con gelatina y un plastificante, por ejemplo la glicerina o la sorbita. Las cápsulas resistentes a la presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas de relleno, por ejemplo la lactosa, ligantes del tipo almidón, lubricantes del tipo talco o estearato magnésico y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos idóneos, por ejemplo aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Pueden añadirse además estabilizantes. Todas las formulaciones de administración oral deberían presentarse en dosificaciones idóneas para la vía de administración elegida.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos a utilizar según la presente invención se administran de modo conveniente en forma de un pulverizador de aerosol desde un envaso presurizado o un nebulizador que contiene un propelente adecuado, p.ej. el diclorodifluormetano, el triclorofluormetano, el diclorotetrafluoretano o el dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse dotándolo de una válvula para entregar una cantidad calibrada previamente. Las cápsulas y los cartuchos p.ej. de gelatina para el uso en un inhalador o en insuflador pueden formularse de modo que contengan una mezcla pulverulenta del compuesto y un polvo base idóneo, por ejemplo de lactosa o de almidón.

Las preparaciones descritas en esta invención pueden formularse para la administración parenteral, p.ej. por inyección de bolo o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, p.ej. en ampollas o en contenedores multidosis a los que opcionalmente se les añade un conservante. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden agentes que facilitan la formulación, por ejemplo agentes de suspensión, de estabilización y/o de dispersión.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Las suspensiones de compuestos activos pueden prepararse además en forma de suspensiones aceitosas apropiadas para la inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos apropiados incluyen los aceites grasos, por ejemplo el aceite de sésamo, o los ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo el oleato de etilo, los triglicéridos y los liposomas. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, por ejemplo la carboximetilcelulosa sódica, la sorbita o el dextrano. La suspensión pueden contener además opcionalmente estabilizantes idóneos o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir que la preparación se base en soluciones muy concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede presentarse en forma de polvo para la constitución antes del uso con un vehículo idóneo, p.ej. agua estéril, libre de pirógenos.

La preparación de la presente invención puede formularse también en forma de composiciones rectales, por ejemplo supositorios o enemas de retención, utilizando p.ej. bases convencionales de supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente puede formularse también una preparación de la presente invención para la administración local, por ejemplo una preparación "depot". Estas formulaciones de actuación prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este modo la preparación puede formularse, por ejemplo, con materiales poliméricos o hidrófobos idóneos (por ejemplo, en forma de emulsión en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio iónico, o con derivados escasamente solubles como son las sales escasamente solubles. Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir, pero no se limitan a, lociones, suspensiones, ungüentos, geles, cremas, gotas, líquidos, emulsiones pulverizables y polvos.

Según una forma preferida de ejecución de la presente invención, la composición farmacéutica se diseña para que tenga una liberación lenta de la preparación de tirfostina. La composición incluye partículas que incorporan un vehículo de liberación lenta (por ejemplo, un vehículo polimérico), por ejemplo el ácido poliláctico, y la preparación de tirfostina. Los vehículos biodegradables de liberación lenta ya son conocidos en la técnica. Tales materiales pueden adoptar la forma de partículas que pueden capturar en su interior uno o varios compuestos activos y degradarse/disolverse lentamente en un medio idóneo (p.ej. acuoso, ácido, básico, etc.) y de este modo degradar/disolver en los líquidos corporales y liberar el o los compuestos activos que contiene. Las partículas son con preferencia nanopartículas (es decir, de un diámetro del orden de nanómetros, comprendido entre 1 y 500 nm, con preferencia entre 50 y 200 nm y con preferencia especial en torno a los 100 nm).

Se proporciona también con arreglo a la presente invención un método de preparación de una composición farmacéutica para la liberación lenta de una tirfostina.

Este método comprende los pasos siguientes:

Primero, se proporciona una preparación de tirfostina enriquecida en un isómero, que contiene los compuestos descritos anteriormente.

Segundo, se disuelven o se dispersan un vehículo de liberación lenta (por ejemplo, un vehículo polimérico) y una preparación de tirfostina enriquecida en un isómero en un disolvente orgánico para obtener una solución orgánica que contenga un vehículo y una preparación de tirfostina enriquecida en un isómero.

Tercero, se añade la solución orgánica a una solución acuosa para obtener una emulsión de tipo aceite en agua. La solución acuosa incluye con preferencia uno o varios agentes tensioactivos.

Cuarto, se evapora el disolvente orgánico de la emulsión de tipo aceite en agua para obtener una suspensión coloidal de partículas que contienen el vehículo de liberación lenta y la preparación de tirfostina enriquecida en un isómero.

Según una forma preferida de ejecución de la presente invención, el vehículo de liberación lenta es un ácido poliláctico.

Se proporciona además según la presente invención un dispositivo de fijación (stent), que consta de una estructura sustancialmente tubular, esta estructura se fabrica o se recubre con un material diseñado para la liberación lenta de una preparación de tirfostina, ya descrita antes.

Específicamente, la formulación de liberación lenta de la preparación de tirfostina puede utilizarse en pacientes que sufren angioplasia de balón, despliegue de "stent", cirugía de "bypass" de la arteria coronaria y trasplante de corazón como proceso preventivo de la restenosis (véase a continuación el apartado "La bioquímica").

Las composiciones farmacéuticas descritas en esta solicitud pueden contener además vehículos o excipientes sólidos o de fase gel. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a: carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, por ejemplo polietilenglicoles.

Muchos de los compuestos moduladores de las PTK en las preparaciones reivindicadas de la presente invención pueden proporcionarse en forma de sales fisiológicamente aceptables, en las que el compuesto puede formar la especie cargada negativamente o la cargada positivamente. Los ejemplos de sales en las que el compuesto forma un resto cargado positivamente incluyen, pero no se limitan, las sales de amonio cuaternario (definidas en esta descripción), por ejemplo el clorhidrato, el sulfato, el carbonato, el lactato, el tartrato, el maleato, el succinato, etc. en las que el nitrógeno del grupo amonio cuaternario es un nitrógeno de un compuesto de la presente invención que reacciona con un ácido adecuado. Las sales en las que el compuesto forma el resto cargado negativamente incluyen, pero no se limitan, a las sales sódica, potásica, cálcica y magnésica formada por reacción con un ácido carboxílico en la molécula con la base apropiada (p.ej. hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido cálcico (Ca(OH)_{2}), etc.).

Dosificación

Las composiciones farmacéuticas idóneas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen las composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de la preparación de tirfostina eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto tratado.

La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz incumbe a la capacidad de los expertos en la materia, en especial a la luz de la descripción detallada en esta solicitud.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr una concentración circulante en un intervalo que incluya la IC_{50} determinada en un cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto ensayado que lograr una inhibición semimáxima de la actividad de la PTK). Tal información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles para las personas humanas.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descritos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, p.ej. determinando la IC_{50} y la LD_{50} (dosis letal que provoca la muerte del 50% de los animales experimentales) para un compuesto concreto. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y los estudios en animales pueden aprovecharse para formular un intervalo de dosificaciones para uso humano. La dosificación puede variar en función de la forma de dosificación elegida y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden elegirse a cargo del facultativo que atiende al enfermo, habida cuenta del estado de salud de este último (véase p.ej. Fingl y col., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1, p. 1, 1975).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para lograr niveles del compuesto activo en plasma que sean suficiente para mantener los efectos de modulación de la quinasa, denominados concentración eficaz mínima (MEC). La MEC puede variar para cada preparación, pero puede estimarse a partir de los datos "in vitro"; p.ej. la concentración necesaria para lograr una inhibición del 50-90% de una quinasa pueden hallarse empleando los métodos descritos en esta solicitud. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Los ensayos por cromatografía HPLC o los bioensayos pueden utilizarse para determinar las concentraciones en plasma.

Los intervalos de dosificación pueden determinarse también utilizando el valor MEC. Las preparaciones deberían administrarse siguiendo un régimen que mantenga los niveles en plasma por encima de la MEC durante el 10-90% del tiempo, con preferencia entre el 30 y el 90% y con preferencia especial entre el 50 y el 90%.

Ya se ha mencionado que, en el caso de administración local o de absorción selectiva, la concentración efectiva local del fármaco no puede referirse a la concentración en plasma. En tales casos, deberán emplearse otros procedimientos ya conocidos de la técnica para determinar la concentración eficaz local.

Dependiendo de la severidad y de la respuesta del estado patológico a tratar, la dosificación puede ser una administración única de una composición de liberación lenta, ya descrita antes, con un curso de tratamiento que dure desde varios días a varias semanas o hasta que se logre la curación o la disminución del estado patológico.

La cantidad de una composición a administrar dependerá como es obvio del sujeto a tratar, de la gravedad de la dolencia, del modo de administración, del criterio del facultativo que atiende al enfermo, etc.

Envase

Las composiciones de la presente invención pueden presentarse, si se desea, en un envase o un dispositivo dispensador, por ejemplo un kit aprobado por al FDA, que puede contener una o varias formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede ser por ejemplo una lámina metálica o de plástico, por ejemplo un envase de tipo blíster. El envase o el dispositivo dispensador puede ir acompañado de las instrucciones de administración. El envase o el dispositivo dispensador puede ir acompañado además por un prospecto asociado con el envase en la forma prescrita por el ministerio gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos, en dicho prospecto deberá reflejarse la aprobación de dicho ministerio en forma de composiciones para la administración a personas humanas o a animales. Dicho prospecto, por ejemplo, puede llevar el sello de aprobación de la U.S. Food and Drug Administration (FDA) para los fármacos de prescripción o el inserto de producto aprobado. Las composiciones que contienen una preparación de la invención, formuladas en un vehículo farmacéuticamente compatible, pueden fabricarse también, colocarse en un contenedor apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado patológico indicado. Los estados patológicos apropiados que se indican en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de una angiogénesis, el tratamiento de la fibrosis, la diabetes y similares.

La bioquímica

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a un método para la modulación de la actividad catalítica de las PTK. El método se lleva a cabo administrando una preparación de la presente invención o una sal o un profármaco fisiológicamente aceptables del mismo a una PTK.

Se entiende por "PTK" tanto las tirosina-quinasas de receptor (RTK) como las tirosina-quinasas celulares (CTK o no-receptor-TK); es decir, en la presente invención se contempla tanto la modulación de la transducción de señales de las RTK como la transducción de señales de las CTK.

El término "método" se refiere a las maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a la práctica un trabajo determinado e incluyen, pero no se limitan a aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos o fácilmente desarrollados a partir de las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los expertos en las ciencias química, farmacológica, biológica, biotécnica y médica.

Tal como se emplea en esta descripción, el término "modulación" indica la alteración de la actividad catalítica de las RTK y/o de las CTK. La modulación se refiere en particular a la inhibición de la actividad catalítica de las RTK y/o de las CTK.

El término "actividad catalítica" empleado en esta descripción indica la velocidad de fosforilación de la tirosina bajo la influencia directa o indirecta de las RTK y/o de las CTK.

El término "administración" utilizado en esta descripción indica un método para poner en contacto una preparación de tirfostina de la presente invención y una PK diana de tal manera que la tirfostina pueda afectar la actividad catalítica de la PK ya sea directamente, es decir, interaccionando con la PK propiamente dicha, ya sea indirectamente, es decir, interaccionando con otra molécula de la que depende la actividad catalítica de la quinasa. Tal como se emplea aquí, la administración puede realizarse ya sea "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo, ya sea "in vivo", es decir, en células o tejidos de un organismo vivo (ver más abajo).

Para llevar a la práctica la presente invención no es necesaria la comprensión exacta del mecanismo por el que las preparaciones de tirfostina de la presente invención inhiben las PKT, sin embargo, a pesar de estar sujetas a ningún mecanismo ni teoría concretos, se cree que las tirfostinas interaccionan con los aminoácidos de la región catalítica de las PTK. Las PTK poseen típicamente una estructura bilobulada, en la que el ATP parece fijarse en la hendidura entre dos lóbulos de una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PTK. Se cree que los inhibidores de las PTK se fijan por interacciones no covalentes, por ejemplo un enlace de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones iónicas en la misma región general en la que el ATP mencionado se fija en el espacio general ocupado normalmente por el anillo adenina del ATP, es decir, se ha sugerido que los inhibidores de las PTK actúan como biomiméticos de la molécula del ATP. Se piensa más en concreto que el componente del anillo de quinoxalina de las tirfostinas se fija en el espacio general ocupado normalmente por el anillo adenina del ATP. Los estudios recientes han sugerido que la inhibición profundamente selectiva de las PTK de tales compuestos se debe de la interacción competitiva o competitiva mixta con el dominio de fijación del ATP así como de la inhibición competitiva mixta con los sub-sitios de fijación del sustrato [23]. Puede surgir una especificidad de una quinoxalina concreta por una PTK particular como resultado de las interacciones adicionales entre varios sustituyentes del núcleo de la quinoxalina y el dominio de aminoácidos específico de la PTK particular. Por consiguiente, los isómeros geométricos de la tirfostina de la presente invención se forman durante el procedimiento de síntesis, que puede tener la capacidad diferencial inherente de fijarse al dominio de fijación del ATP y por ello una selectividad con respecto a ciertas PTK, por ejemplo el PDGFR y potencias diferenciales adicionales con respecto a PTK específicas, p.ej. el PDGFR.

También con arreglo a la presente invención se proporciona un método para inhibir la proliferación celular sometiendo a las células a una preparación de tirfostina de los compuestos descritos anteriormente. En una forma preferida de ejecución de la invención, las células son de un organismo (p.ej. humano), mientras que el someter a las células a un compuesto tirfostina se realiza "in vivo". Como alternativa, las células pueden someterse a un compuesto tirfostina "in vitro".

También con arreglo a la presente invención se proporciona, pues, un método para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad de un organismo, p.ej. un mamífero (p.ej. un ser humano), causado por una proteína-tirosina-quinasa, mediante la administración a dicho organismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita anteriormente.

En esta descripción, el término "tratar" incluye el mermar, sustancialmente el inhibir, retardar o invertir el progreso de una enfermedad, mejorando sustancialmente los síntomas clínicos de dicha enfermedad o previniendo sustancialmente la aparición de los síntomas clínicos de la enfermedad.

En esta descripción, el término "prevenir" se refiere a un método para impedir en primer lugar que un organismo pueda adquirir un trastorno o enfermedad.

Tal como se emplea en esta descripción, "trastorno relacionado con las PTK" indica un trastorno caracterizado por una actividad inapropiada de las PTK o una actividad excesiva de las PTK. Actividad inapropiada indica: (i) la expresión de las PTK en células en las que normalmente no se expresan las PTK; o (ii) una mayor expresión de las PTK que conduce a una proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular no deseados, o (iii) una menor expresión de las PTK que conduce a reducciones no deseadas en la proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular. La actividad excesiva de las PTK significa la amplificación de los genes que codifican a una PTK particular o la producción de un nivel de actividad de las PTK que puede guardar relación con un trastorno de proliferación, diferenciación y/o crecimiento celular (es decir, cuando aumenta el nivel de las PTK, aumenta también la gravedad de uno o de varios síntomas del trastorno celular). La actividad excesiva puede ser también el resultado de la activación independiente y constitutiva de un ligando como consecuencia de mutaciones, por ejemplo deleciones de un fragmento de una PTK que sea necesario para la fijación del ligando.

Por lo tanto, los trastornos mediados por las PTK que son objeto de la presente invención pueden estudiarse, prevenirse o tratarse por métodos definidos en la presente, tanto si las células como los tejidos del organismo existen dentro del organismo o fuera del organismo. Las células que existen fuera del organismo pueden mantenerse o cultivarse en platos de cultivo de celular. En este contexto puede determinarse la capacidad de un compuesto particular de afectar un trastorno relacionado con una PTK, p.ej. puede evaluarse la IC_{50} del compuesto, antes de emprender el uso del compuesto en organismos vivos más complejos. Para las células fuera del organismo existen múltiples métodos, que son bien conocidos por los expertos en la materia, para administrar los compuestos, que incluyen, pero no se limitan a la microinyección celular directa y numerosas técnicas de vehículo transmembrana. Para las células albergadas dentro de un organismo vivo existe también un cúmulo de métodos, que son igualmente bien conocidos de los expertos en la materia, para administrar compuestos, que incluyen, pero no se limitan a las aplicaciones oral, parenteral, dérmica y de aerosol.

El término "organismo" indica cualquier ser vivo, que conste por lo menos de una célula. Un organismo vivo puede ser tan simple por ejemplo como una sola célula eucariótica o tan complejo como un mamífero, incluido el ser humano.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" indica que la cantidad del compuesto administrado aliviará de alguna manera uno o varios síntomas del trastorno tratado.

La presente invención se refiere, pues, a preparaciones que contienen tirfostinas, que modulan la transducción de señales de la actividad de las PTK y afectan la actividad enzimática de las RTK y de las CTK y, de este modo, interfieren en la señal transducida por dichas proteínas.

Son ejemplos, sin limitación, de los tipos de trastornos relacionados con la actividad no regulada de las PTK, que las preparaciones aquí descritas pueden ser útiles para prevenir, tratar y estudiar, los trastornos fibróticos, los trastornos metabólicos y los trastornos de proliferación celular, relacionados con las PTK, por ejemplo con el PDGF, el EGF, el IGF y las met.

Los trastornos fibróticos se refieren a la formación anormal de matrices extracelulares. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen la cirrosis hepática y los trastornos de proliferación de células mesangiales. La cirrosis hepática se caracteriza por un aumento de los constituyentes de la matriz extracelular, que se traduce en la formación de una cicatriz hepática. Los trastornos de proliferación de células mesangiales se refieren a los trastornos provocados por una proliferación anormal de las células mesangiales. Los trastornos de proliferación mesangial incluyen varios trastornos renales humanos, por ejemplo la glomerulonefritis, la nefropatía diabética, la nefrosclerosis maligna, los síndromes de microangiopatía trombótica, el rechazo de trasplante y las glomerulopatías. En este sentido, el PDGFR interviene en el mantenimiento de la proliferación de células mesangiales. Otro trastorno fibrótico en el que interviene es la arteriosclerosis.

La asociación entre la actividad anormal de las PTK y la enfermedad incluye también a las enfermedades metabólicas, por ejemplo la psoriasis, la diabetes mellitus, la curación de las heridas, la inflamación y las enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, se ha indicado el EGFR en la curación de las heridas de la córnea y de la piel. Los defectos en los receptores insulina-R e IGF-1R se indican en la diabetes mellitus de tipo II.

Los trastornos de proliferación celular que pueden prevenirse, tratarse o también estudiarse con la presente invención incluyen el cáncer, los trastornos proliferantes de los vasos sanguíneos y los trastornos proliferantes de las células mesangiales.

Tal como se emplea aquí, el término "cáncer" indica los diversos tipos de neoplasmas malignos, la mayoría de los cuales pueden invadir los tejidos circundantes y pueden metastasizarse en diferentes sitios, tal como se define en el Diccionario médico de Stedman, 25ª edición (coordinador: Hensyl, 1990). Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse con tirfostinas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: cáncer de cerebro, de ovarios, de colon, de próstata, de riñón, de vejiga, de mama, de pulmón, de boca y de piel que presentan una actividad inapropiada de las PTK. Estos cánceres pueden subdividirse. Por ejemplo, los cánceres de cerebro incluyen el glioblastoma multiforme, el astrocitoma anaplásico, el astrocitoma, el ependioma, el oligodendroglioma, el meduloblastoma, el meningioma, el sarcoma, el hemangioblastoma y cáncer pineal parenquimal. De igual manera, los cánceres de piel incluyen el melanoma y el sarcoma de Kaposi. Las PTK se han asociado con el desarrollo del cáncer. Se ha demostrado que algunos de los receptores de las PTK mencionados anteriormente, por ejemplo el EGFR y el PDGFR, se sobreexpresan en muchos tumores y/o se activan persistentemente por bucles autocrinos [31-33]. En especial el PDGFR se ha asociado con el glioblastoma, el melanoma y el cáncer de pulmón, de ovarios y de próstata.

Los trastornos de proliferación en vasos sanguíneos se refieren a los trastornos angiogénicos y vasculogénicos que en general producen una proliferación anormal de vasos sanguíneos. La formación y el desarrollo de vasos sanguíneos, o vasculogénesis y angiogénesis, respectivamente, desempeñan un papel importante en un gran número de procesos fisiológicos, tales como el desarrollo embrionario, la formación del cuerpo lúteo, la curación de las heridas y la regeneración de los órganos. Desempeñan también un papel crucial en el desarrollo del cáncer. Otros ejemplos de trastornos por proliferación de vasos sanguíneos incluyen la artritis, en la que los nuevos capilares sanguíneos invaden la articulación y destruyen el cartílago, y las enfermedades oculares, por ejemplo la retinopatía diabética, en la que los nuevos capilares de la retina invaden el cristalino, sangran y provocan la ceguera. Al revés, los trastornos relacionados con la retracción, la contracción o la obturación de vasos sanguíneos, como es la restenosis, tienen también relación con ello. Son de una importancia especial para los trastornos proliferantes recién descritos los procesos de proliferación y migración en los que intervienen las células activadas de músculos lisos (SMC), que están asociados con la liberación de abundante matriz extracelular por parte de estas células y son fundamentales para el crecimiento de la neoíntima asociado con la arteriosclerosis acelerada que continúa atormentando a pacientes sometidos a angioplastia de balón, despliegue del "stent", cirugía de "bypass" de la arteria coronaria y trasplante de corazón. La lesión de la pared vascular, con o sin pérdida o daño del endotelio, provoca la subpoblación de las células SMC diferenciadas quiescentes que pierden su aparato miofilamentario contráctil y se transforman en células sintéticas con cantidades grandes de retículo endoplásmico rugoso, ribosomas y mitocondrio. Esta transformación dirigida, por lo menos parcialmente, por el PDGF está asociada con la migración y la proliferación de las SMC y con la elaboración posterior de abundante matriz extracelular. Se ha dirigido una gran cantidad de estudios experimentales a la atenuación de las SMC "in vitro" e "in vivo". Sin embargo, se ha logrado un progreso relativamente exiguo en el desarrollo de inhibidores eficaces, selectivos y no tóxicos del crecimiento de las SMC que pueden aplicarse eventualmente en el marco de las intervenciones. El reciente progreso en determinar el mecanismo por el que los factores de crecimiento controlan la proliferación celular ha contribuido al desarrollo de estrategias de tratamiento, que se centran en los mecanismos específicos de transducción de señales con el fin de controlar los trastornos proliferantes.

Se ha constatado específicamente que los inhibidores de las proteína-tirosina-quinasas (PTK) suprimen la quimiotaxis y la proliferación de las SMC. Los inhibidores de la fosforilación de tipo tirfostina, que son el centro de la presente invención, son compuestos sintéticos de bajo peso molecular, cuya estructura básica puede modificarse para bloquear las PTK específicas de receptor o las PTK intracelulares. A diferencia de los anticuerpos de receptores grandes, el pequeño tamaño de las tirfostinas les permite acceder con mayor facilidad a los sitios del receptor dentro de los tejidos, por ejemplo en las profundidades de los medios. El desarrollo de este grupo de compuestos se basa en el concepto de que conducirá a un control más centrado de los trastornos proliferantes, a la consecución de mejores índices terapéuticos y a la reducción de numerosos efectos secundarios adversos que los inhibidores de carácter más general de la síntesis del DNA o del RNA o los agentes que rompen el citoesqueleto. Naturalmente, se ha constatado recientemente que la entrega controlada local del bloqueador no selectivo de PTK, el AG17 (RG50872), inhibe efectivamente la formación de la neoíntima en un modelo de lesión de balón en carótida de rata [24].

La transducción de señales inducida por el PDGF-BB, considerado por muchos como el mitógeno y el quimioatractivo más potente de las SMC arteriales, estimula la migración y la proliferación dirigidas hacia la neoíntima después de una lesión arterial. Se ha constatado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), expresado por las plaquetas, las SMC, las células endoteliales y los macrófagos, desempeña un papel importante en la patogénesis de la formación de neoíntima inducida por lesión en la pared arterial, actuando no solo como mitógeno y como quimioatractivo de las SMC, sino también participando en la transformación de las SMC desde su fenotipo contráctil hasta su fenotipo proliferante. Los estudios "in vivo" han demostrado que la expresión del ligando PDGF y su receptor es elevada después de una lesión arterial.

Se ha demostrado también que la infusión del PDGF en arterias carótidas lesionadas de rata o la transfección de un plásmido que codifique al PDGF en arterias porcinas aumentan la formación de neoíntima. Se ha publicado también que los niveles de receptores de PDGF en las SMC de placas ateroscleróticas humanas son elevados si se comparan con los niveles de receptores en las SMC mediales normales. Recientemente, Sirois y col. [25] han puesto de manifiesto la sobrerregulación marcada de los receptores del PDGF a raíz de una lesión en la pared de un vaso. Han demostrado que el grado de formación de la neoíntima depende sustancialmente tanto de la sobreexpresión del PDGFR-\beta como de su activación por parte del PDGF-BB. Han demostrado además que la entrega local controlada de oligonucleótidos antisentido del receptor PDGF-\beta reduce la formación de neoíntima en el modelo de lesión de carótida en rata. Finalmente se ha constatado que los bloqueadores de las PTK del grupo de la tirfostina bloquean la transducción de señales del receptor del PDGF, incluida la fosforilación y la activación de la PLC\gamma, de la que se cree que participa en la migración de las SMC [20, 21, 22, 26].

Por lo tanto, con arreglo a la presente invención se proporciona un método para el tratamiento local de un trastorno proliferante de un tejido (p.ej. una arteria) de un organismo (p.ej. un ser humano) por aplicación de una composición farmacéutica de liberación lenta, descrita anteriormente, a dicho tejido. El trastorno puede ser de cualquier tipo de los mencionados antes. Más específicamente, el trastorno puede ser un trastorno proliferativo asociado con una proliferación celular excesiva o descontrolada, incluidas, pero sin limitarse a ellas, la psoriasis, el papilloma, la restenosis, la arteriosclerosis, la estenosis "in-stent", la restenosis de injerto vascular, la fibrosis pulmonar, la nefritis glomerular, la artritis reumatoide y las patologías malignas asociadas con el receptor del PDGF.

Los objetos, ventajas y nuevas características adicionales de la presente invención resultarán evidentes a las personas expertas en la materia después de haber examinado los ejemplos siguientes, que no se pretende que sean limitantes. Además, cada una de las varias formas de ejecución y aspectos de la presente invención definidos en esta solicitud y reivindicadas en la siguiente sección de las reivindicaciones encontrará apoyo experimental en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ahora se hará referencia a los ejemplos siguientes, que junto con la anterior descripción, ilustran la invención de forma no limitante. Los protocolos siguientes y los detalles experimentales se referencian en los ejemplos que siguen:

Síntesis química de las tirfostinas, su análisis y verificación estructural Síntesis del 1,2-dimetil-5,6-diamino-bencimidazol

Este compuesto se utiliza como material de partida para la síntesis de todos los compuestos tirfostina, tal como se detalla a continuación. La síntesis del 1,2-dimetil-5,6-diamino-bencimidazol comprende los pasos siguientes:

Síntesis del 2-metil-bencimidazol

Se mantienen en ebullición a reflujo durante 2 horas la fenilendiamina (32 gramos) y el ácido acético glacial (60 ml). Se añade hielo y KOH para ajustar el pH a 8,0 y se filtra el sólido de color ligeramente violeta resultante y se recoge. Por recristalización en benceno se obtienen 30 gramos del 2-metil-bencimidazol en forma de sólido ligeramente amarillo, que tiene un punto de fusión de 170ºC, en un rendimiento total de 77%.

Síntesis del 1,2-dimetil-bencimidazol

A 10 gramos del 2-metil-bencimidazol (75 mmoles), triturado, 25 gramos de KOH triturado (450 mmoles) en 300 ml de acetona se le añade a temperatura ambiente por goteo continuo durante 0,5 horas el yoduro de metilo (15 gramos, 105 mmoles). Después de otras 0,5 horas se añade agua, se extrae la mezcla reaccionante con diclorometano, se concentra y se cromatografía a través de gel de sílice, obteniéndose 6 gramos (54%) del 1,2-dimetil-bencimidazol en forma de sólido blanco, que tiene un punto de fusión de 102ºC.

Síntesis del 1,2-dimetil-5,6-dinitro-bencimidazol

Se enfría con hielo el 1,2-dimetil-bencimidazol (3,3 gramos) en 15 ml de HNO_{3} (del 70%) y se le añaden lentamente 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Después se agita la mezcla reaccionante a 100ºC durante 2 horas, se vierte sobre hielo y se neutraliza con KOH. Se filtra, obteniéndose 4 gramos, rendimiento: 93%, de un sólido de color blanco azulado pálido. El sólido está formado por un 80% de una mezcla 1:1 del isómero 5-nitro:6-nitro, un 10% del isómero 4-nitro y un 10% del isómero 5,6-dinitro.

Se trata la mezcla anterior (1,5 gramos) a 190ºC durante 3,5 horas con 10 ml de HNO_{3} (del 70%) y 6 ml de ácido sulfúrico concentrado, se vierte sobre hielo y se neutraliza con KOH. Se filtra y se recoge un sólido ligeramente verde. Por recristalización de este sólido en etanol se obtienen 0,48 gramos (rendimiento: 26%) del isómero 5,6-dinitro puro, que es un sólido blanco que tiene un punto de fusión de 224ºC, RMN (CDCl_{3}) \delta = 8,17 (1H, s), 7,90 (1H, s), 3,87 (3H, s), 2,73 (3H, s).

Síntesis del 1,2-dimetil-5,6-diamino-bencimidazol

Se hidrogenan durante 4 horas el 1,2-dimetil-5,6-dinitro-bencimidazol puro (0,7 gramos) con 0,2 gramos de Pd/C en 20 ml de etanol y 20 ml de ácido acético glacial. Se filtra y se concentra, obteniéndose 0,5 gramos (rendimiento: 95%) de un sólido blanco, que tiene un punto de fusión de 212ºC.

Síntesis del AG2033 y del AG2034 (que son isómeros geométricos del 1851, descrito en US-A-5 932 580)

Se mantienen en ebullición a reflujo durante 3 horas el 1,2-dimetil-5,6-diamino-bencimidazol (0,5 gramos, 2,8 mmoles) y 0,45 gramos, 3 mmoles, de fenilglioxal hidratado en 20 ml de etanol y 20 ml de ácido acético, se neutralizan con NaOH, se extraen con CH_{2}Cl_{2}, se concentran por evaporación y se separan analíticamente por cromatografía a través de gel de sílice (cromatografía de capa fina, CCF). El isómero AG2033 eluye con una R_{f} = 0,6 (mezcla 5:95 de CH_{3}OH:CH_{2}Cl_{2}), mientras que el isómero AG2034 eluye con una R_{f} = 0,5.

La separación preparativa de los isómeros se realiza por cromatografía a través de 150 gramos de gel de sílice, de 70-230 mesh. La elución se efectúa con metanol al 1% en CH_{2}Cl_{2}.

(i) AG2033: 1,2-dimetil-6-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina ("transoide"). De las primeras fracciones, 0,265 gramos (rendimiento: 32%), un sólido ligeramente amarillo que tiene un punto de fusión de 275ºC. RMN (CDCl_{3}) \delta = 9,30 (1H, s, H_{7}), 8,45 (1H, s, H_{4}), 8,21 (2H, m), 7,95 (1H, s, H_{9}), 7,50 (3H, m), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,75 (3H, s, 2-metilo).

(ii) AG2034: 1,2-dimetil-7-fenil-imidazolo[5,4-g]quinoxalina ("cisoide"). De las últimas fracciones, 0,265 gramos (rendimiento: 32%), un sólido ligeramente amarillo que tiene un punto de fusión de 218ºC. RMN (CDCl_{3}) \delta = 9,32 (1H, s, H_{7}), 8,42 (1H, s, H_{4}), 8,21 (2H, m), 8,0 (1H, s, H_{9}), 7,50 (3H, m), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,75 (3H, s, 2-metilo). EM m/e (AG1851 - mezcla de AG2033, AG2034) -274 (M^{+}, 100%), 259 (M-CH_{3}, 8%), 247 (M-HCN, 11%), 144 (M-fenil-HCN-CN, 68%), 129 (144-CH_{3}, 13), 123 (15), 102 (12), 88 (14), 77 (15).

En el siguiente esquema 1 se ilustra la síntesis y estructura de los dos isómeros, el AG2033 y el AG2034.

Esquema 1

5

Síntesis del AG2043 y del AG2044 (que son isómeros geométricos del AG1992 descrito en US-A-5 932 580)

Se hidrogenan durante 4 horas 4,6 gramos, 20 mmoles, del 1,2-dimetil-5,6-dinitro-bencimidazol, descrito antes, con 0,6 gramos de Pd al 5% sobre C en 30 ml de etanol y 30 ml de ácido acético. Se filtra, obteniéndose 6,3 gramos, 23 mmoles, de tiofenoglioxal [34], se añade 1 ml de HCl y se mantiene la mezcla reaccionante en ebullición a reflujo durante 1,5 horas, se neutraliza con KOH, se extrae con CH_{2}Cl_{2} y se concentra.

Se realiza la separación preparativa de los isómeros por cromatografía a través de 200 gramos de gel de sílice, de 70-230 mesh. Se efectúa la elución con metanol al 1% en CH_{2}Cl_{2}, obteniéndose:

(i) AG2043: 1,2-dimetil-6-(2-tiofeno)-imidazolo[5,4-g]quinoxalina ("transoide"). De las primeras fracciones - 0,23 gramos (rendimiento: 4%), un sólido ligeramente amarillo que tiene un punto de fusión de 274ºC. R_{f} = 0,6 (mezcla 5:95 de CH_{3}OH:CH_{2}Cl_{2}). RMN (CDCl_{3}) \delta = 9,20 (1H, s, H_{7}), 8,34 (1H, s, H_{4}), 7,87 (1H, s, H_{9}), 7,83, 7,52, 7,20 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,75 (3H, s, 2-metilo). RMN (acetona d_{6}) \delta = 9,38 (1H, s, H_{7}), 8,12 (1H, s, H_{4}), 8,02 (1H, s, H_{9}), 8,08, 7,71, 7,27 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,97 (3H, s, N-metilo), 2,70 (3H, s, 2-metilo). RMN (DMSO d_{6}) \delta = 9,48 (1H, s, H_{7}), 8,15 (1H, s, H_{4}), 8,09 (1H, s, H_{9}), 8,18, 7,81, 7,28 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,66 (3H, s, 2-metilo). RMN (nitrobenceno d_{5}) \delta = 9,0 (1H, s, H_{7}), 8,01 (1H, s, H_{4}), 7,6 (1H, s, H_{9}), 7,61, 7,27, 6,92 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,50 (3H, s, N-CH_{3}), 2,38 (3H, s, 2-CH_{3}). EM m/e - (AG1992 - mezcla de AG2043, AG2044) - 280 (M^{+}, 100%), 253 (M-HCN, 8%), 144 (M-tiofeno-HCN-CN, 48%), 127 (13), 111 (11), 88 (14), 76 (9).

(ii) AG2044: 1,2-dimetil-7-(2-tiofeno)-imidazolo[5,4-g]quinoxalina ("cisoide"). De las últimas fracciones - 0,6 gramos (rendimiento: 11%), un sólido ligeramente amarillo que tiene un punto de fusión de 218ºC. R_{f} = 0,5 (mezcla 5:95 de CH_{3}OH:CH_{2}Cl_{2}). RMN (CDCl_{3}) \delta = 9,22 (1H, s, H_{6}), 8,34 (1H, s, H_{4}), 7,90 (1H, s, H_{9}), 7,83, 7,52, 7,20 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,75 (3H, s, 2-metilo). RMN (acetona d_{6}) \delta = 9,38 (1H, s, H_{7}), 8,15 (1H, s, H_{4}), 7,96 (1H, s, H_{9}), 8,08, 7,71, 7,27 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,97 (3H, s, N-metilo), 2,70 (3H, s, 2-metilo). RMN (DMSO d_{6}) \delta = 9,46 (1H, s, H_{7}), 8,14 (1H, s, H_{4}), 8,13 (1H, s, H_{9}), 8,18, 7,81, 7,28 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,88 (3H, s, N-metilo), 2,66 (3H, s, 2-metilo). RMN (nitrobenceno d_{5}) \delta = 9,0 (1H, s, H_{7}), 8,05 (1H, s, H_{4}), 7,47 (1H, s, H_{9}), 7,64, 7,32, 6,95 (3H, línea ABX 12, m, tiofeno), 3,50 (3H, s, N-metilo), 2,38 (3H, s, 2-metilo).

En el siguiente esquema 2 se ilustra la síntesis y estructura de los dos isómeros, el AG2043 y el AG2044.

Esquema 2

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6

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Técnicas y ensayos de cultivo celular Células y reactivos

Se obtienen células de músculo liso (SMC) en condiciones asépticas a partir de aortas abdominales porcinas. Se abre por incisión cada arteria y se raspa mecánicamente la superficie endotelial. Se cortan los vasos en fragmentos de 2 mm^{2}, que se colocan en platos de cultivo con medio Dulbecco's modified Eagle (DMEM) suplementado con un 15% (v/v) de suero fetal bovino (FCS), 100 \mug/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y L-glutamina 0,2 M. A continuación se colocan los fragmentos de tejido en una incubadora a 37ºC en una atmósfera del 9% de CO_{2} hasta que se detecta que las SMC han madurado (típicamente de 3 a 7 días). Se subcultivan poblaciones uniformes de SMC que se ajustan a los modelos característicos de crecimiento de "monte y valle" empleando tripsina al 0,25% para la transferencia. Para los experimentos de verificación del efecto de las tirfostinas en la inhibición del crecimiento y en la recuperación (ver a continuación), se colocan de nuevo sobre placas las SMC procedentes de los pasajes 1 - 3 en hoyos de 15 mm tratados previamente con 3 \mug/cm^{2} de fibronectina (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) a razón de 15.000 células/hoyo.

Se utilizan del modo descrito anteriormente [27, 29] las células endoteliales aórticas porcinas (PAEC), transfectadas de modo estable con el receptor de PDGF (células PAEC/PDGF\betaR, suministradas gentilmente por el Dr. L. Claesson-Welsh, Upsala, Suecia) y con el receptor KDR del VEGF (PAEC/KDR), respectivamente. Las células se cultivan de forma habitual en el medio Ham's F-12 con geneticina (0,4 mg/ml) y un 10% de FCS.

Se adquieren células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC) y células de músculo liso de arteria coronaria humana (HCASMC) a la empresa Clonetics (Heidelberg) y se cultivan en medio EBM (suplementado con EGM-MV SINGLE QUOTS®) y en medio SmBM (suplementado con SmGM-2 SINGLE QUOTS®), respectivamente (Clonetics).

Todos los reactivos para el cultivo celular proceden de la empresa Gibco BRL, a menos que se indique lo contrario. El PDGF es el homodímero BB recombinante humano. El VEGF se obtiene de Sigma. El antisuero DIG-1 de receptor anti-PDGF se cultiva frente a un péptido que corresponde a los restos aminoácido 1075-1089 del receptor PDGF \alpha humano que reconoce igual de bien a los receptores PDGF \alpha y \beta [22]. Ya se ha descrito [5] el antisuero PDGF-R3 contra el receptor PDGF. Se adquiere el ATP[P^{32}] a la empresa DuPont/N-EN (Dreieich, Alemania). Se cultiva el antisuero NEF de receptor anti-KDR policlonal frente a un péptido sintético, ya descrito anteriormente [28]. A continuación se indican los reactivos adicionales empleados en los ensayos concretos y sus suministradores.

Efecto "in vitro" de las tirfostinas sobre la autofosforilación del PDGFR purificado

Se preparan membranas a partir de cultivos confluyentes de células epiteliales renales caninas (TRMP) o de células Swiss 3T3, del modo descrito [23]. Se realiza una purificación ulterior del PDGF-\betaR del modo descrito en [23]. Resumiendo, se incuban 2 \mul de preparación de quinasa durante 20 minutos sobre hielo en presencia de 2 \mug/ml de PDGF-BB en 20 \mul de Hepes 50 mM (pH 7,4). Se ejecuta la reacción de la quinasa durante 10 minutos en hielo con MnCl_{2} 5 mM, vanadato 1 mM, ATP[\gamma-P^{32}] (2,5 \muCi por reacción). Se termina la reacción por adición de 10 \mul de una solución que contiene un 6% de SDS, un 30% de \beta-mercaptoetanol, un 40% de glicerina y 0,5 mg/ml de azul de bromofenol. Se calientan las muestras a 95ºC durante 5 minutos y se someten a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida en presencia de un 0,4% de SDS, utilizando geles de poliacrilamida del 7,5%. Se tiñen los geles, se secan y se someten a un análisis autorradiográfico. Para la cuantificación de la radiactividad de los geles de electroforesis se utiliza un aparato Phospho-Imager (Molecular Dynamics, Fuji, o Bio-Rad) con arreglo a las instrucciones del fabricante. Para obtener los autorradiogramas se exponen los objetos a una película de rayos X (Fuji RX o Kodak X-OMAT) con pantallas de intensificación a -70ºC.

Efecto de las tirfostinas en la autofosforilación del PGFR inducida por el PDGF en células PAEC intactas

Las células PAEC, transfectadas con PDGFR o con KDR, cultivadas en medio Ham's F-12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FCS), se sincronizan durante 20 horas en un medio que contiene un 0,01% de BSA. Después de la preincubación con el AG1295 (que sirve como control no isomerizable, ver referencia 23), el AG2033, el AG2034, el AG2043 o el AG2044 durante 15 minutos y con Na_{3}VO_{4} (100 \muM) durante 5 minutos, se estimulan las células con PDGF-BB (50 ng/ml) o con VEGF-A (50 ng/ml) a 37ºC durante 10 minutos. Después de la estimulación se solubilizan las células en Nonidet P-40 (al 1%) que contiene tampón de lisis.

Se realiza el análisis de la fosforilación del receptor \beta de PDGF del modo siguiente. Se someten los lisados celulares a la inmunoprecipitación empleando un antisuero R3 específico del receptor \beta de PDGF [5]. Se someten los precipitados a electroforesis a través de gel de poliacrilamida (del 7,5%) en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y después se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (Hybond C-EXTRA, Amersham). Se detectan las proteínas fosforiladas por inmunotransferencia (immunoblotting) empleando anticuerpos PY20 y 4G10 de fosfotirosina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (Upstate Biotechnology) y posterior aplicación de un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano y detección basada en la quimioluminiscencia (ECL, Amersham) y autorradiografía.

Se efectúa el análisis de la fosforilación del receptor KDR del modo siguiente. Se someten los lisados celulares a la inmunoprecipitación empleando un antisuero específico del KDR [27]. Se someten los precipitados a electroforesis a través de gel de poliacrilamida (del 7,5%) en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) y después se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (Hybond C-EXTRA, Amersham). Se detectan las proteínas fosforiladas por inmunotransferencia (immunoblotting) empleando el anticuerpo RC20H de fosfotirosina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (Transduction Laboratories) y posterior detección basada en la quimioluminiscencia (ECL, Amersham) y autorradiografía.

La detección de las proteínas del receptor de efectúa del modo siguiente. Se someten los lisados celulares a la inmunoprecipitación empleando un antisuero R3 específico del receptor \beta de PDGF o el antisuero específico del KDR, ya descrito antes, y se lavan los precipitados tres veces y después se someten a SDS-PAGE (7,5%) y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (Hybond C-EXTRA, Amersham). Se detectan las proteínas del receptor por inmunotransferencia (immunoblotting) empleando el anticuerpo de simio anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Amersham) y posterior detección basada en la quimioluminiscencia (ECL, Amersham) y la autorradiografía.

Inhibición de la proliferación y recuperación celular

Se repiten 3 ó 4 veces los ensayos de inhibición del crecimiento y de recuperación celular en monocapas. Cada ensayo se realiza por triplicado. En el día 0 se siembran aproximadamente 15.000 células (SMC o PAEC) en 1 ml de medio de cultivo suplementado con un 15% de FCS (SMC) o un 10% de FCS (PAEC) en hoyos de 15 mm recubiertos previamente con fibronectina (SMC) o no recubiertos (PAEC). En los días 1 y 3 se tratan los cultivos con 10 \mumoles de los siguientes compuestos de tirfostina: el AG2033, el AG2034, el AG2043 y el AG2044 (para las SMC) o con el AG2033 (para las PAEC) disueltos en DMSO del 0,1%. En el día 7 se lavan los cultivos y se deja que las células se recuperen. De forma típica se cuentan las células en los días 3 y 6 para determinar la inhibición y en el día 13 para determinar la recuperación. A lo largo del ensayo se cambia cada dos días el medio suplementado con suero (DMEM para las SMC y el Ham's F-12 para las PAEC).

Evaluación de la migración celular (ensayo de quimiotaxis)

Se evalúa la respuesta quimiotáctica de las células HCASMC, PAEC/KDR y PAEC/PDGFR utilizando una cámara Boyden modificada (Neuro Probe, Inc.) y filtros de policarbonato recubiertos con colágeno (Nucleopore) de diámetros de poro de 8 \mum, tal como se ha descrito anteriormente [27]. Resumiendo, se cultivan las células PAEC/KDR y PAEC/PDGFR y se ensayan en un medio Ham's F12 que contiene un 10% de FCS. Las HCASMC se cultivan en medio SmGM-2 (Clonetics) y se ensayan en SmBM-WM que contiene un 10% de FCS y un 0,1% de BSA. Al medio de la parte inferior de la cámara Boyden se le añade VEGF o PDGF-BB (10 ng/ml, respectivamente). Se añade el AG2033 tanto a la parte superior como a la parte inferior de la cámara. Se deja 4 horas para la migración de las células suspendidas, después de un período de preincubación de 15 minutos en AG2033. El número de células que migran sin la estimulación del PDGF-BB o del VEGF se toman como referencia y se expresan como el 100% de migración (quimioquinesis). Se realiza el ensayo por triplicado y con un microscopio normal (Jenalab) se cuentan cinco campos de potencia media por hoyo.

Evaluación de la proliferación celular (ensayo de incorporación de la timidina-[H^{3}])

Se siembran espaciadas células PAEC/KDR y PAEC/PDGFR, cultivadas en medio Ham's F12 que contiene un 10% de FCS, en platos de cultivo celular de 12 hoyos. Pasadas 24 horas se lavan las células dos veces con medio Ham's F12 que contiene un 1% de FCS y se incuban durante 48 horas más con una renovación del medio. Se incuban las células durante 15 minutos con diferentes concentraciones del AG2033 (0,1; 1 y 10 \muM) o con el disolvente DMSO solo, se estimulan con 3 ng/ml de VEGF o con 15 ng/ml de PDGF-BB durante 20 horas, después se añade timidina-[H^{3}]/ml (Amersham) durante dos horas. Se precipita a 4ºC durante 30 minutos el compuesto radiactivo [H^{3}] de peso molecular elevado utilizando ácido tricloroacético del 5%. Después de dos lavados con H_{2}O enfriada con hielo se solubiliza a temperatura ambiente durante 8 minutos el compuesto radiactivo [H^{3}] en NaOH 1 M (400 \mul/hoyo), se neutraliza por adición de HCl 2 M (400 \mul/hoyo) y se cuantifica por recuento de centelleo líquido.

Resultados experimentales Ejemplo 1 Análisis químico Análisis de estructura cristalina por rayos X AG2043

Todas las operaciones de computador para determinar los valores cristalográficos se realizan con un ordenador VAX9000 de la Universidad Hebrea de Jerusalén, empleando un programa informático TEXSAN para el análisis estructural. Los datos se obtienen empleando un difractómetro ENRAF-NONIUS CAD-4 controlado por el ordenador. Se emplea radiación CuK\alpha(\lambda = 1,54178 \ring{A}) con un monocromador de cristal de grafito para el rayo incidente. Se utilizan programas estándar de centrado CAD-4, indexado y recogida de datos. Las dimensiones de la celdilla unitaria se obtienen por ajuste de cuadrados mínimos de 20 reflexiones centradas en el intervalo de 23º \leq \theta \leq 27º.

Los datos de intensidad se recogen empleando la técnica \omega-2\theta hasta un máximo 2\theta de 120º. La anchura de escaneo, \Delta\omega, para reflexión es de 0,80 \pm 0,15 tan \theta. Una apertura de una altura de 4 mm y una anchura variable, calculada como 2,0 \pm 0,5 tan \theta, se localiza a 173 mm del cristal. Las reflexiones se miden en primer lugar con una velocidad de escaneo de 8,24º/minuto. La velocidad del escaneo final se calcula a partir de los resultados del escaneo preliminar, de modo que la relación I/\sigma (I) sea por lo menos de 40, pero el tiempo máximo de escaneo no deberá sobrepasar los 60 segundos. Si en el escaneo preliminar I/\sigma (I) < 2, esta medición se utiliza como dato de referencia. Las velocidades de escaneo varían entre 1,27 y 8,24º/minuto. De los 96 pasos del escaneo, los primeros 16 y los últimos 16 se consideran como fondo o base. Durante la recogida de datos, se hace el seguimiento de tres reflexiones estándar cada hora de exposición a los rayos X. No se observa disminución. Además se chequean tres orientaciones estándar después de 100 reflexiones con el fin de comprobar los efectos del movimiento del cristal. Si la desviación estándar de los valores h, k e I de cada reflexión de orientación es mayor que 0,08, se calcula una nueva matriz de orientación sobre la base de un nuevo centrado de las 20 reflexiones de referencia.

Se corrigen las intensidades atendiendo a los efectos Lorenz y de polarización. Se encuentran todos los átomos que no son de hidrógeno utilizando los resultados del método de análisis directo SHELX-86 (30). Después de varios ciclos de refinamiento se calculan las posiciones de los átomos de hidrógeno y se añaden al proceso de refinamiento. El refinamiento se realiza por convergencia minimizando la función \Sigmaw (|F_{o}| - |F_{c}|)^{2}. Un mapa final de diferencias de síntesis de Fourier presenta varios picos inferiores a 0,31 e/\ring{A}^{3} esparcidos en la célula unitaria, sin un rasgo significativo.

En la siguiente tabla se presentan los índices de discrepancia, R = \Sigma||F_{o}| - |F_{c}|| / \Sigma|F_{o}| y R_{w} = [\Sigmaw(|F_{o}| - |F_{c}|)^{2} / \Sigmaw(|F_{o}|^{2}]^{1/2} así como otros datos cristalográficos pertinentes, obtenidos para el cristal del isómero puro AG2043.

TABLA 1 Datos cristalográficos del AG2043

fórmula	C_{15}H_{12}N_{4}S
grupo espacial	P2_{l}
a, \ring{A}	10,834 (2)
b, \ring{A}	19,081 (4)
c, \ring{A}	6,618 (1)

TABLA 1 (continuación)

\beta, grados	107,10 (1)
V, \ring{A}^{3}	1307,7 (5)
Z	4
\rho calc., gcm^{-3}	1,42
\mu (CuK\alpha), cm^{-1}	21,46
nº de reflexiones únicas	2007
nº de reflexiones con I \geq 3 \sigma_{I}	1688
R	0,049
R_{w}	0,062

AG2044

Todas las operaciones de computador para determinar los valores cristalográficos se realizan con un ordenador VAX9000 de la Universidad Hebrea de Jerusalén, empleando un programa informático TEXSAN para el análisis estructural. Los datos se obtienen empleando un difractómetro ENRAF-NONIUS CAD-4 controlado por el ordenador. Se emplea radiación CuK\alpha(\lambda = 1,54178 \ring{A}) con un monocromador de cristal de grafito para el rayo incidente. Se utilizan programas estándar de centrado CAD-4, indexado y recogida de datos. Las dimensiones de la celdilla unitaria se obtienen por ajuste de cuadrados mínimos de 24 reflexiones centradas en el intervalo de 25º \leq \theta \leq 30º.

Los datos de intensidad se recogen empleando la técnica \omega-2\theta hasta un máximo 2\theta de 120º. La anchura de escaneo, \Delta\omega, para reflexión es de 0,80 \pm 0,15 tan \theta. Una apertura de una altura de 4 mm y una anchura variable, calculada como 2,0 \pm 0,5 tan \theta, se localiza a 173 mm del cristal. Las reflexiones se miden en primer lugar con una velocidad de escaneo de 8,24º/minuto. La velocidad del escaneo final se calcula a partir de los resultados del escaneo preliminar, de modo que la relación I/\sigma (I) sea por lo menos de 40, pero el tiempo máximo de escaneo no deberá sobrepasar los 60 segundos. Si en el escaneo preliminar I/\sigma (I) < 2, esta medición se utiliza como dato de referencia. Las velocidades de escaneo varían entre 1,27 y 8,24º/minuto. De los 96 pasos del escaneo, los primeros 16 y los últimos 16 se consideran como fondo o base. Durante la recogida de datos, se hace el seguimiento de tres reflexiones estándar cada hora de exposición a los rayos X. No se observa disminución. Además se chequean tres orientaciones estándar después de 100 reflexiones con el fin de comprobar los efectos del movimiento del cristal. Si la desviación estándar de los valores h, k e I de cada reflexión de orientación es mayor que 0,08, se calcula una nueva matriz de orientación sobre la base de un nuevo centrado de las 20 reflexiones de referencia.

Se corrigen las intensidades atendiendo a los efectos Lorenz y de polarización. Se encuentran todos los átomos que no son de hidrógeno utilizando los resultados del método de análisis directo SHELX-86 (30). Después de varios ciclos de refinamiento se calculan las posiciones de los átomos de hidrógeno y se añaden al proceso de refinamiento. El refinamiento se realiza por convergencia minimizando la función \Sigmaw (|F_{o}| - |F_{c}|)^{2}. Un mapa final de diferencias de síntesis de Fourier presenta varios picos inferiores a 0,37 e/\ring{A}^{3} esparcidos en la célula unitaria, sin un rasgo significativo.

En la siguiente tabla se presentan los índices de discrepancia, R = \Sigma||F_{o}| - |F_{c}|| / \Sigma|F_{o}| y R_{w} = [\Sigmaw(|F_{o}| - |F_{c}|)^{2} / \Sigmaw(|F_{o}|^{2}]^{1/2} así como otros datos cristalográficos pertinentes, obtenidos para el cristal del isómero puro AG2044.

TABLA 2 Datos cristalográficos del AG2044

fórmula	C_{15}H_{12}N_{4}S-1,5H_{2}O
grupo espacial	P2_{l}/c
a, \ring{A}	7,261 (3)
b, \ring{A}	17,789 (3)
c, \ring{A}	23,293 (4)
\beta, grados	98,00 (3)
V, \ring{A}^{3}	2979 (1)
Z	8
\rho calc., gcm^{-3}	1,37
\mu (CuK\alpha), cm^{-1}	20,07
nº de reflexiones únicas	4560
nº de reflexiones con I \geq 3 \sigma_{I}	3621
R	0,051
R_{w}	0,074

Por cristalización del AG2043 y del AG2044 en acetonitrilo permite obtener cristales individuales, cuyas estructuras se determinan de modo inequívoco por análisis de rayos X. Las celdillas unitarias del AG2043 y del AG2044 contienen dos orientaciones diferentes de cada molécula (tal como se muestra en las celdillas unitarias presentadas en las figura 1 y 3), con la molécula de agua en la celdilla unitaria del AG2044.

En las siguientes tablas 3 y 4 se presentan más datos que caracterizan la estructura cristalina del AG2043, proporcionando las distancias de los enlaces intramoleculares (tabla 3) y los parámetros angulares (tabla 4) que afectan a los átomos que no son hidrógenos. En las siguientes tablas 5, 6 y 7 se presentan más datos característicos de la estructura cristalina del AG2044, proporcionando las distancias de los enlaces intramoleculares (tabla 5) y los parámetros angulares (tabla 6) que afectan a los átomos que no son hidrógenos (tabla 7).

En las figuras 1, 2a-b se presentan la estructura cristalina de la celdilla unitaria del AG2043, obtenida por análisis de rayos X después de la cristalización en acetonitrilo (figura 1) y la estructura molecular del AG2043 (figuras 2a-b).

En las figuras 3, 4a-b se presentan la estructura cristalina de la celdilla unitaria del AG2044, obtenida por análisis de rayos X después de la cristalización en acetonitrilo (figura 3) y la estructura molecular del AG2044 (figuras 4a-b).

Las estructuras moleculares de los compuestos presentados pueden dividirse por tanto con arreglo a su ordenamiento geométrico: de modo similar a los sustituyentes de los átomos de carbono unidos por un doble enlace, los sustituyentes pueden estar situados al mismo lado del doble enlace (cis) o en lados opuestos (trans). Por consiguiente, los sustituyentes sobre los nitrógenos del anillo imidazol (anillo terminal de 5 eslabones), que ocupan las posiciones 1 y 2 pueden estar situados al mismo lado que el sustituyente arilo del anillo terminal de 6 eslabones (posición 7 del compuesto), formando un ordenamiento geométrico "similar a un cis" ("cisoide") o en lados opuestos (posición 6 del compuesto), formando un ordenamiento geométrico "similar a un trans" ("transoide").

Los datos presentados demuestran que la estructura del isómero más potente, el AG2043 (ver a continuación los resultados de actividad biológica), es una estructura "transoide", es decir, 1,2-dimetil-6-tiofeno (figura 2a-b), en el que el 1-metilo y el anillo tiofeno están en configuración "trans" uno respecto al otro, y algo similar ocurre con el AG2044, la estructura "cisoide", el 1,2-dimetil-7-tiofeno (figura 4a-b).

Volviendo a la evaluación química y a las características biológicas del par de isómeros AG 2033 y AG2034, se obtienen resultados similares: la velocidad de elución a través del gel de sílice (CCF) arroja valores R_{f} idénticos (0,5 y 0,6 para el AG2034 y para el AG2033, respectivamente) y lo mismo se diga del análisis estructural según la RMN. Además, la evaluación de la inhibición "in vitro" de la autofosforilación del PDGF\betaR indica que existen potencias diferenciales en los compuestos, demostrando que el AG2033 es el isómero más potente, si se compara con el AG2034 (véase a continuación los datos biológicos). Por lo tanto, por analogía con el par de isómeros AG2043 y AG2044, en el par de inhibidores AG2033 y AG2034 (en los que un grupo fenilo sustituye al tiofeno) se supone que el AG2033 tiene la estructura "transoide".

TABLA 3 Distancias intramoleculares de los átomos diferentes al hidrógeno del AG2043

Átomo	Átomo	Distancia	Átomo	Átomo	Distancia
S (1)	C (1)	1.733 (6)	C (1)	C (5)	1.454 (9)
S (1)	C (4)	1.700 (8)	C (2)	C (3)	1.41 (1)
S (2)	C (16)	1.709 (6)	C (3)	C (4)	1.33 (1)
S (2)	C (19)	1.703 (9)	C (5)	C (6)	1.420 (9)
N (1)	C (5)	1.328 (7)	C (7)	C (8)	1.430 (8)
N (1)	C (8)	1.371 (7)	C (7)	C (12)	1.396 (8)
N (2)	C (6)	1.291 (8)	C (8)	C (9)	1.405 (8)
N (2)	C (7)	1.380 (7)	C (9)	C (10)	1.383 (8)
N (3)	C (10)	1.386 (8)	C (10)	C (11)	1.425(8)
N (3)	C (13)	1.297 (8)	C (11)	C (12)	1.363 (8)
N (4)	C (11)	1.371 (7)	C (13)	C (14)	1.471 (9)
N (4)	C (13)	1.392 (7)	C (16)	C (17)	1.359 (9)
N (4)	C (15)	1.442 (8)	C (16)	C (20)	1.469 (9)
N (5)	C (20)	1.314 (8)	C (17)	C (18)	1.44 (1)
N (5)	C (23)	1.369 (8)	C (18)	C (19)	1.31 (1)
N (6)	C (21)	1.309 (8)	C (20)	C (21)	1.410(9)
N (6)	C (22)	1.367 (7)	C (22)	C (23)	1.447 (8)

TABLA 3 (continuación)

Átomo	Átomo	Distancia	Átomo	Átomo	Distancia
N (7)	C (25)	1.397 (8)	C (22)	C (27)	1.386 (8)
N (7)	C (28)	1.306 (8)	C (23)	C (24)	1.383 (8)
N (8)	C (26)	1.378 (8)	C (24)	C (25)	1.375 (8)
N (8)	C (28)	1.376 (8)	C (25)	C (26)	1.417 (8)
N (8)	C (30)	1.461 (8)	C (26)	C (27)	1.372 (8)
C (1)	C (2)	1.362 (9)	C (28)	C (29)	1.48 (1)

Las distancias se expresan en angstroms. Las desviaciones estándar estimadas para la figura menos significativa se indican entre paréntesis.

TABLA 4 Ángulos de enlaces intramoleculares de los átomos distintos al hidrógeno del AG2043

Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo	Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo
C (1)	S (1)	C (4)	91.3 (4)	C (8)	C (7)	C (12)	121.2 (5)
C (16)	S (2)	C (19)	91.3 (4)	N (1)	C (8)	C (7)	120.8 (5)
C (5)	N (1)	C (8)	117.1 (5)	N (1)	C (8)	C (9)	118.0 (5)
C (6)	N (2)	C (7)	117.0 (5)	C (7)	C (8)	C (9)	121.1 (6)
C (10)	N (3)	C (13)	106.1 (5)	C (8)	C (9)	C (10)	117.1 (5)
C (11)	N (4)	C (13)	107.0 (5)	N (3)	C (10)	C (9)	130.2 (5)
C (11)	N (4)	C (15)	125.8 (5)	N (3)	C (10)	C (11)	109.4 (5)
C (13)	N (4)	C (15)	127.2 (5)	C (9)	C (10)	C (11)	120.4 (5)
C (20)	N (5)	C (23)	117.8 (5)	N (4)	C (11)	C (10)	104.9 (5)
C (21)	N (6)	C (22)	116.9 (5)	N (4)	C (11)	C (12)	131.5 (6)
C (25)	N (7)	C (28)	105.0 (5)	C (10)	C (11)	C (12)	123.5 (6)
C (26)	N (8)	C (28)	107.1 (5)	C (7)	C (12)	C (11)	116.6 (5)
C (26)	N (8)	C (30)	125.1 (5)	N (3)	C (13)	N (4)	112.6 (5)
C (28)	N (8)	C (30)	127.8 (6)	N (3)	C (13)	C (14)	126.1 (5)
S (1)	C (1)	C (2)	110.3 (5)	N (4)	C (13)	C (14)	121.3 (6)
S (1)	C (1)	C (5)	119.2 (4)	S (2)	C (16)	C (17)	111.7 (5)
C (2)	C (1)	C (5)	130.4 (6)	S (2)	C (16)	C (20)	120.2 (5)
C (1)	C (2)	C (3)	112.7 (6)	C (17)	C (16)	C (20)	128.1 (6)
C (2)	C (3)	C (4)	113.1 (7)	C (16)	C (17)	C (18)	111.3 (7)
S (1)	C (4)	C (3)	112.5 (6)	C (17)	C (18)	C (19)	112.6 (8)
N (1)	C (5)	C (1)	117.6 (5)	S (2)	C (19)	C (18)	113.1 (7)
N (1)	C (5)	C (6)	121.0 (6)	N (5)	C (20)	C (16)	117.4 (5)
C (1)	C (5)	C (6)	121.3 (6)	N (5)	C (20)	C (21)	121.2 (6)
N (2)	C (6)	C (5)	123.9 (6)	C (16)	C (20)	C (21)	121.3 (6)
N (2)	C (7)	C (8)	120.1 (5)	N (6)	C (21)	C (20)	123.8 (6)
N (2)	C (7)	C (12)	118.7 (5)	N (6)	C (22)	C (23)	120.0 (5)
N (6)	C (22)	C (27)	119.0 (5)	C (23)	C (22)	C (27)	120.9 (5)
N (5)	C (23)	C (22)	120.1 (5)	N (5)	C (23)	C (24)	119.9 (5)
C (22)	C (23)	C (24)	119,9 (6)	C (23)	C (24)	C (25)	119.3 (6)
N (7)	C (25)	C (24)	130.6 (5)	N (7)	C (25)	C (26)	109.7 (5)
C (24)	C (25)	C (26)	119.7 (5)	N (8)	C (26)	C (25)	104.8 (5)
N (8)	C (26)	C (25)	104.8 (5)	N (8)	C (26)	C (27)	132.1 (5)
C (25)	C (26)	C (27)	123.1 (6)	C (22)	C (27)	C (26)	117.1 (5)
N (7)	C (28)	N (8)	113.4 (6)	N (7)	C (28)	C (29)	125.2 (6)
N (8)	C (28)	C (29)	121.4 (6)

Los ángulos se expresan en grados. Las desviaciones estándar de la figura menos significativa se indican entre paréntesis.

TABLA 5 Distancias intramoleculares de los átomos diferentes al hidrógeno del AG2044

Átomo	Átomo	Distancia	Átomo	Átomo	Distancia
S (1)	C (1)	1.712 (3)	C (1)	C (5)	1.457 (4)
S (1)	C (4)	1.685 (4)	C (2)	C (3)	1.440 (5)
S (2)	C (16)	1.718 (3)	C (3)	C (4)	1.346 (5)
S (2)	C (19)	1.712 (3)	C (5)	C (6)	1.417 (4)
N (1)	C (5)	1.321 (4)	C (7)	C (8)	1.430 (4)
N (1)	C (8)	1.361 (4)	C (7)	C (12)	1.394 (4)
N (2)	C (6)	1.304 (4)	C (8)	C (9)	1.407 (4)
N (2)	C (7)	1.372 (4)	C (9)	C (10)	1.368 (4)
N (3)	C (10)	1.382 (4)	C (10)	C (11)	1.418 (4)
N (3)	C (13)	1.367 (4)	C (11)	C (12)	1.379 (5)
N (3)	C (14)	1.447 (4)	C (13)	C (15)	1.496 (5)
N (4)	C (11)	1.386 (4)	C (16)	C (17)	1.370 (4)
N (4)	C (13)	1.301 (5)	C (16)	C (20)	1.455 (4)
N (5)	C (20)	1.319 (4)	C (17)	C (18)	1.417 (5)
N (5)	C (23)	1.370 (3)	C (18)	C (19)	1.332 (5)
N (6)	C (21)	1.294 (4)	C (20)	C (21)	1.428 (4)
N (6)	C (22)	1.374 (4)	C (22)	C (23)	1.439 (4)
N (7)	C (25)	1.380 (4)	C (22)	C (27)	1.386 (4)
N (7)	C (29)	1.447 (4)	C (24)	C (25)	1.370 (4)
N (8)	C (26)	1.388 (4)	C (25)	C (26)	1.418 (4)
N (8)	C (28)	1.312 (4)	C (26)	C (27)	1.370 (4)
C (1)	C (2)	1.396 (4)	C (28)	C (30)	1.478 (4)

Las distancias se expresan en angstroms. Las desviaciones estándar estimadas para la figura menos significativa se indican entre paréntesis.

TABLA 6 Ángulos de enlaces intramoleculares de los átomos distintos al hidrógeno del AG2044

Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo	Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo
C (1)	S (1)	C (4)	92.3 (2)	C (8)	C (7)	C (12)	120.9 (3)
C (16)	S (2)	C (19)	91.5 (2)	N (1)	C (8)	C (7)	121.2 (3)
C (5)	N (1)	C (8)	117.4 (2)	N (1)	C (8)	C (9)	118.5 (3)
C (6)	N (2)	C (7)	117.1 (3)	C (7)	C (8)	C (9)	120.3 (3)
C (10)	N (3)	C (13)	106.3 (3)	C (8)	C (9)	C (10)	117.3 (3)
C (10)	N (3)	C (14)	125.3 (3)	N (3)	C (10)	C (9)	131.6 (3)
C (13)	N (3)	C (14)	128.2 (3)	N (3)	C (10)	C (11)	105.4 (3)
C (11)	N (4)	C (13)	105.7 (3)	C (9)	C (10)	C (11)	122.8 (3)
C (20)	N (5)	C (23)	117.2 (3)	N (4)	C (11)	C (10)	108.9 (3)
C (21)	N (6)	C (22)	117.2 (3)	N (4)	C (11)	C (12)	130.7 (3)
C (25)	N (7)	C (28)	106.9 (2)	C (10)	C (11)	C (12)	120.4 (3)
C (25)	N (7)	C (29)	125.1 (2)	C (7)	C (12)	C (11)	118.2 (3)
C (28)	N (7)	C (29)	128.0 (3)	N (3)	C (13)	N (4)	113.6 (3)
C (26)	N (8)	C (28)	105.5 (3)	N (3)	C (13)	C (15)	122.0 (4)
S (1)	C (1)	C (2)	112.2 (2)	N (4)	C (13)	C (15)	124.4 (4)
S (1)	C (1)	C (5)	119.5 (2)	S (2)	C (16)	C (17)	110.9 (2)

TABLA 6 (continuación)

Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo	Átomo	Átomo	Átomo	Ángulo
C (2)	C (1)	C (5)	128.3 (3)	S (2)	C (16)	C (20)	119.8 (2)
C (1)	C (2)	C (3)	109.1 (3)	C (17)	C (16)	C (20)	129.3 (3)
C (2)	C (3)	C (4)	114.1 (3)	C (16)	C (17)	C (18)	112.3 (3)
S (1)	C (4)	C (3)	112.3 (3)	C (17)	C (18)	C (19)	113.0 (3)
N (1)	C (5)	C (1)	117.7 (3)	S (2)	C (19)	C (18)	112.3 (3)
N (1)	C (5)	C (6)	120.9 (3)	N (5)	C (20)	C (16)	117.9 (3)
C (1)	C (5)	C (6)	121.3 (3)	N (5)	C (20)	C (21)	121.2 (3)
N (2)	C (6)	C (5)	123.6 (3)	C (16)	C (20)	C (21)	120.9 (3)
N (2)	C (7)	C (8)	119.8 (3)	N (6)	C (21)	C (20)	123.5 (3)
N (2)	C (7)	C (12)	119.3 (3)	N (6)	C (22)	C (23)	119.9 (3)
N (6)	C (22)	C (27)	119.7 (3)	C (23)	C (22)	C (27)	120.4 (3)
N (5)	C (23)	C (22)	120.8 (3)	N (5)	C (23)	C (24)	118.6 (3)
C (22)	C (23)	C (24)	120.5 (3)	C (23)	C (24)	C (25)	117.2 (3)
N (7)	C (25)	C (24)	132.0 (3)	N (7)	C (25)	C (26)	105.2 (2)
C (24)	C (25)	C (26)	122.9 (3)	N (8)	C (26)	C (25)	109.4 (2)
N (8)	C (26)	C (27)	130.6 (3)	C (25)	C (26)	C (27)	120.1 (3)
C (22)	C (27)	C (26)	118.9 (3)	N (7)	C (28)	N (8)	113.1 (3)
N (7)	C (28)	C (30)	121.9 (3)	N (8)	C (28)	C (30)	125.0 (3)

Los ángulos se expresan en grados. Las desviaciones estándar de la figura menos significativa se indican entre paréntesis.

TABLA 7 Distancias intermoleculares de los átomos distintos al hidrógeno en el AG2044

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 átomo \+  \hskip2cm  \+ átomo \+   \hskip2cm   \+
distancia \+   \hskip2cm   \+ ADC (*)\cr \+\+\+\+\+\+\cr  O
(1w)  \+ \+ O (2w)  \+ \+ 2,764 (5) \+  \+ 66703\cr  O (1w) \+ \+  O
(3w)  \+ \+ 2,777 (5)  \+ \+ 1\cr  O (1w) \+ \+  N (4)  \+ \+ 2,825
(4)  \+ \+ 1\cr  O (2w) \+ \+  O (3w) \+  \+ 2,702 (5) \+  \+ 1\cr 
O (2w) \+ \+  N (8)  \+ \+ 2,816 (4) \+  \+
1\cr}

Contactos hasta los 3,00 angstroms. Las desviaciones estándar de la figura menos significativa se indican entre paréntesis.

Ejemplo 2 Análisis biológico Inhibición "in vitro" por acción de las tirfostinas de la fosforilación de la tirosina inducida por el PDGF

Para evaluar y comparar los efectos inhibidores de los compuestos tirfostinas sobre la actividad de la tirosina-quinasa se utiliza una preparación del PDGFR purificado a partir de membranas de células Swiss 3T3. Se evalúan varias concentraciones de los isómeros "transoides" purificados AG2033 y AG2043. En la siguiente tabla 8 se recogen los valores de la IC_{50} (inhibición de la fosforilación en un 50%, concentración del compuesto en \muM) del AG2033 y del AG2043. Los datos corresponden a las potencias de los compuestos con respecto al PDGFR, determinadas utilizando el receptor aislado (véase métodos experimentales en la sección anterior).

\newpage

TABLA 8

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 concentración ( \mu M) \+   \hskip2cm  \+ % del control \+
  \hskip2cm \+  % del control\cr       \+ \+  AG2033 \+ \+ 
AG2043\cr \+\+\+\+\cr  0 \+ \+  100 \+ \+  100\cr  0,03 \+ \+  97,9
\+ \+  60,1\cr  0,1 \+ \+  37 \+ \+  41,6\cr  0,3 \+ \+  17,9 \+ \+ 
40,4\cr  1 \+ \+  13,7 \+ \+  15,1\cr  3 \+ \+  9,8 \+ \+  11\cr 
IC _{50}  \+ \+  0,07 \+ \+ 
0,09\cr}

Las reacciones de la quinasa, utilizando una preparación del PDGF\betaR aislado, en presencia de tirfostina 0,03-3 \muM se realiza utilizando como sonda el ATP[\gamma-P^{32}]. Los análisis se realizan sometiendo las muestras al SDS-PAGE, cuyos radiogramas se recogen en la figura 5. La evaluación densitométrica, relativa al control sin el inhibidor tirfostina (100%), proporciona la actividad porcentual de la autoquinasa, que se recoge en la tabla 8 y las curvas de dosis-respuesta de los isómeros transoides purificados, el AG2033 (figura 6) y el AG2043 (figura 7). En la figura 8 se presenta una comparación más detallada de los autorradiogramas resultantes de cada par de isómeros geométricos, el AG2033 y el AG2034 (recuadro superior), el AG2043 y el AG2044 (recuadro inferior); sobre su actividad inhibidora de la autofosforilación del PDGF\betaR inducida por el PDGF (intervalo de concentraciones: de 0,1 a 10 \muM) en células intactas. El isómero "transoide" AG2033 despliega una actividad inhibidora marcada en una concentración de 1 \muM, mientras que el isómero "cisoide", el AG2034, requiere concentraciones mucho más elevadas (de 10 a 30 \muM) para lograr una inhibición similar. Estos datos demuestran que el AG2033 tiene una actividad superior (mayor potencia) que el isómero AG2034. La misma relación de potencias existe entre los isómeros AG2043 y AG2044.

Inhibición causada por la tirfostina en la fosforilación de la tirosina inducida por el PDGF en células intactas

La estimulación de las células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) con el PDGF-BB (100 ng/ml) se traduce en una intensa fosforilación del receptor PDGF-\beta de los restos tirosina. La adición de compuestos tirfostina a las células antes de la estimulación del PDGF inhibe por completo la fosforilación de la tirosina del receptor PDGF-\beta. En la siguiente tabla 9 se recogen los valores IC_{50} (inhibición de la fosforilación en un 50%, \muM) de varis tirfostinas, el AG1295 (que actúa como control positivo) y los isómeros purificados del AG1851:AG2033, AG2034 y AG1992:AG2043, AG2044. Los datos de la tabla 9 indican potenciales diferenciales entre los distintos productos en lo que respecta al PDGFR y al KDR, constatados en células PAEC intactas que expresan estos receptores (véase métodos experimentales en la sección anterior).

TABLA 9

compuesto	\hskip2cm	PDGFR	\hskip2cm	KDR
AG2033		0,5		>10
AG2034		10,0		n.d.
AG2043		1,0		3,0
AG2044		5,0		n.d.
AG1295		n.d.		1,0
n.d. = no determinado

Estos compuestos no inhiben otros receptores de tirosina-quinasas en concentraciones menores que 75 \muM. El único receptor afectado por los compuestos recién mencionados es el KDR/VEGFR, pero solamente a concentraciones que son por lo menos de 3 a 20 veces mayores que las necesarias para afectar a la quinasa del PDGFR. Por lo tanto, estos compuestos constituyen bloqueadores eficaces y selectivos de la quinasa del PDGFR. Además, para cada par de isómeros (AG2033, AG2034 y AG2043, AG2044) se evidencian potencias superiores en el isómero "transoide" (AG2033, AG2043) que en el isómero "cisoide" (AG2034, AG2044).

Efectos de las tirfostinas en la proliferación celular Células de músculo liso de corazón de cerdo (SMC)

El tratamiento de células de músculo liso de corazón de cerdo (SMC) con los isómeros purificados AG2043 y AG2044, derivados del AG1992, así como con el AG1295 (concentración 10 \muM en cada caso) se traduce en una reducción media del 46%, del 84% y del 61%, respectivamente, en el recuento de SMC en el día 3 si se compara con las células de control tratadas únicamente con DMSO. Tal como se describe a continuación, el efecto inhibidor del AG2043, del AG2044 y del AG1295 es completamente reversible.

En la figura 9 se muestran los efectos inhibidor y de recuperación de los isómeros AG2043 y AG2044, derivados del AG1992, así como del AG1295 en la proliferación de las células SMC de corazón de cerdo. Se cultivan las células en presencia de las tirfostinas mencionadas y se cuentan en los días 3, 6 y 13 de cultivo. En el día 7 se lavan los cultivos y se deja que las células se recuperen. Las tres tirfostinas muestran un potente efecto inhibidor del crecimiento, si se comparan con los controles. El isómero "transoide", el AG2043, despliega una mayor potencia inhibidora que su oponente, el isómero "cisoide" AG2044. En una concentración de 10 \muM, el AG2043 induce una inhibición muy eficaz, sin tener efecto tóxico sustancial en las células. El efecto inhibidor de los tres compuestos es reversible y las células adoptan de nuevo una respuesta normal de crecimiento tan pronto se cesa el tratamiento con las tirfostinas.

Células endoteliales aórticas porcinas (PAEC)

Se evalúan también los efectos inhibidores de los compuestos tirfostina en la proliferación de células PAEC inducida por el PDGF.

En la siguiente tabla 10 se recogen los valores IC_{50} (inhibición de la proliferación en un 50%, \muM) del isómero AG2033 purificado en las células PAEC transfectadas con PDGFR y KDR.

TABLA 10

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 compuesto \+  \hskip2cm  \+ PDGF \beta R \+ 
 \hskip2cm  \+ KDR\cr \+\+\+\+\cr  AG2033 \+ \+  2,5 \+  \+
>10\cr}

De igual manera a los resultados de inhibición obtenidos en la autofosforilación de los receptores respectivos, la tirfostina AG2033 purificada demuestra ser un inhibidor potente y selectivo de la proliferación de células PAEC transfectadas con PDGF\betaR. Se obtienen resultados similares con las células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC).

Efectos de las tirfostinas en la migración celular

La evaluación de la migración de las células PAEC transfectadas de modo estable con el PDGF\betaR o el KDR con respecto a los factores de crecimiento respectivos, el PDGF-BB y el VEGF (10 ng/ml, respectivamente), en presencia del isómero AG2033 purificado, se realiza en una cámara Boyden (véase la anterior sección experimental). En la siguiente tabla 11 se recogen los valores IC_{50} (inhibición de la migración en un 50%, \muM) para el isómero AG2033 con respecto al PDGFR y al KDR, obtenidos en células PAEC.

TABLA 11

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 compuesto \+  \hskip2cm   \+ PDGF \beta R \+
 \hskip2cm  \+ KDR\cr \+\+\+\+\cr  AG2033 \+ \+ 5,0 \+ \+
>10\cr}

En buena sintonía con los resultados de inhibición de la autofosforilación, recién descritos con respecto a las células PAEC así como con los resultados de proliferación, la tirfostina purifica AG2033 despliega una inhibición potente y selectiva de la migración de las células PAEC.

En una cámara Boyden se realiza una evaluación ulterior de la migración de las células HCASMC frente al PDGF-BB en presencia del isómero "transoide" purificado (véase la anterior sección experimental).

En la figura 10 se recogen los datos obtenidos con el AG2033. La potente inhibición provocada por el isómero de tirfostina purificado se hace evidente tanto en ausencia como en presencia del factor de crecimiento PDGF-BB, es decir, la inhibición dependiente de la dosis se lograr tanto en la actividad migratoria basal (IC_{50} <10 \muM) como en la inducida (IC_{50} <3 \muM) de las células HCASMC. Estos resultados guardan buena relación con los efectos inhibidores descritos anteriormente del AG2033 sobre la migración de las células PAEC y los efectos obtenidos sobre la autofosforilación del receptor.

De manera similar, en la figura 11 se representan los datos obtenidos con el AG2043. Se hace evidente de nuevo la potente inhibición que provoca el isómero de tirfostina purificada tanto en ausencia como en presencia del factor de crecimiento PDGF-BB, es decir, se consigue una inhibición dependiente de la dosis tanto en la actividad migratoria basal (IC_{50} <10 \muM) como en la inducida (IC_{50} \approx 3 \muM) de las células HCASMC. Estos resultados guardan buena relación con los efectos inhibidores descritos anteriormente del AG2043 sobre la autofosforilación del receptor y sobre la migración de las células SMC porcinas.

Una composición farmacéutica de tirfostinas y un método para su entrega "in vitro"

Con arreglo a la presente invención, las tirfostinas se entregan a una zona tratada con balón de una arteria por recubrimiento del balón con nanopartículas de liberación lenta de tirfostina, que descargan lentamente la tirfostina en la zona tratada con el balón, de este modo se inhibe la proliferación celular en la zona tratada.

Para este fin se formula un compuesto tirfostina en nanopartículas, por ejemplo en nanopartículas de ácido poliláctico (PLA) con la tirfostina preparada por un método de emulsión de aceite en agua (O/W) y evaporación del disolvente, del modo que sigue.

Se disuelven cincuenta mg de PLA y 3 mg de la o las tirfostinas seleccionadas en una mezcla orgánica de 0,5 ml de diclorometano y 10 ml de acetona. Se añade la solución orgánica a 20 ml de una solución acuosa que contiene un 0,5% de Poloxamer F68. Se agita la emulsión de tipo aceite en agua (O/W) con un agitador magnético de una potencia de 20 watios durante 5 minutos. Se evaporan los disolventes orgánicos en un evaporador rotatorio a una presión de 20 mm de Hg, obteniéndose una suspensión coloidal de nanopartículas. Finalmente se pasa la suspensión obtenida a través de un papel de filtro Whatman 40.

Esta formulación puede emplearse para inhibir la proliferación celular a través de un mecanismo de liberación lenta en varios trastornos proliferantes, incluidos, pero sin limitarse a ellos, la psoriasis, el papilloma, la restenosis, la arteriosclerosis, la estenosis "in-stent", la restenosis de injerto vascular, la fibrosis pulmonar, la nefritis glomerular, la artritis reumatoide y los estados patológicos malignos asociados con receptores del PDGF.

Aunque la invención se haya descrito en combinación con formas de ejecución específicas de la misma, es evidente que los expertos en la materia podrán intuir muchas alternativas, modificaciones y variaciones.

Lista de referencias citadas

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\newpage

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Claims (32)

1. Un isómero de tirfostina sustancialmente purificado de la fórmula general

7

(compuesto I)

o

8

(compuesto II)

en las que

4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican posiciones del anillo aromático terminal de 6 eslabones;

A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno;

B es un carbono;

la línea de puntos en el anillo de cinco eslabones significa que el enlace A- -B o el enlace B- -D es un doble enlace;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno participa en el doble enlace, entonces R_{1} o R_{3}, respectivamente, es un par de electrones;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno no participa en el doble enlace, R_{1} o R_{3} se elige entre el grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo;

R_{5} y R_{7} se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones;

R_{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} o bien R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5 a 7 eslabones;

R_{6} se elige entre el grupo formado por alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y una sal fisiológicamente aceptable del mismo;

R_{4} y R_{8} se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal fisiológicamente aceptable;

R_{10} y R_{11} se eligen con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal fisiológicamente aceptable;

mientras que dicho R_{6} ocupa la posición 6;

con la condición de que, para el compuesto I, el isómero de tirfostina es capaz de inhibir la actividad de la PDGF-receptor-quinasa.

2. El isómero de tirfostina purificado de la reivindicación 1, en el que

el enlace A- -B es un doble enlace;

R_{1} y R_{2} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado poor alquilo, alcoxi, halógeno, arilo, heteroarilo, nitro y amino; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} forman una estructura de anillo de 5 a 7 eslabones;

R_{3}, R_{5} y R_{7} son en cada caso un par de electrones;

R_{6} es un arilo elegido entre el grupo formado por fenilo, ferroceno, tiofeno, furano, pirrol, indol, tiazol, imidazol y piridina.

3. El isómero de tirfostina purificado según la reivindicación 2, en el que

R_{1} y R_{2} son en cada caso metilo;

R_{4} y R_{8} son en cada caso hidrógeno.

4. Una composición farmacéutica que, como ingrediente activo, contiene el isómero de tirfostina purificado de la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de la composición 4, en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo de liberación lenta.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que el vehículo de liberación lenta es el ácido poliláctico.

7. Composición farmacéutica de la composición 4 para el uso como medicamento destinado a tratar o prevenir un trastorno relacionado con una proteína-tirosina-quinasa en un organismo, que consta del paso de administrar a dicho organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica.

8. Uso de una composición farmacéutica de la reivindicación 4 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de un trastorno relacionado con una proteína-tirosina-quinasa en un organismo, que consiste en el paso de administrar a dicho organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica.

9. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 7 ú 8, en la que dicho trastorno relacionado con la proteína-tirosina-quinasa se elige entre el grupo formado por un trastorno relacionado con el EGF, un trastorno relacionado con el PDGF, un trastorno relacionado con el IGF o un trastorno relacionado con las met.

10. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 7 ú 8, en la que dicho trastorno relacionado con la proteína-tirosina-quinasa se elige entre el grupo formado por un trastorno proliferativo celular, un trastorno fibrótico y un trastorno metabólico.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que dicho trastorno proliferativo celular se elige entre el grupo formado por formado por el papilloma, el blastoglioma, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovarios, el cáncer de próstata, el carcinoma celular escamoso, el astrocitoma, el cáncer de cabeza, el cáncer de cuello, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, el cáncer de tiroides, el cáncer de páncreas, el cáncer gástrico, el carcinoma hepatocelular, la leucemia, el linfoma, la enfermedad de Hodgkin, la enfermedad de Burkitt, la artritis, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la angiogénesis, la restenosis, la restenosis "in-stent", la restenosis de injerto vascular.

\newpage

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que dicho trastorno fibrótico celular se elige entre descritas, el trastorno fibrótico celular se elige entre el grupo formado por la fibrosis pulmonar, la cirrosis hepática, la arteriosclerosis, la glomerulonefritis, la nefropatía diabética, los síndromes de microangiopatía trombótica, el rechazo de trasplante.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que dicho trastorno metabólico celular se elige entre el grupo formado por la psoriasis, la diabetes, la curación de heridas, la inflamación y las enfermedades neurodegenerativas.

14. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 7 ú 8, en la que dicho trastorno relacionado con la proteína-tirosina-quinasa se elige entre el grupo formado por el papilloma, el blastoglioma, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovarios, el cáncer de próstata, el carcinoma celular escamoso, el astrocitoma, el cáncer de cabeza, el cáncer de cuello, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, el cáncer de tiroides, el cáncer de páncreas, el cáncer gástrico, el carcinoma hepatocelular, la leucemia, el linfoma, la enfermedad de Hodgkin, la enfermedad de Burkitt, la artritis, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la angiogénesis, la restenosis, la restenosis "in-stent", la restenosis de injerto vascular, la cirrosis hepática, la arteriosclerosis, la angiogénesis, la glomerulonefritis, la nefropatía diabética, los síndromes de microangiopatía trombótica, el rechazo de trasplante, la enfermedades autoinmunes, la curación de las heridas, la inflamación, las enfermedades neurodegenerativas, la diabetes y los trastornos hiperinmunes.

15. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 7 ú 8, en la que dicho organismo es un mamífero.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en la que dicho mamífero es un humano.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 para el uso como medicamento destinado al tratamiento local o a la prevención de un trastorno de un tejido de un organismo que consta del paso de la aplicación local de dicha composición farmacéutica sobre dicho tejido.

18. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 4 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento local o a la prevención de un trastorno de un tejido de un organismo que consta del paso de la aplicación local de dicha composición farmacéutica sobre dicho tejido.

19. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 17 ó 18, en la que dicho organismo es un ser humano.

20. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 17 ó 18, en la que dicho tejido se elige entre el grupo formado por un vaso sanguíneo, el pulmón o la piel.

21. Isómero de tirfostina purificado de la reivindicación 1 para el uso como medicamento destinado a inhibir la proliferación celular, que consiste en el paso de someter las células a dicho isómero purificado de la tirfostina.

22. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 4 para la fabricación de un medicamento destinado a inhibir la proliferación celular, que consiste en el paso de someter las células a dicho isómero purificado de tirfostina.

23. El isómero purificado de la tirfostina de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que dichas células son de un organismo, mientras que el someter las células a dicho isómero purificado de tirfostina se realiza "in vivo".

24. El isómero purificado de tirfostina de la reivindicación 23, en el que dicho organismo es un humano.

25. El isómero purificado de tirfostina de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el someter dichas células a dicho isómero purificado de tirfostina se realiza "in vitro".

26. Un método para enriquecer en un isómero específico una tirfostina de la fórmula general:

9

(compuesto I)

o

10

(compuesto II)

en las que

4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican posiciones del anillo aromático terminal de 6 eslabones;

A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno;

B es un carbono;

la línea de puntos en el anillo de cinco eslabones significa que el enlace A- -B o el enlace B- -D es un doble enlace;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno participa en el doble enlace, entonces R_{1} o R_{3}, respectivamente, es un par de electrones;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno no participa en el doble enlace, R_{1} o R_{3} se elige entre el grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo;

R_{5} y R_{7} se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones;

R_{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} o bien R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5 a 7 eslabones;

R_{6} se elige entre el grupo formado por alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable del mismo;

R_{4} y R_{8} se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

R_{10} y R_{11} se eligen con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

mientras que para cada molécula del compuesto I, R_{6} ocupa la posición 6 ó 7, o, para cada molécula del compuesto II, R_{6} ocupa la posición 6 ú 8;

el isómero de tirfostina es capaz de inhibir la actividad de la PDGF-receptor-quinasa;

el método consiste en los pasos siguientes:

(i) cromatografiar dicha tirfostina a través de una matriz, con lo cual se separan los isómeros posicionales de dicha tirfostina;

(ii) recoger por lo menos un isómero posicional específico de dicha tirfostina.

27. El método de la reivindicación 26, que consta además del paso siguiente:

(iii) cristalizar por lo menos dicho isómero posicional específico.

28. El método de la reivindicación 26, en el que el enlace A- -B es un doble enlace;

R_{1} y R_{2} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo, alcoxi, halógeno, arilo, heteroarilo, nitro y amino; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} forman una estructura de anillo de 5 a 7 eslabones;

R_{3}, R_{5} y R_{7} son en cada caso un par de electrones;

R_{6} es un arilo elegido entre el grupo formado por fenilo, ferroceno, tiofeno, furano, pirrol, indol, tiazol, imidazol y piridina.

29. El método de la reivindicación 28, en el que

R_{1} y R_{2} son en cada caso metilo;

R_{4} y R_{8} son en cada caso hidrógeno.

30. Un método para fabricar una composición farmacéutica de liberación lenta de una tirfostina que consta de los pasos siguientes:

(i) proporcionar un isómero purificado de tirfostina de la fórmula general:

11

(compuesto I), o

12

(compuesto II)

en las que

4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican posiciones del anillo aromático terminal de 6 eslabones;

A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno;

la línea de puntos en el anillo de cinco eslabones significa que el enlace A- -B o el enlace B- -D es un doble enlace;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno participa en el doble enlace, entonces R_{1} o R_{3}, respectivamente, es un par de electrones;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno no participa en el doble enlace, R_{1} o R_{3} se elige entre el grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo;

R_{5} y R_{7} se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones;

R_{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} o bien R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5 a 7 eslabones;

R_{6} se elige entre el grupo formado por alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable del mismo;

R_{4} y R_{8} se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

R_{10} y R_{11} se eligen con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

mientras que dicho R_{6} ocupa la posición 6;

el isómero de tirfostina es capaz de inhibir la actividad de la PDGF-receptor-quinasa;

(ii) disolver o dispersar un vehículo de liberación lenta y dicho isómero purificado de tirfostina en un disolvente orgánico para obtener una solución orgánica que contenga dicho vehículo y dicho isómero purificado de tirfostina;

(iii) añadir dicha solución orgánica a una solución acuosa para obtener una emulsión de tipo aceite en agua; y

(iv) evaporar dicho disolvente orgánico de dicha emulsión de tipo aceite en agua para obtener una suspensión coloidal de partículas que contienen dicho vehículo de liberación lenta y dicho isómero purificado de tirfostina.

31. El método de la reivindicación 30, en el que dicho vehículo de liberación lenta es el ácido poliláctico.

32. Un dispositivo de fijación (stent) que consta sustancialmente de una estructura tubular, la estructura está hecha de una material diseñado para la liberación lenta de un isómero purificado de tirfostina de la fórmula general:

13

(compuesto I),

o

14

(compuesto II)

en las que

4, 5, 6, 7, 8 y 9 indican posiciones del anillo aromático terminal de 6 eslabones;

A, D, X e Y son en cada caso un nitrógeno;

la línea de puntos en el anillo de cinco eslabones significa que el enlace A- -B o el enlace B- -D es un doble enlace;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno participa en el doble enlace, entonces R_{1} o R_{3}, respectivamente, es un par de electrones;

cuando A o D es nitrógeno y dicho nitrógeno no participa en el doble enlace, R_{1} o R_{3} se elige entre el grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo;

R_{5} y R_{7} se eligen con independencia entre sí en cada caso entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo, trihalometano-sulfonilo y un par de electrones;

R_{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxi, alcoxi, halógeno, C-carboxi, O-carboxi, carbonilo, tiocarbonilo, C-amido, guanilo, sulfonilo y trihalometano-sulfonilo; o, como alternativa, R_{1} y R_{2} o bien R_{2} y R_{3} forman una estructura cíclica de 5 a 7 eslabones;

R_{6} se elige entre el grupo formado por alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable del mismo;

R_{4} y R_{8} se eligen en cada caso con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonamido, S-sulfonamido, trihalometilsulfonamido, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, ureido, guanilo, guanidino, amino y -NR_{10}R_{11} y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

R_{10} y R_{11} se eligen con independencia entre sí entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo y sulfonilo o, como alternativa, R_{10} y R_{11} forman un anillo heteroalicíclico de cinco o seis eslabones; y una sal o un profármaco fisiológicamente aceptable;

mientras que dicho R_{6} ocupa la posición 6;

el isómero de tirfostina es capaz de inhibir la actividad de la PDGF-receptor-quinasa.