KR20010089171A - 퀴나졸린 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백혈병 및 림프종의 치료에 유용한 신규한 JAK-3 억제제를 제공한다. 상기 화합물은 또한, 썬번 및 UVB-유도 피부 염증과 피부암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 화합물은 UVB 방사의 면역저하 효과를 억제하고, 자가면역질환, 염증 및 이식 거부를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 본 발명은 또한, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물과 그들의 용도를 위한 요법을 제공한다.

Description

퀴나졸린 유도체{QUINAZOLINE DERIVATIVES}
이렇게 해서, JAK-3은 림프구, 대식세포 및 비만세포의 기능에서 필수적 역할을 하는 중요한 효소이다. JAK-3을 억제하는 화합물은 림프구, 대식세포 또는 비만세포의 기능이 관련된 백혈병, 림프종, 이식거부(예컨대, 췌장섬(pancrease islet) 이식거부), 골수 이식 적용(예컨대, 이식편대숙주병(graft-versus-hostdisease)), 자가면역 질환(예컨대, 당료병) 및 염증(천식, 썬번(sunburn) 및 피부암과 연관된 염증) 등의 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용한 것으로 기대되어 지고 있다. 그러한 상태 및 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 화합물 및 방법에 대한 계속적인 요구가 있다.
전사의 신호 변환 및 활성 물질(Signal Transducers and Activators of Transcription: STATs)은 티로신 인산화에 의해 활성화될 때까지 세포질에 잔존하는 DNA 결합 단백질 군이다. 이 인산화 과정은 JAK3를 포함하는 티로신 키나아제의 야누스(Janus) 군의 일원에 의해 촉매된다(Ihle, J. N. Adv. Immunol. 60:1-35; Witthuhn, B. A., et al., Leukemia and Lymphoma. 32:289-297, 1999).
STATs의 신호 분자 및 전사 인자로서의 이중 역할은 이들의 구조에 반영되어 있다. 모든 STAT 단백질은 DNA 결합 도메인, SH2 도메인 및 전사 유도를 위해 필수적인 전사활성(transactivation) 도메인을 포함한다. 비자극 세포에서, STATs의 잠재형(latent form)은 주로 세포질에 위치한다. 리간드 결합은 STAT 단백질이 그들의 SH2 도메인으로 다양한 막투과(transmembrane) 세포 표면 수용체의 세포내 도메인 중 티로신 인산화된 모티프에 결합하는 것을 유도한다(Horvath, C. M. and Darnell, J. E., Curr. Opin. Cell. Biol. 9(2):233-239., 1997; Levy, D. E., Cytokine Growth Factor Rev. 8(1):81-90, 1997).
일단 STATs가 수용체에 결합하면, 수용체-결합 야누스 키나아제(JAKs)는 SH2 도메인에 인접한 단일 티로신 잔기에서 STATs를 인산화한다. 그리고, 두 개의 STATs가 특이적 상호간의 SH2 포스포티로신 상호작용을 통하여 이량체화(dimerize)한다. 이량체화 STAT 단백질은 또한 다른 DNA-결합 단백질과 복합체를 형성할 수 있다. 다음에 STAT 이량체/복합체는 핵으로 이동하고, 그들의 DNA 결합 도메인을 사용하여 표적 유전자 프로모터의 DNA 반응 엘리먼트와 상호작용한다(Demoulin, J. B., et al., Mol. Cell. Biol. 16:4710-6, 1996). STATs는 그들의 전사 활성 도메인을 통하여, 표적 유전자의 전사를 활성화하는 RNA 폴리머라제Ⅱ 복합체 요소들과 직접 또는 간접적으로 상호작용한다. 다른 리간드들은 특이적 JAK 및 STAT 군 성원을 사용하고, 이렇게 해서, 이 경로의 이용이 신호 캐스캐이드에서 특이성을 지시하고, 다양한 배열의 세포 반응을 유도한다. JAK3를 포함하는 야누스 키나아제는 소아암의 가장 일반적인 형태인 급성 림포블라스틱 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL)의 아이들의 1차 백혈병 세포에서 높게 발현되고, 최근의 연구는 세포소멸(apoptosis)을 조절하는 신호와 ALL 세포에서 STAT 활성을 관련시켰다(Demoulin, J. B., et al., Mol. Cell. Biol. 16:4710-6, 1996; Jurlander, J., et al., Blood. 89:4146-52, 1997; Kaneko, S., Suzuki, et al, Clin. Exp. Immun. 109:185-193, 1997; and Nakamura, N., et al., J. Biol. Chem. 271:19483-8, 1996).
도1은 화합물5로부터의 식Ⅰ의 대표 화합물의 합성을 도시한다.
도2a는 단백질(파랑색)의 분자 표면 및 촉매(ATP 결합) 부위(노랑색)를 도시하는 JAK3의 모델이다.
도2b는 JAK3 키나아제 도메인의 상동 모델의 리본 표시(Cα골격)이다. WHI-P131 분자는 JAK-3의 촉매 부위에서 공간-충전(space-filling) 모델로서 도시된다.
도2c는 퀴나졸린 억제제 WHI-P131(연두색)가 도킹된 JAK3 모델의 촉매 부위의 상세도이다. 잔기 및 억제제는 공찬-충전 원자로서 도시된다. 촉매 부위의 용매-노출 개구부는 비교적 평평한 억제제가 들어가서 JAK3에 결합하도록 하는 공간을 갖는다. 포켓의 개구는 잔기 Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 및 Tyr904(파랑색 잔기)로 한정된다. 포켓 안쪽의 깊은 벽은 Leu905(Cα 골격), Glu903, Met902, Lys905 및 Asp967(분홍색 잔기)와 연결되어 있고, 포켓의 바닥은 Leu905(측쇄), Val884, Leu956 및 Ala966(노랑색 잔기)에 의해 연결되어 있다. 포켓의 위를 덮는 잔기는 Leu828, Gly829, Lys830 및 Gly831(가장 위의 파랑색 잔기들)을 포함한다. InsightⅡ 프로그램을 사용하여 제작되었다.
도3a는 JAK3 상동 모델의 촉매(ATP 결합) 부위에서 비어있는 공간의 모델이다. 연두색으로 도시된 것은 ATP에 대한 결합 부위이고, 아마도 디메톡시퀴나졸린 억제제에 대한 결합 부위이다. 연두색 키나아제 활성 부위 영역은 대략 530Å의 총 부피를 나타낸다. 모델링 연구는 이 영역에 특이적으로 결합하는 억제제 또는 억제제의 일부가 530Å3미만을 차지하고, 결합 부위 영역의 형태에 적합한 분자 공간을 갖을 것을 나타내었다. 측정할 수 있는 비어있는 부피를 나타내는 결합 부위에 인접한 다른 영역은 진한 파랑, 분홍, 연두색 및 밝은 파랑색을 나타낸다. 이 결합 영역은 억제제 분자(진한 파랑색)에 무익하거나 용매 분자(분홍, 노랑색, 밝은 파랑색)를 차지할 정도로 충분히 큰 영역을 나타낸다. 촉매 부위로 도킹된 WHI-P131의 모델은 연두색 영역 위에 부과된 백색으로 도시된다.
도3b는 퀴나졸린 WHI-P131(다색), WHI-P132(분홍색) 및 WHI-P154(노랑색)을 갖는 JAK3의 촉매 부위의 모델이다. 각 화합물은 결합 부위에 맞게 들어가나 WHI-P132(생물학적 분석에서 JAK3에 대해 불활성으로 보이는)는 Asp967과 결합하는 위치에서 OH기가 결핍되어 있다. 페닐환의 C4'위치의 OH기와 WHI-P131 및 WHI-P154는 JAK3의 Asp967과 바람직한 상호작용을 형성할 수 있고, 이는 억제 활성을 증가시킬 수 있다.
도3c는 JAK3 촉매 부위에 결합하는 것을 보조할 것으로 예상되는 디메톡시퀴나졸린 유도체의 형태이다.
도4a는 5개의 단백질 티로신 키나아제(JAK3(분홍색), BTK(빨강색), SYK(밝은 파랑색), IRK(어두운 파랑색) 및 HCK(노랑색))의 촉매 부위에서 비보존 잔기의 구조적 비교를 도시한다. 도킹된 JAK3 억제제인 WHI-P131(백색)의 5Å 내의 잔기는 막대 형태의 측쇄로 도시된다. JAK3의 Cα백본은 투시를 위한 가느다란 분홍색 라인으로 도시된다. 영역 A에서 F는 촉매 부위에서 비보존 잔기를 포함하는 영역을 나타낸다(B 와 결과 및 고찰). HCK 및 IRK의 결정 구조 코디네이트 및 JAK3, BTK 및 SYK의 상동 모델은 구조 분석을 위해 사용되었다.
도4b는 8개의 다른 단백질 티로신 키나아제의 촉매 부위에서 비보존 잔기를 나타낸다. 영역 A-F는 A에 도시된 촉매 부위에서 위치를 나타낸다.
도5는 JAK3의 티로신 키나아제 활성에 대한 WHI-P131의 영향을 도시한다.
도5a-d는 적절한 바큘로바이러스 발현 벡터에 감염된 Sf21 곤충 난소 세포로부터 면역침강된(immunoprecipitated) JAK3, JAK1 및 JAK2를 WHI-P131로 처리하고, 방법에 기술된 바와 같이, 시험관내에서 키나아제 분석을 한다. JAKs의 효소 활성은 방법에 기술된 바와 같이, 10분 키나아제 분석에서 자가인산화를 측정하여 결정된다. 키나아제 활성(KA) 수치는 기본 활성의 비율(%CON)으로 표시된다.
도5e는 32Dc22-IL-2Rβ 세포의 EMSAs이다. WHI-P131(10㎍/ml=33.6μM) 및 WHI-P154(10㎍/ml=26.6μM)(WHI-P132;10㎍/ml=33.6μM은 제외)는 32Dc11-IL-2Rβ 세포에서 IL-3 유도된 JAK-1/JAK-2-종속 STAT 활성이 아니라 IL-2 유도된 JAK3-종속 STAT 활성을 억제하였다.
도6은 WHI-P131의 특이성을 도시한다.
적절한 바큘로바이러스 발현 벡터에 감염된 Sf21 곤충 난소 세포로부터 면역침강된 JAK3, SYK 및 BTK, NALM-6 사람 B-직계 ALL 세포로부터 면역침강된 LYN 및HepG2 헵파토마 세포로부터 면역침강된 IRK를 WHI-P131로 처리하고, 방법에 기술된 바와 같이, 시험관내에서 키나아제 분석을 한다.
도7은 WHI-P131이 미토콘드리아 질량에 영향을 미치지 않는 농도-종속형에서 미토콘드리아막을 탈분극한다.
NALM-6 사람 백혈병 세포를 48시간 동안 지시된 농도의 WHI-P131로 인큐베이트하고, DiICl으로 염색하여 미토콘드리아막 전위(△ψm)를 측정하거나, 또는 NAO로 염색하여 미토콘드리아 질량을 측정하고, HeNe 레이저가 장착된 세포 소오터(sorter)로 분석하였다. WHI-P131은 증가하는 농도에 따라 탈분극된 미토콘드리아(도A 중의 M1으로 지시됨)에서 상당한 증가를 유도하였다. 유사한 농도에서, 미토콘드리아 질량(도b)에서는 상당한 변화가 확인되지 않았다. 도7c는 세포를 미토콘드리아 질량(연두색 형광) 및 막투과 전위(빨강/오렌지 형광)의 동시 분석을 위하여 JC-1로 염색하였다. 비처리 NALM-6 세포(d.1)와 WHI-P131 5-μM 처리 NALM-6 세포(d.2)를 24시간 동안 JC-1으로 인큐베이트하고, 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하였다. 대조군 세포의 미토콘드리아는 한층 밝은 JC-1 빨강 형광에 의해 지시된 바와 같이, 한층 높은 막전위(△ψm)를 나타내었다. WHI-P131의 처리 세포는 JC-1 빨강 형광에서 실질적 감소에 의해 지시된 바와 같이 미토콘드리아막 △ψm을 감소시켰다.
도8은 WHI-P131가 NALM-6 백혈병 세포에서 세포소멸을 유도함을 도시한다.
도8a는 세포를 WHI-P131 10μM-500μM으로 24시간 동아 인큐베이트하고, 인 시츄(in situ) 세포소멸 분석을 위해 처리하였다. 세포소멸의 비율은 평균 1380세포/10필드/샘플을 조사하여 측정하였다. 데이터 숫자는 두 개의 독립 실험(b1, b2)에서 얻어진 중복 숫자로부터의 평균을 나타낸다.
도b1 및 도b2는 NALM-6 세포를 WHI-P131 100μM로 48시간 동안 인큐베이트하고, 인 시츄 세포소멸 분석을 위해 처리하고, 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 분석하였다. DMSO(0.1%)로 처리한 대조군과 비교시(도b1), WHI-P131(도b2)로 인큐베이트한 다수의 세포들은 세포소멸 핵(노랑색 형광)을 나타내었다. 빨강 형광은 프로피디움아이오다이드로 염색된 핵을 나타내었다.
도9는 WHI-P131이 사람 백혈병 세포에서 세포소멸 DNA 분절(fragmentation)을 유도하는 것을 도시한다. 대조군 및 약제 처리된 세포의 Triton-X-100 용해물로부터의 DNA를 (21)에 기술된 바와 같이 분절에 대해 분석하였다. 도9a는 NALM-6 사람 B-직계 ALL 세포를 1, 3 또는 10μM의 최종 농도로 열거된 디메톡시퀴나졸린 화합물을 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. WHI-P131은 유도 JAK3 억제 화합물로 사용되고, 모든 다른 화합물은 JAK3 억제 활성이 결핍된 대조군으로서 포함된다. 도9b는 LCl;19 사람 B-직계 ALL 세포, 대조군 세포주 SQ20B 및 M24-MET를 최종 농도 1 또는 3μM의 WHI-P131로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다.
도10은 skh-1 마우스에서 UVB-유도 피부 두께에 대한 화합물6의 억제 효과를 도시한다. 암컷 skh-1 마우스를 각각 UVB 선 35mj/㎠에 노출하기 전에, 1mg/㎠의 화합물6으로 국부 처리하였다. 각 마우스의 피하지방(skinfold) 두께를 주당 2회 기록하고, 이 두 번의 측정의 평균을 계산에 사용하였다. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. 비히클 처리 대조군에 비교하여*P≤0.05 및**P≤0.005이다.
도11은 마우스 당 평균 병변 수에 대한 화합물6의 억제 효과를 도시한다. 암컷 skh-1 마우스를 각각 35mj/㎠의 UVB 선에 노출하기 전에, 화합물6의 1mg/㎠로 국부 처리하였다. 병변의 수를 주당 2회 기록하고, 두 번 측정의 평균을 계산에 사용하였다. 데이터는 평균±SEM(n=5-14)을 나타낸다. 비히클 처리 대조군과 비교하여 *P<0.05이다.
도12는 마우스 당 평균 병변 부피에 대한 화합물6의 억제 효과를 도시한다. 암컷 skh-1 마우스를 각각 35mj/㎠의 UVB 선에 노출하기 전에, 화합물6의 1mg/㎠로 국부 처리하였다. 직경 1mm 또는 그 이상의 병변 수를 주당 2회 관찰하여 기록하고, 두 번 관찰의 평균을 계산에 사용하였다. 병변 크기는 재료 및 방법에 기술된 식을 사용하여 계산하였다. 데이터는 평균±SEM(n=5-14)을 나타낸다. 비히클 처리 대조군과 비교하여 *P≤0.05이다.
도13은 UVB 조사 20주 후 마우스의 등 표면의 형태학적 상태를 도시한다. 암컷 skh-1 마우스를 각각 35mj/㎠의 UVB 선에 노출하기 전에, 화합물6의 1mg/㎠로 국부 처리하였다. 마우스를 총 20주 동안 주당 3회 조사하였다. 20주에, 마우스를 마취하고, 이들의 등 표면을 사진 찍었다. 도a는 비조사 및 비히클 처리 대조군. 도b는 UVB 조사 및 비히클-처리 마우스. 도c는 UVB 조사 및 화합물 6 처리 마우스이다(2배 확대).
도14는 화합물6이 UVB-유도 PGE2합성을 억제함을 도시한다. HaCaT 세포 배양액을 UVB(25mj/㎠) 또는 모의 조사하였다. 조사 전 60분에 화합물6(3-30(M))을 첨가하고, UVB 노출 후 재첨가하였다. 연속하는 6시간의 인큐베이션 동안 방출된누적 PGE2를 EIA로 측정하였다. 데이터는 평균±SEM(n=3)을 나타낸다.
도15는 화합물6이 상피 세포에서 EGF-자극 PGE2방출을 억제함을 도시한다. 50ng/ml EGF를 화합물6 존재 및 비존재하는 양쪽의 융합성 HaCaT 세포 배양액을 자극하는데 사용하였고, 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상층액을 수집하고, 인큐베이션 동안 방출된 PGE2를 EIA로 측정하였다. 데이터는 평균±SEM(n=5)를 나타낸다.
도16은 UVB 선 손상이 따르는 skh-1 마우스의 피하지방 두께에 대한 화합물6의 영향을 도시한다. Skh-1 마우스를 2일 동안 화합물6(16mg/kg; i.p. 환약 주사)을 전처리하였다. UVB를 주사하는 날에, 마우스를 마취하고, UVB 노출 15분 전에 등 표면을 1,5mg/㎠ 화합물6으로 칠하고, UVB 선(250mj/㎠)로 조사하였다. 피하지방 두께를 조사 후, 1 내지 5일에 측정하였다. 그 데이터는 평균±SEM(n=5-34)로 나타내었다.
도17은 skh-1 마우스의 피부에서 UVB-유도 혈장 삼출(plasma exudation)의 억제를 도시한다. 혈장 삼출은 다음의 재료 및 방법에 기술된 방법에 따라 피부 추출물에서 에반스(evans) 파랑색의 흡광도를 측정하여 UVB 노출(250mj/㎠) 후 지정된 시간에서 평가되었다. 데이터는 평균±SEM(n=5-34)를 나타내었다.
도18은 UVB 조사 후 4일에 피부 형태에 대한 화합물6의 영향을 도시한다. skh-1 마우스를 2일 동안 화합물6(16mg/kg; i.p. 환약 주사)으로 전처리하고, UVB 노출 전 15분에 등 표면에 1,5mg/㎠의 화합물6으로 칠하고, UVB 선(250mj/㎠)로 조사하였다. 4일째에, 마우스를 마취하고, 등 표면의 사진을 찍었다(2배 확대).
도19는 화합물6에 의한 skh-1 마우스의 피부에서 UVB-유도 조직학적 변화의 억제를 도시한다. 마우스를 도3의 설명에 기술된 바와 같은 동일한 과정을 통해 약제 처리하고, UVB(250mi/㎠)에 노출하였다. 조사 후, 48시간에 마우스를 죽이고, 피부를 생체검사하고, 조직의 파라핀 영역을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. (a) 대조군, (b) UVB(250mi/㎠) 및 (c) 화합물6+UVB(250mj/㎠)(확대 40배).
도20은 skh-1 마우스에서 UVB 조사된 피부의 상피 세포의 세포소멸 및 화합물6에 의한 그것의 억제를 도시한다. 약제 처리 또는 처리하지 않은 조사된 및 모의 조사된 것의 피부 생검을 UVB 조사 후 48시간에 취하고, 얻어진 파라핀 영역을 세포소멸 세포에 대해 염색하였다. 도면은 60배 확대를 사용하는 공초점 현미경에 의해 잡힌 상을 도시한다. 사진에서 연두색 염색은 세포소멸 세포를 나타낸다.
도21은 WHI-P131에 의한 MLR의 투여-종속 억제(A), 스플레노사이트의 PHA 유도(B) 및 ConA 유도(C) 증식을 도시한다. WHI-P131을 5일 간의 배양(MLR) 또는 3일 간의 배양기(PHA 및 ConA) 동안 0.1, 1.0, 10 및 50㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 증식을 WST-1 컬러리메트릭 분석(colorimetric assay)에 의해 측정하였다. 결과는 3-7회의 독립 실험의 평균 O.D.±SEM으로 나타내었다. 그룹간의 통계적 차이는 스튜던트 t-테스트로 분석하였다.
도22는 WHI-P131의 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml을 첨가하는 24시간 배양기 후에 얻어진 세포소멸성 스플레노사이트(TUNEL-양성)의 비율의 플로우 사이토메트리 분석을 도시한다. 결과는 평균±SEM으로 나타낸다. 그룹간의 통계적 차이는 스튜던트t-테스트로 분석하였다.
도23은 BALBc(H-2d)BM/스플레노사이트 이식편을 갖는 C57BL6(H-2b) 수용체에서 주조직적합성(major histocompatibility) 장벽으로 유도된 GVHD 대한 WHI-P131 투여의 생체내 예방 효과를 도시한다. 조사된(7.5 Gy) 수용체는 주어진 BM 및 스플레노사이트(각각 25×106)이었다. 약간의 수용체는 동유전자형의 BM을 수용하는 반면, 다른 것은 재료 및 방법에 기술된 바와 같이, WHI-P131 25mg/kg, WHI-P132 50mg/kg, 사이클로스포린 A 3mg/kg, 메토트랙사이트 10mg/㎡ 또는 비히클 대조군으로 매일 처리하였다. 군 간의 생존율에서 차이를 생명표(life-table) 분석, 만텔-콕스 테스트(Mantel-Cox test)으로 분석하였다.
도24는 BALBc(H-2d)BM/스플레노사이트 이식편을 갖는 C57BL6(H-2b) 수용체에서 주조직적합성 장벽으로 유도된 GVHD 대한 도23에서 제안된 약제 조합의 투여의 생체내 예방 효과를 도시한다. WHI-P131(25mg/kg), 사이클로스포린 A(3mg/kg), 사이클로스포린 A와 WHI-P131의 조합이 복강내 투여되었다. 군 간의 생존율에서 차이를 생명표(life-table) 분석, 만텔-콕스 테스트(Mantel-Cox test)으로 분석하였다.
도25는 BALBc(H-2d)BM/스플레노사이트 이식편을 갖는 C57BL6(H-2b) 수용체에서 주조직적합성 장벽으로 유도된 GVHD 대한 도23에서 제안된 약제 조합의 투여의 생체내 예방 효과를 도시한다. WHI-P131(25mg/kg), 메토트랙사이트(10mg/㎡) 메토트랙사이트와 WHI-P131의 조합이 복강내 투여되었다. 군 간의 생존율에서 차이를생명표(life-table) 분석, 만텔-콕스 테스트(Mantel-Cox test)으로 분석하였다.
도26은 GVHD 발달에 대한 화합물6(60mg/kg/일)의 영향을 도시한다.
도27은 제1 STZ 처리 후 25일의 실험 기간 동안 연구된 LDSTZ-처리 Jak3-결핍 및 야생형(WT) 수컷에서 누적 당료병 발생(A)을 도시하고, 생명표 분석에 의해 통계적 차이를 얻었다.
도28은 제1 STZ 처리 후 25일의 실험 기간 동안 연구된 LDSTZ-처리 Jak3-결핍 및 야생형(WT) 수컷에서 혈중 글루코오스 수치(mg/dl)를 도시하고, ANOVA 분석에 의해 통계적 차이를 얻었다.
도29는 제1 STZ 처리 후 25일의 실험 기간 동안 연구된 LDSTZ-처리 C57BL/6 수컷에서 누적 당료병 발생(A)을 도시하고, 생명표 분석(만텔-콕스 테스트)에 의해 통계적 차이를 얻었다.
도30은 제1 STZ 처리 후 25일의 실험 기간 동안 연구된 LDSTZ-처리 C57BL/6 수컷에서 혈중 글루코오스 수치(mg/dl)를 도시하고, ANOVA 분석에 의해 통계적 차이를 얻었다.
도31은 5 내지 25주까지, 20 및 50mg/kg의 WHI-P131를 매일 처리한 NOD 암컷에서 당료병 발생 당료병 발생(A)을 도시하고, 생명표 분석(만텔-콕스 테스트)에 의해 WHI-P131-처리 및 대조군 마우스 사이의 통계적 유의한 차이를 얻었다.
도32는 5 내지 25주까지, 100mg/kg의 WHI-P131를 처리한 NOD 암컷에서 당료병 발생 당료병 발생을 도시하고, 생명표 분석(만텔-콕스 테스트)에 의해 WHI-P131-처리 및 대조군 마우스 사이의 통계적 유의한 차이를 얻었다.
도33은 15 내지 20주 동안, 100mg/kg의 WHI-P131를 처리한 C57BL/6 암컷(20주), 비당료병 대조군 NOD 암컷(25주) 및 NOD 암컷(25주)에서 실시된 IPGTT 시험을 도시하고, 스튜던트 t-테스트에 의해 통계적 차이를 얻었다. 각각 NOD 비히클 대조군과 비교하여*, **, ***, ****p<0.05, 0.01, 0.005 및 0.0001이다.
도34는 WHI-P131 처리에 의한 NOD-scid 암컷으로의 당료병의 양자 이식의 지연을 도시한다. NOD-scid 암컷에 10×106당료병성 스플레노사이트를 이식하고, 당료병의 발생시기까지 WHI-P131의 50mg/kg을 복강내로 매일 처리하였다. 생명표 분석(만텔-콕스 테스트)에 의해 통계적 차이를 얻었다.
도35는 Jak3-/-가 섬 동족이식편을 거부하지 않음을 도시한다. 당료병성 Jak3-/-수용체의 신장 주머니 하에서 이식된 동종이식성 섬 이식편의 헤마톡실린 및 에오신(B) 및 인슐린에 대한 면역염색(C)은 이식 후 100일째에 죽었다. 데이터는 >30분획/이식편 및 6 마우스/군을 나타낸다(×10).
도36은 WHI-P131이 MLR 반응을 억제함을 도시한다. 응답 스프레노사이트(4×106/ml)을 자극 스프레노사이트(1.6×106/ml)와 혼합하고, 5일간의 배양기 동안, 약제를 0.1, 1, 10 및 50g/ml의 농도로 첨가하였다. 증식은 WST-1 컬러리메트릭 분석으로 측정하였다. 결과는 6회의 독립 실험의 평균 O.D.±SEM으로 나타내었다. WHI-P131에 비노출된 대조군 세포의 증식과 비교하여 p=0.0095이었다.
도37은 세포소멸성 스플레노사이트(TUNEL-양성)의 플로우 사이토메트리 분석을 도시한다. TUNEL 염색은 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml의 WHI-P131로 스플레노사이트(1.5×106)의 20시간의 인큐베이션 후 실시하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다. 군 간의 통계적 차이는 스튜던트 t-테스트로 분석하였다.
도38은 섬 동종이식편 생존율에 대한 WHI-P131(50 및 75mg/kg), WHI-P132(50mg/kg) 및 사이클로스포린 A-처리(20mg/kg)영향을 도시한다. p 값은 생명표 분석(만텔-콕스 테스트)에 의해 얻어졌다.
도39는 10일 동안 WHI-P131 130mg/kg의 처리 후 C57BL/6 스프레노사이트의 플로우 사이토메트리 분석을 도시한다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다. 군 간의 통계적 차이는 스튜던트 t-테스트로 분석하였다.
도40은 이식 후 180일 동안 WHI-P131 50mg/kg 또는 비히클 대조군으로 처리된 동종이식형 섬 이식 수용체에서 비-금식 혈중 글루코오스(mg/dl)를 도시한다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도41은 이식 후 70일(B)에 8시간의 금식 후, 도39에서의 동일한 수용체 및 비이식된 대조군 마우스의 IPGTT를 실시하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도42는 이식 후 180일(C)에 8시간의 금식 후, 도39에서의 동일한 수용체 및 비이식된 대조군 마우스의 IPGTT를 실시하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
본 발명은 투여된 양의 범위내에서 비독성인 JAK-3 억제 화합물을 제공한다. 본 발명의 JAK-3 억제제는 백혈병 및 림프종의 치료에 유용하다. 상기 화합물은 또한, 썬번 및 UVB-유도 피부 염증을 치료 또는 예방하고, 피부암을 예방하는데 유용하다. 게다가, 본 발명의 화합물들은 UVB 방사선의 면역저하 효과를 예방하고, 자가면역질환, 염증 및 이식거부의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명은 백혈병 또는 림프종의 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 이식거부의 치료 또는 예방에 유용한 약제를 제조하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류에서 UVB 방사선-유도 염증 반응의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류에서 프로스타글란딘 E2방출의 억제에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류에서 UVB-유도 피부 부종(edema) 또는 혈관 투과도(vascular permeability) 변화의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하기위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류에서 UVB-방사선 유도에 의한 상피 세포(epithelial cell) 손상 또는 변이 빈도의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 UVB 선(light)의 종양발생 효과(tumorigenic effects)로부터 포유류의 보호에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류에서 T-세포 활성의 중재에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 자가면역질환의 치료에 유용한 약제를 조제하기 위한 JAK-3 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 의학요법에서 이용을 위한 JAK-3 억제 화합물을 제공한다.
본 발명은 JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 백혈병 또는 림프종 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 UVB-방사선 유도 염증 반응을 예방 또는 감소시키는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 프로스타글란딘 E2의 방출을 억제하는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 UVB-유도 피부 부종 또는 혈관 투과도 변화를 예방 또는 감소시키는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 UVB 방사선-유도 상피 세포 손상 또는 변이 빈도를 예방 또는 감소시키는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하는 UVB 선의 종양발생 효과로부터 포유류를 보호하는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 대표적 JAK-3 억제제는 또한, T-세포에 대해 상당한 항-증식 활성을 나타내고, IL-2 종속 세포 증식을 억제하는 것이 확인되었다. 이렇게 해서, 상기 화합물들은 이식 합병증(예컨대, 숙주 면역체계에 의한 공여체 기관의 거부) 및 이식편대숙주병(GVHD)의 발달 같은 골수 이식과 관련한 합병증을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 인슐린-종속 당료병 같은 자가면역질환을 치료 및 예방하는데 효과적이다. 또한, 상기 화합물들은 에어웨이(airway) 염증(예컨대, 천식)의 치료에 효과적이다.
따라서, 본 발명은 또한, 식Ⅰ 화합물의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 포함하여, 백혈병, 이식거부, GVHD, 염증, 천식, 당료병을 포함하는 자가면역질환, 피부에서 염증 관련 암 발달을 치료(또는, 예방)를 위한 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 여기서 개시된 식Ⅰ의 신규한 화합물 및 식Ⅰ 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제 및 방법에 유용한 특이적 JAK-3 억제제는 식Ⅰ의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
{식중, X는 HN, R11N, S, O, CH2또는 R11CH(여기서, R11은 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알카노일이다.)
R1-R8은 각각 독립적으로, 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로(여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기는 그들이 부착한 페닐환과 함께 부가적인 결합환, 예컨대, 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성할 수 있고, 또한, 여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기에 의해 형성된 환은 부가적으로, 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로로 치환될 수 있다.)이고,
R9및 R10은 각각 독립적으로, 수소, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로 또는 (C1-C4)알카노일이거나, R9및 R10은 모두 메틸렌디옥시이다.}
바람직하게는 R2및 R3중 적어도 하나는 히드록시이다. 더욱 바람직하게는, R2및 R3중 적어도 하나는 히드록시이고, R1내지 R5중 하나는 할로이다.
별도로 기술되지 않는 한 하기 정의가 사용된다. 할로는 플르오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도이다. 알킬, 알콕시 등은 직쇄 및 분쇄기를 나타내고, 그러나, "프로필" 같은 개별기는 단지 직쇄기를 포함하고, "이소프로필"기 같은 개별기는 단지 분쇄기만을 포함한다. 아릴은 페닐기 또는 적어도 하나의 환이 방향족인 약 9 내지 10개 환 원자를 갖는 오르토-결합 바이사이클릭클릭카르보사이클릭기를 나타낸다. 헤테로아릴은 탄소로 구성된 5 또는 6개 환 원자를 포함하는 모노사이클릭 방향족환의 환 탄소를 통하여 부착된 기를 포함하고, 1 내지 4개의 헤테로 원자는 각각 비-페록사이드 산소, 황 및 N(W)(여기서, W는 비존재 또는 H, O, (C1-C4)알킬, 페닐 또는 벤질과 이들로부터 기원된 약 8 내지 10개 환 원자의 오르토-결합 바이사이클릭 헤테로사이클의 기이고, 특히, 벤즈-유도체 또는 이것에 프로필렌, 트리메틸렌 또는 테트라메틸렌 디라디컬을 결합시킨 것)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
라디컬, 치환기 및 범위에 대해 하기 열거된 특정 값은 단지 기술을 위한 것이다. 그들은 다른 한정된 값 또는 라디컬 및 치환기에 대해 한정된 범위내의 다른 값을 배제하지 않는다.
특히, (C1-C4)알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소-부틸 또는 이차부틸일 수 있고, (C1-C4)알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소-부톡시 또는 이차부톡시일 수 있고, (C1-C4)알킬티오는 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 이소프로필티오, 부틸티오 또는 이소부틸티오일 수 있고, (C1-C4)알카노일은 아세틸, 프로판오일, 부탄오일 또는 이소부탄오일일 수 있고, 아릴은 페닐, 인데닐 또는 나프틸일 수 있고, 및 헤테로아릴은 퓨릴, 이미다졸일, 트리아졸일, 트리아지닐, 옥사조일, 이소옥사조일, 티아졸일, 이소티아조일, 피라졸일, 피롤일, 피라지닐, 테트라졸일, 피리딜(또는, 이것의 N-옥사이드), 티에닐, 피리미디닐(또는, 이것의 N-옥사이드), 인돌일, 이소퀴놀일(또는, 이것의 N-옥사이드) 또는 퀴놀일(또는, 이것의 N-옥사이드)일 수 있다.
키랄 중심을 갖는 본 발명의 화합물들이 존재할 수 있고, 광학 활성형 및 라세미형으로 분리될 수 있는 것이 종래 기술에 공지되어 있다. 다수의 화합물들은 다형성을 나타낼 수 있다. 본 발명은 라세미, 광학 활성, 다형성 또는 입체이성질체형 또는 이것의 혼합물을 포함하고, 본 발명의 혼합물은 여기에 기술된 유용한 성질을 갖고, 공지 기술에서 광학 활성형을 제조하는 방법(예컨대, 재결정화 기술에 의한 라세미형의 분석, 광학 활성 개시 물질로부터의 합성, 키랄 합성 또는 키랄 고정상을 사용하는 크로마토그라픽 분리) 및 여기서 기술된 표준 시험을 사용하거나 공지된 다른 유사한 기술을 사용하여 프로스타글란딘 E2억제 활성을 측정하는 방법이 공지되어 있다.
특이적 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, X는 R11N이다.)의 화합물들이다. 다른 특이적 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, X는 HN이다.)의 화합물들이다.
특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R1, R2, R4, R5, R6, R7및 R10은 각각 H이다.)의 화합물들이다.
특정 군의 화합물들은 식Ⅰ{여기서, R3는 (C1-C4)알콕시, 히드록시, 니트로, 할로, 트리플루오로메틸 또는 NR12R13(여기서, R12및 R13은 각각 독립적으로 수소,(C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C8)시클로알킬 또는 헤테로사이클이다.)이다.}의 화합물들이다. 다른 특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R3는 히드록시이다.)의 화합물들이다.
특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R8은 (C1-C4)알콕시이다.)의 화합물들이다. 다른 특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R8은 메톡시이다.)의 화합물들이다.
특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R9는 (C1-C4)알콕시이다.)의 화합물들이다. 다른 특정 군의 화합물들은 식Ⅰ(여기서, R9는 메톡시이다.)의 화합물들이다.
바람직한 화합물은 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 WHI-P131 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염이다.
바람직한 화합물은 4-(3'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 WHI-P180 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염이다.
바람직한 화합물은 4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 WHI-P97 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염이다.
바람직한 화합물은 4-(3'브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 WHI-P154 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염이다.
본 발명의 화합물은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 사람 환자와 같은 포유류 숙주에 선택된 투여 방식, 즉, 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국부, 피하 방식에 적절한 다양한 형태로 투여될 수 있다.
이렇게 해서, 상기 물질은 불활성 희석제 또는 흡수할 수 있는 식용 가능한 담체와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 예컨대, 경구로, 조직에 투여될 수 있다. 이들은 딱딱하거나 또는 부드러운 껍질의 젤라틴 캡슐으로 포장될 수 있거나 환자의 식이 식품에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 상기 물질은 하나 이상의 부형제와 조합될 수 있고, 섭취 가능한 정제, 버켈제(buccal tablets), 트로키제, 캡슐, 엘릭실제, 현탁제, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 그러한 조성물 및 제제는 상기 물질을 적어도 0.1% 포함해야한다. 물론, 조성물 및 제제의 비율은 다양할 수 있고, 주어진 단위 제형의 중량의 약 2 내지 60% 사이가 적당할 수 있다. 그러한 치료적으로 유용한 조성물에서 상기 물질의 양은 유효 투여 수준이 얻어질 수 있는 것이다.
정제, 트로키제, 환제, 캡슐 등은 또한 다음의 트라가칸드 고무, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제, 인산이칼슘 같은 부형제, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등의 분해제, 스테아르산마그네슘 같은 윤활제 및 수크로오스, 프럭토오스, 락토오스 또는 아스파탐 등의 감미료 또는 페퍼민트, 동록유 또는 체리향의 향미료를 첨가할 수 있다. 단위 제형이 캡슐일 때, 이것은 상기 형태의 재료에 더하여 식물성 오일 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 재료가 코팅으로 존재할 수 있거나 그렇지 않으면 고체 단위 제형의 물리적 형태를 수정한 것일 수 있다. 예컨대, 정제, 환제 또는 캡슐을 젤라틴, 왁스, 셸랙(shellec) 또는 당 등으로 코팅할 수 있다. 시럽 또는 엘릭실제는 활성 화합물, 감미료로서 수크로오스 또는 프럭토오스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤,향미료로 염료 및 체리 또는 오렌지향을 포함할 수 있다. 물론, 조제에 사용된 어떠한 물질도 약제학적으로 허용 가능하고, 실질적으로 비독성인 양이 사용되는 단위 제형이어야 한다. 게다가, 상기 물질은 서방형 제제(sustained-release preparations) 및 장치에 포함될 수 있다.
상기 물질은 또한 주입 또는 주사에 의한 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 상기 물질의 용액은 비독성 계면활성제를 부가적으로 혼합하여 물 중에 조제될 수 있다. 분산제는 또한, 글리세롤, 액성 폴리에틸렌글리콜, 트리아세틴 및 이것의 혼합물 및 오일 중에 조제될 수 있다. 저장 및 사용의 환경 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 포함한다.
주사 또는 주입에 적절한 약제학적 제형은 살균 주사 또는 주입 용액 또는 분산제의 즉석 제제(extemporaneous preparation)에 적합한 상기 물질을 포함하는 살균 수용액 또는 분산제 또는 살균 파우더를 포함할 수 있고, 부가적으로 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 모든 경우에서, 최상의 제형은 제조 및 저장 상태에서 살균성, 액체성 및 안정성이 있어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 식물성 오일, 비독성 글리세릴에스테르 및 이것의 적절한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성이 예컨대, 리포좀의 형성, 분산제의 경우에 요구된 미립자 크기의 유지 또는 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 활성의 억제는 다양한 항박테리아 및 항균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 치메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 대부분의 경우에, 등장제, 예컨대, 당, 완충액 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물의 지속적 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 용매 중의 요구된 양의 상기 물질을 요구된 바와 같이, 상기 열거된 다른 여러 가지 성분들과 혼합하여 조제한 후, 여과 살균한다. 살균 주사 용액의 조제를 위한 살균 분말의 경우에, 조제의 바람직한 방법은 진공 건조 및 냉동 건조기술이고, 이는 이전에 살균-여과된 용액 중에 바람직한 성분들을 추가하여 유효 성분의 분말을 생산한다.
국부 투여를 위해 상기 물질은 정제 형태, 즉 액체로 도포될 수 있다. 그러나, 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 조성물 또는 제형으로 피부에 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다. 유용한 고체 담체는 활석, 흙, 미세결정 셀룰로오스, 실리카, 알루미나 등의 정제 분리된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 알코올 또는 글리콜 또는 물-알코올/글리콜 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 물질은 비독성 계면활성제의 보조적 추가로, 유효 수준으로 용해 또는 분산될 수 있다. 방향 및 첨가 항미생물제 등의 보조제는 주어진 용도를 위한 특성을 최적화하도록 추가될 수 있다. 생성 액체 조성물은 흡수 패드로부터 도포될 수 있고, 밴드 및 다른 드레싱에 넣을 수 있거나, 펌프형 또는 에어로졸 스프레이어를 사용하여 상처 부분에 스프레이될 수 있다.
합성 중합체, 지방산, 지방산염 및 에스테르, 지방알코올, 변형 셀룰로오스 또는 변형 무기 물질 등의 증점제는 또한, 액체 담체와 사용되어 사용자의 피부에직접 도포하기 적당한 펼쳐질 수 있는 파스타제, 겔, 연고, 소프 등을 형성할 수 있다.
피부에 상기 물질을 전달하는데 사용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 종래 공지되어 있고, 예컨대, 쟈크에트 등(Jacquet et al., U.S. Pat. No. 4,608,392), 게리아(Geria, U.S. Pat. No. 4,992,478), 스미스(Smith, U.S. Pat. No. 4,559,157) 및 워츠만(Wortzman, U.S. Pat. No. 4,820,508)이다.
식Ⅰ의 화합물의 유효량은 동물 모델에서의 이들의 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교하여 측정될 수 있다. 마우스 및 다른 동물에서 유효량의 외삽법의 사람에의 적용 방법이 공지 문헌, 예컨대, U.S. Pat. No. 4,938,949에 공지되어 있다.
일반적으로, 로숀 등의 액체 조성물에서 상기 물질의 농도는 약 0.1-25중량%, 바람직하게는 0.5-10중량%이다. 겔 또는 분말 등의 반고체 또는 고체 조성물 중의 농도는 약 0.1-5중량%, 바람직하게는 약 0.5-2.5중량%이다.
치료를 위해 요구된 상기 물질의 양은 선택된 특정 염과 투여 방식, 치료될 상태 및 환자의 나이 및 상태에 따라 다양하고, 결정적으로 의사의 판단에 따를 것이다.
그러나, 일반적으로, 적절한 투여량은 약 0.5 내지 100mg/kg, 예컨대, 1일 수용체의 무게 kg 당 약 3 내지 50mg 같은 1일 몸무게 당 약 10 내지 75mg/kg, 바람직하게는 6 내지 90mg/kg/일, 가장 바람직하게는 15 내지 60mg/kg/일이다.
상기 물질은 예컨대, 5 내지 1000mg, 적당하게는 10 내지 750mg, 가장 적당하게는 단위 제형 당 50 내지 500mg의 유효 성분으로 투여될 수 있다.
이상적으로는, 상기 물질은 약 0.5 내지 75μM의 피크 혈장 농도를 얻도록 투여되고, 바람직하게는, 약 1 내지 50μM, 가장 바람직하게는 약 2 내지 30μM이다. 이는 예컨대, 상기 물질의 0.05 내지 5%를 식염수에 추가하여 정맥내 주사 또는 상기 물질의 약 1-100mg을 포함하는 환약으로 경구 투여되어 이루어질 수 있다. 바람직한 혈중 수치는 연속 주입으로 약 0.01-5.0mg/kg/시간 또는 상기 물질의 약 0.4-15mg/kg을 포함하는 간헐적 주입으로 유지될 수 있다.
상기 물질은 1회 투여 또는 적당한 간격, 예컨대, 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 서브-투여하는 것으로 투여될 수 있다. 서브-투여 그 자체는 예컨대, 취분기(insufflator)로부터 수회 흡입 또는 눈에 여러 방울을 떨어뜨리는 것 같은 불연속적인 부정확한 간격으로 나누어질 수 있다.
본 발명을 하기의 비제한 실시예를 통하여 설명한다.
(실시예)
융해점은 비정정되었다.1H-NMR 스펙트라는 DMSO-d6또는 CDCl3중에서 배리언 머큐리 300 스펙트로메터(Varian Mercury 300 spectrometer)를 사용하여 기록하였다. 화학적 시프트는 0ppm의 내부 기준으로서 테트라메틸실란(TMS)으로 100만당 일부분(ppm)으로 기록하였다. 커플링 상수(J)는 헤르츠이고, 그 약호는 s, d, t, q 및 m이고, 각기 싱글렛, 더블렛, 트리플렛, 쿼테트 및 멀티플렛을 나타낸다. 적외선 스펙트라는 니콜렛 프로테그 460-IR 스펙트로메터(Nicolet PROTEGE 460-IRspectrometer) 위에 기록하였다. 매스 분광기 데이터는 HP 5973 매스 선택 검출기가 장착된 FINNIGAN MAT 95, VG 7070E-HF G.C. 시스템에 기록하였다. UV 스펙트라는 용매로 MeOH를 사용하고 BECKMAN DU 7400에 기록되었다. TLC는 전코팅된 실리카겔 플레이트(실리카겔 KGF; Whitman Inc) 위에서 실시하였다. 실리카겔(200-400메시, Whitman inc.)을 모든 컬럼 크로마토그라피 분리를 위해 사용하였다. 모든 화학약품은 시약 등급으로, 알드리치 케미컬 컴퍼니(Milwaukee, Wis) 또는 시그마 케미컬 컴퍼니(St. Louis, MO)로부터 구매하였다.
식Ⅰ의 대표 화합물의 합성은 실시예1에 기술된다. 식Ⅰ의 다른 화합물들은 실시예1에 기술된 것과 유사한 과정으로 조제될 수 있다.
실시예1: 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(6)의 화학 합성 및 특성
4,5-디메톡시-2-니트로벤조산(1)을 염화티오닐로처리하고, 암모니아와 반응시켜서 에프 노모토 등(F. Nomoto et al. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1591-1595)에 의해 기술된 바와 같이, 4,5-디메톡시-2-니트로벤즈아미드(2)를 얻었다. 화합물(2)의 니트로기는 황산구리의 존재 하에 수소화붕소나트륨으로 환원되어(C.L. Thomas Catalytic Processes and Proven Catalysts Academic Press, New York(1970)), 4,5-디메톡시-2-아미노벤즈아미드(3)가 생성되고, 이는 포름산에 의한 환류에 의해 환을 형성하여 6,7-디메톡시퀴나졸린-4(3H)-온(4)을 얻었다. 화합물(4)을 산화삼염화인으로 환류하여 화합물(5)를 얻고, 이는 식Ⅰ(여기서, X는 NH이다.)의 화합물을 조제하기 위한 유용한 중간체이다. 필요 아닐린과 화합물(5)의 반응은 식Ⅰ의 하기 화합물을 제공한다.
상기 기술된 유사한 방식 또는 다른 퀴나졸린 화합물을 조제하는 종래 공지된 과정을 사용하여 식Ⅰ의 화합물을 조제할 수 있다. 예컨대, 식Ⅰ(여기서, X는S, O 또는 CH2이다.)의 화합물은 도1에 기술된 바와 같은 반응에 의해 식(5)의 화합물로부터 조제될 수 있다.
실시예2: JAK3 키나아제에 대한 상동 모델을 구성하는 선별적 JAK-3 억제제의 확인
도메인
JAK-3에 대한 상동 모델을 이. 에이. 서드백 등(E. A. Sudbeck et al., Clinical Cancer Research, 1999, 5, 1569-1582)에 의해 기술된 바와 같이 제작하였다. JAK3 키나아제 도메인의 3차원 구조가 현재 알려져 있지 않기 때문에, JAK3의 구조 모델은 JAK3 억제제의 도킹 분석에 대해 요구되었다. JAK3의 상동 모델은 참고로 상동의 키나아제 도메인의 공지된 구조를 사용하여 제작되었다(도2). JAK3 상동 모델은 먼저 유전자뱅크(Genbank, National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)로부터 JAK3의 단백질 서열(Swiss-Prot #P52333, Univ. of Geneva, Geneva, Switzerland)을 얻고, 몇 가지 주형 구조(HCK, FGFR 및 IRK 등의 공지된 키나아제 구조((Sicheri, F., et al., Nature. 385:602-9, 1997; Mohammadi, M, et al., Cell. 86:577-87, 1996; Mohammadi, M. et al., Science. 276:955-60, 1997; and Hubbard, S. R., et al., Nature. 372:746-54, 1994)에 비교하여 JAK3 키나아제 도메인에 대한 가장 적절한 서열 배열을 결정하여 설계한다.
이는 InsightⅡ 프로그램을 사용하는 HCK, FGFR 및 IRK의 키나아제 도메인의 Cα 구조를 먼저 첨가하여 최적의 전체적 구조 비교를 제공함으로써 이루어졌다(InsightⅡ, Molecular Simulations Inc. SanDiego, CA, 1996). 상기 서열들은 그들의 구조의 부가물을 기본으로 하여 연결되었다(아미노산 서열은 이들의 Cα 위치가 서로에게 공간적으로 관련되어 있는 지에 의해 결합되었다.). 이 배열은 다른 단백질 서열과는 다른 단백질에서 루프로서의 특징을 가지고 있었다. 구조적 부가는 InsightⅡ 프로그램의 상동 모듈 및 실리콘 그래픽스 INDIGO2 컴퓨터(Silicon Graphics, Mountain View, CA)를 사용하여 실시되었다. 상기 서열 배열은 수동으로 진행되고, 각각 부과된 Cα 위치에 대한 서열 변동 프로파일을 생성한다. 상기 서열 변동 프로파일은 다른 세 가지 단백질과 JAK3 키나아제의 수반하는 서열 배열에 대한 기초로 제공된다. 이 과정에서, JAK3의 서열을 프로그램에 넣고, 이전에 기술된 서열 변동 프로파일을 근거로 공지된 세 가지 키나아제 단백질과 정렬시켰다. 다음에, 3D 구조 세트를 주형으로 HCK의 3D 구조 및 InsightⅡ 프로그램 내의 상동 모듈을 사용하여 JAK3 키나아제 서열로 지정하였다. 서열 삽입이 일어나는 루프 영역에 대한 구조(루프가 없는 HCK와 비교)는 컴퓨터 프로그램에 의해 자동적으로 생성된 제한된 가능성으로부터 선택되고, 프로그램 CHAIN을 사용하여 한층 이상적인 기하학적 구조에 수동으로 조정되었다(Sack, J. S. Mol. Graphics. 6:244-245, 1988). 마지막으로, JAK3 키나아제 도메인의 제작된 모델을 X-PLOR 프로그램을 사용하여 에너지를 최소화하여 모델-설계 과정시 도입된 공간적 변형을 제거할 수 있다(Brunger, A. T. X-PLOR, A System for X-ray Crystallography and NMR). 상기 모델은 바람직하지 않은 입체적 접촉에 대해 스크린되고, 필요하다면, 그러한 측쇄를 로타머 라이브러리 데이터베이스 또는 수동적으로 각 측쇄를 회전시켜서 재모델할 수 있다. 상동 모델 제작에 대한 과정은 구조주형으로 JAK3 모델을 사용하여 JAK1(SWISS-PROT #P23458) 및 JAK2(Genbank #AF005216)에 대해 반복할 수 있다. JAK1, JAK2 및 JAK3의 에너지 최소화 상동 모델은 JAK/디메톡시퀴나졸린 복합체의 모델링 연구를 위해 디메톡시퀴나졸린 화합물의 에너지 최소화 구조적 모델과 결합하여 사용될 수 있다.
JAK3 키나아제 도메인의 상동 모델을 사용하는 도킹 과정
JAK3/디메톡시퀴나졸린 복합체의 모델링은 프로그램 INSIGHTⅡ 내의 도킹 모듈 및 단백질 결합 부위에 억제제를 자동적으로 도킹하는 친화력이 높은 적절한 프로그램을 사용하여 이루어질 수 있다(EGFR 및 BTK에 대한 유사한 과정이 이전에 Ghosh, S., et al., Clin. Can. Res. 4:2657-2668, 1998; Mahajan, S., et al., J. Biol. Chem. 274:9587-9599, 1999에 기술되어 있다.). 각 화합물의 다양한 도킹 위치는 결합 상수, Ki를 측정한 INSIGHTⅡ에서 Ludi(Bohm, H. J. et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 8:243-56, 1994) 스코링 과정을 사용하고, 예상된 지질친화성, 수소 결합 및 억제제와 단백질 사이의 반데르발스 상호작용을 고려하여 평가되었다. 다른 몇 가지 PTK의 촉매 부위 잔기의 비교가 IRK 및 HCK의 키나아제 도메인 및 JAK1, JAK2, JAK3, BTK 및 SYK의 모델의 결정 구조를 수동적으로 부가하여 제작되었고, JAK3에 특이적인 활성 부위의 특징을 확인하였다(도3 및 도4).
퀴나졸린 유도체의 화학 합성
표1에 열거된 화합물을 합성하고, 문헌 과정을 사용하여 특성화하였다(Rewcastle, G. W., et al., J. Med. Chem. 38:3482-7, 1995).
(표1)
면역 복합체 키나아제 분석
폴 행렬구더기(fall armyworm) 스포도테라 프루기페르다(Spodotera Frugiperda)의 난소 조직에서 기원한 Sf21(IPLB-SF21-AE) 세포(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274:1646-1656, 1999)를 인비트로젠(Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 얻고, 10% FBS 및 1.0% 항생제/항마이코틱(GIBCOBRL)으로 보충된 그레이스(Grace's) 곤충 세포 배지에서 유지하였다. 저장 세포를 60-90rpm에서, 1L 벨코 스피너(Belco spinner) 플라스크 중의 600ml 총 배양 부피 중 0.2-1.6×106/ml의 현탁액으로 유지하였다. 세포 생존성은 트리판 블루 염료 배제법에 의해 측정된 95-100%로 유지하였다. Sf21 세포를 BTK, SYK, JAK1, JAK2 또는 JAK3에 대한 바큘로바이러스 발현 벡터에 감염시켰다. 세포를 하베스트, 용해(10mM Tris pH 7.6, 100mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 50mM NaF, 100μM Na3VO4, 50㎍/ml 페닐메틸술포닐플루오라이드, 10㎍/ml 아프로토닌, 10㎍/ml 류펩틴)하고, 그 키나아제를 용해물로부터 면역침강시키고, 그들의 효소 활성을 공지된 바와 같이 분석하였다(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274:1646-1656, 1999; Uckun, F. M., et al., Science. 22:1096-1100, 1996; Goodman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273:17742-48, 1998; Mahajan, S., et al., Mol. Cell. Biol. 15:5304-11, 1995; and Uckun, F. M., et al., Science. 267:886-91, 1995). 면역침강물은 이전에 기술된 방식의 웨스턴 블롯 분석을 하였다(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274:1646-1656, 1999; and Uckun, F. M., et al., Science. 22:1096-1100, 1996).
인슐린 수용체 키나아제(IRK) 분석을 위하여, 약 80% 융합성으로 자란 HepG2 사람 헵파토마 세포를 혈청을 함유하지 않은 DMEM으로 한 번 세척하고, CO2인큐베이터의 37℃에서 3시간 동안 굶겼다.
계속해서, 세포를 실온에서, 10분 동안 인슐린(Eli Lilly and Co.,Indianapolis, IN, cat# CP-410; 10 단위/ml/10×106세포)로 자극하였다. 다음의 IRK 활성 단계에서, 세포를 혈청 없는 배지로 한 번 세척하고, NP-40 완충액에서 용해하고, IRK를 항-IRβ 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Cat# sc-711, 폴리클로날 IgG)로 용해물로부터 면역침강하였다. 면역 복합체 키나아제 분석을 실행하기 전에, 비드(bead)를 키나아제 완충액에 균형을 맞추었다(30mM Hepes pH 7.4, 30nM NaCl, 8mM MgCl2, 4mM MnCl2). LYN을 이전에 기술된 NALM-6 사람 백혈병 세포의 전체 세포 용해물로부터 면역침강하였다(Uckun, F. M., et al., Science. 267:886-91, 1995; and Uckun, F. M., et al., Journal of Biological Chemistry., 271:6396-6397, 1996).
JAK3 면역 복합체 키나아제 분석에서(17,22), KL-2 EBV-변형 사람 림포블라스토이드 B 세포(천연의 JAK3 키나아제 분석) 또는 곤충 난소 세포(재조합 JAK3 키나아제 분석)를 NP-40 용해 완충액(50mM, Tris, pH 8, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 100μM 소듐몰리브데이트, 8㎍/ml 아프로티닌, 5㎍/ml 류펩틴 및 500μM PMSF)으로 용해하고, 13000×g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 샘플을 JAK3에 대해 조제된 항혈청으로 면역침강하였다. 상기 항혈청은 희석되고, 면역 복합체를 15㎕ 단백질 A 세파로스로 인큐베이션하여 수집하였다. NP-40 용해 완충액으로 4번 세척 후, 단백질 A 세파로스 비드를 키나아제 완충액(20mM MOPS, pH 7, 10mM MgCl2)로 한 번 세척하고, 동일한 완충액에서 재현탁하였다.
반응을 25μCi[γ-32P] ATP(5000 Ci/mMole) 및 표지되지 않은 ATP를 최종 종도 5μM로 첨가하여 개시하였다. 반응은 SDS 샘플 완충액에서 4분 동안 가열하여 종결하였다. 샘플을 9.5% SDS 폴리아크릴아미드겔에 영동하고, 표지된 단백질을 자기방사법(autoradiography)으로 검출하였다.
전기 영동에 이어, 키나아제 겔을 와트만(Whatman) 3M 여과지 위에 건조하고, 필름 위에 자기방사하고, 몰레큘라 이미저(Molecular Imager, Bio-Rad, Hercules, CA) 위에 포스포링이미징(phosphorimaging) 하였다. 각 투여 농도에 대해, 키나아제 활성 지수(KA)를 포스포이미저 단위(PIU)에서 키나아제 활성을 기준 샘플의 것과 비교하여 측정하였다. 몇 개의 실험에서는, 문헌에 기술된 바와 같이콜드 키나아제 분석을 실시하였다(Uckun, F. M., et al., Clin. Can. Res. 4:901-912, 1998).
전기영동 이동 시프트 분석(Electrophoretic Mobility Shift Assays;EMSAs)
EMSAs를 32Dcll/IL2Rβ 세포(Dr. James Ihle, St. Jude Children's Research Hospital)에서 사이토카인-유도 STAT 활성에 대한 디메톡시퀴나졸린 화합물의 영향을 조사하기 위하여, 이전에 기술된 바와 같이(Goodman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273:17742-48, 1998) 실시하였다.
미토콘드리아 막 전위 측정
미토콘드리아에서 변화를 측정하기 위해, 세포를 24시간 또는 48시간 동안 7.4㎍/ml(25μM) 내지 30㎍/ml(200μM) 농도 범위의 WHI-P131로 인큐베이션하고, 특정 형광 염료로 염색하고, 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 미토콘드리아 막전위(△ψm)를 몰레큘러 프로브(Molecular Probes, Eugene, OR)로부터 얻은 지질친화성 양이온 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸일카르보시아닌아이오다이드(JC-1) 및 시아닌 염료, 1,1'3,3,3',3'-헥사메틸인도디카르보시아닌아이오다이드(DiICl(27-29))를 포함하는 두 가지 염료를 사용하여 측정하였다. JC-1은 490nm에서 흥분 후 527nm에서 모노머이고, △ψm의 분극으로, J-집합체가 형성되어 590nm에 방사를 시프트한다(30). 이는 동시에 연두색 신호(527nm) 및 연두색-오렌지 신호(590nm)를 측정하여 분극 및 탈분극된 미토콘드리아 세포수의 지수를 얻어 플로우 사이토메트리 위에서 검출될 수 있다.
양쪽성(amphioatheic) 및 양이온성인 시아닌 염료인 DiICl은 에너지화된 미토콘드리아에 집중되고, 미토콘드리아막 전위를 측정하는 다양한 연구에 사용된다(Fujii, H., et al., Histochem J. 29:571-581, 1997; Mancini, M., et al., J. Cell Biol. 138:449-469, 1997; and Petit, P. X., et al., J. Cell Biol. 130:157-167, 1995). 또한, 세포를 JC-1에 대해 기술된 바와 같이, 어두운 곳에서 30분 동안 40nM 농도의 DiICl으로 염색하였다. 상기 세포는 635nm에서 흥분하는 HeNe 레이저가 장착된 벤티지 멕톤 디킨슨(Vantage Becton Dickinson, San Jose, CA) 세포 소오터를 사용하여 분석하였고, 형광이 666nm에서 수집되었다.
미토콘드리아 질량 측정
상대 미토콘드리아 질량은 벡톤 디킨슨 칼리부(Calibur) 플로우 사이토메트리를 사용하여 측정되고, 상기 형광은 미토콘드리아 인지질 카르디오리핀에 결합하는 10-n-노닐-아크리딘 오렌지(NAO)로 염색하고, 이는 미토콘드리아 질량의 지수를제공하는데 넓게 사용되어 왔다(Maftah, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:185-190, 1989).
실시예2에 대한 결과 및 고찰
JAK3 키나아제 도메인의 상동 모델
단백질/억제제 모델링 연구에서 사용된 JAK3의 3차원 구조를 재료 및 방법에 기술된 바와 같이, 세 가지 단백질 티로신 키나아제(PTKs)(HCK(9), FGFR(11) 및 IRK(37)의 키나아제 도메인)의 키나아제 도메인의 공지된 결정 구조의 서열에 따른 구조적 배열을 근거로 하여 제작하였다. 도2a 및 도1b는 JAK3 키나아제 도메인의 상동 모델을 도시하고, 이는 촉매(ATP-결합) 부위에 인접한 경첩부에 의해 결합된 N-말단 로브 및 C-말단 로브로 구성된다. 촉매 부위는 키나아제 도메인의 중심부에 위치한 포켓이고, 이는 N 및 C 로브 사이의 경계면에서 2개의 β-시트에 의해 한정된다. 촉매 부위에의 개구는 용매 접근이 쉽고, ATP 결합을 용이하게 한다. 작은 분자성 억제제도 또한, 촉매 부위에 결합할 수 있어서 ATP 결합의 억제로 PTK 활성을 감소시킨다. JAK3 모델의 분석은 4변형의 포켓으로 기술될 수 있는 촉매 부위의 특정 형태를 나타내었다(도2c). 포켓의 개구는 Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 및 Tyr904 잔기들로 한정된다(파랑색 잔기, 도2c). 포켓의 안쪽 깊은 벽은 Leu905(Cα골격), Glu903, Met902, Lys905 및 Asp967과 연결되어 있고(분홍색 잔기, 도2c), 포켓의 바닥은 Leu905(측쇄), Val884, Leu956 및 Ala966로 연결되어 있다(노랑색 잔기, 도2c). 포켓의 위를 한정하는 잔기는 Leu828, Gly829, Lys830 및 Gly831을 포함한다(최상은 파랑색 잔기, 도2c). 도2c 및 3a는JAk3의 촉매 부위가 대략8×11×20Å의 치수를 갖고, 대략 530Å3의 결합을 위한 유용한 부피를 갖는다. 모델에 따라, 결합 영역에 용매 노출된 개구는 억제제가 그 분자가 어떤 평면을 가질지라도 들어가서 결합하도록 한다.
JAK3 키나아제 도메인의 촉매 부위 잔기의 대부분이 다른 PTKs와 비교하여 보존되어 있는 반면, 몇 가지의 특정 변이가 관찰되었다(도4). 이들 차이는 SYK에서 Glu 및 JAK3에서 Pro906으로 변화하는 BTK, IRK 및 HCK/LYN에서의 알라닌 잔기(영역A, 도4a)를 포함한다. 영역 B에서 티로신 잔기는 JAK3(Tyr904), BTK 및 LYN에서 보존되나 HCK에서는 Phe(이는 억제제 결합과 관련한 HCK 및 LYN 사이의 유일한 명확한 잔기 차이이다.), SYK에서는 Met 및 IRK에서는 Leu으로 변화한다. 영역C는 BTK, IRK 및 HCK/LYN에서 보존되는 메티오닌 잔기를 나타내나, JAK3에서는 Leu905 및 SYK에서는 Ala로 변화한다. 영역D는 JAK3에서 Met902를 나타내고, 이느 SYK 및 IRK에서 보존되나 BTK에서는 Thr로 변화하고, LYN 및 HCK에서는 더 작은 잔기인 Ala로 변화한다. JAK3에서 Met902 잔기는 포켓의 뒷벽에 위치하고, 포켓 부피의 중앙을 향하여 튀어나와서 결합 포켓의 형태에 상당한 영향을 미친다. 이 위치에서, Met902 측쇄의 연장된 형태는 BTK(Thr) 및 HCK/LYN(Ala)과 같은 더 작은 잔기를 갖는 다른 키나아제와 비교하여, 포켓의 뒷벽을 연결하는 잔기들과 경첩부를 갖는 억제제의 밀접한 접촉을 방지할 수 있다. 영역E에서 Ala966은 HCK/LYN에서 보존되나 IRK에서는 Gly 및 BTK 및 SYK에서는 더욱 친수성인 잔기 Ser으로 변화한다. 억제제 위치로부터 멀리 떨어진 영역F는 촉매 부위의 최소 보존된 영역이고, JAK3에서 Asp912, BTK에서 Asn, SYK에서 Lys, IRK에서 Ser 및 HCK/LYN에서 Asp를 포함한다(도4). 티로신 키나아제 사이에서 차이를 확인하는 이들 잔기는 JAK3 키나아제 도메인의 선별적 억제제를 제작하는 기초를 제공한다.
JAK3 억제제의 구조 기초 제작 및 합성
컴퓨터 도킹 과정은 얼마나 효과적으로 억제제가 JAK3의 촉매 부위에 결합하고, 키나아제 억제를 일으키는지를 예상하는데 사용된다(도3b). 디메톡시퀴나졸린 화합물 WHI-P258(4-(페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린)은 다른 환 치환기 없이 퀴나졸린 모이어티에 두 개의 메톡시기를 포함한다. JAK3 키나아제 도메인의 상동 모델을 사용하는 분자 모델링 연구는 WHI-P258이 JAK3의 촉매 부위에 일치하나 제한된 수소 결합 상호작용 때문에 강하게 결합할 수 없음을 제안하였다. JAK3의 촉매 부위에서 주요 잔기인 Asp967는 촉매 부위에 결합하는 분자와 수소결합을 형성할 수 있고, 그러한 분자는 OH기 같은 수소 결합 공여체기를 포함한다. 그러나, WHI-P258은 OH기를 포함하지 않고, 그러므로, Asp967과 적절하게 상호작용할 수 없다. 우리는 WHI-P258의 페닐 환의 위치4에서 OH기의 존재가 Asp967과의 추가된 상호작용 때문에 JAK3에 더 강하게 결합하게 된다는 것을 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위해 일련의 디메톡시퀴나졸린 화합물을 제작하고, 합성하였다.
화합물에 대한 분자 부피의 평가는 표1에 제공된다.
JAK3의 촉매 부위에의 결합에 관련하여 관찰된 제작된 디메톡시퀴나졸린의 구조적 특징의 요약은 도3c에 도시된다. 표1에서 화합물들의 대략적 분자 부피는 252Å 내지 370Å이고, 이는 JAK3 키나아제의 530Å3결합 부위에 일치하기에 충분히 작다. 표1은 또한, JAK3 촉매 부위에 도킹하는 화합물들에 대한 측정된 결합 상수(즉, Ki값)을 포함하는 분자 모델링 연구의 결과를 열거한다. 도킹 연구에서 평가된 화합물들은 페닐 환의 다른 위치에서 유사한 관능기의 치환을 포함한다.
표1에서 열거된 화합물들의 에너지-최소화 도킹 모델의 형태는 페닐환 및 퀴나졸린환 시스템 사이의 대략 4-18°의 2면각을 가진 비교적 평면이었다. 이 형태는 분자를 JAK3의 촉매 부위에 더욱 용이하게 일치하도록 한다. 열거된 화합물 모두는 환 질소(N1)를 포함하고, 이는 JAK3의 경첩 영역에서 Leu905의 NH와 수소결합을 형성할 수 있다. N1가 프로토네이트 될 때, NH는 대신에 JAK3의 Leu905의 카르보닐기와 상호 작용할 수 있다. 페닐 환의 위치4에서 OH기의 존재는 JAK3의 촉매 부위에 결합하는데 특히 중요한 것으로 기대되었다.
도1에 도시된 WHI-P131(측정된 Ki=2.3μM), WHI-P154(측정된 Ki=1.4μM) 및 WHI-P97(측정된 Ki=0.6μM)은 이들이 JAK3의 Asp967와 수소결합을 형성하여 결합력을 향상시킬수 있는 페닐 환의 4'OH기를 포함하기 때문에, JAK3에 바람직한 결합력을 갖고, 효과적인 JAK3 억제 활성을 갖을 것으로 기대되었다. 그러나, WHI-P132의 2'OH기는 Asp967과 상호 작용할 수 있는 오른쪽 방향에 존재하지 않아서, 퀴나졸린 환 질소와 분자간 수소결합을 형성할 것이고, 이는 JAK3의 촉매 부위에 대한 WHI-P132의 상당히 낮은 친화도를 유도할 수 있다. 비교적 큰 브로마인 치환기(WHI-P154)는 상기 분자가 결합 부위에 일치할 수 있도록, 결합 부위 잔기와 접촉하는 분자 표면적을 증가시킬 수 있다. WHI-P154 및 WHI-P97의 모델링은 페닐환이 분자의 결합된 환기에 비교하여 약간 타이트한 경우에도, 브로마인기를 수용할 충분한 공간이 있음을 도시한다. 모델링 연구의 결과는 WHI-P131, WHI-P154 및 WHI-P97이효과적인 JAK3 억제 활성을 갖는다는 가설을 지지한다.
가설을 시험하고, 상기 기술된 JAK3 상동 모델의 예상 값을 확인하기 위해, 우리는 표1에 열거된 WHI-P131, WHI-P154, WHI-P97 및 5개의 다른 디메톡시퀴나졸린 화합물을 합성하였다.
이론적으로 제작된 디메톡시퀴나졸린 화합물에 의한 JAK3의 억제
우리는 먼저, KL2 EBV-변형 사람 림포블라스토이드 B 세포주로부터 면역침강된 사람 JAK3의 효소 활성에 대한 합성된 디메톡시퀴나졸린 화합물의 영향을 비교하기 위해 면역 복합체 키나아제 분석을 사용하였다. 0.6μM 내지 2.3μM의 매우 유사한 측정된 Ki 값을 갖고, 마이크로몰라 농에서 상당한 JAK3 억제 활성을 나타낼 것으로 기대되어지는 WHI-P131, WHI-P154 및 WHI-P97(25μM 내지 72μM의 측정된 Ki 값을 갖는 다른 화합물의 경우는 제외)은 농도-종속형으로 JAK3를 억제하였다. 측정된 IC50값은 WHI-P131은 9.1μM, WHI-P97은 11.0μM 및 WHI-P154는 27.9μM이나, 다른 디메톡시퀴나졸린 화합물 모두는 >300μM이었다(표1). WHI-P131 및 WHI-P154는 또한 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템에서 발현된 재조합 뮤린 JAK3에 대해 시험되었고, 각각 23.2㎍/ml(~78μM, 도5a) 및 48.1㎍ml(~128μM, 도5b)의 IC50값을 갖는 농도-종속형으로 JAK3를 억제하였다. 재조합 JAK3를 억제하는 WHI-P131 및 WHI-P154의 활성은 4번의 독립 실험에서 확인되었다. 이들 키나아제 분석 결과는 상기 기술된 우리의 모델링 연구와 일치한다.
중요하게, WHI-P131 및 WHI-P154는 면역 복합체 키나아제 분석에서 재조합JAK1 또는 JAK2에 대해 검출할 수 있는 어떠한 억제 활성을 나타내지 않았다(도5c 및 도5d). 전기영동 이동 시프트 분석(EMSAs)은 또한, 32Dcll/IL2Rβ 세포에서 사이토카인 유도 STAT 활성을 조사하여 이들 디메톡시퀴나졸린 화합물의 JAK3 특이성을 확인하는데 사용되었다. 도5e에 도시된 바와 같이, WHI-P131(10㎍ml=33.6μM) 및 WHI-P154(10㎍/ml=26.6μM)(대조군 화합물 WHI-P131는 제외, 10㎍/ml=33.6μM) 모두가 IL-2 자극 후 JAK3-종속 STAT 활성을 억제하나, 이들은 IL-3 자극 후 JAK1/JAK2-종속 STAT 활성에는 영향을 미치지 않았다. 모델링 연구는 이 놀라운 JAK3 특이성이 JAK1 및 JAK2에서 글리신으로 변화했으나 JAK3의 촉매 부위에 존재하는 알라닌 잔기(Ala966) 때문일 수 있음을 제안하였다. 결합한 디메톡시퀴나졸린 화합물의 페닐환에 인접한 알라닌기는 페닐기와 한층 큰 소수성 접촉을 제공하고, 이렇게 해서, JAK1 및 JAK2의 결합 부위의 영역에서의 한층 작은 글리신 잔기와 비교하여 한층 높은 친화성을 유도할 수 있다. 그러나, JAK3 대 JAK1 및 JAK2의 WHI-P131 및 WHI-P154에의 민감도에 대한 이런 놀라운 차이의 정확한 해석은 이들의 촉매 부위에서 단순한 아미노산 불일치가 알려진 구조적 차이를 일으킬 수 있기 때문에 이들 키나아제의 X-선 결정 구조의 확인이 요구된다.
티로신 키나아제 억제제로서의 WHI-P131의 특이성
화합물 WHI-P131을 이 신규한 JAK3 억제제의 하나인 디메톡시퀴나졸린에 비-야누스 군 단백질 티로신 키나아제의 민감도를 조사하기 위하여 제작된 실험을 위해 선택하였다. JAK3에 대한 WHI-P131의 억제 활성은 ZAP/SYK 군 티로신 키나아제 SYK(도6c), TEC 군 티로신 키나아제 BTK(도6d), SRC 군 티로신 키나아제 LYN(도6e)및 수용체 군 티로신 키나아제 IRK(도6f)를 포함하는 다른 단백질 티로신 키나아제(표1, 도6)의 350μM의 높은 농도에서도 영향을 미치지 않기 때문에, 특이적이다. 이들 PTKs의 구조 분석은 HCK의 결정 구조(LYN에 대한 상동 모델로서 제공되었다.) 및 IRK을 사용하여 실시되었고, JAK3, BTK 및 SYK의 상동 모델을 제작하였다. 이 분석은 WHI-P131의 특이성에 이바지할 수 있는 다른 티로신 키나아제의 촉매 결합 부위에 위치한 약간의 비보존된 잔기를 나타내었다(도4). 도킹된 억제제에 가장 인접하게 위치된 그러한 잔기의 하나는 WHI-P131의 소수성 페닐환과 접촉하는 가장 바람직한 분자 표면을 제공할 수 있는 JAK3에서의 Ala966(도4에서 영역E)이다. LYN이 JAK3에서 보존된 Ala 잔기(Ala966)를 포함할지라도, WHI-P131이 LYN을 억제하지 못하는 사실은 다른 인자(잔기 차이)가 이 선택성에 영향을 미치는 것을 제안한다. 티로신 키나아제의 촉매 부위에서 다른 비보존된 잔기는 영역A 내지 F에 도시된다(도4). 잔기, 특히, 결합된 억제제와 직접 접촉하는 잔기들에서의 이들 차이는 모두 JAK3에 대한 관찰된 특이성에서 중요한 역할을 할 수 있다.
실시예2는 JAK3 키나아제 도메인의 신규한 상동 모델이 JAK3의 효과적이고 특이적인 억제제의 구조 기초 제작 및 합성을 위해 사용될 수 있음을 증명한다.
마지막으로, 상동 모델은 JAK3의 활성 부위가 억제제 결합에 유용한 대략 530Å3부피를 갖는 대략 8Å×11Å×20Å임을 지시한다. JAK3 키나아제의 제작된 상동 모델을 사용한 우리의 모델링 연구는 또한, 퀴나졸린 억제제의 개선에 상당한 가능성이 있음을 나타내었다. JAK3 모델은 퀴나졸린 유도체에 의한 더 잘 이용될 수 있는 ATP-결합 부위에서 추가적인 부피가 있음을 나타내었다. 우리의 디메톡시퀴나졸린 화합물의 평균 분자적 부피는 277Å3이고, 이는 530Å3의 결합 부위의 측정되 총 부피 보다 작다. 이는 페닐환의 2' 및 3'위치에서 더 큰 관능기를 갖는 새로운 억제제의 고안에 대한 가능성을 제시한다. Jak3 촉매 부위에 대한 그들의 결합을 용이하게 하는 디메톡시퀴나졸린 화합물의 구조 및 화학적 특징은 도3c에 기술된 하기 특성을 포함한다. 1) 페닐환의 4'-OH기의 존재, 2) Leu905 NH에 인접한 수소결합 수용체 또는 Leu905 카르보닐에 인접한 수소결합 공여체(NH, OH)의 존재, 3) 결합 부위에 접근할 수 있는 다소 편평한 분자적 형태, 4) Jak3 촉매 부위를 연결하는 잔기들에 의해 한정된 530Å3공간에 일치하는 능력이다. 촉매 부위에서 JAK3 잔기에 대한 이들 예상된 결합 선호는 JAK3의 새롭고 더 효율적인 고안을 위한 기초로 사용된다.
항-백혈병제로 작용하는 화합물의 효능은 종래 공지된 분석을 사용하여 측정될 수 있거나, 실시예3에서 기술된 것과 유사한 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
실시예3: 백혈병 분석
하기 세포주들이 다양한 생물학적 분석에 사용되었다.
NALM-6(pre-B-ALL), LCl;19(pre-B-ALL), DAUDI(B-ALL), RAMOS(B-ALL), MOLT-3(T-ALL), HL60(AML), BT-20(유방암), M24-MET(흑색종), SQ20B(편평세포 암종) 및 PC3(전립선암)
이들 세포주를 이전에 기술된 배양액에 유지시켰다(16, 17, 20, 24, 32, 33). 세포는 화합물6의 다양한 농도를 함유하는 처리 배지에 50×104세포/웰의 밀도에서 6웰 조직 배양 플레이트에 시드되고, 습한 5% CO2분위기, 37℃에서, 24-48시간 동안 인큐베이트 하였다.
사람 백혈병 세포를 발현하는 JAK-3에 대한 화합물6의 세포독성을 시험하기 위해, 백혈병 세포를 이 JAK3 억제제에 노출시키고, 특정 형광 미토콘드리아 탐침 및 다변인 플로우 사이토메트리를 사용하여 미토콘드리아 막 전위(△ψm) 및 미토콘드리아 질량에서 세포소멸-관련 변화에 대해 조사하였다. △ψm에서 변화를 측정하기 위해, DiICl(에너지화된 미토콘드리아에 축적)를 사용하였고, 반면, 미토콘드리아 질량은 에너지 상태에 독립적인 미토콘드리아 내막에 결합하는 형광 염료인 NAO로 세포를 염색하여 측정하였다. 24시간 또는 48시간 동안, 7.4㎍/ml(25μM) 내지 60㎍/ml(200μM)의 화합물6으로 NALM-6 백혈병 세포의 처리는 DiICl을 사용하는 플로우 사이토메트리로 측정된 농도 및 시간-종속형으로 탈분극된 미토콘드리아의 수를 증가시켰다(도7a). 도7a에 도시된 바와 같이, 탈분극된 미토콘드리아를 갖는 DiICl-음성 세포의 분획이 48시간 동안 비히클 처리 대조군 세포의 1.3%에서 200μM 화합물6으로 처리된 세포의 81.6%로 증가하였다. 감소된 DiICl 염색에 의해 측정된 바와 같이, 미토콘드리아의 탈분극을 유도한 화합물6의 평균 EC50값은 24시간 처리 동안 79.3μM, 48시간 처리의 경우 58.4μM이었다. △ψm에서 관찰된 변화는 처리 및 비처리 NALM-6 세포에서 NAO의 실제상 동일한 염색 강도에 의해 확인된 바와 같이, 미토콘드리아 질량의 손실 때문이 아니었다(도7b). △ψm에서 이 상대적 변화를 증명하기 위해, 우리는 미토콘드리아 염료인 JC-1을 사용하였고, 이는일반적으로 연두색 형광을 방출하는 단량체로서 용액에 존재하고, 미토콘드리아 막투과 전위에 의해 유도된 반응에서 빨강색 형광을 방출하는 이량체 형태를 가정한다(Smiley, S. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:3671-3675, 1991). 이렇게 해서, JC-1의 이용은 미토콘드리아 질량(연두색 형광) 및 미토콘드리아막 투과 전위(빨강색/오렌지 형광)의 동시 분석을 가능하게 한다. 25μM 내지 200μM의 증가하는 농도 범위 및 24시간 또는 48시간의 증가하는 노출 기간으로 NALM-6 세포를 처리 후, 우리는 JC1 연두색 형광에서 의미있는 상응하는 바 없이 JC-1 빨강/오렌지 형광에서 감소를 갖는 △ψm와 미토콘드리아 질량 사이의 혁신적인 분리를 관찰하였다(도7c&d).
도7c에 도시된 바와 같이, JC-1 빨강색/오렌지 형광-음성 세포의 분획은 48시간 동안 비히클-처리 대조군 세포에서 79.2%에서 200μM 화합물6 처리 세포에서 16.9%로 감소하였다. JC-1 연두색 형광에 대한 상응 값은 비히클 처리 세포에 대해 99.3% 및 화합물6-처리(200μM×48시간) 세포에 대해 99.8%이었다. 감소된 JC-1 빨강/오렌지 형광에 의해 측정된 바와 같이, 미토콘드리아의 탈분극을 유도한 화합물6에 대한 평균 EC50값은 24시간 처리에 대해 94.2μM이고, 48시간 처리에 대해 50.4μM이었다. 도7d는 JC-1으로 염색한 비히클 처리 및 화합물6 처리(100μM×48시간) NALM-6 세포의 단일 색(빨강/오렌지) 형광 공초점 상을 비교한다. 이 결과는 화합물6이 NALM-6 사람 백혈병 세포의 미토콘드리아막 투과 전위에서 상당한 감소를 유도하는 것을 총괄하여 증명하였다.
세포소멸 분석
세포를 화합물6으로 처리후 세포소멸 변화에 대해 종래 문헌에서 기술된 바와 같이, 제조자의 추천에 따라, ApopTaq 세포소멸 검출 키트(Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하여 인 시츄 말단 디디옥시뉴크레오티딜트랜스퍼라제-중재 dUTP 말단-표지(TUNEL) 분석에 의해 조사하였다(Zhu, D. M., et al., Clin. Can. Res. 4:2967-2976, 1998; D'Cruz, O., P., G., and Uckun, F. M. Biology of Reproduction. 58:1515-1526, 1998).
DNA의 세포소멸성 분절을 검출하기 위해, 세포를 37℃, 1, 3 및/또는 10μM 농도에서 24시간 노출 후에 하베스트하였다. DNA를 분절의 분석을 위해 Triton-X-100 용해물로부터 조제하였다(21). 요약해서, 세포를 저장성 10mmol/l Tris-HCl(pH 7.4), 1mmol/l EDTA, 0.2% Triton-X-100 세정제에서 용해한 후, 11,000g에서 원심분리하였다. 세포소멸-관련 DNA 분절을 검출하기 위해 상층액을 1.2% 아가로스겔에 전기영동하고, DNA 절편을 에티디늄브로마이드로 염색 후 자외선으로 가시화하였다.
화합물6이 백혈병 세포에서 세포소멸을 유도할 수 있는지를 확인하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 함께 인 시츄 TUNEL 분석 방법을 사용하는 디족시제닌-결합 UTP을 갖는 3'OH 말단의 TdT-중재 표지가 사용되었다. 10μM 내지 500μM 농도의 화합물6으로 처리 후, 48시간에 FITC-결합 항디족시제닌(연두색 형광) 및 프로피디윰아이오다이드 대조염색(빨강색 형광)을 사용하여 디족시제닌-dUTP 결합에 대해 조사하였다. 세포소멸성 세포의 비율이 84.6μM의 평균 EC50값을 갖는 농도-종속형에서 증가하였다(도8a). 도8b1 및 도8b2는 비히클 처리 대조군 세포 및 100μM의 화합물6 처리 세포의 두가지 색의 공초점 현미경 상을 도시한다. 화합물6 처리 세포는 세포소멸성 노랑색 핵(=부가된 연두색 및 빨강색 형광)을 도시하였다(도8b.2). 세포소멸에 대한 다른 증거가 DNA 분절 분석에서 관찰되었다. 낮은 비율의 세포소멸성 세포로부터 방출된 DNA 절편을 검출하는 정교한 민감도 때문에, 세포소멸의 DNA 겔 분석은 새로운 항백혈병제의 비특이적 독성을 조사하는데 매우 적합하다.
도9a는 1μM 또는 3μM의 화합물6으로 처리된 NALM-6 백혈병 세포로부터의 상층액이 세포소멸과 일치하는 "사다리형" 분절을 갖는 올리고뉴클레오솜 길이 DNA 분절을 포함하는 반면, JAK3 억제 활성이 없는 구조적으로 유사한 디메톡시퀴나졸린 화합물로 처리된 NALM-6 세포의 상층액에서는 어떠한 DNA 분절이 관찰되지 않았다.
JAK3-양성 백혈병 세포(도9a에서 NALM-6 세포, 도9b에서 LCl;19 세포)와는 다르게, JAK3 음성 SQ20B 편평세포 암종 세포 및 M24 MET 흑색종 세포는 화합물6 처리 후 어떤 세포소멸성 DNA 분절을 나타내지 않았다(도9b).
이들 결과는 JAK3 특이적 티로신 키나아제 억제제 화합물6이 핵 DNA의 사다리형 분절 양상 및 TdT의 존재시 분절된 핵 DNA의 노출된 3'-히드록실 말단의 디족시제닌-11-UTP 표지에 의해 증명된 바와 같이, 미토콘드리아막의 탈분극을 유도하고, 사람 B-직계 ALL 세포에서 세포소멸을 유도한다.
클론원성 분석
클론원성 종양 세포에 대한 화합물6의 항백혈병 활성을 메틸셀룰로오스 콜로니 분석 시스템을 사용하여 조사하였다(Uckun, F. M., et al., J. Exp. Med. 163:347-368, 1986; Messinger, Y., et al., Clin Cancer Res. 4:165-70, 1998). 요약해서, 세포(RPMI-10% FBS 중의 105/ml)를 다양한 농도의 화합물6으로 37℃에서 밤새 처리하였다. 처리 후, 세포를 두 번 세척하고, 페트리디쉬의 RPMI-10% FMS-0.9% 메틸셀룰로오스에서 104또는 105세포/ml로 플레이트하고, 습한 5% CO2인큐베이터의 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 계속해서, 백혈병 세포(또는 종양 세포) 콜로니를 역상-대조 현미경을 사용하여 계수하였다. 콜로니 형성의 억제 비율을 하기식을 사용하여 계산하였다.
화합물6의 항백혈병 활성은 ALL 세포주 NALM-6, DAUDI, LCl;19, RAMOS, MOLT-3 및 AML 세포주 HL-60의 시험관내 콜로니 성장을 억제하는 활성을 확인하여 측정하였다. 표1에 상세히 설명된 바와 같이, NALM-6 세포에 대해 24.4μM 및 DAUDI 세포에 대해 18.8μM의 EC50값을 갖는 농도-종속형에서 클론원성 성장을 억제하였다. 100μM에서 화합물6은 99% 이상으로로 이들 백혈병 세포주에 의한 시험관내 콜로니 형성을 억제하였다. 반대로, 화합물6은 JAK3-음성 M24 흑색종 또는 SQ20B 편평세포 암종 세포주의 클론원성 성장을 억제하지 않았다.
(표1)
다른 연구에서, 화합물6은 JAK3을 억제하나 JAK2, SYK, BTK, LYN 및 IRK를 포함하는 다른 단백질 티로신 키나아제를 억제하지 않았다. ALL 세포는 JAK2를 발현한다. 유사하게 Src 군 PTK LYN, Zap/Syk 군 PTK SYK 및 Tec 군 PTK BTK는 ALL 세포에서 발현되고, 그들의 부착, 증식 및 생존에 영향을 미친다(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274: 1646-1656, 1999, Uckun, F. M., et al., Science. 267:886-91, 1995; Kristupaitis, D., et al., J. Biol. Chem. 273(15):9119-9123, 1998; and Xiao, J., et al., J. Biol. Chem. 271:7659-64, 1996). IRK는 백혈병 세포, 특히, t(1;19)전좌를 갖는 pre-B ALL 세포에서 검출되는 수용체 PTK 군의 유일한 구성원이다(41-43). 화합물6은 이들 티로신 키나아제를 억제하지 않기 때문에, ALL 세포를 죽이는 활성은 이들 세포에서 JAK2, LYN, SYK, BTK 또는 IRK의 비특이적 억제에 이바지할 수 없다(Kaplan, G. C., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159(3): 1275-82, 1989; Newman, J. D., et al., Int. J. Cancer. 50(3): 500-4, 1992; Bushkin, I. and Zick, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172(2):676-82, 1990).
상기한 바는 식Ⅰ(화합물6)의 대표적인 JAK3 억제제가 급성 림포블라스틱 백혈병을 치료하는 유용한 치료제이고, 화합물6이 백혈병 세포에서 세포소멸을 유도하는 것을 증명하였다. 이렇게 해서, 식Ⅰ의 디메톡시퀴나졸린 같은 JAK3의 효과적이고 특이적인 억제제는 소아암의 가장 통상적인 형태인 급성 림포블라스틱 백혈병을 치료하는데 유용하다.
피부암을 예방 또는 치료하는 화합물의 효능은 종래 공지된 분석 방법 또는 실시예4에 기술된 것과 유사한 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
실시예4: 피부암 분석
6-7주된 털 없는 알비노 마우스(skh-1) 암컷을 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)로부터 구매하고, USDA(United States Department of Agriculture)로부터 인정된 제어된 환경(12-h 광/12-h 암 주기 기간, 22±1℃, 60±10% 상대 습도)에서 사육하였다. U.S 애니멀 웰페어 액트(Animal Welfare Act.) 및 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰(NIH)의 규정에 따라 병원균 없는 환경에서 5그룹을 사육하였다. 모든 마우스를 고압 멸균된 깔짚을 포함하는 마이크로아이솔레이터 케이지(Lab Products, Inc., NJ)에서 사육하였다. 실험 전반에 걸쳐서 마우스가 고압멸균된 펠렛 사료 및 수돗물에 접근하기 쉽도록 한다. 동물 관리 및 실험 과정은 제도적 정책에 일치하여 실시하였다.
완충 포르말린 인산(10%)을 피셔 사이언티픽(Fisher Scirntific)(Springfield, NJ)으로부터 구매하였다. 디메틸술폭사이드(DMSO) 및 인산 완충 식염수(PBS)는 시그마(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. UVB 범위(280 내지 320nm)에서 주로 빛을 방출하는 자외선 램프(8-FSX24T12/HO/UVB)는 내셔널 바이로지컬 코포레이션(National Biological Corporation, Twinsburg, OH)으로부터 구매하였다. UVB 메터(모델-500C, 내셔널 바이로지컬 코포레이션)를 사용하여 각각 조사 전에 UVB 램프의 방사조도를 측정하였다. UV 선에 노출하기 위해, 마우스 세 마리를 세 구획(한 구획에 한 마리의 마우스)으로 분리된 개방 28cm×10cm 플라스틱 박스에 놓았다. 플라스틱 박스는 UVB 선 뱅크하의 중앙에 놓이고, 마우스를 UVB 35mj/㎠로 조사하였다. UVB 35mj/㎠의 노출 시간은 30-40s로 다양하게 하였다. UVB 램프와 조사를 수용하는 표면 사이의 거리는 20cm이다.
종양발생 과정: 표1에 도시된 바와 같이 그룹당 5-14마리의 마우스를 포함하는 3가지 그룹으로 마우스를 분리하였다. 각각 UVB 노출 전에 등 표면에 2㎠ 이상의 화합물6(DMSO에 용해된 1.0mg/㎠)의 1회 투여로 국부 처리하였다. 15분 후에, 화합물6 처리 마우스를 UVB(35mj/㎠)로 조사하였다. 마우스의 UVB 노출은 총 20주 동안 주당 3회 실시하였다. 대조군 마우스는 UVB 노출 전에 비히클로 처리하였다.
(표1)
마우스의 피부 두께 및 직경 1mm 이상의 유두상 피부 병변을 주당 2회 측정하여 기록하고, 두 번 측정의 평균을 계산에 사용하였다. 피부 두께, 병변수 및 병변 직경 측정은 화합물6 또는 비히클 로 처리된 마우스의 등 표면 위의 단지 2㎠에 한정하였다. 병변 부피는 하기 식을 사용하여 계산하였다.
부피=4/3πr3
연구 종결시에, 각 그룹의 5-19 병변을 임의로 생검하고, 10% 완충 포르말린에 고정하였다. 포르말린-고정 표본을 파라핀 블록에 끼워 넣고, 4㎛ 두께로 잘라내어 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 피부 분획의 병리적 평가는 표본의 정체를 알 수 없는 공인된 수의 병리학자에 의해 실시되었다.
종양의 병리학적 분류: 종양의 병리학적 분류는 다음과 같다. 1) 피부 유두종: 종양 세포의 침습성 성장 없이 극세포성 표피의 진피로의 종양 유두 성장. 종양 세포는 비전형적인 것으로 보이지 않는다. 2) 광선각화증(actinic keratosis): 과증식성, 오르토케라토틱(orthokeratotic), 완만한 표피비후성 상피(acanthotic epithelium)에 마일드함. 3) 플로리드 광선각화증: 최상 진피로 확장하는 완만한 표피비후성 융기에 마일드한 광선각화증으로, 외견상의 침습성 편평세포 암종과 유사. 4) 각화극세포종(keratoacanthoma): 과증식성, 표피비후성층이 형성된 편평 상피세포로 둘러싸인 크레이터로 충전된 중앙 케라틴을 갖는 유도상 성장. 종양의 가장자리 끝은 진피를 이루는 기반으로 밀고 들어간다. 5) 편평세포 암종(SCC): 최상 및 중간 진피로 침습하는 비전형적 세포 모임을 갖는 종양.
실시예4에 대한 결과
썬번은 피부 혈관확장(홍반) 및 상처 입은 피부에 액의 삼출(부종)을 갖는 혈관 투과도의 증가로 특징지어지는 UV 유도 염증 반응이다. 혈장 삼출에서 UVB 유도 증가는 조사 후 24시간에서 피하지방 두께의 증가로 확인할 수 있다(Berg, R. J., et al., 1998, J. Invest Dermatol 110:405-9). 마우스의 UVB 선에 노출(그룹 B)은 대조군 마우스의 피부 두께와 비교하여 피하지방 두께의 증가를 유도하였다(도10). 화합물6 처리 그룹(그룹C)에서는 대조군(그룹A)과 비교하여 피부 두께의 증가가 있었다. 그러나, 피부 두께의 증가는 마우스의 UVB-조사된 및 비히클-처리 그룹과 비교하여 상당히 낮았고, 이는 화합물6의 항염증 효과를 지시한다. 마우스는주당 3회 정기적으로 조사되기 때문에, 피부 부종의 지속된 증가가 UVB-조사 마우스에서 연구의 기간 동안 관찰되었다(그룹 B&C). 그러나, 어떤 주어진 시간에도 피부 부종에서 증가는 약제 처리 마우스에서 화합물6에 의해 부분적으로 억제되었다.
피부의 UVB 조사에의 만성적 노출은 그러한 조사에 노출에 의한 크기 및 수를 증가시킬 수 있는 미세 피부 병변의 발달을 주로 유도한다. 도11에 도시된 바와 같이, 마우스의 만성 UVB 노출은 마우스의 비히클 처리 및 UVB 조사 그룹(그룹 B)에서 약 10주간의 조사에서 처음 나타난 상처 입은 피부에서 미세 병변을 유도하였다. 피부 병변의 총 수는 UVB-조사 그룹 마우스(그룹B)에서 UVB-노출 수의 증가에 따라 지수적으로 증가하였다. 그러나, 화합물6 처리 마우스(그룹C)에서, 병변 발생은 지연되었고, 첫 병변은 UVB 조사 14주 후에 관찰되었다. 이 그룹에서 마우스당 평균 병변의 수는 또한, 어떤 주어진 시간에서, 그룹B에서처럼 UVB 노출의 증가하는 수에 따라 증가할 지라도, 마우스 당 평균 병변의 수는 비처리 대조군(그룹B)과 비교하여 작았다.
상기 데이터는 UV 노출 이전의 화합물6의 처리가 UVB 처리(그룹B)의 10주에서 14주로 종양의 발생을 지연시키고, 반복된 UVB 노출로부터 발생하는 총 병변의 수를 억제한다.
UVB 조사의 약 10-14주에 처음 발생한 병변은 UVB 노출의 회수를 증가시킴에 따라, 크기와 총수가 동시에 증가하였다. 피부 병변의 크기를 비교하기 위해, 병변 직경을 재료 및 방법에 기술된 식을 사용하여 병변 부피로 전환하고, 마우스 당 평균 병변 부피를 비교하였다. 도12는 마우스 당 평균 병변 부피에 대한 화합물6 처리의 영향을 도시한다. 도면으로부터 평균 병변 부피가 UVB 조사된 마우스 그룹(그룹 B&C)에서 시간에 따라 증가하나, 화합물6 처리 마우스는 병변 부피에서 증가가 억제됨이(그룹C) 관찰되었다(도12 및 표2). 또한, 우리는 조사 20주 후, 화합물6 처리 및 비처리 그룹의 마우스에서 병변 당 평균 부피를 비교하였다. 이전에 관찰된 바와 같이, 마우스 당 평균 피부 병변 부피와, 병변 당 평균 부피는 또한, 화합물6 처리에 의해 억제되었다(표2).
(표2)
형태학적 및 조직병리학적 데이터
3개 그룹의 마우스로부터 조사 20주 후에 마우스 피부의 형태학적 외관을 비교하였다. 도13은 UVB으로 반복된 노출이 병든 피부에서 다수의 병변 성장을 유도하는(도13, 패널B) 반면, 화합물6의 처리는 그러한 병변의 성장을 억제하였다.
UVB 조사 20주 후의 마우스에서 피부 생검의 조직병리학적 발견을 표3에 나타내었다.
(표3)
온화한 피부염이 연구 과정 동안 주당 3회 비히클(DMSO)의 국부 도포에 의해 유도될 수 있는 비조사 마우스 그룹(그룹A)을 포함하는 세 개 그룹에서 관찰되었다. 과형성성 및 온화한 표비비후성 상피를 나타내는 광선각화증은 UVB 조사그룹(그룹 B&C)으로부터의 생검조직의 대부분에 나타났다. 각화극세포종의 단일 병변은 UVB 조사 및 비히클 처리 마우스 그룹에서 관찰되었다(그룹B). 그러한 병변은 화합물6 처리 그룹 중 14마리의 마우스 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다(그룹C). 표면상의 침습성 편평세포 암종(플로리드 광선각화증 및 SCC에 전구체) 및 SCC의 발생은 UVB 조사 그룹(B&C)에서 확인되나, 화합물6 처리 마우스(그룹C)에서는 약23% 억제되었다(표3). 유사하게, 피부 유두종의 발생은 화합물6에 의해 부분적으로 억제되었다.
실시예4의 결과는 UV 조사 전의 화합물6의 국부 도포는 만성 노출에서 피부암의 해로운 결과로부터 피부를 보호한다는 것을 지시한다. 표면적으로, UVB 노출 전의 피부에 화합물6의 국부 도포는 피부 병변의 형성을 상당히 억제하고, 종양 크기를 감소시키고, skh-1 마우스에서 종양의 발달을 억제하였다. 많은 문헌이 피부 종양 형성에서 UVB 조사의 역할을 확인하였다(Devary, Y., et al., 1992, Cell 71:1081-91; Ley, R. D., et al., 1989, Photochem Photobiol 50:1-5; Hall, E. J., et al., 1988, Am. J. Clin. Oncol. 11:220-52; and Marks, R. 1995, Cancer 75:607-12). 피부 세포의 UVB-조사는 증가된 아라키돈산 및 그것의 대사물의 방출을 유도한다(Konger, R. L., et al., 1998, Biochem Biophys Acta 1401:221-34)(12-15). 아라키돈산의 산소화 산물인 프로스타글란딘은 피부 세포의 UVB 조사에 따라 높은 양 생성되고(Hawk, J. L. M., and J. A. Parrish. 1993. Responses of Normal Skin to Ultraviolet Radiations. Plenum Medical Book Publishers, New York; Hruza, L. L., and A. P. Pentland. 1993, J Invest Dermatol 100:35S-41S; Kang-Rotondo, et al., 1993, Am J Physiol 264:C396-401; and Grewe, M., U. et al., 1993, J Invest Dermatol 101:528-31), 종양발생의 다양한 모델에 관련될 수 있다(Vanderveen, E. E., et al., 1986, Arch Dermatol 122:407-12; Cerutii, P. A., and B. F. Trump. 1991, Cancer Cells 3:1-7). 종양 성장 자극에 더하여, 프로스타글란딘은 숙주의 면역 감시를 억제하는 경향을 갖는 것이 증명되었고(Plescia, O. J., et al., 1975, Proc Natl Acad Sci U.S.A 72:1848-51; Goodwin, J. S. 1984. Am J Med 77:7-15), 이렇게 해서, 종양 진행을 돕는다. PGE2의 증가된 수치는편평세포 및 피부의 기저세포 암종에서 관찰되고, 이들 종양의 증가된 전이 활성 및 침습 반응과 관련될 수 있다(Vanderveen, E. E., et al., 1986, Arch Dermatol 122:407-12; Klapan, I., V. et al., 1992, J Cancer Res Clin Oncol 118:308-13). 프로스타글란딘의 생산을 억제하는 다양한 화학 화합물이 종양의 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다(Snyderman, C. H., et al., 1995, Arch Otolaryngol Head Neck Surg 121:1017-20; Hial, V., et al., 1976, Eur J Pharmacol 37:367-76; Lynch, N. R., et al., 1978, Br J Cancer 38:503-12).
이전의 관찰과 조합하여 UVB 유도 피부 종양발생을 억제하는 화합물6의 효능은, 화합물6이 자외선 같은 환경적 요소에 의해 유도된 사람 암의 형태에 대한 유용한 화학예방제로 습성 피부 염증을 억제한다는 것을 지시한다.
피부암의 예방 또는 치료에 대한 화합물의 효능은 종래 기술된 분석법 또는 실시예5에 기술된 것과 유사한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
실시예5: UVB-유도 피부 발암과정 분석
화합물6은 상피 세포에서 UVB 유도 염증 조정자 방출을 억제할 수 있고, 이렇게 해서, UVB 노출 피부의 염증 반응을 방지한다.
6-7주된 털 없는 알비노 마우스(skh-1) 암컷을 찰스 리버 연구소(Wilmington, MA)로부터 구매하였다. 생체내 변이를 검출하기 위한 빅블루(LIZ shuttle vector)의 다중 복사체를 갖는 트랜스제닉 빅블루 마우스를 스트라타진(Stratagene)(La Jolla, CA)로부터 구매하였다. U.S 애니멀 웰페어 액트 및 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰(NIH)의 규정에 따라 병원균 없는 환경에서 5그룹을 사육하였다. 동물 관리 및 실험 과정은 제도적 정책에 일치하여 실시하였다.
상피 세포 세포주: HaCaT는 자연발생 변형된 사람 상피 세포주(16)로서 10% 소태아 혈청(Summit Biotech, Ft. Collins, CO)을 보충한 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지(DMEM)에서 유지되었다.
조사 과정: UVB 범위(280 내지 320nm)에서 주로 빛을 방출하는 자외선 램프 8-FSX24T12/HO/UVB는 내셔널 바이로지컬 코포레이션(National Biological Corporation)(Twinsburg, OH)으로부터 구매하여 마우스 및 세포 배양액을 조사하는데 사용되었다. UVB 메터(모델-500C, 내셔널 바이로지컬 코포레이션)를 사용하여 각각 조사 전에 UVB의 방사조도를 측정하였다. 배양액 조사에 사용된 UVB는 25mj/㎠이었다. 마취한 마우스의 등 표면의 2.0㎠ 에 UVB를 조사하였다. 이 영역은 조사 15분 전에, 약제 수용 마우스는 시험 화합물(1.5mg/㎠) 또는 대조군 마우스에서는 비히클을 처리하여 페인트되었다. UVB 램프와 조사를 수용하는 표면 사이의 거리는 20cm이었다. skh-1 털 없는 마우스에 의해 수용된 최종 방사량은 250mj/㎠이었고, 이는 대략, 이들 마우스에서 최소 홍반 투여량(MED)(17)의 7배 이상이다. 빅블루 마우스는 조사 전에 등을 면도하고, 화합물6의 존재 또는 비존재로 400mj/㎠ UVB에 노출하였다.
프로스타글란딘E 2 분석
24웰 배양 디쉬에서 배양된 융합성 HaCaT 세포를 1% 소혈청 알부민(BSA)(Cayman chemicals, Ann Arbor, MI)을 함유하는 혈청 없는 DMEM으로 3번 세척하고, 37℃에서, 1시간 동안 3-30μM 화합물6으로 인큐베이트 하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 25mj/㎠ UVB에 노출하거나 또는, 50ng/ml rhRGF로 자극하고, 1% BSA를 함유하는 혈청 없는 DMEM으로 사육한다. 화합물6을 재투여하고, 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이트 하였다. 자극 후 6시에, 세포 상층액을 수집하고, 세포 상층액에 방출된 PGE2를 아세틸콜린에스테라제-PGE2트레이서 및 ELISA 키트(Cayman chemicals, Ann Arbor, MI)로 제공된 항-PGE2항체를 사용하여 경쟁적 EIA에 의해 측정하였다. 세포 단백질을 피어스(Pierce's) BCA 단백질 분석법을 사용하여 측정하였다(Smith, P. K., et al., 1985, Anal Biochem. 150(1):76-85).
화합물6을 10mg/ml 농도의 디메틸술폭사이드(DMSO)(Sigma, St. Louis, MO) 중에 먼저 용해하고, 주사 전에 인산 완충 식염수(PBS)에 의해 1mg/ml로 희석하였다. 마우스는 D-2(즉, UVB 노출 2일 전)부터 실험 종결시까지, 화합물6 16mg/kg을 복강내 환약 주사로 매일 처리하였다. 약제 수용 마우스는 조사 15분 전에 또한 화합물6의 1.5mg/㎠로 도포된다. 대조군 마우스는 비히클만 처리되었다.
자외선 B-조사된 각질세포에서 주요한 아라키돈산 대사물 중 하나는 6시간 일찍 검출될 수 있는 프로스타글란딘 E2이고, UVB 노출에 따라 24-48시기에 피크를 이루고, 피부에서 부종 및 홍반을 유도하였다(Gilchrest, B. A., et al., 1981, J Am Acad Dermatol. 5(4):411-22; Konger R. L., et al., 1998, Biochem. et Biophys. Acta(1401):221-34; Woodward, D. F., et al., 1981, Agents actions. 11(6-7):711-7; Snyder, D. S., and W. H. Eaglastein. 1974. Br J Dermatol.90(1):91-93; Snyder, D. S., and W. Eaglastein. 1974. J Invest Dermatol 62:47-50; and Gupta, N., and L. Levy 1973, Br J Pharmacol 47(2):240-8). 우리는 화합물6의 UVB 조사된 상피 세포에서의 PGE2방출에 대한 영향을 측정하였다. 사람 상피 세포, HaCaT를 UVB에 노출하고, 화합물6의 존재 또는 비존재시에서 인큐베이트하고, 6시간 인큐베이션 동안의 세포 상층액에서 방출된 누적 PGE2를 측정하였다. PGE2방출의 분석(도14)은 25mj/㎠ UVB에 HaCaT의 노출이 비-UVB 조사 대조군과 비교하여 조사 6시간 후에 PGE2수치가 약 11배(11.11(4.23)) 증가를 유도하였다. UVB 유도된 프로스타글란딘 방출은 농도 종속 방식으로 화합물6에 의해 억제되었고, 프로스타글란딘 방출에서 약 90% 억제는 화합물 30μM 투여량에서 관찰되었다. 이 데이터는 화합물6이 UVB 자극 상피 세포에서 프로스타글란딘 E2방출을 억제할 수 있음을 지시하였다.
HaCaTs 와 제1의 사람 각질세포는 이들 세포 표면에 기능성 EGF-수용체를 매우 높은 수로 발현한다. 상피 세포에 존재하는 EGF 수용체의 자극은 막 투과 신호에 참여하고, 프로스타글란딘의 형성을 유도한다. 화합물6에 의한 프로스타글란딘 방출의 이전의 관찰된 억제가 EGF-R 활성을 억제하기 때문인지를 확인하기 위해, 우리는 화합물6의 상피 세포에서 EGF-자극 프로스타글란딘 형성에의 영향을 연구하였다. 6시간 동안의 50mg/ml rhEGF로의 HaCaT의 자극은 비자극 대조군 보다 프로스타글란딘 방출을 약 4배 증가를 유도하고(도15), 프로스타글란딘 방출에서 관찰된 증가는 30μM 화합물6의 존재에서 억제되었는데, 이는 (ⅰ) 표피 성장 인자 수용체가 상피 세포에서 프로스타글란딘 형성을 중재하고, (ⅱ) 화합물6이 EGF-R 활성의 억제를 통하여 UVB 자극 세포에서 프로스타글란딘 방출을 억제한다는 것을 지시한다.
형태학 및 피부 부종 측정
UVB 조사된 피부의 형태학적 특징이 실제로 감지되었고, 대조군 마우스 피부와 비교되었다. 마우스의 등 표면의 피하지방 두께는 0.015mm의 정확성을 갖는 0-10mm 범위의 두께를 측정하는 디질탈 두께 게이지(Mitutiyo, So. Plainfield, NJ)를 사용하여 5일 동안 UVB 노출 전과 그 후 매일 기록하였다.
이미 언급된 바와 같이, 프로스타글란딘 E2는 효과적인 염증 중개자이고, 혈관확장을 유도하고, 상처가 따르는 피부에서 부종을 일으키는 것이 공지되어 있다. 상피 세포를 사용하는 우리의 시험관내 연구는 화합물6이 UVB 자극 세포에서 PGE2의 방출을 억제한다는 것을 보여주기 때문에, 우리는 화합물6이 생체내 UVB 노출에 따르는 피부의 해로운 염증 반응을 억제할 수 있는 지를 확인하는 것에 관심을 갖고 있다. 이들 연구를 위해, 우리는 털 없는 알비노 skh-1 마우스 암컷을 사용하여 250mj/㎠ UVB로 등 표면을 노출하였다. 마우스의 등 표면의 피하지방 두께는 조사 후 1 내지 5일 동안 피부 부종의 측정으로 확인되었다. 도16은 250mj/㎠ UVB로의 마우스의 1회 노출이 피하지방 두께에서 시간 종속 증가를 유도하였다. 화합물6은 조사후 24시간에 피부 부종을 억제하는 데 효과적이지 않았다. 그러나, 조사된 마우스 그룹에서 UVB 노출 후 48시간까지 피부 두께에서 증가를 억제하였다. 반대로,같은 시간에, 대조군 마우스 피부 두께의 약 70%까지 증가하였다. 조사 후 72시간에, 화합물6 처리 마우스에서 피부 부종의 상당한 감소가 관찰되었고, 조사 후 5일 까지 약제 처리된 마우스에서 피하지방 두께는 거의 대조군 수준이었다. 반대로, 비히클 처리 그룹에서, 피부 두께는 5일에 걸쳐서 대조군 마우스 피부 두께의 총 2.5배 증가하였다. 유사한 결과가 폴리에틸렌글리콜-200(PEG-200)에 용해된 WHI-P131로 얻어졌다(데이터 생략). 이들 관찰은 화합물6이 마우스에서 UVB 유도 피부 부종을 억제한다는 것을 지시하였다.
우리는 또한, 화합물6 처리 및 비히클 처리군 마우스에서 UVB 노출 후 피부 외관에서의 형태학적 변화를 관찰하였다. UVB 노출 후의 24-48시간에서 피부에 대한 썬번 손상은 피부 표면의 "코끼리 피부"로서 확인되었다. 마우스의 UVB 조사된 피부는 분홍색의 가죽으로 두꺼워 보인다. 염증 유도 첫째날 및 둘째날에, 약제 처리된 및 비히클 처리된 마우스군의 피부 외관에서 어떠한 차이도 보이지 않았다. 그러나, 3일째 시작되는 UVB 조사시, 비히클 처리 마우스는 피부를 벗기는 얇은 껍질들이 피부 표면으로부터 박리되고, 5일 째에는 이 그룹의 마우스의 피부는 질겨지고, 표면에 발달된 흉터를 갖는다. 반대로, 화합물6 처리군에서, 마우스의 피부 외관은 UVB 조사 3일 및 5일 까지 향상되고, 피부 염증의 신호를 갖지 않고, 피부 외관은 대조군 마우스의 것과 유사하였다(도18).
피부의 UVB 유도 조직학적 변화가 또한 연구되었다. 통상의 표피는 일반적으로 2-3 세포층을 갖고, 특히, 털 폴리클 주위에 산발되어 있는 염증성 세포를 포함한다(19a). UVB 유도 피부는 3-5 세포층으로 두꺼워짐을 나타내었다. 반대로, 화합물6으로 처리된 마우스의 피부는 1-2세포층의 상피 세포와 정상의 진피를 갖는 비조사 대조군의 피부와 거의 유사한 것처럼 보였다(도19c). 이렇게 해서, 화합물6은 UVB 조사 마우스의 피부에서 부종의 발달 및 중성백혈구(neutrophil) 유입을 억제하였다.
혈관 투과도
혈관 투과도는 알부민 결합된 음이온성 염료, 에반스 블루(Sigma, St. Louis, MO)의 용기로부터 누출에 의하여 정량 분석되었다. 에반스 블루(1%, 200(l/마우스))를 꼬리 동맥을 통하여 주입하고, 4시간 후, 마우스를 죽이고, 등의 조사된 피부를 생체검사한다. 생검으로부터 염료를 2시간 동안 80℃에서 가열하여 포름아미드(Sigma, St. Louis, MO) 중에서 추출하고, 포름아미드의 광학 흡광도를 620nm에서 측정하였다.
부종이 증가된 혈장 삼출과 관련되기 때문에, 우리는 화합물6의 UVB 유도 피부 혈관 투과도에 영향을 측정하였다. UVB 조사에 따른 혈관 투과도 변화에 대한 데이터를 도17에 도시하였다. 피부 부종 발견과 일치하는 UVB 조사 마우스에서 피부의 혈관 투과도의 증가가 있었다. 화합물6의 효과는 조사 후 24 및 48시간에 최소였다. 그러나, UVB 조사 후 5일에, 화합물6 처리군에서 혈관 투과도가 대조군 수치와 비슷한 반면, UVB 노출된 비히클 처리군에서는 혈관 투과도가 5배 증가하였다.
썬번 세포 염색 및 조직학적 연구
마우스를 목 탈구에 의해 죽인 후, 피부를 제거하고, 치과용 왁스의 시트에편다. 구멍(8mm)을 뚫고, 완충 포르말린으로 고정한다. 4-5㎛ 두께의 분획을 파라핀 블록으로부터 잘라낸다. 썬번 세포 염색을 디족시제닌-표지 제노믹 DNA의 직접 형광에 의해 썬번 세포를 검출하는 Apop Taq Plus 인 시츄 검출 키트(Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하여 실시하였다. 요약해서, 디족시제닌-뉴클레오타이드의 잔기를 말단 디옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 효소의 존재 하에 이중 또는 단일 스트랜드 DNA의 3'-OH 말단에 촉매적으로 추가하고, 결합된 뉴클레오타이드를 플루오레세인과 결합한 항-디족시제닌 항체를 사용하여 검출하였다.
조직 분획을 조사하여 조직학적 변화를 연구하는 것은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 상기 염색된 슬라이드를 현미경상에서 조사하였다.
UVB에의 심한 노출은 피부 세포에서 썬번을 유도한다. UVB-조사된 마우스 피부에서 썬번 세포의 존재는 이전에 기술된 인 시츄 세포소멸 검출 키트를 사용하여 검출하였다. 상당한 수의 썬번 세포(도20)는 광 노출 후, 48시간에 UVB 조사된 마우스의 피부에서 관찰되었다. 반대로, 같은 시간에서, 화합물6 처리 마우스에서는 썬번 세포가 거의 관찰되지 않았다. 이렇게 해서, 상기 데이터는 화합물6이 마우스 피부에서 UVB 유도 세포 죽음을 억제한다는 것을 제안하였다.
이식 합병증을 예방 또는 치료하는 화합물의 효능은 종래 공지된 분석법 또는 실시예6에 기술된 것과 유사한 분석법을 사용하여 측정되었다.
실시예6: 이식 합병증
증식 분석
9주된 C57BL6 수컷으로부터의 스플레노사이트(4×105/100㎕)를 파이토헤마글루티닌(PHA)- 및 콘카나발린A(Con A)-유도 증식 분석에서 응답동물로 사용하였다. 세포는 10% 소태아 혈청에 의해 보충된 RPMI 1640 배지 200㎕의 최종 부피로 96웰 마이크로플레이트에 그룹당 3개씩 적용되었다. PHA 또는 Con A(Sigma, St. Louis, MO)를 각각 5 또는 2㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 화합물6은 0.1, 1, 10 및 50㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 세포는 3일 동안 37℃의 인큐베이터에서 습한 공기의 5% CO2에서 배양되었다. 그 후, 살아있는 세포에서의 미토콘드리아 디하이드로게나아제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)에 의한 테트라졸리움 염 WST-1의 분할을 근거로 한 세포 증식의 정량화를 위한 컬러리메트릭 분석은 제조자의 지시를 따라 실시하였다. 흡광도는 멀티스캔 MS 마이크로플레이트 스캐너에서 450/690으로 측정하였다. 세포 증식의 값은 PHA 또는 Con A 자극 세포 증식의 감소하는 O. D. 값과 비자극된 세포의 O.D. 값(음성 대조군)에 의해 얻어졌다.
혼합 림프구 반응(Mixed lymphocyte reaction; MLR)
MLR 분석을 위해, 응답 동물 세포(9주된 C57BL6 수컷으로부터 얻은 스플레노사이트)를 4×105/100㎕의 농도로 96웰 플레이트에 3중으로 플레이트 하고, 마이토마이신 처리 자극제(10-12주된 BALB/c 수컷)를 8×104/50㎕의 농도로 첨가하였다. 화합물6을 상기 기술된 농도로 최종 부피 200㎕이 되도록 첨가하였다. 세포를 5일 동안 배양하였고, 컬러리메트릭 WST-1 분석을 상기 기술된 바와 같이 실시하였다.
세포소멸 검출
C57BL6 스플레노사이트(3×106/ml)을 상기 기술된 조건 하에서 RPMI 1640의 500㎕ 중에 24시간 동안 24웰 플레이트에서 배양하였다. 화합물6을 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 세포소멸성 세포 사멸은 인 시츄 세포 검출 키트, 플로오르세인(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, TUNEL에 의해 검출하였다. 배양기 후, 세포를 하기 제조자의 지시에 따라 세척, 고정, 투과, 염색하고, 세포소멸을 FACS Calibur를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다(Becton Dickinson, San Jose, Ca).
마우스
골수 이식 수용체는 8-10주된 C57BL/6(H-2b)이었고, 공여체는 6-8주된 BALB/c(H-2d) 수컷이었다(두 균주 모두 Taconic, Germantown, NY). 마우스를 특정 병원체 없는 조건 하의 휴우즈 인스티튜트(The Hughes Institute)의 동물 보호 시설에서 사육하였다. 기본 마우스 식이(Harlan Teklad LM-485)와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 수용체에는 이식 전 날로부터 시작하여 항생물질-보충된 물(술파메톡사졸/트리메토프림, Hi-Tech Pharmacal, Amityville, NY)이 주어졌다.
조사
파이 형태의 루사이트 홀더(Lucite holder)에 위치시킨 수용체 마우스에 골수 이식 하루 전에 세슘(JL Sheppard Labs, 47.08rad/min)의 치사량(7.5Gy)을 처리하였다.
골수 이식(BMT)
공여체 BALB/c 골수를 대퇴골 및 경골의 샤프트를 플러싱에 의해 L-글루타민(Cellgro)(Mediatech, Hendon, VA)로 RPMI 1640으로 수집하였다. 동시에, 용해 완충액(ACK 용해 완충액-0.15M NH4Cl, 1.0M KHCO3, 0.01M Na2EDTA)로부터 제거된 스플레노사이트의 공여체 단일 세포 현탁액을 역시 준비하였다. BM 세포를 파스테르 파이펫으로 저어서 현탁하고, 미세 구멍 나일론 세포 스테이너를 통과시켜 잔여물로부터 분리하였다. 적혈구를 용해 완충액으로 제거하고, 잔여물의 클럼프를 침전시켰다. 세포를 세척하고, 꼬리 정맥을 통하여 i.v. 주사를 위해 재현탁하였다. 표준 접종물은 및 RPMI 1640의 0.5ml 중의 25×106BM 세포 및 25×106스플레노사이트로 구성되었다.
이식편대숙주병(GVHD) 감지
BMT 수용체는 GVHD의 임상 증거(무게 감소, 피부 홍반의 증거, 탈모증, 곱사병, 설사)의 징후 및 90일 관찰 기간 동안의 생존에 대해 매일 관찰되었다. 생존 시간은 BMT(0일)의 날부터 측정하였다. 이식의 11일 이내에 일어난 죽음은 방사선 유도로 고려되어 제외하였다.
약제 처리
GVHD 예방을 위해, 화합물6(WHI-P131), 4-(3'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(WHI-P132, 화합물7), 사이클로스포린(SandimmuneRSandoz Pharmaceuticals Ltd, Basle, Switzerland), 메틸프레드니솔론(Depo-MedrolRPharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan), 메토트랙사이트(Immunex Corporation, Seattle, Washington) 및 비히클 대조군의 매일 복강내(i.p.) 주사로 BMT 전날(-1) 또는 BMT의 날(0일)부터 마우스에 투여하였다. BMT의 0일부터, 화합물6을 25mg/kg/일 및 60mg/kg/일(3회 투여로 나누어서)의 투여량으로, 화합물7은 50mg/kg/일(3회 투여로 나누어서)로 투여하였고, 사이클로스포린, 메틸프레드니솔론 및 메토트랙사이트는 소아 암 그룹(CCG) 과정에 따른 투여량으로 각각, 3mg/kg/일(2회 투여로 나누어서), 10mg/kg/일(2회 투여량으로 나누어서) 및 10mg/㎡/일(1일 1회)로 투여하였다. 사이클로스포린 및 메틸프레드니솔론의 처리는 BMT 전날(-1)부터 시작하여 실험의 종결시까지 계속되는 반면, 메토트랙사이트는 BMT 후 1, 3, 6 및 11일에 투여하였다.
통계 분석
증식 분석, MLR 및 세포소멸 데이터에서 얻어진 데이터의 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 실시되는 반면, 생존 데이터는 만텔-콕스 테스트를 사용하여 생명표 방법에 의해 분석하였다.
상기 분석으로부터의 데이터는 도21-26에 나타내었다.
도21은 WHI-P131에 의한 MLR의 투여-종속 억제(A), PHA-유도(B) 및 ConA-유도(C) 증식 유도를 도시한다. WHI-P131은 5일 배양(MLR) 또는 3일 배양기(PHA 및 ConA 분석) 동안 0.1, 1, 10 및 50㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 증식은 WST-1 컬러리메트릭 분석에 의해 측정하였다. 결과는 3-7회의 독립 실험의 평균 O.D.±SEM으로 나타내었다. 그룹간의 통계적 차이는 스튜던트 t-테스트에 의해 분석하였다.
자가면역 질환(예컨대, 자가면역 유도 당료병)을 예방 또는 치료하는 화합물의 효능은 종래 공지된 분석 방법 또는 실시예7에 기술된 것과 유사한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
실시예7: 자가면역 질환
C57BL 및 NOD 마우스를 타코닉(Taconic Germantown, NY)으로부터 구매하고, 휴우즈 인스티튜트의 동물 보호 시설의 병원체 없는 조건하에서 사육하였다. 붕괴된 Jak3 유전자에 상동성인 Jak3-/-(C57BL/6×129/Sv) 마우스는 Dr. J. N. Ihle로부터 얻었다(St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN). 상동성 Jak3-/-마우스를 C57BL/6 마우스와 교배시키고, F1 세대의 자손을 C57BL/6 마우스와 역교배하였다. C57BL/6의 역교배 3세대 후, 그 자손을 이종교배하여 Jak3-/-및 야생형(WT)Jak3+/+마우스를 얻었고, 이것이 우리의 실험에 사용되었다.
당료병 LDSTZ 모델의 유도
자가면역 실험적 당료병(LDSTZ)의 유도를 위해, 5일 연속으로 STZ(Sigma, St. Louis, MO)의 낮은 투여량(40mg/kg)을 매일 C57BL/6 수컷 마우스 또는 JAK-3 결핍 및 야생형 마우스(8-10주)에 복강내 주사하였다. STZ를 얼음에서 시트레이트 완충액 pH4.0에 용해하고, 10분 이내에 주사하였다. 원 터치 프로파일 당료병 트래킹 시스템(Lifescan, Milpitas, Ca)에 의해 STZ 투여 후, 2주(7일)부터 혈중 글루코오스를 시험하여 당료병 발달에 대해 조사하였다. 세 번의 연속 시험에서220mg/dl 이상의 당혈증을 갖는 마우스를 당료병 발생시기로 고려되는 만성 당혈증의 제1 검출로 하여 당료병으로 간주하였다. 실험 개시일로부터 25일까지, C57BL/6 수컷 마우스군을 2회의 동일한 투여량으로 나누어서 WHI-P131-100mg/kg/일, i.p.으로 처리하였다. WHI-P131을 PBS 중의 10% DMSO에 용해하고, 대조군 마우스를 상기 기술된 동일한 조건을 사용하여 PBS 중의 10% DMSO로 처리하였다.
WHI-P131로 NOD 암컷의 처리 및 당료병 발달의 평가
NOD 암컷을 5 또는 10주된 것으로부터 WHI-P131의 다른 투여량을 매일 복강내 주사로 처리하였다. 대조군 마우스는 PBS 중의 10% DMSO로 처리하였다. 마우스를 상기 기술된 바와 같이 원 터치 프로파일 당료병 트래킹 시스템에 의해 10주부터 혈중 글루코오스를 측정하여 당료병 발달에 대해 조사하였다.
복강내 글루코오스 내성 시험(IPGTT)
복강내 글루코오스 내성 시험(IPGTT)을 실험 말기에 비-당료병성 WHI-P131 처리 및 비히클-처리 대조군 NOD 암컷의 군(25주된 NOD 마우스)에서 실시하였다. 마우스를 10시간 동안 금식시키고, 글루코오스 용액(1.5g/kg 체중)을 복강내 주사하였다. 글루코오스 주사 전 및 후에, 혈액 샘플을 취하여 혈중 글루코오스 수치를 0, 30, 60 및 120분에 측정하였다(상기한 바와 같이).
조직학
대조군 및 WHI-P131 처리된 비당료병성 NOD 암컷(25주된)을 실험의 말기에 죽이고, 섬(islet)의 특징적인 조직병리학적 병변(인슐린염(insulitis))을 마우스 당 적어도 25개의 섬을 스코링하여 각 마우스에서 평가하였다. 요약하면, 췌장을제거, 10% 포르말린에서 고정, 파란핀 블록에 끼워 넣고, 잘라내고, 광학현미경성 조사를 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 세 가지의 겹치지 않는 췌장 수치로부터의 모든 섬들을 하기와 같은 인슐린염 스코어로 지정하였다. 0-병변이 보이지 않음, 1-섬 투과 없는 주위-인슐린염, 2-25% 이하의 투과된 섬, 3->25%이상의 투과된 섬, 4-말기
NOD-scid/scid 암컷에 당료병성 스플레노사이트의 양자이식(adoptive transfer) 및 당료병 발달의 평가.
8-10주된 당료병성 NOD 암컷으로부터의 지라 백혈구의 단일 세포 현탁액을 Nitex 110 메쉬를 통하여 준비하고, 적혈구를 10×Gey's에 용해하였다. 1×107스프레노사이트의 일정 부분을 4주된 NOD/Lt-scid/scid 암컷(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)의 정맥내 양자이식하였다. NOD-scid 마우스의 WHI-P131 처리(50mg/kg) 또는 대조군 처리(PBS 중의 10% DMSO)를 동시에 개시하였다. 마우스를 Chemstrip uGK 스트립스(Boehringer Mannhein, Indianapolis, IN)에 의한 이식 후 2주부터 매주 요로 글루코오스 시험으로 당료병 발달에 대해 조사하였다. 연속하는 주 시험에서 500mg/dl(+++) 이상의 당료를 갖는 마우스를 IDDM 발생의 날로 하는 만성 당료의 제1 검출로 당료병으로 간주하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 언페어드(unpaired) 스튜던트 t-테스트(IPGTT 및 취도염 데이터) 및 ANOVA 테스트(실험군 간의 혈당 수치의 차이)를 사용하여 실시하였다. WHI-P131 처리 및 대조군 NOD 및 LDSTZ 처리 마우스에서 또는 양자이식된 scid 마우스에서 IDDM 발생 연구에서 실험적 차이는 만텔-콕스 시험을 사용하여 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생명표에 의해 평가되었다. p 값 <0.05로 통계적으로 유의하였다.
실시예7에 대한 결과
LDSTZ 당료병의 발달은 JAK3-결핍 마우스에서 억제되었다.
도27은 낮은 투여량 STZ으로 처리된 JAK3-결핍 및 야생형 마우스에서 누적 당료병 발생(A) 및 혈중 글루코오스 수치(B)를 도시한다. 야생형 마우스의 13/13(100%)는 첫 번째 STZ 주사 후 14일 까지 고혈당증을 발달시키고, JAK3-결핍 마우스의 단지 1/12(8.3%)는 25일의 전체 실험 기간에서 당료병이 되었다(p<0.0001)(도27). 야생형 마우스는 7일부터 혈중 글루코오스의 증가를 나타내고, 제1 STZ 주사후 9일에 고혈당 수치(>220mg/dl)에 도달하였다. 반대로, JAK3-결핍 마우스는 총 실험 기간 동안 정상혈당성을 유지하였다(ANOVA에 의해 야생형 혈당 수치와 비교하여 p<0.0001)(도28).
JAK3 키나아제 억제제 WHI-P131에 의한 질환 LDSTZ 모델에서 당료병 발달의 억제
매일 WHI-P131 100mg/kg(2회 투여량)의 C57BL/6 복강내 처리를 STZ 주사의 첫 날부터 개시하고, LDSTZ 당료병의 발달을 억제하였다(도29). STZ 첫 주사 후, 대조군 마우스의 20/38(52.6%)이 7일째에 당료병을 발달시키고, 9일째에 32/38(84.2%) 및 11일째에 36/38(97.4%)이고, WHI-P131 처리 마우스의 단지 4/20(20%)만이 7일째, 9일째에 10/20(50%) 및 11일째에 13/20(65%)로 당료병이 되었다(도29). 도30은 WHI-P131 처리 마우스가 대조군 마우스와 비교하여 전체 실험기간 동안 혈중 글루코오스 수치가 상당히 낮음(p=0.027)을 도시한다.
WHI-P131 처리에 의한 NOD 암컷에서 IDDM 발달의 예방
NOD 암컷에서 당료병 빈도는 매일 a) 5-25주로부터 WHI-P131의 20 및 50mg/kg와 b) 5-8, 5-25 및 10-25주로부터 WHI-P131의 100mg/kg를 처리하여 조사하였다. DMSO 처리 마우스(대조군)에서 13주에 당료병이 발달하는 반면, WHI-P131(50mg/kg) 처리 마우스는 22주에 당료병을 발달시키기 시작하였다(도27). 25주에, 대조군 마우스의 22/37(60%)가 당료병이 되고, WHI-P131 50mg/kg 처리된 NOD 암컷의 단지 2/11(18%)만이 당료병을 발달시켰다(p=0.017). WHI-P131 20mg/kg의 매일 처리는 18주까지 발달된 당료병 처리 마우스의 5/9(56%) 당료병 발달에 보호적 효과를 나타내지 않았다(도27). 우리는 생후 5내지 9주까지 WHI-P131 100mg/kg의 단기간 처리가 보호 효과를 지속할 수 있는 지를 질문하였다. 도28은 그러한 처리가 당료병 발달을 보호하지 못하는 결과를 나타내고, NOD 암컷의 10/12(83%)가 25주에 당료병을 발달시켜 당료병이 되었다. 그리고, WHI-P131 100mg/kg으로 치료(10주)의 후기 시작이 당료병의 예방에 효과적일 수 있는지가 연구되었다. 도28은 10주에 시작한 WHI-P131 100mg/kg의 처리가 더 이른 시기에 처리한 것 만큼 효과적이고, 5주에서 당료병 발생은 제1 처리하에서 25주에 9%(1/11)(대조군에 비교하여, p=0.007) 및 후자의 처리 하에서 18%(4/22)(대조군에 비교하여, p=0.025)에 도달하였다.
20(n=6) 또는 15주(n=7) 동안 DMSO(n=3) 또는 WHI-P131 100mg/kg 처리한 정상혈당의 NOD 암컷 마우스군을 실험 종결시(25주) 금식시키고, IPGTT를 실시하였다. 비당료병성 비처리 C57BL/6 마우스(n=5)를 IPGTT 시험에서 대조군으로 사용하였다. 그 결과 혈중 글루코오스 수치는 글루코오스 처리 후 120분 동안 C57BL/6 마우스 및 WHI-P131 처리 NOD 마우스군에서 유사하였다. 반대로, 정상혈당의 DMSO-처리 마우스는 WHI-P131 처리군의 이른 시기 보다 각각 관찰된 시기에 더 높은 혈중 글루코오스 수치를 나타내었다.
또한, IPGTT에서 분석된 마우스로부터 얻어진 췌장의 인슐린염 수준의 조직학적 조사가 실시되었다. 대조군(n=3)의 인슐린염 스코어는 1.43±0.15이고, 반면, 5-25주까지 WHI-P131 처리된 NOD 암컷의 인슐린염 스코어는 0.86±0.12로 상당히 낮았다(p=0.026). 그러나, 10-25주까지 WHI-P131 처리된 NOD 암컷의 인슐린염 스코어는 대조군과 다르지 않았다(1.42±0.24).
WHI-P131 처리에 의한 양자이식된 NOD scid/scid 암컷에서 당료병 발달의 예방.
WHI-P131이 타입Ⅰ 당료병의 자연 발생의 전당료병기 동안 NOD 암컷에서 당료병 발달을 억제하는 활성을 나타내기 때문에, 계속해서, 우리는 WHI-P131이 이미 당료병인 마우스로부터 NOD-scid 마우스에 질환을 옮기는데 있어서, 억제 효능을 발휘할 수 있는 지를 확인하기를 원했다. NOD-scid 암컷의 두 군을 당료병 NOD 암컷으로부터 1×107으로 양자이식되었고, 한 군을 이식한 날부터 WHI-P131 50mg/kg(n=12)으로 처리하는 반면, 다른 하나는 10% DMSO(n=11)을 처리하였다(도34). 대조군 NOD-scid의 6/11(55%)은 4주에 당료병이 되었고, 양자이식 5주 후에 8/11(73%)가 당료병이 되었으며, WHI-P131 처리 NOD scid 암컷의 단지 1/12(8%)만이 동일한 시기에 당료병이 되었다(도4). 따라서, 양자이식 후 당료병 발달은 WHI-P131 처리에 의해 상당히 억제되었다(p<0.002).
동종이식 생존을 연장하는 화합물의 효능이 종래 공지된 분석법 또는 실시예8에 기술된 것과 유사한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
실시예8: 섬 기능의 손상 없이 동종이식 생존의 연장
8-12주된 수컷 C57BL/6 마우스(H-2b)를 수용체로서, BALB/c(H-2d) 수컷을 동너로 사용하였다. 두 마우스는 모두 타코닉으로부터 구매하였고, 휴우즈 인스티튜트의 동물 보호 시설의 병원체 없는 조건하에서 사육하였다. 붕괴된 Jak3 유전자에 대해 상동성인 Jak3-/-(C57BL/6×129/Sv, H-2b) 마우스를 Dr. J. N. Ihle(St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN)으로부터 얻었다. 상동 Jak3-/-마우스를 C57BL/6 마우스와 교배시키고, F1의 자손을 C57BL/6과 역교배하였다. 역교배 3세대 후, 그 자손을 이종교배하여 Jak3-/-및 야생형 Jak3+/+을 얻었고, 야생형 수컷을 BALB/c 섬의 수용체로서 사용하였다.
혼합 림프구 반응(MLR)
MLR 분석을 위해, 응답 동물 세포(10주된 C57BL6 수컷으로부터 얻은 스플레노사이트)를 10% 소태아 혈청(Laboratories Inc., Logan, UT)의 첨가와 RPMI(Life Technologies, GrandIsland, NY) 4×105/100㎕의 농도로 96웰 플레이트에 3중으로플레이트 하였다. 마이토마이신 처리 자극제(10-12주된 BALB/c 수컷)를 8×104/50㎕의 농도로 첨가하였다. WHI-P131을 최종 부피 200㎕이 되도록 첨가하였고, 세포를 5일 동안, 37℃로 인큐베이터에서 습한 공기의 5% CO2로 배양하였다. 세포 증식의 정량화를 위한 컬러리메트릭 분석은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 디하이드로게나아제에 의한 테트라졸리움 염 WST-1의 분열을 기초로 하여 하기 지시자의 지시에 따라 실시하였다. 흡광도는 멀티스캔 MS 마이크로플레이트 스캐너에서 450/690으로 측정하였다. 세포 증식의 값은 PHA 또는 Con A 자극 세포 증식의 감소하는 O. D. 값과 비자극된 세포의 O.D. 값(음성 대조군)에 의해 얻어졌다.
세포소멸 검출
C57BL6 스플레노사이트(3×106/ml)을 상기 기술된 조건 하에서 RPMI 1640의 500㎕ 중에 24시간 동안 24웰 플레이트에서 배양하였다. WHI-P131을 0.1, 1, 10 및 100㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 세포소멸성 세포 사멸은 인 시츄 세포 검출 키트, 플로오르세인(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, TUNEL에 의해 검출하였다. 배양기 후, 세포를 하기 제조자의 지시에 따라 세척, 고정, 투과, 염색하고, 세포소멸을 FACS Calibur를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다(Becton Dickinson, San Jose, Ca).
플로우 사이토메트릭(FACS) 분석
스플레노사이트의 단일 세포 현탁액을 WHI-P131(130mg/kg/일) 또는 비히클 처리 C57BL 마우스로부터 준비하고, 적혈구 세포를 용해 완충액으로 용해하고, 스프레노사이트(1×106)를 하기의 항-마우스 모노클로날 항체의 1:100 희석으로 염색하였다. (Ab): 항-CD3-FITC Ab(클론 145-2C11), 항-CD4-FITC Ab(클론 GK1.5), 항-CD8-PE Ab(클론 53-6.7) 및 항-CD19-PE Ab(클론 ID3). 모든 Abs는 Pharmingen, San Diego, Ca. 으로부터 구매하였다. 염색된 스플레노사이트를 상기 기술된 바와 같이, FACS Calibur로 분석하였다.
섬 분리
랑게르한스 섬은 이전에 기술된 바와 같이, 콜라게나아제 P(3mg/ml)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 및 디옥시리보뉴클리아제(0.1mg/ml)(Sigma, St. Louis, MO) 3-4ml의 담관 주입에 의해 BALB/c 수컷으로부터 분리하였다(Cetkovic-Cvrlje M., et al., 1997, Diabetes, 46:1975-1982). 섬은 외분비 조직, 혈관, 림프걸 및 관이 없어지기 전에 해부 현미경 하에서 3-4번 주의해서 골라서 이식을 위해 처리하였다.
동종 섬 이식 및 약제 처리
400개의 섬을 해밀톤 시린지(Hamilton syringe)에 놓고, 각 당료병 수용체 마우스의 왼쪽 신장 주머니 아래 이식하였다. 수용체는 이식 1주전에 스트랩토조토신(200mg/kg, Sigma, St. Louis, MO)을 1회 투여하여 당료병이 되었다. 혈중 글루코오스 수치는 원 터치 프로파일 글루코오스 감시 시스템(Lifescan, Milpitas, Ca)으로 측정하였다. 혈당량 350mg/dl의 당료병 마우스가 이식 수용체로서 사용되었다.
동종이식 기능은 연속적인 혈중 글루코오스 측정에 의해 관찰되었다. 제1차이식 기능은 이식 3일 후 200mg/dl 하의 혈중 글루코오스로 한정되고, 두 번의 연속 측정에서 250mg/dl 이상의 혈중 글루코오스에서 린스로 한정되었다. 수용체는 이식한 날부터 거부의 날까지 높은 투여량의 사이클로스포린(20mg/kg)(Sigma, St. Louis, MO), WHI-P131(50 및 75mg/kg, 3번으로 나누어서), WHI-P132(50mg/kg, 3번으로 나누어서) 또는 비히클 대조군만을 매일 처리하였다. 모두 복강내 주사하였다.
동유전자형의 섬 이식 수용체에서 복강내 글루코오스 내성 시험(IPGTT)
동유전자형의 섬 이식(400 C57BL/6 섬)으로 이식하고, 2달 동안 WHI-P131 또는 비히클 대조군으로 처리한 C57BL/6 수용체에서 IPGTT를 실시하였다. 마우스를 10시간 동안 금식시키고, 글루코오스 용액(1.5g/kg 체중)을 복강내 주사하였다. 글루코오스 주사 전 및 후에 혈액 샘플을 취하고, 혈중 글루코오스 수치를 0, 30, 60 및 120분에 측정하였다.
조직병리학적 연구
섬 동종이식의 비히클 대조군(n=3) 및 WHI-P131 처리 C57BL/6 수용체(n=5)를 이식 후 14일에 죽이고, Jak3-/-수용체(n=6)를 이식 후 100일에 죽이고, 동유전자형의 섬-비히클 대조군-(n=4) 및 WHI-P131 처리(n=5)의 C57BL/6 수용체를 이식 후 180일에 죽였다. 이식을 갖는 신장을 제거, 10% 포르말린에 고정 및 파라핀에 삽입하였다. 이식의 연속 분획을 잘라서, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 인슐린 염색을 위해, 분획을 폴리클로날 기니아 피그(guinea pig) 항-인슐린 항체 (GpxInsulin, Dako, Carpinteria, Ca)의 1:100 희석 및 호오스 래디쉬 페록시다제(horse radish peroxidase)에 결합된 2차 항체(Guinea Pig Immunoglobulins HRP, Dako, Carpinteria, Ca)의 1:100 희석을 사용하는 면역페록시다제 방법으로 염색하였다. 분획을 헤마톡실린으로 간단히 대조염색하고, 조사를 위해 광학 현미경에 장착하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 언페어드 스튜던트 t-테스트(MLR 및 FACS 데이터)를 사용하여 실시하였다. 약제 처리 및 대조군 사이의 동종 이식 거부의 실험적 차이는 만텔-콕스 테스트를 사용하는 카플란-마이어 생명표 분석에 의해 평가되었다. p 값 < 0.05의 유의적 차이가 있었다.
실시예8에 대한 결과
Jak3 -/- 마우스는 섬 동종이식을 거부하지 않는다.
STZ에 의해 당료병을 갖게된 JAK3-결핍 수컷(n=6) 및 그들의 야생형 리터메이트(n=7)를 신장 캡슐 하에서 BALB/c 섬으로 이식하였고, 혈중 글루코오스 수치가 이식 후 100일 동안 관찰되었다. 야생형 대조군의 섬 동종이식이 12.9±1.1일의 MST로 거부되고, Jak3-/-의 모든 섬 동종이식 수용체는 이식 후 100일 동안 살았다(도35). 이식에 대한 병리학적 분석은 완전히 보존된 섬 형태를 갖는 이식 영역의 약한 모노뉴클리어(mononuclear) 침투에 어떤 침투도 보이지 않았다.
WHI-P131 유도 MLR 반응의 억제
0.1, 1, 10 및 50㎍ml의 농도로 첨가된 WHI-P131은 투여량-종속 방식으로 MLR에서 알로리엑티브(alloreactive) 스플레노사이트의 증식을 억제하였다(도36). WHI-P131의 0.1g/ml의 농도가 MLR 반응의 통계적으로 유의한 감소를 유도할 때(p=0.0095), 반응의 완전한 제거(얻어진 O.D. 값은 비자극 대조군의 O.D. 수분 이하이었다.)가 WHI-P131 1㎍/ml의 첨가로 얻어졌다(도36). 다음에, 우리는 WHI-P131 유도 림프구 사멸이 억제된 MLR 반응에 대한 원인인지를 조사하였다. 그러므로, 세포소멸성 스플레노사이트(TUNEL-양성)은 WHI-P131의 다른 농도의 첨가와 더불어 20시간의 배양기 후 측정하였다. 도37은 WHI-P131 0.1 및 1㎍/ml의 첨가로 배양된 스플레노사이트의 세포소멸성 세포 사멸 세포는 대조군의 세포와 다르지 않은 반면, 10 및 100㎍/ml의 첨가는 관찰된 배양기 동안 대조군 세포소멸과 비교하여 세포소멸성 세포 소멸을 증가시켰다(각각, p=0.008 및 p<0.0001). 그러므로, 약제의 낮은 농도(0.1 및 1㎍/ml)로 얻어진 MLR 억제에 대한 WHI-P131의 영향은 세포 소멸의 유도에 의해 야기되지 않는 것처럼 보였다.
수용체의 WHI-P131 처리가 섬 동종이식 생존을 연장하였다.
대조군 C57BL/6 마우스(n=39)는 14.1±0.9일의 평균 생존 시간에 BALB/c 섬 동종이식을 거부하였다. CsA 높은 투여량 20mg/kg으로 수용체(n=10)의 매일 처리는 동종이식 생존을 상당히 증가시켰다(p=0.0005)(MST-27.9±4.6일)(도38).
WHI-P131의 50mg/kg(n=14) 또는 75mg/kg(n=14)의 처리는 대조군과 비교하여동종이식의 생존(각각, MST=24.7±3.4 및 25.3±3.8)에서 CsA 만큼 효과적이었다(각각, p=0.0002 및 0.001)(도38).
대조군(n=3)으로 처리된 정상혈당의 수용체로부터 이식 14일 후에 하베스트된 섬 동종이식의 조직 검사는 인슐린에 대한 면역염색으로 명확히 보여지는 림프구 침습 및 거대한 섬 파괴를 나타내었다. 이 결과는 WHI-P131 50mg/kg(n=5)으로 처리된 수용체들로부터 동종이식을 갖는 스트라킹 대조에 있고, 여기서, 광범위한 섬의 파괴 없이 림프 침투가 있었다. 동시에 하베스트된 고혈당 비히클-처리 동종이식(n=4)은 남은 인슐린-생산 세포 없이 림프구에 의해 완전히 침습된다.
다음의 실험은 생체내 스플레노사이트 집단에 대한 WHI-P131 처리의 효과를 연구하는 것을 목적으로 실시되었다. C57BL/6 수컷을 10일 동안 WHI-P131 130mg/kg(n=7) 및 비히클 대조군(n=5)으로 처리하였다. 스플레노사이트의 총수는 비히클 처리 대조군에서 154±8.5×106이 반면, WHI-P131 처리된 마우스에서는 119±9.4×106으로 감소하였다(p=0.025). WHI-P131 및 비히클 처리 마우스 사이에는 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T-세포 및 CD19+ B 세포의 비율에 차이가 없었다(데이터 생략). 그러나, 도6은 WHI-P131 처리된 및 대조군 사이에서 연구된 세포 집단에서의 수에 약간의 차이가 있음이 확인되었다. 이렇게 해서, CD3+ 스프레노사이트의 수는 대조군에서 46.9±2.6×106과 비교하여 WHI-P131 처리 마우스에서 37.7±3.2×106으로 감소하였다(그러나, 통계학적으로 유의하지 않았다. p=0.0617). CD4+ T-세포 16.8±1.2×106(p=0.0416) 및 B 세포 57.1±5.3×106(p=0.0267)로, 대조군에서 각각 20.5±0.6×106및 78.2±6.1×106과 비교하여 WHI-P131 처리된 마우스에서 감소하였다(도39).
이식된 동유전자형의 섬의 기능이 WHI-P131의 장기간 처리 후 유지되었다.
이 연구는 동유전자형의 섬 이식 기능에 대한 WHI-P131 50mg/kg의 장기간(180일) 처리의 영향을 시험하기 위하여 실시되었다. 도40에 도시된 바와 같이, 비-금식 혈중 글루코오스 수준은 비히클 대조군(n=4) 및 WHI-P131 처리(n=5) 동유전자형의 수용체 사이의 이식 후 180일의 실험 기간 동안 다르지 않았다. IPGTT가 처리 70일에 실시되었다. 이때의 대조군 및 P131 처리 수용체의 비금식 혈중 글루코오스는 각각 102.0±6.7 및 124.6±10.8mg/dl이었다. IPGTT 시험은 비-이식된 섬 기능, 비처리 C57BL/6 수컷, 이식된 비히클 처리 수용체(대조군) 및 이식된 WHI-P131 처리 수용체 사이에 차이가 없음을 나타내었다(도41). 다른 IPGTT 시험이 실험 말기(이식 후 180일)에 실시되었다. 이때의 비금식 혈중 글루코오스 수치는 비히클 대조군에서 120.9±12.5 및 WHI-P131 처리 수용체에서 115.2±9.2mg/dl이었다. IPGTT 시험은 WHI-P131 처리 수용체의 섬 기능이 대조군 수용체 또는 비이식 C57BL/6 마우스의 섬 기능과 다르지 않음을 나타내었다.
비히클 대조군 및 WHI-P131 처리 동유전자형의 섬 이식편의 광학현미경성 평가로부터의 대표적 예는 도8에 도시되어 있다. 비히클 대조군 및 WHI-P131 처리 이식의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 이들 사이에 의미있는 형태학적 변화가 없음을 나타내었다. 면역조직화학적 분석은 WHI-P131 처리 이식에서 인슐린 발현이 비히클대조군 처리 수용체의 이식의 것과 비교됨을 확인하였다.
모든 문헌, 특허 및 특허 명세서는 각각 개별적으로 여기서 참고문헌으로 포함된다. 본 발명은 다양한 특정 및 바람직한 실시형태와 기술로 설명되어 있다. 그러나, 본 발명의 관점을 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변화 및 수정이 이루어질 수 있다.

Claims (42)

  1. 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린을 제외한 하기식Ⅰ의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염.
    (화학식Ⅰ)
    {식중, X는 HN, R11N, S, O, CH2또는 R11CH(여기서, R11은 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알카노일이다.)
    R1-R8은 각각 독립적으로, 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로(여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기는 그들이 부착된 페닐환과 함께 부가적인 결합환, 예컨대, 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성할 수 있고, 또한, 여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기에 의해 형성된 환은 부가적으로, 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로로 치환될 수 있다.)이고,
    R9및 R10은 각각 독립적으로, 수소, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로 또는 (C1-C4)알카노일이거나, R9및 R10은 모두 메틸렌디옥시이다.}
  2. 제1항에 있어서, 상기 X는 R11N인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 X는 HN인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R1, R2, R4, R5, R6, R7및 R10은 각각 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 R3는 (C1-C4)알콕시, 히드록시, 니트로, 할로, 트리플루오로메틸 또는 NR12R13(여기서, R12및 R13은 각각 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C8)시클로알킬 또는 헤테로사이클이다.)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 R3는 히드록시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 R2또는 R3는 히드록시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 R2또는 R3는 히드록시이고, R1-R5중 어느 하나는 할로인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 R2또는 R3는 히드록시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 R8은 (C1-C4)알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 R9는 (C1-C4)알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 4-(3'히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 4-(3'-브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이들 각각에 대한 약제학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 화학식Ⅰ의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물.
    (화학식Ⅰ)
    {식중, X는 HN, R11N, S, O, CH2또는 R11CH(여기서, R11은 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알카노일이다.)
    R1-R8은 각각 독립적으로, 수소, 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로(여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기는 그들이 부착된 페닐환과 함께 부가적인 결합환, 예컨대, 나프틸 또는 테트라히드로나프틸환을 형성할 수 있고, 또한, 여기서, R1-R5중 두 개의 인접한 기에 의해 형성된 환은 부가적으로, 1,2,3 또는 4 히드록시, 머캅토, 아미노, 니트로, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오 또는 할로로 치환될 수 있다.)이고,
    R9및 R10은 각각 독립적으로, 수소, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로 또는 (C1-C4)알카노일이거나, R9및 R10은 모두 메틸렌디옥시이다.}
  14. 제13항에 있어서, 상기 R2또는 R3는 히드록시인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 R2또는 R3는 히드록시이고, R1-R5중 어느 하나는 할로인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 화학식Ⅰ의 화합물은 4-(3'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 4-(3'-브로모-4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이들 각각의 약제학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 백혈병 또는 림프종 치료에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  19. 기관 이식 거부의 치료 또는 예방에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  20. 포유류에서 UV B 방사 유도 염증 반응의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  21. 포유류에서 프로스타글란딘 E2방출의 억제에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  22. 포유류에서 UVB-유도 피부 부종 또는 혈관 투과도 변화의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  23. 포유류 피부의 상피 세포 또는 변이 빈도에 대한 UVB 방사-유도 손상의 예방 또는 감소에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  24. UVB 선의 종양발생 효과로부터 포유류를 보호하는데 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  25. 포유류에서 T-세포 활성을 억제하는데 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  26. 자가면역질환의 치료에 유용한 약제를 조제하는 JAK-3 억제제의 용도.
  27. 골수 이식 후 이식편대숙주병의 예방 또는 치료에 유용한 약제를 조제하는JAK-3 억제제의 용도.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JAK-3 억제제는 제1항 내지 12항 중 어느 한 항의 화합물인 것을 특징으로 하는 JAK-3 억제제의 용도.
  29. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JAK-3 억제제는 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 JAK-3 억제제의 용도.
  30. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 백혈병 또는 림프종의 치료 요법.
  31. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 이식 거부의 치료 또는 예방 요법.
  32. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 자외선 B 방사-유도 염증 반응의 예방 또는 감소 요법.
  33. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 프로스타글란딘 E2방출의 억제 요법.
  34. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 UVB-유도 피부 부종 또는 혈관 투과도 변화의 예방 또는 감소 요법.
  35. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류 피부에서 상피 세포 또는 변이 빈도에 대한 자외선 B 방사 유도 손상의 예방 또는 감소 요법.
  36. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 UVB 선의 종양발생 효과로부터 포유류의 보호 요법.
  37. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 T-세포 활성의 억제 요법.
  38. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 자가면역질환의 치료 또는 예방 요법.
  39. JAK-3 억제제의 유효량을 그것의 필요에 따라 포유류에 투여하는 것을 특징으로 하는 골수 이식 후 이식편대숙주병의 치료 또는 예방 요법.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물인 것을 특징으로 하는 요법.
  41. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JAK-3 억제제는 4-(4'-히드록실-페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 요법.
  42. 의학적 치료에서의 용도를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물.
KR1020017002230A 1998-08-21 1999-08-20 퀴나졸린 유도체 KR20010089171A (ko)

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