DE69729798T2

DE69729798T2 - Therapeutische behandlung von vegf-bedingten augenkrankheiten

Info

Publication number: DE69729798T2
Application number: DE69729798T
Authority: DE
Inventors: P. Lloyd AIELLO; R. Michael JIROUSEK; L. George KING; Louis Vignati; Kirk Douglas WAYS
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: NO985067D0; PT918519E; NZ538109A; NO322209B1; EP0918519B1; AU724923B2; EP0918519A1; JP2000514402A; CN1158073C; HK1020017A1; DE69729798D1; KR100364487B1; AU2936197A; ES2224249T3; PL330463A1; NO985067L; BR9710705A; HU226378B1; EA001752B1; ATE270548T1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Hemmung des Endothelzellwachstums und der Kapillarpermeabilität, die mit dem vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) assoziiert ist, beispielsweise das durch VEGF induzierte gesteigerte Zellwachstum und die erhöhte Permeabilität, mittels eines Inhibitors des β-Isoenzyms der Proteinkinase C (PKC). Diese durch VEGF induzierten Bedingungen sind eng mit einer Vielzahl an okularen, vaskulären Störungen assoziiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Inhibitors des β-Isoenzyms der Proteinkinase C (PKC) zur Behandlung von okularen, vaskulären Störungen, einschließlich Makuladegeneration, Makulaödem, vaskuläre Retinopathie, Retinavenenverschluss, Irisneovaskularisierung, Histoplasmose und ischämische Retinaerkrankungen.
2. Beschreibung des Stands der Technik
VPF/VEGF ist ein glycosyliertes, multifunktionelles Cytokin. Die Überexpression von VPF/VEGF ist mit einer Vielzahl an okularen, vaskulären Störungen assoziiert.
VPF/VEGF induziert die Endothelzellproliferation, die übermäßige Permeabilität über die Aktivierung des vesikulär-vakuolär vermittelten Transports in der Organelle, die Migration und Aktinreorganisation mit Formänderungen und Wellenbildung. Es wird die Endothelzellgenexpression verändert, was die gesteigerte Bildung von Gewebefaktor und mehreren Proteasen induziert, einschließlich der interstitiellen Collagenase und sowohl der Urokinase-ähnlichen und als auch der Gewebsplasminogenaktivatoren. Die Mehrzahl derselben Gene wird durch die Phorbolmyristatacetat (PMA) stimulierte Aktivierung der PKC induziert.
Der vaskuläre Endothelzellwachstumsfaktor (VEGF) dürfte zusammen sowohl mit dem Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) und dem transformierenden Wachstumsfaktor (TGFβ) eine Hauptrolle bei der Vermittlung der aktiven, intraokularen Neovaskularisierung bei Patienten mit ischämischen Retinaerkrankungen spielen (Aiello et al., New England Jour. Medicine, 331 (22): 1480–1487 (1994), Amin et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35, 3178–3188 (1994)).
Eine der okularen, vaskulären Störungen, die mit einer erhöhten VEGF Expression assoziiert ist, ist die Makuladegeneration. Die altersbedingte Makuladegeneration ist die Hauptursache für Erblindung im Alter. Es wird geschätzt, dass die Makuladegeneration mehr als 16% der Leute mit 85 und älter und 6 der Leute zwischen einem Alter von 65 und 74 betrifft. Mehr als 20% der Patienten über einem Alter von 75 haben eine Makuladegeneration. Die Krankheit tritt bei Frauen häufiger auf (H. M. Liebowitz, D. E. Krueer, L. E. Maunder et al., "The Framingham Eye Study: VI Macular Degeneration", Surv. Ophthalmol. 24 (Supplement 10: 428–457, 1980), Klein et al., "Prevalence of Age Related Maculopathy: The Beaver Dam Study", Ophthalmology, 99 (6): 933–943, 1992). Die Makuladegeneration kann in einen trockenen oder feuchten Typ unterteilt werden, wobei der trockene Typ zehnfach häufiger ist, aber im allgemeinen in seinen klinischen Ausprägungen weniger schwer ist. Die ernstere feuchte oder exsudative Makuladegeneration ist mit einem anormalen Wachstum von choroidalen Gefäßen (choroidale Neovaskularisierung) in das subretinale Pigmentepithel oder den subretinalen Raum assoziiert und führt oft zu schweren Sehstörungen.
Die Makuladegeneration weist als anfängliche pathologische Läsion das Auftreten von Drusen auf, die eine anormale Gewebeablagerung in der Retinapigmentepithelschicht (RPE) darstellen und dies dürfte nach der vaskulären Insuffizienz erfolgen. Dann wachsen neue Blutgefäße durch die Bruch's Membran, die zwischen der RPE und den Choriokapillaren liegt, um in die Retina einzudringen. Diese Retinainvasion verursacht die Zerstörung von Lichtrezeptoren und kann zur Hämorrhagie führen, die die Sehfähigkeit verringert.
Eine der häufigsten Formen der Behandlung für die Makuladegeneration ist die Lasertherapie. Die Lasertherapie wird verwendet, um Bereiche der Neovaskularisierung zu behandeln, die sich nicht in den zentralen Makulabereich (Fovea) erstrecken. Jedoch ist das Wiederauftreten der Erkrankung nach einer Lasertherapie normal. (MPS Group, Arch. Ophthalmol., Band 109, Seiten 1232–1241 (1991)). Darüberhinaus kann die Lasertherapie zu zurückbleibenden Scotomen führen und ist daher keine optimale Behandlung der Neovaskularisierung im zentralen Makulabereich. Nur eine begrenzte Anzahl an Patienten erfüllen die Eignungskriterien für die Form der Behandlung im Prinzip durch die gewöhnlich beobachtete schlecht definierte oder okkulte Art der choroidalen Neovaskularisierung (Freund et al., Amer. Jour. Ophthalmol., 115: 786–791 (1993)). Interferon wurde auch als therapeutisches Mittel aufgrund der bekannten Aktivität von Wachstumsfaktoren, wie dem Fibroblastenwachstumsfaktor auf die Stimulation der pathologischen Angiogenese ausprobiert. Jedoch wurde kein konsistenter Effekt beobachtet (Kirkpatrick et al., Br. J. Ophthalmol., 77: 766–770 (1993), Chan et al., Ophthalmology, 101: 289–300 (1994)). Kürzlich wurde ein Versuch unter Verwendung des transformierenden Wachstumsfaktors β-2 (TGF β-2) zur Behandlung der Makuladegeneration ohne Erfolg abgeschlossen. Biotechnologys Newswatch, 1. Januar 1996.
Mit dem schnellen Altern der Population stellt die Makuladegeneration ein substanzielles Gesundheitsproblem der Gesellschaft dar. Derzeit existiert keine Heilung und die weniger als zufriedenstellenden Ergebnisse, die mit der Laserbehandlung erhalten werden, sind die einzig akzeptierte Therapie, obwohl die FDA kürzlich Thalidomid zur Verwendung in einer klinischen Studie am Menschen zugelassen hat ("Researchers Focus on Macular Degeneration: Common Eye Problems, Causes and Treatment Get New Attention" von Steven Sternberg, Washington Post Heath, 31. Oktober 1995). Es bleibt ein starker Bedarf für eine wirksame Arzneimitteltherapie für die Makuladegeneration in der Technik bestehen.
Das Makulaödem ist mit vielen Typen an vaskulären Augenkrankheiten assoziiert, wie Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie, Pars plantis, Retinavenenobstruktion, senile Hyalitis und mit intraokularen Operationsverfahren (Henkind, Surv. Ophthalmol. 28: 431–432 (1984), Bird, Surv. Ophthalmol., 28: 433–436 (1984), Cunha-Vaz, Surv. Ophthalmol. 28: 485–492 (1984)). Das cystoide Makulaödem ist die häufigste Komplikation nach einer Kataraktoperation (Yannuzzi, Surv. Ophthalmol. 28: 540–553 (1984)) und wahrscheinlich die häufigste Ursache von Sehverlusten bei Patienten, die sich einer Linsenentnahme unterziehen (Jampol et al., Surv. Ophthalmol. 28: 535–539 (1984)). Das cystoide Makulaödem limitiert sich normalerweise selbst und sogar chronische Fälle können sich spontan verbessern (Yannuzzi, Surv. Opthalmol. 28: 540–553 (1984)). Jedoch kann ein kleiner Teil an Patienten (1 bis 15%) eine irreversible Schädigung und eine permanente Sehunfähigkeit entwickeln (Yannuzzi et al., Ophthalmology, 88: 847–854 (1981)).
Das Makulaödem ist auch eine Ursache des Verlusts der Sehfähigkeit bei Patienten mit dem Vogt-Koyanagi-Harada (VKH)Syndrom (Rutzen et al., J. Ret and Vit. Dis. 15 (6): 475–479 (1995)). Das Makulaödem ist eng mit Mikroaneurismen bei der diabetischen Retinopathie und bei nicht-diabetischen Personen mit der Sichelzellanämie, der Okklusion der verzweigten Venen, einer Erkrankung der Arteria carotis oder schwerem Bluthochdruck assoziiert (Klein, Med. Chem. N. Am. 72: 1415–1437 (1989)). Mikroaneurismen verlieren oft Lipoproteinmaterial, das zu harten Exsudaten führt. Diese Exsudate treten in einer verstreuten, aggregierten oder ringförmigen Konfiguration auf. Wenn sich Exsudate und Flüssigkeit im posterioren Teil der Retina ansammelt, kann ein Makulaödem entstehen, das ein signifikantes Verschwimmen der Sehfähigkeit verursacht und zum Verlust der Sehschärfe führen kann.
Ein Laserverfahren, das fokale Photokoagulation genannt wird, wird zur Behandlung der Bereiche der Retinaschwellungen neben Mikroaneurismen verwendet. Die fokale Photokoagulation verringert das Auftreten der Störung der Sehschärfe um 60% bei Patienten mit einem klinisch signifikanten Makulaödem, aber es wurde kein Nutzen der Photokoagulation bei Patienten mit mildem bis moderatem Makulaödem gezeigt (Raskin et al., Ann. Int. Med., 117 (3): 226–233 (1992)). Die Glaskörperoperation kann die visuelle Prognose nur in den Fällen des diabetischen Makulaödems verbessern, das mit einem pathologischen Glaskörper-Makula-Übergang assoziiert ist (Vaneffenterre et al., J. Francais D Ophthalmol. 16 (11): 602–610 (1993)). Arzneimittelbehandlungen, wie orales und topisches Indomethacin (Miwa, Drug Intell. Clin. Pharm. 20: 548–550 (1986) wie auch Erythropoetin (Friedman et al., Amer. J. Kidney Dis., 26 (1): 202–208 (1995)) wurden für Makulaödem evaluiert, aber es wurde kein signifikanter Effekt beobachtet. Es besteht in der Technik ein Bedarf für eine wirksame Arzneimitteltherapie für das Makulaödem.
Während von VEGF bekannt ist, dass es eine Rolle bei der Pathologie von bestimmten vaskulären Störungen spielt, muss noch bestimmt werden, ob die von VEGF bereitgestellte hemmende Wirkung einen therapeutischen Nutzen für die Behandlung solcher okularer, vaskulärer Störungen bereitstellen würde. Die vorliegende Erfindung demonstriert, dass die Hemmung der Aktivität von VEGF die Pathologie einer Vielzahl dieser Okularen, vaskulären Störungen lindern kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Aspekt der Erfindung, Verfahren zur Behandlung einer _Okularen, vaskulären Störung bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Kapillarpermeabilität bereitzustellen, die mit einem Makulaödem bei einem Säuger assoziiert ist.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Hemmung der durch den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) induzierten Neovaskularisierung bereitstellen.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden durch eine oder mehrere unten beschriebene Ausführungsformen bereitgestellt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung eines Bisindolylmaleimid- oder eines makrocyclischen Bisondolylmaleimidinhibitors des β-Isoenzyms der Proteinkinase C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer VEGF-bezogenen okularen, vaskulären Störung, ausgewählt aus Makuladegeneration, mit Retinitis pigmentosa zusammenhängendes Makulaödem, mit Pars plantis zusammenhängendes Makulaödem, mit Retinavenenobstruktion zusammenhängendes Makulaödem, mit Altershyalitis zusammenhängendes Makulaödem, Makulaödem, das mit einer Komplikation einer Intraokularoperation zusammenhängt, mit Sichelzellanämie zusammenhängendes Makulaödem, mit Venenverästelungsokklusion zusammenhängendes Makulaödem, mit einer Erkrankung der Arteria carotis zusammenhängendes Makulaödem und mit starkem Bluthochdruck zusammenhängendes Makulaödem, bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung liefert die Kenntnis über die Identität von Verbindungen, die bei der Behandlung einer Vielzahl an Okularen, vaskulären Störungen prophylaktisch und wirksam sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die hemmende Wirkung des PKC Inhibitors (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion auf das durch rekombinantem humanem VEGF stimulierte Endothelzellwachstum.
Die 2 erläutert die hemmende Wirkung des PKC Inhibitors (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion auf das durch rekombinantem humanem VEGF stimulierte Endothelzellwachstum.
Die 3 zeigt den Einfluss des PKC Inhibitors auf die Aktivität des endogenen VEGF, der durch die Kultivierung von Retinapericyten unter hypoxischen Bedingungen exprimiert wird.
Die 4 erläutert den hemmenden Effekt des PKC Inhibitors auf das durch rekombinantem, humanem VEGF stimulierte Endothelzellwachstum.
Die 5A und 5B zeigen den Zeitverlauf der durch VEGF induzierten Retinapermeabilität.
Die 6 demonstriert die Reaktion der Fluoresceinpermeabilität der Retina auf VEGF.
Die 7 demonstriert die Wirkung der PKC Hemmung im Glaskörper und die Stimulierung der Retinapermeabilität.
Die 8A and 8B zeigen die Hemmung der Retinapermeabilität in Reaktion auf VEGF durch einen oral verabreichten Proteinkinase C β-Inhibitor.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass die therapeutische Verwendung einer bestimmten Klasse an Proteinkinase C Inhibitoren, nämlich Bisindolylmaleimid- oder makrocyclische Bisindolylmaleimidinhibitoren des β-Isoenzyms der Proteinkinase C und speziell β-Isoenzym-selektive Inhibitoren der PKC, den Wirkungen von VEGF entgegenwirkt. Insbesondere ist eine Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung dieser bestimmten Klasse an Proteinkinase C Inhibitoren dem Endothelzellwachstum und der Kapillarpermeabilität entgegenwirkt, speziell dem Endothelzellwachstum und der Kapillarpermeabilität, die durch den Wachstumsfaktor VEGF stimuliert werden. Daher können solche Verbindungen therapeutisch zur Behandlung von Störungen verwendet werden, die mit VEGF assoziiert sind, insbesondere einer Vielzahl an _Okularen, vaskulären Störungen.
Die Erfindung verwendet Bisindolylmaleimid- oder makrocyclische Bisondolylmaleimidproteinkinase C Inhibitoren, die wirksam das β-Isoenzym hemmen. Bisondolylmaleimide sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen die Verbindungen, die in US 5 621 098 A , US 5 552 396 A , US 5 545 636 A , US 5 481 003 A , US 5 491 242 A und US 5 057 614 A beschrieben sind. Makrocyclische Bisindolylmaleimide werden insbesondere durch die Verbindungen der Formel I dargestellt. Diese Verbindungen und die Verfahren zu ihrer Herstellung werden in Patent US 5 552 396 A beschrieben.
Diese Verbindungen werden in einer therapeutisch wirksamen Menge einem Säuger zur Hemmung des Endothelzellwachstums oder der Kapillarpermeabilität, die mit VEGF assoziiert sind und zur Hemmung der mit okularen Störungen assoziierten VEGF Effekte verabreicht. Diese Verbindungen können auch an Patienten als Prophylaxe verabreicht werden, die einem Risiko für die oben erwähnten Krankheitszustände ausgesetzt sind.
Eine bevorzugte Klasse an Verbindungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren hat die Formel (I)
worin
W steht für -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CO-, C₂-C₆ Alkylen, substituiertes Alkylen, C₂-C₆ Alkenylen, -Aryl-, -Aryl(CH₂)_mO-, -Heterocyclus-, -Heterocyclus-(CH₂)_mO-, -fusionierter Bicyclus-, -fusionierter Bicyclus-(CH₂)_mO-,NR³-, -NOR³-, -CONH- oder -NHCO-,
X und Y unabhängig für C₁-C₄ Alkylen, substituiertes Alkylen stehen oder X, Y und W zusammen unter Bildung von -(CH₂)_n-AA- kombinieren,
alle R¹ für Wasserstoff oder bis zu vier optionale Substituenten stehen, unabhängig ausgewählt aus Halogen, C₁-C₄ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, Halogenalkyl, Nitro, NR⁴R⁵ oder -NHCO(C₁-C₄ Alkyl),
R² für Wasserstoff, CH₃CO-, NH₂ oder Hydroxy steht,
R³ für Wasserstoff, -(CH₂)_mAryl, -C₁-C₄ Alkyl, -COO(C₁-C₄ Alkyl), -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH₂, -SO(C₁-C₄ Alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵ oder -SO₂(C₁-C₄ Alkyl) steht,
R⁴ und R⁵ unabhängig für Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, Phenyl oder Benzyl stehen oder mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, unter Bildung eines gesättigten oder ungesättigten fünf- oder sechsgliedrigen Rings kombinieren,
AA für einen Aminosäurerest steht,
m unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 steht und
n unabhängig für 2, 3, 4 oder 5 steht,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Esterderivat hiervon
Ein bevorzugtere Klasse an Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung wird durch die Formel I repräsentiert, worin die Reste -X-W-Y- 4 bis 8 Atome enthalten, die substituiert oder unsubstituiert sein können. Am bevorzugtesten enthalten die Reste -X-W-Y- 6 Atome.
Andere bevorzugte Verbindungen zur Verwendung im Verfahren der Erfindung sind die Verbindungen der Formel I, worin R¹ und R² für Wasserstoff stehen und W für ein substituiertes Alkylen, -O-, S-, -CONH-, -NHCO- oder -NR³- steht. Besonders bevorzugte Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung sind die Verbindungen der Formel Ia:
worin Z für -(CH₂)_p oder -(CH₂)_p-O-(CH₂)_p steht, R⁴ für Hydroxy, -SH, C₁-C₄ Alkyl, (CH₂)_mAryl, -NH(Aryl), -N(CH₃)(CF₃), -NH(CF₃) oder NR⁵R⁶ steht, R⁵ für Wasserstoff oder C₁-C₄ Alkyl steht, R⁶ für Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder Benzyl steht, p für 0, 1 oder 2 steht und m unabhängig für 2 oder 3 steht,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Esterderivat hiervon. Die am meisten bevorzugten Verbindungen der Formel Ia sind die, worin Z für CH₂ steht und R⁴ für -NH₂, -NH(CF₃) oder -N(CH₃)₂ steht, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Esterderivat hiervon.
Andere bevorzugte Verbindungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind Verbindungen, worin W in Formel I für -O- steht, Y für ein substituiertes Alkylen steht und X für ein Alkylen steht. Diese bevorzugten Verbindungen werden durch die Formel Ib dargestellt:
worin Z für -(CH₂)_p steht, R⁴ für NR⁵R⁶, -NH(CF₃) oder -N(CH₃)(CF₃) steht, R⁵ und R⁶ unabhängig für H oder C₁-C₄ Alkyl stehen, p für 0, 1 oder 2 steht und m unabhängig für 2 oder 3 steht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Esterderivat hiervon. Am bevorzugtesten sind die Verbindungen der Formel Ib, worin p für 1 steht und R⁵ und R⁶ für Methyl stehen.
Da sie einen basischen Rest enthalten, können die Verbindungen der Formel I, Ia und Ib auch als pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze vorkommen. Säuren, die herkömmlich zur Bildung solcher Salze verwendet werden, sind unter anderem anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, wie auch organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und verwandte anorganische und organische Säuren. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze umfassen daher Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, 2-Butin-1,4-dioat, 3-Hexin-2,5-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, Hippurat, β-Hydroxybutyrat, Glycolat, Maleat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Die Hydrochlorid- und Mesylatsalze werden bevorzugt verwendet.
Zusätzlich zu pharmazeutisch annehmbaren Salzen können auch andere Salze vorkommen. Sie können als Zwischenprodukt bei der Reinigung der Verbindungen bei der Herstellung von anderen Salzen oder zur Identifizierung und Charakterisierung der Verbindungen oder Zwischenprodukte dienen.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindungen der Formel I, Ia und Ib können auch als verschiedene Solvate vorkommen, wie mit Wasser, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Ethylacetat und dergleichen. Gemische von solchen Solvaten können ebenfalls hergestellt werden. Die Quelle eines solchen Solvats kann aus dem Kristallisationslösemittel, dem bei der Herstellung oder Kristallisation anwesenden Lösemittel oder einem speziell zugegebenen Lösemittel gebildet werden.
Es ist bekannt, dass verschiedene stereoisomere Formen der Verbindungen der Formeln I, Ia und Ib vorkommen können, beispielsweise kann W ein chirales Kohlenstoffatom im substituierten Alkylenrest enthalten. Die Verbindungen werden normalerweise als Razemate hergestellt und können bequem als solche verwendet werden. Alternativ dazu können beide einzelnen Enantiomere isoliert oder durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, wenn dies gewünscht wird. Solche Razemate, einzelnen Enantiomere und Gemische hiervon bilden einen Teil der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen.
Die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen umfassen auch die pharmazeutisch annehmbaren Prodrugs der Verbindungen der Formeln I, Ia und Ib. Ein Prodrug ist ein Arzneimittel, das chemisch modifiziert wurde und am Wirkort biologisch inaktiv ist, das aber durch ein oder mehrere enzymatische oder andere in vivo Prozesse in die zugrundeliegende bioaktive Form abgebaut oder modifiziert werden kann. Das Prodrug kann ein unterschiedliches pharmakokinetisches Profil haben, wie die Ausgangsverbindung, was eine leichtere Absorption über das Mucosaepithel, eine bessere Salzbildung oder Löslichkeit und/oder verbesserte systemische Stabilität (beispielsweise eine Erhöhung der Plasmahalbwertszeit) ermöglicht. Typischerweise umfassen solche chemischen Modifikationen die folgenden:

1) Ester- oder Amidderivate, die durch Esterasen oder Lipasen gespalten werden können,
2) Peptide, die durch spezifische oder nicht-spezifische Proteasen erkannt werden können,
3) Derivate, die an einer Wirkungsstelle durch die Membranselektion einer Prodrugform oder einer modifizierten Prodrugform akkumulieren, oder jede Kombination der obigen Punkte 1 bis 3. Herkömmliche Verfahren zur Auswahl und Herstellung geeigneter Prodrugderivate werden beispielsweise beschrieben in H. Bundgaard, Design of Prodrugs (1985).

Die Synthese von verschiedenen Bisindol-N-maleimidderivaten ist in Davis et al., US 5 057 614 A beschrieben und die Synthese der bevorzugten Verbindungen, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, werden in den vorher identifizierten US Patenten 5 552 396 A und in Faul et al. EP 0 657 411 A1 beschrieben.
Ein besonders bevorzugter Proteinkinase-β-Inhibitor zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren ist die in Beispiel 5 g im vorher erwähnten Patent US 5 552 396 A beschriebene Verbindung ((S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion als Hydrochloridsalz). Diese Verbindung ist ein potenter Proteinkinase C Inhibitor. Sie ist für die Proteinkinase C gegenüber anderen Kinasen selektiv und hoch Isoenzym-selektiv, das heißt sie ist für die β-1- und β-2-Isoenzyme selektiv. Andere Salze dieser Verbindung wären ebenfalls bevorzugt, speziell die Mesylatsalze.
Ein bevorzugtes Mesylatsalz kann durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel II
mit Methansulfonsäure in einem nicht-reaktiven organischen Lösemittel, vorzugsweise einem organischen Lösemittel/Wasser-Gemisch, und am meisten bevorzugt Wasser-Aceton hergestellt werden. Andere Lösemittel, wie Methanol, Aceton, Ethylacetat und Gemische hiervon sind ebenfalls funktionsfähig. Das Verhältnis von Lösemittel zu Wasser ist nicht entscheidend und wird normalerweise durch die Löslichkeit der Reagenzien bestimmt. Bevorzugte Lösemittel : Wasser Verhältnisse betragen im allgemeinen 0,1 : 1 bis 100 : 1 Lösemittel zu Wasser bezogen auf das Volumen. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis 1 : 1 bis 20 : 1 und am bevorzugtesten 5 : 1 bis 10 : 1. Das optimale Verhältnis hängt vom ausgewählten Lösemittel ab und dies ist vorzugsweise Aceton in einem 9 : 1 Lösemittel : Wasser-Verhältnis.
Die Reaktion umfasst gewöhnlich etwa äquimolare Mengen der zwei Reagenzien, obwohl andere Verhältnisse, speziell die, worin Methansulfonsäure im Überschuss vorliegt, funktionsfähig sind. Die Zugabegeschwindigkeit der Methansulfonsäure ist für die Umsetzung nicht entscheidend und kann schnell (< 5 Minuten) oder langsam über 6 oder mehr Stunden zugegeben werden. Die Reaktion wird bei Temperaturen ausgeführt, die von 0°C bis Rückfluss reichen. Das Reaktionsgemisch wird gerührt, bis die Bildung des Salzes vollständig ist, wie dies durch Röntgenbeugung am Pulver bestimmt wird, und kann 5 Minuten bis 12 Stunden dauern.
Die Salze der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt und werden leicht als kristalline Form hergestellt. Die Trihydratform des Salzes kann leicht in das Monohydrat durch die Trocknung oder Exposition bei 20–60% relativer Luftfeuchtigkeit umgewandelt werden. Das Salz ist im wesentlichen kristallin, wobei es einen definierten Schmelzpunkt, eine Doppelbrechung und ein Röntgenstreuungsmuster zeigt. Im allgemeinen weisen die Kristalle weniger als 10% amorphen Feststoff und vorzugsweise weniger als 5 und am bevorzugtesten weniger als 1% amorphen Feststoff auf.
Das Mesylatsalz wird durch Filtration oder andere Trenntechniken, die in der Technik bekannt sind, direkt aus dem Reaktionsgemisch in Ausbeuten von 50% bis 100% isoliert. Eine Umkristallisation und andere Reinigungstechniken, die in der Technik bekannt sind, können verwendet werden, um das Salz weiter zu reinigen, falls dies gewünscht wird.
Die Endothelzellen in Gewebekultur, die durch Wachstumsfaktoren stimuliert wurden, wie VEGF, zeigen eine höhere Wachstumsrate als die basale Zellwachstumsrate. Experimente, die in der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden, zeigen, dass der Proteinkinase C Inhibitor, nämlich (S)-3,4-[N,N'-1,1'-(2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dionsäuresalz, bei einer in vitro Verabreichung in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 100 nM das durch den Wachstumsfaktor (wie VEGF) stimulierte nicht-basale Zellwachstum signifikant hemmt.
Wichtig ist, dass andere Versuche zeigen, dass das normale Endothelzellwachstum in Gewebekultur nicht durch diese Verbindung gehemmt wird, wie dies durch die fehlende Hemmung des Endothelzellwachstums ohne VEGF Stimulierung in normoxischen konditionierten Medien gezeigt wird. Bei hypoxisch konditionierten Medien erhöht sich die Zellwachstumsrate aufgrund der Zunahme des Gehalts an endogenem Wachstumsfaktor VEGF, der durch die hypoxischen Zellen gebildet wird. Erneut normalisiert der Proteinkinase C Inhibitor (S)-3,4-[N,N'-1,1'-(2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dionsäuresalz das durch solche hypoxischen Bedingungen induzierte Zellwachstum.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Experimente zeigen, dass die Kapillarpermeabilität auch durch Wachstumsfaktoren beeinflusst wird, wie VEGF. Der Test hat gezeigt, dass VEGF in einem Tiermodell signifikant die Kapillarpermeabilität bis zum Dreifachen erhöht. Die von VEGF abhängige Erhöhung der Kapillarpermeabilität ist auch dosisabhängig. Gemäß dem in vivo Tierversuch hemmt die Verabreichung des Proteinkinase C Inhibitors bei einer Konzentration von etwa 25 mg/kg/Tag vor der VEGF Provokation stark die durch VEGF induzierte Kapillarpermeabilität. Die Verwendung von Konzentrationen von 1 nM bis 5 mM und vorzugsweise von 1 nM bis 500 nM werden vor allem umfasst. Die Hemmung kann bis zu 80% betragen und ist im allgemeinen für eine durch einen Wachtumsfaktor induzierte Kapillarpermeabilität spezifisch. Die Kapillarpermeabilität kann durch eine Fluoresceinangiographie gemessen werden. Insbesondere beim Makulaödem ist die Fluoresceinangiographie ein photographisches Retinaverfahren, das die Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in den Blutstrom umfasst, um Leckagebereiche in der Retina zu detektieren.
Obwohl man nicht durch eine technische Erklärung beschränkt werden will, glauben die Erfinder, dass Veränderungen in der Retinaperfusion, die durch einen verringerten Blutfluss, einen Verlust der Retinakapillaren, einer peripheren Vaskulaturagenese oder Obliteration oder Abtrennung der choroidalen Blutversorgung von der Retina zustande kommen, alle zu einer relativen Retinaischämie führen. Diese Ischämie stimuliert die Synthese und Sekretion von Wachstumsfaktoren, wie VEGF in Retinapericyten, Endothelzellen, im Retinapigmentepithel, in Gliazellen und möglicherweise anderen Zelltypen und dies führt anschließend zu einer Retinaneovaskularisierung und einer erhöhten Kapillarpermeabilität. Diese Bedingungen sind mit einer Vielzahl an okularen, vaskulären Störungen assoziiert.
Die Inhibitoren des β-Isoenzyms von PKC, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, können zur Behandlung der Erkrankungszustände verwendet werden, die mit Endothelzellwachstum und Kapillarpermeabilität assoziiert sind, speziell einer Vielzahl an okularen, vaskulären Störungen.
Okulare, vaskuläre Störungen, die durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelbar sind, umfassen Makuladegeneration, mit Retinitis pigmentosa zusammenhängendes Makulaödem, mit Pars plantis zusammenhängendes Makulaödem, mit Retinavenenobstruktion zusammenhängendes Makulaödem, mit Altershyalitis zusammenhängendes Makulaödem, Makulaödem, das mit einer Komplikation einer Intraokularoperation zusammenhängt, mit Sichelzellanämie zusammenhängendes Makulaödem, mit Venenverästelungsokklusion zusammenhängendes Makulaödem, mit einer Erkrankung der Arteria carotis zusammenhängendes Makulaödem und mit starkem Bluthochdruck zusammenhängendes Makulaödem.
Der Fachmann erkennt, dass eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteinkinase C Inhibitors des β-Isoenzyms die Menge ist, die zur Hemmung des Wachstums von Endothelzellen oder der Entwicklung der Kapillarpermeabilität durch die Hemmung von VEGF ausreichend ist und dass diese Menge unter anderem in Abhängigkeit der betroffenen Gewebegröße, der Konzentration der Verbindung in der therapeutischen Formulierung und des Körpergewichts des Patienten variiert. Im allgemeinen kann eine Menge an zu verabreichendem Proteinkinase C Inhibitor des β-Isoenzyms als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Okularen, vaskulären Störungen auf einer Fall zu Fall Basis durch den behandelnden Arzt bestimmt werden. Als Anhaltspunkt werden das Ausmaß der Neovaskularisierung, das Körpergewicht und das Alter des Patienten in Betracht gezogen, wenn eine geeignete Dosis eingestellt wird.
Im allgemeinen ist eine geeignete Dosis eine, die zu einer Konzentration des Proteinkinase C Inhibitors des β-Isoenzyms an der Behandlungsstelle im Bereich von 0,5 nM bis 200 μM und gewöhnlicher etwa 0,5 nM bis 200 nM führt. Es wird erwartet, dass Serumkonzentrationen von 0,5 nM bis 100 nM in vielen Fällen ausreichend sein sollten.
Um diese Behandlungskonzentrationen zu erhalten, verabreicht man einem behandlungsbedürftigen Patienten zwischen etwa 0,001 mg pro Tag pro kg Körpergewicht und etwa 50,0 mg pro Tag pro kg. Gewöhnlich sollten nicht mehr als etwa 1,0 bis 10,0 mg pro Tag pro kg Körpergewicht Proteinkinase C Inhibitor des β-Isoenzyms erforderlich sein. Wie oben erwähnt, können die obigen Mengen auf einer Fall zu Fall Basis variieren.
Die Verbindungen der Formel I und die bevorzugten Verbindungen der Formeln Ia und Ib werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert. Geeignete pharmazeutische Formulierungen werden durch bekannte Verfahren mittels gut bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe hergestellt. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen, die zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Träger gemischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einem Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Hilfsstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Daher können die Zusammensetzungen vorliegen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lonzetten, Sachets, Cachets, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Weich- und Hartgelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen und sterilen verpackten Pulvern entweder zur oralen oder topischen Verabreichung.
Einige Beispiele für geeignete Träger, Hilfsstoffe und Verdünnungsmittel sind unter anderem Lactose, Glucose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärkearten, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Tragacanth, Gelatine, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup, Methylcellulose, Methyl- und Propylhydroxybenzoate, Talkum, Magnesiumstearat und Mineralöl. Die Formulierungen können zusätzlich Gleitmittel, Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Konservierungsstoffe, Süßstoffe oder Geschmacksstoffe enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können so formuliert werden, dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten bereitstellen. Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer Einheitsdosierungsform formuliert, wobei jede Dosierung etwa 0,05 mg bis etwa 3 g, gewöhnlicher etwa 750 mg des Wirkstoffs enthält. Es ist jedoch verständlich, dass die verabreichte therapeutische Dosis von einem Arzt in Anbetracht der relevanten Umstände bestimmt wird, einschließlich der Schwere des zu behandelnden Zustands, der Wahl der zu verabreichenden Verbindung und des gewählten Verabreichungswegs. Daher sollen die obigen Dosierungsbereiche den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken. Der Ausdruck "Einheitsdosierungsform" bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einmalige Dosierungen für den Menschen oder andere Säuger geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet wurde, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger enthält.
Zusätzlich zu den obigen Formulierungen, von denen die meisten oral verabreicht werden können, können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen auch topisch verabreicht werden. Topische Formulierungen sind unter anderem Salben, Cremes und Gele.
Salben werden im allgemeinen mittels entweder (1) einer ölartigen Grundlage, nämlich einer, die aus fetten Ölen oder Kohlenwasserstoffen besteht, wie weiße Vaseline oder Mineralöl, oder (2) einer Absorptionsgrundlage, nämlich einer, die aus einer wasserfreien Substanz oder Substanzen besteht, die Wasser absorbieren können, beispielsweise wasserfreies Lanolin, hergestellt. Herkömmlicherweise wird nach der Formulierung der Grundlage, ob ölartig oder absorbierend, der Wirkstoff (die Verbindung) in einer Menge zugegeben, die die gewünschte Konzentration ergibt.
Cremes sind Öl/Wasser Emulsionen. Sie bestehen aus einer Ölphase (innere Phase), die typischerweise gehärtete Öle, Kohlenwasserstoffe und dergleichen enthält, wie Wachse, Petrolatum, Mineralöl und dergleichen, und eine wässrige Phase (kontinuierliche Phase), die Wasser und alle wasserlöslichen Substanzen enthält, wie zugegebene Salze. Die zwei Phasen werden durch die Verwendung eines Emulgiermittels stabilisiert, beispielsweise einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat, hydrophilen Kolloiden, wie Akaziengummi, kolloidale Tonerden, Veegum und dergleichen. Nach der Bildung der Emulsion wird herkömmlicherweise der Wirkstoff (die Verbindung) in einer Menge zugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erhalten.
Gele enthalten eine Grundlage, die aus einer ölartigen Grundlage, Wasser oder einer Emulsions-Suspensionsgrundlage ausgewählt ist. Zur Grundlage wird ein gelierendes Mittel gegeben, das unter Erhöhung der Viskosität eine Matrix in der Grundlage bildet. Beispiele für gelierende Mittel sind Hydroxypropylcellulose, Acrylsäurepolymere und dergleichen. Herkömmlicherweise wird der Wirkstoff (die Verbindung) in der gewünschten Konzentration an einem Punkt zur Formulierung gegeben, der der Zugabe des gelierenden Mittels vorausgeht.
Die Menge des in die erfindungsgemäße topische Formulierung eingearbeiteten Wirkstoffs ist nicht entscheidend, wobei die Konzentration in einem Bereich liegen sollte, die die einfache Anwendung der Formulierung auf die Fläche des betroffenen Gewebes in einer Menge erlaubt, die die gewünschte Menge der Verbindung an die gewünschte Behandlungsstelle abgibt.
Die herkömmliche Menge einer auf ein betroffenes Gewebe anzuwendenden topischen Formulierung hängt von der betroffenen Gewebegröße und der Konzentration der Verbindung in der Formulierung ab. Im allgemeinen wird die Formulierung auf das betroffene Gewebe in einer Menge aufgetragen, die etwa 1 bis etwa 500 μg Verbindung pro cm² betroffenes Gewebe beträgt. Vorzugsweise beträgt die aufgetragene Menge der Verbindung etwa 30 bis etwa 300, μg/cm², insbesondere etwa 50 bis etwa 200 μg/cm² und vor allem etwa 60 bis etwa 100 μg/cm².
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd.
Formulierung 1
Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge (mg/Kapsel)

Wirkstoff 250

Stärke, getrocknet 200

Magnesiumstearat 10

Gesamt 460 mg
Die obigen Bestandteile werden gemischt und in 460 mg Mengen in Hartgelatinekapseln gefüllt.
Formulierung 2
Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge (mg/Tablette)

Wirkstoff 250

mikrokristalline Cellulose 400

pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid 10

Stearinsäure 5

Gesamt 665 mg
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepresst, wobei jede 665 mg wiegt.
Formulierung 3

Tabletten, die jeweils 60 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

	Menge (mg/Tablette)
Wirkstoff	60 mg
Stärke	45 mg
Mikrokristalline Cellulose	35 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser)	4 mg
Natriumcarboxymethylstärke	4,5 mg
Magnesiumstearat	0,5 mg
Talkum	1 mg
Gesamt	150 mg

Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die Polyvinylpyrrolidonlösung wird mit dem entstehenden Pulver vermischt und das Gemisch wird anschließend durch ein Nr. 14 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepresst, die jeweils 150 mg wiegen.
Beispiele
Die Beispiele zeigen alle die Verwendung von (S)-3,4-[N,N'-1,1'-(2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dionhydrochloridsalz zur Hemmung des Endothelzellwachstums in vitro und zur Hemmung der gesteigerten Kapillarpermeabilität in vivo, die durch VEGF stimuliert werden.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die hemmende Wirkung der erwähnten Verbindung auf das durch VEGF stimulierte Endothelzellwachstum unter Verwendung von rekombinantem, humanem VEGF untersucht.
Endothelzellen der Rinderretina werden aus frischen Kalbsaugen durch Homogenisierung und eine Reihe an Filtrationsschritten isoliert. Primäre Endothelzellkulturen werden in Fibronectin (NYBen Reagents, New York Blood Center) beschichteten Schalen (Costar) angezogen, die Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 5,5 mM Glucose, 10% von Plasma stammendes Pferdeserum (Wheaton, Scientific), 50 mg Heparin pro Liter und 50 Einheiten Endothelzellwachstumsfaktor pro Liter (Boehringer Mannheim) enthalten. Nachdem die Zellen die Konfluenz erreichen wird das Medium ausgetauscht, um 5% fetales Rinderserum (HyClone) zu enthalten. Das Medium wird alle 3 Tage ausgetauscht. Die Endothelzellhomogenität wird mit anti-Faktor VIII Antikörper bestimmt.
Die Wirkung des erwähnten PKC Inhibitors auf die VEGF Wirkung in vitro wird unter Verwendung von spärlich plattierten Kulturen aus milkrovaskulären Endothelzellen der Rinderretina evaluiert, die nach der Zugabe von VEGF eine Wachstumsstimulation zeigen. Die Endothelzellen der Rinderretina werden spärlich (~2500 Zellen pro Vertiefung) in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (Costar) plattiert und über Nacht in DMEM inkubiert, worin 10% Kälberserum (GIBCO) enthalten sind. Das Medium wird am nächsten Tag ausgetauscht.
Um die Wirkung des erwähnten PKC Inhibitors auf das Endothelzellwachstum zu untersuchen, wird ein Satz an Experimenten ausgeführt, worin das Zellwachstum in Abwesenheit jedes Wirkstoffs als Kontrolle dient und dann wird die Wirkung der Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors sowohl in Gegenwart von VEGF (25 ng/ml, Genentech) und in Abwesenheit von VEGF untersucht. Nach der Inkubation bei 37°C für 4 Tage werden die Zellen in 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und der DNA Gehalt wird mittels Hoechst 33258 Farbstoff und einem Fluorometer (Modell TKO-100, Hoefer) gemessen.
Alle Bestimmungen werden statistisch zumindest dreifach ausgeführt und die Experimente werden mindestens dreimal wiederholt. Die Ergebnisse werden als Mittel ± SD für alle Experimente angegeben. Eine Analyse der in vitro Ergebnisse wird durch einen nicht-gepaarten Student's T-Test ausgeführt. Ein p Wert von < 0,050 wird als statistisch signifikant betrachtet.
Die 1 zeigt die mittels rekombinantem VEGF erhaltenen Ergebnisse. Wie dies durch die drei Säulen ganz links in der Figur gezeigt ist, hat die Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors auf die Endothelzellkultur im wesentlichen keinen Einfluss auf die basale Wachstumsrate (Säule 1). Die Wachstumsrate erhöht sich wesentlich durch die Zugabe von VEGF (vierte Säule). Diese Wachstumsrate wird nach der Zugabe von > 0,5 nM des erwähnten PKC Inhibitors (vier Säulen ganz rechts) wesentlich zurückgefahren.
Beispiel 2
Dieses Beispiel ist ähnlich zu dem Versuch, der in 1 angegeben ist und erläutert weiter die hemmende Wirkung des angegebenen PKC Inhibitors auf das durch VEGF stimulierte Endothelzellwachstum mittels rekombinantem, humanem VEGF.
Unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 werden Endothelzellen aus der Rinderretina isoliert und angezogen und dann werden spärlich plattierte Kulturen hergestellt. Erneut werden mittels des Verfahrens von Beispiel 1 Experimente ausgeführt, worin die Wirkung des erwähnten PKC Inhibitors auf das Endothelzellwachstum sowohl in Gegenwart von VEGF (25 ng/ml, Genentech) als auch in Abwesenheit von VEGF untersucht wird. Nach der Inkubation bei 37°C für 4 Tage werden die Zellen in 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und der DNA Gehalt wird mittels Hoechst 33258 Farbstoff und einem Fluorometer (Modell TKO.100, Hoefer) gemessen.
Die 2 erläutert die Ergebnisse dieses Versuchs. Wie dies in den Säulen über der Legende -VEGF gezeigt ist, hat die Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors auf die Endothelzellkultur von 0,1 nM bis 100 nM im wesentlichen keinen Einfluss auf die basale Wachstumsrate der Zellen. Die Stimulierung der Endothelzellen mit rekombinantem, humanem VEGF (25 ng/ml) ruft einen signifikanten Anstieg im zellulären DNA Gehalt nach 4 Tagen, was einen Anstieg in der Wachstumsrate anzeigt, im Vergleich zu unstimulierten Zellen hervor (Vergleich –VEGF bei 0 mit +VEGF bei 0). Diese Wachstumsrate wird signifikant bei der Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors eingeschränkt (vier Säulen ganz rechts über der Le gende +VEGF). Insbesondere wird die Stimulationswirkung von VEGF leicht in Gegenwart von 0,1 nM des PKC Inhibitors reduziert und wird im wesentlichen vollständig durch die gleichzeitige Zugabe von 1 nM und mehr des PKC Inhibitors eliminiert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel untersucht die Wirkung des erwähnten PKC Inhibitors auf die Aktivität des endogenen VEGF, was durch die Kultivierung von Retinapericyten unter hypoxischen Bedingungen ausgedrückt wird.
Endothelzellen aus der Rinderretina und Retinapericyten werden aus frischen Kälberaugen durch Homogenisierung und eine Reihe an Filtrationsschritten isoliert. Die Endothelzellen werden angezogen und spärlich auf Kulturplatten unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 kultiviert. Mittels ähnlicher Techniken werden Pericyten aus der Rinderretina in DMEM/5,5 mM Glucose mit 20% fetalem Rinderserum kultiviert.
Hypoxisch konditioniertes Medium für die endogene VEGF Expression und normoxisch konditioniertes Kontrollmedium werden jeweils gemäß der folgenden Verfahren hergestellt. Konfluente Retinapericytenmonoschichten werden für 24 Stunden gegenüber 2% O₂/5% CO₂/93% N₂ mittels eines Lab-Line Instruments Computers kontrollierten Infrarot CO₂ Inkubators mit Wassermantel mit verringerter Sauerstoffkontrolle (Modell 480) ausgesetzt. Alle Zellen werden bei 37°C gehalten und zeigen keine morphologischen Veränderungen im Trypanblauausschluss in der Lichtmikroskopie (> 98%) und können anschließend normal passagiert werden. Die Zellen aus demselben Ansatz und derselben Passage, die unter normoxischen Bedingungen (95% Luft/5% CO₂) angezogen wurden, werden als Kontrolle verwendet. Das Medium wird anschließend gewonnen und vor der Verwendung filtriert (Nalgene, 0,22 μm).
In diesem Beispiel werden Experimente ausgeführt, die den erwähnten PKC Inhibitor auf das Endthelzellwachstum in Gegenwart von entweder normoxisch konditionierten Medien oder hypoxisch konditionierten Medien untersuchen. Wie dies in den vorherigen Beispielen ausgeführt wurde, werden die Zellen nach einer Inkubation bei 37°C für 4 Tage in 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und der DNA Gehalt wird mittels Hoechst 33258 Farbstoff und einem Fluorometer (Modell TKO-100, Hoefer) gemessen.
In den in 3 berichteten Tests wird der erwähnte PKC Inhibitor in einer Konzentration von 10 nM verwendet. Wie in 3 gezeigt, wird das Zellwachstum der Retinaendothelzellen durch konditioniertes Medium aus Retinapericyten stimuliert, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, welche bekanntermaßen die VEGF Expression induzieren (vergleiche Säule 1 mit Säule 3 in 3). Dieses Wachstum wird in Gegenwart des Hydrochloridsalzes von (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion des PKC Inhibitors suprimiert (normalisiert) (vergleiche Säule 3 mit Säule 4).
Beispiel 4
Dieses Beispiel ist ähnlich zu den Experimenten, die in den 1 und 2 berichtet werden und erläutert ferner den hemmenden Effekt des angegebenen PKC Inhibitors auf das durch VEGF stimulierte Endothelzellwachstum mittels rekombinantem, humanem VEGF.
Unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 werden Endothelzellen aus der Rinderretina isoliert und angezogen und dann werden spärlich plattierte Kulturen hergestellt. Erneut werden unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 Experimente ausgeführt, worin die Wirkung des erwähnten PKC Inhibitors auf das Endothelzellwachstum sowohl in Gegenwart (+VEGF) (25 ng/ml, Genentech) und Abwesenheit von VEGF (-VEGF) untersucht wird. Wie oben werden die Zellen nach einer Inkubation bei 37°C für 4 Tage in 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und der DNA Gehalt wird mittels Hoechst 33258 Farbstoff und einem Fluorometer (Modell TKO-100, Hoefer) gemessen.
Die 4 erläutert die Ergebnisse dieser Arbeit. Wie es durch die Säulen über der Legende -VEGF gezeigt wird, hat die Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors zur Endothelzellkultur bei einer Konzentration von 10 nM im wesentlichen keinen Einfluss auf die basale Wachstumsrate der Zellen. Die Stimulierung der Endothelzellen mit rekombinantem, humanem VEGF (25 ng/ml) ruft eine signifikante Zunahme des zellulären DNA Gehalts, was eine Zunahme der Wachstumsrate anzeigt, im Vergleich zu unstimulierten Zellen hervor (vergleiche -VEGF Kontrolle mit +VEGF Kontrolle). Diese Wachstumsrate wird durch die Zugabe des erwähnten PKC Inhibitors bei einer Konzentration von 10 nM wesentlich eingeschränkt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die beschriebene Klasse an PKC Inhibitoren und insbesondere (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion die in vitro Stimulierung des Retinaendothelzellwachstums sowohl durch exogenen als auch durch Hypoxie-induzierten VEGF verhindern. Da die VEGF Expression eng mit der Neovaskularisierung in Zusammenhang gebracht wurde, die mit einer Makuladegeneration assoziiert ist, unterstützen diese Ergebnisse die Verwendung der PKC Inhibitoren als Therapie für die Behandlung der Makuladegeneration.
Beispiel 5
Dieses Beispiel demonstriert den Zeitverlauf der durch VEGF induzierten Retinapermeabilität. Ein Auge jeder Ratte erhält eine Injektion von 2,0 ng VEGF in den Glaskörper (geschätzte Endkonzentration 25 ng/ml). Das kontralaterale Auge erhält ein ähnliches Volumen einer Kontrolllösung. Nach 10 Minuten werden 30 Mikroliter Fluorescein durch den Katheter in die rechte Jugularvene injiziert. Eine Fluorophotometrie des Glaskörpers wird zu den angegebenen Zeiten nach der Fluoresceininjektion ausgeführt.
Wie in 5A gezeigt, findet eine deutliche Zunahme der Permeabilität des Fluoresceins in den Glaskörper in den mit VEGF behandelten Augen statt. Dies wird innerhalb von 10 Minuten einer Fluoresceinangiogramminjektion statistisch signifikant und bleibt für mindestens 30 Minuten erhalten. Die 5B zeigt, dass diese als Prozent der Kontrolle ausgedrückte Stimulation demonstriert, dass über die Zeit eine zusätzliche Fluoresceinleckage in den mit VEGF behandelten Augen besteht.
Beispiel 6
Das Beispiel zeigt die Dosisantwort der Retinapermeabilität gegenüber Fluorescein in Reaktion auf VEGF.
In ein Auge jedes Tieres wird eine Kontrolle injiziert, während in das kontralaterale Auge verschiedene Dosen an VEGF injiziert werden. 10 Minuten später wird Fluorescein intravenös injiziert und die Menge an Glaskörper Leckage wird nach 30 Minuten analysiert. Wie in 6 gezeigt, existiert eine von der VEGF Dosis abhängige Erhöhung der Retinapermeabilität. Die Stimulierung ist bei 14 bis 20 ng/ml maximal, die auch vom Menschen bekannt ist.
Beispiel 7
Dieses Beispiel demonstriert die Wirkung des PKC Inhibitors (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dionhydrochloridsalz im Glaskörper und dessen Stimulierung auf die Retinapermeabilität.
Rattenaugen injiziert man entweder 2,0 ng VEGF pro Auge, 10 nM des PKC β-Inhibitors oder 1 μg PDBU (ein PKC Agonist), wie dies in 7 gezeigt ist. PKC β-Inhibitor wird 15 Minuten vor der VEGF Zugabe injiziert. 10 Minuten nach der VEGF Zugabe wird Fluorescein intravenös verabreicht und das Fluorescein im Glaskörper wird nach 30 Minuten untersucht.
Wie in 7 gezeigt, zeigt eine VEGF Injektion in den Glaskörper die erwartete Stimulierung der Retinapermeabilität. Eine Injektion des PKC β-Inhibitors in den Glaskörper 15 Minuten vor der Injektion von VEGF eliminiert den Hauptteil der Permeabilitätsreaktion. Eine direkte Stimulierung der Proteinkinase C durch die Injektion von PDBU demonstriert eine Zunahme der Permeabilität sehr ähnlich zu VEGF.
Beispiel 8
Das Beispiel demonstriert die Hemmung der Retinapermeabilität in Reaktion auf VEGF durch den oral verabreichten Proteinkinase C β-Inhibitor (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dionhydrochloridsalz.
Die Ratten werden mit Nahrung, die mit Proteinkinase C β-Inhibitor vermischt ist, mit den in den 8A und 8B angegebenen Dosen gefüttert. Nach einer Woche mit dieser Nahrung wird die Retinapermeabilität in Reaktion auf 2,0 ng in den Glaskörper injiziertes VEGF bestimmt, wie dies vorher diskutiert wurde. Die orale Verabreichung des PKC β-Inhibitors der Erfindung für 1 Woche verringert die Retinapermeabilität in Reaktion auf VEGF. Dies macht sich vor allem bei höheren Dosen bemerkbar.
Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung werden in der vorhergehenden Beschreibung beschrieben. Die Erfindung, die hierin geschützt werden soll, soll jedoch nicht auf die bestimmten beschriebenen Formen beschränkt werden, da sie als erläuternd und nicht als beschränkend angesehen werden.

Claims

Verwendung eines Bisindolylmaleimid- oder eines makrocyclischen Bisindolylmaleimidinhibitors des β-Isoenzyms der Proteinkinase C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer VEGF-bezogenen okularen, vaskulären Störung, ausgewählt aus Makuladegeneration, mit Retinitis pigmentosa zusammenhängendes Makulaödem, mit Pars plantis zusammenhängendes Makulaödem, mit Retinavenenobstruktion zusammenhängendes Makulaödem, mit Altershyalitis zusammenhängendes Makulaödem, Makulaödem, das mit einer Komplikation einer Intraokularoperation zusammenhängt, mit Sichelzellanämie zusammenhängendes Makulaödem, mit Venenverästelungsokklusion zusammenhängendes Makulaödem, mit einer Erkrankung der Arteria carotis zusammenhängendes Makulaödem und mit starkem Bluthochdruck zusammenhängendes Makulaödem.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor Isoenzym-selektiv ist und worin die Isoenzymselektivität aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus β-1- und β-2-Isoenzymen besteht.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Proteinkinase C Inhibitor die folgende Formel aufweist
worin W für -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CO-, C₂-C₆ Alkylen, substituiertes Alkylen, C₂-C₆ Alkenylen, Aryl, Aryl(CH₂)_mO-, Heterocyclus, Heterocyclus-(CH₂)_mO-, fusionierten Bicyclus, fusionierten Bicyclus-(CH₂)_mO-, -NR³-, -NOR³-, -CONH- oder -NHCO- steht, X und Y unabhängig für C₁-C₄ Alkylen, und substituiertes Alkylen stehen oder X, Y und W zusammen unter Bildung von -(CH₂)_n-AA- kombinieren, R¹ für Wasserstoff oder für bis zu vier optionale Substituenten steht, die unabhängig ausgewählt sind aus Halogen, C₁-C₄ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, Halogenalkyl, Nitro, NR⁴R⁵ oder -NHCO(C₁-C₄ Alkyl), R² für Wasserstoff CH₃CO-, NH₂ oder Hydroxy steht, R³ für Wasserstoff (CH₂)_m-Aryl, C₁-C₄ Alkyl, -COO(C₁-C₄ Alkyl), -CONR⁴R⁵, -(C=NH)NH₂, -SO(C₁-C₄ Alkyl), -SO₂(NR⁴R⁵) oder -SO₂(C₁-C₄ Alkyl) steht, R⁴ und R⁵ unabhängig für Wasserstoff C₁-C₄ Alkyl, Phenyl oder Benzyl stehen oder mit dem Stickstoff an den sie gebunden sind, unter Bildung eines gesättigten oder ungesättigten fünf- oder sechsgliedrigen Rings kombinieren, AA für einen Aminosäurerest steht, m unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 steht, und n unabhängig für 2, 3, 4 oder 5 steht, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Ester hiervon.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Proteinkinase C Inhibitor die folgende Formel aufweist
worin Z für -(CH₂)_p- oder -(CH₂)_p-O-(CH₂)_p- steht, R⁴ für Hydroxy, -SH, C₁-C₄ Alkyl, (CH₂)_m-Aryl, -NH(Aryl), -N(CH₃)(CF₃), -NH(CF₃) oder -NR⁵R⁶ steht, R⁵ für Wasserstoff oder C₁-C₄ Alkyl steht, R⁶ für Wasserstoff C₁-C₄ Alkyl oder Benzyl steht, p für 0, 1 oder 2 steht und in unabhängig für 2 oder 3 steht, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Ester hiervon.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Proteinkinase C Inhibitor die folgende Formel aufweist
worin Z für -(CH₂)_p- steht, R⁴ für -NR⁵R⁶, -NH(CF₃) oder -N(CH₃)(CF₃) steht, R⁵ und R⁶ unabhängig für H oder C₁-C₄ Alkyl stehen, p für 0, 1 oder 2 steht und m unabhängig für 2 oder 3 steht, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Prodrug oder Ester hiervon.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Proteinkinase C Inhibitor (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2''-Ethoxy)-3'''(O)-4'''-(N,N-dimethylamino)butan)-bis-(3,3'-indolyl)]-1(H)-pyrrol-2,5-dion oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die okulare, vaskuläre Störung eine alterbedingte Makuladegeneration ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die okulare, vaskuläre Störung ausgewählt ist aus Makulaödem, das mit Sichelzellanämie, Venenverästelungsokklusion, Erkrankung der Arteria carotis oder starkem Bluthochdruck assoziiert ist.