DE60027431T2 - Verwendung von p38 MAPK Inhibitoren in der Behandlung von Augenkrankheiten - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Nervensystemerkrankungen, die jene einschließen, die durch den NMDA-Rezeptor, der z.B. auf Glutamat anspricht, vermittelt werden.
  • Es ist gezeigt worden, dass das HIV-1-Glykoprotein gp120, das Hüllprotein von HIV, neuronalen Schaden und Apoptose sowohl in Nagetier als auch menschlichen Zellkulturen erzeugt. Siehe z.B. Brenneman et al., Nature 335: 639–642 (1988); Dreyer et al., Science 248: 364–367 (1990); und Müller et al., Eur. J. Pharmacol. 226: 209–214 (1992). Transgene Mäuse, die gp120 exprimieren, entwickelten neuropathologische Merkmale, die auf viele Arten und Weisen HIV-vermittelter Demenz ähneln. Siehe Toggas et al., Nature 367: 188–193 (1994). Obwohl HIV-1 selbst offensichtlich Neuronen nicht infiziert, kann die HIV-1-Infektion in anderen Zellen im Gehirn (z.B. Makrophagen/Mikroglia) auftreten, und dieses kann zu neuronaler Verletzung, neuronalem Schaden oder Tod durch Apoptose in den Gehirnen der Patienten mit AIDS führen. Zusätzlich zu den Neuronen im Gehirn beeinflusst die HIV-1-Infektion auch andere Arten von Nervenzellen, z.B. retinale Ganglienzellen, und kann zum Verlust des Sehens führen.
  • Mitogen-aktivierte Proteinkinse p38(MAPK)-Inhibitoren sind bekannt und sind zur Behandlung von mehreren verschiedenen spezifischen Erkrankungen vorgeschlagen worden. Siehe: Nagarkatti, D. S., et al. "Role of p38 MAP Kinase in Myocardial Stress", J Mol Cell Cardiol 30, 1651–1664 (1998); Ma, X. L., et al. "Inhibition of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Decreases Cardiomyocyte Apoptosis and Improves Cardiac Function After Myocardial Ischemia and Reperfusion", Americal Heart Association Bd. 99, Nr. 13, 1999, 1685–1691; Lieu, C-H, et al. "Role of Mitogen-activated Protein Kinase in Taxol-Induced Apoptosis in Human Leukemic U937 Cells", Cell Growth & Diffenrentiation Bd. 9, 1998, 767–776; WO 99/00357 Vertex Pharmaceuticals Inc.; WO 98/27098 Vertex Pharmaceuticals Inc.; WO 99/61039 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V.; US 6288089 Zawada et al.; und Courtney et al. "CA on STN2, Chemical Abstracts Service, Accession Nr. 129: 14783.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung von p38-MAPK-Inhibitoren in Medikamenten zur Behandlung von mehreren spezifischen medizinischen Zuständen, für welche derartige Inhibitoren vorher nicht verwendet worden sind, nämlich Glaukom, optische Neuropathie, Sehnervenentzündung (optische Neuritis), retinale Ischämie, laserinduzierter optischer Schaden oder chirurgie- oder traumainduzierte proliferative Vitreoretinopathie, neuronale Verletzung oder Apoptose, die retinale Ganglienzellen einschließt, oder eines medizinischen Zustands vor, welcher nitrosativen oder oxidativen Stress an retinalen Ganglienzellen durch übermäßige Aktivierung von exzitatorischen Aminosäurerezeptoren oder die Erzeugung von freien Radikalen verursacht.
  • Gemäß eines ersten Gesichtspunkts davon schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines mitogen-aktivierten Proteinkinase-p38(MAPK)-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an Glaukom, optische Neuropathie, optischer Neuritis, retinaler Ischämie, laserinduziertem optischen Schaden oder chirurgie- oder traumainduzierter proliferativer Vitreoretinopathie leidet; eines Patienten, der an neuronaler Verletzung oder Apoptose, die retinale Ganglienzellen einschließt, leidet; oder eines Patienten, der an an einem medizinischen Zustand leidet, der nitrosativen oder oxidativen Stress an retinalen Ganglienzellen durch übermäßige Aktivierung von exzitatorischen Aminosäurerezeptoren oder die Erzeugung von freien Radikalen verursacht.
  • Geeigneterweise ist der p38-MAPK-Inhibitor eine Verbindung mit der Fähigkeit, TNF-α in bekannten Modellen zu inhibieren, wie dem Modell, das menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Bluts verwendet, die durch LPS stimuliert werden, wie in Henry et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett. 8: 3335–3340 (1998), welches hier durch Inbezugnahme eingeführt wird. Eine derartige Inhibierung kann durch einen IC50 von höchstens 500 nM in derartigen Assays dargelegt werden. Ein stark inhibierendes Ion ist am meisten bevorzugt durch einen IC50 von höchstens 100 nM gekennzeichnet, wenn es in derartigen Assays bewertet wird.
  • In einer Ausführungsform ist der p38-MAPK-Inhibitor folgender Formel (I):
    Figure 00030001
    wobei gilt:
    A ist N oder CRα. Jeder Rest Rα, Ra, Rb und Rc ist unabhängig voneinander ein Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Amid, Halogen, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl, wobei jeder Rest Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls mit Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Alkylsulfinyl oder Halogen gegebenenfalls substituiert ist. Rc und Rd verbinden sich gegebenenfalls, um Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl zu bilden, wobei jeder Rest gegebenenfalls mit Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Alkylsulfinyl oder Halogen substituiert ist.
  • Die Verwendung eines Salzes des p38-MAPK-Inhibitors der Formel (I) liegt auch im Schutzbereich dieser Erfindung. Zum Beispiel kann sich ein Salz zwischen einem positiv geladenen Aminosubstituenten (z.B. -N+(CH3)3) mit einem negativ geladenen Gegenion (z.B. Chlorid, Bromid, Nitrat oder Sulfat) bilden. Als ein anderes Beispiel kann ein negativ geladener Carboxylatsubstituent ein Salz mit einem positiv geladenen Gegenion, wie einem Natriumion, Kaliumion oder Magnesiumion, bilden.
  • In einer Ausführungsform ist der p38-MAPK-Inhibitor ein Imidazol (d.h. A ist N), wobei Ra Wasserstoff, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl (z.B. Piperidin) ist; Rb Wasserstoff, Aryl oder Heteroaryl (z.B. 4-Alkylsulfinylphenyl) ist; Rc Wasserstoff, Aryl oder Heteroaryl (z.B. 4-Halogenphenyl) ist; und Rd 4-Pyridyl ist.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der p38-MAPK-Inhibitor ein Pyrrol (d.h. A ist CRα, wobei Rα Wasserstoff, Aryl oder Heteroaryl ist). Rc und Rd können sich verbinden, um Heteroaryl (z.B. Pyridin) zu bilden, welches gegebenenfalls mit Alkyl, Alkoxy, Aryloxy, Amino oder Halogen (z.B. -OCH3 oder -NH2) substituiert ist.
  • Der p38-MAPK-Inhibitor kann ausgewählt sein aus einem oder mehreren des Folgenden: Triarylimidazol- oder Triarylpyrrol-Verbindungen von SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, PA), wie SmithKline-Arzneistoff-Nr. SB 203580 (d.h. 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol), SB 202190 (d.h. 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-hydroxylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol), SB 220025 (d.h. 5-(2-Amino-4-pyrimidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-1-(4-piperidinyl)-1H-imidazol), SmithKline-Arzneistoff-Nr. SB 239063, SC 68376 (d.h. 2-Methyl-4-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol, erhältlich von Alexis Biochemicals, San Diego, CA), SmithKline Französische Arzneistoff-Nr. (French drug no.) SKF-104,351, SKF-86002 (d.h. 6-(4-Fluorphenyl)-2,3-dihydro-5-(4-pyridyl)imidazo-[2,1-b]-thiazol); Pyrrolopyridin-Arzneistoffe von R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Raritan, NJ), wie RWJ 68354 (d.h. 6-Amino-2-(4-fluorphenyl)-4-methoxy-3-(4-pyridyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin); Vertex Pharmaceuticals-Arzneistoff-Nr. VK-19911 (d.h. 1-(4-Piperidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol); oder Derivate oder Verwandte jeder der eben erwähnten Verbindungen.
  • Der Patient, der behandelt wird, leidet an Glaukom oder anderen optischen Neuropathien, wie Sehnervenentzündung (optische Neuritis), retinaler Ischämie, laserinduziertem optischen Schaden, proliferativer Vitreoretinopathie, die z.B. durch Chirurgie oder Trauma induziert wird; an neuronaler Verletzung oder Apoptose, die retinale Ganglienzellen einschließt, oder an einem medizinischen Zustand, welcher nitrosativen oder oxidativen Stress an retinalen Ganglienzellen durch übermäßige Aktivierung von exzitatorischen Aminosäurerezeptoren oder die Erzeugung von freien Radikalen verursacht.
  • Die neuronale Apoptose kann durch eine HIV-Infektion (z.B. durch das gp120-Protein), ein α-Chemokin (z.B. SDF-1) oder einer Kombination von beiden induziert sein.
  • In einem bestimmten Fall betrifft die Erfindung die Behandlung des Glaukoms. Einem Patienten, der am Glaukom leidet, kann eine wirksame Menge eines mitogen-aktivierten Proteinkinase-p38(MAPK)-Inhibitors verabreicht werden. In einer Ausführungsform ist der p38-MAPK-Inhibitors 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol, 4-(4-Fluorphenyl)-(4-hydroxylphenyl)-5- (4-pyridyl)-1H-imidazol, 5-(2-Amino-4-pyrimidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-1-(4-piperidinyl)-1H-imidazol, 2-Methyl-4-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol, SmithKline Französische Arzneistoff-Nr. SKF-104,351, 6-(4-Fluorphenyl)-2,3-dihydro-5-(4-pyridyl)imidazo-[2,1-b]-thiazol, 6-Amino-2-(4-fluorphenyl)-4-methoxy-3-(4-pyridyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin oder 1-(4-Piperidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol.
  • Wie hier verwendet, ist Alkyl eine gerade oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele des Alkyls schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl und 2-Methylhexyl.
  • Cycloalkyl bedeutet einen zyklischen Alkylrest, der 3 bis 8 Kohlenstoffatome enthält. Einige Beispiele von Cycloalkyl sind Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Adamantyl und Norbornyl. Heterocycloalkyl ist ein Cycloalkylrest, der 1–3 Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält. Beispiele von Heterocycloalkyl schließen Piperidinyl, Piperazinyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydrofuryl und Morpholinyl ein.
  • Wie hier verwendet, ist Aryl ein aromatischer Rest, der 6–12 Ringatome enthält und kondensierte Ringe enthalten kann, welche gesättigt, ungesättigt oder aromatisch sein können. Beispiele eines Arylrests schließen Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Phenanthryl, Anthracyl ein. Heteroaryl ist ein Aryl, das 1–3 Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält und kondensierte Ringe enthalten kann. Einige Beispiele des Heteroaryls sind Pyridyl, Furanyl, Pyrrolyl, Thienyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Indolyl, Benzofuranyl und Benzthiazolyl.
  • Beachte, dass ein Aminorest nichtsubstituiert, monosubstituiert, oder disubstituiert sein kann. Er kann mit Resten, wie Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl, substituiert sein. Halogen bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
  • Andere Merkmale und Vorteile sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich.
  • In den Zeichnungen gilt:
  • 1(A) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, dem β-Chemokin RANTES oder einer Kombination von gp120 und RANTES.
  • 1(B) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, dem β-Chemokin MIP-1β oder einer Kombination von gp120 und MIP-1β.
  • 2 ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, den α-Chemokinen SDF-1β (20 nm), SDF-1β (50 nm), SDF-1α (50 nm) und einer Kombination von gp120 und jedem von SDF-1β (20 nm), SDF-1β (50 nm) und SDF-1α (50 nm).
  • 3(A) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, dem Tripeptid TKP, oder einer Kombination von gp120 und TKP.
  • 3(B) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, SDF-1β oder einer Kombination von gp120 und SDF-1β.
  • 3(C) ist ein Balkendiagramm der Nitrit-(reflektierend für Stickstoffoxid)Produktion in Gegenwart von Zytokinen oder einer Kombination von TKP und Zytokinen.
  • 4(A) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von gp120, SmithKline Arzneistoff-Nr. SB 203580 oder einer Kombination von gp120 und SB 203580.
  • 4(B) ist ein Balkendiagramm der neuronalen Apoptose in Gegenwart von SDF-1β, SmithKline Arzneistoff-Nr. SB 203580 oder einer Kombination von SDF-1β und SB 203580.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der Axotomie auf die Dichte von RGCs zeigt.
  • 6 ist ein Balkendiagramm, das die neuroprotektive Wirkung von SB 203580 zeigt.
  • 7 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierung der p38-Aktivität zeigt, die gezüchtete RGCs vor der N-Methyl-D-aspartat(NMDA)-induzierten Apoptose schützt.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das in vivo die neuroprotektive Wirkung von MK801 gegenüber der Axotomie-induzierten RGC-Apoptose zeigt.
  • Wie die ausführliche Beschreibung nachstehend erklärt, kann gezeigt werden, dass die mitogen-aktivierten Proteinkinase-p38(MAPK)-Inhibitoren neuronale Verletzung, Schaden oder Tod, z.B. durch HIV-Infektion induzierte neuronale Apoptose, verringern. Basierend auf dieser Arbeit, ist gezeigt worden, dass derartige Inhibitoren eine wirksame Behandlung für Glaukom und mehrere verwandte retinale neurodegenerative Krankheiten bereitstellen.
  • Ohne zu beabsichtigen, durch irgendeine Theorie gebunden zu sein, schützt ein mitogen-aktivierter Proteinkinase-p38(MAPK)-Inhibitor Neuronen vor Schaden oder Tod infolge von Apoptose, die sich aus einer HIV-Infektion ergibt, bezogen auf die folgenden Feststellungen. Alle hier zitierten Veröffentlichungen werden hier durch Inbezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeführt.
  • Zerebrokortikale Kulturen der Ratte als in vitro-Modell für neuronale Apoptose-Assays
  • Obwohl einige gp120-Proteine aus HIV-1 direkt über Chemokin-Rezeptoren an neuronalen Zelllinien und an isolieren Nagetierneuronen signalisieren können, mandatiert die Wichtigkeit der Zell-Zell-Wechselwirkung im Gehirn, dass Krankheitspathogenese in vitro in einem Kultursystem nahe kommt, das den Typ und den Anteil von Zellen rekapituliert, die normalerweise im Gehirn gefunden werden, wie Neuronen, Astrozyten und Makrophagen/Mikroglia.
  • Das Modell, das in den nachstehend beschriebenen Assays verwendet wurde, d.h. zerebrokortikale Kulturen der Ratte, wurde aus Embryonen von Sprague-Dawley-Ratten an Tag 15 bis 17 der Schwangerschaft hergestellt. Siehe Lei et al., Neuron 8: 1087–1099 (1992) und Lipton et al., Nature 364: 626–632 (1993). Kulturen wurden für Experimente nach 17 bis 24 Tagen in Kultur verwendet. Diese Kulturen enthalten Neuronen, Astrozyten und Makrophagen/Mikroglia, wie mit spezifischer Immunmarkierung bestimmt. Vor einigen Experimenten wurden Makrophagen/Mikroglia oder Neuronen aus den Kulturen durch Einwirken von 7,5 mM L-Leucinmethylester beziehungsweise 2 mM N-Methyl-D-aspartat (NMDA) entzogen. Siehe Lipton, NeuroReport 3: 913–915 (1992). Das Fehlen von Makrophagen/Mikroglia oder Neuronen in diesen Kulturen wurde immunzytochemisch unter Verwendung von Antikörpern gegen ED-1 beziehungsweise Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP-2) bestätigt. In einigen Experimenten wurde die Griess-Reaktion verwendet, um Nitritwerte im Kulturmedium als Index der Stickstoffoxid(NO)-Freisetzung zu messen. Siehe Chao et al., Glia 16: 276–284 (1996).
  • Neuronale Apoptose-Assays
  • Kulturen wurden in Earle's ausgeglichener Salzlösung (Earle's Balanced Salt Solution) (EBSS) überführt und 24 Stunden lang mit gp120, Chemokinen, Tuftsin-Fragment 1-3, d.h. Thr-Lys-Pro (TKP), p38-MAPK-Inhibitor SB 203580 (d.h. 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol, Calbiochem, San Diego, CA) oder Kombinationen davon inkubiert. Chemokine oder TKP wurden 5 Minuten lang und SB 203580 15 Minuten lang vor dem Einwirken von gp120 aufgebracht.
  • TKP wurde von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Rekombinantes menschliches MIP-1β, SDF-1α, SDF-1β und rekombinante Ratten-RANTES wurden von R&D-Systems (Minneapolis, WI) beziehungsweise Endogen (Woburn, MA) gekauft. HIV-1-Hüll-Glykoprotein gp120 aus dem Stamm SF2 wurde aus dem NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten. Siehe Scandella et al., AIDS Res Hum. Retroviruses 9: 1233–1244 (1993). Zusätzliche gp120s aus den HIV-1-Stämmen IIIB und RF2 wurden von Genentech beziehungsweise dem National Cancer Institute erhalten. TNFα, IFNγ, und IL-1β wurden von Genzyme (Cambridge, MA), Gibco BRL (Grand Island, NY) beziehungsweise Endogen (Woburn, MA) erhalten.
  • Einschätzung der neuronalen Apoptose
  • Die neuronale Apoptose in den vorstehend beschriebenen Assays wurde unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, z.B. Färben von durchlässiggemachten Zellen mit Propidiumiodid, um die Apoptosemorphologie zu bestimmen, und eines neuronenspezifischen Antikörpers (gegen NeuN oder MAP-2), um den Zellentyp zu identifizieren, eingeschätzt. Kurz zusammengefasst, wurden Zellen 5 Minuten lang mit eiskaltem Aceton bei –20°C und nach dreimal Waschen in PBS 4 Minuten lang mit 2% (w/v) Paraformaldehyd-Lösung in PBS bei Raumtemperatur (RT) fixiert. Aceton-Paraformaldehyd-fixierte Zellen wurden unter Verwendung von 0,2% Tween 20 in PBS (PBST) durchlässiggemacht, und nichtspezifische Bindungsstellen wurden durch 1 Stunde lange Inkubation mit einer 10% Lösung von wärmeinaktiviertem Ziegenserum in PBST geblockt. Um Neuronen spezifisch zu färben, wurden die Zellen dann 4 Stunden lang bei RT oder über Nacht bei 4°C mit 1:500 Verdünnungen von Anti-MAP-2 (Sigma) oder von monoklonalem Anti-NeuN-Antikörper (mAb; Chemicon, Temecula, CA) inkubiert. Ihre jeweiligen unspezifischen Isotypantikörper dienten als Kontrollen. Nach dreimal Waschen wurden die Zellen in einem zweiten polyklonalen Antikörper (pAb), der entweder mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert wurde, inkubiert. Im Fall von HRP-gekoppeltem pAb diente Diaminobenzidin (DAB) als das Farbsubstrat, das durch Inkubation in einem Gemisch aus 1 mg/ml DAB und 0,8% H2O2 mit einem Verhältnis von 3:1 entwickelt wurde. Die Zellkerne wurden anschließend 5 Minuten lang mit 20 mg/ml Propidiumiodid im Dunkeln gefärbt, und dann wurden Deckgläser auf Objektträgern angebracht. Die Experimente wurden mindestens 3mal mit dreifachen Werten in jedem Experiment wiederholt. Statistische Bedeutung wurde durch eine Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Scheffé- oder Bonferroni/Dunn-Post-hoc-Test, beurteilt.
  • β-Chemokine heben die gp120-induzierte neuronale Apoptose auf; α-Chemokine induzieren die neuronale Apoptose
  • Mit Bezug auf 1(A) und 1(B) wurde die neuronale Apoptose, die durch gp120 induziert wurde (200 pM), durch die Gegenwart von β-Chemokinen, d.h. RANTES und MIP-1β (jeweils bei 20 nM) aufgehoben, während BSA (0,001% = 144 nM) und die Gegenwart von α-Chemokinen, d.h. SDF-1α oder SDF-1β (20–50 nM) den neuronalen Schaden oder die neuronale Apoptose nicht verringerten. Tatsächlich erhöhten diese α-Chemokine die neuronale Apoptose (ungefähr 2fache Zunahme der neuronalen Apoptose im Vergleich zur Kontrolle). Siehe 2. MIP-1β und RANTES inhibieren die neurotoxische Wirkung von gp120SF2 auf eine indirekte Art und Weise, weil RANTES an die β-Chemokin-Rezeptoren CCR1, CCR3 und CCR5 bindet, und MIP-1β an CCR5 bindet (oder einem funktionellen Rattenhomolog), wohingegen gp120SF2 (und SDF-1α/β) mit dem α-Chemokin-Rezeptor CXCR4 wechselwirkt. Beachte, dass, obwohl gp120SF2 zu einem geringeren Grad mit dem β-Chemokin-Rezeptor CCR5 an einigen transfizierten Zellenlinien auch wechselwirken kann, nicht gezeigt worden ist, dass dies an primären Zellen auftritt, wie hier verwendet.
  • Es sollte unterstrichen werden, dass zerebrokortikale Nagetierkulturen ein geeignetes Modellsystem sind, um diese Wirkungen von gp120 zu studieren, weil diese Spezies CXCR4-Homologe exprimieren, welche wie der menschliche CXCR4 in der Lage sind, eine HIV-1-Infektion über die gp120-Bindung zu vermitteln.
  • Wirkungsweise von gp120 und Chemokinen
  • Um zu untersuchen, ob die neuroprotektive Wirkung dieser β-Chemokine und die neurotoxische Wirkung von gp120 durch Makrophagen, Astrozyten, Neuronen oder durch gleichzeitige Wirkung an zwei oder allen drei Zellentypen vermittelt werden, wurde das Makrophageninhibitionstripeptid Thr-Lys-Pro (TKP) im Assay verwendet. Es ist gezeigt worden, dass TKP die Aktivierung von Makrophagen/Mikroglia und die nachfolgende Freisetzung ihrer toxischen Faktoren sowohl in vitro als auch in vivo spezifisch verhindert, wohingegen Kontrollpeptide keinen Effekt haben. Siehe z.B. Auriault et al., FEBS Lett. 153: 11–15 (1983). Bei unseren Assays schützte TKP (50 μM) die Neuronen vor gp120-induzierter Apoptose. Siehe 3(A). Im Gegensatz dazu wurde die SDF-1β-induzierte neuronale Apoptose durch TKP nicht aufgehoben. Siehe 3(B).
  • Mehrere Reihen von Beweis bestätigten vorherige Berichte, dass TKP seine Inhibitionswirkung spezifisch an Makrophagen/Mikroglia anwendete, und nicht an Astrozyten oder Neuronen. Zum Beispiel inhibierte bei Fehlen von Makrophagen/Mikroglia TKP die NO-Freisetzung durch Zytokin-aktivierte Astrozyten nicht. Siehe 4(C), und TKP beeinträchtigte die NMDA-induzierte neuronale Apoptose nicht. Diese Feststellungen zeigen an, dass aktivierte Makrophagen zur gp120-induzierten, aber nicht zur α-Chemokin-induzierten neuronalen Apoptose erforderlich sind.
  • Die Anzahl an HIV-1-infizierten Zellen im Gehirn ist verhältnismäßig klein, und produktiv infizierte Zellen sind ausschließlich von der Monozytenlinie. Siehe Lipton und Gendelman, N. Engl. J. Med. 332: 934–940 (1995). Dies legt nahe, dass HIV-1 einen neurodegenerativen Prozess initiiert, der Verstärkung zur Folge hat, um eine ausgesprochene ZNS-Verletzung zu erzeugen. In der Tat ist festgestellt worden, dass in Kultursystemen sowohl von Nagetier als auch von menschlichem Gehirn HIV-1-infizierte oder gp120-stimulierte Makrophagen und Mikroglia Neurotoxine freisetzen, die zum neurodegenerativen Prozess mindestens teilweise durch übermäßige Stimulierung des NMDA-Subtyps des Glutamatrezeptors beitragen. Die Tatsache, dass gp120-transgene Mäuse einen neuronalen Schaden manifestieren, der dem ähnelt, der sowohl in Nagetierkulturen als auch im menschlichen Gehirn mit HIV-assoziierter Demenz festgestellt wurde, zeigt an, dass sogar bei Fehlen von intaktem HIV-1 ein Fragment des Virus ausreicht, um wichtige Gesichtspunkte dieser Verstärkungskaskade beim neurodegenerativen Prozess in unserem in vitro-System auszulösen, welches deshalb Bedeutung für die in vivo Pathogenizität hat.
  • Inhibierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 verbessert sowohl die gp120- als auch die SDF-1β-induzierte neuronale Apoptose
  • In einer anderen Reihe von Experimenten untersuchten wir eine Vielzahl von Inhibitoren der intrazellulären Signalkaskaden auf ihre Fähigkeit, die mit gp120 assoziierte neuronale Apoptose zu verhindern. Diese Inhibitoren schlossen Parke-Davis-Arzneistoff-Nr. PD 98059 (2 μM) (d.h. 2'-Amino-3'-methoxyflavon; Calbiochem, La Jolla, CA) ein, welche die extrazelluläre regulierte Kinase (ERK) MAPK inhibiert, Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC, 5 μM), welches NF-kB inhibiert, und SB 203580 (10 μM), welcher p38-MAPK spezifisch inhibiert. Unter diesen Verbindungen verminderte nur SB 203580 im Wesentlichen die gp120SF2-induzierte neuronale Apoptose. Siehe 4(A). Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass der p38-MAPK-Weg beim gp120-aktivierten Todessignal eingeschlossen ist. Die Inhibierung von p38-MAPK verbessert auch die SDF-1-Neurotoxizität. Siehe 4(B). Dies zeigt an, dass die neurotoxischen Prozesse, die sowohl durch gp120SF2 als auch SDF-1 initiiert wurden, den gewöhnlichen MAPK-Signalweg verwenden, welcher p38-MAPK einschließt. Weil die SDF-1β-induzierte Neurotoxizität beim tatsächlichen Fehlen von Makrophagen/Mikroglia auftritt, muss p38-MAPK als Stressantwort in Neuronen oder Astrozyten aktiviert werden. Jedoch können wir die Möglichkeit, dass gp120 und SDF-1 auch p38 in Makrophagen/Mikroglia aktiviert, nicht ausschließen. Tatsächlich ist dies wahrscheinlich, dass es auftritt, weil immunzytochemische Experimente in unserem Kultursystem aktiviertes (diphosphorylisiertes) p38 sowohl in Neuronen als auch Makrophagen nach gp120-Anregung gezeigt haben.
  • Andere p38-MAPK-Inhibitoren
  • Es gibt andere p38-MAPK-Inhibitoren, welche den Signalweg auf eine ähnliche Art und Weise wie SB 203580 inhibieren. Diese Inhibitoren schließen Triarylimidazol- oder Triarylpyrrol-Verbindungen von SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, PA), wie SmithKline Beecham-Arzneistoff-Nr. SB 202190 (d.h. 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-hydroxylphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol), SB 220025 (d.h. 5-(2-Amino-4-pyrimidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-1-(4-piperidinyl)imidazol), SmithKline Beecham-Arzneistoff-Nr. SB 239063, SmithKline Französische Arzneistoff-Nr. (French drug no.) SKF-104,351; Pyrrolopyridin-Arzneistoffe von R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Raritan, NJ), wie RWJ 68354 (d.h. 6-Amino-2-(4-fluorphenyl)-4-methoxy-3-(4-pyridyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin); Vertex Pharmaceuticals-Arzneistoff-Nr. VK-19911 (d.h. 1-(4-Piperidinyl)-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol); Alexis Biochemicals-Arzneistoff-Nr. SC 68376 (d.h. 2-Methyl-4-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol) und Derivate und Verwandte jeder der eben erwähnten Verbindungen ein.
  • Diese p38-MAPK-Inhibitoren können durch mehrere verschiedene Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können diese Inhibitoren durch Fischersche Indolsynthese hergestellt werden, wie in Henry et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8: 3335–40 (1998) beschrieben. Siehe auch Gallagher et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5(1): 49–64 (1997) und Henry et al., J. Med. Chem. 22: 4196–8 (1998).
  • Assay zum Behandeln von Glaukom
  • Als Modell für das Studieren der Behandlung des Glaukoms wurden beschädigte (axotomisierte), retinale Ganglienzellen verwendet. Genauer verursacht das Durchschneiden des Sehnervs nahe dem Zellkörper den apoptotischen Tod von retinalen Ganglienzellen (RGCs), ähnlich dem, der im Glaukom festgestellt wird. In erwachsenen Ratten wurden RGCs mit Fluoro-GoldTM (d.h., Hydroxystilbamidin) retrograd markiert, das in die Colliculi superior injiziert wurde. Drei Tage später wurde der linke Sehnerv 1 mm vom Bulbus oculi intraorbital durchgeschnitten. Einen Tag nach der Axotomie wurde keine bemerkenswerte Änderung im Fluoreszenzmuster von RGCs gesehen, verglichen mit dem von Kontrollen. Die RGC-Dichte, wie durch mehrere fluoreszenzmarkierte Zellen geprüft, begann zwischen 4 und 7 Tagen nach der Axotomie zu sinken. Bei 14 Tagen schien eine wesentliche Anzahl von fluoreszenzmarkierten RGCs verloren worden zu sein. Morphologisch manifestierte in vollständig angebrachten Retinae, die mit Cresylviolett gefärbt wurden, eine Ganglienzellschicht (GCL) von unverletzten Kontrollretinae keine apoptotischen Profile oder pyknotischen Kerne. Im Gegensatz dazu wurden 10 Tage nach der Axotomie multiple degenerierende Zellkörper mit pyknotischen Kernen in der GCL ersichtlich, und die Zelldichte in dieser Schicht schien stark vermindert zu sein. Als die Hydroxystilbamidin-Fluoreszenz in der GCL quantitativ bestimmt wurde, betrug in unverletzten Kontrollretinae die mittlere RGC-Dichte 2533 ± 104 Zellen/mm2 (Mittelwert ± Standardabweichung). Innerhalb von 14 Tagen nach der Axotomie nahm die mittlere RGC-Dichte auf 348 ± 107 (14% der Kontrolle) ab. Siehe 5.
  • Einen Tag nach der Axotomie wurde das aktivierte (diphosphorylierte) p38 durch Immunhistochemie in der RGC-Schicht, aber nicht in den Kontrollretinae sichtbar gemacht. Durch Westernblot wurde p38 zuerst 12 Stunden nach der Axotomie detektiert, und erreichte bei 24 Stunden ein Maximum, bevor es abnahm. SB 203580 wurde zum Zeitpunkt der Axotomie intravitreal verabreicht, und bei 5 Tagen und 10 Tagen wiederholt.
  • 14 Tage nach der Axotomie geprüft, erhöhte SB 203580 die Anzahl der überlebenden RGCs auf eine dosisabhängige Art und Weise. Siehe 6. Ein wesentlicher Grad an Neuroprotektion wurde nach der Injektion von höchstens 0,2 nmol SB 203580 beobachtet, was einer intravitrealen Konzentration von 1,6 μM entspricht, vorausgesetzt, es ist berichtet worden, dass das Volumen des Rattenglaskörpers ~120 μl beträgt. SB 203580 (10 nmol) erhöhte die Anzahl an überlebenden RGCs von 348 auf 1.347 Zellen/mm2 14 Tage nach der Axotomie (Kontrolle: 2.511 Zellen/mm2).
  • Um zu bestimmen, ob die Glutamatneurotoxizität über die Aktivierung des NMDA-Rezeptors die Apoptose über den p38-Signalweg in RGCs bewirken könnte, wurden die Wirkungen von SB 203580 auf die NMDA-induzierte RGC-Apoptose in vitro untersucht. Mit Bezug auf 7 erhöhte die Behandlung mit 1 μM SB 203580 das Überleben von RGCs angesichts einer NMDA-Einwirkung, die in der Lage ist, Apoptose zu bewirken, wesentlich.
  • Diese Feststellung legte nahe, dass die p38-Aktivierung bei der RGC-Apoptose, die durch den NMDA-Rezeptor vermittelt wurde, eingeschlossen ist.
  • Die Wirkung auf die Axotomie des nichtkompetitiven NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK801 wurde auch in vivo untersucht. MK801 wurde auf dieselbe Art und Weise wie SB 203580 in den Glaskörper injiziert. Mit Bezug auf 8 erhöhte MK801 nicht nur die Anzahl der überlebenden RGCs 14 Tage nach der Axotomie, sondern inhibierte auch die p38-Phosphorylierung/Aktivierung auf eine dosisabhängige Art und Weise. Die Zugabe von SB 203580 zu MK801 bot in diesem Beispiel keinen weiteren Schutz über den von MK801 alleine hinaus.
  • Ausführliche Verfahren zum Durchführen der vorstehend beschriebenen Experimente werden nachstehend aufgezeigt.
  • Retrogrades Markieren von retinalen Ganglienzellen. Erwachsene männliche Long-Evans-Ratten, die 200 bis 250 g wiegen, wurden von einem lokalen Züchter erhalten und wurden für alle experimentellen Handhabungen mit 1–2% Isofluran und 70% N2O betäubt. RGCs wurden retrograd mit Hydroxystilbamidin (Molecular Probes, Eugene, OR, auch bekannt als Fluoro-GoldTM) markiert, um genaues Zählen der Zellkörper zu erlauben, wie in Vorwerk et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40: 813–816 beschrieben. Die Ratten wurden betäubt und in ein kleines stereotaktisches Instrument gelegt. Der Schädel wurde freigelegt und trocken gehalten. Das Bregma wurde identifiziert und markiert, und ein kleines Fenster wurde oberhalb der rechten Hemisphäre gebohrt, wobei die Dura intakt gelassen wurde. Unter Verwendung einer stereotaktischen Messvorrichtung und einem Hamiltoninjektor wurde Hydroxystilbamidinlösung in vier (4) Regionen des rechten Colliculus superior injiziert, wobei die folgenden Koordinaten vom Bregma verwendet wurden (anterior-posterior; medio-lateral; Tiefe, alle aufgeführt in mm): (1) –5,8, +1,0, –4,4; (2) –6,5, +0,7, –4,0; (3) –6,5, +1,0, –4,0; und (4) –7,3, +1,5, –3,7.
  • Axotomie. Die Sehnerv-Axotomie wurde am linken Auge 4 Tage nach dem retrograden Markieren durchgeführt. Nach Inzision der Conjunctiva dorsolateralis wurde der laterale Augenmuskel durchgeschnitten, und der Sehnerv wurde unter einem stereoskopischen Mikroskop freigelegt. Der Sehnerv wurde dann in einem Abstand von etwa 1 mm vom Bulbus oculi durchgeschnitten. Während der Operation wurde darauf geachtet, dass Schaden an der retinalen Blutzuführung vermieden wird.
  • Arzneistoffanwendung. Intravitreale Injektionen wurden im Anschluss an eine Pupillenerweiterung mit 1% Atropinsulfat mit einer 33 Gauge-Nadel durchgeführt, die an einer 25 μl-Spritze angebracht war. Die Spitze der Nadel wurde durch den dorsalen Limbus des Auges unter stereomikroskopischer Sichtbarmachung eingeführt. Die Injektionen wurden über einen Zeitraum von 1 Minute abgeschlossen. Intravitreale Injektionen von SB 203580 (Calbiochem, San Diego, CA), MK801 (Research Biochemicals International, Natick, MA) oder Kontrolllösungen (als gleiches Volumen von Kochsalzlösung-Verdünnungsmittel) wurden an operierten Augen sofort nach der Axotomie durchgeführt und 5 und 10 Tage nach der Axotomie wiederholt.
  • Quantifizierung von Überleben und Histologie von axotomisierter RGC. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Ratten eine Überdosis Pentobarbital gegeben, und die Augen wurden entfernt. Die Retina wurde vorsichtig vom Auge seziert, als flacher ganzer Objektträger in einer 4% Paraformaldehyd-Lösung präpariert und durch Epifluoreszenzmikroskopie auf gefärbte Ganglienzellen untersucht, um die Dichte zu bestimmen. Die Anzahl an überlebenden RGCs in experimentellen und Kontrollretinae wurde durch Zählen von hydroxystilbamidin-markierten Neuronen in drei Standardbereichen von jedem Netzhautquadranten bei einem Sechstel, der Hälfte und fünf Sechstel des retinalen Radius bei einer Gesamtfläche von 2,25 mm2 bestimmt, wie in Kermer et al., J Neurosci 18: 4656–4662 (1998) beschrieben. RGC-Überlebensdaten aus jeder Gruppe von Tieren werden als die mittlere Dichte (RGCs/mm2) und Standardabweichung für n = 3 bis 6 Retinae dargestellt. Statistische Bedeutung der Daten wurde durch eine Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Dunnett's-Post-hoc-Test bestimmt. Für die histologischen Untersuchungen wurden retinale ganze Objektträger präpariert und mit dem Verfahren von Nissl unter Verwendung von Cresylviolett (0,1%) gefärbt.
  • Immunhistochemie. Nach Enukleation wurden die Augen bei 4°C in Fixiermittel eingetaucht, das aus 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) bestand. 10 Minuten später wurden die Augen im Fixiermittel hemiseziert, und das vordere Segment, die Linse und der Glaskörper wurden verworfen. Das restliche hintere Augenschälchen wurde über Nacht bei 4°C in frischer Fixierlösung gehalten. Das Augenschälchen wurde dann in Paraffin eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden mit einem Mikrotom geschnitten und auf Gelatine-überzogene Objektträger überführt. Nach Rehydratisierung wurden die Schnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Methanol behandelt, um die Membrandurchlässigkeit zu erhöhen, gefolgt von 4% Wasserstoffperoxid 1 Stunde lang, um die intrinsische Peroxidaseaktivität zu blockieren. Dann wurden die Schnitte 1 Stunde lang mit 20% normalem Ziegenserum (NGS) inkubiert. Nach dem Ausspülen wurden die Schnitte über Nacht bei 4°C in PBS mit 0,3% Triton-X 100, 1% NGS und einem der folgenden spezifischen Antikörper inkubiert: 1:1000 Anti-p38α-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), 1:250 Anti-phospho-spezifischer p38 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA) oder 1:50 Anti-Ratte-ED1-Antikörper (Serotech, UK). Die Schnitte wurden dann mit biotinyliertem Anti-IgG (Sigma Immunochemicals) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Farbentwicklung wurde mit einem Vektor AEC-Substratkit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) oder mit einem Sigma Fast DAB-Kit durchgeführt. Wenn die Immunreaktivität ausschließlich auf den Kern beschränkt war, wurde Gegenfärben benötigt, um Zellsomata zu definieren, und Meyer-Hämatoxylin wurde verwendet.
  • Immunoblot. Retinae wurden in Natriumdodecylsulfat(SDS)-probenpuffer (2% SDS, 0,6% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 50 mM Tris, pH 7,2) homogenisiert und zentrifugiert. Nach Schätzung der Proteinkonzentration im Überstand mit einem BIO-RAD ProteinassayTM (Bio-Rad Lab., Hercules, CA) wurden Aliquots, die 70 μg Protein enthalten, durch SDS-PAGE getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran überführt (Hybond ECL, Amercham Pharmacia Biotech, UK). Die Membranen wurden dann mit 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl und 0,1% Tween 20, das 5% fettfreie Milch enthält, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt. Membranen wurden mit 1:1500 Anti-p38α-Antikörper, 1:200 Anti-p38β-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) oder 1:500 Anti-phospho-spezifischer p38 gemäß den Anleitungen des Herstellers untersucht. Die Antikörper-reaktiven Banden wurden durch Chemolumineszenzdetektion (ECL western detection kit, Amercham Pharmacia Biotech UK, Limited) sichtbar gemacht.
  • Retinale Zellkulturen. Retinale Zellen wurden aus 6–10 Tage alten Long-Evans-Ratten hergestellt, wie in Leifer et al., Science 224: 303–306 (1984) beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurden retinale Zellen im Anschluss an die Dissoziation in Papain auf Poly-L-lysin-beschichtete Deckgläser in Eagle's essentiellem Minimalmedium (Eagle's minimum essential medium) plattiert. RGCs wurden durch immunzytochemische Färbung unter Verwendung eines Anti-Thy-1-Antikörpers (2G12), welcher unter retinalen Rattenzellen für die Ganglienzellen spezifisch ist, identifiziert.
  • Einschätzung von NMDA-induzierter Apoptose in gezüchteten RGCs. Um hauptsächlich Apoptose zu induzieren (siehe Bonfoco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7162–7166 (1995); Dreyer et al., Neuroreport 6: 942–944 (1995)), wurden retinale Zellkulturen 18 Stunden lang 300 μM NMDA/5 μM Glycin in hohem Calciummedium (3 mM) ausgesetzt. Für eine spezifische Markierung von RGCs wurden die Kulturen mit Anti-Thy-1-Antikörper 1 Stunde lang inkubiert. Im Anschluss an dreimal Waschen mit PBS wurden die Zellen in Ziege-anti-Maus-IgG-FITC 1 Stunde lang inkubiert. Zur Einschätzung der Apoptose wurden die retinalen Zellen fixiert, durchlässig gemacht und 5 Minuten lang mit 20 μg/ml Propidiumiodid gefärbt, wie in Ankarcrona et al., Neuron 15: 961–973 (1995) beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurden die Deckgläser, die die Zellen enthalten, einmal mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit 85% Methanol durchlässig gemacht. Nach einer weiteren Wäsche mit PBS, wurden die Deckgläser 5 Minuten lang in Aceton fixiert und anschließend 5 Minuten lang mit Propidiumiodid im Dunkeln gefärbt. Die Deckgläser wurden dann auf Objektträger in Glyzerin:PBS (1:1) angebracht und unter Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Apoptotische Kerne wurden in Zellen gezählt, die auch durch Anti-Thy-1 gefärbt und als ein Anteil der Gesamt-RGCs exprimiert wurden.
  • Der p38-MAPK-Inhibitor kann unter Verwendung eines pharmazeutischen Trägers (z.B. physiologischer Kochsalzlösung) in eine pharmazeutische Zubereitung eingeschlossen werden; die genaue Formulierung des therapeutischen Gemisches hängt von dem Weg der Verabreichung ab, z.B. oral, parenteral (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan), intravitreal, topisch in das Auge eingeträufelt, intrazerebroventrikulär oder intrathekal.
  • Beispiele von parenteralen Dosierungsformen schließen wässrige Lösungen des Wirkstoffs in einer isotonischen Kochsalzlösung, 5% Glukose oder einen anderen bekannten pharmazeutisch verträglichen Excipienten ein. Solubilisierende Mittel, wie Cyclodextrine, oder andere solubilisierende Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, können als pharmazeutische Excipienten zur Abgabe der therapeutischen Verbindungen verwendet werden. Zur oralen Verabreichung kann die p38-MAPK-Inhibitor-Zusammensetzung in einer Kapsel, einer Geldichtung oder einer Tablette formuliert sein. Kapseln können jedes pharmazeutisch verträgliche Standardmaterial, wie Gelatine oder ein Cellulosederivat, umfassen. Tabletten können gemäß dem herkömmlichen Verfahren durch Zusammenpressen von Gemischen der p38-MAPK-Inhibitoren und eines festen Trägers und einem Gleitmittel formuliert werden. Beispiele von festen Trägern schließen Stärke- und Zuckerbentonit ein. Der p38-MAPK-Inhibitor kann auch in einer Form einer Hartschalentablette oder -kapsel, die zum Beispiel Laktose oder Mannit als Bindemittel und einen herkömmlichen Füllstoff und ein Tablettenmittel enthalten, verabreicht werden. Für Zusammensetzungen, die an die Augen abgegeben werden sollen, können topische Formulierungen verwendet werden und können ophthalmologisch verträgliche Konservierungsmittel, oberflächenaktive Mittel, Viskositätsverstärker, Puffer, Natriumchlorid und Wasser einschließen, um sterile Augenlösungen und -suspension zu erzeugen. Eine wirksame Menge eines p38-MAPK-Inhibitors ist als die Menge der Verbindung definiert, welche bei Verabreichung an einen Patienten, der diese benötigt, dem behandelten Patienten eine therapeutische Wirkung verleiht. Die wirksame Menge, die an einen Patienten zu verabreichen ist, beruht typischerweise auf Alter, Fläche, Gewicht und Zustand des Patienten. Die Wechselwirkung von Dosierungen für Tiere und Menschen (bezogen auf Milligramm pro Quadratmeter Körperoberfläche) ist von Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219 beschrieben. Die Körperoberfläche kann ungefähr aus der Größe und dem Gewicht des Patienten bestimmt werden. Siehe z.B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537. Eine wirksame Menge eines p38-MAPK-Inhibitors kann im Bereich von etwa 1–10.000 mg/kg (z.B. etwa 1–500 mg/kg) liegen. Wirksame Dosen variieren auch, wie vom Fachmann erkannt, die vom Weg der Verabreichung, von der Excipientenverwendung und von der Möglichkeit der Coverwendung mit anderen therapeutischen Behandlungen abhängig sind. Figurenbeschreibung FIG. 1
    Neuroal apotosis = Neuronale Apoptose
    Control = Kontrolle
    Fig. 2
    Neuronal apoptosis = Neuronale Apoptose
    Control = Kontrolle
    Fig. 3
    Neuronal apoptosis = Neuronale Apoptose
    Nitrite = Nitrit
    Cytokines = Zytokine
    Fig. 4
    Neuronal apoptosis = Neuronale Apoptose
    Control = Kontrolle
    Fig. 5
    Days after axotomy = Tage nach Axotomie
    Fig. 6
    Cells = Zellen
    Axotomy = Axotomie
    Fig. 7
    Apoptosis = Apoptose
    Control = Kontrolle
    Fig. 8
    Cells = Zellen
    Control = Kontrolle
    Axotomy = Axotomie

Claims (10)

  1. Verwendung eines mitogen-aktivierten Proteinkinase-p38(MAPK)-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an Glaukom, optischer Neuropathie, optischer Neuritis, retinaler Ischämie, Laser induziertem optischen Schaden oder Chirurgie oder Trauma induzierter proliferativer Vitreoretinopathie leidet; eines Patienten, der an neuronaler Verletzung oder Apoptose leidet, die retinale Ganglienzellen involviert; oder eines Patienten, der an einem medizinischen Zustand leidet, der nitrosativen oder oxidativen Stress an Ganglienzellen durch übermässige Aktivierung von anregenden Aminosäurerezeptoren oder der Generierung freier Radikale verursacht.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der p38-MAPK-Inhibitor der folgenden Formel ist:
    Figure 00200001
    wobei A N oder CRα ist, und jedes Rα, Ra, Rb und Rc, unabhängig, Hydrogen, Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Amid, Halo, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl ist, jedes Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl und Heteroaryl optional durch Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Alkylsulfinyl oder Halo substituiert wird; Rc und Rd sich optional verbinden, um Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Heteroaryl zu bilden, wovon jedes optional durch Alkyl, Hydroxyl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Thio, Amino, Amid, Carboxyl, Ester, Alkylsulfinyl oder Halo; oder einem Salz davon substituiert wird.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei A N ist und Ra Hydrogen, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl oder Heteroaralkyl ist.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei A N ist und Rb Hydrogen, Aryl oder Heteroaryl ist.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei Rb Phenyl, an der 4-Position durch Alkoxy, Alkylsulfinyl, Halo oder Amino substituiert, ist.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei A N ist und Rc Hydrogen, Aryl oder Heteroaryl ist.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei Rc Phenyl, substituiert durch Alkoxy, Alkylsulfinyl, Halo oder Amino, ist.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei A N ist und Rd 4-Pyridyl, vorzugsweise nichtsubstituiert, ist.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei A CRα ist und sich Rc und Rd verbinden, um Heteroaryl zu bilden, das optional durch Alkyl, Alkoxy, Aryloxy, Amino oder Halo substiotuiert wird.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der P38-MAPK-Inhibitor 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-Methylsulfinylphenyl)-S-(4-Pyridyl)-IH-Imidazol, 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-Hydroxylphenyl)-5-(4-Pyridyl)-IH-Imidazol, 5-(2-Amino-4-Pyrimidinyl)-4-(4-Fluorophenyl)-1-(4-Piperidinyl)-IH-Imidazol, 2-Methyl-4-Phenyl-5-(4-Pyridyl)Oxazol, SmithKline French Droge Nr. SKF-104,351, 6-(4-Fluorophenyl)-2,3-Dihydro-5-(4-Pyridyl)-Imidazo-[2,1-b]-Thiazole, 6-Amino-2-(4-Fluorophenyl)-4-Methoxy-3-(4-Pyridyl)-IH-Pyrrolo[2,3-b]Pyridin, oder 1-(4-Piperidinyl)-4-(4-Fluorophenyl)-5-(4-Pyridyl)-1H-Imidazol ist.
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