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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung von Nicergoline zur Herstellung eines Arzneimittels, das
zur Prävention
und/oder Behandlung von motoneuronalen Erkrankungen bestimmt ist.
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Nicergoline oder (8β)-10-Methoxy-1,6-dimethylergolin-8-methyl-5-bromnicotinat
(Sermion®)
weist insbesondere α-blockierende, α2-adrenolytische
Eigenschaften (CARPENE C. et al., J. Pharmacol, 14, 57–66 (1983)),
antiischämische
Eigenschaften (CAHN R. et al., Chem. Abstracts, 107, 228784x (1987);
UEDAT et al., Chem. Abstracts, 118, 225224f (1993)), Antikalk-Eigenschaften
(TAKAHASHI K. et al., Br. J. Pharmacol., 100, 705–710 (1990)),
Antioxidans-Eigenschaften (TANAKA M. et al., Neurosci. Let., 248,
67–72
(1998)), antithrombotische Eigenschaften (Chem. Abstracts 105, 54314K
(1986)) auf. Es verbessert das Lernvermögen des Gedächtnisses (Chem. Abstracts,
113, 52358u (1990); Chem. Abstracts, 111, 108396h, 1989; Chem. Abstracts, 109,
86208c, 1988; Chem. Abstracts, 106, 12788e, 1987; Chem. Abstracts,
115, 198237s, 1991).
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Es wurde nun gefunden, dass Nicergoline
das Überleben
der Motoneuronen verbessert und somit in der Prävention und/oder Behandlung
von motoneuronalen Erkrankungen verwendet werden kann.
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Die motoneuronalen Erkrankungen umfassen
die amyotrophe Lateralsklerose, die progressive spinale Muskelatrophie,
die Kindermuskelatrophie, die primäre Lateralsklerose.
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In Gegenwart eines trophischen Trägers, der
durch die neurotrophen Faktoren BDNF oder GDNF bereitgestellt wird,
bestehen die Kulturen von Motoneuronen aus großen und homogenen Neuronen
mit langen verzweigten Neuriten. Dagegen sterben die Mo toneuronen
durch Apoptose, wenn die Kultur in Abwesenheit eines trophischen
Trägers
durchgeführt
wird.
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Die Wirkung von Nicergoline wurde
in einem Degenerationsmodell, induziert durch Entzug des neurotrophen
Faktors bei den Motoneuronen in Kultur, bestimmt.
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Darüber hinaus spielen die Astrozyten
bei der Kontrolle und Aufrechterhaltung einer für das motoneuronale Überleben
adäquaten
Umgebung eine Hauptrolle.
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Nicergoline wurde gleichermaßen auf
eine Cokultur von Motoneuronen und Astrozyten untersucht.
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Die verwendeten Protokolle sind die
folgenden:
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KULTUREN, DIE MIT MOTONEURONEN
ANGEREICHERT SIND:
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Die Kulturen, die mit Motoneuronen
angereichert sind, werden unter Verwendung des Zentrifugationsverfahrens,
das von R. L. SCHNAAR und A. E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204–217 (1981)
beschrieben wurde und von W. CAMU und C. E. HENDERSON, J. Neurosci.
Methods, 44, 59–70
(1992) modifiziert wurde, hergestellt. Auf Kulturplatten, die vorher
nach dem Verfahren von A. G. ESTEVEZ et al., J. Neurosci., 18 (3), 923–931 (1998)
mit Laminin/Ornithin überzogen
worden waren, werden die Motoneuronen in einer Dichte von 2.500
Zellen pro Platte mit 35 mm ausgebreitet. Die Kulturen werden dann
in L15-Medium (GIBCO BRL) gehalten, das Natriumbicarbonat (22 mM),
Conalbumin (0,1 mg/ml), Putrescin (0,1 mM), Insulin (5 μg/ml), Natriumselenit
(31 nM), Glucose (20 mM), Progesteron (21 nM), Penicillin (100 IE/ml)
und Streptomycin (100 μg/ml) enthält.
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Die so erhaltenen Motoneuronen bestehen
aus großen
und homogenen Neuronen (25 bis 30 μM) mit langen verzweigten Neuriten.
Mehr als 70% der Zellen sind gegenüber dem Neurotro phinrezeptor
p75 und den Inselmarkern 1/2 für
die spinalen Motoneuronen immunreaktiv. Etwa 70% der Motoneuronen
sterben 24 h nach der Ausbreitung durch Apoptose, wenn die Kultur
in Abwesenheit von trophischem Faktor durchgeführt wird.
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KULTUR VON RÜCKENMARKS-ASTROZYTEN
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Die Astrozyten werden von jungen
Ratten mit einem Alter von 1 Tag nach dem Verfahren von R. P. SANETO
und J. DE VELLIS in Neurochemistry a practical approach (A. J. TURNER
und H. S. St. JOHN) IRL Press, Oxford-Washington DC, S. 27–63, das
leicht modifiziert war, erhalten. Das Rückenmark wird steril seziert,
von Hirnhaut und dorsalen Ganglinnen befreit. Fünf bis zehn Rückenmark
werden in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) transferiert und vor
Inkubation bei 37°C
für 25
min in PBS, der man 0,25% Trysin zugesetzt hatte, abgeschnitten.
Die enzymatische Behandlung wird durch Zusatz von 10 ml modifiziertem
Dulbecco-Eagle-Medium (DMEM), dem 10% fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt war,
gestoppt; die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt. Eine
andere Stufe der mechanischen Dissoziation wird durchgeführt, indem das
Ende einer 1 ml-Pipette verwendet wird. Die Zellen werden mit einer
Dichte von 1,5-2 × 106 Zellen pro 25 cm2 Kulturmedium in DMEM
mit 10% FCS ausgebreitet. Nach 2 Tagen in vitro erhalten die Kulturen
täglich Nahrung.
Sobald eine Monolayer aus Zellen vollendet ist, werden die Kulturen
48 h mit 250 U/min bewegt und am nächsten Tag werden die Monolayer
für 48
h mit Cytosinarabinosid (10–5 M) behandelt. Die
Astrozyten-Monolayer werden dann zu einer Dichte von 5 auf den Kulturplatten
mit 35 mm für
Kulturflaschen mit 25 cm2 zu Beginn amplifiziert.
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Die Kulturen von spinalen Astrozyten
bestehen zu mehr als 98% aus polygonalen flachen Zellen, die gegenüber dem
sauren fibrilären
Gliaprotein (GFAP) immunreaktiv sind. Die Monolayer werden dem zu
untersuchenden Produkt ausgesetzt und dann mit dem motoneuronalen
Medium unter Erhalt eines konditionierten Kulturmediums inkubiert.
Dieses Medium wird transfe riert und mit verschiedenen Verdünnungen
untersucht, um seine Wirkungen auf das neuronale Überleben
zu bestimmen.
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IMMUNCHEMIE
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Die Zellen werden mit 4% para-Formaldehyd
und 0,1% Glutaraldehyd in PBS (pH 7,4 bei 4°C für 15 min) und in einer kalten
methanolischen Lösung
fixiert. Die Kulturen werden dann gewaschen und die nicht-spezifischen
Stellen mit 10 Ziegenserum und 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS
blockiert und immunochemisch behandelt, indem die Antikörper gegen
den Neurotrophinrezeptor mit schwacher Affinität p75 verwendet werden oder
ein Neurofilamentprotein 200 kD (Amersham) verwendet wird, wobei
den Instruktionen des Herstellers Folge geleistet wurde und die
Amplifizierungsreaktion Avidin-Biotin-DAB/Wasserstoffperoxid angewendet
wird.
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BEHANDLUNG DER
ASTROZYTEN MIT NICERGOLINE
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Die Behandlung der Astrozyten mit
Nicergoline wird wie folgt beschrieben durchgeführt: Das Produkt wird in Methanol
gelöst,
durch Filtration sterilisiert und unverzüglich nach der Herstellung
verwendet. Die Behandlung, die auf mit Motoneuronen angereicherte
Kulturen angewendet wird, erfolgt durch Zusatz von Aliquots der
zu untersuchenden Produkte in Lösung
im Milieu L15 durch Ausbreitung. Die Astrozyten-Monolayer werden
dem Vehikel oder Lösungen
der zu testenden Verbindung 24 h lang und bei unterschiedlichen
Konzentrationen ausgesetzt. Die Astrozyten-Monolayer werden dreimal
mit DMEM gewaschen und mit dem vollständigen Medium L15 inkubiert.
Das konditionierte Astrozytenmedium wird 24 h später aufgenommen und mit 1.800
g 15 min lang zentrifugiert und unverzüglich verwendet oder maximal
2 Wochen bei –70°C ohne Verlust an
trophischer Aktivität
konserviert.
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ZÄHLUNG DER ZELLEN UND STATISTISCHE
ANALYSE
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Die für die Neurofilamente immunreaktiven
Zellen, die längere
Neuriten als der Durchmesser der Zellen aufweisen, werden als lebende
Motoneurone angesehen. Die Zahl der Motoneuronen wird durch Zählung der
markierten Zellen auf einer Oberfläche von 0,4-1 cm2 unter
dem Mikroskop mit 200-facher Vergrößerung beurteilt. In jedem
Fall werden die Werte als prozentualer Wert der Anzahl der Motoneuronen,
die in den Kulturen, welche mit den trophischen Faktoren am Leben
gehalten wurden, vorlagen, angegeben. Die Experimente werden mindestens
dreimal durchgeführt.
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Die statistischen Analysen werden
unter Verwendung des Studenten-Tests (t-Test) durchgeführt.
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Die erhaltenen Resultate sind die
folgenden:
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1 – Wirkung
von Nicergoline auf das motoneuronale Überleben in Cokulturen Astrozyten/Motoneuronen:
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Diese Resultate beweisen, dass Nicergoline
bei einer Konzentration von 10 μM
das motoneuronale Überleben
im Vergleich zu Cokulturen, die nur mit dem Vehikel behandelt worden
waren, um 63,7% erhöht.
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2 – Neurotroph-artige Wirkung
von Nicergoline auf den neuronalen Tod in Kulturen, die mit Motoneuronen
angereichert sind und denen tropher Faktor fehlt:
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In diesem Test erhöht Nicergoline
das Überleben
der Motoneuronen um 13% (p < 0,05).
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Die vorliegende Erfindung betrifft
auch die Verwendung von Nicergoline zur Herstellung eines Arzneimittels,
das zur Behandlung von motoneuronalen Erkrankungen und insbesondere
von amyotropher Lateralsklerose, progressiver spinaler Muskelatrophie,
Kindermuskelatrophie, primärer
Lateralsklerose bestimmt ist .
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Nicergoline kann nach dem US-Patent
3,228,943 hergestellt werden.
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Die Arzneimittel bestehen wenigstens
aus Nicergoline in reinem Zustand oder in Form einer Zusammensetzung,
in der es mit einem anderen pharmazeutisch verträglichen Produkt, das inert
oder physiologisch aktiv sein kann, kombiniert ist. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel
können
insbesondere auf oralem oder parenteralem Weg verabreicht werden.
Als feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können Tabletten,
Pillen, Pulver (Gelatinekapseln, Briefchen) gefriergetrocknete,
oral verabreichbare Mittel (Lyoc®)
oder Granulat verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen wird
der Wirkstoff mit einem oder mehreren inerten Verdünnungsmitteln
wie Amidon, Weinsäure,
Gummiarabikum, Natriumsaccharin, Vanillin, Cellulose, Saccharose,
Lactose oder Siliciumdioxid unter einem Argonstrom vermischt. Diese
Zusammensetzungen können auch
andere Substanzen als die Verdünnungsmittel
enthalten, z. B. ein oder mehrere Gleitmittel wie Magnesiumstearat
oder Talk, ein Färbemittel,
ein Überzugsmittel
(Dragees) oder eine Glasur.
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Als flüssige Zusammensetzung zur oralen
Verabreichung kann man Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen, Sirupe und Elixiere verwenden, die pharmazeutisch
annehmbar sind und inerte Verdünnungsmittel
wie Wasser, Ethanol, Glycerin, pflanzliche Öle oder Paraffinöl enthalten.
Diese Zusammensetzungen können
andere Substanzen als Verdünnungsmittel
umfassen, z. B. schäumende
Produkte, süßende Produkte,
verdickende Produkte, aromatisierende Produkte oder Stabilisatoren.
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Die sterilen Zusammensetzungen zur
parenteralen Verabreichung können
vorzugsweise wässrige oder
nicht-wässrige
Lösungen,
Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösungsmittel oder Vehikel kann
man Wasser, Propylenglykol, ein Polyethylenglykol, Pflanzenöle, insbesondere
Olivenöl,
organische injizierbare Ester wie z. B. Ethyloleat, oder andere
zweckdienliche organische Lösungsmittel
verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien, insbesondere
Netzmittel, Isotonisiermittel, Emulgiermittel, Dispergiermittel
und Stabilisatoren sein. Die Sterilisation kann auf mehrere Arten
erfolgen, z. B. durch aseptisierende Filtration, durch Einarbeitung
von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzung, durch Bestrahlung
oder durch Erhitzen. Sie können
auch in Form von festen sterilen Zusammensetzungen hergestellt werden,
die zum Zeitpunkt der Verwendung in sterilem Wasser oder in jedem
anderen injizierbaren sterilen Milieu gelöst werden können.
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FORMULIERUNGSBEISPIELE:
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Kapseln: 5 mg Nicergoline und als
Exzipientien Talk, Lactose und Magnesiumstearat;
orales Lyophilisat:
5 mg Nicergoline und als Exzipientien Weinsäure, Lactose, Gummiarabikum,
Natriumsaccharin und Vanillin;
Pulver zur parenteralen Verwendung:
5 mg Nicergoline und als Exzipientien Weinsäure und Lactose;
die Dosierungen
hängen
von der gewünschten
Wirkung, der Dauer der Behandlung und dem verwendeten Verabreichungsweg
ab; sie umfassen im allgemeinen 30 bis 100 mg pro Tag bei oraler
Verabreichung an einen Erwachsenen mit Dosiseinheiten von 5 bis
20 mg Wirkstoff.
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Der Arzt wird ganz allgemein die
geeignete Posologie als Funktion des Gewichts und anderen Faktoren,
die der zu behandelnden Person eigen sind, bestimmen.
