CH689541A5

CH689541A5 - Inhibitoren der Enzymaktivität von Rotamase.

Info

Publication number: CH689541A5
Application number: CH02789/96A
Authority: CH
Inventors: P Steiner Joseph
Original assignee: Guilford Pharm Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-06-15
Also published as: LV11986B; EE9700331A; HUP9900816A3; LV11986A; US6022878A; DE19680255T1; BG102072A; US5696135A; CA2206824C; SI9620089A; EA199700360A1; NO974290L; BR9608485A; MX9707552A; DK125696A; NO974290D0; US20030114365A1; ES2166740B1; SE9604097L; GB2305605A8

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Verwendung neurotropher Pipecolinsäurederivate mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ als Inhibitoren der mit Immunophilinproteinen assoziierten Enzymaktivität und insbesondere Inhibitoren für die Enzymaktivität von Peptidylprolylisomerase oder Rotamase zur Herstellung eines Arzneimittels.

Stand der Technik

Der Ausdruck Immunophilin bezieht sich auf eine Reihe von Proteinen, die als Rezeptoren für die hauptsächlichen immunsuppressiven Wirkstoffe Cyclosporin A (CsA), FK506 und Rapa mycin dienen. Bekannte Klassen von Immunophilinen sind Cyclophiline und FK506 bindende Proteine wie FKBP. Cyclosporin A bindet an Cyclophilin, während FK506 und Rapamycin an FKBP binden. Diese Immunophilin-Wirkstoff-Komplexe bilden Schnittstellen zu einer Reihe von intrazellulären Signalübertragungssystemen, insbesondere im Immunsystem und dem Nervensystem.

Immunophiline sind dafür bekannt, dass sie eine Peptidylprolylisomerase- (PPIase) oder Rotamaseenzymaktivität besitzen. Es wurde bestimmt, dass die Rotamaseaktivität bei der Katalysierung des wechselseitigen Übergangs vom cis- zum trans-Isomeren bei Immunophilinproteinen eine Rolle spielt.

Immunophiline wurden ursprünglich in Immungewebe entdeckt und untersucht. Es wurde zunächst von den Fachleuten postuliert, dass eine Inhibierung der Rotamaseaktivität der Immunophiline zur Inhibierung der T-Zellenproliferation führt, wodurch die immunsuppressive Wirkung, die immunsuppressive Wirkstoffe wie Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin zeigen, ausgelöst wird. Weitere Studien haben gezeigt, dass die Inhibierung der Rotamaseaktivität, von selbst, für eine immunsuppressive Aktivität nicht ausreichend ist. Siehe Schreiber et al. in Science 1990, 250, 556-559. Stattdessen scheint die Immunsuppression von der Bildung eines Komplexes der immunsuppressiven Wirkstoffe und Immunophiline herzurühren. Es wurde gezeigt, dass die Immunophilin-Wirkstoff-Komplexe in ihrer Wirkungsweise mit ternären Proteintargets in Wechselwirkung treten. Siehe Schreiber et al. in: Cell 1991, 66, 807-815.

Im Falle von FKBP-FK506 und FKBP-CsA binden die Wirkstoff-Immunophilin-Komplexe an das Enzym Calcineurin, was das T-Zellenrezeptorsignal inhibiert, das zur T-Zellenproliferation führt. In gleicher Weise tritt der Komplex aus Rapamycin und FKBP in Wechselwirkung mit dem RAFT1/FRAP-Protein und inhibiert das Signal vom IL-2-Rezeptor.

Es wurde gefunden, dass Immunophiline in hohen Konzentrationen im Zentralnervensystem vorhanden sind. Immunophiline sind im Zentralnervensystem 10- bis 50mal mehr angereichert als im Immunsystem. In neuralem Gewebe scheinen Immunophiline die Stickoxidsynthese, die Neurotransmitterfreisetzung und die Extension von Neuronenfortsätzen zu beeinflussen.

Stickoxid dient im Körper verschiedenen Zwecken. Im Gehirn scheint Stickoxid ein Neurotransmitter zu sein. Es wird aus Arginin durch Stickoxidsynthetase gebildet, die die Guanidingruppe von Arginin oxidiert, wobei sich Stickoxid und Citrullin bilden. Eine Stimulation des N-Methyl-d-aspartat (NMDA) Untertyps von Glutamatrezeptoren aktiviert Stickoxidsynthetase schnell und merklich und stimuliert die Bildung von cGMP. Eine Inhibierung der Stickoxidsynthetase mit Argininderivaten wie Nitroarginin blockiert die durch Glutamat induzierte Erhöhung der cGMP-Werte.

Stickoxidsynthetase ist ein Enzym, das Calcium-Calmodulin erfordert und die Aktivierung des N-Methyl-d-aspartatrezeptors stimuliert die Stickoxidsynthetaseaktivität, da der N-Methyl-d-aspartatrezeptor einen Calciumkanal besitzt, der durch Glutamatstimulierung geöffnet wird, was ermöglicht, dass Calcium in die Zellen kommt und die Stickoxidsynthetase aktiviert.

Glutamat ist ein physiologischer Neurotransmitter. Wenn es jedoch in Überschuss freigesetzt wird, bewirkt es Neurotoxizität über die N-Methyl-d-aspartatrezeptoren. Eine Behandlung von Neuronenkulturen des Zerebralkortex mit Glutamat oder N-Methyl-d-aspartat zerstört bis zu 90% der Neuronen und diese Wirkungen werden durch N-Methyl-d-asparatatantagonisten blockiert. Es wird angenommen, dass diese Neurotoxizität des N-Methyl-d-aspartat einen Hauptfaktor zur Neuronenschädigung nach einem Schlaganfall darstellt. Es tritt daher nach einem zerebralen Gefässverschluss eine massive Freisetzung von Glutamat auf und zahlreiche N-Methyl-d-aspartatantagonisten blockieren Schlaganfallschäden. Die Phosphorylierung der Stickoxidsynthetase inhibiert ihre katalytische Aktivität.

Durch Verstärken der Stickoxidsynthetasephosphorylierung kann FK506 die Stickoxidbildung funktionell inhibieren und auf diese Weise die Glutamatneurotoxizität blockieren. In der Tat können geringe Konzentrationen von FK506 und Cyclosporin A beide die Neurotoxizität von N-Methyl-d-aspartat in Kortexkulturen blockieren. Die vermittelnde Rolle von FKBP ist offensichtlich, da Rapamycin die therapeutische Wirkung von FK506 umkehrt. Vermutlich kann FK506, das schon als immunsuppressiver Stoff vermarktet wird, bei Schlaganfallpatienten klinisch angewendet werden.

FK506 erhöht auch die Phosphorylierung des wachstumassoziierten Proteins 43 (GAP43). GAP43 ist bei der Neuronenfortsatzextension beteiligt und seine Phosphorylierung scheint diese Aktivität zu erhöhen. Dementsprechend wurde die Wirkung von FK506, Rapamycin und Cyclosporin bei der Extension von Neuronenfortsätzen unter Verwendung von PC12-Zellen untersucht. PC12-Zellen sind eine kontinuierliche Linie von neuronenartigen Zellen, die Neuriten ausbilden, wenn sie durch den Nervenwachstumsfaktor (NGF) stimuliert werden.

Überraschend wurde gefunden, dass picomolare Konzentrationen eines immunsuppressiven Stoffes wie FK506 und Rapamycin das Neuritenwachstum aus PC12-Zellen und sensorischen Nervenzellen, insbesondere Rückenmarkswurzelganglienzellen (DRG) stimulieren. Siehe Lyons et al. in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 3191-3195. In Experimenten mit ganzen Tieren wurde gezeigt, dass FK506 die Nervenregeneration nach Gesichtsnervenverletzungen stimuliert und zu einer funktionellen Wiederherstellung bei Tieren mit Ischiasnervenläsionen führt.

Es wurde insbesondere gefunden, dass Wirkstoffe mit einer hohen Affinität für FKBP potente Rotamaseinhibitoren sind und ausgezeichnete neurotrophe Effekte zeigen. Siehe Snyder et al. "Immunophilins and the Nervous System" in: Nature Medicine, Band 1, Nr. 1, Januar 1995, S. 32-37. Diese Ergebnisse legen die Verwendung von Immunsuppressiva zur Behandlung verschiedener Neuropathien des peripheren Nervensystems und zur Verstärkung des erneuten Neuronenwachstums im Zentralnervensystem (CNS) nahe. Untersuchungen haben gezeigt, dass neurodegenerative Störungen wie die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit und amyotrophe laterale Sklerose (ALS) durch einen Verlust oder verminderte Verfügbarkeit einer neurotrophen Substanz, die für eine bestimmte Population von Neuronen spezifisch sind, die von der Störung betroffen sind, auftreten kann.

Es wurden verschiedene neurotrophe Faktoren, die spezifische Neuronenpopulationen im Zentralnervensystem beeinflussen, identifiziert. Es wurde beispielsweise die Hypothese aufgestellt, dass die Alzheimer-Krankheit aus einer Abnahme oder einem Verlust des Nervenwachstumsfaktors (NGF) resultiert. Daher wurde vorgeschlagen, die Alzheimer-Krankheit mit exogenem Nervenwachstumsfaktor oder anderen neurotrophen Proteinen wie dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3 zu behandeln, um das Überleben degenerierender Neuronenpopulationen zu erhöhen.

Eine klinische Anwendung dieser Proteine in verschiedenen Stadien neurologischer Erkrankung ist behindert durch Schwierigkeiten bei der Verabreichung und Bioverfügbarkeit der grossen Proteine für Ziele im Nervensystem. Im Gegensatz dazu sind die immunsuppressiven Wirkstoffe mit neurotropher Aktivität relativ klein und zeigen eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit und Spezifität. Wenn sie jedoch chronisch verabreicht werden, zeigen Immunsuppressiva eine Reihe von potentiell schwerwiegenden Nebenwirkungen einschliesslich Nephrotoxizität wie Beeinträchtigung der glonerulären Filtration und irreversible interstitielle Fibrose (Kopp et al., 1991, in: J. Am. Soc. Nephrol. 1:162), neurologische Ausfälle wie unwillkürlicher Tremor oder unspezifische zerebrale Angina wie nicht lokalisierte Kopfschmerzen (De Groen et al., 1987, in: N. Engl. T.

Med. 317:861) und Bluthochdruck mit den daraus resultierenden Komplikationen (Kahan et al., 1989 in: N. Engl. J. Med. 321:1725).

Die vorliegende Erfindung stellt nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivate zur Verfügung, die FKBP-Rotamase-Inhibitoren mit kleinem Molekül enthalten, die äusserst fähig sind zur Erhöhung des Auswachsens von Neuriten und zum Fördern des Neuronenwachstums und zur Regeneration in verschiedenen neuropathologischen Situationen, wo eine Reparatur von Neuronen erleichtert werden kann wie Schädigung peripherer Nerven durch physische Verletzung oder Krankheitszustände wie Diabetes, physische Schädigung des Zentralnervensystems (Rückenmark und Gehirn), Gehirnschäden in Verbindung mit Schlaganfall und zur Behandlung neurologischer Störungen in Zusammenhang mit Neurodegeneration einschliesslich der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und amyotropher lateraler Sklerose.

Die Erfindung betrifft eine Verwendung neurotropher Pipecolinsäurederivatverbindungen mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ als Inhibitoren für die Enzymaktivität bei Immunophilinproteinen und insbesondere Inhibitoren für die Enzynaktivität von Peptidylprolylisomerase oder Rotamase zur Herstellung eines Arzneimittels.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ zur Herstellung eines Arzneimittels für neurologische Störungen bei einem Tier und zur Stimulierung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven oder zur Förderung der Neuronenregeneration, worin das Immunophilin vom FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigt und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, des Wachstumsfaktors der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neutrotropin-3 zur Herstellung eines Arzneimittels für neurologische Störungen bei einem Tier und zur Stimulierung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven oder zur Förderung der Neuronenregeneration, worin das Immunophilin vom FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigt und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung oder Förderung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven, worin die Immunophiline vom FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigen und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven, worin das Immunophilin von FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigt und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotanaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ an ein Tier zur Förderung der Regeneration und des Wachstums von Neuronen bei Tieren, worin die Immunophiline vom FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigen und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verwendung einer wirksamen Menge eines nicht immunsuppressiven Pipecolinsäurederivats mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung der Neurodegeneration in einem Tier, worin das Immunophilin vom FKBP-Typ eine Rotamaseaktivität zeigt und das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1
Expression von FKBP-12 und GAP-43 im Gesichtskern (-nukleus) nach Nervenquetschung. In situ Hybridisierung zum Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Expression von mRNA im Gesichtskern für FKBP12 (links) und GAP-43 (rechts). Der rechte Gesichtskern liegt auf der gleichen Seite wie die Quetschung und die linke Seite ist eine unbehandelte Kontrolle (Fig. 1B). In situ Hybridisierung für FKBP-12 auf einer unbehandelten Kontrolle (links) und für Calcineurin A alpha , beta 7 Tage nach der Gesichtsnervenquetschung (rechts). Die Versuche wurden mindestens dreimal wiederholt mit ähnlichen Ergebnissen.

Figur 2
Lokalisierung von FKBP-12 an motorischen Neuronen des Gesichts nach Nervenquetschung. Hellfeldmikrophotographien der in situ Hybridisierung für FKBP-12 in motorischen Neuronen des Gesichtskerns 7 Tage nach Quetschung (Fig. 2A) und motorischen Neuronen einer Gesichtskernkontrolle (Fig. 2B).

Figur 3
Regelung der FKBP-12 mRNA in motorischen Neuronen des Lendenrückenmarks nach Quetschung des Ischiasnervs. In situ Hybridisierung für FKBP-12 7 Tage nach Quetschung des rechten Ischiasnervs. Die obere Tafel (Fig. 3A) zeigt die Reaktion der motorischen Neuronen im ventralen Horn des unteren Lendenrückenmarks (durch Pfeil gekennzeichnet). Hellfeldmikroaufnahmen der entsprechenden Pools von motorischen Neuronen sind in den unteren Tafeln gezeigt (Fig. 3B) ist die linke Seite gegenüberliegend der Nervenquetschung, (Fig. 3C) ist die rechte Seite auf der gleichen Seite wie die Nervenquet schung. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt mit ähnlichen Ergebnissen.

Figur 4
Induktion von FKBP und FKBP-12 mRNA im Rückenmarkswurzelganglion 1 und 6 Wochen nach Quetschung des Ischiasnervs. Dunkelfeldmikroaufnahmen von Schnitten durch das Rückenmarkswurzelganglion L4 auf der gleichen Seite wie die Ischiasnervenquetschung behandelt für die FKBP-in-situ-Hybridisierung sind in den linken Tafeln gezeigt und für (<3>H)FK506- Autoradiographie in den rechten Tafeln. Diese Ergebnisse wurden für jeden Zeitpunkt dreimal wiederholt.

Figur 5
Rizinläsion des rechten Gesichtsnervs. Nissl-Anfärbung (untere Tafel, Fig. 5A) zeigt ausgedehnte Degeneration der motorischen Neuronen im rechten Gesichtskern mit einer begleitenden Gliaproliferation 7 Tage nach Injektion von Rizin in den Gesichtsnerv. In situ Hybridisierung für FKBP mRNA 7 Tage nach Rizinläsion des Gesichtsnervs/-kerns ist in der oberen Tafel (Fig. 5B) gezeigt. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt mit ähnlichen Ergebnissen.

Figur 6
(<3>H)FK506-Bindung in Teilstücken des Ischiasnervs 7 Tage nach Quetschung. Das Diagramm zeigt die vom Nerv entnommenen 3 mm grossen Teilstücke: Einschnürungen geben die Positionen der Ligaturen an, die am Tag 7 während der 6 h Versuchszeit angelegt wurden, wie es bei den Verfahren beschrieben ist. Die distale Stelle der Ligatur ist 10 mm neben der ursprünglichen Quetschstelle. Der anterograde Transport von FKBP beträgt 124 mm/Tag. Die Daten sind Mittelwerte +/- mittlere Standardabweichung (n = 3).

Figur 7
Transport von FKBP im Ischiasnerv. Dunkelfeldmikroaufnahmen von Schnitten durch eine Ischiasnerv-Kontrolle (unbehandelt) und eine 7 Tage alte Quetschstelle eines Ischiasnerven behandelt für FKBP-12-in-situ-Hybridisierung (Fig. 7A, Fig. 7B) und für (<3>H)FK506-Autoradiographie (Fig. 7C, Fig. 7D) Pfeile geben die Ansicht der Nervenquetschstelle an. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt mit ähnlichen Ergebnissen.

Figur 8
Ausmass der Bindung von (<3>H)FK506 in PC12-Zellen, die mit und ohne NGF (50 ng/ml) gehalten wurden, für jeden Zeitpunkt ist n = 3. Balken geben die mittlere Standardabweichung an.

Figur 9
Durch Immunsuppressiva vermittelte Verstärkung des Neuritenwachstums in PC12-Zellen. Kontrastmikroaufnahmen nach Hoffman (64) der 48 h in Gegenwart von NGF gewachsenen Kulturen mit oder ohne zugesetztes FK506 oder Rapamycin. Fig. 9A: PC12-Zellen gewachsen in 1,0 ng/ml NGF. Fig. 9B: 50 ng/ml NGF. Fig. 9C: 1,0 ng/ml NGF und 100 nM FK506. Fig. 9D: 1,0 ng/ml NGF und 100 nM Rapamycin. Vergrösserung 200fach.

Figur 10
Einfluss von FK506 auf das Neuritenwachstum in PC12-Zellen. Kulturen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an NGF mit oder ohne 100 nM FK506 behandelt und das Spriessen der Neuriten wurde nach 48 h gemessen. Das Auswachsen wurde wie bei den Verfahren beschrieben quantitativ bestimmt durch Auszählen der Zellen mit Neuritenfortsätzen, die grösser sind als 5 mu m. Es wurden n = 4 einzelne Experimente für jeden Punkt durchgeführt und Fehlerbalken stellen die mittlere Standardabweichung dar.

Figur 11
Der Zusammenhang von Konzentration-Reaktion bei der Potenzierung des Neuritenwachstums in PC12-Zellen durch FK506. Zellen wurden 48 h mit 1 ng/ml NGF und verschiedenen Konzentrationen von FK506 behandelt. Die Reaktion des Neuritenwachstums wurde wie in Fig. 10 und bei Verfahren beschrieben gemessen. Es wurden n = 4 einzelne Experimente für jeden Datenpunkt durchgeführt, *p < 0,001 Student-t-Test.

Figur 12
(<3>H)FK506-Autoradiographie bei Kulturen von Explantaten von Rückenmarkswurzelganglien. Nach 26 Tagen der Kultur mit 100 ng/ml NGF zeigen die ausgedehnten Fortsätze reichlich mit FKBP verbundene Silberkörner. Autoradiographische Körner werden mit 1 mu M unmarkiertem FK506 entfernt.

Figur 13
Phasenkontrastmikroaufnahmen von Rückenmarkswurzelganglien, die mit verschiedenen Substanzen gewachsen sind. Fig. 13A: NGF 100 ng/ml, Fig. 13B: FK506 1 mu M, Fig. 13C: FK506 1 mu M und anti-NGF-Antikörper, Fig. 13D: kein Wachstumsfaktor zugegeben, Fig. 13E: FK506 1 pM, Fig. 13F: FK506 1 mu M und Rapamycin 1 mu M. Der Massstabbalken beträgt 205 mu m. NGF erzeugt reichlich Auswuchs von Axonen (Fig. 13A) ebenso wie 1 mu M FK506 (Fig. 13B). Der Einfluss von FK506 wird durch Reduzieren der Konzentration auf 1 pM (Fig. 13E) wesentlich verringert. Jedoch ist der Auswuchs von Neuriten mit 1 pM FK506 grösser als bei dessen Abwesenheit (Fig. 13D). Die Wirkung von FK506 wird auch durch Zugabe von anti-NGF-Antikörper zur Eliminierung der Wirkung von NGF, das durch nicht neuronale Zellen in den Kulturen erzeugt ist, verringert.

Die zahlreichen Neuriten, die als Reaktion auf NGF (100 ng/ml) (Fig. 13A) oder 1 mu M FK506 (Fig. 13B) in grossen Bündeln auftreten, erscheinen weiss, während kleine Bündel oder einzelne Neuriten schwarz erscheinen. Nicht neuronale Zellen, Schwann-Zellen und einige Fibrobla sten sind mit 1 pM FK506 (Fig. 13E) oder anti-NGF-Antikörper (Fig. 13C) auffälliger als mit 1 mu M FK506 (Fig. 13B). Von nicht neuronalen Zellen in den Kulturen erzeugter NGF führt zu dem begrenzten Axonwachstum, das bei Kulturen ohne zugesetzten Wachstumsfaktor zu sehen ist (Fig. 13D). Die grosse Zahl der lichtbrechenden nicht neuronalen Zellen, die weiss erscheinen, kann leicht die wenigen Neuriten überschatten (Fig. 13D). Rapamycin inhibiert das Axonwachstum in Gegenwart von FK506 völlig (Fig. 13F). Mikroaufnahmen stellen 12-30 Ganglien von jeder Versuchsbedingung dar.

Unterschiede zwischen allen Versuchsgruppen waren in hohem Masse reproduzierbar.

Figur 14
Einfluss von FK506 und Rapamycin auf NGF-vermittelte Neuritenextension in PC12-Zellen. PC12-Zellen (Passage 60) wurden mit verschiedenen Konzentrationen an NGF allein oder in Gegenwart von 100 nM FK506, 100 nM Rapamycin oder 100 nM WAY-124,466 behandelt. Nach 96 Stunden wurde bei Zellen, die Fortsätze von mehr als dem Durchmesser der als positiv erkannten Zellen tragen, das Neuritenwachstum gemessen. Es wurden n = 3 einzelne Experimente für jeden Punkt durchgeführt und Fehlerbalken zeigen die mittlere Standardabweichung an.

Figur 15
Picomolare Konzentrationen von (A) FK506 und (B) Rapamycin und WAY-124,466 potenzieren die durch NGF (0,5 ng/ml) ausgelöste Neuritenextension in PC12-Zellen. PC12-Zellen mit geringer Passage wurden 4 Tage mit 0,5 ng/ml NGF in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an FK506 ( &squ& ), Rapamycin (.) oder WAY-124,466 ( &cir& ) behandelt. Die Neuritenexpression wurde wie oben bei Fig. 14 beschrieben quantitativ bestimmt. Das Ausmass der Neuritenproduktion in Gegenwart von 0,5 ng/ml NGF (bezeichnet mit L) und 50 ng/ml NGF (bezeichnet mit H) ist zum Zwecke des Vergleichs angegeben.

Figur 16
Mikrophotographien von PC12-Zellen behandelt mit Immunophilin-Liganden +0,5 ng/ml NGF selbst oder 50 ng/ml NGF.

Figur 17
Immunophilin-Liganden reduzieren die erforderliche Menge an NGF zur Erzeugung einer maximalen Neuritenextension in sensorischen Ganglien von Hühnern. Ganze Explantate von Rückenmarkswurzelganglien wurden aus 9 bis 10 Tage alten Hühnerembryos isoliert und in mit Matrigel beschichteten 12-Loch-Platten enthaltend L15-Medium plus Glucose, mit 10% fetalem Kalbsserum versetzt mit 10 mu M Ara C Penicillin und Streptomycin bei 37 DEG C in einer Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Sensorische Ganglien wurden mit 1 ng/ml NGF, 1 ng/ml NGF plus 100 nM FK506 oder 100 ng/ml NGF 48 h lang behandelt und Neuronenfortsätze wurden ausgezählt und photographiert.

Figur 18
FK506, Rapamycin und WAY-124,466 potenzieren die NGF-abhängige Neuritenproduktion in sensorischen Ganglien. Explantate von Hühner-DRG wurden wie oben bei Fig. 17 beschrieben kultiviert. FK506, Rapamycin und WAY-124,466 (jeweils 100 nM plus oder minus 0,1 ng/ml NGF) wurden den DRG-Explantatenkulturen zugesetzt. Nach 48 h wurden das Neuritenwachstum quantitativ bestimmt und die Kulturen photographiert.

Figur 19
Mikrophotographie von Beispiel 111 zur Förderung des Neuritenwachstums in Kulturen von Hühnerrükkenmarkswurzelganglien. Die drei Tafeln zeigen Neuritenwachstum bei Konzentrationen von 1 pM (linke Tafel), 100 pM (mittlere Tafel) und 100 nM (rechte Tafel) für Beispiel 111.

Figur 20
Mikrophotographie von Beispiel 17 zur Förderung des Neuritenwachstums in Kulturen von Rückenmarkswurzelganglien. Die drei Tafeln zeigen das Neuritenwachstum bei Konzentrationen von 1 pM (linke Tafel), 100 pM (mittlere Tafel) und 100 nM (rechte Tafel) für Beispiel 17.

Figur 21
Mikrophotographie von Beispiel 102 zur Förderung des Neuritenwachstums in Kulturen von Rückenmarkswurzelganglien. Die drei Tafeln zeigen das Neuritenwachstum bei Konzentrationen von 1 pM (linke Tafel), 100 pM (mittlere Tafel) und 100 nM (rechte Tafel) für Beispiel 102.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die neuen neurotrophen Pipecolinsäurederivatverbindungen gemäss der Erfindung besitzen eine Affinität für FK506-bindende Proteine wie FKBP-12. Es wurde gefunden, dass wenn die erfindungsgemässen neurotrophen Verbindungen an FKBP gebunden werden, inhibieren sie die Aktivität der Prolyl-peptidyl-cis-trans-isomerase oder Rotamaseaktivität des bindenden Proteins und stimulieren unerwarteterweise das Neuritenwachstum.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Form von Salzen verwendet werden, die aus anorganischen oder organischen Säuren und Basen erhalten sind. Unter diesen Säuresalzen befinden sich die folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat.

Basensalze umfassen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-glucamin und Salze mit Aminosäuren wie Arginin, Lysin und so weiter. Es können auch die basischen stickstoffhaltigen Gruppen quaternisiert werden mit Verbindungen wie niederen Alkylhalogeniden, beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -iodiden; Dialkylsulfaten wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden, Aralkylhalogeniden wie Benzyl- und Phenethylbromiden und anderen. Es werden dabei in Wasser oder \l lösliche oder dispergierbare Produkte erhalten.

Die neurotrophen Verbindungen gemäss der Erfindung können einem Patienten periodisch verabreicht werden, der sich einer Behandlung wegen neurologischer Störungen oder aus anderen Gründen unterzieht, bei denen es wünschenswert ist, die Regeneration oder das Wachstum von Neuronen zu stimulieren, wie bei verschiedenen Neuropathien des peripheren Nervensystems oder neurologischen Störungen in Zusammenhang mit einer Neurodegeneration. Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch an andere Säuger als Menschen verabreicht werden, um verschiedene neurologische Störungen von Säugern zu behandeln.

Die neuen Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung sind potente Inhibitoren der Rotamaseaktivität und besitzen ein ausgezeichnetes Mass an neurotropher Aktivität. Diese Aktivität ist nützlich bei der Stimulation von geschädigten Neuronen, bei der Förderung der Neuronenregeneration, der Vermeidung einer Neurodegeneration und bei der Behandlung von einigen neurologischen Störungen, von denen bekannt ist, dass sie mit einer neuronalen Degeneration und Neuropathien des peripheren Nervensytems verbunden sind.

Die neurologischen Störungen, die behandelt werden können, umfassen ohne darauf beschränkt zu sein: Trigeminusneuralgie, Glossopharyngusneuralgie, Bell-Lähmung, Myasthenia gravis, Muskeldystrophie, amyotrophie laterale Sklerose, progressive Muskelatrophie, progressive bulbäre Muskelatrophie, Bandscheibensyndrome mit Hernien, Rupturen oder Prolapsen, zervikale Spondylosis, Erkrankungen des Plexus, Thoraxsyndrome, Neuropathien des peripheren Nervensystems wie durch Blei, Diaphenylsulfon, Ticks, Porphyrie oder das Gullain-Barré-Syndrom, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit.

Für diese Zwecke können die erfindungsgemässen Verbindungen oral, parenteral, durch Sprühinhalation, äusserlich, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir in Dosisformulierungen, die herkömmliche nicht toxische pharmazeutisch akzeptable Träger, Adjuvantien oder Vehikel enthalten, verabreicht werden. Der hier verwendete Ausdruck parenteral umfasst subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrathekale, intraventrikuläre, intrasternale und intrakraniale Injektions- oder Infusionstechniken.

Damit sie an Zentralnervensystemtargets therapeutisch wirksam sind, sollten die Immunophilin-Wirkstoffkomplexe die Blut-Hirnschranke leicht überschreiten können, wenn sie peripher verabreicht werden. Verbindungen gemäss der Erfindung, die die Blut-Hirnschranke nicht überwinden können, können auf intraventrikulärem Wege wirksam verabreicht werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines sterilen injizierbaren Präparats vorliegen, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölhaltige Suspension. Diese Suspension kann nach den Fachleuten bekannten Techniken formuliert werden, wobei geeignete Dispergier- oder Netzmit tel und Suspensionsmittel verwendet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral akzeptablen Verdünnungsmittel oder Lösemittel sein, zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den akzeptablen Vehikeln und Lösemitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Ausserdem können bekanntermassen sterile, fixierte \le als Lösemittel oder Suspensionsmedium verwendet werden.

Zu diesem Zweck kann jedes milde fixierte \l verwendet werden einschliesslich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Fettsäuren wie Oleinsäure und ihre Glyceridderivate finden Verwendung bei der Herstellung injizierbarer Präparate, Olivenöl oder Castoröl, besonders in ihren polyoxyethylierten Versionen. Diese \llösungen oder -suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol als Verdünnungsmittel oder Dispergiermittel enthalten.

Die Verbindungen können beispielsweise oral in Form von Kapseln oder Tabletten verabreicht werden oder als wässrige Suspension oder Lösung. Im Falle von Tabletten zur oralen Verwendung werden üblicherweise eingesetzte Träger wie Lactose oder Stärke verwendet. Ebenso werden typischerweise Gleitmittel wie Magnesiumstearat zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform nützliche Verdünnungsmittel umfassen Lactose und getrocknete Stärke. Wenn zur oralen Verwendung wässrige Suspensionen erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulgatoren und Suspensionsmitteln kombiniert. Wenn es gewünscht ist, können bestimmte Süssungsmittel und/oder Geschmacksstoffe und/oder Farbstoffe zugesetzt werden.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch in Form von Suppositorien zur rektalen Verabreichung des Arzneistoffes verabreicht werden. Diese Zusammensetzungen können durch Mischen des Arzneistoffes mit einem geeigneten nicht reizen den Trägerstoff hergestellt werden, der bei Raumtemperatur fest ist, aber bei rektaler Temperatur flüssig ist und daher im Rektum schmilzt, so dass der Wirkstoff freigegeben wird. Solche Stoffe umfassen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglykole.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch topisch verabreicht werden, insbesondere wenn die zur Behandlung vorgesehenen Bedingungen Bereiche oder Organe betreffen, die für eine äusserliche Anwendung leicht zugänglich sind, wie neurologische Störungen des Auges, der Haut oder des unteren Verdauungstraktes. Geeignete topische Formulierungen werden für jeden dieser Bereiche einfach hergestellt.

Für eine ophthalmische Verabreichung können die Verbindungen als Mikrosuspensionen in isotonischer, pH-regulierter steriler Salzlösung oder, bevorzugt, als Lösungen in isotonischer, pH-regulierter steriler Salzlösung formuliert werden, entweder mit oder ohne einen Konservierungsstoff wie Benzylalkoniumchlorid. Alternativ können für die ophthalmische Verwendungen die Verbindungen in eine Salbengrundlage wie Petrolatum formuliert werden.

Zur äusserlichen Anwendung auf der Haut können die Verbindungen in eine geeignete Salbe formuliert werden, die die Verbindung suspendiert oder gelöst enthält, beispielsweise in einer Mischung mit einer oder mehreren der folgenden Substanzen: Mineralöl, Paraffinöl, Vaseline, Propylenglykol, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen, Emulgierwachs und Wasser. Alternativ können die Verbindungen in eine geeignete Lotion oder Creme formuliert werden, die den Wirkstoff suspendiert oder gelöst enthält, beispielsweise in einer Mischung mit einer oder mehreren der folgenden Substanzen: Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetearylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser.

Eine äusserliche Anwendung für den unteren Verdauungstrakt kann mit einem rektalen Suppositoriumformulierung erreicht werden (siehe oben) oder in einer geeigneten Klistierformulierung.

Dosishöhen in der Grössenordnung von ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 10 000 mg der Wirkstoffverbindung sind zur Behandlung der obigen Zustände zweckmässig, wobei bevorzugte Mengen ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 1000 mg betragen. Die Menge an Wirkstoff, die mit den Trägersubstanzen kombiniert werden kann, um eine Einzeldosis herzustellen, hängt vom zu behandelnden Patienten und der speziellen Art der Verabreichung ab.

Es ist jedoch selbstverständlich, dass eine spezifische Dosishöhe für einen bestimmten Patienten von einer Reihe von Faktoren abhängt wie der Aktivität des speziellen verwendeten Wirkstoffs, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, Nahrungsgewohnheiten, Verabreichungszeit, Ausscheidungsrate, Wirkstoffkombination und der Schwere der zu behandelnden Krankheit und der Art der Verabreichung.

Die Verbindungen können mit anderen neurotrophen Stoffen verabreicht werden wie dem neurotrophen Wachstumsfaktor (NGF), dem Wachstumsfaktor der Glia, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3. Die Dosishöhe anderer neurotropher Wirkstoffe hängt von den zuvor aufgeführten Faktoren ab und der neurotrophen Wirksamkeit der Wirkstoffkombination.

Verfahren und Vorgehensweisen

Ischiasnervenquetschung

Dieses Beispiel zeigt die hohen Mengen an FKBP in normalen Nerven des peripheren Systems und dass sie nach einer Nervenquetschung zunehmen.

Wenn FKBP physiologisch mit der Extension von Neuronenfortsätzen bei der Wirkung von GAP-43 in Verbindung steht, dann sind wesentliche Mengen an FKBP in peripheren Nerven zu erwarten. Dementsprechend wurde die (<3>H)FK506-Bindung im Ischiasnerv der Ratte gemessen sowie in Wachstumsstellen, die aus 2 Tage alten Ratten isoliert wurden, und mit Werten für den Zerebralkortex und verschiedene periphere Gewebe verglichen.

Es wurde wie beschrieben eine (<3>H)FK506-Autoradiographie auf unfixierten Schnitten durchgeführt, die aufgetaut und an der Luft getrocknet wurden und dann 1 h in Puffer bestehend aus 50 mM Hepes, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 5% Ethanol und 0,02% Tween 20 bei pH 7,4 inkubiert wurden. Die Schnitte wurden dann 1 h bei Raumtemperatur in Inkubationspuffer mit 1 nM (<3>H)FK506 (86,5 Ci/mMol; DuPont-NEN, Boston, MA) behandelt. Nicht spezifische Bindung wurde durch Zusatz von 1 mu M FK506 definiert. Nach der Inkubation wurden die Objekträger 4 x 5 min in eiskaltem Inkubationspuffer gewaschen und an der Luft getrocknet.

Die radiomarkierten Schnitte wurden dann neben einen auf Tritium empfindlichen Film oder mit Kodak NTB-2-Emulsion beschichtete Abdeckgläser gelegt.
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle 1
(<3>H)FK506-Bindung an Ischiasnerv und Wachstumskegel
(A) (<3>H)FK506-Bindung am Ischiasnerv
<tb>Head Col 1: Gewebe
<tb>Head Col 2: Bmax (pmol/mg Protein)
<tb><SEP>Erwachsene Ratte
<tb><SEP>Ischiasnerv<SEP>22,1
<tb><CEL AL=L>Zerebralkortex<SEP>38,0
<tb><SEP>Thymus<SEP>9,5
<tb><SEP>Milz<SEP>8,0
<tb><SEP>Neugeborene Ratte
<tb><SEP>Vorderhirn<SEP>25,5
<tb><SEP>Wachstumskegel<SEP>10,2
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=3 (B) (<3>H)FK506-Bindung nach Ischiasnervenquetschung
<tb>Head Col 1: Protein
<tb>Head Col 2: Bmax
fmol/5 mm Segment
<tb>Head Col 3:

Bmax
pmol/mg
<tb><SEP>Unbehandelt<SEP>31,8 +/- 2,1<SEP>21,2 +/- 1,4
<tb><SEP>7 Tage Quetschung<SEP>136,5 +/- 15,7*<CEL AL=L>40,1 +/- 2,0
<tb></TABLE>

Die (<3>H)FK506-Bindung wurde wie bei den Verfahren beschrieben untersucht. In Tabelle 1A wurden die Experimente dreimal wiederholt, wobei weniger als 10% Abweichung auftrat. In Tabelle 1B sind die Werte als Mittel +/- die mittlere Standardabweichung (n = 3) dargestellt. * P </= 0,05 Student-t-Test für unabhängige Mittel.

Bei allen untersuchten Geweben sind die Bindungswerte beim Ischiasnerv am höchsten, etwas höher als die des Zerebralkortex und ungefähr 10mal höher als die Werte im Thymus und der Milz, die FKBP in Verbindung mit Lymphozyten enthalten. Siehe Tabelle 1A.

Einen Hinweis auf die Rolle von FKBP bei der Nervenregeneration ergibt sich aus den Experimenten, in denen der Ischiasnerv bei erwachsenen Ratten gequetscht und 7 Tage später die (<3>H)FK506-Bindung in einem 5 mm Teilstück unmittelbar angrenzend an die Nervenquetschung gemessen wurde.

Sprague-Dawley-Ratten (175-200 g) wurden mit einer Mischung aus Rompun (12 mg/kg) und Ketamine (30 mg/kg) anästhesiert. Mit aseptischen Techniken wurde der Gesichtsnerv mit einer Uhrmacherpinzette 2 mal 30 Sekunden 2 mm distal zu seinem Austritt aus dem Foramen stylomastoideum gequetscht. Die Quetschung des Ischiasnerven auf Höhe der Mitte des Oberschenkels wurde nach identischen Vorgehensweisen vorgenommen.

Die gesamte Bindung im Teilstück nahe der Quetschung war im Vergleich zu Kontrollwerten vervierfacht. Da das gesamte Protein im proximalen Teilstück wesentlich erhöht ist, ist die (<3>H)FK506-Bindung pro mg Protein im proximalen Teilstück nur verdoppelt.

Gesichtsnervenquetschung

Dieses Beispiel zeigt, dass Gesichtsnervenläsionen die gleichzeitige Expression von FKBP und GAP-43 erhöhen.

Nach der Quetschung des Gesichtsnerven erhöhen sich die mRNA-Werte von GAP-43 im Gesichtsnervenkern. Unter Verwendung der in situ Hybridisierung wurden die mRNA-Werte von FKBP, GAP-43 und Calcineurin nach der Gesichtsnervenquetschung untersucht.

Ratten erhielten transkardial 150-200 ml eiskalte phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) (0,1 M, pH 7,4). Gewebe wurden entfernt und sofort in Isopentan eingefroren (-80 DEG C). Es wurden 18 mu m dicke Cryostatschnitte abgetrennt und auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht.

Es wurde wie zuvor beschrieben eine in situ Hybridisierung durchgeführt, wobei entgegengesetzte Oligonukleotidsonden mit (<3><5>S)dATP Endmarkierung verwendet werden. Für FKBP wurden drei getrennte Oligonukleotide verwendet, die zu den folgenden Regionen der geklonten cDNA komplementär sind: 70-114, 214-258, 441-485 wie es offenbart ist bei Maki et al., (1990), in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5440-5443 und Standaert, R.F. et al., (1990), in: Nature 346, 671-674 und durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht wird. Für GAP-43 wurden drei getrennte entgegengesetzte Oligonukleotide verwendet, die zu den Nukleotiden 961-1008, 1081-1128, 1201-1248 der geklonten cDNA komplementär sind wie es offenbart ist bei Rosenthal, A. et al., (1987), in: EMBO, T. 6, 3641-3646 und durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht wird.

Für Calcineurin A alpha wurden entgegengesetzte Oligonukleotide verwendet, die zu den Nukleotiden 1363-1410 und 1711-1758 komplementär sind, wie es offenbart ist bei Ito et al., (1989), in: Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1492-1497 und durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht wird, und für Calcineurin A beta die zu 1339-1386 und 1569-1616 komplementären wie es offenbart ist bei Kuno, T. et al., (1989), in: Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1352-1358 und durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht wird. Die Schnitte wurden aufgetaut und getrocknet, dann 5 min in 4%igem frisch depolymerisiertem Paraformaldehyd in PBS fixiert.

Nach zwei Spülungen in PBS wurden die Schnitte acetyliert mit 0,25%igem Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin 0,5% NaCl (pH 8,0) und dann in Alkoholen dehydratisiert, in Chloroform 5 min lang entfettet, erneut auf 9 Ethanol hydratisiert und zum Trocknen an der Luft stehen gelassen. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37 DEG C in Puffer mit 50% deionisiertem Formamid, 10% Dextransulfat, 4 x SSC, 1 x Denhardt-Lösung, 20 mM Phosphatpuffer, 0,1 mg/ml DNA aus Lachssperma, 0,1 mg/ml Hefetransfer-RNA, 10 mM Dithiothreitol, 2,0% Betamercaptoethanol (BMD), 1,0 mM EDTA und einer markierten Sonde (2 000 000 dpm/Schnitt) durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte in 1 x SSc, 1,0% BME 15 min bei Raumtemperatur gespült, dann zweimal 10 min lang bei 55 DEG C luftgetrocknet und auf einen Film gebracht oder in Kodak NTB-2-Emulsion getaucht.

Es wird eine auffällige Verstärkung der FKBP- und GAP-43-Expression beobachtet, während bei der Calcineurinexpression keine Veränderungen ersichtlich sind. Schon 24 h nach der Gesichtsnervenquetschung ist die FKBP-Expression erhöht, wobei sich Spitzenwerte 1-2 Wochen später zeigen, während sich nach 3 Wochen die mRNA-Konzentrationen wesentlich verringern. Eine Untersuchung unter hoher Vergrösserung zeigt, dass die erhöhten Werte an Silberkörnern für FKBP-mRNA auf die neuronalen Zellkörper beschränkt sind (Fig. 2). Northern-Blot-Analyse der entfernten Gesichtskerne bestätigt die erhöhten Werte an FKBP spezifischer mRNA. Die Werte für GAP-43 mRNA folgen einem Zeitprofil, das dem von FKBP sehr ähnlich ist. Im Gegensatz dazu werden bei der Calcineurinexpression zu keinem der untersuchten Zeitpunkte Veränderungen festgestellt.

Es wurde die gesamte zelluläre RNA aus den entnommenen Gesichtskernen isoliert. Proben von 10 oder 20 mu g der gesamten RNA wurden einer Elektrophorese durch 1% Agarose, 2,0% Formaldehydgel unterzogen und auf eine Nylonmembran in 10 nM NaOH übertragen. cDNA-Sonden für mit (<3><5>)dCTP markiertem FKBP auf eine spezifische Aktivität von 1 x 10<9> cpm/ mu g wurden über Nacht bei 42 DEG C in Puffer bestehend aus 50% Formamid, 2 x SSPE, 7% SDS, 0,5% Blotto und 100 mu g/ml Lachssperma-DNA hybridisiert. Die Blots wurden 20 min bei Raumtemperatur gewaschen und 2 x 15 min lang bei 65 DEG C in 0,15 x SSC, 0,15% SDS und dann 48-96 h auf einen Film aufgebracht.

Auf der Seite ohne Läsionen ist eine geringe Zunahme der Silberkörner im Vergleich zu Kontrollschnitten zu beobachten. Dies ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen, dass kontralaterale Neuronen auch auf Axotomie reagieren.

Nach der Quetschung des Gesichtsnerven entwickeln Ratten eine Gesichtsnervenlähmung, die durch ein Fehlen der Bewegung der Schnurrhaare erkennbar ist, wobei eine Wiederherstellung der Funktion nach 3 Wochen eintritt, was mit der Beendigung der Nervenregeneration zusammenfällt. Bei den Ratten dieses Versuchs wurde auch ein Verlust der Schnurrhaarbewegung nach Nervenquetschung und Wiederkehr der Funktion nach 3 Wochen beobachtet. Auf diese Weise korreliert der Zeitverlauf der erhöhten Expression von GAP-43 und FKBP mit dem Prozess der Nervenregeneration.

Ischiasnervenregeneration

Dieses Beispiel zeigt Veränderungen in FKBP und GAP-43 in Verbindung mit der Ischiasnervenregeneration.

Nach Ischiasnervenläsionen sind die GAP-43 mRNA-Werte sowohl in motorischen Neuronen des Rückenmarks wie in den neuronalen Zellen der Rückenmarkswurzelganglien erhöht. Bei Ratten, die eine Ischiasnervenquetschung erhielten, wurde eine auffällige Erhöhung der mRNA-Werte für FKBP in motorischen Neuronen bei L-4, 5 (Fig. 3) und in den neuronalen Zellen der Rückenmarkswurzelganglien beobachtet, was mit der berichteten Erhöhung der GAP-43-Expression (Fig. 4) übereinstimmt. Bei hoher Vergrösserung wurden die FKMB-mRNS-Silberkörner an neuronalen Zellkörpern lokalisiert beobachtet (Fig. 3). FKBP-Proteinwerte wurden durch Autoradiographie der (<3>H)FK-506-Bindung unter Bedingungen, in denen es selektiv an FKBP bindet, untersucht (Fig. 4).

Es wird erhöhtes FKBP in den primären sensorischen Neuronen in Rückenmarkswurzelganglien nachgewiesen, obwohl in den motorischen neuronalen Zellen nach Ischiasnervenquetschung keine Zunahmen ersichtlich sind.

Die Verbindung von erhöhter FKBP-Expression und Regeneration wird ferner selektiv gestützt durch Experimente mit Rizin. Wenn Rizin in periphere Nerven injiziert wird, wird es in den Zellkörper zurücktransportiert, der ohne damit verbundene Nervenregeneration zerstört wird. Es wurden 0,5 mu g Rizin (RCA 60, Sigma, St. Louis, MO) auf derselben Seite, auf der in anderen Experimenten die Quetschungen vorgenommen wurden, in den Gesichtsnerven injiziert gemäss dem Verfahren von Streit und Kreutzberg in 0,5 mu l PBS und 0,1% Fast Green. Siehe Streit et al., (1988), in: J. Comp. Neurol. 268, 248-263.

Es wurden Lokalisierungsstudien durch in situ Hybridisierung für FKBP mRNA nach 2, 4 und 7 Tagen nach Rizinbehandlung durchgeführt (Fig. 5). Nach der Rizinbehandlung wurde keine Zunahme an FKBP mRNA beobachtet. Sowohl nach Rizinbehandlung wie nach Nervenquetschung tritt Gliosis auf. Das Fehlen einer Zunahme von FKBP mRNA nach Rizinbehandlung stimmt überein mit der selektiven neuronalen Lokalisierung von FKBP mRNA im Gesichtskern.

FKBP-Transport im Ischiasnerv

Dieses Beispiel zeigt, dass FKBP im Ischiasnerv schnell transportiert wird.

Das Fehlen einer Erhöhung des FKBP-Proteins in motorischen Neuronen nach Ischiasnervenquetschung trotz einer Zunahme bei FKBP mRNA weist darauf hin, dass das Protein schnell aus dem Zellkörper hinaus in die Nervenfortsätze transportiert wird. Dies stimmt mit früheren Beobachtungen überein, dass FKBP mRNA in Zellgranula des Kleinhirns konzentriert ist, die geringe Mengen an FKBP-Protein enthalten, während die FKBP-Proteinwerte in der molekularen Schicht im Kleinhirn in Verbindung mit den parallelen Fasern aus den Zellgranula hoch konzentriert sind. Zur Untersuchung eines möglichen Transports von FKBP wurde der Ischiasnerv gequetscht und 7 Tage später Ligaturen 10 und 20 mm neben der Quetschung angebracht. Sechs Stunden nach der Ligatur wurde die (<3>H)FK506-Bindung in 3 mm Teilstücken im Bereich der Ligaturen untersucht (Fig. 6).

Für Experimente zum Axontransport wurden klassische Ligaturtechniken nach den Verfahren von Tetzlaff et al. angewendet. Eine Woche nach Ischiasnervenquetschungen wurden zwei Probeligaturen am Nerven angebracht, ungefähr 10 mm entfernt voneinander, wobei die distale Ligatur 10 mm neben der ursprünglichen Quetschstelle liegt. Sechs Stunden später werden 5-3 mm Teilstücke des Nerven aus den Bereichen proximal, distal und zwischen den Probeligaturen entnommen, wie es in Fig. 5 dargestellt ist. Die Nervensegmente werden für (<3>H)-FK506-Bindungsversuche präpariert durch Homogenisieren in 10 Volumenmengen aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Die homogenen Proben werden 20 min bei 4 DEG C zentrifugiert bei 15 000 x g und die Überstände aufgenommen und mit dem Coomassie-Farbstoffbindungsversuch (Pearce) auf die Gesamtproteinkonzentration analysiert.

Die (<3>H)FK506-Bindung wurde wie beschrieben (4) durchgeführt mit Probenmengen, die 2 mu g des gesamten löslichen Proteins in einem Endvolumen von 0,4 ml Puffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 250 pM (<3>H)FK506 und wechselnden, Konzentrationen von unmarkiertem FK506 enthalten. Nach 60 min Inkubation bei 25 DEG C wurden 0,35 ml davon auf eine 0,8 ml Säule mit Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB) aufgeschichtet und mit 0,4 ml Puffer gewaschen.

Die Eluate wurden aufgenommen und in einem Szintillationszähler ausgezählt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. (<3>H)FK506-Bindungswerte sind in dem Teilstück direkt neben der Ligatur 20 mm von der Quetschung am höchsten, was fast vierfache Werte wie bei anderen Teilstücken ergibt. Ausgehend von den Werten der (<3>H)FK506-Bindung in Teilstücken A-D wurde die Geschwindigkeit des anterograden Transports für FKBP errechnet. Diese Geschwindigkeit von 240 mm pro Tag ist im wesentlichen gleich der Transportgeschwindigkeiten für GAP-43, die die schnellsten Transportgeschwindigkeiten für neuronale Proteine darstellen.

Um die Akkumulation von FKBP nach einer Nervenquetschung sichtbar zu machen, wurde eine lose Ligatur angebracht, um die Stelle der Quetschung des Ischiasnervs zu markieren, und eine in situ Hybridisierung für FKBP mRNA sowie eine Autoradiographie für die (<3>H)FK506-Bindung durchgeführt (Fig. 7). Die Akkumulation von FKBP mRNA und (<3>H)FK506-Bindung ist unmittelbar neben der Quetschung am höchsten. Diese Werte sind beträchtlich höher als bei der Kontrolle mit dem unbehandelten Ischiasnerv. Eine Untersuchung der in situ Hybridisierung und der Autoradiographiepräparate unter hoher Vergrösserung zeigt Silberkörner in Verbindung mit Neuronenfasern. Es sind auch Silberkörner in Zellen lokalisiert, deren Identität nicht definitiv bestimmt werden konnte, so dass sie Schwann-Zellen, Makrophagen oder Fibroblasten sein können.

FKBP in PC12-Zellen

Dieses Beispiel zeigt, dass PC12-Zellen FKBP enthalten und dass FKBP-Werte durch den Nervenwachstumsfaktor erhöht werden. Es wurden PC12-Zellen auf das Vorhandensein von FKBP untersucht, indem die Bindung von (<3>H)FK-506 an Zellen unter Grundbedingungen und nach Behandlung mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) verfolgt wurde.

Werte für FKBP in PC12-Zellen wurden aus Scatchard-Analyse der (<3>H)FK506-Bindungskurven erhalten. Kulturen wurden aus den Kulturvertiefungen entnommen und in 10 Volumenmengen mit 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM EDTA, 100 mu g/ml Phenylmethylsulfonylfluorid homogenisiert und 20 min bei 4 DEG C bei 40 000 x g zentrifugiert. Das Protein wurde durch den Coomassie-Farbstoffbindungsversuch mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Bindung von 250 pM (<3>H)-Dihydro-FK506 (86,5 Ci/mmol, DuPont/NEN) wurde bei Proben gefunden, die 5 mu g lösliches Protein in einem Endvolumen von 0,4 ml Puffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mg/ml BSA und wechselnden Konzentrationen an unmarkiertem FK506. Nach 60 min Inkubation bei 25 DEG C wurden 0,35 ml über eine 0,8 ml Säule mit Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB) geschichtet, mit Puffer auf ein vorläufiges Gleichgewicht eingestellt.

Die Säule wurde dann mit 0,4 ml Puffer gewaschen, die Eluate aufgenommen, gemischt mit Formel 963 (DuPont/NEN) und in einem Szintillationszähler (Beckman) ausgezählt. Die spezifische Bindung wurde durch Subtraktion der Bindung bestimmt, die in Gegenwart von 1 mu M unmarkiertem FK506 aus dem gesamten gebundenen (<3>H)FK506 erhalten wurde.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. (<3>H)FK506 bindet sättigend an unbehandelte homogenisierte PC12-Zellen. In typischen Experimenten sind etwa 1000 cpm gebunden, während die unspezifische Bindung in Gegenwart von 1 mu M FK506 ungefähr 150 cpm beträgt. Mit 1-2 nM FK506 tritt 50 Prozent Inhibierung der (<3>H)FK506-Bindung auf, was anzeigt, dass die Bindungsstellen dem authentischen FKBP entsprechen. Nach Behandlung mit NGF tritt eine merkliche Zunahme der (<3>H)FK506-Bindung auf. Nach 10-15 h sind deutliche Zunahmen ersichtlich. Nach 20 h hat sich die Bindung verdreifacht und ein geringe weitere Zunahme ist nach 100 h sichtbar.

Erhöhte Neuritenextension in PC12-Zellen

Dieses Beispiel zeigt, dass FK506 und Rapamycin die Neuritenextension in PC12-Zellen erhöhen.

PC12-Zellen wurden bei 37 DEG C, 5% CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) versehen mit 10% durch Wärme inaktiviertem Pferdeserum und 5% durch Wärme inaktiviertem fetalem Rinderserum gehalten. Zur Differenzierung in NGF wurden die Zellen mit 1 x 10<5> in 35 mm Kulturplatten beschichtet mit 5 mu g/cm<2> Rattenschwanzkollagen eingebracht und nach Anhaften wurden die Medien durch DMEM versehen mit 2% fetalem Pferdeserum, NGF und/oder FK506 oder Rapamycin ersetzt. Zur quantitativen Bestimmung des Neuritenwachstums wurden Photographien aufgenommen (3 -4 pro Vertiefung) und die Fortsätze tragenden Neuronen mit Fortsätzen von mehr als 5 mu m wurden ausgezählt. Die experimentellen Bedingungen waren dem Photographen und dem Auszähler unbekannt. Für jeden gezeigten Datenpunkt wurden vier getrennte Experimente doppelt durchgeführt.

Die Neuriten von ungefähr 100 Zellen pro Photo wurden identifiziert und ausgezählt. Auf diese Weise wurden Neuriten von 1200-1600 Zellen pro Datenpunkt ausgezählt.

Wie beobachtet stimuliert NGF das Neuritenwachstum stark, wobei eine halbmaximale Stimulierung bei 1 ng/ml und eine maximale Steigerung bei ungefähr 50-100 ng/ml erreicht wird (Fig. 9 und 10). FK506 (100 nM) erhöht die Wirkung von NGF merklich, indem es die Empfindlichkeit auf NGF erhöht. Auf diese Weise verringert FK506 die zur Erzielung maximalen Wachstums notwendige NGF-Konzentration um das 20- bis 50fache. Die Hälfte des maximalen Wachstums ohne FK506 tritt bei 5 ng/ml NGF auf und in Gegenwart von FK506 bei 0,1 ng/ml.

Bei maximalen Konzentrationen an NGF (10-100 ng/ml) kann FK506 kein weiteres Neuritenwachstum erzeugen.

FK506 ist in seinen neurotrophen Wirkungen äusserst stark. In Gegenwart von submaximalen Konzentrationen an NGF (1 ng/ml) erreicht 1 nM FK506 dasselbe maximale Wachstum wie es mit 50 ng/ml NGF beobachtet wird (Fig. 11). Die Hälfte der maximalen Wirkung von FK506 tritt bei ungefähr 100 pM auf. Ohne NGF kann FK506 kein Neuritenwachstum erreichen (Fig. 10).

Rapamycin ist ein starker immunsuppressiver Stoff, von dem nicht angenommen wird, dass er durch Calcineurin wirkt, aber der ändere Phosphorylierungskaskaden beeinflussen kann. Rapamycin kann Wirkungen von FK506, die durch FK506 und Calcineurin auftreten, potent abblocken, vermutlich indem es bei FKBP als FK506-Antagonist wirkt. Rapamycin (1 mu M) kann die neurotrophen Wirkungen von FK506 nicht blockieren. Stattdessen ist Rapamycin selbst neurotroph, indem es bei 1 nM wesentliches Neuritenwachstum erzielt. Rapamycin und FK506 scheinen über unterschiedliche Mechanismen zu wirken. Auf diese Weise erhöht Rapamycin die Anzahl der Fortsätze sowie ihre Länge, während FK506 primär die Länge der Neuriten vergrössert. Ausserdem scheinen sich die Wirkungen von FK506 und Rapamycin zu ergänzen.

Rückenmarkswurzelganglien

Dieses Beispiel zeigt, dass FK506 für sensorische Ganglien neurotroph ist. Es wurde die Wirkung von FK506 auf primären Kulturen von Rückenmarkswurzelganglien aus Ratten am 16. Embryonentag untersucht.

Embryonen im Stadium E16 wurden aus trächtigen Sprague-Dawley-Ratten entnommen und die Rükkenmarkswurzelganglien entfernt. Explantate von ganzen Ganglien wurden in kollagenbeschichteten Schalen von 35 mm (Falcon) kultiviert, wobei N2-Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium und Ham F12-Medium gemischt 1:1 und versetzt mit Progesteron, Selen, Insulin, Putrescin, Glucose und Penicillin-Streptomycin) bei 37 DEG C in einer Atmosphäre von 15% CO2 verwendet wird. Die sensorischen Ganglien wurden mit verschiedenen Konzentrationen an NGF und/oder FK506 oder Rapamycin oder anti-NGF-Antikörper behandelt. Die Ganglien wurden alle 2-3 Tage unter Phasenkontrast mit einem Mikroskop Olympus IMT-2 betrachtet und Messungen der Axonlänge vorgenommen.

Das axonale Feld jedes Ganglions wurde in vier Quadranten unterteilt und die Länge des längsten Axons in jedem Quadraten wurden in Mikrometern gemessen, wobei ein Augenmikrometer verwendet wurde. Der Mittelwert dieser Messungen wurde als Axonlänge für jedes Ganglion ermittelt.

Für die (<3>H)FK506-Autoradiographie wurden Rückenmarkswurzelganglien auf mit Kollagen beschichteten (5 mu g/cm<2>) Objektträgern mit Kammer kultiviert. Die Kulturen wurden auf dem Objektträger mit eiskaltem 4,0%igem frisch depolymerisiertem Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, 1 h lang fixiert, dann zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Die fixierten Kulturen wurden durch Inkubation der Objektträger in einem Puffer bestehend aus 50 mM Hepes, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,02% Tween-20, pH 7,4 mit (<3>H)FK506 markiert. Dies wurde gefolgt von einer Inkubation in demselben Puffer enthaltend 1 nM (<3>H)FK506. Nicht spezifische Bindung wurde durch Zugabe von 1 mu M unmarkiertem FK506 bestimmt. Die Objektträger wurden dann 4 x 5 min gespült, bevor sie getrocknet und 10 Tage lang neben einen auf Tritium empfindlichen Film gelegt wurden.

Die Autoradiographie der (<3>H)FK506-Bindungsstellen zeigt wesentliche Mengen an FKBP in Verbindung mit Silberkörnern in diesen Ganglien (Fig. 12). Bei 1 mu M unmarkiertem FK506 sind die autoradiographischen Körner nicht vorhanden, was die Spe zifizität der Bindung angibt. Wie zuvor berichtet erhöht NGF (100 ng/ml die Anzahl und Länge der Ganglienfortsätze merklich (Fig. 13). FK506 (1 mu M) allein erzeugt einen ähnlichen neurotrophen Effekt, während nur 1 nM FK506 eine erkennbare Wachstumszunahme erzeugt. Rapamycin (1 mu M), das als FK506-Antagonist wirkt, blockiert die Wirkung von FK506 (1 mu m) völlig, wodurch die Wirkung von FK506 eine für FKBP charakteristische Wirkstoffspezifität zeigt.

Während FK506 ohne zugesetzten NGF kein Neuritenwachstum in PC12-Zellen stimulieren kann, ist FK506 in sensorischen Ganglien allein neurotroph. Schwann-Zellen in den Ganglien können NGF herstellen und die Produktion von NGF in Schwann-Zellen ist durch eine Proteinphosphorylierung geregelt. Um festzustellen, ob die Wirkung von FK506 allein an der Potenzierung des endogenen NGF beteiligt sind, wurde der Einfluss von Antikörpern auf NGF untersucht (Fig. 13). Anti-NGF reduziert die neurotrophe Wirkung von FK506 (1 mu M) merklich. Der anti-NGF wirkt nicht auf toxische Weise, da keine morphologische Spur der Toxizität in den dem anti-NGF ausgesetzten Zellen mit oder ohne zugesetzten NGF zu beobachten ist.

FK506 ist äusserst potent zur Stimulierung des Neuritenwachstums. Nur 1 pM FK506 erzeugt eine nachweisbare Zunahme. Zunehmend stärkeres Wachstum tritt bei 0,1 und 10 nM FK506 auf (Daten nicht gezeigt), während maximales Wachstum 1 mu M FK506 erfordert.

Der Zeitverlauf des Neuritenwachstums ist bei allen Konzentrationen von NGF und FK506 ähnlich. Am 1. Tag ist ein gewisses Wachstum erkennbar, während ungefähr am Tag 5-6 eine Plateauphase des Wachstums beginnt.

Die neurotrophe Wirkung von FK506 umfasst FKBP (FK506 bindendes Protein) in sensorischen Ganglien, da die Wirkung von FK506 durch geringe Konzentrationen von Rapamycin, einem bekannten Antagonisten von FK506 bei FKBP, umgekehrt wird. Die mangelnde Fähigkeit von Rapamycin, die FK506-Wirkung in PC12-Zellen zu blockieren, zeigt vermutlich die separate stimulierende Wirkung von Rapamycin. Mechanismen der Rapamycinstimulierung auf das Neuritenwachstum in PC12-Zellen sind nicht unmittelbar ersichtlich. Es wird angenommen, dass seine immunsuppressive Wirkung andere Mechanismen umfasst, als die bei FK506. Rapamycin kann S6-Kinase inhibieren, die die S6-Ribosomenuntereinheit phosphoryliert. Rapamycin inhibiert auch die Phosphatidylinositol-3-kinase.

Die durch Proteinkinase C (PKC) vermittelte Phosphorylierung wurde mit dem Fortsatzwachstum bei der Neuronenregeneration in Verbindung gebracht. Andere Hinweise legen eine inhibierende Wirkung von PKC bei der Neuronenfortsatzextension nahe.

GAP43 ist ein wichtiges Calcineurinsubstrat, das in Neuriten hochkonzentriert vorliegt, und seine Phosphorylierung wird durch FKBP geregelt. GAP-43 kann bei der Neuritenextension nicht direkt beteiligt sein, da PC12-Zellinien mit geringen Mengen an GAP43 normales Neuritenwachstum zeigen. Jedoch können GAP43 und seine Phosphorylierung beim Targeting von Neuriten beteiligt sein, die Mengen an phosphoryliertem GAP43 erhöht sind, wenn die Neuriten sich an ihre Targets annähern. Die Phosphorylierung von GAP-43 kann auch die Mobilisierung von Ca<2><+> beeinflussen, das die Neuritenextension reguliert. Phosphoryliertes GAP-43 inhibiert die Bildung von Phosphatidylinositol-bis-phosphat, was die Menge an Inositol-1,4,5triphosphat und die damit verbundene Ca<2><+>-Freisetzung verringert.

Ausserdem verringert die Phosphorylierung von GAP-43 seine Affinität für Calmodulin und das resultierende freie Calmodulin, das zur Bindung an Ca<2><+> verfügbar ist.

Immunophiline können an Stellen neben Calcineurin wirken, die das Ca<2><+> beeinflussen, das das Neuritenwachstum reguliert. FKBP bindet an den Ryanodin-Rezeptor, der ein Ca<2><+>-Freigabekanal ist. In Skelettmuskeln dissoziiert das Sarcoplasmaretikulum-FK506 FKBP vom Ryanodin-Rezeptor, um den durch Ca<2><+> induzierten Ca<2><+>-Freigabemechanismus zu erleichtern. Ausserdem wirkt FK506 an anderen Stellen einschliesslich den FKBP-25-Steroid-Rezeptoren und anderen nicht identifizierten Targets, wie die in Zusammenhang mit FKBP13. Daher können andere potentielle Mechanismen in der Neuritenextension eine gewisse Rolle spielen.

Nicht immunsuppressive und immunsuppressive Liganden der Immunophiline stimulieren das Neuritenwachstum in PC12-Zellen

In der vorliegenden Studie wurden die Einflüsse einer Reihe von Liganden der Immunophiline auf die Neuritenextension in PC12-Zellen und in intakten sensorischen Ganglien von Hühnern ausführlich untersucht. Es wird berichtet, dass nicht immunsuppressive ebenso wie immunsuppressive Liganden bei der Steigerung des Neuritenwachstums in PC12-Zellen und in sensorischen Ganglien äusserst potent sind.

In früheren Studien wurde gefunden, dass Immunsuppressiva das Auswachsen von Neuriten in PC12-Zellen stimulieren, indem sie die Potenz des Nervenwachstumsfaktors (NGF) etwa 10fach erhöhen (Lyons et al., 1994). Ohne zugesetzten NGF werden keine neurotrophen Effekte beobachtet. In der vorliegenden Untersuchung wurden die Wirkungen der immunsuppressiven Wirkstoffe FK506 und Rapamycin auf das PC12-Neuritenwachstum in Gegenwart von 0,1-100 ng/ml NGF bestimmt.

Ohne zugesetzten NGF stimuliert keiner der Wirkstoffe das Neuritenwachstum. Bei 0,1 ng/ml erzeugt NGF allein eine ge ringe Zunahme der Neuritenextension von nur ungefähr 15% der maximalen Wirkung, die bei 50 ng/ml erkennbar ist (Fig. 14). Rapamycin stimuliert das Neuritenwachstum in stärkerem Masse als andere Wirkstoffe, wobei eine 3-4fache Stimulierung bei 0,1-0,5 ng/ml NGF auftritt. Das Ausmass der durch Rapamycin ausgelösten Zunahme nimmt mit höheren Konzentrationen an NGF ab und ist bei 5-50 ng/ml NGF statistisch nicht signifikant. FK506 ist ebenfalls neurotroph, wobei die Effekte bei geringeren NGF-Konzentrationen am deutlichsten sind und eine maximale Verstärkung um das 2- bis 5fache des Neuritenwachstums ist bei 0,5 ng/ml NGF erkennbar.

Es gibt prinzipiell drei Strukturklassen der immunsuppressiven Wirkstoffe, die in der Struktur mit Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin verwandt sind. Obwohl FK506 und Cyclosporin A an bestimmte Immunophilinproteine binden, wirken sie beide als Immunsuppressiva durch Inhibierung von Calcineurin. Rapamycin bindet mit hoher Affinität an FKBP-12, aber der Wirkstoff-Immunophilin-Komplex wiederum bindet nicht an Calcineurin. Stattdessen ergeben sich immunsuppressive Wirkungen aus dem Rapamycin-FKBP-12-Komplex, der an ein unlängst identifiziertes und geklontes Protein bindet, das mit RAFT 1 bezeichnet ist (Rapamycin und FK506-Target) und auch als FRAP bezeichnet ist (Siehe Sabatini und Snyder, 1994; Brown et al., 1994; Chen et al., 1994). Weil Rapamycin stark an FKBP12 bindet, aber Calcineurin nicht inhibiert, kann es als Antagonist für FK506 dienen.

Es gibt nicht immunsuppressive Derivate von Rapamycin. Eines davon, WAY-124,466, ein Trienderivat von Rapamycin, bindet mit hoher Affinität an FKBP-12 und inhibiert die Rotamaseaktivität, besitzt aber keine immunsuppressive Wirkung. Cyclosporin A ist ein grosses cyclisches Undecapeptid. Die blosse Einfügung einer Methylgruppe an ein Alanin in der Position 6 führt zu einem Stoff, der Calcineurin nicht inhibiert und keine immunsuppressive Wirkung aufweist, obwohl es die Rotamaseaktivität von Cyclophilin in einem ähnlichen Ausmass inhibiert wie Cyclosporin A (Me CsA ref).

Zur Bestimmung, ob die immunsuppressive Aktivität für neurotrophe Wirkung erforderlich ist, wurden die neurotrophen Wirkungen von FK506, Rapamycin und Cyclosporin A mit dem nicht immunsuppressiven WAY-124,466 verglichen, wobei ein grosser Konzentrationsbereich mit PC12-Zellen betrachtet wurde (Fig. 15, 16). Alle Studien wurden in Gegenwart von 0,5 ng/ml NGF durchgeführt. Wie zuvor beobachtet, stimuliert FK506 sehr stark die Neuritenextension, wobei die Hälfte der maximalen Stimulation bei 0,5 nM und maximale Stimulation bei 5-100 nM erreicht werden.

Rapamycin ist der stärkste der untersuchten Stoffe und erzeugt die höchsten maximalen Werte der Neuritenextension. In wiederholten Experimenten sind 50% der maximalen Extension bei ungefähr 0,2-0,4 nM erkennbar, während maximale Wirkung bei ungefähr 10-100 nM erkennbar ist. Die maximale Neuritenextension mit Rapamycin ist vergleichbar mit maximaler Wirkung bei 50 ng/ml NGF. WAY-124,466 ist ebenfalls neurotroph, ist aber weniger potent und erzeugt eine geringere maximale Wirkung als Rapamycin. Die Hälfte der maximalen Stimulierung mit WAY-124,466 tritt bei ungefähr 10 nM auf und maximale Wirkung tritt bei 100-1000 nM auf. Auf diese Weise ist Rapamycin etwa 100fach potenter als WAY-124,466, was seiner 40fach höheren Potenz zur Bindung an FKBP-12 vergleichbar ist (Tabelle II).

Cyclosporin A ist wesentlich weniger potent als FK506 oder Rapamycin zur Stimulierung des Neuritenwachstums, was seiner wesentlich geringeren Potenz zum Inhibieren der Rotamaseaktivität entspricht. Fünfzig Prozent der maximalen Stimulierung des Neuritenwachstums sind mit Cyclosporin A bei 50 nM erkennbar, wobei die maximale Wirkung bei 100 nM liegt und bei höheren Konzentrationen an Cyclosporin A eine Abnahme des Neuritenwachstums auftritt. Eine maximale Stimulation mit Cyclosporin A beträgt etwa 60% der Wirkung von 50 ng/ml NGF.

Das allgemeine Muster der Fortsatzextension ist bei den verschiedenen Immunophilinliganden und bei NGF ähnlich. Bei Konzentrationen, die 50% der maximalen Wirkung erreichen, NGF (1-5 ng/ml) bilden 40-50% der Zellen Fortsätze, die mindestens so lang sind wie der Zellkörper, während 15% längere Fortsätze bilden, die bis zu 3- bis 5mal die Länge des Zellkörpers erreichen. Das Muster ist bei den verschiedenen untersuchten Wirkstoffen ziemlich ähnlich. Rapamycin und WAY124,466 tendieren zur Bildung einer grösseren Anzahl von Fortsätzen pro Zelle wie FK506. Cyclosporin A liegt im Hinblick auf die Zahl der Fortsätze in der Mitte.

Nervenextension bei Rückenmarkswurzelganglien von Hühnern (Küken) durch nicht immunsuppressive und immunsuppressive Liganden von Immunophilinen

In einer früheren Untersuchung wurde eine neurotrophe Wirkung von immunsuppressiven Wirkstoffen in Explantaten von Rückenmarkswurzelganglien bei Ratten beobachtet, wobei eine deutliche Zunahme des Nervenwachstums mit FK506-Konzentrationen von nur 1 picomol auftrat (Lyons et al., 1994). Bei den Rattenganglien wurden neurotrophe Effekte mit FK506 selbst ohne NGF beobachtet. In dieser Studie wurden Explantate von Rückenmarkswurzelganglien von Küken verwendet, die in Nervenwachstumsversuchen leichter zu verwenden sind. Ohne zugesetzten NGF wurde eine minimale Wirkung der Immunophilinligandenwirkstoffe beobachtet. Die Hühnerzellen sind auf NGF empfindlicher als PC12-Zellen, so dass 0,1 ng/ml NGF verwendet wurden, um ein minimales Neuritenwachstum zu erzeugen und die neurotrophe Wirkung von Immunophilinliganden zu zeigen (Fig. 17, 18).

Rückenmarkswurzelganglien wurden aus Kükenembryos am 10. Tag der Gestation entnommen. Ganze Ganglionexplantate wurden auf mit einer dünnen Schicht Matrigel beschichteten 12-Lochplatten mit Liebovitz L15 plus Glucosemedium versehen mit 2 mm Glutamin und 10% fetalem Kalbsserum und auch mit einem Gehalt an 10 mu M Cytosin- beta -D-arabinofuranosid (Ara C) bei 37 DEG C in einer Atmosphäre von 5% CO2 kultiviert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die DRG mit verschiedenen Konzentrationen an Nervenwachstumsfaktor, Immunophilinliganden oder Kombinationen von NGF plus Wirkstoffen behandelt. Achtundvierzig Stunden nach der Wirkstoffbehandlung wurden die Ganglien sichtbar gemacht unter Phasenkontrast oder Hoffman-Modulationskontrast mit einem Zeiss Axiovert Inversionsmikroskop. Es wurden Mikroaufnahmen der Explantate aufgenommen und das Neuritenwachstum quantitativ bestimmt.

Neuriten, die länger sind als der DRG-Durchmesser wurden als positiv gezählt, wobei die Gesamtzahl der Neuriten pro Versuchsanordnung quantitativ erfasst wurde. Pro Probenvertiefung wurden drei bis vier DRG kultiviert und jede Behandlung wurde doppelt durchgeführt.

Die relative Stärke jedes der verschiedenen Immunophilinliganden zur Stimulierung des Nervenwachstums in den Ganglien war ähnlich wie ihre relativen Stärken in PC12-Zellen. Auf diese Weise ist Rapamycin der stärkste Wirkstoff mit einem EC50 von 1 nM, 10mal potenter als WAY-124,466, während FK506 einen EC50 von 1-2 nM zeigt.

Die maximale Zunahme der Anzahl der Fortsätze, ihre Länge und Verzweigung bei maximal wirksamen Konzentrationen der Immunophilinliganden und bei NGF (100 ng/ml) ist ziemlich ähnlich. Mit zunehmend erhöhten Konzentrationen der verschiedenen Wirkstoffe, wird eine grössere Zahl von Fortsätzen, aus gedehntere Verzweigung und eine höhere Länge der einzelnen Fortsätze beobachtet.

Die Stärken der Wirkstoffe zum Binden an FKBP-12 wurden durch Untersuchung der Inhibierung der <3>H-FK506-Bindung an rekombinantes FKBP-12 bestimmt. Es gibt eine auffällige Parallele zwischen den Affinitäten der Wirkstoffe für FKBP-12 und ihren Stärken zur Stimulierung des Neuritenwachstums und der Inhibierung der Rotamaseaktivität. Die Stimulierung des Nervenwachstums steht eindeutig nicht in Zusammenhang mit der Calcineurininhibierung. Die Calcineurininhibierung stimmt gut überein mit den immunsuppressiven Wirkungen, WAY-124,466 ist nicht immunsuppressiv und kann Calcineurin nicht inhibieren. Rapamycin ist ein starkes Immunsuppressiv, aber der Rapamycin-FKBP-12-Komplex bindet an RAFT-1, so dass es immunsuppressive Prozesse auslöst (Sabatini und Snyer, 1994; Snyder und Sabatini, 1995).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle 2
Neurotrophie von Immunophilinliganden ist parallel zur Inhibierung von Rotamase, nicht von Calcineurin
<tb>Head Col 1: Wirkstoff
<tb>Head Col 2: (<3>H)-FK506-FKBP12 (IC50)
<tb>Head Col 3: Calcineurin-
Inhibier.
<tb>Head Col 4: Rotamase
(Ki)
<tb>Head Col 5: Neuritenwachstum (ED50)
<tb><SEP>FK506<SEP>0,6 nM<SEP>ja<SEP>0,4 nM<SEP>0,5 nM
<tb><CEL AL=L>Rapamycin<SEP>0,5nM<SEP>nein<SEP>0,2 nM<SEP>0,5 nM
<tb><SEP>WAY-124,466<SEP>10,0 nM<CEL AL=L>nein<SEP>12,0 nM<SEP>10 nM
<tb><SEP>Cyclosporin A (CsA)<SEP>keines<SEP>ja<SEP>20 nM<SEP>50 nM
<tb></TABLE>

Die Fähigkeit von nicht immunsuppressiven Immunophilinliganden zur Förderung des Neuritenwachstums in Explantatkulturen von Rückenmarkswurzelganglien aus Küken wurden verglichen (Tabelle 3). Jede der Verbindungen ist unfähig, Calcineurin zu inhibieren, aber sie treten in Wechselwirkung mit dem Immunophilin FKBP-12, so dass sie die Rotamaseaktivität mit den verschiedenen Inhibitorkonstanten, die in Tabelle 3 angegeben sind, inhibieren.

Die Fähigkeit dieser Verbindungen ein Neuritenwachstum in den DRG zu fördern, stimmt mit ihrer Fähigkeit zur Inhibierung der Rotamaseaktivität von FKBP-12 gut überein.
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle 3
Neurotrophie von Immunophilinliganden ist parallel zur Inhibierung von Rotamase, nicht von Calcineurin
<tb>Head Col 1: Wirkstoff
<tb>Head Col 2: (<3>H)-FK506-
FKBP12 (IC50)
<tb>Head Col 3: Calcineurin-
Inhibier.
<tb>Head Col 4: Rotamase
(Ki)
<tb>Head Col 5: Neuritenwachstum (ED50)
<tb><SEP>Beisp. 12<SEP>8 mu M<SEP>nein<SEP>250 nM<SEP>300 nM
<tb><CEL AL=L>Beisp. 13<SEP>4 mu M<SEP>nein<SEP>25 nM<SEP>80 nM
<tb></TABLE>

Die sehr enge Korrelation zwischen den Fähigkeiten der Wirkstoffe zur Bindung an Immunophiline, was ihrer Rotamaseaktivität inhibiert und das Neuritenwachstum stimuliert, weist darauf hin, dass eine Inhibierung der Rotamaseaktivität für die neurotrophe Wirkung der Wirkstoffe verantwortlich ist. Die aussergewöhnlich hohe Fähigkeit der Wirkstoffe zur Stimulierung des Neuritenwachstums und zur Bindung an Immunophiline macht es sehr unwahrscheinlich, dass andere Targets für die neurotrophe Wirkung in Frage kommen könnten. Es ist vorstellbar, dass eine biologische Aktivität der Immunophiline ausser Rotamase von den Wirkstoffen beeinflusst sein könnte, um eine neurotrophe Wirkung zu vermitteln. Es wurde jedoch noch keine solche Aktivität berichtet.

Wegen der aussergewöhnlichen Fähigkeit der Wirkstoffe und der engen Korrelation zwischen der Rotamaseinhibierung und neurotrophen Wirkung ist zu schliessen, dass die Rotamaseinhibierung wahrscheinlich an der neurotrophen Wirkung beteiligt ist. Es wurde von einer Reihe von Proteinen berichtet, dass sie Substrate für die Rotamaseaktivität von Immunophilinen einschliesslich Kollagen (Steinmann et al., 1991) und Transferin (Lodish und King, 1991) sind. Kürzlich wurde berichtet von hochgereinigten Präparaten des Ryanodinrezeptors und des IP-3-Rezeptors, wichtigen intrazellulären Calciumkanälen, die in einem Komplex mit FKEP-12 vorliegen. Eine Dissoziierung des FKBP-12 von diesen Komplexen bewirkt, dass der Calciumkanal "undicht" wird (Cameron et al., 1995).

Calciumströme sind an der Neuritenextension beteiligt, so dass der IP-3-Rezeptor und der Ryanodinrezeptor an den neurotrophen Effekten der Wirkstoffe beteiligt sein können. Da die Wirkstoffe an FKBP-12 an dieselbe Stelle binden wie der IP-3-Rezeptor oder der Ryanodinrezeptor, wäre zu postulieren, dass die Wirkstoffe die Kanäle von FKBP-12 verschieben. Es wurde keine Wechselwirkung zwischen diesen Calciumkanälen im Cyclophilin berichtet, so dass dieses Modell die neurotrophe Wirkung von Cyclosporin A nicht erklären kann.

Die neurotrophe Wirkung der hier untersuchten Wirkstoffe tritt bei äusserst geringen Konzentrationen ein, was auf Fähigkeiten hinweist, die mit denen der neurotrophen Proteine vergleichbar sind wie dem Wachstumsfaktor des Gehirns, Neurotropin-3 und dem neurotrophen Wachstumsfaktor.

Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht als Beschränkung darauf zu betrachten. Alle Polymermolekulargewichte sind mittlere Durchschnittsmolekulargewichte. Alle Prozentangaben beruhen auf Gewichtsprozenten des endgültigen Abgabesystems oder der hergestellten Formulierung, sofern nichts anderes angegeben ist und alles ergibt insgesamt gleich 100 Gew.-%.

Beispielhafte Pipecolinsäurederivate, die für Anwendungen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen:

Beispiel 1

EMI44.1

Diese beispielhafte Verbindung eines Pipecolinsäurederivats ist offenbart bei Ocain et al. in: Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 192, Nr. 3, 1993. Die Verbindung wurde synthetisiert bei Wyeth-Ayerst von Dr. Phil Hughes durch Umsetzung von 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion mit Rapamycin.

Beispiel 2

EMI44.2

Diese Pipecolinsäurederivatverbindung ist offenbart bei Chakraborty et al. in: Chemistry and Biology, März 1995, 2:157-161.

Beispiele 3-5

EMI45.1

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Ikeda et al. in: J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 4143-4144 und werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 6-9

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Wang et al. in: Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Band 4, Nr. 9, S. 1161-1166, 1994, insbesondere die Verbindungen 2a-2d werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiel 10

EMI46.1

Dieses Beispiel eines Pipecolinsäurederivats, Verbindung 10, ist offenbart bei Birkenshaw et al. in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 4, Nr. 21, S. 2501-2506, 1994 und wird durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 11-21

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Holt et al. in: J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9925-9938, insbesondere die Verbindungen 4-14 und sie werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 22-30

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Caffery et al. in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 4, Nr. 21, S. 2507-2510, 1994 und sie werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiel 31

EMI47.1

Dieses Beispiel eines Pipecolinsäurederivats, Verbindung 31, ist offenbart bei Teague et al. in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 3, Nr. 10, S. 1947-1950, 1993 und wird durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 32-34

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Yamashita et al. in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 4, Nr. 2, S. 325-328, 1994, insbesondere die Verbindungen 11, 12 und 19 werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 35-55

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Holt et al. in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 4, Nr. 2, S. 315-320, 1994, insbesondere die Verbindungen 3-21 und 23-24 werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 56-68

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Holt et al. in: Bicorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 3, Nr. 10, S. 1977-1980, 1993, insbesondere die Verbindungen 3-15 und sie werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 69-83

Beispiele für Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind offenbart bei Hauske et al. in: J. Med. Chem. 1992, 35, 4284-4296, insbesondere die Verbindungen 6, 9-10, 21-24, 26, 28, 31-32 und 5255, die durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht werden.

Beispiel 84

EMI48.1

Dieses Beispiel eines Pipecolinsäurederivats ist offenbart bei Teague et al. in: Biaorganic & Med. Chem. Letters, Band 4, Nr. 13, S. 1581-1584, 1994 und wird durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 85-88

Beispiele von Pipecolinsäurederivatverbindungen sind offenbart bei Stocks et al. in: Bioorganic & Med. Chem. Letters, Band 4, Nr. 12, S. 1457-1460, 1994, insbesondere die Verbindungen 2, 15-17 und sie werden durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Beschreibung gemacht.

Beispiele 90-111

Weitere Beispiele von Pipecolinsäurederivaten sind in Schema 10 und den Tabellen 1-5 beschrieben.
EMI49.1

EMI50.1

EMI51.1

EMI52.1

EMI52.2

EMI53.1

EMI53.2

EMI54.1

EMI55.1

EMI56.1

EMI56.2

EMI57.1

EMI58.1

EMI58.2

EMI59.1

EMI60.1

EMI61.1

EMI61.2

EMI62.1

EMI62.2

EMI63.1

EMI63.2

EMI63.3

Neurotrophe Wirkung von Rotamaseinhibitoren

Tabelle I gibt eine Reihe von beanspruchten Beispielen an und ihre Fähigkeiten zur Auslösung trophischer Effekte in kultivierten sensorischen Neuronen, wie es oben beschrieben ist. Die Fig. 19 und 20 zeigen Mikroaufnahmen von Beispiel 111 und Beispiel 17, die das Neuritenwachstum in Kulturen von Rückenmarkswurzelganglien fördern.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle I
Fähigkeiten von Versuchsbeispielen in vitro
<tb>Head Col 1: Beisp.
<tb>Head Col 2:

Rotamaseinhibition
Ki, nM
<tb>Head Col 3: neurotrophe ED50
Küken-DRG, nM
<tb><SEP>6<SEP>140<SEP>25
<tb><SEP>9<SEP>13<SEP>0.030
<tb><SEP>11<CEL AL=L>170<CEL AL=L>1
<tb><SEP>12<SEP>250<SEP>300
<tb><SEP>13<SEP>25<SEP>80
<tb><SEP>15<SEP>17<CEL AL=L>0.30
<tb><SEP>19<SEP>12<SEP>0.017
<tb><SEP>36 (SEP)<> 10,000 (SEP)<> 10,000
<tb><CEL AL=L>41<SEP>1300<SEP>5000
<tb><SEP>50 (SEP)<> 10,000 (SEP)<> 10,

000
<tb><SEP>90<SEP>1800<CEL AL=L>2500
<tb><SEP>91<SEP>28<SEP>200
<tb><SEP>92<SEP>39<SEP>90
<tb><SEP>93<SEP>75<CEL AL=L>35
<tb><SEP>94<SEP>70<SEP>8
<tb><SEP>95<SEP>165<SEP>5-10
<tb><SEP>96<SEP>740<CEL AL=L>10-20
<tb><SEP>97<SEP>725<SEP>150
<tb><SEP>98<SEP>130<SEP>75
<tb><SEP>99<SEP>30<CEL AL=L>5
<tb><SEP>100<SEP>60<SEP>43
<tb><SEP>101<SEP>15<SEP>0.17
<tb><SEP>102<SEP>12<CEL AL=L>2.5
<tb><SEP>103<SEP>120<SEP>3
<tb><SEP>104<SEP>20<SEP>.016
<tb><SEP>105<SEP>103<CEL AL=L>6
<tb><SEP>106<SEP>760<SEP>1
<tb><SEP>107<SEP>210<SEP>0.82
<tb><SEP>108<SEP>32<CEL AL=L>0.29
<tb><SEP>109<SEP>2<SEP>0.08
<tb><SEP>110<SEP>24<SEP>0.002
<tb><SEP>111<CEL AL=L>5<CEL AL=L>0.08
<tb></TABLE>

Aktivität von Beispielverbindungen in einem Modell der Nervenregeneration in vivo

Ischiasnervaxotomie

Sechs Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden anästhesiert und der Ischiasnerv freigelegt und auf Höhe der Hüfte mit Pinzetten gequetscht. Testverbindungen oder Vehikel wurden subkutan direkt vor der Läsion und in den folgenden 18 Tagen täglich verabreicht. Teilstücke des Ischiasnervs wurden mit Holmes-Silberfärbung angefärbt, um die Anzahl der Axone quantitativ zu bestimmen, und mit Luxol-Blau, um das Ausmass der Myelinisation quantitiv zu bestimmen. Achtzehn Tage nach der Läsion zeigte sich eine deutliche Abnahme in der Anzahl der Axone (50% Abnahme im Vergleich zur Kontrolle ohne Läsion) und im Ausmass der Myelinisation (90% Abnahme im Vergleich zur Kontrolle ohne Läsion) in mit dem Vehikel behandelten Tieren.

Die Verabreichung von Beispiel 12 (30 mg/kg s.c.) oder Beispiel 13 (mg/kg, s.c.) direkt vor der Läsion und in den folgenden 18 Tagen täglich führte zu einer deutlichen Regeneration sowohl der Anzahl der Axone (25% bzw. 5% Abnahme, im Vergleich zur Kontrolle ohne Läsion) und den Ausmass der Myelinisation (65% bzw. 50%, im Vergleich zur Kontrolle ohne Läsion) im Vergleich zu mit dem Vehikel behandelten Tieren. Die deutliche Wirksamkeit der Beispiele 12 und 13 geht einher mit ihrer starken Aktivität zur Inhibierung der Rotamaseaktivität und zur Stimulierung des Neuritenwachstums in Küken-DRG und ihre relativen Fähigkeiten in vivo gehen parallel zu ihren Fähigkeiten in vitro (Tabelle I).

Diese Ergebnisse sind in Fig. 21 dargestellt. "Sham" bezeichnet Tiere, die Vehikel erhielten, aber keine Läsion hatten; "Vehicle" bezeichnet Tiere, die eine Läsion hatten und nur Vehikel erhielten (d.h. keinen Wirkstoff). Beispiel 12 und Beispiel 13 zeigten eine auffällige Ähnlichkeit zu den "Sham"-Tieren, was die starke neuroregenerative Wirkung dieser Verbindungen in vivo zeigt. Diese Daten sind in Tabelle II dargestellt.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle II
<tb>Head Col 1: Behandlung
<tb>Head Col 2: Axonanzahl
(% Kontrolle)
<tb>Head Col 3: Myelinwert
<tb><SEP>Sham<SEP>100<SEP>100
<tb><SEP>Läsion + Vehikel<SEP>50<CEL AL=L>10
<tb><CEL AL=L>+ Beisp. 12 (30 mg/kg s.c.)<SEP>75<SEP>35
<tb><SEP>+ Beisp. 13 (30 mg/kg s.c.)<SEP>100<SEP>50
<tb></TABLE>

Bei der hier beschriebenen Erfindung ist ersichtlich, dass sie auf zahlreiche Arten variiert werden kann. Solche Variationen sind nicht als Abweichung vom Geist und dem Rahmen der Erfindung zu betrachten und alle Modifikationen liegen im Rahmen der Ansprüche.

Claims

1. Verwendung einer wirksamen Menge einer organische Substituenten R<1> und R<2> umfassenden Verbindung der Formel: EMI67.1 im folgenden nicht immunsuppressives Pipecolinsäurederivat genannt, mit einer Affinität für Immunophiline vom FKBP-Typ zur Herstellung eines Arzneimittels für neurologische Störungen, bei welchem das nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivat, in Verbindung mit einem Immunophilin vom FKBP-Typ, welches eine Rotamaseaktivität zeigt, die Rotamaseaktivität des Immunophilins inhibiert.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für neurologische Störungen bei einem Tier und zur Stimulierung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven oder zur Förderung der Neuronenregeneration.

3.

Verwendung nach Anspruch 2, worin die neurologische Störung eine Störung ist aus der Gruppe bestehend aus Neuropathien des peripheren Nervensystems bedingt durch physische Verletzung oder Krankheitszustände, physische Schädigung des Gehirns, physische Schädigung des Rückenmarks, Schlaganfall in Verbindung mit Gehirnschädigung und neurologische Störungen in Verbindung mit Neurodegeneration.

4. Verwendung nach Anspruch 3, worin die neurologische Störung eine Störung ist aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und anyotrophe Lateralsklerose.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI68.1

6.

Verwendung nach Anspruch 1, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI69.1

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI69.2

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.

9. Verwendung nach Anspruch 2 in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3.

10.

Verwendung nach Anspruch 9, worin die neurologische Störung eine Störung ist aus der Gruppe bestehend aus Neuropathien des peripheren Nervensystems bedingt durch physische Verletzung oder Krankheitszustände, physische Schädigung des Gehirns, physische Schädigung des Rückenmarks, Schlaganfall in Verbindung mit Gehirnschädigung und neurologische Störungen in Verbindung mit Neurodegeneration.

11. Verwendung nach Anspruch 10, worin die neurologische Störung eine Störung ist aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose.

12. Verwendung nach Anspruch 9, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI70.1

13.

Verwendung nach Anspruch 9, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsaurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI71.1

14. Verwendung nach Anspruch 9, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI71.2

15. Verwendung nach Anspruch 9, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.

16. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung oder Förderung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven.

17.

Verwendung nach Anspruch 16 in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors zur Stimulierung oder Förderung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3.

18. Verwendung nach Anspruch 16, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI72.1

19. Verwendung nach Anspruch 16, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI73.1

20. Verwendung nach Anspruch 16, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI73.2

21.

Verwendung nach Anspruch 16, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.

22. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des Wachstums von geschädigten peripheren Nerven.

23. Verwendung nach Anspruch 22 in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3.

24. Verwendung nach Anspruch 22, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI74.1

25.

Verwendung nach Anspruch 22, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI75.1

26. Verwendung nach Anspruch 22, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI75.2

27. Verwendung nach Anspruch 22, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.

28. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Neuronenregeneration bei Tieren.

29.

Verwendung nach Anspruch 28 in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors zur Förderung der Neuronenregeneration ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3.

30. Verwendung nach Anspruch 28, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI76.1

31. Verwendung nach Anspruch 28, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI77.1

32. Verwendung nach Anspruch 28, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI77.2

33.

Verwendung nach Anspruch 28, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.

34. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung einer Neurodegeneration bei Tieren.

35. Verwendung nach Anspruch 34 in Kombination mit einer wirksamen Menge eines neurotrophen Faktors zur Vermeidung einer Neurodegeneration ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem neurotrophen Wachstumsfaktor, dem Wachstumsfaktor des Gehirns, dem Wachstumsfaktor der Glia, dem ziliaren neurotrophen Faktor und Neurotropin-3.

36. Verwendung nach Anspruch 34, worin die Pipecolinsäurederivatverbindung eine Way-124,666 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI78.1

37.

Verwendung nach Anspruch 34, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine Rap-Pa genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI79.1

38. Verwendung nach Anspruch 34, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung eine SLB-506 genannte Verbindung ist mit der Formel: EMI79.2

39. Verwendung nach Anspruch 34, worin die nicht immunsuppressive Pipecolinsäurederivatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen der genannten Beispiele 3-84 und 86-88.