SI9620089A - Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti - Google Patents

Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti Download PDF

Info

Publication number
SI9620089A
SI9620089A SI9620089A SI9620089A SI9620089A SI 9620089 A SI9620089 A SI 9620089A SI 9620089 A SI9620089 A SI 9620089A SI 9620089 A SI9620089 A SI 9620089A SI 9620089 A SI9620089 A SI 9620089A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
acid derivative
use according
pipecolic acid
neurotrophic
immunosuppressive
Prior art date
Application number
SI9620089A
Other languages
English (en)
Inventor
Joseph Steiner
Solomon Snyder
Gregory S. Hamilton
Ted Dawson
Original Assignee
Guilford Pharmaceuticals Inc.,
Johns Hopkins University School Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27044341&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SI9620089(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/474,072 external-priority patent/US5798355A/en
Application filed by Guilford Pharmaceuticals Inc.,, Johns Hopkins University School Of Medicine filed Critical Guilford Pharmaceuticals Inc.,
Publication of SI9620089A publication Critical patent/SI9620089A/sl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4535—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom, e.g. pizotifen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/5025—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Abstract

Predloženi izum se nanaša na postopek za uporabo nevrotrofnih spojin derivatov pipekolinske kisline, ki imajo afiniteto za imunofiline tipa FKBP, kot inhibitorjev encimske aktivnosti, povezane z imunofilinskimi proteini, in posebno kot inhibitorjev peptidil-prolil izomerazne ali rotamazne encimske aktivnosti, da se stimulira ali pospeši nevronalna rast ali regeneracija.ŕ

Description

1. Guilford Pharmaceuticals Inc.
2. Johns Hopkins University School of Medicine
Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti
Predložena prijava je delna nadaljevalna prijava US patentne prijave ser. št. 08/474,072, vložene 7. junija 1995.
Predloženi izum se nanaša na postopek za uporabo nevrotrofnih spojin derivatov pipekolinske kisline, ki imajo afiniteto za imunofiline tipa FKBP, kot inhibitorjev encimske aktivnosti, povezane z imunofilinskimi proteini, in posebno kot inhibitorjev peptidil-prolil izomerazne ali rotamazne encimske aktivnosti.
Izraz imunofilin se nanaša na številne proteine, ki rabijo kot receptorji za osnovna imunosupresantna zdravila ciklosporin A (CsA), FK506 in rapamicin. Znani razredi imunofilinov so ciklofilini in FK506-vezivni proteini, kot je FKBP. Ciklosporin A veže na ciklofilin, medtem ko FK506 in rapamicin vežeta na FKBP. Ti kompleksi imunofilin-zdravilo so povezani z nizom intracelularnih signalnih transdukcijskih sistemov, posebno v imunskem in živčnem sistemu.
Imunofilini so znani, da imajo peptidil-prolil izomerazno (PPI-azno) ali rotamazno encimsko aktivnost. Ugotovljeno je, da ima rotamazna aktivnost vlogo pri kataliziranju interkonverzije cis in trans izomera imunofilinskih proteinov.
Imunofilini so bili originalno odkriti in študirani v imunskem tkivu. Strokovnjaki so na začetku domnevali, da inhibicija imunofilinske rotamazne aktivnosti vodi do inhibicije T-celične proliferacije in pri tem povzroči imunosupresivno delovanje, ekshibirano z imunosupresivnimi zdravili, kot so ciklosporin A, FK506 in rapamicin. Iz nadaljnjih študij je razvidno, da inhibicija rotamazne aktivnosti sama po sebi ni zadostna za imunosupresantno aktivnost. Schreiber et al. Science 1990, 250, 556-559. Namesto tega se zdi, da imunosupresija izvira iz formulacije kompleksa imun2 osupresantnih zdravil in imunofilinov. Pokazano je bilo, da kompleksi imunofilinzdravilo vzajemno delujejo s ternarnimi proteinskimi tarčami, kot je njihov način delovanja.
Schreiber et al., Celi 1991, 66, 807-815. V primeru FKBP-FK506 in FKBP-CsA, kompleksi zdravilo-imunofilin vežejo na encim kalcinevrin, pri čemer inhibirajo signaliziranje T-celičnega receptorja, kar vodi do T-celične proliferacije. Podobno kompleks rapamicina in FKBP vzajemno deluje z RAFT1/FRAP proteinom in inhibira signaliziranje IL-2 receptorja.
Za imunofiline so ugotovili, da so prisotni v visokih koncentracijah v centralnem živčnem sistemu. Imunofilini so 10-50-krat bolj obogateni v centralnem živčnem sistemu kot v imunskem. V nevralnih tkivih se zdi, da imunofilini vplivajo na sintezo dušikovega oksida, sproščanje nevrotransmiterjev in ekstenzijo nevronalnih podaljškov.
Dušikov oksid ima različne vloge v telesu. V možganih se zdi, da je dušikov oksid nevrotransmiter. Tvori se iz arginina z dušikovo oksidno sintetazo, ki oksidira gvanidino skupino arginina, pri čemer se tvori dušikov oksid in citrulin. Stimulacijo N-metil-d-aspartata (NMDA) podtipa glutamatnih receptorjev hitro in izrazito aktivira dušikova oksidna sintetaza in stimulira tvorbo cGMP. Inhibicija dušikove oksidne sintetaze z argininskimi derivati, kot je nitroarginin, blokira glutamatno inducirano povečanje nivojev cGMP. Dušikova oksidna sintetaza je Ca-kalmodulin, ki potrebuje encim in aktivacija N-metil-d-aspartatnega receptorja stimulira aktivnost dušikove oksidne sintetaze, ker ima N-metil-d-aspartatni receptor kalcijev kanal, ki se odpre z glutamatno stimulacijo, s čemer dopusti, da pride kalcij hitro v celice in aktivira dušikovo oksidno sintetazo.
Glutamat je fiziološki nevrotransmiter. Kadar se le-ta sprosti v prebitku, izzove nevrotoksičnost preko N-metil-d-aspartatnih receptorjev. Obdelava cerebralnih kortikalnih nevronalnih kultur z glutamatom ali N-metil-d-aspartatom uniči 90 % nevronov in te učinke blokirajo zdravila N-metil-d-aspartatni antagonisti. Zato N-metild-aspartatno toksičnost smatrajo, da je glavni povzročitelj nevronalne poškodbe po vaskularni kapi. Tako pride do močnega sproščanja glutamata po cerebralni vaskularni okluziji in številni N-metil-d-aspartatni antagonisti blokirajo poškodbo zaradi kapi. Fosforilacija dušikove oksidne sintetaze inhibira njegovo katalitično aktivnost. S povečevanjem fosforilacije dušikove oksidne sintetaze FK506 lahko funkcionalno inhibirajo tvorbo dušikovega oksida in tako blokirajo glutamatno nevrotoksičnost.
Nizke koncentracije obeh FK506 in ciklosporina A vsekakor blokirajo N-metil-daspartatno nevrotoksičnost v kortikalnih kulturah. Mediatorska vloga FKBP je evidentna, ker rapamicin spremeni terapevtski učinek FK506. Verjetno bi se FK506, kije že na tržišču kot imunosupersant, lahko klinično uporabljal pri pacientih s kapjo.
FK506 poveča tudi fosforilacijo proteina-43 (GAP43), povezanega z rastjo. GAP43 je vključen v ekstenzijo nevronalnih podaljškov in za njegovo fosforilacijo se zdi, da poveča to aktivnost. V skladu s tem so raziskali učinke FK506, rapamicina in ciklosporina pri ekstenziji nevronalnih podaljškov z uporabo celic PC12. Celice PC12 so kontinuirna linija celic, podobnih nevronalnim, ki razširjajo nevrite, kadar so stimulirane z živčnim rastnim faktorjem (NGF).
Presenetljivo so ugotovili, da pikomolarne koncentracije imunosupresanta, kot sta FK506 in rapamicin, stimulirajo nevritno izraščanje v celicah PC12 in senzornih živcih, in sicer v ganglionskih celicah dorzalnega debla (DRGs). Lyons et al. proč. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 3191-3195. V vseh živalskih eksperimentih je bilo prikazano, da FK506 stimulira regeneracijo živcev po poškodbi obraznih živcev in ima za posledico funkcionalno okrevanje pri živalih s poškodbami ishiadičnih živcev.
Bolj posebno so ugotovili, da so zdravila z visoko afiniteto za FKBP močni rotamazni inhibitorji in kažejo odlične nevrotrofne učinke. Snyder et al., Immunophilins and the Nervous System, Nature Medicine, vol. 1, št. 1, januar 1995, 32-37. Te ugotovitve navajajo k uporabi imunosupresantov pri zdravljenju različnih perifernih nevropatij in povečevanju nevronalne ponovne rasti v centralnem živčnem sistemu (CNS). Iz študijev je razvidno, da do nevrodegenerativnih motenj, kot so Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofna lateralna skleroza (ALS), lahko pride zaradi izgube ali zmanjšanja razpoložljivosti nevrotrofne substance, specifične za posebno populacijo nevronov, prizadetih pri motnji.
Identificirani so bili različni nevrotrofni faktorji, ki vplivajo na specifične nevronalne populacije v centralnem živčnem sistemu. Tako npr. obstajajo hipoteze, da je Alzheimerjeva bolezen posledica zmanjšanja oz. izgube živčnega rastnega faktorja (NGF). Na ta način so predložili zdravljenje pacientov z Alzheimerjevo boleznijo z eksogenim živčnim rastnim faktorjem ali drugimi nevrotrofnimi proteini, kot so rastni faktor, izveden iz možganov, rastni faktor, izveden iz glije, ciliarni nevrotrofni faktor in nevrotropin-3, da bi povečali preživetje degenerirajočih nevronalnih populacij.
Klinične aplikacije teh proteinov pri različnih stanjih nevroloških bolezni so ovirane zaradi težav pri dajanju in bio uporabnosti velikih proteinov tarčam živčnega sistema. V primerjavi s tem so imunosupresantna zdravila z nevrotrofno aktivnostjo relativno majhna in razkrivajo odlične bio-uporabnosti in specifičnosti. Vendar pa imunosupresanti kažejo pri kroničnem dajanju številne potencialne resne stranske učinke, vključno nevrotoksičnost, kot npr. poslabšanje glomerularne filtracije in ireverzibilno intersticialno fibrozo (Kopp et al., 1991, J. Am. Soc. Nephrol. 1:162); nevrološke deficite, kot npr. neprostovoljne tremorje ali nespecifično cerebralno angino, kot npr. nelokalizirane glavobole (De Groen et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:861); in vaskularno hipertenzijo z zapleti, ki so posledica le-te (Kahan et al., 1989 N. Engl. J. Med. 321:1725).
Predloženi izum zagotavlja ne-imunosupresivne kot tudi imunosupresivne spojine derivate pipekolinske kisline, ki vsebujejo majhne molekule FKBP - rotamaznih inhibitorjev, ki so ekstremno močni pri povečevanju nevritnega izraščanja in pri pospeševanju nevronalne rasti ter regeneraciji pri različnih nevropatoloških situacijah, kjer je nevronalno zdravljenje možno olajšati, ki vključujejo poškodbe perifernih živcev s fizično poškodbo ali bolezenskim stanjem, kot so diabetes, fizične poškodbe centralnega živčnega sistema (hrbtenjača in možgani), možganske poškodbe, povezane s kapjo, in pri zdravljenju nevroloških motenj, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo, vključno Parkinsonove bolezni, Alzheimerjeve bolezni in amiotrofne lateralne skleroze.
Predloženi izum se nanaša na postopek za uporabo nevrotrofnih spojin derivatov pipekolinske kisline, ki imajo afiniteto za imunofiline tipa FKBP kot inhibitorjev encimske aktivnosti, povezane z imunofilinskimi proteini in posebno kot inhibitorjev peptidil-prolil izomerazne ali rotamazne encimske aktivnosti.
Prednostna izvedba predloženega izuma je postopek za zdravljenje nevroloških motenj pri živalih, označen s tem, da obsega:
dajanje živali efektivne količine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, da se stimulira rast poškodovanih perifernih živcev ali pospeši nevronalno regeneracijo, pri čemer imunofilin tipa FKBP kaže rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Druga prednostna izvedba predloženega izuma je postopek za zdravljenje nevrološke motnje pri živalih, označen s tem, da obsega:
dajanje živali efektivne količine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, v kombinaciji z efektivno količino nevrotrofnega faktorja, izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo nevrotrofni rastni faktor, rastni faktor, izveden iz možganov, rastni faktor, izveden iz glije, cilialni nevrotrofni faktor in nevrotropin3, da se stimulira rast poškodovanih perifernih živcev ali pospeši nevronalna regeneracija, pri čemer imunofilin tipa FKBP kaže rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Nadaljnja prednostna izvedba v smislu izuma je postopek za stimuliranje rasti poškodovanih perifernih živcev, označen s tem, da obsega:
dajanje poškodovanim perifernim živcem efektivne količine spojine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, da se stimulira ali pospeši rast poškodovanih perifernih živcev, pri čemer imunofilini tipa FKBP kažejo rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Nadaljnja prednostna izvedba predloženega izuma je postopek za stimuliranje rasti poškodovanih perifernih živcev, označen s tem, da obsega:
dajanje poškodovanim perifernim živcem efektivne količine spojine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, da se stimulira rast poškodovanih perifernih živcev, pri čemer imunofilin tipa FKBP kaže rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Nadaljnja prednostna izvedba predloženega izuma je postopek za pospeševanje nevronalne regeneracije in rasti pri živalih, označen s tem, da obsega: dajanje živali efektivne količine spojine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, da se pospeši nevronalna regeneracija, pri čemer imunofilini tipa FKBP kažejo rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Še nadaljnja prednostna izvedba predloženega izuma je postopek za preprečevanje nevrodegeneracije pri živalih, označen s tem, da obsega:
dajanje živalim efektivne količine derivata pipekolinske kisline, ki ima afiniteto za imunofiline tipa FKBP, da se prepreči nevrodegeneracija, pri čemer imunofilin tipa FKBP kaže rotamazno aktivnost in derivat pipekolinske kisline inhibira navedeno rotamazno aktivnost imunofilina.
Kratek opis slik
Slika 1
FKBP-12 in GAP-43 ekspresija v obraznem nukleusu po strtju živca. Hibridizacija in situ, pri čemer primerjamo časovni potek ekspresije mRNA v obraznem nukleusu za FKBP12 (levo ) in GAP-43 (desno). Desni obrazni nukleus je ipsilateralen glede na strtje in leva stran je neoperirana kontrola (sl. IB). Hibridizacija in situ za FKBP-12 na neobdelani kontroli (levo) in za kalcinevrin Αα,β 7 dni po strtju obraznega živca (desno).
Poskuse smo ponovili vsaj 3-krat s podobnimi rezultati.
Slika 2
Lokalizacija FKBP-12 za obrazne motorne nevrone po strtju živca. Fotomikrodiagrami v svetlem polju hibridizacije in situ za FKBP-12 v motornih nevronih obraznega nukleusa 7 dni po strtju (sl. 2A) in v motornih nevronih kontrolnega obraznega nukleusa (sl. 2B).
Slika 3
Regulacija navzgor mRNA FKBP-12 v motornih nevronih ledvene hrbtenjače po strtju ishiadiČnega živca. Hibridizacija in situ za FKBP-12 7 dni po strtju desnega ishiadičnega živca. Zgornji panel (sl. 3A) prikazuje odziv motornih nevronov v ventralnem traktu nižje ledvene hrbtenjače (označeno s puščico). Fotomikodiagrami v svetlem polju ustreznih poolov motornih nevronov so prikazani na spodnjih panelih: (sl. 3B) leva stran kontralateralno glede na strti živec; (sl. 3C), desna stran ipsilateralno glede na strti živec. Ta poskus smo ponovili 3-krat s podobnimi rezultati.
Slika 4
Indukcija FKBP in mRNA FKBP-12 v ganglionu dorzalnega debla 1 in 6 tednov po strtju ishiadičnega živca. Fotomikrodiagrami v temnem polju sekcij skozi L4ganglion dorzalnega debla ipsilateralno glede na strti ishiadični živec, izvedenih za
FKBP-hibridizacijo in situ, so prikazani NA levih panelih in za avtoradiografijo [3H]FK506 na desnih. Te rezultate smo ponovili 3-krat za vsako časovno točko.
Slika 5
Ricinska poškodba desnega obraznega živca. Nissl barva (zgornji panel, sl. 5A) razkriva ekstenzivno degeneracijo motornih nevronov v desnem obraznem nukleusu s spremljajočo glialno proliferacijo 7 dni po injekciji ricina v obrazni živec. Hibridizacija in situ za FKBP mRNA 7 dni po ricinski poškodbi obraznega živca/nukleusa je prikazana na spodnjem panelu (sl. 5B). Ta poskus smo ponovili 3-krat s podobnimi rezultati.
Slika 6 [3H]FK506-vezava v segmentih ishiadičnega živca 7 dni po strtju. Diagram ponazarja 3 mm-segmente odvzetega živca: konstrikcije označujejo položaje ligatur, apliciranih na dan 7 za kolekcijski čas 6 h, kot je opisano v postopkih. Distalno ligaturno mesto je 10 mm proksimalno glede na originalno mesto strtja. Anterogradni transport FKBP je 124 mm/dan. Podatki so povprečje ± S.E.M. (n = 3).
Slika 7
Transport FKBP v ishiadičnem živcu. Fotomikrodiagrami v temnem polju sekcij skozi kontrolni (neobdelani) ishiadični živec in mesto strtja ishiadičnega živca po 7 dneh, izdelano za hibridizacijo FKBP-12 in situ (sl. 7A, sl. 7B) in za avtoradiografijo [3H]FK-506 (sl. 7C, sl. 7D). Puščice označujejo stran strtja živca. Ta poskus smo ponovili 3-krat s podobnimi rezultati.
Slika 8
Nivoji [3H]FK506-vezave v celicah PC-12; vzdrževano v prisotnosti ali odsotnosti NGF (50 ng/ml). n = 3 za vsako časovno točko. Stolpci prikazujejo S.E.M.
Slika 9
Povečanje nevritnega izraščanja v celicah PC-12, posredovano z imunosupresanti.
Hoffmanovi kontrastni fotomikrodiagrami (64) kultur, zraslih v 48 urah v prisotnosti
NGF z ali brez dodanega FK506 ali rapamicina. Sl. 9A: rast celic PC-12 v 1,0 ng/ml NGF. Sl. 9B: 50 ng/ml NGF. Sl. 9C: 1,0 ng/ml NGF in 100 nM FK506. Sl. 9D: 1,0 ng/ml NGF in 100 nM rapamicina. 200-kratno povečanje.
Slika 10
Učinki FK506 na nevritno izraščanje v celicah PC-12. Kulture obdelamo z različnimi koncentracijami NGF v prisotnosti ali odsotnosti 100 nM FK506; nevritno brstenje izmerimo pri 48 h. Izraščanje kvantitativno ugotovimo, kot je opisano v postopkih, s štetjem celic z nevritnimi podaljški, večjimi od 5 μτη. n = 4 ločeni poskusi za vsako točko in stolpci napak pomenijo SEM.
Slika 11
Zveza koncentracija-odziv za nevritno izraščanje v celicah PC-12, omogočeno s FK506. Celice obdelujemo 48 h z 1 ng/ml NGF in različnimi koncentracijami FK506. Odziv nevritnega izraščanja izmerimo, kot je opisano na sl. 10 in s postopki, n = 4 ločeni poskusi za vsako podatkovno točko ‘p <0,001 Študentov t-test.
Slika 12 [3H]FK-506-autoradiografija eksplantnih kultur gangliona dorzalnega debla. Po 26 dneh kultiviranja s 100 ng/ml NGF kažejo ekstenzivni podaljški obilna srebrna zrna, povezana z FKBP. Avtoradiografska zrna odpravimo z 1 μΜ neoznačenega FK506.
Slika 13
Fazno kontrastni mikrodiagrami ganglijev dorzalnega debla, zraslih z različnimi substancami. Sl. 13A: NGF 100 ng/ml, sl. 13B: FK506 1 μΜ, sl. 13C: FK506 1 μΜ in protitelo anti-NGF, sl. 13D: ni dodanega rastnega faktorja, sl. 13E: FK506 1 pM, Sl. 13F: FK506 1 μΜ in rapamicin 1 μΜ. Merilni stolpec je 205 μΜ. NGF proizvede obilno aksonsko izraščanje (Sl. 13A) kot tudi 1 μΜ FK506 (sl. 13B). Učinki FK506 so v bistvu zmanjšani z znižanjem koncentracije na lpM (sl. 13E). Vendar je nevritno izraščanje z lpM FK506 večje kot v njegovi odsotnosti (sl. 13D). Učinki FK506 se zmanjšajo tudi z dodajanjem protitelesa anti-NGF, da eliminiramo učinke NGF, proizvedene z ne-nevronalnimi celicami v kulturah. Obilni nevriti, ki nastanejo v velikih fasciklih v odziv na NGF (100 mg/ml) (sl. 13A) ali 1 μΜ FK506 (sl. 13B), so vidni beli, medtem ko so majhni fascikli ali individualni nevriti vidni črni. Nenevronalne celice, Schwannove celice in nekateri fibroblasti so bolj evidenti z 1 pM FK506 (sl. 13E) ali protitelesom anti-NGF (sl. 13C) kot z 1 μ,Μ FK506 (sl. 13B). NGF, proizveden z ne-nevronalnimi celicami v kulturah, ima za posledico omejeno aksonsko izraščanje vidno v kulturah brez dodanih rastnih faktorjev (sl. 13D). Veliko število refraktilnih ne-nevronalnih celic, ki se zdijo bele, ima tendenco, da zasenčijo malo nevritov (sl. 13D). Rapamicin popolno inhibira aksonsko izraščanje v prisotnosti FK506 (sl. 13F). Mikrodiagrami predstavljajo 12-30 ganglijev za vsak eksperimentalni pogoj. Razlike med vsemi poskusnimi skupinami so zelo reproducibilne.
Slika 14
Učinki FK506 in rapamicina na nevritne ekstenzije, posredovani z NGF v celicah PC-12. Celice PC-12 (pasaža 60) obdelamo z različnimi koncentracijami samega NGF ali v prisotnosti 100 nM FK506, 100 nM rapamicina ali 100 nM Way-124,466. Nevritno izraščaje izmerimo po 96 urah pri celicah, ki nosijo podaljške, daljše od premera celic, in jih označimo kot pozitivne, n = 3 ločene poskuse za vsako točko in stolpci napak pomenijo S.E.M.
Slika 15
Pikomolarne koncentracije (A) FK506 in (B) rapamicina in Way-124,466 omogočajo nevritno ekstenzijo, izzvano z NGF (0,5 ng/ml) v celicah PC-12. Nizko pasažo celic PC-12 obdelujemo 4 dni z 0,5 ng/ml NGF v prisotnosti različnih koncentracij FK506 (□), rapamicina ( ) ali Way-124,466 ( ). Nevritno ekspresijo kvantitativno določimo, kot je opisano zgoraj na sl. 14. Nivoji nevritne produkcije v prisotnosti 0,5 ng/ml NGF (označeno L) in 50 ng/ml NGF (označeno H) so označeni za primerjalne namene.
Slika 16
Fotomikrodiagrami celic PC12, obdelanih z imunofilinskima ligandoma FK506 in rapamicinom + 0,5 ng/ml NGF samega ali 50 ng/ml NGF, pri čemer prikazujejo: sl. 16A: neobdelane celice PC-12; sl. 16B: celice PC-12, obdelane z NGF; sl.l6C: celice PC-12, obdelane z 0,5 ng/ml NGF; sl.l6D: celice PC-12, obdelane z 0,5 nM FK506; sl. 16E: celice PC-12, obdelane z rapamicinom (1 nM) in sl.l6F: celice PC-12, obdelane z Way-124,466 (1 nM).
Slika 17
Imunofilinski ligandi z nižjo količino NGF,potrebno, da proizvede maksimalno nevritno ekstenzijo v piščančjih senzornih ganglijih. Celotne eksplante ganglionov dorzalnega debla izoliramo iz 9-10-dnevnih piščančjih embriov in kultiviramo v posodah z 12 vdolbinami, premazanimi z matrigelom, ki vsebujejo medij L15 in visoko glukozo, s fetalnim telečjim serumom (10 %), dopolnjenim z 10 μΜ Ara C penicilinom in streptomicinom pri 37 °C v atmosferi s 5 % CO2. Senzorne ganglije obdelujemo z 1 ng/ml NGF, 1 ng/ml NGF in 100 nM FK506 ali 100 ng/ml NGF 48 h, preštejemo nevronalne podaljške in jih fotografiramo.
Slika 18
FK506, rapamicin in Way-124,466 omogočajo nevritno produkcijo, odvisno od NGF v senzornih ganglijih. Eksplante piščančjih DRG kultiviramo, kot je opisano pri sl. 17, zgoraj. FK506, rapamicin in Way-124,466 (100 nM vsakega plus ali minus 0,1 ng/ml NGF) dodamo eksplantnim kulturam DRG. Pri 48 h kvantitavino določimo nevritno izraščanje in kulture fotografiramo.
Slika 19
Fotomikrodiagram Primera 111, ki pospešuje nevritno izraščanje v piščančjih ganglionskih kulturah dorzalnega debla. Trije panel prikazujejo nevritno izraščanje pri koncentracijah 1 pM (levi panel), 100 pM (srednji panel) in 100 nM (desni panel) Primera 111.
Slika 20
Fotomikrodiagram Primera 17, ki pospešuje nevritno izraščanje v ganglionskih kulturah dorzalnega debla. Trije panel prikazujejo nevritno izraščanje pri koncentracijah 1 pM (levi panel), 100 pM (srednji panel) in 100 nM (desni panel) Primera 17.
Slika 21
Fotomikrodiagram Primera 102, ki pospešuje nevritno izraščanje v ganglionskih kulturah dorzalnega debla. Trije paneli prikazujejo nevritno izraščanje pri koncentracijah 1 pM (levi panel), 100 pM (srednji panel) in 100 nM (desni panel) Primera 102.
Nove nevrotrofne spojine derivati pipekolinske kisline v smislu izuma imajo afiniteto za FK506-vezivne proteine, kot je FKBP-12. Kadar so nevrotrofne spojine v smislu izuma vezane na FKBP je zanje ugotovljeno, da inhibirajo prolil-peptidil cis-trans izomerazno aktivnost ali rotamazno aktivnost vezivnega proteina in nepričakovano stimulirajo nevritno rast.
Spojine v smislu izuma lahko uporabimo v obliki soli, izvedenih iz anorganskih ali organskih kislin in baz. Med take kislinske soli so vključene naslednje: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat butirat, citrat, kamforat, kafrasulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat heptanoat, heksanoat, hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocianat, tozilat in undekanoat. Bazne soli vključujejo amonijeve, soli alkalijskih kovin, kot so natrijeve in kalijeve, soli zemeljskoalkalijskih kovin, kot so kalcijeve in magnezijeve, soli z organskimi bazami, kot dicikloheksilaminske, N-metil-Dglukamin in soli z amino kislinami, kot so arginin, lizin itd. Prav tako lahko kvaterniziramo bazične skupine, vsebujoče dušik, s takimi sredstvi, kot so nižji alkil halogenidi, kot so metil, etil, propil in butil kloridi, bromidi in jodidi; dialkilsulfati, kot dimetii, dietil, dibutil in diamilsulfati, dolgoverižnimi halogenidi, kot so decil, lavril, miristil in stearil kloridi, bromidi in jodidi; aralkil halogenidi, kot so benzil in fenetil bromidi in drugi. Pri tem dobimo v vodi ali olju topne ali disperzibilne produkte.
Nevrotrofne spojine v smislu izuma lahko periodično damo pacientu, ki je izpostavljen zdravljenju nevroloških motenj ali zaradi drugih razlogov, pri katerih je želeno, da se stimulira nevronalna regeneracija in rast, kot so različne periferne nevropatske in nevrološke motnje, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo. Spojine v smislu izuma lahko damo tudi sesalcem, drugačnim od ljudi, za zdravljenje različnih sesalčjih nevroloških motenj.
Nove spojine v smislu izuma so močni inhibitorji rotamazne aktivnosti in imajo odlično stopnjo nevrotrofne aktivnosti. Ta aktivnost je koristna pri stimulaciji poškodovanih nevronov, pospeševanju nevronalne regeneracije, preprečevanju nevrodegeneracije in pri zdravljenju različnih nevroloških motenj, za katere je znano, da so povezane z nevronalno degeneracijo in perifernimi nevropatijami. Nevrološke motnje, ki jih lahko zdravimo, vključujejo, vendar ne omejujoče: trigeminalno nevralgijo, glosofaringealno nevralgijo, Bellovo hromoto, miastenijo gravis, mišično distrofijo, amiotrofno lateralno sklerozo, progresivno muskularno atrofijo, progresivno bulbno podedovano muskularno atrofijo, sindrome herniiranega, prelomljenega ali zdrknjenega invertebralnega diska, cervikalno spondilozo, pleksusne motnje, sindrom destrukcije torakalne odprtine, periferne nevropatije, kot so tiste, povzročene s svincem, dapsonom, klopi, poriferijo, ali sindrom Gullain-Barre, Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen.
Za te namene lahko damo spojino v smislu izuma oralno, parenteralno, z inhalacijskim pršilom, lokalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ali preko implantiranih rezervoarjev v dozirnih formulacijah, ki vsebujejo konvencionalne netoksične farmacevtsko sprejemljive nosilce, adjuvanse in vehikle. Izraz parenteralno, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje subkutane, intravenozne, intramuskularne, intraperitonealne, intratekalne, intraventrikularne, intrasternalne in intrakranialne injekcijske ali infuzijske tehnike.
Da je kompleks imunofilin-zdravilo terapevtsko učinkovit, tako da zadane živčni sistem, mora z lahkoto penitrirati bariero kri-možgane, kadar ga damo periferno. Spojine v smislu izuma, ki ne morejo penetrirati bariere kri-možgane, lahko učinkovito damo na intraventrikularen način.
Farmacevtski sestavki so lahko v obliki sterilnega injekcijskega pripravka, npr. kot sterilna injekcijska vodna ali oljna suspenzija. To suspenzijo lahko formuliramo v skladu z znanimi tehnikami z uporabo prikladnih dispergirnih ali omočilnih in suspendirnih sredstev. Sterilni injekcijski pripravek je lahko tudi sterilna injekcijska raztopina ali suspenzija v netoksičnem parenteralno sprejemljivem razredčilu ali topilu, npr. kot raztopina v 1,3-butandiolu. Med sprejemljivimi vehikli in topili, ki jih lahko uporabimo, so voda, Ringerjeva raztopina in izotonična raztopina natrijevega klorida. Poleg tega konvencionalno uporabimo sterilna fiksirana olja kot topilo ali suspendirni medij. Za te namene lahko uporabimo katerokoli blago fiksirano olje, vključno sintetične mono ali digliceride. Maščobne kisline, kot so oljna in njeni gliceridni derivati, so tudi uporabne pri pripravi injekcijskih pripravkov, olivno olje ali ricinovo olje, posebno v njihovih polioksietiliranih verzijah. Te oljne raztopine ali suspenzije lahko vsebujejo tudi dolgoverižno alkoholno razredčilo ali disperzant. Spojine lahko damo oralno npr. v obliki kapsul ali tablet ali kot vodno suspenzijo ali raztopino. V primeru tablet za oralno uporabo vključujejo nosilci, ki se navadno uporabljajo, laktozo in koruzni škrob. Značilno dodamo tudi maziva, kot je npr. magnezijev stearat. Za oralno dajanje v obliki kapsul vključujejo uporabna razredčila laktozo in posušeni koruzni škrob. Kadar potrebujemo vodne suspenzije za oralno uporabo aktivno sestavino združimo z emulgirnimi in suspendirnimi sredstvi. Če je želeno lahko dodamo določena sladila in/ali arome in/ali sredstva za obarvanje.
Spojine v smislu izuma lahko damo tudi v obliki supozitorijev za rektalno dajanje zdravil. Te sestavke lahko pripravimo z mešanjem zdravila s prikladnim neiritantnim ekscipientom, ki je trden pri sobni temperaturi, toda tekoč pri rektalni temperaturi in se tako stopi v rektumu, da sprosti zdravilo. Take snovi vključujejo kokosovo maslo, čebelji vosek in polietilenglikole.
Spojine v smislu izuma lahko damo tudi optično, posebno kadar pogoj za zdravljenje vključujejo površine ali organe z lahkoto dosegljive za lokalno aplikacijo, vključno nevrološke motnje oči, kože ali nižjega intestinalnega trakta. Prikladne lokalne formulacije lahko z lahkoto pripravimo za vsako od teh področij.
Za oftalmično uporabo lahko spojine formuliramo kot mikronizirane suspenzije v izotonični sterilni fiziološki raztopini soli z naravnanim pH ali prednostno kot raztopine v izotonični sterilni fiziološki raztopini soli z naravnanim pH bodisi z ali brez varovalnega sredstva, kot je npr. benzilalkonijev klorid. Alternativno lahko za oftalmično uporabo spojine formuliramo v mazilu, kot je vazelin.
Za lokalno aplikacijo na koži spojine lahko formuliramo v prikladnem mazilu, ki vsebuje spojino suspendirano ali raztopljeno npr. v zmesi z eno ali več substanc, kot so: mineralna olja, tekoča vazelin, beli vazelin, propilen glikol, polioksietilen polioksipropilenska spojina, emulzibilni vosek in voda. Alternativno lahko spojino formuliramo v prikladnem losionu ali kremi, ki vsebuje aktivno spojino, suspendirano ali raztopljeno npr. v zmesi z eno ali več od naslednjih substanc, kot so: mineralno olje, sorbitan monostearat, polisorbat 60, cetil estrski vosek, cetearil alkohol, 2-oktildodekanol, benzil alkohol in voda.
Lokalno aplikacijo za nižji intestinalni trakt lahko izvedemo z rektalno supozitorno formulacijo (glej zgoraj) ali s prikladno klistirno formulacijo.
Dozirni nivoji velikosti približno 0,1 mg do približno 10000 mg aktivne sestavine so uporabni pri zdravljenju zgornjih stanj s prednostnimi nivoji približno 0,1 mg do približno 1000 mg. Količina aktivne sestavine, ki je lahko združimo z nosilnimi materiali, da proizvedemo posamezno dozirno obliko, variira, odvisno od gostitelja, ki ga zdravimo in posebnega načina dajanja.
Razumljivo je, da je specifični dozirni nivo za vsakega posebnega pacienta odvisen od različnih faktorjev, ki vključujejo aktivnost specifične uporabljene spojine, starost in maso telesa, splošno zdravstveno stanje, spol, dieto, čas dajanja, hitrost izločanja, kombinacijo zdravil in resnost posebne bolezni, ki jo zdravimo, in obliko dajanja.
Spojine lahko damo z drugimi nevrotrofnimi sredstvi, kot so nevrotrofni rastni faktor (NGF), rastni faktor, izveden iz glije, rastni faktor, izveden iz možganov, ciliarni nevrotrofni faktor in nevrotropin-3. Dozirni nivo drugih nevrotropnih zdravil je odvisen od pred tem navedenih faktorjev in nevrotrofne učinkovitosti kombinacije zdravil.
Strtje ishiadičnega živca
Ta primer prikazuje visoke nivoje FKBP v normalnem perifernem živcu in da se le-ti povečajo po strtju živca.
Če so FKBP fiziološko povezani z ekstenzijo nevronalnih podaljškov pri delovanju GAP-43, potem lahko pričakujemo bistvene nivoje FKBP v perifernem živcu. V skladu s tem izmerimo [3H]FK506-vezavo v podganjem ishiadičnem živcu kot tudi v rastočih konusih, izoliranih iz dva dni starih podganjih mladičev in primerjamo vrednosti s tistimi od cerebralnega korteksa in različnih perifernih tkiv.
[3H]FK506-autoradiografijo izvedemo, kot je opisano, na nefiksiranih sekcijah, ki jih odtajamo in posušimo na zraku, pred preinkubacijo 1 h v pufru, ki je sestavljen iz hepesa (50 mM), govejega serumskega albumina (2 mg/ml), etanola (5 %), in Tween-20 (0,02 %), pH 7,4. Sekcije nato izpostavimo 1 nM [3H]FK-506 (3,20 χ 1012 Bq/mmol; DupPont-NEN, Boston, MA) za 1 h pri sobni temperaturi v preinkubacijskem pufru. Nespecifično vezavo definiramo z dodatkom 1 jum FK-506.
Po inkubaciji plošče izpiramo 4-krat 5 min v ledeno hladnem preinkubacijskem pufru in posušimo na zraku. Radioaktivne označene sekcije nato jukstapozicioniramo filmu, občutljivem za tritij ali na krovna stekla (coverslips), premazana z emulzijo Kodak NTB-2.
TABELA 1 [3H]FK506-vezava za ishiadičen živec in rastne konuse (A) [3H]FK506-vezava v ishiadičnem živcu
Tkivo Bmaks (pmol/mg proteina)
Odrasla podgana
ishiadični živec 22,1
cerebralni korteks 38,0
timus 9,5
vranica 8,0
Neonatalna podgana
prednji možgani 25,5
rastni konusi 10,2
(B) [3H]FK506-vezava po strtju ishiadičnega živca
Bmaks Bmaks fmol/5 mm-segment pmol/mg proteina neoperiran 31,8 ± 2,1 21,2 ± 1,4 dni po strtju 136,5 ± 15,7* 40,1 ± 2,0* [3H]FK506-vezavo preizkusimo, kot je opisano v postopkih. Poskuse v Tabeli 1A ponovimo 3-krat z manj kot 10 % spremembo. V tabeli IB so navedene vrednosti kot povprečje ± S.E.M. (n = 3). *P< 0,05 Študentov t-test za neodvisen način.
Od vseh raziskanih tkiv so nivoji vezave ishiadičnega živca najvišji, nekoliko višji od tistih za cerebralni korteks in približno 10-krat višji od nivojev v timusu in vranici, ki vsebujejo FKBP, povezan z limfociti. Glej tabelo 1A.
Dokaz za vlogo FKBP pri regeneraciji živcev izhaja iz poskusov, pri katerih smo strli ishiadični živec odraslih podgan in 7 dni kasneje izmerili [3H]FK506-vezavo v 5 mm-segementu takoj proksimalno glede na strti živec.
Podgane Sprague-Dawley (175-200 g) anestetiziramo z zmesjo Rompuna (12 mg/kg) Ketamina (30 mg/kg). Z uporabo aseptičnih tehnik stremo obrazni živec z draguljarskimi kleščami 2-krat 30 sekund 2 mm distalno glede na njegov izhod iz stilomastoidnega foramena. Enake postopke uporabimo, da stremo ishiadični živec na nivoju sredine stegna.
Celokupna vezava v segmentu proksimalno glede na strtje je 4-kratna v primerjavi s kontrolnimi vrednostmi. Ker je celokupni protein v bistvu povečan v proksimalnem segmentu je [3H]FK506-vezava na mg proteina samo podvojena v proksimalnem segmentu.
Strtje obraznega živca
Ta primer prikazuje, da poškodbe obraznega živca povečajo koincidentno ekspresijo FKBP in GAP-43.
Po strtju obraznega živca se nivoji mRNA GAP-43 povečajo v nukleusu obraznega živca. Z uporabo hibridizacije in situ smo raziskali nivoje mRNA FKBP-ja GAP-43 in kalcinevrina po strtju obraznega živca.
Podgane izpostavimo transkardialni perfuziji s 150-200 ml ledeno hladne fosfatnopuferne fiziološke raztopine soli (PBS) (0,1 M, pH 7,4). Tkivo odstranimo in takoj zamrznemo v izopentanu (-80 °C). Kriostatne sekcije (debelina 18 μιη) prerežemo in odtajane namestimo na plošče, premazane z želatino.
Hibridizacijo in situ izvedemo, kot je opisano predhodno, z uporabo antisens oligonukleotidnih sond z označenimi konci z [35S]dATP. Za FKBP uporabimo tri ločene oligonukleotide, komplementarne za naslednje regije, klonirane cDNA, opisane od: Maki, et al. (1990) Proč. Natl. Acad.-Sci. USA 87, 5440-5443, in Standaert, R.F. et al. (1990) Nature 346, 671-674 in vključene tukaj z referenco; 70-114, 214-258, 441-485. Za GAP-43 uporabimo tri ločene antisens oligonukleotide, komplementarne za nukleotide 961-1008, 1081-1128, 1201-1248, klonirane cDNA, opisane od Rosenthala, A. et al. (187) EMBO J. 6, 3641-3646 in vključene tukaj z referenco. Za kalcineurin Aa uporabimo antisens oligonukleotide, komplementarne za nukleotide 1363-1410 in 1711-1758, opisane od: Ito et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1492-1497 in vključene tukaj z referenco, in za kalcinevrin Αβ uporabimo 1339-1386 in 1569-1616, opisane od Kuno T. et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1352-1358 in vključene tukaj z referenco. Sekcije odtajamo in pustimo, da se posušijo, nato pa jih fiksiramo 5 minut v sveže depolimeriziranem paraformaldehidu (4 %) v PBS. Po dveh izpiranjih v PBS sekcije acetiliramo z acetanhidridom (0,25 %) v trietanolaminu (0,1 M) NaCl (0,5 %) (pH 8,0) in nato dehidratiramo v klasiranem alkoholu, razmastimo v kloroformu v 5 minutah, rehidratiramo v etanolu (95 %) in pustimo, da se posušijo na zraku. Hibridizacijo izvajamo preko noči pri 37 °C v pufru, ki vsebuje deioniziran formamid (50 %), dekstran sulfat (10 %), 4 x SSC, 1 x Denhardtovo raztopino, fosfatni pufer (20 mM), DNA lososove sperme (0,1 mg/ml), transferno RNA kvasovk (1,0 mg/ml), ditiotreitol (10 mM), betamerkaptoetanol (BMD) (2,0 %), EDTA (1,0 mM) in označeno sondo (2000 000 dpm/sekcijo). Po hibridizaciji sekcije spiramo v 1 x s SCC, BME (1,0 %) 15 minut pri sobni temperaturi, nato 2-krat po 10 minut pri 55 °C sušimo na zraku in damo na film ali potopimo v emulzijo Kodak NTB-2.
Opazimo izredno povečano ekspresijo FKBP in GAP-43, medtem ko v ekspresiji kalcinevrina ni evidentnih sprememb. Že 24 ur po strtju obraznega živca se poveča ekspresija FKBP z vrhovi nivojev, evidentnimi pri 1-2 tednih, medtem ko se koncentracije mRNA bistveno zmanjšajo pri treh tednih. Raziskava pri večji povečavi razkriva, da so povečani nivoji srebrnih zrn mRNA FKBP omejeni na nevronalna celična telesa (slika 2). Analiza Northern blot seciranega obraznega nukleusa potrjuje povečane nivoje specifične mRNA FKBP. mRNA GAP-43 nivoji sledijo časovnemu poteku, ki je zelo podoben tistemu za FKBP. Nasprotno, ne zaznamo nobenih sprememb v ekspresiji kalcinevrina v katerikoli časovni točki raziskovanja.
Izoliramo celotno celularno RNA iz seciranega obraznega nukleusa. Vzorce po 10 ali 20 /xg celotne RNA izpostavimo elektroforezi skozi agarozo (1 %), formaldehidni gel (2,0 %) in prenesemo na najlonsko membrano v 10 nM NaOH. Sonde cDNA za FKBP, označen z [35]dCTP za specifično aktivnost 1 χ 109 cpm/ug z naključnim primingom, hidribridiziramo preko noči pri 42 °C v pufru, ki je sestavljen iz formamida (50 %), 2 x SSPE, SDS (7 %), Blotto (0,5 %) in 100 gg/ml DNA lososove sperme.
Prepivke spiramo 20 minut pri sobni temperaturi in 2 x 15 minut pri 65 °C v 0,15 x
SSC, SDS (0,15 %) in nato izpostavimo filmu za 48096 ur.
Na nepoškodovani strani opazimo zmerno povečanje srebrnih zrn v primerjavi s kontrolnimi sekcijami. To je konsistentno z ugotovitvami, da se kontralateralni nevroni tudi odzivajo na aksotomijo.
Po strtju obraznega živca podgane razvijejo ohromelost obraznega živca, ki je evidentna zaradi pomanjkanja naglih gibov, s funkcionalnim okrevanjem pri 3 tednih, koincidentnim s popolno regeneracijo živca. V naših podganah smo tudi opazili izgubo naglih gibov po strtju živca z vrnitvijo te funkcije pri 3 tednih. Tako je časoven potek povečane ekspresije GAP-43 in FKBP v koleraciji s postopkom regeneracije živca.
Regeneracije ishiadičnega živca
Ta primer ponazarja spremembe FKBP in GAP-43, povezane z regeneracijo ishiadičnega živca.
Po poškodbah ishiadičnega živca se nivoji mRNA GAP-43 povečajo tako v motornih nevronih hrbtenjače kot tudi v nevronalnih celicah ganglijev dorzalnega debla.
Pri podganah, izpostavljenih strtju ishiadičnega živca, opazimo izredno povečanje nivojev mRNA za FKBP v motornih nevronih pri L-4, 5 (slika 3) in v ganglijskih nevronalnih celicah dorzalnega debla, koincidentno z navedenim povečanjem ekspresije GAP-43 (slika 4). Pri velikem povečanju opazimo mRNA FKBP - srebrna zrna lokalizirana na nevronalnih celičnih telesih (slika 3). Nadzorujemo nivoje proteina FKBP z avtoradiografijo [3H]FK-506-vezave pri pogojih, pri katerih le-ta veže selektivno na FKBP (slika 4). Povečanje FKBP detektiramo v primarnih senzornih nevronih v ganglijih dorzalnega debela, čeprav ni evidentnih povečanj v motornih nevronalih celicah po strtju ishiadičnega živca.
Povezava povečane ekspresije FKBP z regeneracijo je selektivno nadalje podprta z eksperimenti z ricinom. Kadar injiciramo ricin v periferne živce, se le-ta transportira nazaj v celično telo, ki se uniči brez povezane regeneracije živca. 0,5 μ-g ricina (RCA 60, Sigma, St. Louis, MO) injiciramo v obrazni živec na istem mestu, kjer smo izvedli strtje pri drugih poskusih v skladu s postopkom Streita in Kreutzbnerga, v 0,5 μΙ PBS in 0,1 % Fast Greena. Streit et al., (1988) J. Comp. Neurol. 268,248-263.
Izvedemo študije lokalizacije hibridizacije in situ za mRNA FKBP 2, 4 in 7 dni po obdelavi z ricinom (slika 5). Ne opazimo povečanja mRNA FKBP po obdelavi z ricinom. Do glioze pride tako po obdelavi z ricinom kot tudi strtju živca. Nezmožnost, da se poveča mRNA FKBP po obdelavi z ricinom, se ujema s selektivno nevronalno lokalizacijo mRNA FKBP v obraznem nukleusu.
Transport FKBP v ishiadičnem živcu
Ta primer prikazuje, da se FKBP hitro transportira v ishiadični živec.
Nezmožnost, da se FKBP-protein poveča v motornih nevronih po strtju ishiadičnega živca kljub povečanju mRNA FKBP navaja k temu, da se protein hitro transportira iz celičnega telesa v podaljške živcev. To se ujema s predhodnimi opažanji, da se mRNA FKBP koncentrira v granulnih celicah malih možganov, ki vsebujejo nizke nivoje proteina FKBP, medtem ko so nivoji proteina FKBP zelo koncentrirani v molekularni plasti v malih možganih, povezanih s paralelnimi vlakni, ki izhajajo iz granulnih celic. Da raziščemo možen transport FKBP, stremo ishiadični živec in 7 dni kasneje apliciramo ligature 10 in 20 mm proksimalno glede na strtje. 6 ur po ligaturi nadzorujemo [3H]FK-506 -vezavo v 3 mm-segmentih, ki povezujejo površino ligatur (slika 6).
Za poskuse aksonskega transporta uporabimo klasične ligaturne tehnike po postopkih Tetzlaffa et al. En teden po strtju ishiadičnega živca damo dve kolekcijski ligaturi (510 šivov) na živec približno 10 mm narazen z najbolj distalno ligaturo nameščeno 10 mm proksimalno glede na začetno mesto strtja. 6 ur kasneje zberemo 5-3 mmsegmente živca iz regij, ki so proksimalno in distalno glede na kolekcijske ligature in med le-temi, kot je prikazano na sliki 5. Segmente živcev pripravimo za preizkus [3H]FK-506-vezave s homogeniziranjem v 10 volumnih tris-HCl (50 mm), pH 7,4. Homogenate centrifugiramo pri 15000 g 20 minut pri 4 °C in supernatante zberemo in preizkusimo za celokupno proteinsko koncentracijo z uporabo preizkusa vezave Coomassie blue barve (Pearce). [3H]FK-506-vezavo izvedemo, kot je opisano (4) na alikvotih, ki vsebujejo 2 jug celokupnega topnega proteina v končnem volumnu 0,4 ml preizkusnega pufra, kije sestavljen iz tris-HCl (50 mM), pH 7,4,2 mg/ml govejega serumskega albumina, [3H]FK-506 (250 pM) in različnih koncentracij neoznačenega FK-506. Po inkubaciji 60 minut pri 25 °C nanesemo 0,35 ml na 0,8 mlkolono LH-20 Sephadex (Pharmacia LKB) in izperemo z 0,4 ml preizkusnega pufra. Eluate zberemo in preštejemo v scintilacijskem števcu.
Rezultati so prikazani na sliki 5. Nivoji [3H]FK-506-vezave so najvišji v segmentu ravno proksimalno glede na ligaturo 20 cm od strtja, in so skoraj štirikratni nivoji v drugih segmentih.
Na osnovi nivojev [3H]FK-506-vezave v segmentih A-D izračunamo hitrost anterogradnega transporta FKBP. Ta hitrost 240 mm na dan je v bistvu enaka kot transportne hitrosti za GAP-43 in pomeni največjo transportno hitrost za nevronalne proteine.
Za vizualiziranje akumulacije FKBP po strtju živca nanesemo prosto ligaturo, da označimo mesto strtja ishiadičnega živca in izvedemo hibridizacijo in situ za mRNA FKBP kot tudi avtoradiografijo za [3H]FK-506-vezavo (slika 7). Večina mRNA FKBP in [3H]FK-506-vezave se akumulira takoj proksimalno glede na strtje. Ti nivoji so precej višji kot v kontrolnem nestrtem ishiadičnem živcu. Raziskava hibridizacije in situ avtoradiografskih pripravkov pri veliki povečavi razkriva srebrna zrna, povezana z nevronalnimi vlakni. Obstajajo tudi srebrna zrna, lokalizirana na celicah, katerih identiteto nismo mogli definitivno ugotoviti, tako da so lahko Schwannove celice, magrofagi ali fibroblasti.
FKBP v celicah PC12
Ta primer prikazuje, da celice PC-12 vsebujejo FKBP in da so nivoji FKBP povečani z živčnim rastnim faktorjem. Raziskali smo celice PC-12 za prisotnost FKBP z nadzorovanjem vezave [3H]FK-506 na celice pri bazalnih pogojih in po obdelavi z živčnim rastnim faktorjem (NGF).
Nivoje FKBP v celicah PC-12 dobimo s Scatchardovo analizo krivulj [3H]FK-506vezave. Kulture postrgamo iz vdolbin za kulturo in homogeniziramo v 10 volumnih tris-HCl (50 mM), pH 7,4, EDTA (1 mM), fenilmetilsulfonilfluorida (100 /tg/ml) in centrifugiramo pri 40000 g 20 minut pri 4 °C. Protein ugotovimo preskusom vezave Coomassie blue barve z uporabo govejega serumskega albumina kot standarda. Vezavo 250 pM [3H]dihidro FK 506 (3,20 χ 1012 Bq/mmol, DuPont/NEN) preizkusimo za vzorce, ki vsebujejo 5 μg topnega proteina v končnem volumnu 0,4 ml preskusnega pufra, ki vsebuje Tris-HCl (50 mM), pH 7,4, BSA (2 mg/ml) in različne koncentracije neoznačenega FK506. Po 60-minutni inkubaciji pri 25 °C nanesemo 0,35 ml na 0,8 ml kolono LH-20 Sephadex (Pharmacia LKB), predhodno uravnoteženo s preskusnim pufrom. Kolono nadalje speremo z 0,4 ml preskusnega pufra, eluate zberemo, zmešamo s Formulo 963 (DuPont/NEN) in preštejemo v Be22 ckmanovem scintilacijskem števcu. Specifično vezavo ugotovimo z odštevanjem vezave, dobljene v prisotnosti 1 μΜ neoznačenega FK506 od celokupnega vezanega [3H]FK-506.
Rezultati so prikazani na sliki 8. [3H]FK-506 veže nasičeno na neobdelane PC-12 celične homogenate. Pri značilnih poskusih je vezanih približno 1000 cpm, medtem ko je nespecifična vezava v prisotnosti 1 μΜ FK506 približno 150 cpm. Do 50 % inhibicije [3H]FK-506-vezave pride z 1-2 nM FK506, kar označuje, da mesta vezave ustrezajo avtentičnemu FKBP. [3H]FK-506-vezava znatno naraste po NFGobdelavi. Znatna povečanja so evidentna v 10-15 urah. Vezava se potroji v 20 urah, skromno nadaljnje povečanje pa je evidentno pri 100 urah.
Povečana nevritna ekstenzija v celicah PC-12
Ta primer prikazuje, da FK-506 in rapamicin povečata nevritno ekstenzijo v celicah PC-12. Celice PC-12 vzdržujemo pri 37 °C in 5 % CO2 v Eaglovem mediju, modificiranem po Dulbecco-u (DMEM), dopolnjenem s toplotno inaktiviranim konjskim serumom (10 %) in toplotno inaktiviranim fetalnim govejim serumom (5 %). Za diferenciacijo v NGF, celice zasadimo pri 1 χ 105 v 35 mm-vdolbine za kulturo, premazane s kolagenom podganjega repa pri 5 μg/cm2, in pustimo, da se pritrdijo predno nadomestimo medije z DMEM, dopolnjenim s fetalnim konjskim serumom (2 %), NGF in/ali FK-506 rapamacina. Za kvantitativno določitev nevritnega izraščanja naredimo naključne fotografije (3-4 na vdolbino) in preštejemo nevrone, ki nosijo podaljške, ki so večji od 5 μπι. Eksperimentalni pogoji so neznani fotografu in števcu celic. Štiri ločene poskuse izvedemo v dvojniku za vsako podatkovno točko. Identificiramo in preštejemo nevrite iz približno 100 celic na fotografijo. Tako preštejemo nevrite iz 1200-1600 celic na podatkovno točko.
Kot opazimo, NGF močno stimulira nevritno izraščaje s polovično maksimalno stimulacijo pri 1 ng/ml in maskimalnim povečanjem pri približno 50-100 ng/ml (sl. 9, 10). FK506 (100 nM) znatno poveča učinek NGF s povečevanjem občutljivosti za NGF. Tako FK506 zniža 20-50-krat NGF-koncentracijo, potrebno, da izzove maksimalno izraščanje. Do polovičnega maksimalnega izraščanja v odsotnosti FK506 pride pri 5 ng/ml NGF in v prisotnosti FK506 pri 0,1 ng/ml NGF. Pri maksimalnih koncentracijah NGF (10-100 ng/ml) FK506 ne proizvede dodatnega nevritnega izraščanja.
FK506 je ekstremno močan pri svojih nevrotrofnih učinkih. V prisotnosti submak23 simalne koncentracije NGF (1 ng/ml) FK506 izzove pri 1 nM enako maksimalno izraščanje, zaznano s 50 ng/ml NGF (sl. 11). Do polovičnih maksimalnih učinkov FK506 pride pri približno 100 pM. V odsotnosti NGF FK506 ni zmožen izzvati nevritnega izraščanja (sl. 10).
Rapamicin je močan imunosupresant, za katerega ni mišljeno, da deluje preko kalcinevrina, vendar lahko vpliva na druge fosforilacijske kaskade.
Rapamicin močno blokira delovanje FK506, kar se zgodi preko FKBP, kalcinevrin pa verjetno z delovanjem kot FK506-antagonist pri FKBP. Rapamcin (1 μΜ) ni zmožen blokirati nevrotrofnih delovanj FK506. Namesto tega je rapamicin sam nevrotrofen, pri čemer zagotavlja glavno nevritno izraščanje pri 1 nM.
Za rapamicin in FK506 se zdi, da delujeta preko različnih mehanizmov. Tako rapamicin poveča število podaljškov kot tudi njihovo dolžino, medtem ko FK506 primarno poveča nevritno dolžino. Poleg tega se zdi, da so učinki FK506 in rapamicina aditivni.
Gangliji dorzalnega debla
Ta primer prikazuje, da je FK506 nevrotrofen za senzorne ganglije. Raziskali smo delovanje FK506 na primarne kulture ganglijev dorzalnega debla podganjih 16dnevnih embriov.
Embrie v stopnji E16 odstranimo iz brejih podgan Sprague-Dawley in seciramo ganglije dorzalnega debla. Celotne ganglijske eksplante kultiviramo v 35 mmposodah, premazanih s kolagenom (Falcon) z uporabo medija N2 (Eaglov medij, modificiran po Dulbecco-u in Hamov F12 medij v zmesi 1:1 in dopolnjeno s progesteronom, selenom, inzulinom, putrescinom, glukozo in penicil-streptomicinom) pri 37 °C v atmosferi s 15 % CO2. Senzorne ganglije obdelamo z različnimi koncentracijami NGF in/ali FK506 ali rapamicina ali protitelesa anti-NGF. Ganglije opazujemo vsake 2 do 3 dni pod faznim kontrastiranjem z uporabo invertiranega mikroskopa Olympus IMT-2 in izvedemo meritve aksonske dolžine. Aksonalno polje vsakega gangliona razdelimo v štiri kvandrante in izmerimo dolžino najdaljših aksonov v vsakem kvadrantu v pm z uporabo okularnega mikrometra. Povprečje teh meritev vzamemo kot aksonsko dolžino za ganglion.
Za [3H]FK506-avtoradiografijo vzgojimo ganglijske kulture dorzalnega debla na komornih ploščah, premazanih s kolagenom, 5 μ-g/cm2. Kulture fiksiramo na ploščah z ledeno hladnim sveže depolimeriziranim paraformaldehidom (4,0 %) v natrijevem fosfatnem pufru (0,1 M), pH 7,4, 1 uro in nato speremo 2-krat s fosfatno pufrano fiziološko raztopino soli. Fiksirane kulture označimo s [3H]FK506 s preinkubiranjem plošč v pufru, ki je sestavljen iz hepesa (50 mM), govejega serumskega albumina (2 mg/ml), Tween-20 (0,02 %), pH 7,4. Nato izvedemo inkubacijo v istem preskusnem pufru, ki vsebuje 1 nM [3H]FK506. Nespecifično vezavo ugotovimo z dodajanjem 1 μΜ neoznačenega FK506. Plošče nato splakujemo 4x5 minut pred sušenjem in jukstapozicioniramo filmu, občutljivemu za tritij, za 10 dni.
Avtoradiografija [3H]FK506-vezavnih mest razkriva bistvene nivoje srebrnih zrn, povezanih z FKBP, v teh ganglijih (sl. 12). Pri 1 μΜ neoznačenega FK506 so avtoradiografska zrna uničena, kar označuje specifičnost vezave. Kot je predhodno navedeno NGF (100 ng/ml) izrazito poveča število in dolžino ganglijskih podaljškov (sl. 13). FK506 (1 μΜ) sam proizvede podoben nevrotrofen učinek, medtem ko že tako malo kot 1 nM FK506 proizvede opazno povečanje v rasti. Rapamicin (1 μΜ), ki deluje kot FK506-antagonist, popolnoma blokira učinke FK506 (ΙμΜ) in tako delovanje FK506 prikazuje zdravilno specifično značilnost FKBP.
Medtem ko FK506 ni zmožen stimulirati nevritnega izraščanja v celicah PC-12 v odsotnosti dodanih NGF, je v senzornih ganglijih sam FK506 nevrotrofen. Schwannove celice v ganglijih lahko izdelajo NGF in produkcijo NGF s temi celicami regulira proteinski fosforilacijski dogodek. Da bi določili ali delovanja samega FK506 vključujejo potenciacijo endogenega NGF, smo raziskali vpliv protiteles na NGF (sl. 13). Anti-NGF izrazito zniža nevrotrofne učinke FK506 (1 μΜ). Anti-NGF ne deluje na toksičen način, ker ni opaznih morfoloških dokazov toksičnosti v celicah, izpostavljenih anti-NGF v prisotnosti ali odsotnosti dodanega NGF.
FK506 je izjemno močan pri stimuliranju nevritnega izraščanja. Že tako malo kot 1 pM FK506 proizvede zaznavno povečanje. Do progresivno večjega izraščanja pride pri 0,1 in 10 nM FK506 (podatki niso pokazani), medtem ko maksimalno izraščanje zahteva 1 μΜ FK506.
Časovni potek nevritnega izraščanja je podoben pri vseh koncentracijah NGF in
FK506. Nekaj izraščanja je vidnega s prvim dnem, medtem ko rast začne dosegati plato pri približno 5-6 dnevih.
FK506-nevrotrofni učinki vključujejo FKBP (FK506-vezivni protein) v senzornih ganglijih, ker so učinki FK506 obrnjeni z nizkimi koncentracijami rapamicina, znanega antagonista FK506 pri FKBP. Nezmožnost rapamicina, da blokira učinke FK506 v celicah PC-12, verjetno kaže ločene stimulatorne učinke rapamicina. Mehanizmi za rapamacinsko stimulacijo nevritnega izraščanja v celicah PC-12 niso takoj evidentni. Za njegova imunosupresantna delovanja je mišljeno, da vključujejo drugačne mehanizme, kot so tisti za FK506. Rapamicin lahko inhibira S6-kinazo, ki fosforilira S6-ribosomalno podenoto. Rapamicin inhibira tudi fosfatidilinozitol-3kinazo.
Fosforilacija, posredovana s protein kinazo C (PKC), je bila vključena v postopek izraščanja med nevronalno regeneracijo. Drug dokaz navaja k inhibitornim učinkom PKC pri ekstenziji nevronalnih podaljškov.
GAP43 je prominenten kalcinevrinski substrat, visoko koncentriran v nevritih in njegovo fosforilacijo regulira FKBP. GAP43 ne sme biti direktno vključen v nevritno ekstenzijo, ker PC-12 celične linije z nizkimi nivoji GAP43 prikazujejo normalno nevritno izraščanje. Vendar sta GAP43 in njegova fosforilacija lahko vključena v ciljanje nevritov, ker so nivoji fosforiliranega na GAP43 povečani, kadar se nevriti približajo svojim tarčam. Fosforilacija GAP43 lahko vpliva tudi na mobilizacijo Ca2+, da regulira nevritno ekstenzijo. Fosforiliran GAP-43 inhibira tvorbo fosfatidil inozitol bis-fosfata, ki naj bi zmanjšal nivo inozitol 1,4,5-trifosfata in povezano sproščanje Ca2+. Poleg tega fosforilacija GAP-43 zmanjša njegovo afiniteto za kalmodulin z rezultantom brez kalmodulina, na razpolago za vezavo Ca2+.
Imunofilini lahko delujejo na mestih poleg kalcinevrina, kar vpliva na Ca2+, da regulira nevritno izraščanje. FKBP veže na rianodinski receptor, ki je kanal za sproščanje Ca2+. V skeletnih mišicah sarkoplazemskega retikuluma FR506 disociira FKBP iz rianodinskega receptorja, da olajša s Ca2+ induciran mehanizem sproščanja Ca2+. Poleg tega FK506 deluje na drugih mestih, ki vključujejo FKBP25-steroidne receptorje in druge neidentificirane tarče, kot so tiste, vezane na FKBP13. Tako imajo lahko drugi potencialni mehanizmi tudi nekaj vloge pri nevritni ekstenziji.
Nevritno izraščanje v celicah PC-12, stimulirano z ne-imunosupresivnimi in imunosupresivnimi ligandi imunofilinov
V predloženi študiji smo podrobno raziskali vplive številnih ligandov imunofilinov na nevritno ekstenzijo v celicah PC-12 in v intaktnih piščančjih senzornih ganglijih. Navajamo, da so tako ne-imunosupresivni kot tudi imunosupresivni ligandi ekstremno močni pri povečevanju nevritnega izraščanja tako v celicah PC-12 kot tudi senzornih ganglijih.
V naši prejšnji študiji smo ugotovili, da imunosupresanti stimulirajo nevritno izraščanje v celicah PC-12 s povečevanjem moči živčnega rastnega faktorja (NGF) za približno 10-krat (Lyons et al., 1994). V odsotnosti dodanega NGF nismo opazili nobenih nevrotropnih učinkov. V priloženi študiji ocenjujemo učinke imunosupresantnih zdravil FK506 in rapamicina na PC-12-nevritno izraščanje v prisotnosti 0,1-100 ng/ml NGF.
V odsotnosti dodanega NGF nobeno zdravilo ne stimulira nevritnega izraščanja. 0,1 ng/ml samega NGF proizvede majhno povečanje nevritne ekstenzije, le približno 15 % maksimalnih učinkov, ki so evidentni pri 50 ng/ml (sl. 14). Rapamicin stimulira nevritno izraščanje do večjega obsega kot druga zdravila s 3-4-kratno stimulacijo pri 0,1-0,5 ng/ml NGF. Obseg povečanja, izzvan z rapamicinom, se zmanjša z višjo koncetracijo NGF in ni statistično pomemben pri 5-50 ng/ml NGF. FK506 je tudi nevrotropen z učinki, ki so najbolj vidni pri nižjih koncentracijah NGF in največ 2,5kratnim povečanjem nevritnega izraščanja, evidentnim pri 0,5 ng/ml NGF.
Obstajajo trije osnovni strukturni razredi imunosupresantnih zdravil, ki so sorodni v strukturi ciklosporinu A, FK506 in rapamicinu. Čeprav FK506 in ciklosporin A vežeta na različne imunofilinske proteine, pa oba delujeta kot imunosupresanta z inhibiranjem kalcinevrina. Rapamicin veže z zelo visoko afiniteto FKBP-12, vendar pa kompleks zdravilo-imunofilin po svoji strani ne veže na kalcinevrin. Namesto tega so imunosupresantna delovanja posledica vezave kompleksa rapamcin-FKBP-12 na nedavno identificiran in kloniran protein, označen RAFT-1 (rapamicin in FK506 tarča) in tudi označen FRAP (Sabatini in Snyder, 1994; Brown et al., 1994; Chen et al., 1994). Ker rapamicin veže močno na FKBP-12, vendar ne inhibira kalcinevrina, lahko rabi kot antagonist za FK506. Obstajajo neimunosupresivni derivati rapamicina. Eden od teh Way-124,466, trienski derivat rapamicina veže z zelo visoko afiniteto na FKBP-12 in inhibira rotamazno aktivnost, vendar nima imun27 osupresantnih delovanj. Ciklosporin A je velik ciklični undekapeptid. Samo dodatek metilne skupine na alanin na položaju 6 ima za posledico sredstvo, ki ne inhibira kalcinevrina in nima imunosupresivnih učinkov, Čeprav le-to inhibira rotamazno aktivnost ciklofilina do podobnega obsega kot ciklosporin A (Me CsA ref).
Da ugotovimo ali je imunosupresantna aktivnost potrebna za nevrotrofna delovanja, primerjamo nevrotrofne učinke FK506, rapamicina in ciklosporina A z neimunosupresantom Way-124,466, pri čemer ocenimo široko območje koncentracij na celicah PC-12 (sl. 15,16). Vse študije naredimo v prisotnosti 0,5 ng/ml NGF. Kot smo opazili pred tem, FK506 zelo močno stimulira nevritno ekstenzijo s polovično maksimalno stimulacijo pri 0,5 nM in maksimalnimi učinki pri 5-100 nM.
Rapamicin je najbolj močno raziskano sredstvo in proizvede največji maksimalni nivo nevritne ekstenzije. V ponovljenih poskusih je evidentna 50 % maksimalna ekstenzija pri približno 0,2-0,4 nM, medtem ko so maksimalni učinki evidentni pri približno 10-100 nM. Maksimalna nevritna ekstenzija z rapamicinom je primerljiva z maksimalnimi učinki 50 ng/ml NGF. Way-124,466 je tudi nevrotrofen, vendar je manj močan in proizvede manjši maksimalni učinek kot rapamicin. Do polovične maksimalne stimulacije z Way-124,466 pride pri približno 10 nM in do maksimalnih učinkov 100-1000 nM. Tako je rapamicin približno 100-krat bolj močan od Way124,466, če primerjamo njegovo 40-krat večjo moč pri vezavi na FKBP-12 (Tabela Π).
Ciklosporin A je bistveno manj močan kot FK506 ali rapamicin pri stimuliranju nevritnega izraščanja, kar ustreza njegovi bistveno manjši moči pri inhibiranju rotamazne aktivnosti. 50 % maksimalna stimulacija nevritnega izraščanja s ciklosporinom A je evidentna pri 50 nM z maksimalnimi učinki pri 100 nM in zmanjšanje nevritnega izraščanja pri višjih koncentracijah ciklosporina A. Maksimalna stimulacija s ciklosporinom A je približno 60 % učinkov 50 ng/ml NGF.
Splošni model ekstenzije podaljškov je podoben z različnimi imunofilinskimi ligandi in NGF. Pri koncentracijah, ki izzovejo 50 % maksimalnih učinkov NGF (1-5 ng/ml), ima 40-50 % celic raztezek podaljškov vsaj tako dolg, kot je celično telo, medtem ko jih 15 % raztegne daljše podaljške do 3-5-kratne dolžine celičnega telesa. Model je precej podoben pri različnih raziskanih zdravilih. Rapamicin in Way-124,466 imata tendenco da rezultirata večje število podaljškov na celico kot FK506. Ciklosporin A ima tendenco, da je vmesen glede števila podaljškov.
Ekstenzija živca, izzvana v piščančjih ganglijih dorzalnega debla z neimunosupresivnimi in supresivnimi ligandi imunofilinov
V naši predhodni študiji smo opazovali nevrotrofne učinke imunosupresantnih zdravil v eksplantih ganglijev podganjega dorzalnega debla z znatnim povečanjem v izraščanju živcev, zaznanem s koncentracijami FK506 tako nizkimi, kot je 1 pikomolar (Lyons et al., 1994). V podganjih ganglijih opazimo nevrotrofne učinke z FK506 celo v odsotnosti NGF. V predloženi študiji uporabimo eksplante ganglijev piščančjega dorzalnega debla, ki so lažji za uporabo pri študijah izraščanja živcev. V odsotnosti dodanega NGF opazimo minimalne učinke imunofilinskih Ugandskih zdravil. Piščančje celice so bolj občutljive za NGF kot celice PC-12, tako da uporabimo 0,1 ng/ml NGF, da proizvedemo minimalno nevritno izraščanje in da prikažemo nevrotropna delovanja imunofilinskih ligandov (sl. 17,18).
Ganglion dorzalnega debla seciramo iz piščančjih embriov 10-dnevne oplojenosti. Celotne ganglionske eksplante kultiviramo na ploščah z 12 vdolbinami, premazanih s tanko plastjo Matrigela z medijema Liebovitz L15 in visoko glukozo, dopolnjenima z glutaminom (2 mM) in fetalnim telečjim serumom (10 %), ki vsebuje tudi citozin /3-D-arabinofuranozid (Ara C) (10 μΜ) pri 37 °C v atmosferi, ki vsebuje 5 % CO2. 24 ur kasneje obdelamo DRG-je z različnimi koncentracijami živčnega rastnega faktorja, imunofilinskih ligandov ali kombinacijami NGF in zdravil. 48 ur po obdelavi z zdravilom ganglije vizualiziramo pod faznim kontrastom ali Hoffmanovim modulacijskim kontrastom s Zeissovim invertiranim mikroskopom Axiovert. Izdelamo fotodiagrame eksplantov in kvantitativno ugotovimo nevritno izraščanje. Nevrite, daljše od premera DRG, preštejemo kot pozitivne s celokupnim številom kvantitativno ugotovljenih nevritov za vsak eksperimentalni pogoj. 3 do 4 DRG-je kultiviramo na vdolbino in vsako obdelavo izvedemo v dvojniku.
Relativne moči različnih imunofilinskih ligandov pri stimuliranju izraščanja živcev v ganglijih so podobne njihovim relativnim močem v celicah PC-12. Tako je rapamicin najbolj močno sredstvo z EC501 nM, 10-krat bolj močno kot Way-124,466, medtem ko FK506 prikazuje EC$01-2 nM.
Maksimalno povečanje števila podaljškov, njihove dolžine in razvejenosti so popolnoma podobne pri maksimalno učinkovitih kontrakcijah imunofilinskih ligandov in
NGF (100 ng/ml). S progresivnim povečevanjem koncentracij različnih zdravil opazimo večje število podaljškov, bolj ekstenzivno razvejenje in večje dolžine posameznih podaljškov.
Ocenili smo moč zdravil pri vezavi na FKBP-12 z raziskovanjem inhibicije 3H-FK506 vezave na rekombinanten FKBP-12. Obstaja izredna paralela med afinitetami zdravil za FKBP-12 in njihovo močjo pri stimuliranju nevritnega izraščanja in inhibiranju rotamazne aktivnosti. Podrobneje, stimulacija izraščanja živcev ni v zvezi z inhibicijo kalcinevrina. Inhibicija kalcinevrina se dobro ujema z imunosupresantnimi delovanji, Way-124,466 ni imunosupresiven in ni zmožen inhibirati kalcinevrina. Rapamicin je močan imunosupersant, vendar rapamicin-FKBP-12-kompleks veže na RAFT-1, da iniciira imunosupresivne procese (Sabatini in Snyder, 1994; Snyder in Sabatini, 1995). Rezultati so navedeni v Tabeli 2.
TABELA 2; Paralele inhibicije rotamaze, na osnovi nevrotrofizma imunofilinskih ligandov, ne kalcinevrina
Zdravilo [3H]-FK506- inhibicija rotamaza nevritno
FKBP-12 (IC50) kalcinevrina (K,) (ED50)
FK506 0,6 nM da 0,4 nM 0,5 nM
rapamicin 0,5 nM ne 0,2 nM 0,5 nM
Way-124,466 10,0 nM ne 12,0 nM IOnM
ciklo-
sporin A - da 20 nM 50 nM
(CsA)
Primerjamo sposobnost ne-imunosupresivnih imunofilinskih ligandov, da pospešijo nevritno izraščanje v eksplantnih kulturah gangliona piščančjega dorzalnega debla (Tabela 3). Vse od teh spojin so nesposobne inhibirati kalcinevrin, vendar le-te vzajemno delujejo z imunofilinskim FKBP-12, da inhibirajo njegovo rotamazno aktivnost z različnimi inhibitomimi konstantami, navedenimi v Tabeli 3. Sposobnost teh spojin, da pospešijo nevritno izraščanje v DRG-jih, je v dobri koleraciji z njihovo sposobnostjo, da inhibirajo rotamazno aktivnost FKBP-12.
TABELA 3: Paralele inhibicije rotamaze, na osnovi nevrotrofizma imunofilinskih ligandov, ne kalcinevrina
Zdravilo [3H]-FK506FKBP-12 (IC50) inhibicija kalcinevrina rotamaza (K,) nevritno izraščanje (ED50)
Primer 12 8μΜ ne 250 nM 300 nM
Primer 13 4μ,Μ ne 25 nM 80 nM
Zelo tesna koleracija med močni zdravil pri vezavi na imunofiline, inhibiranju njihove rotamazne aktivnosti in stimuliranju nevritnega izraščanja naznačuje, da je inhibicija rotamazne aktivnosti odgovorna za nevrotrofne učinke zdravil. Zaradi izredno velike moči zdravil pri stimuliranju nevritnega izraščanja in vezavi na imunofiline je kar neverjetno, da bi katerikoli drugi cilj lahko šteli za nevrotrofen učinek. Razumljivo je, da na biološko aktivnost imunofilina, razen rotamaze, lahko vplivajo zdravila, da posredujejo nevrotrofna delovanja. Vendar nobena taka aktivnost ni bila navedena do sedaj.
Zaradi izredne moči zdravil in tesne koleracije med rotamazno inhibicijo in nevrotrofnimi delovanji, sklepamo, da je rotamazna inhibicija verjetno vključena v nevrotrofne učinke. Številni proteini so navedeni kot substrati za rotamazno aktivnost imunofilinov, vključno kolagen (Steinmann et al., 1991) in transferin (Lodish and King, 1991). Za nedavno visoko očiščene pripravke rianodinskega receptorja in IP3-receptorja, izrazite intracelularne kalcijeve kanale, je bilo navedeno, da obstajajo v kompleksu z FKBP-12. Disociacija FKBP-12 teh kompleksov povzroči, da postanejo kalcijevi kanali prepustni (leaky) (Cameron et al., 1995). Fluksi kalcija so vključeni v nevritno ekstenzijo, tako da sta IP-3 receptor in rianodinski receptor lahko vključena v nevrotrofne učinke zdravil. Ker zdravila vežejo na isto mesto na FKBP12 kot IP-3 receptor ali rianodinski receptor, bi lahko sklepali, da zdravila odmaknejo kanale od FKBP-12. Nobena interakcija med temi kalcijevimi kanali v ciklofilinu ni bila navedena, tako da ta model ne bi pojasnil nevrotrofnih delovanj ciklosporina A.
Nevrotrofna delovanja zdravil, študirana v predloženem izumu, so izražena pri izjemno nizkih koncentracijah, ki označujejo moči, primerljive s tistimi za nevrotrofne proteine, kot je rastni faktor, izveden iz možganov, nevrotropin-3 in nevrotrofni rastni faktor.
Naslednji primeri ponazarjajo prednostne izvedbe predloženega izuma in niso izdelani, da bi bil le-ta z njimi omejen. Vse polimerne molekulske mase so srednje povprečje molekulskih mas. Vsi odstotki so na osnovi masnih odstotkov končnega sistema za dajanje ali pripravljene formulacije, če ni drugače označeno, vse celokupne vsote pa so enake 100 mas.%.
Ilustrativne spojine derivate pipekolinske kisline, ki jih lahko uporabimo za namene predloženega izuma, vključujejo:
PRIMER 1
Way-124,466
To eksemplarično spojino derivat pipekolinske kisline opisujejo: Ocain et al.,
Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 192, št. 3,1993. Spojine je sintetiziral doktor Phil Hughes pri Wyeth-Ayerst z reakcijo 4-fenil-l,2,4-triazolin3,5-diona z rapamacinom.
PRIMER 2
To spojino derivat pipekolinske spojine opisujejo: Chakraborty et al., Chemistry and Biology, marec 1995, 2:157-161.
PRIMERI 3-5
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Ikeda et al., J. Am. Chem. Soc. 1994,116,4143-4144, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 6-9
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, št. 9, str. 1161-1166, 1994, posebno spojine 2a-2d, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMER 10
To eksemplarično spojino 10 derivat pipekolinske kisline opisujejo: Birkenshaw et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, št. 21, str. 2501-2506,1994, in je vključena tukaj z referenco.
PRIMERI 11-21
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Holt et al., J. Am. Chem. So., 1993, 115, 9925-9938, posebno spojine 4-14, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 22-30
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Caffery et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, št. 21, str. 2507-2510, 1994, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMER 31
MeO OMe
To eksemplarično spojino 31 derivat pipekolinske kisline opisujejo: Teague et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 3, št. 10, str. 1947-1950, 1993, in je vključena tukaj z referenco.
PRIMERI 32-34
Te eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Yamashita et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4., št. 2, str. 325-328, 1994, posebno spojine 11,12 in 19, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 35-55
Eksemplarične derivate pipekolinske kisline opisujejo: Holt et at, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, št. 2, str. 315-320, 1994, posebno spojine 3-21 in 23-24, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 56-68
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Holt et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 3, št. 10, str. 1977-1980, 1993, posebno spojine
3-15, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 69-83
Eksemplarične spojine v smislu izuma opisujejo: Hauske et al., J. Med. Chem. 1992, 35, 4284-4296, posebno spojine 6, 9-10, 21-24, 26, 28, 31-32 in 52-55, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMER 84
Ta eksemplarični derivat pipekolinske kisline opisujejo: Teague et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol-. 4, št. 13, str. 1581-1584, 1994, in je vključen tukaj z referenco.
PRIMERI 85-88
Eksemplarične spojine derivate pipekolinske kisline opisujejo: Stocks et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol. 4, št. 12, str. 1457-1460, 1994, posebno spojine 2, 15-17, in so vključene tukaj z referenco.
PRIMERI 90-111
Dodatni eksemplarični derivati pipekolinske kisline so opisani na shemi 10, tabele
1-5.
SHEMA 01
PRIMER/SPOJINA
STRUKTURA
9
X = h2 x = ch2
X = H, CH3 X = O
SHEMA 2
SHEMA 2 (NADALJEVANJE)
SHEMA 3
PRIMER/SPOJINA št.
STRUKTURA
o
SHEMA 4
TABELA 1
PRIMER/SPOJINA st. STRUKTURA
22 y=l
23 y=2
24 m n 1
TABELA 2
PRIMER/SPOJINA št. STRUKTURA
25 n=l
26 n=2
27 n=3
TABELA3
PRIMER/SPOJINA št. STRUKTURA
28 n=l
29 n=2
30 n=3
SHEMA 5
PRIMER/SPOJINA št
R - fenil
R = N(alil)2
O
SHEMA 6
TABELA 1
nadaljevanje tabele 1
nadaljevanje tabele 1
TABELA 2
PRIMER/SPOJINA št
STRUKTURA
nadaljevanje tabele 2
OMe
OMe
OMe
O2S
O
SHEMA 7
TABELA 1
x = OH x = OMe x = Oi Pr x = OBn x = OCH MePh x = OCH2CHCHPh x = OCH2CH2CH2(3,4-OMe2)Ph x = NHBn x = NHCH2CH2CH2Ph
TABELA 2
TABELA 3
SHEMA 8
TABELA 1
PRIMERI/SPOJINA št
O
Ri
I
Ri
STRUKTURA
R2 = Phe-o-terc.butil
TABELA 2
Rj=m-OCH3Ph; R3*=Val-o-terc.butil Rj=m-OCH3Ph; R3 1==Leu-o-terc.butil Rj=m-OCH3Ph; R3*=Ileu-o-terc.butil Rj=m-OCH3Ph; R3 1=heksahidro-Pheterc.butil
Rj=m-OCH3Ph; R3 l=alilalanin-o-terc. butil
Rj=B-naftil; R3 J=Val-o-terc.butil
TABELA3
PRIMERI/SPOJINA št
STRUKTURA
Rj = CH2(CO)-m-OCH3PH
R/ = CH2Ph
R5’ = OCH3
Rj = CH2(CO)-B-naftil
R? = CH,Ph
Rj1 = OCH3
TABELA 4
PRIMERI/SPOJINA št
STRUKTURA
Rj = m-OCHjPh X = trans-CH=CH R/ = H
Y = OC(o)Ph Rj = m-OCH3Ph X = tians-CH=CH R/ = H
Y = OC(o)CF3 R^m-OCHjFh
X = trans-CH=CHI R?=Y = Rj = m-OCH3Ph X = trans-CH=CH R4‘ = H
Y = 001201=(¾
Rt = m-OCH3Ph
X = C=O R/=H
Y = Ph
SHEMA 9
TABELA 1
TABELA2
OMe
R2
R, = H, R2 = OMeR3 = CH2OMe Rt = H, R2 = R3 = H Ri = Me, R? = R3 = H
SHEMA 10
TABELA 1
PRIMER R =
90 3,4-dikloro
91 3,4,5-trimetoksi
92 H
93 3-(2,5-dimetoksi)-fenilpropil
94 3-(3,4-metilendioksi)fenilpropil
TABELA 2
OR (Γί
PRIMER
R =
4-(p-metoksi)-butil
3-fenilpropil
3-(3-piridil)-propil
TABELA3
OR
PRIMER R =
98 3-(3-piridil)-propil
99 l,7-difenil-4-heptil
100 4-(4-metoksi)butil
101 l-fenil-6-(4-metoksi-fenil)-4-heksil
102 3-(2,5-dimetoksi)fenil-propil
103 3-(3,4-metilendioksi)fenilpropil
104 1,5-difenilpentil
TABELA4
PRIMER
105
106 107
3-cikloheksilpropil
3-fenilpropil
TABELA5
OR
PRIMER
108
109
110 111
R =
3-cikloheksilpropil
3- fenilpropil
4- (4-metoksi)butil l,7-difenil-4-heptil
Nevrotrofni učinki rotamaznih inhibitorjev
V tabeli 1 so navedene številke zahtevanih primerov skupaj z njihovimi močmi, da inducirajo tropne učinke v kultiviranih senzornih nevronih, kot je opisano zgoraj. Sl. 19 in 20 prikazujeta fotomikrodiagrama Primera 111 in Primera 17, pospeševanje nevritnega izraščanja v ganglionskih kulturah dorzalnega debla.
TABELA I
Moči preskusnih Primerov in vitro
Primer Rotamazna inhibicija
K.nM
Nevrotrofni ED50 piščančjih DRG [nM]
6 140 25
9 13 0.030
11 170 1
12 250 300
13 25 80
15 17 0.30
19 12 0.017
36 >10,000 >10,000
41 1300 5000
50 >10,000 >10,000
90 1800 2500
91 28 200
92 39 90
93 75 35
94 70 8
95 165 5-10
96 740 10-20
97 72S 150
9Θ 130 75
99 30 5
100 60 43
101 15 0.17
102 12 2.5
103 120 3
104 20 .016
105 103 6
106 760 1
107 210 0.82
108 32 0.29
109 2 0.08
110 24 0.002
111 5 0.08
Aktivnost spojin Primerov v modelu regeneracije živcev in vivo
Aksotomija ishiadičnega živca
Šest tednov stare podganje samice Sprague-Dawley anestetiziramo in ishiadični živec izpostavimo in stremo na nivoju kolka s kleščami. Preizkusne spojine ali vehikle damo subkutano tik pred poškodbo in dnevno naslednjih 18 dni. Sekcije ishiadičnega živca obarvamo s Holmesovo srebrno barvo, da kvantitativno ugotovimo število aksonov, in Luxolovo hitro modro, da kvantitativno določimo nivo mielinacije. 18 dni po poškodbi je znatno zmanjšanje števila aksonov (50 % zmanjšanje v primerjavi z nepoškodovano kontrolo) in stopnje mielinacije (90 % zmanjšanje v primerjavi z nepoškodovano kontrolo) v živali, obdelani z vehiklom.
Rezultat dajanja Primera 12 (30 mg/kg s.c.) ali Primera 13 (30 mg/kg s.c.) tik pred poškodbo in dnevno 18 dni po poškodbi je znatna regeneracija tako števila aksonov (25 % oz. 5 % zmanjšanje v primerjavi z nepoškodovano kontrolo) kot tudi stopnje mielinacije (65 % oz. 50 % zmanjšanje v primerjavi s kontrolo) v primerjavi z živalmi, obdelanimi z vehiklom. Znatni učinkovitosti Primerov 12 in 13 sta konsistentni z njuno močno aktivnostjo pri inhibiranju rotamazne aktivnosti in stimuliranju nevritnega izraščanja v piščančjih DRG in njihovimi relativnimi močmi in vivo, paralelno z njihovimi močmi in vitro (tabela 1). Ti rezultati so prikazani na sl. 21. Lažni poskusni vzorec(Sham) označuje kontrolne živali, ki so prejele vehikel, vendar niso bile poškodovane; vehikel označuje živali, ki so bile poškodovane in so prejele samo vehikel (tj. nič zdravila). Iz Primerov 12 in 13 je razvidna izredna podobnost z živalmi, obdelanimi z lažnim poskusnim vzorcem, kar prikazuje močne nevroregenerativne učinke teh spojin in vivo. Ti podatki so kvantitativno navedeni v Tabeli II.
TABELAH
Obdelava
Št aksonov Mielinski nivo (% kontrole)
Lažni poskusni vzorec 100
100
Poškodba:
- vehikel (s.c.) 50 10
- Primer 12 (30 mg/kg s.c.)
- Primer 13 (30 mg/kg s.c.)
100 50
Predloženi izum je na ta način opisan in očitno je, da ga je možno spremeniti na mnogo načinov. Take spremembe ni potrebno smatrati kot oddaljevanje od smisla in obsega izuma in za vse take modifikacije je predvideno, da so vključene v obsegu spodnjih patentnih zahtevkov.

Claims (42)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Imunofilinski ligand za uporabo pri pripravi zdravila za pospeševanje nevronalne rasti in regeneracije pri nevropatološkem stanju, kjer lahko olajšamo nevronalno reparacijo, označen s tem, da le-ta ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  2. 2. Imunofilinski ligand za uporabo pri pripravi zdravila za zdravljenje nevrološke motnje, označen s tem, da le-ta ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  3. 3. Imunofilinski ligand za uporabo pri pripravi zdravila za zaščito živcev pred nevronalno degeneracijo, označen s tem, da le-ta ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  4. 4. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2 ali 3, označen s tem, da ga uporabimo v kombinaciji z efektivno količino nevrotrofnega faktorja, izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo nevrotrofni rastni faktor, rastni faktor, izveden iz možganov, rastni faktor, izveden iz glije, cilialni nevrotrofni faktor in nevrotropin-3.
  5. 5. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da nevropatološko stanje, nevronalna degeneracija ali nevrološka motnja vključuje periferne nevropatije, povzročene s fizično poškodbo ali bolezenskim stanjem, fizične poškodbe možganov, fizične poškodbe hrbtenjače, kapi, povezane s poškodbo možganov, in nevrološke motnje, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo.
  6. 6. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevku 5, označen s tem, da nevrološko motnjo izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofna lateralna skleroza.
  7. 7. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da je neimunosupresiven.
  8. 8. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevku 7, označen s tem, da je neimunosupresivni imunofilinski ligand Way-124,466.
  9. 9. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevku 7, označen s tem, da je neimunosupresivni imunofilinski ligand Rap-Pa.
  10. 10. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevku 7, označen s tem, da je ne64 imunosupresivni imunofilinski ligand SLB-506.
  11. 11. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevku 7, označen s tem, da neimunosupresivni imunofilinski ligand izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo spojine 3-84,86-88 in 90-111.
  12. 12. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da uporaba zagotavlja vsaj 75 % regeneracijo aksonskega števila in vsaj 35 % okrevanje mielinacije.
  13. 13. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da uporaba zagotavlja vsaj 75 % regenercijo aksonskega števila in vsaj 50 % okrevanje mielinacije.
  14. 14. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 200 nM.
  15. 15. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 35 nM.
  16. 16. Imunofilinski ligand za uporabo po zahtevkih 1, 2, 3 ali 4, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od lnM.
  17. 17. Imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za pospeševanje nevronalne rasti in regeneracije pri nevropatološkem stanju, kjer lahko olajšamo nevronalno reparacijo, označen s tem, da derivat pipekolinske kisline ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  18. 18. Imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za za zdravljenje nevrološke motnje, označen s tem, da derivat pipekolinske kisline ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  19. 19. Imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za za zaščito živcev pred nevronalno degeneracijo, označen s tem, da derivat pipekolinske kisline ne vključuje FK506 ali rapamicina.
  20. 20. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18 ali 19, označen s tem, da ga uporabimo v kombinaciji z efektivno količino nevrotrofnega faktorja, izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo nevrotrofni rastni faktor, rastni faktor, izveden iz možganov, rastni faktor, izveden iz glije, cilialni nevrotrofni faktor in nevrotropin-3.
  21. 21. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18, 19 ali 20, označen s tem, da nevropatološko stanje, nevronalna degeneracija ali nevrološka motnja vključuje periferne nevropatije, povzročene s fizično poškodbo ali bolezenskim stanjem, fizične poškodbe možganov, fizične poškodbe hrbtenjače, kapi, povezane s poškodbo možganov, in nevrološke motnje, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo.
  22. 22. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevku 21, označen s tem, da nevrološko motnjo izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofna lateralna skleroza.
  23. 23. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17, 18,19 ali 20, označen s tem, da uporaba zagotavlja vsaj 75 % regeneracijo aksonskega števila in vsaj 35 % okrevanje mielinacije.
  24. 24. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18,19 ali 20, označen s tem, da uporaba zagotavlja vsaj 75 % regeneracijo aksonskega števila in vsaj 50 % okrevanje mielinacije.
  25. 25. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18,19 ali 20, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 200 nM.
  26. 26. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18,19 ali 20, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni EDJ0 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 35 nM.
  27. 27. Derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 17,18,19 ali 20, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 1 nM.
  28. 28. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za pospeševanje nevronalne rasti in regeneracije pri nevropatološkem stanju, kjer lahko olajšamo nevronalno reparacijo.
  29. 29. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za zdravljenje nevrološke motnje.
  30. 30. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo pri pripravi zdravila za zaščito živcev pred nevronalno degeneracijo.
  31. 31. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, ali 30, označen s tem, da ga uporabimo v kombinaciji z efektivno količino nevrotrofnega faktorja, izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo nevrotrofni rastni faktor, rastni faktor, izveden iz možganov, rastni faktor, izveden iz glije, cilialni nevrotrofni faktor in nevrotropin-3.
  32. 32. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, da nevropatološko stanje, nevronalna degeneracija ali nevrološka motnja vključuje periferne nevropatije, povzročene s fizično poškodbo ali bolezenskim stanjem, fizične poškodbe možganov, fizične poškodbe hrbtenjače, kapi, povezane s poškodbo možganov, in nevrološke motnje, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo.
  33. 33. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevku 32, označen s tem, da nevrološko motnjo izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofna lateralna skleroza.
  34. 34. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, daje le-ta Way-124,466.
  35. 35. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, da je le-ta Rap-Pa.
  36. 36. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, daje le-ta SLB-506.
  37. 37. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28,29,
    30 ali 31, označen s tem, da le-tega izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo spojine 3-84, 86-88 in 90-111.
  38. 38. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, da le-ta zagotavlja vsaj 75 % regeneracijo aksonskega števila in vsaj 35 % okrevanje mielinacije.
  39. 39. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28,29, 30 ali 31, označen s tem, da le-ta zagotavlja vsaj 75 % regenercijo aksonskega števila in vsaj 50 % okrevanje mielinacije.
  40. 40. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28, 29, 30 ali 31, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni ED50 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 200 nM.
  41. 41. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28,29, 30 ali 31, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni EDJ0 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 35 nM.
  42. 42. Ne-imunosupresivni derivat pipekolinske kisline za uporabo po zahtevkih 28,29, 30 ali 31, označen s tem, da z uporabo dosežemo nevrotrofni EDJ0 pri uporabi koncentracije spojine, ki ni večja od 1 nM.
SI9620089A 1995-06-07 1996-06-05 Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti SI9620089A (sl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/474,072 US5798355A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Inhibitors of rotamase enzyme activity
US08/653,905 US5696135A (en) 1995-06-07 1996-05-28 Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
PCT/US1996/009561 WO1996040140A1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Inhibitors of rotamase enzyme activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9620089A true SI9620089A (sl) 1999-04-30

Family

ID=27044341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9620089A SI9620089A (sl) 1995-06-07 1996-06-05 Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti

Country Status (28)

Country Link
US (5) US5696135A (sl)
EP (1) EP0777478B1 (sl)
AU (1) AU710423B2 (sl)
BG (1) BG102072A (sl)
BR (1) BR9608485A (sl)
CA (1) CA2206824C (sl)
CH (1) CH689541A5 (sl)
CZ (1) CZ232997A3 (sl)
DE (1) DE19680255T1 (sl)
DK (1) DK125696A (sl)
EA (1) EA001379B1 (sl)
EE (1) EE9700331A (sl)
ES (3) ES2138518B1 (sl)
FI (1) FI964137A (sl)
GB (1) GB2305605B (sl)
HK (1) HK1013254A1 (sl)
HU (1) HUP9900816A3 (sl)
LU (1) LU88834A1 (sl)
LV (1) LV11986B (sl)
MX (1) MX9707552A (sl)
NO (1) NO974290L (sl)
NZ (1) NZ310767A (sl)
PL (1) PL323381A1 (sl)
SE (1) SE9604097L (sl)
SI (1) SI9620089A (sl)
SK (1) SK161097A3 (sl)
TW (1) TW523410B (sl)
WO (1) WO1996040140A1 (sl)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2325230A (en) * 1995-06-07 1998-11-18 Guilford Pharm Inc Intermediate for Neurotrophic N-glyoxylprolyl esters
US7056935B2 (en) * 1995-06-07 2006-06-06 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
US5696135A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
US6291510B1 (en) 1995-06-07 2001-09-18 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US6509477B1 (en) 1998-11-12 2003-01-21 Guilford Pharmaceuticals Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US5859031A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US6037370A (en) * 1995-06-08 2000-03-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5801197A (en) * 1995-10-31 1998-09-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
US5794887A (en) 1995-11-17 1998-08-18 Komerath; Narayanan M. Stagnation point vortex controller
US5801187A (en) 1996-09-25 1998-09-01 Gpi-Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters and amides
US5811434A (en) * 1996-11-13 1998-09-22 Vertex Pharmacueticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5780484A (en) * 1996-11-13 1998-07-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for stimulating neurite growth with piperidine compounds
US5840736A (en) * 1996-11-13 1998-11-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5874449A (en) * 1996-12-31 1999-02-23 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of heterocyclic thioesters
US5935989A (en) 1996-12-31 1999-08-10 Gpi Nil Holdings Inc. N-linked ureas and carbamates of heterocyclic thioesters
SK57899A3 (en) * 1996-12-31 2000-05-16 Guilford Pharm Inc N-linked ureas and carbamates of heterocyclic thioesters
US5721256A (en) * 1997-02-12 1998-02-24 Gpi Nil Holdings, Inc. Method of using neurotrophic sulfonamide compounds
US5846979A (en) * 1997-02-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic esters, amides, thioesters, and ketones
US6852496B1 (en) 1997-08-12 2005-02-08 Oregon Health And Science University Methods of screening for agents that promote nerve cell growth
US6268384B1 (en) 1997-08-29 2001-07-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds possessing neuronal activity
US5968921A (en) 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US6121280A (en) * 1998-03-24 2000-09-19 Pfizer Inc. Azabicyclic rotomase inhibitors
US6096762A (en) * 1998-06-02 2000-08-01 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic difluoroamide agents
JP2002516904A (ja) 1998-06-03 2002-06-11 ジーピーアイ ニル ホールディングス インコーポレイテッド Ｎ−複素環式カルボン酸またはカルボン酸等配電子体のｎ−結合スルホンアミド
US6331537B1 (en) 1998-06-03 2001-12-18 Gpi Nil Holdings, Inc. Carboxylic acids and carboxylic acid isosteres of N-heterocyclic compounds
AU756912B2 (en) 1998-07-17 2003-01-23 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Compounds, compositions, and methods for stimulating neuronal growth and elongation
GB9815880D0 (en) * 1998-07-21 1998-09-16 Pfizer Ltd Heterocycles
US6335348B1 (en) * 1998-08-14 2002-01-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Nitrogen-containing linear and azepinyl/ compositions and uses for vision and memory disorders
US6376517B1 (en) * 1998-08-14 2002-04-23 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivatives for vision and memory disorders
US7338976B1 (en) * 1998-08-14 2008-03-04 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters or amides for vision and memory disorders
US6339101B1 (en) * 1998-08-14 2002-01-15 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of N-heterocyclic carboxylic acids or isosteres for vision and memory disorders
US7265150B1 (en) * 1998-08-14 2007-09-04 Gpi Nil Holdings Inc. Carboxylic acids and carboxylic acid isosteres of N-heterocyclic compounds for vision and memory disorders
EP1105112A2 (en) * 1998-08-14 2001-06-13 GPI NIL Holdings, Inc. Compositions and uses for vision and memory disorders
US6333340B1 (en) * 1998-08-14 2001-12-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule sulfonamides for vision and memory disorders
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
US6307049B1 (en) 1998-09-30 2001-10-23 The Procter & Gamble Co. Heterocyclic 2-substituted ketoamides
US6300341B1 (en) 1998-09-30 2001-10-09 The Procter & Gamble Co. 2-substituted heterocyclic sulfonamides
US6228872B1 (en) 1998-11-12 2001-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic diamide and carbamate agents
WO2000046181A1 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Schering Aktiengesellschaft Carboxylic acid derivatives, process for their preparation and their use as rotamase enzyme activity inhibitors
US6284779B1 (en) 1999-02-03 2001-09-04 Schering Aktiiengesellschaft Heteroaromatic compounds
EP1196386A2 (en) * 1999-07-06 2002-04-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated N-substituted glycine derivatives
JP2003504367A (ja) 1999-07-09 2003-02-04 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 神経栄養性ピロリジン類およびピペリジン類、並びに関連組成物および方法
WO2001004091A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic 2-azetidinecarboxylic acid derivatives, and related compositions and methods
US6734211B1 (en) 1999-07-09 2004-05-11 Oregon Health & Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US6323215B1 (en) 1999-07-09 2001-11-27 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic tetrahydroisoquinolines and tetrahydrothienopyridines, and related compositions and methods
AU6913700A (en) * 1999-08-18 2001-03-13 Schering Aktiengesellschaft Piperidine and pyrrolidine derivatives displaying neuronal activity
US7807211B2 (en) 1999-09-03 2010-10-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Thermal treatment of an implantable medical device
US20070032853A1 (en) 2002-03-27 2007-02-08 Hossainy Syed F 40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin coated stent
US6790228B2 (en) 1999-12-23 2004-09-14 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Coating for implantable devices and a method of forming the same
CA2383086A1 (en) 1999-09-08 2001-03-15 Joseph P. Steiner Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use
US7253169B2 (en) 1999-11-12 2007-08-07 Gliamed, Inc. Aza compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
US6417189B1 (en) 1999-11-12 2002-07-09 Gpi Nil Holdings, Inc. AZA compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
AR034103A1 (es) * 1999-11-12 2004-02-04 Alcon Inc Composicion farmaceutica que comprende ligandos de neurofilina para el tratamiento de condiciones oculares
GT200000203A (es) 1999-12-01 2002-05-24 Compuestos, composiciones y metodos para estimular el crecimiento y elongacion de neuronas.
US6818643B1 (en) 1999-12-08 2004-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic bicyclic diamides
ATE319712T1 (de) 1999-12-21 2006-03-15 Mgi Gp Inc Hydantoin derivate, pharmazeutische zusammensetzungen und verfahren zu ihrer verwendung
US6656971B2 (en) 2001-01-25 2003-12-02 Guilford Pharmaceuticals Inc. Trisubstituted carbocyclic cyclophilin binding compounds and their use
US7041283B1 (en) 2001-02-16 2006-05-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of using immunophilin binding drugs to improve integration and survival of neuronal cell transplants
US6593362B2 (en) 2001-05-21 2003-07-15 Guilford Pharmaceuticals Inc. Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use
JP2005500270A (ja) * 2001-05-29 2005-01-06 ギルフォード ファーマシュウティカルズ インコーポレイテッド 手術の結果として発生した神経損傷を治療するための方法
ATE421525T1 (de) * 2001-08-20 2009-02-15 Max Planck Gesellschaft Katalyse der cis-trans isomerisierung von sekundären-amid peptidverbindungen
CN1173960C (zh) 2001-12-06 2004-11-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 取代六元氮杂环类化合物及其作为神经调节剂的用途
US20030176455A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Wyeth Method of inhibiting cell death
EP1402888A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-31 Jerini AG The use of substituted carbocyclic compounds as rotamases inhibitors
CA2500417A1 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 Shoei Furukawa Neurotrophic factor production promoter
US7033612B2 (en) * 2003-01-03 2006-04-25 Kang David S Composition and method for treating age-related disorders
US20050118344A1 (en) 2003-12-01 2005-06-02 Pacetti Stephen D. Temperature controlled crimping
CA2539324A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Macusight, Inc. Transscleral delivery
WO2005084673A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Wyeth Non-immunosuppressive immunophilin ligands as neuroprotective and/or neuroregenerative agents
EP1720886A1 (en) * 2004-03-02 2006-11-15 Wyeth Macrolides and methods for producing same
MXPA06014080A (es) * 2004-06-03 2007-02-15 Wyeth Corp Agregado de genes biosinteticos para la produccion de un policetido complejo.
DK1778637T3 (da) * 2004-06-29 2012-06-18 Aventis Pharma Inc FKBP-bindingssammensætninger og farmaceutisk anvendelse deraf
US7777042B2 (en) * 2004-06-29 2010-08-17 Aventis Pharmaceuticals Inc. N-sulfonylpipecolic acid derivative FKBP binding composition and pharmaceutical use thereof
US20060189551A1 (en) * 2004-10-04 2006-08-24 Duke University Combination therapies for fungal pathogens
JP2008524232A (ja) * 2004-12-20 2008-07-10 ワイス ラパマイシン誘導体及び神経障害の治療におけるその使用
DK1828202T3 (da) * 2004-12-20 2012-05-07 Wyeth Llc Rapamycinanaloge samt deres anvendelse ved behandling af neurologiske, proliferative og inflammatoriske lidelser
US8663639B2 (en) 2005-02-09 2014-03-04 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Formulations for treating ocular diseases and conditions
US8637070B2 (en) 2005-02-09 2014-01-28 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Rapamycin formulations and methods of their use
KR20080018874A (ko) * 2005-04-27 2008-02-28 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨. 인간 질병과 관련된 돌연변이 단백질의 분해 촉진을 위한물질 및 방법
WO2006125324A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Queen's University At Kingston Treatment of protein folding disorders
EP2001438A2 (en) 2006-02-09 2008-12-17 Macusight, Inc. Stable formulations, and methods of their preparation and use
ES2563288T3 (es) 2006-03-23 2016-03-14 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Rapamicina en dosis bajas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular
AU2008338989A1 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
DE102008060549A1 (de) 2008-12-04 2010-06-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Wirkstoff-Peptid-Konstrukt zur extrazellulären Anreicherung
US20100317711A1 (en) * 2008-12-17 2010-12-16 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
EP2705856A1 (en) 2012-09-07 2014-03-12 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. Compounds for the treatment of neurodegenerative disorders
US9121859B2 (en) 2012-12-04 2015-09-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compounds and methods for determination of FKBP-binding immunosuppressant drugs
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AU2017214550B2 (en) * 2016-02-04 2024-03-07 The Johns Hopkins University Synthesis and composition of Rapafucin libraries
ES2837484T3 (es) 2016-02-04 2021-06-30 Univ Johns Hopkins Rapadocinas, inhibidores del transportador de nucleósidos equilibrativo 1 y usos de los mismos
US11066416B2 (en) 2016-02-04 2021-07-20 The Johns Hopkins University Rapafucin derivative compounds and methods of use thereof
CN108697729B (zh) 2016-02-04 2023-05-09 约翰霍普金斯大学 新型GLUT抑制剂rapaglutin及其用途
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CN114533708A (zh) * 2022-03-23 2022-05-27 四川大学 Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的应用

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4390695A (en) * 1980-06-23 1983-06-28 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
US4310461A (en) * 1980-06-23 1982-01-12 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
US4578474A (en) * 1980-06-23 1986-03-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
AU563282B2 (en) * 1982-09-13 1987-07-02 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Pyrrolidino and piperidino derivatives and condensed derivatives thereof
US4593102A (en) * 1984-04-10 1986-06-03 A. H. Robins Company, Inc. N-[(amino)alkyl]-1-pyrrolidine, 1-piperidine and 1-homopiperidinecarboxamides (and thiocarboxamides) with sulfur linked substitution in the 2, 3 or 4-position
US5385915A (en) * 1990-05-16 1995-01-31 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with Alzheimer disease using modulators of protein phosphorylation
US5242932A (en) * 1991-12-17 1993-09-07 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with alzheimer disease
US5504197A (en) * 1990-06-20 1996-04-02 The Salk Institute For Biological Studies DNA encoding neurotrophic growth factors
US5192773A (en) * 1990-07-02 1993-03-09 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Immunosuppressive compounds
AU8727491A (en) * 1990-08-29 1992-03-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified di- and tripeptidyl immunosuppressive compounds
AU1677092A (en) * 1991-03-20 1992-10-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrahydroxyalkane derivatives as inhibitors of hiv aspartyl protease
US5321009A (en) * 1991-04-03 1994-06-14 American Home Products Corporation Method of treating diabetes
AU2007192A (en) * 1991-05-08 1992-12-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Rfkbp: a novel prolyl isomerase and rapamycin/fk506 binding protein
US5620971A (en) * 1991-05-09 1997-04-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biologically active acylated amino acid derivatives
DE69229782T2 (de) * 1991-05-09 2000-04-27 Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge Neue immunsuppressive verbindungen
MX9202466A (es) * 1991-05-24 1994-06-30 Vertex Pharma Compuestos inmunosupresores novedosos.
WO1993007269A1 (en) * 1991-10-11 1993-04-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated ISOLATION OF AN Mr 52,000 FK506 BINDING PROTEIN AND MOLECULAR CLONING OF A CORRESPONDING HUMAN cDNA
CA2091194A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-09 Richard D. Connell 2-oxo-ethyl derivatives as immunosuppressants
WO1993023548A2 (en) * 1992-05-20 1993-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated METHOD OF DETECTING TISSUE-SPECIFIC FK506 BINDING PROTEIN MESSENGER RNAs AND USES THEREOF
IS2334B (is) * 1992-09-08 2008-02-15 Vertex Pharmaceuticals Inc., (A Massachusetts Corporation) Aspartyl próteasi hemjari af nýjum flokki súlfonamíða
NZ314207A (en) * 1992-09-28 2000-12-22 Vertex Pharma 1-(2-Oxoacetyl)-piperidine-2-carboxylic acid derivatives as multi drug resistant cancer cell sensitizers
AU5748194A (en) * 1992-12-11 1994-07-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Mannitol derivatives and their use as inhibitors of aspartyl protease
DE4302860A1 (de) * 1993-01-22 1994-08-04 Chemie Linz Deutschland N-Cyclische und N,N'dicyclische Harnstoffe
US5385918A (en) * 1993-02-09 1995-01-31 Miles Inc. Aminomethylene-peptides as immunosuppressants
US5846981A (en) * 1993-05-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5798355A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
GB2279006A (en) * 1993-06-03 1994-12-21 Fujisawa Pharmaceutical Co Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
DE69512220T2 (de) * 1994-03-07 2000-03-16 Vertex Pharmaceuticals Inc. Sulfonamidderivate als aspartylprotease-inhibitoren
US5744485A (en) * 1994-03-25 1998-04-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carbamates and ureas as modifiers of multi-drug resistance
US5898029A (en) * 1994-04-12 1999-04-27 The John Hopkins University Direct influences on nerve growth of agents that interact with immunophilins in combination with neurotrophic factors
US5716929A (en) * 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5856116A (en) * 1994-06-17 1999-01-05 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystal structure and mutants of interleukin-1 beta converting enzyme
US5488816A (en) * 1994-07-21 1996-02-06 Boehringer Mannheim Corporation Method and apparatus for manufacturing a coagulation assay device in a continuous manner
IL115685A (en) * 1994-11-16 2000-08-31 Vertex Pharma Amino acid derivatives pharmaceutical compositions containing the same and processes for the preparation thereof
US5543423A (en) * 1994-11-16 1996-08-06 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Amino acid derivatives with improved multi-drug resistance activity
US5726184A (en) * 1995-05-19 1998-03-10 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetralin compounds with improved MDR activity
SI9500173B (sl) 1995-05-19 2002-02-28 Lek, Trofazna farmacevtska oblika s konstantnim in kontroliranim sproščanjem amorfne učinkovine za enkrat dnevno aplikacijo
US5859031A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US5696135A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
US6037370A (en) 1995-06-08 2000-03-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth

Also Published As

Publication number Publication date
US6500843B2 (en) 2002-12-31
CH689541A5 (de) 1999-06-15
EE9700331A (et) 1998-06-15
HUP9900816A2 (hu) 1999-07-28
BG102072A (en) 1998-08-31
GB9624258D0 (en) 1997-01-08
HUP9900816A3 (en) 2000-02-28
HK1013254A1 (en) 1999-08-20
ES2194596A1 (es) 2003-11-16
CA2206824A1 (en) 1996-12-19
US6022878A (en) 2000-02-08
ES2166740A1 (es) 2002-04-16
FI964137A0 (fi) 1996-10-15
DK125696A (da) 1996-12-20
AU710423B2 (en) 1999-09-23
CA2206824C (en) 2001-08-14
TW523410B (en) 2003-03-11
NO974290L (no) 1997-12-04
WO1996040140A1 (en) 1996-12-19
SK161097A3 (en) 1998-11-04
LV11986B (en) 1998-09-20
SE9604097L (sv) 1996-12-08
US20030114365A1 (en) 2003-06-19
US20020052372A1 (en) 2002-05-02
GB2305605B (en) 2000-01-12
PL323381A1 (en) 1998-03-30
LU88834A1 (de) 1997-01-15
CZ232997A3 (cs) 1998-07-15
US5696135A (en) 1997-12-09
ES2194596B1 (es) 2005-02-16
LV11986A (lv) 1998-03-20
EA001379B1 (ru) 2001-02-26
FI964137A (fi) 1997-01-15
NZ310767A (en) 2000-11-24
EP0777478A4 (en) 1998-07-08
EP0777478B1 (en) 2001-11-07
MX9707552A (es) 1998-07-31
SE9604097D0 (sv) 1996-11-08
ES2138518A1 (es) 2000-01-01
GB2305605A (en) 1997-04-16
ES2138518B1 (es) 2001-01-01
GB2305605A8 (en) 1999-01-20
BR9608485A (pt) 1999-07-06
EP0777478A1 (en) 1997-06-11
EA199700360A1 (ru) 1998-08-27
NO974290D0 (no) 1997-09-17
DE19680255T1 (de) 1997-06-05
AU6162296A (en) 1996-12-30
US5843960A (en) 1998-12-01
ES2166740B1 (es) 2003-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9620089A (sl) Inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti
US5798355A (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
WO1996040140A9 (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5846981A (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
Steiner et al. Neurotrophic actions of nonimmunosuppressive analogues of immunosuppressive drugs FK506, rapamycin and cyclosporin A
US6080753A (en) Stimulating nerve growth with immunophilins
EP1265605B1 (en) Pharmaceutical compositions comprising beta-turn peptidomimetic cyclic compounds
JPH11514643A (ja) ロタマーゼ酵素活性阻害剤
JP3089350B2 (ja) シクロフィリンロタマーゼ活性の阻害剤
Harper et al. Analysis of the neurotrophic effects of GPI-1046 on neuron survival and regeneration in culture and in vivo
US7816384B2 (en) Method for treating a demyelinating condition
Pong et al. Therapeutic implications for immunophilin ligands in the treatment of neurodegenerative diseases
US20030186960A1 (en) Cyclized amino acid derivatives
JP2000501118A (ja) ２，２′−ビ−１ｈ−ピロール化合物を含有する相乗作用性免疫抑制剤組成物
US20030130256A1 (en) Cyclized amide derivatives
US20040266811A1 (en) Methods for inducing regeneration, remyelination, and hypermyelination of nervous tissue
AU740089B2 (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
US20020111347A1 (en) Amino-alkyl derivatives
US20090221610A1 (en) Compositions and Methods for Treating Cognitive Disorders

Legal Events

Date Code Title Description
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20050404