SK161097A3 - Use of the immunophilin ligand for the preparation of agent to stimulate neuronal growth and regeneration at neuropathological conditions - Google Patents

Use of the immunophilin ligand for the preparation of agent to stimulate neuronal growth and regeneration at neuropathological conditions Download PDF

Info

Publication number
SK161097A3
SK161097A3 SK1610-97A SK161097A SK161097A3 SK 161097 A3 SK161097 A3 SK 161097A3 SK 161097 A SK161097 A SK 161097A SK 161097 A3 SK161097 A3 SK 161097A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
immunosuppressive
pipecolic acid
neurotrophic
immunophilin
ligand
Prior art date
Application number
SK1610-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Joseph P Steiner
Solomon Snyder
Gregory S Hamilton
Original Assignee
Guilford Pharm Inc
Univ Johns Hopkins Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27044341&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK161097(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/474,072 external-priority patent/US5798355A/en
Application filed by Guilford Pharm Inc, Univ Johns Hopkins Med filed Critical Guilford Pharm Inc
Publication of SK161097A3 publication Critical patent/SK161097A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4535—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom, e.g. pizotifen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/5025—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Description

Vynález sa týka použitia zlúčenín odvodených od kyseliny pipekolovej s neurotrofickým účinkom, ktoré majú afinitu k imunofilínom typu FKBP ako inhibítorom enzymatickej aktivity spojenej s imunofilínovými bielkovinami, najmä ako inhibítorom peptidyl-prolyl izomerázovej alebo rotamázovej enzymatickej aktivity, na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov, prostriedku na liečenie neurologickej poruchy ako aj na ochranu nervov. Táto prihláška je čiastočnou pokračovacou prihláškou U.S. Patent Application Seriál No. 08/474, 072, ktorá bola podaná 7. júna 1995.
Doterajší stav techniky
Výrazom imunofilín sa označujú početné bielkoviny, ktoré slúžia ako receptory pre hlavné liečivá s imunosupresívnym pôsobením a to pre cyklosporín A (CsA), FK506 a rapamycín. Známymi skupinami imunofilínov sú cyklofilíny a bielkoviny, ktoré viažu látku FK506, medzi ktoré patrí napr. FKBP. Cyklosporín A sa viaže na cyklofilín, zatiaľ čo FK506 a rapamicín sa viažu na FKPB. Tieto komplexy, ktoré pozostávajú z imunofilínu a príslušnej látky, interagujú s rôznymi vnútrobunkovými signálnymi transdukčnými systémami, najmä v imunitnom a nervovom systéme.
O imunofilínoch je známe, že majú peptidyl-prolyl izomerázovú aktivitu (PPIáza), alebo enzymatickú rotamázovú aktivitu. Zistilo sa, že rotamázová aktivita má úlohu pri katalýze interkonverzie cis a trans izoméru imunofilínových bielkovín.
Imunofilíny sa pôvodne objavili a študovali v imunitnom tkanive. Spočiatku sa predpokladalo, že inhibícia rotamázovej aktivity imunofilínov vedie k inhibícii proliferácie T-buniek, čo zapríčiní imunosupresívny účinok, ktorý vyvolávajú imunosupresívne látky, napr. cyklosporín A, FK506 a rapamycín. Neskoršie štúdium ukázalo, že priama i nepriama inhibícia rotamázovej aktivity nepostačuje na imunosupresívny účinok (Schreiber a spol., Science 1990, 250, 556-559). Naproti tomu sa zdá, že imunosupresia pochádza z tvorby komplexu imunosupresívnych látok s
- 2 imunofilínmi. Ukázalo sa, že tieto komplexy imunofilínov s látkami interagujú pri ich účinku sternárnymi väzobnými miestami bielkovín (Schreiber a spol., Celí 1991, 66, 807-815). V prípade komplexov FKBP-FK506 a FKBP-CsA sa tieto komplexy látok s imunofilínmi viažu na enzým kalcineurín, čím inhibujú receptorovú signalizáciu Tbuniek, čo napokon vedie k proliferácii T-buniek. Podobne komplex rapamycínu a FKBP interaguje s bielkovinou RAFT1/FRAP a inhibuje signalizáciu z receptora pre IL-2.
Zistilo sa, že imunofilíny sú prítomné vo vysokých koncentráciách v centrálnom nervovom systéme. Imunofilíny sa v tomto systéme vyskytujú v 10-50-krát vyšších konncentráciach ako v imunitnom systéme. Zdá sa, že v nervovom tkanive imunofilíny ovplyvňujú syntézu oxidu dusnatého, uvoľňovanie neurotransmiterov i predlžovanie neuronálnych výbežkov.
Oxid dusnatý má v organizme viacero úloh. Zdá sa, že v mozgu funguje ako neurotransmiter. Vytvára sa zarginínu pôsobením syntetázy oxidu dusnatého, ktorá oxiduje guanidínovú skupinu arginínu. Pri reakcii vzniká pritom oxid dusnatý a citrulín. Stimulácia subtypu glutamátového receptora pre N-metyl-d-aspartát (NMDA) rýchlo a výrazne aktivuje syntetázu oxidu dusnatého a stimuluje tvorbu cGMP. Inhibícia syntetázy oxidu dusnatého derivátmi arginínu, napr. nitroarginínom zabraňuje zvýšeniu hladiny cGMP indukovanej glutamátom. Syntetáza oxidu dusnatého je enzým, ktorý si vyžaduje prítomnosť komplexu vápnik-kalmodulín. Aktivácia receptora pre N-metyl-daspartát stimuluje aktivitu syntetázy oxidu dusnatého, pretože receptor pre N-metyl-daspartát obsahuje vápnikový kanál, ktorý sa otvára po stimulácii glutamátom. Tým sa umožní vápniku vnikať do buniek a aktivovať spomenutú syntetázu oxidu dusnatého.
Glutamát je fyziologický neurotransmiter. Ak sa však uvoľní v nadbytku, má neurotoxický účinok, ktorý je sprostredkovaný receptormi pre N-metyl-d-aspartát. Pri pôsobení glutamátu alebo N-metyl-d-aspartátu na kultúry kôrových neurónov dochádza k zániku až 90 % neurónov. Tieto účinky možno inhibovať antagonistami N-metyl-daspartátu. Predpokladá sa, že táto neurotoxicita N-metyl-d-aspartátu má podstatný podiel na poškodení neurónov pri náhlych mozgových príhodách cievneho pôvodu. Po uzávere ciev v mozgu dochádza teda k rozsiahlemu uvoľneniu glutamátu a mnohí antagonisti Nmetyl-d-aspartátu inhibujú poškodenie vyvolané náhlou mozgovou príhodou. Fosforylácia syntetázy oxidu dusnatého inhibuje jej katalytickú aktivitu. Látka FK506 by mohla zvýšením fosforylácie syntetázy oxidu dusnatého funkčne inhibovať tvorbu oxidu dusnatého a teda mohla by blokovať neurotoxicitu spôsobenú glutamátom. Skutočne,
- 3 FK506 i cyklosporín A v nízkych koncentráciách inhibujú v kortikálnych kultúrach neurotoxicitu N-metyl-d-aspartátu. Sprostredkujúca úloha FKBP je zrejmá, pretože rapamycín revertuje terapeutický účinok FK506. Zdá sa, že FK506, ktorý už je na trhu ako imunosupresívum, by sa mohol klinicky využiť u pacientov s náhlou mozgovou príhodou.
Látka FK506 zvyšuje aj fosforyláciu proteínu-43 (GAP43), ktorý je spojený s rastom. Tento GAP43 sa zúčastňuje na predlžovaní výbežkov nervových buniek. Zdá sa, že jeho fosforylácia túto aktivitu zvyšuje. V nadväznosti na to sa na bunkách typu PC 12 študovali účinky FK506, rapamycínu a cyklosporínu na predlžovanie výbežkov nervových buniek. Tieto bunky sú kontinuálnou líniou buniek, ktoré sa podobajú na neuróny predlžujúce neurity, ak sa stimulujú nervovým rastovým faktorom (Nerve Growth Factor - NGF).
Bolo prekvapením, keď sa zistilo, že imunosupresíva, napr. FK506 alebo rapamycín v pikomolámych koncentráciách stimulujú vyrastanie neuritov z buniek typu PC 12 a zo senzorických buniek, t.j. z buniek ganglií zadných koreňov miechy (Dorsal Root Ganglion Cells (DRGs) (Lyons a spol. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1994, 91, 3191-3195). V experimentoch na zvieratách, na celých organizmoch, sa ukázalo, že FK506 stimuluje regeneráciu nervu po poškodení tvárového nervu a že u zvierat s poškodením sedacieho nervu spôsobí obnovu funkcie.
Okrem toho sa zistilo, že látky s vysokou afinitou ku FKBP sú účinné inhibítory rotamázy a majú vynikajúce neurotrofické účinky (Snyder a spol. „ Imunophilins and the Nervous System“, Natura Medicíne, zväzok 1, číslo 1, január 1995, 32-37). Tieto pozorovania poukazujú na možnosť použiť imunosupresíva pri liečbe rôznych periférnych neuropatií a pri zvýšení opätovného rastu neurónov v centrálnom nervovom systéme (CNS). Štúdie ukázali, že neurodegeneratívne ochorenia, napr. Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a amyotrofická laterálna skleróza (ALS) sa môžu vyskytovať ako následok straty alebo zníženej dostupnosti neurotrofických látok špecifických pre príslušnú populáciu nervových buniek ovplyvnených chorobou.
V centrálnom nervovom systéme sa identifikovali viaceré neurotrofické faktory, ktoré ovplyvňujú špecifické populácie nervových buniek. Predpokladá sa napríklad, že Alzheimerova choroba vzniká ako následok zníženia alebo straty nervového rastového faktora (NGF). Vychádzajúc z toho, navrhlo sa liečiť pacientov s Alzheimerovou chorobu exogénnym nervovým rastovým faktorom, alebo inými neurotrofickými
- 4 bielkovinami, napr. rastovým faktorom izolovaným z mozgu, rastovým faktorom izolovaným zglie, ciliámym neurotrofickým faktorom, alebo neurotropínom-3, aby sa zlepšilo prežívanie degenerujúcich populácií nervových buniek.
Klinické používanie týchto bielkovín u rôznych neurologických chorobných stavov je sťažené problémami s podávaním a s biodostupnosťou veľkých bielkovín určených pre cieľové štruktúry v nervovom systéme. Na rozdiel od tohoto imunosupresívne látky s neurotrofickou účinnosťou sú relatívne malé a majú vynikajúcu biodostupnosť a špecificitu. Ak sa však imunosupresíva podávajú chronicky, majú mnoho potenciálne vážnych nežiaducich účinkov, vrátane nefrotoxicity, ako napr. poškodenie glomerulárnej filtrácie a ireverzibilnú intersticiálnu nekrózu (Kopp a spol., 1991, J. Am. Soc. Nephrol., 1:162), ďalej vrátane neurologických poškodení, napr. mimovoľný tras, nešpecifickej mozgovej angíny, napr. nelokalizované bolesti hlavy (De Groen a spol., 1987 N. Engl. J. Med. 317:861), alebo cievnej hypertenzie s komplikáciami, ktoré z nej vyplývajú (Kahan a spol., 1989 M Engl. J. Med 321:1725).
Predložený vynález poskytuje zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej s imunosupresívnym účinkom prípadne i bez tohoto účinku, ktoré obsahujú FKBP inhibítory rotamázy sa malou molekulou, ktoré sú extrémne účinné pri zvyšovaní vyrastania neuritov a pri podpore rastu nerónov ako aj pri ich regenerácii pri rôznych neuropatologických situáciách, v ktorých možno podporiť opravu neurónov vrátane poškodenia periférnych nervov fyzikálnym poškodením alebo chorobným stavom, ako napr. diabetom, fyzikálnym poškodením centrálneho nervového systému (miecha a mozog), poškodením mozgu súvisiacim s náhlou mozgovou príhodou, alebo na liečbu neurologických porúch súvisiach s neurodegeneráciou vrátane Parkinsonovej choroby, Alzheimerovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka použitia zlúčenín odvodených od kyseliny pipekolovej s neurotrofickým účinkom, ktoré majú afinitu k imunofilínom typu FKBP, ako k inhibítorom enzymatickej aktivity spojenej s imunofilínovými bielkovinami, najmä ako inhibítorom peptidyl-prolyl izomerázovej alebo rotamázovej enzymatickej aktivity,
- 5 na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov, prostriedku na liečenie neurologickej poruchy ako aj na ochranu nervov.
Predložený vynález sa teda týka použitia imunofilínového ligandu na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov, pričom imunofilínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycin, ako aj použitia imunofilínového ligandu na prípravu prostriedku na liečenie neurologickej poruchy a na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou, kde imunofilínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycin.
Imunofilínový ligand sa dá použiť v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofický faktor a neurotropín-3.
Neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou, pričom neurologickou poruchou môže byť neurologická porucha, patriaca do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
Predložený vynález sa ďalej týka použitia imunofilínového ligandu na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov, kde imunofilínový ligand je imunosupresívum alebo nie je imunosupresívum, pričom neimunosupresívnym ligandom je Way-124,666, Rap-Pa, zlúčenina SLB-506 alebo neimunosupresívny ligand je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo zlúčenín 3-84 a 86-88.
Použitie imunofilínového ligandu podľa predloženého poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie, s výhodou najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie, pričom neurotrofická ED;o sa dosahuje použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM, s výhodou použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM, ešte výhodnejšie použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
- 6 Okrem toho sa predložený vynález použitia imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov, pričom derivát kyseliny pipekolovej nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
Ďalej sa predložený vynález týka použitia imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na liečenie neurologickej poruchy, kde imunofílínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín, ako aj použitia imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou, kde imunofílínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
Imunofílínový ligand môže byť použitý v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofický faktor a neurotropín-3.
Neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou, pričom neurologickou poruchou môže byť neurologická porucha patriaca do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
Použitie tohto imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie, s výhodou najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie, pričom neurotrofícká ED50 sa dosahuje použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM, s výhodou v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM, najvýhodnejšie použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
Ešte ďalej sa predložený vynález týka použitia neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov, použitia neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na liečenie
- 6a neurologickej poruchy ako aj použitia neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou.
Imunofilínový ligand sa dá použiť v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofický faktor a neurotropín-3.
Neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou, kde neurologická porucha patrí do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
Neimunosupresívnym derivátom kyseliny pipekolovej je Way-124,666, Rap-Pa, zlúčenina SLB-506 alebo neimunosupresívny derivát kyseliny pipekolovej je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo zlúčenín 86-88 a 90-111.
Použitie uvedeného neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie, s výhodou najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie. Neurotrofícká ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM, s výhodou v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM, ešte výhodnejšie použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
Prehľad obrázkov
Vynález je bližšie objasnený pomocou priložených obrázkov, kde
Obrázok 1 znázorňuje expresiu FKBP-12 a GAP-43 v jadre tvárového nervu po rozdrvení nervu. Hybridizácia FKBP12 (vľavo) a GAP-43 (vpravo) in situ v porovnaní s časovým priebehom expresie mRNA v jadre tvárového nervu. Jadro tvárového nervu vpravo je ipsilaterálne vo vzťahu k poškodeniu, na ľavej strane je neoperovaná kontrola (Obr. 1B). Hybridizácia FKBP-12 in situ u neliečenej kontroly (vľavo) a kalcineurínu Αα, β 7 dní po rozdrvení nervu (vpravo).
Pokusy boli opakované najmenej 3 razy s podobnými výsledkami.
- 6b Obrázok 2 zobrazuje lokalizáciu FKBP-12 do motorických neurónov tvárového nervu po rozdrvení nervu. Mikrofotografie vo svetlom poli. Hybridizácia FKBP-12 in situ v motorických neurónoch jadra faciálneho nervu 7 dní po poškodení (obr. 2A) a v motorických neurónoch kontrolného jadra tvárového nervu (obr. 2B).
Obrázok 3 zobrazuje zvýraznenie (upregulácia) FKBP-12 mRNA v motorických neurónoch v bedrovej mieche po rozdrvení sedacieho nervu. Hybridizácia FKBP-12 in situ 7 dní po rozdrvení sedacieho nervu vpravo. V hornej časti obrázku (obr. 3A) sa dokumentuje odpoveď motorických neurónov v predných rohoch dolnej časti bedrovej miechy (viď šipka). V dolnej časti sú mikrofotografie vo svetlom poli, ktoré ukazujú korešpondujúce populácie motorických neurónov. Na obr. 3B je ľavá strana kontralaterálna vo vzťahu k poškodeniu nervu, na obr. 3C je pravá strana ipsilaterálna k poškodeniu nervu. Tento pokus sa opakoval 3 razy s podobnými výsledkami.
Obrázok 4 predstavuje indukciu FKBP a FKBP-12 mRNA vgangliu zadných koreňov miechy o 1 a 6 týždňov po rozdrvení sedacieho nervu. Mikrofotografie v tmavom poli. Rezy cez ganglion zadných koreňov miechy ipsilaterálne voči poškodeniu sedacieho nervu spracované hybridizáciou FKBP in situ sú na ľavej strane. Na pravej strane sú autorádiogramy [3H]FK506. Tieto výsledky sa replikovali 3 razy v každom časovom intervale.
Obrázok 5 predstavuje ricínovú léziu pravého tvárového nervu. Farbenie podľa Nissla (spodná časť obrázku, obr. 5A) dokumentuje rozsiahlu degeneráciu motorických neurónov v jadre tvárového nervu vpravo so sprievodnou proliferáciou glie o 7 dní po injekcii ricínu do tvárového nervu. V hornej časti obrázku obr. 5B je hybridizácia FKBP mRNA in situ 7 dní po ricínovej lézii tvárového nervu resp. jeho jadra. Tento pokus sa replikoval 3 razy s podobným výsledkom.
Obrázok 6 zobrazuje väzbu [3H]FK506 v segmentoch sedacieho nervu 7 dní po jeho rozdrvení. Diagram ukazuje odobraté 3 mm segmenty sedacieho nervu. Zúženia indikujú polohu ligatúr naložených v siedmy deň na 6h čas odberu, ako sa to opisuje v metódach. Miesto distálnej ligatúry je 10 mm proximálne od miesta pôvodného rozdrvenia. Anterográdny transport FKBP je 124 mm/deň. Údaje predstavujú priemery ± strednú chybu priemeru (n = 3).
Obrázok 7 ukazuje transport FKBP v sedacom nerve. Mikrofotografie v tmavom poli. Rezy cez kontrolný, neovplyvnený sedací nerv a cez miesto rozdrvenia sedacieho nervu po 7 dňoch spracované hybridizáciou FKBP-12 in situ (obr. 7A, obr. 7B) a autorádiografiou [ H]FK506. Šípky označujú miesto rozdrvenia nervu. Tento experiment sa opakoval 3 razy s podobným výsledkom.
Obrázok 8 predstavuje množstvo väzby [3H]FK506 v bunkách PC-12 udržované za prítomnosti resp. neprítomnosti NGF (50 ng/ml). Počet experimentov n = 3 v každom časovom intervale. Rozptyly označujú strednú chybu priemeru.
Obrázok 9 ukazuje zväčšenie vyrastania neuritov sprostredkované imunosupresívami v bunkách typu PC-12. Mikrofotografie sHoffmanovým kontrastom (64). Kultúry rastúce 48 h za prítomnosti NGF, s pridaním alebo bez pridania FK506 resp. rapamycínu. Na obr. 9A sú bunky PC-12 inkubované za prítomnosti NGF v koncentrácii 1,0 ng/ml, na obr. 9B 50 ng/ml NGF, na obr. 9C 1,0 ng/ml NGF a 100 nM FK506, na obr. 9D 1,0 ng/ml NGF a 100 nM rapamycínu. Zväčšenie 200 x.
Obrázok 10 predstavuje účinky FK506 na vyrastanie neuritov v bunkách PC-12. Kultúry sa udržovali za prítomnosti NGF v rôznych koncentráciách za prítomnosti 100 nM FK506, príp. bez neho. Vyrastanie neuritov sa meralo po 48 hodinách. Vyrastanie sa kvantifikovalo spôsobom, ktorý sa popisuje v metódach a to tak, že sa počítali bunky s neuritickými výrastkami dlhšími ako 5 pm. Počet experimentov bol v každom časovom intervale n = 4. Rozptyly označujú stredné chyby priemerov.
Obrázok 11 predstavuje závislosť odpovede od koncentrácie pre potenciáciu vyrastania neuritov spôsobeného látkou FK506 v bunkách typu PC-12. Bunky sa udržovali v prostredí s NGF v koncentrácii 1 ng/ml a v rôznych koncentráciách FK506. Vyrastanie neuritov sa meralo spôsobom, ktorý sa uvádza na obrázku 10 a v opise metód. Počet experimentov bol v každom časovom intervale n = 4. * p<0,001 Študentov t test.
Obrázok 12 znázorňuje autorádiografiu [3H]FK506 v kultúrach explantátov z ganglií zadných koreňov miechy. Po kultivácii kultúr v prítomnosti NGF v koncentrácii 100 ng/ml, ktorá trvala dvadsať šesť dní, možno pozorovať extenzívne výrastky s početnými granulami striebra viazanými na FKBP: Autorádiografické zrná sa nevyskytujú v prítomnosti neznačeného FK506 v koncentrácii 1 μΜ.
Obrázok 13 znázorňuje mikrofotografie vo fázovom kontraste. Gangliá zadných koreňov miechy inkubované s rôznymi látkami. Obr. 13A: NGF 10,0 ng/ml, obr. 13B: FK506 1 μΜ, obr. 13C: FK506 1 μΜ a protilátka proti NGF, obr. 13D: bez prítomnosti rastového faktora, obr. 13E: FK506 1 pM, obr. 13F: FK506 1 μΜ a rapamycín 1 μΜ. Kalibrácia je 205 μπι. NGF indukuje rozsiahle vyrastanie axónov (obr. 13A), podobne ako 1 μΜ FK506 (obr.l3B). Účinky FK506 sú výrazne zmenšené znížením koncentrácie na 1 pM (obr. 13E). Vyrastanie neuritov za prítomnosti lpM FK506 je však väčšie, ako za jeho neprítomnosti (obr. 13D). Účinky FK506 sa zmenšujú aj po pridaní protilátky proti NGF na eliminovanie pôsobenia NGF vytváraného neneuronálnymi bunkami v kultúrach. Početné neurity, ktoré sa vyskytujú vo veľkých zväzkoch ako odpoveď na NGF (100 ng/ml) (obr. 13A) alebo na 1 μΜ FK506 (obr. 13B), sa zdajú byť biele, zatiaľ čo malé zväzky alebo individuálne neurity sa zdajú byť čierne. Neneuronálne bunky, Schwannove bunky a niektoré fibroblasty sú zreteľnejšie pri 1 pM FK506 (obr.l3E) alebo pri protilátke proti NGF (obr. 13C), ako pri 1 μΜ FK506. NGF, ktorý sa vytvára v kultúrach v neneuronálnych bunkách spôsobuje obmedzené vyrastanie výrastkov axónov, ktoré možno pozorovať v kultúrach bez pridania rastového faktora (obr. 13D). Veľký počet refraktémych neuronálnych buniek, ktoré sa javia ako biele, má tendenciu prekryť ojedinelé neurity (obr. 13D). Rapamycín celkom inhibuje vyrastanie axónov za prítomnosti FK 506 (obr. 13F). Mikrofotografie sú reprezentatívnym nálezom z 12-30 ganglií v každej z experimentálnych podmienok. Rozdiely medzi experimentálnymi skupinami boli vysoko reprodukovateľné.
Obrázok 14 predstavuje pôsobenie FK506 a rapamycínu na predlžovanie neuritov v bunkách typu PC-12 vyvolané NGF. Bunky PC12 (60 pasáží) sa udržovali za prítomnosti samotného NGF v rôznych koncentráciách, alebo za prítomnosti 100 nM FK.506, 100 nM rapamycínu alebo 100 nM WAY-124,466. Vyrastanie neuritov sa meralo po 96 hodinách, pričom za pozitívny nález sa pokladali bunky, ktoré mali výrastky dlhšie ako priemer buniek. Počet experimentov bol v každom časovom intervale n = 3. Rozptyly udávajú stredné chyby priemerov.
Obrázok 15 predstavuje látky FK 506 (A), rapamycín (B) alebo WAY-124,466, ktoré v pikomolámych koncentráciách potencujú predlžovanie neuritov vyvolané NGF (0,5 ng/ml) v bunkách typu PC 12. Bunky PCI2 s malým počtom pasáží sa vystavili po 4 dni účinku NGF v koncentrácii 0,5 ng/ml za prítomnosti rôznych koncentrácií FK506 (□), rapamycín ( ) alebo WAY-124,466 ( ). Zvýraznenie neuritov sa kvantifikovalo spôsobom, ktorý sa opisuje pri obrázku 14. Na porovnanie je znázornená úroveň tvorby neuritov za prítomnosti NGF v koncentrácii 0,5 ng/ml (označené ako L) a 50 ng/ml (označené ako H).
Obrázok 16 predstavuje mikrofotografie buniek typu PC 12 inkubovaných za prítomnosti ligandov pre imunofilín + NGF v koncentrácii 0,5 ng/ml, samotný alebo 50 ng/ml NGF.
Obrázok 17: ligandy pre imunofilín zmenšujú množstvo NGF potrebné na vyvolanie maximálneho predlžovania neuritov v senzorických gangliách kurčiat. ZkurČacích embryí starých 9-10 dní sa izolovali explantáty celých ganglií dorzálnych koreňov miechy a kultivovali sa v kultivačných platničkách s 12 jamkami pokrytými Matrigelom, ktoré obsahovali médium L15 s vysokým obsahom glukózy, s 10 % fetálneho teľacieho séra s prídavkom 10 μΜ Ara C, penicilínu a streptomycínu pri 37 °C v prostredí s 5 % CO2. Senzorické gangliá sa inkubovali počas 48 hodín s 1 ng/ml NGF, 1 ng/ml NGF plus 100 nM FK506 alebo 100 ng/ml NGF. Potom sa neuronálne výbežky počítali a fotografovali.
- 10 Obrázok 18: látky FK506, rapamycín a WAY-124,466 potencujú tvorbu neuritov, ktorá závisí od NGF v senzorických gangliách. Explantáty kuracích ganglií zo zadných koreňov miechy sa kultivovali spôsobom, ktorý sa opisuje na predchádzajúcom obr. 17. Do týchto kultúr gangliových explantátov sa pridávali látky FK506, rapamycín a WAY1214,466 (každá v koncentrácii 100 nM s 0,1 mg/ml NGF, príp. bez neho). Po 48 hodinách sa kvantifikovalo vyrastanie neuritov a kultúry sa fotografovali.
Obrázok 19: mikrofotografia príkladu 111, dokumentujúca podporu vyrastania neuritov v kultúrach ganglií dorzálnych koreňov miechy kurčiat. Tri časti obrázku demonštrujú vyrastanie neuritov v koncentrácii 1 pM (ľavá časť), 100 pM (stredná časť) a 100 nM (pravá časť) z príkladu 111.
Obrázok 20 zobrazuje mikrofotografíu príkladu 17, dokumentujúcu podporu vyrastania neuritov v kultúrach ganglií zadných koreňov miešnych. Tri časti obrázku demonštrujú vyrastanie neuritov v koncentrácii 1 pM (ľavá časť), 100 pM (stredná časť) a 100 nM (pravá časť) z príkladu 17.
Obrázok 21: mikrofotografia dokumentujúca podporu vyrastania neuritov v kultúrach ganglií zadných koreňov miešnych príkladom 102. Tri časti obrázku demonštrujú vyrastanie neuritov v koncentrácii 1 pM (ľavá časť), 100 pM (stredná časť) a 100 nM (pravá časť) príkladu 102.
Podrobný opis vynálezu
Neurotrofické deriváty kyseliny pipekolovej, opisované v tomto vynáleze, majú afinitu k bielkovinám viažucim FK506, akou je napr. FKBP-12. Pozorovalo sa, že keď sa neurotrofické látky podľa tohoto vynálezu viažu na FKBP, inhibujú prolyl-peptidyl cis-trans izomerázovú aktivitu alebo rotamázovú aktivitu väzobnej bielkoviny a neočakávane podporujú rast neuritov.
Látky podľa predloženého vynálezu možno použiť vo forme solí odvodených od anorganických alebo organických kyselín a zásad. Medzi týmito kyslými soľami môžu byť octan, adipan, alginan, aspartan, benzoan, benzénosulfonan, bisulfát butyran, citran, gáforan, gáforsulfónan, cyklopentanopropionan, diglukonan, dodecylsulfát, etanosulfónan, fumaran, glukoheptanoan, glycerofosfát, hemisulfoheptanoan, hexanoan, hydrochlorid, hydrojodid, 2-hyroxyetanosulfónan, laktan, malean, metanosulfónan, 2-naftalénsulfónan, nikotinan, oxalát, pamoan, pektinan, propionan, sukcinan, tartarát, tiokyanan,
- 11 tosylan, a undekanoan. Medzi bázickými soľami môžu byť amóniové soli, soli alkalických kovov, napr. sodné a draselné soli, soli alkalických zemín, napr. vápenaté a horečnaté soli, soli s organickými zásadami, napr. dicyklohexylamínové soli, N-metyl-Dglukamín, soli s aminokyselinami, napr. s arginínom, lyzínom atď. Okrem toho skupiny, ktoré obsahujú bázický dusík, sa dajú kvartemizovať látkami, ako sú nižšie alkylhalogenidy, napr. metyl, etyl, propyl a butyl chlorid, bromidy a jodidy; dialkylsulfáty ako dimetyl, dietyl, dibutyl a diamyl sulfáty, halogenidy s dlhým reťazcom, napr. decyl, lauryl, myristyl a stearyl chloridy, bromidy a jodidy, aralkylhalogenidy, napr. benzyl a fenetyl bromidy a ďalšie. Takto sa získajú produkty rozpustné alebo dispergovateľné vo vode alebo v oleji.
Neurotrofické zlúčeniny podľa tohoto vynálezu možno pravidelne podávať pacientovi, ktorý sa lieči na neurologické poruchy, alebo pre iné dôvody, v ktorých je potrebné stimulovať neuronálnu regeneráciu a rast, ako napr. pri rôznych periférnych neuropatických a neurologických poruchách, ktoré majú vzťah k neurodegenerácii. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa dajú popri ľuďoch podávať aj iným cicavcom na liečbu rôznych neurologických porúch, aké sa vyskytujú u cicavcov.
Zlúčeniny podľa tohoto vynálezu sú účinnými inhibítormi rotamázovej aktivity a majú vynikajúci stupeň neurotrofickej aktivity. Táto účinnosť sa dá využiť na stimuláciu poškodených neurónov, na podporu neuronálnej regenerácie, na prevenciu neurodegenerácie a pri liečbe niekoľkých neurologických porúch, o ktorých je známe, že sú spojené sneuronálnou degeneráciou a s periférnymi neuropatiami. Neurologické poruchy, ktoré sa dajú liečiť, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené iba na ne, neuralgiu trojklanného nervu, glosofaryngeálnu neuralgiu, Bellovu paralýzu (Belľs Palsy), myasténiu gravis, muskulámu dystrofiu, amyotrofickú laterálnu sklerózu, progresívnu muskulámu atrofiu, progresívnu bulbámu vrodenú muskulámu atrofiu, syndróm prietrže, ruptúry alebo prolapsu medzistavcovej platničky, cervikálnu spondylózu, poruchy plexov, syndrómy porušenia hrudného výstupu (thoracic outlet destruction syndromes), periférne neuropatie, napr. neuropatie, ktoré sú spôsobené olovom, dapsónom, kliešťom (hmyz), porfyriou alebo syndrómom Guillan-Barré, Alzheimerovou chorobou a Parkinsonovou chorobou.
Zlúčeniny podľa súčasného vynálezu sa dajú na tieto účely podávať perorálne, parenterálne, inhalačnými rozprašovačmi, miestne, rektálne, nazálne, bukálne, vaginálne alebo pomocou implantovateľného rezervoára vo farmaceutických prípravkoch
- 12 obsahujúcich bežné netoxické, farmaceutický vhodné nosiče, adjuvanciá alebo vehikulá. Termín parenterálny, ako sa používa tu, zahŕňa podkožné, intraperitoneálne, intratekálne, intraventrikuláme, intrastemálne a intrakraniálne injekčné alebo infuzne techniky.
Aby komplex látky s imunofilínom bol terapeuticky účinný so zameraním na centrálny nervový systém, mal by po periférnom podaní ľahko prenikať cez hematoencefalickú bariéru. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ktoré nemôžu prenikať cez hematoencefalickú bariéru, možno efektívne podávať intraventrikulámou cestou.
Farmaceutické prípravky môžu byť vo forme sterilných injikovateľných preparátov, napr. ako sterilné injikovateľné vodné alebo olejové suspenzie. Tieto suspenzie sa dajú upravovať známymi technikami pomocou vhodných dispergujúcich alebo zmáčavých látok a suspendujúcich látok. Týmito sterilnými injikovateľnými preparátmi môžu byť aj sterilné injikovateľné roztoky alebo suspenzie v netoxických parenterálne prijateľných riedidlách alebo rozpúšťadlách, napr. roztoky v 1,3-bután-diole. Medzi prijateľné vehikulá a rozpúšťadlá, ktoré sa dajú použiť, patrí voda, Ringerov roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Okrem toho ako rozpúšťadlá alebo suspendujúce médiá sa bežne používajú sterilné, stabilizované oleje. Na toto je možné použiť akýkoľvek jemný stabilizovaný olej vrátane syntetických mono- alebo diglyceridov. Pri príprave injikovateľných preparátov nájdu využitie aj mastné kyseliny, napr. kyselina olejová a jej glyceridové deriváty, olivový olej alebo kastorový olej, najmä však ich polyoxyetylované verzie. Tieto olejové roztoky alebo suspenzie môžu obsahovať aj alkoholické rozpúšťadlá alebo disperzíva s dlhým reťazcom.
Zlúčeniny možno podávať perorálne, napríklad vo forme kapsúl alebo tabliet, alebo ako vodné suspenzie alebo roztoky. V prípade tabliet určených na perorálne podávanie sa bežne používajú ako nosiče napr. laktóza alebo kukuričný škrob. Bežne sa používajú aj lubrikanty, napr. stearan horečnatý. Na perorálne podávanie vo forme kapsúl možno medzi vhodnými riedidlami uviesť laktózu a sušený kukuričný škrob. Ak sa na perorálne podávanie vyžadujú vodné suspenzie, aktívna zložka sa kombinuje s emulzifikujúcimi a suspendujúcimi látkami. Ak je potrebné, je možné pridať aj sladidlá, prípadne dochucujúce alebo prifarbujúce látky.
Látky podľa tohto vynálezu je možné podávať aj vo forme čapíkov určených na podávanie liečiv do konečníka. Tieto liekové formy sa dajú pripraviť zmiešaním látky s vhodnou nedráždivou pomocnou látkou (excipientom), ktorá je pri izbovej teplote
- 13 tuhá, ale je tekutá pri teplote konečníka a preto sa v konečníku rozpustí a tak látku uvoľní. Takýmto materiálom je kakaové maslo, včelí vosk a polyetylénglykoly.
Látky podľa tohto vynálezu sa dajú aplikovať aj topicky, najmä ak podmienky vyžadujúce liečbu zasahujú oblasti alebo orgány, ktoré sú ľahko prístupné na miestnu aplikáciu, vrátane neurologických porúch oka, kože, alebo dolného zažívacieho traktu. Vhodné aplikačné formy na miestu aplikáciu sa dajú jednoducho pripraviť pre každú túto oblasť.
Na aplikáciu do oka sa dajú zlúčeniny pripraviť vo forme mikronizovaných suspenzií vizotonickom sterilnom soľnom roztoku s upraveným pH, alebo ešte vhodnejšie ako roztoky v izotonickom soľnom roztoku s upraveným pH s konzervačnou látkou, napr. chloridom benzylalkónia, alebo bez neho. Ako alternatívu na použitie v oftalmológii možno látky upraviť do masti, napr. vo vazelíne.
Na miestnu aplikáciu látok na kožu sa dá pripraviť masť, obsahujúca látku suspendovanú alebo rozpustenú vo vhodnom masťovom základe, napr. zmes s jednou alebo viacerými z týchto látok - minerálny olej, tekutý parafín, biela vazelína, propylénglykol, polyoxyetylén, polyoxypropylénová zlúčenina, emulzifíkačný vosk a voda. Alternatívne, látky možno upravovať do vhodného lócia alebo krému, ktorý obsahuje aktívnu látku suspendovanú alebo rozpustenú napr. v zmesi jednej alebo viacerých z týchto látok - minerálny olej, sorbitan monostearan, polysorban 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylakohol a voda.
Miestnu aplikáciu v dolnej časti zažívacieho traktu možno zaistiť liekovou formou v podobe rektálnych čapíkov (viď vyššie) alebo v liekovej forme vhodnej na podávanie klystírom.
Na liečbu spomenutých stavov sú vhodné dávky v rozsahu od približne 0,1 mg do približne 10.000 mg účinnej látky, pričom odporúčané dávky sú približne 0,1 mg až 1.000 mg. Množstvo účinnej látky, ktoré možno kombinovať s nosičovými materiálmi na získanie jednoduchej aplikačnej formy, sa bude meniť v závislosti od jedinca, ktorý je liečený a od príslušného spôsobu podávania. Je však zrejmé, že špecifická dávka pre akéhokoľvek pacienta bude závisieť od mnohých faktorov, vrátane účinnosti špecifickej látky, ktorá sa podáva, od veku pacienta, jeho telesnej hmotnosti, celkového zdravotného stavu, pohlavia, diéty, času podávania, stupňa exkrécie, kombinácie látok, od stupňa
- 14 príslušného onemocnenia, ktoré sa lieči a od liekovej formy, ktorá sa používa. Látky je možné podávať spolu s inými neurotrofickými látkami, napr. s neurotrofickým rastovým faktorom (NGF), rastovým faktorom izolovaným z glie, ciliámym neurotrofickým faktorom a neurotropínom-3. Dávka iných neurotrofických látok bude závisieť od faktorov, ktoré sa spomínali vyššie a od neurotrofickej účinnosti tejto kombinácie látok.
Metódy a postupy
Rozdrvenie sedacieho nervu
Tento príklad demonštruje vysoké hladiny FKBP v normálnom periférnom nerve a ukazuje, že tieto hladiny sa zvyšujú po rozdrvení nervu.
Ak FKBP boli fyziologicky spojené s predlžovaním výbežkov neurónov pri pôsobení GAP-43, potom by bolo možné očakávať v periférnom nerve zreteľné hladiny FKBP. V zhode s tým sa zistila väzba [3H]FK-506 v sedacom nerve potkana, ako aj v rastových výbežkoch (kónusoch) izolovaných z potkaních mláďat starých 2 dni a porovnala sa jej hladina s hladinami v mozgovej kôre a vo viacerých periférnych tkanivách.
Autorádiografia [3H]FK-506 sa robila spôsobom, ktorý bol opísaný na nefixovaných rezoch. Rezy sa roztopili a vysušili na vzduchu pred predinkubáciou trvajúcou 1 hodinu. Predinkubácia sa robila vtlmivom roztoku obsahujúcom 50 mM HEPESu, 2 mg/ml teľacieho albumínu, 5 % etanolu a 0,02 % TWEENu 20 pri pH 7,4. Rezy sa potom vystavili [3H]FK-506 v koncentrácii 1 nM (86,5 Ci/mmol; DuPont-NEN, Boston, MA) po dobu 1 h pri izbovej teplote v predinkubačnom tlmivom roztoku. Nešpecifická väzba sa definovala pridaním FK-506 v koncentrácii 1 μΜ. Po inkubácii sa rezy premyli 4x5 min v ľadovom predinkubačnom tlmivom roztoku a vysušili sa na vzduchu. Rádioaktívne označené rezy sa potom položili na film so zvýšenou citlivosťou na trícium alebo na krycie sklíčka pokryté emulziou KODAK NTB-2.
- 15 TABUĽKA 1
Väzba [3H]FK-506 na sedací nerv a na rastové výbežky (kónusy) (A) Väzba [3H]FK-506 na sedací nerv
Tkanivo
Bmax (pmol/mg bielkoviny) dospelý potkan sedací nerv 22,1 mozgová kôra 38,0 týmus 9,5 slezina 8,0 novorodený potkan predný mozog 28,5 rastové výbežky (kónusy) 10,3 (B) Väzba [3H]FK-506 po rozdrvení sedacieho nervu
Bmax bielkovina fmol/5mm segment
Bmax pmol/mg neoperované 31,8 ±2,1 21,2 ±1,4 dní po poškodení 136,5 ±15,7* 40,1 ± 2,0*
Väzba [3H]FK-506 bola stanovená spôsobom, opísaným v metódach. V experimentoch uvedených v tabuľke 1A sa experimenty opakovali tri razy s variabilitou menšou ako 10 %. V tabuľke 1B sa hodnoty prezentujú ako priemery so strednými chybami priemerov (n = 3). * p<0.05 pre Študentov t-test prejavy nezávislé.
Zo všetkých tkanív, ktoré sa vyšetrovali, hladiny väzby sú najvyššie v sedacom nerve, kde sú o čosi vyššie ako hladiny v mozgovej kôre a asi lOx vyššie ako hladiny v týmuse a v slezine, ktoré obsahujú FKBP viazané na lymfocyty. Viď tabuľka 1 A.
Dôkaz o úlohe FKBP pri regenerácii nervov vidno v experimentoch, v ktorých sa poškodzoval sedací nerv u dospelých potkanov a u ktorých sa o 7 dní neskôr merala väzba [3H]FK-506 v 5 mm segmente bezprostredne proximálne od miesta poškodenia nervu.
Potkany druhu Sprague-Dawley (175-200 g) sa anestezovali zmesou Rompunu (12mk/kg) a Ketaminu (30mg/kg). Dodržujúc aseptické zásady pomocou hodinárskej pinzety sa rozdrvil tvárový nerv 2x po 30 sekúnd 2 mm distálne od jeho výstupu zo
- 16 stylomastoidového otvoru. Rovnaký postup sa použil na rozdrvenie sedacieho nervu v strede stehna.
Rozdrvenie tvárového nervu
Tento príklad ukazuje, že lézie tvárového nervu zvyšujú súčasnú expresiu FKBP a GAP-43.
Po rozdrvení tvárového nervu sa v jadre tvárového nervu zvyšujú hladiny mRNA pre GAP-43. Pomocou hybridizácie in situ sa vyšetrili hladiny mRNA pre FKBP, GAP43 a kalcineurín po rozdrvení tvárového nervu.
Potkany sa transkardiálne perfundovali ľadovochladným fyziologickým roztokom, ktorého pH bolo stabilizované fosfátovým tlmivým roztokom (PBS) (0,1 M, pH 7,4). Tkanivá sa vyňali sa ihneď zmrazili vtiopentáne (-80 °C). Zo vzoriek sa narezali kryostatické rezy hrubé 18 pm apo roztopení sa fixovali na podložných sklíčkach pokrytých želatínou.
Spôsobom opísaným vyššie sa vykonala hybridizácia in situ, pričom sa použili opačné sondy pre oligonukleotidy označené [35S]dATP. Pre FKBP sa použili tri odlišné oligonukleotidy tvoriace komplement k nasledovným oblastiam klonovanej cNDA, ktoré opísal Maki a spol. (1990) {Proc Natl. Acad. - Sci. USA 87, 5440-5443) a Standaert, R.F. a spol. (1990) {Náture 346, 671-674) a ktoré boli tu zabudované podľa odkazu: 70-114, 214-258, 441-485. Pre GAP-43 sa použili tri zvláštne opačné oligonukleotidy tvoriace komplement k nukleotidom 961-1008, 1081-1128, 1201-1248 klonovanej cDNA, ktorú opísal Rosenthal, A. a spol. (187) {EMBO J. 6, 3641-3646) a tu sa zabudovali podľa odkazu. Pre kalcineurín Aa sa použili opačné oligonukleotidy, komplementárne pre nukleotidy 1363-1410 a 1711-1758, ktoré opísali Ito a spol. (1989) {Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1492-1497) a ktoré sa tu zabudovali podľa odkazu a pre kalcineurín Αβ 1339-1386 a 1569-1616, ktoré opísal Kuno T. a spol. (1989) {Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1352-1358) a ktoré sa tu zabudovali podľa odkazu. Rezy sa rozmrazili a nechali vyschnúť. Potom sa fixovali počas 5 min v 4 % čerstvo depolymerizovaného paraformaldehydu v PBS. Po opakovanom výplachu v PBS sa rezy acetylovali v 0,25 % acetanhydridu v 0,1 M trietanolamíne, 0,5 % NaCl (pH 8,0). Potom sa rezy dehydratovali v roztokoch etanolu so stúpajúcou koncentráciou, lipidy sa odstránili v chloroforme počas 5 min. Rezy sa rehydratovali v 95% etanole a ponechali sa na vzduchu vyschnúť. Hybridizácia sa robila cez noc pri 37 °C v tlmivom roztoku,
- 17 ktorý obsahoval 50 % deionizovaného formamidu, 10 % sulfátu dextranu, 4 x SSC, 1 x Denhardtov roztok, 20 mM fosfátového tlmivého roztoku, 0,1 mg/ml DNA z lososieho mlieča, 0,1 mg/ml transférovej RNA z kvasníc, 10 mM ditiotreitolu, 2,0 % beta merkaptoetanolu (BMD), 1,0 mM EDTA a označenej sondy (2,000.000 dpm/rez). Po hybridizácii sa rezy opláchli v 1 x SSC, 1,0 % BME počas 15 min pri izbovej teplote. Potom sa rezy sušili dvakrát po 10 min pri 55 °C a umiestnili sa na filme, alebo sa namočili do emulzie Kodak NTB-2
Pozorovalo sa výrazné zvýšenie expresie FKBP a GAP-43, zatiaľ čo v expresii kalcineurínu nebolo možné pozorovať žiadne zmeny. Expresia FKBP sa zvyšuje už po 24 hodinách po rozdrvení tvárového nervu, pričom maximálne hladiny sú zreteľné po 1-2 týždňoch, zatiaľ čo koncentrácie mRNA sa podstatne znižujú po 3 týždňoch. Vyšetrenie pri väčšom zväčšení ukázalo, že zvýšená úroveň výskytu zrniek striebra pre FKBP mRNA sa nachádza v telách nervových buniek (obrázok 2). Analýza vypreparovaného jadra tvárového nervu technikou Northern blot potvrdzuje zvýšené hladiny mRNA špecifickej pre FKBP. Hladiny mRNA pre GAP-43 tesne sledujú časový priebeh podobným spôsobom, ako hladiny pre mRNA pre FKBP. Naopak, nedokázali sa žiadne zmeny expresie kalcineurínu v žiadnom zo sledovaných časových intervaloch.
Z jadra tvárového nervu sa izolovala celková bunková RNA. Vzorky celkovej RNA, veľké 10 alebo 20 pg, sa podrobili elektroforéze na 1% agaróze, 2,0% formaldehydovom géle a preniesli sa na nylonovú membránu v 10 nM NaOH. cDNA sondy pre FKBP označené [35]dCTP o špecifickej aktivite 1 x 109 cpm/pg v tlmivom roztoku zloženom z 50 % formamidu, 2 x SSPE, 7 % SDS, 0,5 % Blotto a 100 pg/ml DNA z lososieho mlieča. Bloty sa premývali počas 20 min pri izbovej teplote a 2 x po 15 min pri 65 °C v 0,15 x SSC, 0,15 % SDS a potom sa exponovali na filme počas 48096 hodín.
V porovnaní so kontrolnými rezmi sa na nepoškodenej strane pozorovalo mierne zvýšenie výskytu zŕn striebra. Zhoduje sa to so zistením, že na axotómiu reagujú aj kontralaterálne neuróny.
Po rozdrvení tvárového nervu u potkanov vzniká paralýza tvárového nervu, ktorá sa prejavila vymiznutím pohybov fúzových chlpov. Paralýza vymizla po 3 týždňoch, čo koincidovalo s ukončením regenerácie nervu. Aj u testovaných potkanov sa pozorovalo po rozdrvení tvárového nervu vymiznutie pohybov fúzových chlpov s obnovením funkcie po 3 týždňoch. Časový priebeh zvýšenia expresie GAP-43 a FKBP sa teda zhoduje s priebehom nervovej regenerácie.
- 18 Regenerácia sedacieho nervu
Tento príklad demonštruje súvislosť zmien FKBP a GAP-43 s regeneráciou sedacieho nervu.
Po lézii sedacieho nervu sa zvyšuje hladina mRNA pre GAP-43 v motorických neurónoch v mieche i v neurónoch ganglií zadných koreňov. U potkanov, ktorým sa rozdrvil sedací nerv, sa pozorovalo zreteľné zvýšenie hladín mRNA pre FKBP v motorických neurónoch vo výške L-4 a 5 (obrázok 3) a v neurónoch ganglií zadných koreňoch miechy súčasne s opísaným zvýšením expresie GAP-43 (obrázok 4). Pri väčšom zväčšení sa zistili zrná striebra, ktoré dokumentujú prítomnosť mRNA pre FKM a ktoré boli lokalizované v telách nervových buniek (obrázok 3). Autorádiografiou väzby [3H]FK-506 sa monitorovali hladiny bielkoviny typu FKBP v podmienkach, v ktorých sa ligand viaže selektívne na FKBP (obrázok 4). Zvýšenie FKBP sa pozorovalo v primárnych senzorických neurónoch ganglií zadných koreňov miechy, hoci v motorických nervových bunkách sa po rozdrvení sedacieho nervu nepozorovalo žiadne zvýšenie FKBP.
Selektívnu asociáciu zvýšenej expresie FKBP s regeneráciou podporujú ďalej pokusy s ricínom. Ak sa ricín injikuje do periférneho nervu, transportuje sa späť do tela buniek, ktoré je zničené, bez regenerácie nervu na to nadväzujúcej. Do tvárového nervu sa injikoval ricín (RCA 60, Sigma, St. Louis, MO) v dávke 0.5 pg ricínu. Ricín sa aplikoval na tom istom mieste, na ktorom sa tieto nervy poškodzovali rozdrvením v iných pokusoch a to metódou, ktorú opísali Streit a Kreuzbnerg, v 0,5 μΐ PBS a 0,1 % Fast Green. Streit a spol., (1988) (J. Comp. Neurol. 268,248-263).
Boli urobené lokalizačné analýzy mRNA pre FKBP hybridizáciou in situ o 2, 4 a 7 dní po podám ricínu (obrázok 5). Po podaní ricínu sa nepozorovalo žiadne zvýšenie mRNA pre FKBP. Po podaní ricínu i po rozdrvení nervu sa v obidvoch prípadoch vyskytla glióza. Neschopnosť mRNA pre FKBP zvýšiť sa po podaní ricínu sa zhoduje so selektívnou neuronálnou lokalizáciou mRNA pre FKBP v jadre tvárového nervu.
Transport FKBP v sedacom nerve
Tento príklad demonštruje rýchly transport FKBP v sedacom nerve
Neschopnosť bielkoviny FKBP zvýšiť sa v motorických neurónoch po rozdrvení sedacieho nervu napriek zvýšeniu mRNA pre FKBP poukazuje na to, že táto bielkovina
- 19 sa rýchlo transportuje z tela buniek do nervových výbežkov. Nález sa zhoduje s predchádzajúcimi pozorovaniami, že mRNA pre FKBP sa koncentruje v granulámych bunkách mozočka, ktoré obsahujú nízku hladinu bielkoviny FKBP, zatiaľ čo hladiny bielkoviny FKBP v molekulárnej vrstve mozočka v spojení s paralelnými vláknami pochádzajúcimi z granulámych buniek sú vysoko koncentrované. Pri analýze predpokladaného transportu FKBP bol rozdrvený sedací nerv a o 7 dní neskôr boli naložené ligatúry 10 a 20 mm proximálne nad miestom rozdrvenia. O šesť hodín po podviazaní sa monitorovala väzba [3H]FK-506 v troj-milimetrových segmentoch v oblasti medzi týmito dvoma ligatúrami (obrázok 6).
Pri štúdiu transportu v axónoch bola použitá klasická podväzová technika, ktorú opísal Tetzlaff a spol. O týždeň po rozdrvení sedacieho nervu sa na nerv naložili dva zberné podväzy (niť č. 510) približne 10 mm od seba, pričom distálny podväz bol umiestnený 10 mm proximálne od miesta pôvodného rozdrvenia. O 6 hodín neskôr sa z oblasti nervu proximálne od podväzov, medzi nimi, i distálne od nich vypreparovali 5-3 mm segmenty tak, ako sa to demonštruje na obrázku 5. Na stanovenie väzby [3H]FK-506 sa segmenty nervu pripravili homogenizáciou v 10 objemoch 50mM TrisHC1 s pH 7,4. Homogenáty sa centrifugovali pri 15.000 x g po 20 min pri 4 °C, použili sa supematanty a v nich sa stanovila koncentrácia celkových bielkovín stanovením väzby farbiva Coomassie modrá (Pearce). Väzba [3H]FK-506 sa stanovila spôsobom, ktorý je opísaný vyššie (4) a to v alikvotoch obsahujúcich 2 pg celkovej rozpustnej bielkoviny v konečnom objeme 0,4 ml analytického tlmivého roztoku,, ktorý obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mg/ml albumínu z hovädzieho séra, 250 pM [3H]FK-506 a rôzne koncentrácie neoznačeného FK-506. Po inkubácii pri teplote 25 °C počas 60 min sa 0,35 ml tejto tekutiny nalialo na 0,8ml stĺpec Sephadexu LH-20 (Pharmacia LKB) a stĺpec sa premyl 0,4 ml analytického tlmivého roztoku. Eluáty sa zozbierali a odčítali sa na scintilačnom počítači.
Výsledky sú na obrázku 5. Hladiny väzby [3H]FK-506 sú najvyššie v segmente, ktorý je práve proximálne od ligatúry 20 mm od miesta rozdrvenia, pričom sú skoro štvornásobne vyššie ako sú v iných segmentoch. Vychádzajúc v hladín väzby [3H]FK506 v segmentoch A-D sa vypočítala rýchlosť anterográdneho transportu FKBP. Táto rýchlosť, 240 mm za deň, je v podstate rovnaká ako rýchlosť transportu GAP-43, ktorá predstavuje najvyššiu rýchlosť transportu neuronálnych bielkovín.
- 20 Na vizualizáciu hromadenia FKBP po rozdrvení nervu bola nasadená voľná ligatúra na označenie miesta rozdrvenia sedacieho nervu a urobila sa hybridizácia mRNA pre FKBP in situ ako aj autorádiografia väzby [3H]FK-506 (obrázok 7). Väčšina mRNA pre FKBP a väzby [3H]FK-506 bola bezprostredne proximálne nad miestom rozdrvenia. Tieto hladiny sú podstatne vyššie ako v kontrolnom nerozdrvenom sedacom nerve. Vyšetrenie autorádiografických preparátov s hybridizáciou in situ demonštrovali zrná striebra viazané na neuronálne vlákna. Vyskytli sa aj zrná striebra lokalizované v bunkách, ktorých indentitu sa nedala spoľahlivo stanoviť. Mohlo sa jednať o Schwannove bunky, o makrofágy alebo fibroblasty.
FKBP v bunkách PC-12
Tento príklad ukazuje, že bunky PC-12 obsahujú FKBP a že hladiny FKBP sa zvyšujú pôsobením nervového rastového faktora. Sledovaním väzby [3H]FK-506 na bunky PC-12 za základných podmienok i po pôsobení nervového rastového faktora (NGF) sa vyšetrovala prítomnosť FKBP v týchto bunkách.
Hladiny FKBP v bunkách PC-12 sa získali Scatchardovou analýzou kriviek väzby [3H]FK-506. Kultúry buniek sa zoškrabali z kultivačných jamiek a homogenizovali sa v 10 objemoch 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 100 pg/ml fenylmetylsulfonylfluoridu a centrifugovali sa pri 40.000 x g po 20 min pri 4 °C. Bielkovina sa stanovila analýzou väzby farbiva Commassie modrej, pričom ako štandard sa použil albumín z hovädzieho séra. Stanovila sa aj väzba 250 pM [3H]dihydroFK-506 (86,5 Ci/mmol, DuPont/NEN) vo vzorkách obsahujúcich 5 pg rozpustnej bielkoviny v analytickom tlmivom roztoku o konečnom objeme 0,4 ml, ktorý obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mg/ml BSA (hovädzí sérový albumín) a rôzne koncentrácie neoznačeného FK506. Po 60 min inkubácie pri 25 °C sa 0,35 ml tejto tekutiny nalialo na 0,8 ml stĺpec Sephadexu LH-20 (Pharmacia LKB), ktorý sa predtým ekvilibroval s analytickým tlmivým roztokom. Stĺpec sa potom premyl 0,4 ml analytického tlmivého roztoku, eluáty sa zozbierali, zmiešali sa s Formulou 963 (DuPont/NEN) a počítali sa v Beckmanovom scintilačnom počítači. Špecifická väzba sa stanovila odčítaním väzby získanej za prítomnosti 1 μΜ neoznačeného FK506 od celkovej väzby [3H]FK-506.
Výsledky sú na obrázku 8. [3H]FK-506 sa saturovateľne viaže na kontrolné homogenáty buniek PC-12. V typických experimentoch sa viaže asi 1.000 cpm, zatiaľ čo nešpecifická väzba za prítomnosti 1 μΜ FK506 je asi 150 cpm. Päťdesiatpercentná
- 21 inhibícia väzby [3H]FK-506 sa vyskytuje pri 1-2 nM FK506. Poukazuje to na to, že väzobné miesta zodpovedajú autentickému FKBP. Väzba [3H]FK-506 sa výrazne zvyšuje po pôsobení NGF. Signifikantné vzostupy sú zreteľné po 10 - 15 hodinách. Väzba sa strojnásobňuje po 20 h a ďalší mierny vzostup badať po 100 hodinách.
Nárast predĺženia neuritov v bunkách PC12
Tento príklad demonštruje, že FK506 a rapamycín zväčšujú predlžovanie neuritov v bunkách PC-12.
Bunky PC-12 sa udržovali pri 37 °C, 5 % CO2 vDulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM), doplnenom 10 % konského séra inaktivovaného teplom a 5 % fetálneho hovädzieho séra inaktivovaného teplom. Na diferenciáciu v NGF sa bunky očkovali pri 1 x 105 v 35mm kultivačných jamkách pokrytých kolagénom z myších chvostov pri 5 pg/cm2 a potom sa ponechali, aby sa prichytili skôr, ako sa médium vymenilo za DMEM doplnený 2 % fetálneho konského séra, NGF, prípadne FK 506 alebo rapamycínom. Na kvantifikáciu vyrastania neuritov sa vyhotovili náhodne fotografie (3-4 na jamku), na ktorých sa spočítali neuróny, ktoré mali výrastky dlhšie ako 5 pm. Fotograf, ani pracovník, ktorý zratúval bunky, nepoznal experimentálne podmienky. Pre každý údaj sa urobili dvojmo štyri zvláštne experimenty. Identifikovali a spočítali sa neurity v približne 100 bunkách na každej fotografii. Celkove sa teda hodnotilo 1200 - 1600 buniek na každý údaj.
Ako sa zistilo, NGF účinne dráždi vyrastanie neuritov, pričom stredná účinná koncentrácia je 1 ng/ml. Maximálna stimulácia sa vyskytuje približne pri koncentrácii 5-100 ng/ml (obr. 9 a 10). FK506 (100 nM) zreteľne zvyšuje účinok NGF zvýšením citlivosti k NGF. FK.506 teda 20 - 50násobne zmenšuje koncentráciu, ktorá je potrebná na maximálne vyrastanie. Polovičný účinok NGF za neprítomnosti FK506 sa vyskytuje pri 5 ng/ml a za prítomnosti FK506 pri koncentrácii 0,1 ng/ml NGF. Pri maximálnej koncentrácii NGF (10 -100 ng/ml), FK506 už ďalšie vyrastanie neuritov nespôsobuje.
Neurotrofické účinky FK506 sú mimoriadne výrazné. Za prítomnosti submaximálnej koncentrácie HGF (1 ng/ml) FK506 v koncentrácii 1 nM spôsobuje rovnaké maximálne vyrastanie, aké sa pozorovalo pri 50 ng/ml NGF (obr. 11). Polovičný účinok FK506 sa vyskytuje približne v koncentrácii 100 pM. Za neprítomnosti NGF stráca FK.506 schopnosť spôsobiť vyrastanie neuritov (obr. 10).
- 22 Rapamycín je účinné imunosupresívum, o ktorom sa nepredpokladá, že by účinkoval prostredníctvom kalcineurínu. Môže však ovplyvniť iné fosforylačné kaskády. Rapamycín účinne inhibuje účinky FK506, ktoré sa vyskytujú prostredníctvom FKBP ako aj kalcineurín, pravdepodobne pôsobením ako antagonista FK506 na FKBP. Rapamycín (1 μΜ) nie je schopný inhibovať neurotrofické účinky FK506. Naproti tomu rapamycín sám je neurotrofická látka, ktorá stimuluje väčšie vyrastanie neuritov pri koncentrácii 1 nM. Zdá sa, že rapamycín a FK506 účinkujú rôznymi mechanizmami.
r
Rapamycín teda zvyšuje počet výbežkov ako aj ich dĺžku, zatiaľ čo FK5906 prednostne zvyšuje dĺžku neuritov. Okrem toho sa zdá, že účinky FK506 a rapamycínu sú aditívne.
Gangliá zadných koreňov miechy
Tento príklad ukazuje, že FK506 je v senzorických gangliách neurotrofickou látkou. Vyšetrované bolo pôsobenie FK506 na primáme kultúry ganglia zadných koreňov miechy izolovaných z potkanov v 16. dni embryonálneho života.
Z gravidných potkanov Sprague-Dawley sa vyňali embryá v stave E16 a vypreparovali sa gangliá zadných koreňov. Explantáty celých ganglií sa kultivovali v miskách (35 mm, Falcon) pokrytých kolagénom v médiu N2 (zmes Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média a média F12 v pomere 1:1 doplneného progesterónom, selénom, inzulínom, putrescínom, glukózou a penicilínom-streptomycínom) pri 37 °C v prostredí s 15% CO2. Senzorické gangliá sa vystavili NGF, bez alebo s FK506, alebo rapamycínu, alebo protilátke proti NGF v rôznych koncentráciách. Gangliá sa pozorovali každé 2-3 dni pomocou invertovaného mikroskopu Olympus IMT-2 s fázovým kontrastom a merala sa dĺžka axónov. Pole axónov každého ganglia sa rozdelilo do štyroch kvadrantov, pričom sa pomocou okulárového mikrometra merala dĺžka najdlhších axónov v mikrónoch. Priemer vypočítaný z týchto meraní sa pokladal za dĺžku axónov v danom gangliu.
Na autorádiografiu [3H]FK506 sa pestovali kultúry ganglií koreňov na komorových sklíčkach pokrytých kolagénom (5 pg/cm2). Kultúry sa fixovali na sklíčku ľadovo chladným 4,0% čerstvo depolymerizovaným paraformaldehydom v 0,1 M sodnofosfátovom tlmivom roztoku s pH 7,4 počas 1 h, potom sa po dva razy premývali vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom. Fixované kultúry sa označili [3H]FK506 predinkubáciou sklíčok v nárazníkovom roztoku zloženom z 50 mM Hepesu, 2 mg/ml albumínu z hovädzieho séra, 0,02% Tweenu-20 o pH 7,4. Po tejto predinkubácii
- 23 nasledovala inkubácia vtom istom analytickom tlmivom roztoku obsahujúcom 1 nM [3H]FK506. Nešpecifická väzba sa stanovila pridaním 1 μΜ neoznačeného FK506. Sklíčka sa potom pred sušením prepláchli 4x5 min a uložili sa na film senzitivovaný na trícium na dobu 10 dní.
Autorádiografia väzobných miest pre [3H]FK506 v týchto gangliách ukázala významné hladiny zŕn striebra viazaných na FKBP (obr. 12). Za prítomnosti 1 μΜ neoznačeného FK506 autorádiografické zrnká sa nedali pozorovať, čo poukazuje na špecifickú väzby. Ako sa spomínalo už predtým, NGF (100 ng/ml) zreteľne zvyšuje počet a dĺžku výbežkov vgangliu (obr. 13). FK506 (1 μΜ) samotný má podobný neurotrofický účinok, pričom už 1 nM FK506 spôsobuje pozorovateľný vzostup dĺžky. Rapamycín (1 μΜ), ktorý pôsobí ako antagonista FK506, celkom inhibuje tento účinok FK506 (1 μΜ). Účinok FK506 má teda znaky špecificity charakteristickej pre FKBP.
Zatiaľ čo FK506 za neprítomnosti exogénneho NGF nestimuluje vyrastanie neuritov v bunkách typu PC-12, FK506 samotný v senzorickom gangliu má neurotrofický účinok. Schwannove bunky v gangliách môžu produkovať NGF a táto tvorba NGF v Schwannových bunkách sa reguluje fosforyláciou bielkovín. Aby sa zistilo, či účinok látky FK506 samotnej zahŕňa potenciáciu endogénneho NGF, analyzoval sa vplyv protilátok proti NGF (obr. 13). Protilátka proti NGF zreteľne znižovala neurotrofické účinky FK506 (1 μΜ). Protilátka proti NGF neúčinkuje toxickým spôsobom, pretože v bunkách vystavených tejto protilátke či už za prítomnosti, alebo za neprítomnosti exogénneho NGF sa nepozorovali žiadne morfologické príznaky toxicity.
Látka FK506 je mimoriadne účinná na stimuláciu vyrastania neuritov. Už v koncentrácii 1 pM spôsobuje FK506 detegovateľné zvýšenie vyrastania. Progresívne vyšší rast sa vyskytuje pri 0,1 a 10 nM FK506 (údaje sa neprezentujú), zatiaľ čo maximálny rast vyžaduje 1 μΜ FK506.
Časový priebeh vyrastania neuritov je podobný vo všetkých koncentráciách NGF a FK506. Určité vyrastanie možno pozorovať už v 1. dni. V 5.-6. dni možno pozorovať už spomaľovanie rastu
Neurotrofické účinky látky FK 506 v senzorickom gangliu zahŕňajú FKBP (bielkovina, ktorá viaže FK506), keďže účinky FK506 sa revertujú v nízkych koncentráciách rapamycínu, známeho antagonistu väzby FK506 na FKBP. Neschopnosť rapamycínu inhibovať pôsobenie FK506 v bunkách PC-12 odráža pravdepodobne
- 24 zvláštne stimulačné účinky rapamycínu. Mechanizmy stimulácie vyrastanie neuritov rapamycínom v bunkách PC-12 nie sú zatiaľ známe. Predpokladá sa, že jeho imunosupresívne účinky sú spôsobené inými mechanizmami ako účinky FK506. Rapamycín môže inhibovať kinázu S6, ktorá fosforyluje S6 ribozomálnu podjednotku. Rapamycín inhibuje okrem toho aj fosfatidylinozito 1-3-kinázu.
Na vyrastaní výbežkov počas regenerácie neurónov sa implikovala fosforylácia sprostredkovaná proteínkinázou C (PKC). Iný dôkaz poukazuje i na inhibičné účinky PKC v predlžovaní neuronálnych výbežkov.
GAP43 je významný substrát pre kalcineurín, ktorý sa vneuritoch nachádza vo vysokej koncentrácii a ktorý sa reguluje FKBP. GAP43 sa nezapája priamo do predlžovania neuritov, pretože v líniách buniek PC-12 s nízkymi hladinami GAP43 sa pozorovalo normálne vyrastanie neuritov. Avšak GAP43 a jeho fosforylácia sa môže zúčastňovať na usmerňovaní rastu neuritov (targeting), keďže hladiny fosforylovaného GAP43 sa zvyšujú, keď neurity dosiahnu svoj cieľ. Fosforylácia GAP-43 môže ovplyvňovať aj mobilizáciu Ca2+, ktorý reguluje predlžovanie neuritov. Fosforylovaný GAP-43 inhibuje tvorbu fosfatidylinozitol bis-fosfátu, ktorá by mala znižovať hladinu inozitol 1,4,5-trifosfátu a s tým spojené uvoľňovanie Ca2+. Fosforylácia GAP-43 znižuje okrem toho jeho afinitu ku kalmodulínu, čoho výsledkom je zvýšenie voľného kalmodulínu dostupného na väzbu s Ca2+.
Okrem ovplyvnenia kalcineurínu môžu imunofilíny pôsobiť aj na miestach, ktoré ovplyvňujú Ca2+, regulujúce vyrastanie neuritov. FKBP sa viaže na ryanodínový receptor, čo je kanál prepúšťajúci Ca2+. V sarkoplazmatickom retikule kostrového svalu FK506 disociuje FKBP z ryanodínového receptora a tak facilituje mechanizmus uvoľnenia Ca2+ vyvolaného Ca2+. Okrem toho FK506 pôsobí aj na iných miestach, vrátane receptorov FKBP25 pre steroidy, ako aj na iných neidentifikovaných väzobných miestach, napr. na miestach, ktoré majú vzťah ku FKBP13. V predlžovaní neuritov teda môžu hrať úlohu aj iné potenciálne mechanizmy.
Neimunosupresívne a imunosupresívne ligandy imunofilínov stimulujú vyrastanie neuritov v bunkách PC-12
V tejto štúdii boli podrobne študované vplyvy rôznych ligandov imunofilínov na predlžovanie neuritov v bunkách typu PC-12 a vintaktných senzorických gangliách
- 25 sliepok. Zistilo sa, že neimunosupresívne, ako aj imunosupresívne Ugandy sú veľmi účinné pri potenciácii vyrastania neuritov v bunkách PC-12 i v senzorických gangliách.
V predchádzajúcej štúdii sa zistilo, že imunosupresíva stimulujú vyrastanie neuritov v bunkách PC-12 zvýšením účinnosti nervového rastového faktora (NGF) asi desaťnásobne (Lyons a spol., 1994). Bez prítomnosti exogénneho NGF sa nepozorovali žiadne neurotrofické účinky. V tejto štúdii sa posudzovali účinky imunosupresívnych látok FK506 a rapamycínu na vyrastanie neuritov v bunkách PC-12 za prítomnosti 0,1 -100 mg/ml NGF.
Bez pridania exogénneho NGF žiadna z uvedených látok nestimulovala vyrastanie neuritov. NGF sám v koncentrácii 0,1 ng/ml spôsoboval malé zvýšenie predĺženia neuritov, dosahujúce iba asi 15 % maximálneho účinku, aké sa vyskytovalo pri 50 ng/ml (obr. 14). Rapamycín stimuluje vyrastanie neuritov vo väčšom rozsahu ako iné látky a to až 3-násobnú stimuláciu pri 0,1 - 0,5 ng/ml NGF. Rozsah zvýšenia spôsobeného rapamycínom sa znižuje pri vyššej koncentrácii NGF a nie je štatisticky významný pri 5 ng/ml NGF. Aj FK506 je látkou s neurotrofíckým pôsobením, pričom naj zreteľnej ši účinok má pri nízkych koncentráciách NGF. Maximálne, 2,5 násobné zvýšenie vyrastania neuritov, bolo možné pozorovať pri 0,5 ng/ml NGF.
Existujú tri základné štrukturálne skupiny imunosupresívnych látok, ktoré sú odvodené od štruktúry cyklosporínu A, FK506 a rapamycínu. Hoci FK506 a cyklosporín A sa viažu na rôzne imunofilínové bielkoviny, obidve tieto látky pôsobia ako imunosupresíva inhibíciou kalcineurínu. Rapamycín sa viaže s vysokou afinitou na FKBP-12, komplex látka-imunofilín sa však neviaže na kalcineurín. Namiesto toho sú imunosupresívne účinky podmienené väzbou komplexu rapamycínu a FKBP-12 na nedávno identifikovanú a klonovanú bielkovinu, označovanú ako RAFT-1 (väzobné miesto pre rapamycín a FK506), označovaný aj ako FRAP (Sabatini a Snyder, 1994; Brown a spol. 1994; Chen a spol., 1994). Pretože rapamycín sa intenzívne viaže na FKBP-12 avšak neinhibuje kalcineurín, môže slúžiť ako antagonista FK506. Existujú aj neimunosupresívne deriváty rapamycínu. Jeden z nich, WAY-124,466, ktorý je triénovým derivátom rapamycínu, sa s vysokou afinitou viaže na FKBP-12 a inhibuje rotamázovú aktivitu. Nemá však žiadne imunosupresívne účinky. Cyklosporín A je veľký cyklický undekapeptid. Púha adícia metylovej skupiny na alanín v pozícii 6 spôsobuje, že výsledná látka neinhibuje kalcineurín a že stráca imunosupresívne účinky,
- 26 hoci inhibuje rotamázovú aktivitu cyklosporínu v podobnom rozsahu ako cyklosporín A (Me CsA ref).
Aby sa zistilo, či pri neurotrofickom pôsobení je potrebná imunosupresívna aktivita, na bunkách typu PC-12 sa porovnali neurotrofické účinky FK506, rapamycínu a cyklosporínu A s účinkami neimunosupresívnej látky WAY-124,466 v širokom rozpätí koncentrácií (obr. 15, 16). Všetky štúdie sa vykonali za prítomnosti 0,5 ng/ml NGF. Ako sa pozorovalo predtým, FK506 veľmi účinne stimuluje predlžovanie neuritov s polovičnou stimuláciou pri 0,5 nM a s maximálnym účinkom pri 5 -100 nM.
Rapamycin je najúčinnejšou látkou aká bola testovaná a ktorá spôsobuje najväčší maximálny stupeň predlžovania neuritov vôbec. V opakovaných pokusoch sa 50 % maximálneho predĺženia vyskytuje približne v 0,2 - 0,4 nM, maximálne účinky sú zreteľné približne pri koncentrácii 10 - 100 nM. Maximálne predĺženie neuritov spôsobené rapamycínom je porovnateľné s maximálnymi účinkami vyskytujúcimi sa pri 50 ng/ml NGF. Aj látka WAY-124,466 má neurotrofické účinky, je však menej účinná a spôsobuje menší maximálny účinok ako rapamycin. Polovičný účinok sa u látky WAY124,466 vyskytuje približne pri 10 nM a maximálne účinky sa vyskytujú pri 100 - 1.000 nM. Rapamycin je teda asi lOOx účinnejší ako látka WAY-124,466, čo pripomína jeho 40 násobne vyššiu účinnosť vo väzbe na FKBL-12 (tabuľka II).
Cyklosporín A je pri stimulácii vyrastanie neuritov podstatne menej účinný ako FK506 alebo rapamycin. Zodpovedá to jeho podstatne menšej účinnosti v inhibovaní rotamázovej aktivity. Päťdesiat percent maximálnej stimulácie vyrastania neuritov spôsobenej cyklosporínom A sa vyskytuje pri 50 nM s maximálnym účinkom pri 100 nM a so zmenšením vyrastania neuritov pri vyšších koncentráciách cyklosporínu A. Maximálna stimulácia s cyklosporínom A dosahuje asi 60 % účinkov pozorovaných pri 50 ng/ml NGF.
U rôznych imunofilínových ligandov a NGF sa vyskytuje podobný všeobecný obraz predlžovania výbežkov. NGF v koncentráciách, ktoré dosahujú 50 % maximálnych účinkov (1-5 ng/ml), 40 až 50 % buniek vysiela výbežky, ktoré sú aspoň také dlhé, ako je telo bunky, zatiaľ čo 15 % vysiela výbežky až 3 - 5x dlhšie ako je dĺžka tela buniek. U rôznych látok, ktoré sa testovali, je tento obraz veľmi podobný. Rapamycin a WAY124,466 majú tendenciu vyvolať väčší počet výbežkov na bunku ako FK.506. Vzhľadom na počet výbežkov má cyklosporín A tendenciu byť medzi týmito dvoma skupinami.
- 27 Predlžovanie nervu vyvolané v kuracom gangliu zadných koreňov neimunosupresívnymi a imunosupresívnymi ligandami imunofilínov
V predchádzajúcej štúdii boli pozorované neurotrofické účinky imunospresívncyh látok u explantátov z potkaních ganglií zadných koreňov miechy s významnou stimuláciou vyrastania nervov, ktoré sa pozorovalo u FK506 už v 1 pikomolámej koncentrácii (Lyons a spol., 1994). V potkaních gangliách sa neurotrofícké účinky FK506 pozorovali dokonca i za neprítomnosti NGF. V tejto štúdii sa použili explantáty kuracích ganglií zadných koreňov, ktoré možno v štúdiách predlžovania nervov ľahšie použiť. Za neprítomnosti exogénneho NGF boli pozorované minimálne účinky látok, ktoré sa viažu na imunofilíny. Kuracie bunky sú na NGF citlivejšie ako bunky PC-12, takže na dosiahnutie minimálneho vyrastania neuritov a na demonštrovanie neurotrofických účinkov imunofilínových ligandov sa použil NGF v koncentrácii 0,1 ng/ml (obr. 17,18).
Gangliá zadných koreňov miešnych sa vypreparovali z kuracích embryí na 10. deň gestácie. Explantáty celých ganglií sa kultivovali na kultivačných platničkách s jamkami pokrytými tenkou vrstvou Matrigelu-12 v Leibovitzovom médiu L15 s vysokým obsahom glukózy, doplnenom 2 mM glutamínom a 10 % hovädzieho fetálneho séra, ktoré obsahovalo aj 10 μΜ cytozínu β-D arabinofuranozidu (Ara C) pri 37 °C v prostredí s 5% CO2. O 24 hod neskôr sa gangliá zadných koreňov vystavili nervovému rastovému faktoru v rôznych koncentráciách, imunofilínovým ligandom, alebo kombinácii NGF s látkami. Štyridsaťosem hodín po aplikácii látok sa gangliá pozorovali vo fázovom kontraste alebo v Hoffmanovom modulačnom kontraste pomocou Zeissovho invertovaného mikroskopu Axiovert. Vyhotovili sa mikrofotografíe explantátov a kvantifikovalo sa vyrastanie neuritov. Neurity dlhšie ako priemer ganglia zadných koreňov sa počítali ako pozitívne, pričom sa rátal celkový počet neuritov pre každú experimentálnu podmienku zvlášť. V každej jamke sa kultivovali tri až štyri gangliá a každá procedúra sa robila v duplikáte.
Pri vyrastaní nervových výbežkov relatívne účinnosti rôznych imunofilínových ligandov pripomínajú ich relatívne účinnosti zistené v bunkách PC-12. Rapamycín je teda najúčinnejšia látka s EC50 rovnajúcou sa 1 nM, pričom je 10-násobne účinnejší ako WAY-124,466, zatiaľ čo u látky FK506 je EC50 1-2 nM.
Maximálne zvýšenie počtu výbežkov, ich dĺžka a rozvetvenie sa celkom podobá zmenám pozorovaným pri maximálne účinných koncentráciách imunofilínových
- 28 ligandov a NGF (100 ng/ml). Pri progresívne sa zvyšujúcich koncentráciách rôznych látok možno pozorovať väčší počet výbežkov, ich rozsiahlejšie vetvenie a väčšiu dĺžku jednotlivých výbežkov.
Sledovaním inhibície väzby 3H-FK506 na rekombinantnú FKBP-12 sa vyhodnocovala účinnosť látok pri ich väzbe na FKBP-12. Vyskytuje sa tu nápadná paralela medzi afinitami látok ku FKBP-12 a ich účinnosťou pri stimulácii vyrastania neuritov a inhibíciou rotamázovej aktivity. Je teda zrejmé, že vyrastanie neuritov nemá vzťah k inhibícii kalcineurínu. Inhibícia kalcineurínu sa dobre zhoduje s imunosupresívnymi účinkami. Látka WAY-124,466 nie je imunosupresívum a nie je schopná inhibovať kalcineurín. Rapamycín je účinné imunosupresívum, avšak komplex rapamycín-FKBP-12 sa viaže na RAFT-1 a tak iniciuje imunosupresívne procesy (Sabatini a Snyder, 1994; Snyder a Sabatini, 1995). Výsledky sa uvádzajú v tabuľke 2.
Tabuľka 2
NEUROTROFIZMUS IMUNOFILÍNOVÝCH LIGANDOV KORELUJE S INHIBÍCIOU ROTAMÁZY, NIE VŠAK S INHIBÍCIOU KALCINEURÍNU
Látka [3H]-506- FKBP12(ICsn) Inhibícia kalcineurínu Rotamáza (K,) Vyrastanie neuritov ÍEM
FK506 0,6 nM áno 0,4 nM 0,5 nM
Rapamycín 0,5 nM žiadna 0,2 nM 0,5 nM
WAY-124466 10,0 nM žiadna 12.0 nM 10 nM
Cyklosporín A (CsA) žiadna áno 20 nM 50 nM
Bola porovnávaná schopnosť neimunosupresívnych imunofilínových ligandov podporovať vyrastanie neuritov v kultúrach explantátov zganglií zadných koreňov miechy kurčiat (tabuľka 3). Žiadna z týchto látok nie je schopná inhibovať kalcineurín. Tieto látky však interagujú s imunofilínom FKBP-12 a inhibujú jeho rotamázovú aktivitu s rôznymi inhibičnými konštantami, ktoré sa uvádzajú v tabuľke 3. Schopnosť
- 29 týchto látok podporovať vyrastanie neuritov vgangliách zadných koreňov sa dobre zhoduje s ich schopnosťou inhibovať rotamázovú účinnosť FKBP-12.
Tabuľka 3
NEUROTROFIZMUS IMUNOFILÍNOVÝCH LIGANDOV KORELUJE S INHIBÍCIOU ROTAMÁZY, ALE NIE S INHIBÍCIOU KALCINEURÍNU
Látka [3H]-FK506- FKBP12 ŕlC™) Inhibícia kalcineurínu Rotamáza O Vyrastanie neuritov ÍEM
Príklad 12 8 μΜ žiadna 250 nM 300 nM
Príklad 13 4 μΜ žiadna 25 nM 80 nM
Veľmi úzka súvislosť medzi účinnosťou látok pri väzbe na imunofilíny, inhibíciou ich rotamázovej aktivity a stimuláciou vyrastanie neuritov napovedá, že za neurotrofické účinky týchto látok je zodpovedná inhibícia rotamázovej účinnosti. Mimoriadne vysoká účinnosť látok pri stimulácii vyrastania neuritov a pri väzbe na imunofilíny robí vysoko nepravdepodobným, že by za tieto neurotrofické účinky mohla byť zodpovedná akákoľvek iná cieľová štruktúra. Je zrejmé, že biologická aktivita imunofilínov iných ako rotamáza by mohla byť ovplyvnená látkami sprostredkujúcimi neurotrofické účinky. Avšak o žiadnej takejto účinnosti nie sú zatiaľ dostupné žiadne správy.
Pre mimoriadne veľkú účinnosť látok a úzku súvislosť medzi inhibíciou rotamázovej aktivity a neurotrofickými účinkami sa prijíma záver, že inhibícia rotamázy sa pravdepodobne zúčastňuje na neurotrofických účinkoch. Zistilo sa, že viaceré bielkoviny, vrátane kolagénu (Steinman a spol., 1991) a transferínu (Lodish a King, 1991), sú substrátmi pre rotamázovú aktivitu imunofilínov. Nedávno sa u veľmi čistých preparátov ryanodínového receptora a receptora pre IP-3, významného vnútrobunkového vápnikového kanála zistilo, že existujú v komplexe sFKBP-12. Disociácia FKBP-12 z týchto komplexov spôsobuje, že tento vápnikový kanál sa stáva „leaky“, priepustný (Cameron a spol., 1995). Na predlžovaní neuritov sa zúčastňujú aj toky vápnika, takže receptor pre IP-3 a ryanodínový receptor by sa mohli zúčastňovať na neutrofickom účinku látok. Keďže tieto látky sa viažu na to isté miesto na FKBP-12 ako na receptore pre IP-3 alebo na ryanodínovom receptore, dalo by sa predpokladať, že látky z FKBP-12 tieto kanály vytesňujú. Medzi týmito vápnikovými kanálmi a cyklofilínom sa zatiaľ
- 30 nezistila žiadna interakcia, takže tento model nemôže nevysvetľovať neurotrofické účinky cyklosporínu A.
Neurotrofické účinky látok, ktoré sa tu študovali, sa vyskytujú pri ich mimoriadne nízkych koncentráciách, čo poukazuje na účinnosť, ktorú možno porovnať s účinnosťou neurotrofických bielkovín, napr. s účinnosťou rastového faktora pochádzajúceho z mozgu, neurotropínu-3 a nervového rastového faktora.
Nasledujúce príklady demonštrujú odporúčané predmety vynálezu a v žiadnom prípade nie sú myslené ako obmedzujúce tento vynález. Všetky molekulové hmotnosti polymérov udávajú priemerné molekulové hmotnosti. Všetky percentuálne údaje sa vzťahujú na percento hmotnosti konečného pripraveného aplikačného systému alebo farmaceutickej formy, iba ak by sa uviedlo inak a všetky súčty sa rovnajú 100 % hmotnostným.
Príklady uskutočnenia
Príklady zlúčenín derivátov kyseliny pipekolovej, ktoré sa dajú použiť na účely podľa tohoto vynálezu pozostávajú z nasledujúcich príkladov.
PRÍKLAD 1
WAY-124,466
- 31 Túto typickú zlúčeninu odvodenú od kyseliny pipekolovej zverejnil Ocain a spol. v Biochemical and Biophysical Research Communication, vol. 192, č.3, 1993. Zlúčeninu syntetizoval vo Wyeth-Ayerst Dr. Phil Hughes reakciou 4-fenyl-l,2,4-triazolín-3,5diónu s rapamycínom.
PRÍKLAD 2
RAP-Pa
Túto zlúčeninu odvodenú od kyseliny pipekolovej zverejnil Chakraborty a spol. v Chemistry andBiology, v marci 1995,2:157-161.
PRÍKLADY 3 až 5
Typické zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej zverejnil Ikeda a spol. v J. Am Chem. Soc. 1994,116,4143-4144 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
- 32 PRÍKLADY 6-9
Typické zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej zverejnil Wang a spol. v Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 9, str. 1161-1166, 1994, najmä zlúčeniny 2a-2d a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLAD 10
MeO OMe
Tento typický derivát kyseliny pipekolovej, zlúčeninu 10, zverejnil Birkenshaw á spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č.21, str. 2501-2506,1994 a je sem zaradený prostredníctvom odkazu.
PRÍKLADY 11-21
Typické zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej zverejnil Holt a spol. v J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 9925-9938, najmä látky 4-14 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLADY 22-30
Typické zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej zverejnil Caffery a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 21, str. 2507-2510,1994 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLAD 31
R
Tento typický príklad kyseliny pipekolovej, zlúčeninu 31, zverejnil Teague a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 3, č. 10, str. 1947-1950, 1993 a je sem zaradený prostredníctvom odkazu.
PRÍKLADY 32-34
Typické zlúčeniny odvodené od kyseliny pipekolovej zverejnil Yamashita a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 2, str. 325-328, 1994, najmä zlúčeniny 11, 12, a 19 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLADY 35-55
Typické príklady derivátov kyseliny pipekolovej zverejnil Holt a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 2, str. 315-320, 1994, najmä zlúčeniny 3-21 a 23-24 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLADY 56-68
Typické príklady derivátov kyseliny pipekolovej zverejnil Holt a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 3, č. 10, str. 1977-1980, 19934, najmä zlúčeniny 315 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
- 34 PRÍKLADY 69-83
Typické zlúčeniny podľa súčasného vynálezu zverejnil Hauske a spol. v J. Med. Chem., 1992, 35, 4284-4296, najmä zlúčeniny 6, 9-10, 21-24, 26, 28, 31-32 a 52-55 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLAD 84
Tento typický derivát kyseliny pipekolovej zverejnil Teague a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 13, str. 1581-1584, 1994 a je sem zaradený prostredníctvom odkazu.
PRÍKLADY 85-88
Typické príklady derivátov kyseliny pipekolovej zverejnil Stocks a spol. v Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 4, č. 12, str. 1457-1460, 1994, najmä zlúčeniny 2,15-17 a sú sem zaradené prostredníctvom odkazov.
PRÍKLADY 90-111
Ďalšie typické príklady derivátov kyseliny pipekolovej sa uvádzajú v schéme 10, a v tabuľkách 1-5.
SCHÉMA 01
PRÍKLAD / ZLÚČENINA ŠTRUKTÚRA
6 X = H?
7 X = CH2
S X = H, CH3
9 X = 0
SCHÉMA 2
CTI*
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo
R·»
CMs
I
I-
zpz1 /y^AJ
1S ô
/gjQ
SCHÉMA 3
PRÍKLAD/ZLÚČENINA číslo
ŠTRUKTÚRA
SCHÉMA 4 Tabuľka 1
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo ŠTRUKTÚRA
24 y = i
23 y = 2
24 y = 3
Tabuľka 2
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo VZOREC
25 n = 1
26 n = 2
27 n = 3
Tabuľka 3
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo VZOREC
28 n = 1
29 n = 2
30 n = 3
SCHÉMA 5
- 3S PRÍKLAD l ZLÚČENINA číslo VZOREC
R = fenyl R = N (alyl)2
SCHÉMA 6 Tabuľka 1
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo
VZOREC
R
35 MO
35
3 7
3 3 I
39 M.
40
41 v
42 “γ-αχ
43 “Ô
44
45 wQ
45 >JrQ
- 39 47 'Ό 'ό 'χ>
Tabuľka 2
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo VZOREC
- 40 SCHÉMA 7 Tabuľka 1
61 62 x = OH x = OMe x = Oi Pr x = OBn x = OCH MePh x = OCH2CHCHPh x = OCH2CH2CH2 (3,4-OMe2) Ph x = NHBn x = NHCH2CH2CH2Ph
Tabuľka 2
R = Me R = Bn
- 41 Tabuľka 3
R.2 = Phe-o-terc-butyl , u n = 2, R, = o&.
R2 = Phe-o-terc-butyl
- 42 Tabuľka 2
71 Ri=m-OCH3Ph; R3 =V al-o-terc-buty 1
72 Ri=m-OCH3Ph; R3 1 =Leu-o-terc -butyl
73 R,=m-OCH3Ph; R3 l=Ileu-o-terc-butyl
74 Ri=m-OCH3Ph; R3 1 =hexahydro-phe-<
terc-butyl
75 Ri=m-OCH3Ph; R3*=alylalanín-o-terc
butyl
76 Ri=B-naftyl; R3* =Val-o-terc-butyl
Tabuľka 3
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo
VZOREC
R, = CH2(CO)-m-OCH3Ph R? = CH2Ph R5* = OCH3
R, = CH2(CO)-B-naftyl R? = CH2Ph Rs1 = OCH3
- 43 Tabuľka 4
PRÍKLAD / ZLÚČENINA číslo
VZOREC
R, = m-OCH3Ph X = trans-CH=CH Ri1 = H Y = OC (o) pH
R, = m-OCH3Ph X = trans-CH=CH Rj1 = H
Y = OC (o) CF3
R.
X
R41 = Y = m-OCH3Ph trans-CH=CHI
Ri = m-OCH3Ph X = trans-CH=CH R41 = H
Y = OCH2CH=CH2
Ri = m-OCH3Ph X = C=O R? = H Y = Ph
- 44 SCHÉMA 9 Tabuľka 1
Tabuľka 2
sa
JLr a •a
«I
86 Ri =H, R2 = OMeR3=CH2OMe
87 R! = H, r2 = r3=h
88 Ri = Me, r2 = r3=h
SCHÉMA 10 Tabuľka 1
• i
PRÍKLAD
3,4-dichlór
3,4,5-trimetoxy
- 45 92
3-(2,5-dimetoxy)-fenylpropyl
3-(3,4-metylén-dioxy)fenylpropyl
Tabuľka 2
PRÍKLAD
R =
4-(p-metoxy)-butyl
3-fenylpropyl
3-(3-pyridyl)-propyl
Tabuľka 3
PRÍKLAD
100 101 102
103
104
R =
-(3 -pyridyl)-propyl
1,7-difenyl-4-heptyl
4-(4-metoxy)-butyl l-fenyl-6-(4-metoxy-fenyl)-4-hexyl
3-(2,5-dimetoxy)-fenyl-propyl
3-(3,4-metyléndioxy)-fenylpropyl
1,5-difenylpentyl
Tabuľka 4
cn
PRÍKLAD
105
106 107
R4-(4-metoxy)-butyl
3-cyklohexylpropyl
3-fenylpropyl
Tabuľka 5
4^
PRÍKLAD
108
109
110 111
R =
-cyklohexylpropyl
3- fenylpropyl
4- (metoxy)-butyl
1,7-difenyl-4-heptyl
NEUROTROFICKÉ ÚČINKY INHIBÍTOROV ROTAMÁZY
V tabuľke I sa uvádzajú početné príklady predmetu vynálezu aj s ich účinnosťami pri trofických účinkoch pozorovaných na kultúrach senzorických neurónov, ako sa to spomínalo vyššie. Na obrázkoch 19 a 20 sú mikrofotografie zlúčenín Príkladu 111a Príkladu 17 podporujúcich vyrastanie neuritov v kultúrach ganglií zadných koreňov.
- 47 Tabuľka I
Účinnosti testovaných príkladov in vitro
Príklad inhibícia rotamázy Kj, nM neurotrofická ED50 ganglion zadných koreňov u kurčiat, nM
6 140 25
9 13 0,030
11 170 1
12 250 300
13 25 80
15 17 0,30
19 12 0,017
36 >10.000 >10.000
41 1300 5000
50 >10.000 >10.000
90 1800 2500
91 28 200
92 39 90
93 75 35
94 70 8
95 165 5-10
96 740 10-20
97 725 150
98 130 75
99 30 5
100 60 43
101 15 0,17
102 12 2,5
103 120 3
104 20 0,016
105 103 6
106 760 1
107 210 0,82
108 32 0,29
109 2 0,08
110 24 0,002
111 5 0,08
- 48 ÚČINNOSŤ PRÍKLADOV ZLÚČENÍN NA REGENERÁCIU NERVOV V MODELOCH IN VIVO
Axotómia sedacieho nervu
Anestezovaným potkanom kmeňa Sprague-Dawley, samcom starým 6 mesiacov, sa na úrovni bedrovej kosti vypreparovali sedacie nervy a peánom sa rozdrvili. Študované látky alebo vehikulá sa im podávali podkožné tesne pred operáciou a potom denne počas nasledujúcich 18 dní. Na kvantifikovanie počtu axónov sa rezy sedacieho nervu farbili striebrom podľa Holmesa a na kvantifkovanie stupňa myelinizácie sa rezy farbili Luxolovou rýchlou modrou (Luxol fast blue). O osemnásť dní po lézii sa u zvierat, ktorým sa podalo vehikulum, pozorovalo signifikantné zníženie počtu axónov (50% zníženie v porovnaní s nepoškodenou kontrolou) a zníženie stupňa myelinizácie (90% zníženie v porovnaní s nepoškodenou kontrolou).
Podanie zlúčeniny Príkladu 12 (30 mg/kg s.c.) alebo Príkladu 13 (mg/kg s.c.) tesne pred spôsobením lezie a počas 18 nasledujúcich dní spôsobilo signifikantnú regeneráciu počtu axónov (25% a 5% zníženie u uvedených látok v porovnaní s nepoškodenou kontrolou) i stupňa myelinizácie (65% a 50% zníženie u týchto látok pri porovnaní s kontrolami), ak sa údaje porovnali so zvieratami, ktorým sa podalo iba vehikulum. Signifikantná účinnosť zlúčenín Príkladov 12 a 13 sa zhoduje s ich výraznou účinnosťou pri inhibovaní rotamázovej aktivity a pri stimulácii vyrastania neuritov vgangliách zadných koreňov kurčiat a s ich relatívnou účinnosťou in vivo, ktorá zodpovedá aj ich účinnosti in vitro (Tabuľka I). Tieto výsledky sa uvádzajú na obrázku 21. Ako „sham“ (slepé) sa označujú kontrolné zvieratá, ktorým sa podalo vehikulum, ale ktorým sa nespôsobila lézia. Ako „vehikulum“ sa označujú zvieratá, ktorým sa spôsobila lézia a ktorým sa podalo iba vehikulum (t.j. žiadna látka). Príklad 12 a Príklad 13 ukazujú zreteľnú podobnosť so „sham“ operovanými zvieratami, čo demonštruje silné neuroregeneratívne pôsobenie týchto látok in vivo. Tieto údaje sú kvantifikované v Tabuľke II.
- 49 Tabuľka II
ošetrenie počet axónov (% kontroly) hladina myelínu
„sham“ 100 100
lézia: + vehikulum (s.c.) 50 10
+ Príklad 12 (30 mg/kg s.c.) 75 35
+ Príklad 13 (30 mg/kg s.c.) 100 50
Z opísaného vynálezu je teda zrejmé, že rovnaký účinok sa dá získať rôznymi spôsobmi. Takéto obmeny nemožno pokladať za odchýlku od ducha a hľadiska vynálezu a akékoľvek takéto modifikácie sa považujú za zahrnuté do rozsahu nasledujúcich nárokov.

Claims (42)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie imunofilínového Ugandu na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov, pričom imunofílínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  2. 2. Použitie imunofilínového Ugandu na prípravu prostriedku na liečenie neurologickej poruchy, kde imunofílínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  3. 3. Použitie imunofilínového Ugandu na prípravu prostriedku na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou, kde imunofílínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  4. 4. Použitie imunofilínového Ugandu podľa nárokov 1 až 3, kde imunofílínový ligand je použitý v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofický faktor a neurotropín-3.
  5. 5. Použitie imunofilínového Ugandu podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, kde neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou.
  6. 6. Použitie imunofilínového Ugandu podľa nároku 5, kde neurologická porucha patrí do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
  7. 7. Použitie imunofilínového Ugandu podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, kde imunofílínový ligand je imunosupresívum alebo nie je imunosupresívum.
    - 51
  8. 8. Použitie imunofilínového ligandu podľa nároku 7, kde neimunosupresívnym ligandom je Way-124,666.
  9. 9. Použitie imunofilínového ligandu podľa nároku 7, kde neimunosupresívnym ligandom je Rap-Pa.
  10. 10. Použitie imunofilínového ligandu podľa nároku 7, kde neimunosupresívnym ligandom je zlúčenina SLB-506.
  11. 11. Použitie imunofilínového ligandu podľa nároku 7, kde neimunosupresívny ligand je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo zlúčenín 3-84 a 86-88.
  12. 12. Použitie imunofilínového ligandu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie.
  13. 13. Použitie imunofilínového ligandu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie.
  14. 14. Použitie imunofilínového ligandu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, kde sa dosahuje neurotrofická ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM.
  15. 15. Použitie imunofilínového ligandu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, kde sa dosahuje neurotrofická ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM.
  16. 16. Použitie imunofilínového ligandu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, kde sa dosahuje neurotrofická ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
  17. 17. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže
    - 52 byť zlepšená reparácia neurónov, pričom derivát kyseliny pipekolovej nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  18. 18. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na liečenie neurologickej poruchy, kde imunofilínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  19. 19. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou, kde imunofilínový ligand nezahrnuje FK506 alebo rapamycín.
  20. 20. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18 alebo 19, kde imunofilínový ligand je použitý v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofický faktor a neurotropín-3.
  21. 21. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nároku 17, 18, 19 alebo 20, kde neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou.
  22. 22. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nároku 21, kde neurologická porucha patrí do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby,’ Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
  23. 23. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18, 19 alebo 20, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie.
    - 53
  24. 24. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18, 19 alebo 20, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie.
  25. 25. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18, 19 alebo 20, kde sa dosahuje neurotrofícká ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM.
  26. 26. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18, 19 alebo 20, kde sa dosahuje neurotrofícká ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM.
  27. 27. Použitie imunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 17, 18, 19 alebo 20, kde sa dosahuje neurotrofícká ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
  28. 28. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na podporu rastu a regenerácie neurónov u neuropatologických stavov, v ktorých môže byť zlepšená reparácia neurónov.
  29. 29. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na liečenie neurologickej poruchy.
  30. 30. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej na prípravu prostriedku na ochranu nervov pred neuronálnou degeneráciou.
  31. 31. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29 alebo 30, kde imunofilínový ligand je použitý v kombinácii s účinným množstvom neurotrofického faktora, vybraného zo skupiny zahrnujúcej neurotrofický rastový faktor, rastový faktor pochádzajúci z mozgu, rastový faktor pochádzajúci z glie, ciliárny neurotrofícký faktor a neurotropín-3.
    - 54
  32. 32. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej ligand podľa nárokov 28, 28, 30 alebo 31, kde neuropatologický stav, neuronálna degenerácia alebo neurologická porucha zahrnujú periférne neuropatie zapríčinené fyzikálnym poranením alebo chorobným stavom, fyzikálnych poškodení mozgu, fyzikálnych poškodení miechy, náhlych mozgových príhod spojených s poškodením mozgu a neurologických porúch, ktoré súvisia s neurodegeneráciou.
  33. 33. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nároku 32, kde neurologická porucha patrí do skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a amyotrofickej laterálnej sklerózy.
  34. 34. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde neimunosupresívnym derivátom kyseliny pipekolovej je Way124,666.
  35. 35. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde neimunosupresívnym derivátom kyseliny pipekolovej je Rap-Pa.
  36. 36. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde neimunosupresívnym derivátom kyseliny pipekolovej je zlúčenina SLB-506.
  37. 37. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde neimunosupresívny derivát kyseliny pipekolovej je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo zlúčenín 86-88 a 90-111.
  38. 38. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 35% obnovenie myelinizácie.
    - 55
  39. 39. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde použitie poskytuje najmenej 75% regeneráciu počtu axónov a najmenej 50% obnovenie myelinizácie.
  40. 40. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde sa dosahuje neurotrofická EDj0 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 200 nM.
  41. 41. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde sa dosahuje neurotrofická ED50 použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 35 nM.
  42. 42. Použitie neimunosupresívneho derivátu kyseliny pipekolovej podľa nárokov 28, 29, 30 alebo 31, kde sa dosahuje neurotrofická EDso použitím zlúčeniny v koncentrácii nie vyššej ako 1 nM.
    1/21 náhradný list (pravidlo 26)
SK1610-97A 1995-06-07 1996-06-05 Use of the immunophilin ligand for the preparation of agent to stimulate neuronal growth and regeneration at neuropathological conditions SK161097A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/474,072 US5798355A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Inhibitors of rotamase enzyme activity
US08/653,905 US5696135A (en) 1995-06-07 1996-05-28 Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
PCT/US1996/009561 WO1996040140A1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Inhibitors of rotamase enzyme activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK161097A3 true SK161097A3 (en) 1998-11-04

Family

ID=27044341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1610-97A SK161097A3 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Use of the immunophilin ligand for the preparation of agent to stimulate neuronal growth and regeneration at neuropathological conditions

Country Status (28)

Country Link
US (5) US5696135A (sk)
EP (1) EP0777478B1 (sk)
AU (1) AU710423B2 (sk)
BG (1) BG102072A (sk)
BR (1) BR9608485A (sk)
CA (1) CA2206824C (sk)
CH (1) CH689541A5 (sk)
CZ (1) CZ232997A3 (sk)
DE (1) DE19680255T1 (sk)
DK (1) DK125696A (sk)
EA (1) EA001379B1 (sk)
EE (1) EE9700331A (sk)
ES (3) ES2138518B1 (sk)
FI (1) FI964137A (sk)
GB (1) GB2305605B (sk)
HK (1) HK1013254A1 (sk)
HU (1) HUP9900816A3 (sk)
LU (1) LU88834A1 (sk)
LV (1) LV11986B (sk)
MX (1) MX9707552A (sk)
NO (1) NO974290L (sk)
NZ (1) NZ310767A (sk)
PL (1) PL323381A1 (sk)
SE (1) SE9604097L (sk)
SI (1) SI9620089A (sk)
SK (1) SK161097A3 (sk)
TW (1) TW523410B (sk)
WO (1) WO1996040140A1 (sk)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2325230A (en) * 1995-06-07 1998-11-18 Guilford Pharm Inc Intermediate for Neurotrophic N-glyoxylprolyl esters
US7056935B2 (en) * 1995-06-07 2006-06-06 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
US5696135A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
US6291510B1 (en) 1995-06-07 2001-09-18 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US6509477B1 (en) 1998-11-12 2003-01-21 Guilford Pharmaceuticals Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US5859031A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US6037370A (en) * 1995-06-08 2000-03-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5801197A (en) * 1995-10-31 1998-09-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
US5794887A (en) 1995-11-17 1998-08-18 Komerath; Narayanan M. Stagnation point vortex controller
US5801187A (en) 1996-09-25 1998-09-01 Gpi-Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters and amides
US5811434A (en) * 1996-11-13 1998-09-22 Vertex Pharmacueticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5780484A (en) * 1996-11-13 1998-07-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for stimulating neurite growth with piperidine compounds
US5840736A (en) * 1996-11-13 1998-11-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5874449A (en) * 1996-12-31 1999-02-23 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of heterocyclic thioesters
US5935989A (en) 1996-12-31 1999-08-10 Gpi Nil Holdings Inc. N-linked ureas and carbamates of heterocyclic thioesters
SK57899A3 (en) * 1996-12-31 2000-05-16 Guilford Pharm Inc N-linked ureas and carbamates of heterocyclic thioesters
US5721256A (en) * 1997-02-12 1998-02-24 Gpi Nil Holdings, Inc. Method of using neurotrophic sulfonamide compounds
US5846979A (en) * 1997-02-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic esters, amides, thioesters, and ketones
US6852496B1 (en) 1997-08-12 2005-02-08 Oregon Health And Science University Methods of screening for agents that promote nerve cell growth
US6268384B1 (en) 1997-08-29 2001-07-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds possessing neuronal activity
US5968921A (en) 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US6121280A (en) * 1998-03-24 2000-09-19 Pfizer Inc. Azabicyclic rotomase inhibitors
US6096762A (en) * 1998-06-02 2000-08-01 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic difluoroamide agents
JP2002516904A (ja) 1998-06-03 2002-06-11 ジーピーアイ ニル ホールディングス インコーポレイテッド Ｎ−複素環式カルボン酸またはカルボン酸等配電子体のｎ−結合スルホンアミド
US6331537B1 (en) 1998-06-03 2001-12-18 Gpi Nil Holdings, Inc. Carboxylic acids and carboxylic acid isosteres of N-heterocyclic compounds
AU756912B2 (en) 1998-07-17 2003-01-23 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Compounds, compositions, and methods for stimulating neuronal growth and elongation
GB9815880D0 (en) * 1998-07-21 1998-09-16 Pfizer Ltd Heterocycles
US6335348B1 (en) * 1998-08-14 2002-01-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Nitrogen-containing linear and azepinyl/ compositions and uses for vision and memory disorders
US6376517B1 (en) * 1998-08-14 2002-04-23 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivatives for vision and memory disorders
US7338976B1 (en) * 1998-08-14 2008-03-04 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters or amides for vision and memory disorders
US6339101B1 (en) * 1998-08-14 2002-01-15 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of N-heterocyclic carboxylic acids or isosteres for vision and memory disorders
US7265150B1 (en) * 1998-08-14 2007-09-04 Gpi Nil Holdings Inc. Carboxylic acids and carboxylic acid isosteres of N-heterocyclic compounds for vision and memory disorders
EP1105112A2 (en) * 1998-08-14 2001-06-13 GPI NIL Holdings, Inc. Compositions and uses for vision and memory disorders
US6333340B1 (en) * 1998-08-14 2001-12-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule sulfonamides for vision and memory disorders
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
US6307049B1 (en) 1998-09-30 2001-10-23 The Procter & Gamble Co. Heterocyclic 2-substituted ketoamides
US6300341B1 (en) 1998-09-30 2001-10-09 The Procter & Gamble Co. 2-substituted heterocyclic sulfonamides
US6228872B1 (en) 1998-11-12 2001-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic diamide and carbamate agents
WO2000046181A1 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Schering Aktiengesellschaft Carboxylic acid derivatives, process for their preparation and their use as rotamase enzyme activity inhibitors
US6284779B1 (en) 1999-02-03 2001-09-04 Schering Aktiiengesellschaft Heteroaromatic compounds
EP1196386A2 (en) * 1999-07-06 2002-04-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated N-substituted glycine derivatives
JP2003504367A (ja) 1999-07-09 2003-02-04 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 神経栄養性ピロリジン類およびピペリジン類、並びに関連組成物および方法
WO2001004091A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic 2-azetidinecarboxylic acid derivatives, and related compositions and methods
US6734211B1 (en) 1999-07-09 2004-05-11 Oregon Health & Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US6323215B1 (en) 1999-07-09 2001-11-27 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic tetrahydroisoquinolines and tetrahydrothienopyridines, and related compositions and methods
AU6913700A (en) * 1999-08-18 2001-03-13 Schering Aktiengesellschaft Piperidine and pyrrolidine derivatives displaying neuronal activity
US7807211B2 (en) 1999-09-03 2010-10-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Thermal treatment of an implantable medical device
US20070032853A1 (en) 2002-03-27 2007-02-08 Hossainy Syed F 40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin coated stent
US6790228B2 (en) 1999-12-23 2004-09-14 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Coating for implantable devices and a method of forming the same
CA2383086A1 (en) 1999-09-08 2001-03-15 Joseph P. Steiner Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use
US7253169B2 (en) 1999-11-12 2007-08-07 Gliamed, Inc. Aza compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
US6417189B1 (en) 1999-11-12 2002-07-09 Gpi Nil Holdings, Inc. AZA compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
AR034103A1 (es) * 1999-11-12 2004-02-04 Alcon Inc Composicion farmaceutica que comprende ligandos de neurofilina para el tratamiento de condiciones oculares
GT200000203A (es) 1999-12-01 2002-05-24 Compuestos, composiciones y metodos para estimular el crecimiento y elongacion de neuronas.
US6818643B1 (en) 1999-12-08 2004-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic bicyclic diamides
ATE319712T1 (de) 1999-12-21 2006-03-15 Mgi Gp Inc Hydantoin derivate, pharmazeutische zusammensetzungen und verfahren zu ihrer verwendung
US6656971B2 (en) 2001-01-25 2003-12-02 Guilford Pharmaceuticals Inc. Trisubstituted carbocyclic cyclophilin binding compounds and their use
US7041283B1 (en) 2001-02-16 2006-05-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of using immunophilin binding drugs to improve integration and survival of neuronal cell transplants
US6593362B2 (en) 2001-05-21 2003-07-15 Guilford Pharmaceuticals Inc. Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use
JP2005500270A (ja) * 2001-05-29 2005-01-06 ギルフォード ファーマシュウティカルズ インコーポレイテッド 手術の結果として発生した神経損傷を治療するための方法
ATE421525T1 (de) * 2001-08-20 2009-02-15 Max Planck Gesellschaft Katalyse der cis-trans isomerisierung von sekundären-amid peptidverbindungen
CN1173960C (zh) 2001-12-06 2004-11-03 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 取代六元氮杂环类化合物及其作为神经调节剂的用途
US20030176455A1 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Wyeth Method of inhibiting cell death
EP1402888A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-31 Jerini AG The use of substituted carbocyclic compounds as rotamases inhibitors
CA2500417A1 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 Shoei Furukawa Neurotrophic factor production promoter
US7033612B2 (en) * 2003-01-03 2006-04-25 Kang David S Composition and method for treating age-related disorders
US20050118344A1 (en) 2003-12-01 2005-06-02 Pacetti Stephen D. Temperature controlled crimping
CA2539324A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Macusight, Inc. Transscleral delivery
WO2005084673A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Wyeth Non-immunosuppressive immunophilin ligands as neuroprotective and/or neuroregenerative agents
EP1720886A1 (en) * 2004-03-02 2006-11-15 Wyeth Macrolides and methods for producing same
MXPA06014080A (es) * 2004-06-03 2007-02-15 Wyeth Corp Agregado de genes biosinteticos para la produccion de un policetido complejo.
DK1778637T3 (da) * 2004-06-29 2012-06-18 Aventis Pharma Inc FKBP-bindingssammensætninger og farmaceutisk anvendelse deraf
US7777042B2 (en) * 2004-06-29 2010-08-17 Aventis Pharmaceuticals Inc. N-sulfonylpipecolic acid derivative FKBP binding composition and pharmaceutical use thereof
US20060189551A1 (en) * 2004-10-04 2006-08-24 Duke University Combination therapies for fungal pathogens
JP2008524232A (ja) * 2004-12-20 2008-07-10 ワイス ラパマイシン誘導体及び神経障害の治療におけるその使用
DK1828202T3 (da) * 2004-12-20 2012-05-07 Wyeth Llc Rapamycinanaloge samt deres anvendelse ved behandling af neurologiske, proliferative og inflammatoriske lidelser
US8663639B2 (en) 2005-02-09 2014-03-04 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Formulations for treating ocular diseases and conditions
US8637070B2 (en) 2005-02-09 2014-01-28 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Rapamycin formulations and methods of their use
KR20080018874A (ko) * 2005-04-27 2008-02-28 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨. 인간 질병과 관련된 돌연변이 단백질의 분해 촉진을 위한물질 및 방법
WO2006125324A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Queen's University At Kingston Treatment of protein folding disorders
EP2001438A2 (en) 2006-02-09 2008-12-17 Macusight, Inc. Stable formulations, and methods of their preparation and use
ES2563288T3 (es) 2006-03-23 2016-03-14 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Rapamicina en dosis bajas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular
AU2008338989A1 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
DE102008060549A1 (de) 2008-12-04 2010-06-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Wirkstoff-Peptid-Konstrukt zur extrazellulären Anreicherung
US20100317711A1 (en) * 2008-12-17 2010-12-16 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
EP2705856A1 (en) 2012-09-07 2014-03-12 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. Compounds for the treatment of neurodegenerative disorders
US9121859B2 (en) 2012-12-04 2015-09-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compounds and methods for determination of FKBP-binding immunosuppressant drugs
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AU2017214550B2 (en) * 2016-02-04 2024-03-07 The Johns Hopkins University Synthesis and composition of Rapafucin libraries
ES2837484T3 (es) 2016-02-04 2021-06-30 Univ Johns Hopkins Rapadocinas, inhibidores del transportador de nucleósidos equilibrativo 1 y usos de los mismos
US11066416B2 (en) 2016-02-04 2021-07-20 The Johns Hopkins University Rapafucin derivative compounds and methods of use thereof
CN108697729B (zh) 2016-02-04 2023-05-09 约翰霍普金斯大学 新型GLUT抑制剂rapaglutin及其用途
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CN114533708A (zh) * 2022-03-23 2022-05-27 四川大学 Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的应用

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4390695A (en) * 1980-06-23 1983-06-28 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
US4310461A (en) * 1980-06-23 1982-01-12 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
US4578474A (en) * 1980-06-23 1986-03-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Imido, amido and amino derivatives of mercaptoacyl prolines and pipecolic acids
AU563282B2 (en) * 1982-09-13 1987-07-02 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Pyrrolidino and piperidino derivatives and condensed derivatives thereof
US4593102A (en) * 1984-04-10 1986-06-03 A. H. Robins Company, Inc. N-[(amino)alkyl]-1-pyrrolidine, 1-piperidine and 1-homopiperidinecarboxamides (and thiocarboxamides) with sulfur linked substitution in the 2, 3 or 4-position
US5385915A (en) * 1990-05-16 1995-01-31 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with Alzheimer disease using modulators of protein phosphorylation
US5242932A (en) * 1991-12-17 1993-09-07 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with alzheimer disease
US5504197A (en) * 1990-06-20 1996-04-02 The Salk Institute For Biological Studies DNA encoding neurotrophic growth factors
US5192773A (en) * 1990-07-02 1993-03-09 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Immunosuppressive compounds
AU8727491A (en) * 1990-08-29 1992-03-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified di- and tripeptidyl immunosuppressive compounds
AU1677092A (en) * 1991-03-20 1992-10-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrahydroxyalkane derivatives as inhibitors of hiv aspartyl protease
US5321009A (en) * 1991-04-03 1994-06-14 American Home Products Corporation Method of treating diabetes
AU2007192A (en) * 1991-05-08 1992-12-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Rfkbp: a novel prolyl isomerase and rapamycin/fk506 binding protein
US5620971A (en) * 1991-05-09 1997-04-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biologically active acylated amino acid derivatives
DE69229782T2 (de) * 1991-05-09 2000-04-27 Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge Neue immunsuppressive verbindungen
MX9202466A (es) * 1991-05-24 1994-06-30 Vertex Pharma Compuestos inmunosupresores novedosos.
WO1993007269A1 (en) * 1991-10-11 1993-04-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated ISOLATION OF AN Mr 52,000 FK506 BINDING PROTEIN AND MOLECULAR CLONING OF A CORRESPONDING HUMAN cDNA
CA2091194A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-09 Richard D. Connell 2-oxo-ethyl derivatives as immunosuppressants
WO1993023548A2 (en) * 1992-05-20 1993-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated METHOD OF DETECTING TISSUE-SPECIFIC FK506 BINDING PROTEIN MESSENGER RNAs AND USES THEREOF
IS2334B (is) * 1992-09-08 2008-02-15 Vertex Pharmaceuticals Inc., (A Massachusetts Corporation) Aspartyl próteasi hemjari af nýjum flokki súlfonamíða
NZ314207A (en) * 1992-09-28 2000-12-22 Vertex Pharma 1-(2-Oxoacetyl)-piperidine-2-carboxylic acid derivatives as multi drug resistant cancer cell sensitizers
AU5748194A (en) * 1992-12-11 1994-07-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Mannitol derivatives and their use as inhibitors of aspartyl protease
DE4302860A1 (de) * 1993-01-22 1994-08-04 Chemie Linz Deutschland N-Cyclische und N,N'dicyclische Harnstoffe
US5385918A (en) * 1993-02-09 1995-01-31 Miles Inc. Aminomethylene-peptides as immunosuppressants
US5846981A (en) * 1993-05-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5798355A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
GB2279006A (en) * 1993-06-03 1994-12-21 Fujisawa Pharmaceutical Co Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
DE69512220T2 (de) * 1994-03-07 2000-03-16 Vertex Pharmaceuticals Inc. Sulfonamidderivate als aspartylprotease-inhibitoren
US5744485A (en) * 1994-03-25 1998-04-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carbamates and ureas as modifiers of multi-drug resistance
US5898029A (en) * 1994-04-12 1999-04-27 The John Hopkins University Direct influences on nerve growth of agents that interact with immunophilins in combination with neurotrophic factors
US5716929A (en) * 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5856116A (en) * 1994-06-17 1999-01-05 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystal structure and mutants of interleukin-1 beta converting enzyme
US5488816A (en) * 1994-07-21 1996-02-06 Boehringer Mannheim Corporation Method and apparatus for manufacturing a coagulation assay device in a continuous manner
IL115685A (en) * 1994-11-16 2000-08-31 Vertex Pharma Amino acid derivatives pharmaceutical compositions containing the same and processes for the preparation thereof
US5543423A (en) * 1994-11-16 1996-08-06 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Amino acid derivatives with improved multi-drug resistance activity
US5726184A (en) * 1995-05-19 1998-03-10 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetralin compounds with improved MDR activity
SI9500173B (sl) 1995-05-19 2002-02-28 Lek, Trofazna farmacevtska oblika s konstantnim in kontroliranim sproščanjem amorfne učinkovine za enkrat dnevno aplikacijo
US5859031A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US5696135A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
US6037370A (en) 1995-06-08 2000-03-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth

Also Published As

Publication number Publication date
US6500843B2 (en) 2002-12-31
CH689541A5 (de) 1999-06-15
EE9700331A (et) 1998-06-15
HUP9900816A2 (hu) 1999-07-28
BG102072A (en) 1998-08-31
GB9624258D0 (en) 1997-01-08
HUP9900816A3 (en) 2000-02-28
HK1013254A1 (en) 1999-08-20
ES2194596A1 (es) 2003-11-16
CA2206824A1 (en) 1996-12-19
US6022878A (en) 2000-02-08
ES2166740A1 (es) 2002-04-16
FI964137A0 (fi) 1996-10-15
DK125696A (da) 1996-12-20
AU710423B2 (en) 1999-09-23
CA2206824C (en) 2001-08-14
TW523410B (en) 2003-03-11
NO974290L (no) 1997-12-04
WO1996040140A1 (en) 1996-12-19
LV11986B (en) 1998-09-20
SE9604097L (sv) 1996-12-08
US20030114365A1 (en) 2003-06-19
US20020052372A1 (en) 2002-05-02
GB2305605B (en) 2000-01-12
PL323381A1 (en) 1998-03-30
LU88834A1 (de) 1997-01-15
CZ232997A3 (cs) 1998-07-15
US5696135A (en) 1997-12-09
ES2194596B1 (es) 2005-02-16
LV11986A (lv) 1998-03-20
EA001379B1 (ru) 2001-02-26
FI964137A (fi) 1997-01-15
NZ310767A (en) 2000-11-24
EP0777478A4 (en) 1998-07-08
EP0777478B1 (en) 2001-11-07
MX9707552A (es) 1998-07-31
SE9604097D0 (sv) 1996-11-08
ES2138518A1 (es) 2000-01-01
GB2305605A (en) 1997-04-16
ES2138518B1 (es) 2001-01-01
SI9620089A (sl) 1999-04-30
GB2305605A8 (en) 1999-01-20
BR9608485A (pt) 1999-07-06
EP0777478A1 (en) 1997-06-11
EA199700360A1 (ru) 1998-08-27
NO974290D0 (no) 1997-09-17
DE19680255T1 (de) 1997-06-05
AU6162296A (en) 1996-12-30
US5843960A (en) 1998-12-01
ES2166740B1 (es) 2003-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK161097A3 (en) Use of the immunophilin ligand for the preparation of agent to stimulate neuronal growth and regeneration at neuropathological conditions
JP3060373B2 (ja) ロタマーゼ酵素活性の阻害剤
WO1996040140A9 (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
JP3089350B2 (ja) シクロフィリンロタマーゼ活性の阻害剤
RU2197240C2 (ru) Способы и композиции для стимуляции роста невритов
US5846981A (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
SK55998A3 (en) Use of pipecolic acid derivative
US20100178277A1 (en) Methods and compositions for stimulating cells
Harper et al. Analysis of the neurotrophic effects of GPI-1046 on neuron survival and regeneration in culture and in vivo
SK158597A3 (en) Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US20150258058A1 (en) Compounds For Enhancing Hypoxia Inducible Factor Activity And Methods Of Use
WO2002080957A1 (en) Adenosine a2a receptor antagonists combined with neurotrophic activity compounds in the treatment of parkinson&#39;s disease
AU740089B2 (en) Inhibitors of rotamase enzyme activity
US20090221610A1 (en) Compositions and Methods for Treating Cognitive Disorders
US7282340B2 (en) Methods for identifying an analog that promotes nerve regeneration
MXPA98003356A (en) Inhibitors of the activity of enzima rotam