TW523410B

TW523410B - Non-immunosuppresive 2-pipecolic acid derivative-containing pharmaceutical compositions for promoting neuronal growth and regeneration in a neurophathological condition where neuronal repair can be facilitated, for treating a neurological disorder

Info

Publication number: TW523410B
Application number: TW085113075A
Authority: TW
Inventors: Joseph P Steiner; Solomon Snyder; Gregory S Hamilton
Original assignee: Guilford Pharm Inc; Univ Johns Hopkins Med
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 2003-03-11
Also published as: BG102072A; HUP9900816A3; GB9624258D0; SE9604097L; ES2166740B1; LV11986A; ES2194596A1; EP0777478A1; NO974290L; BR9608485A; NZ310767A; ES2166740A1; HUP9900816A2; CA2206824A1; EA001379B1; FI964137A0; HK1013254A1; SK161097A3; GB2305605A8; ES2138518A1

Description

523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（/ ) 相闊的由請案本案發明傺為於1 995年6月7日提申的美國專利申請案 08/474,072之一部分延續申請案。發明背景本發明像有關使用對FKBP-型免疫菲林（im!nun0Phi 1 in) 具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物以作為與免疫葬林蛋白質（特別是肽醯基-腩胺醯基異構酶或旋轉異構酶）有關的酵素活性之抑制子的方法。習知抟慈夕説明免疫菲林此辭意指一群作為諸如璟孢菌素A (Cyc 1 〇-s ρ 〇 r i n , C s A )、F K 5 0 6以及雷帕黴素（r a p a m y c i η )之主要免疫抑制藥物的受體之蛋白質。已知的免疫菲林類別有環菲林（〇¥〇1(^}1丨1丨^)以及「1(5 0 6結合蛋白（諸如？0?)。環孢麵素Α會結合環葬林，而FK506與雷帕黴素會結合FKBP。這些免疫菲林-藥物複合物會與各種不同的細胞内信號轉導条統（特別是免疫条統與神經条統）相互作用。已知免疫菲林具有肽醯基-脯胺醯基異構酶（PP lase) 或旋轉異構酶酵素活性。已經確定旋轉異構酶酵素活性在免疫菲林蛋白質的順式或反式異構吳之相互轉換的催化作用中占有一角色。免疫菲林最初是在免疫組織中被發現及研究之。熟習此藝者首先假設免疫菲林旋轉異構酶活性之抑制作用導致 T-細胞增殖作用之抑制作用，因而造成由諸如環孢鍾素A 、FK5 06與雷帕黴素之免疫抑制性藥物所展現出之免疫抑 (請先閲讀背面之注意事項再IP?本頁) r

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2) 制性作用。進一步之研究已顯示，出光靠旋轉異構酶活性之抑制作用本身不足以達成免疫抑制性活性。Sehre i ber et Sci^nr^ (1990) , ·:556-559。相對地，免疫抑制作用似乎是源自於免疫抑制性藥物與免疫葬林之一錯合物的形成。已有人顯示免疫葬林-藥物複合物會與三元蛋白質檫的物相互作用以為其作用之模式。S c h r e i b e r e t al" Cell (1991)，m:807-815。就 FKBP-FK506與 FKBP-C s A而言，該等藥物-免疫菲林複合物會結合至酵素鈣神經素（calcineur i n)，而抑制T-受體發出導向了-細胞增殖之信號。同樣地，雷帕黴素與FKBP之複合物會與RAFT1/FRAP 蛋白質相互作用，而抑制源自於IL-2受體之信號發出。已發現免疫菲林於中樞神經条統中像以高濃度而存在。免疫菲林之量在中樞神經条統中要比在免疫条統中要高出10至50倍。在神經組織内，免疫葬林似乎會影響氧化氮合成、神經遞質釋出以及神經元的突起擴展。氧化氮在身體内扮演數種角色Q在腦中9氧化氮似乎是一種神經傳導子。其傷藉由氧化氮合成酶而從精胺酸所形成的，氧化氮合成酶會氧化精胺酸的胍基基團而形成氧化氮與瓜胺酸。谷胺酸受體之N-甲基-d-天冬胺酸（NMDA) 亞型的剌激作用快速且顯著地活化氣化氮合成酶，並剌激 cGMP形成。以諸如硝基精胺酸之精胺酸衍生物來抑制氧化氮合成酶會逼止谷胺酸誘發的cGMP位準之增高。氧化氮合成酶傺為一種需要數-c a 1 m 〇 d u 1 i η的酵素且N -甲基-d ~天冬胺酸受體活化作用會剌激氧化氮合成酶活性，因為該N-甲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） -5 - (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 木經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（彡）基-d-天冬胺酸具有一個藉由谷胺酸剌激作用而被打開的鈣通道，這容許鈣衝入細胞内並活化氧化氮合成酶。谷胺酸傺為一種生理性神經傳導子。但是，當被過量地釋出時，谷胺酸會經由I甲基-d-天冬胺酸受體而激發神經毒性。以谷胺酸或N-甲基_d~天冬胺酸來處理大腦皮質神經元的培養物會殺死高達90¾的神.經元，而這些作用會被N-甲基-d-天冬胺酸拮抗劑藥物所遏止。此.甲基-d_ 天冬胺酸神經毒性被認為是血管性中風之後的神經損害之一主要貢獻者。因此，在腦血管閉合之後有一大量的谷胺酸之釋出，而多種的N-甲基-d-天冬胺酸拮抗劑會遏阻中風損害。氧化氮合成酶之磷酸化會抑制其催化活性。藉由增進氧化氮合成酶磷酸化，FK506可有功能地抑制氧化氮形成並因此逼阻谷胺酸神經毒性。確實地，低濃度之FK506 以及環孢菌素A此二者會遏阻皮質培養物内之N -甲基-d-天冬胺酸神經毒性。FKBP之調節角色是明顯的，因為雷帕黴素會逆轉FK506之治療性作用。已被當作免疫抑制劑而上市之FK506被認為在臨床上可用在中風病人身上。 FK506亦增大生長-相關性蛋白質43 (GAP43)之磷酸化。神經元的突起伸展中涉及到GAP43，而GAP43之磷酸化似乎會增大此活性。於是，在神經元的突起伸展中，FK506 、雷帕黴素以及環孢菌素之作用已使用PC 12細胞予以撿查之。PC 12細胞是類神經元的細胞之一種持續細胞株*該細胞株在受到神經生長因子之剌激後會伸展出神經突。令人驚訝地，已發現到ΗΓ 1 2莫耳濃度之一諸如FK506 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 6 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、τ 523410 A7 B7___ 五、發明説明（么）與雷帕黴素的免疫菲林會剌激PC 12細胞與感覺神經，亦即背根神經結細胞（DRGs)，内之神經突長出。Lyons et al., —Acad, Sc s . (1994) , 3191 -319.5。在整値動物實驗中，FK506顯示出會剌激顔面神經損害之後的神經再生，並造成患有坐骨神經損害之動物體内的功能恢復ϋ 更令人驚訝地，已發現到對FKBP具一高親和力之藥物係為有力的旋轉異構酶抑制子並展現神經營養性作用。

Snyer e t a 1 . I m m u η o p h i 1 i n s and the Nervous System , H^ture Medicine, (1 ) : 3 2 - 3 7 , J a η , 19 9 5。這些發現建議，在治療各種不同的周邊神經病以及促進中樞神經条統（CNS)中的神經元之再生上，可以使用免疫抑制劑。研究已經證實，諸如阿滋海黙氏症、帕金森氏症以及肌萎縮性側索硬化（ALS)之神經退化性障礙，可能傺導因於一種神經營養性物質之喪失或減低的可用性，而該神經營養性物質對一種受該障礙所影響的特定的神經元族群具有專一性。經濟部中央標準局員工消費合作社印製已鑑定出數種會影響中樞神經条統内之持定的神經元族群之神經營養性因子。例如，曽有人假設阿滋海黙氏症偽導因於一種神經生長因子（NGF)之減少或喪失。因而有人建議以外源性神經生長因子或其他的神經營養性蛋白質，諸如腦衍生的生長因子、神經膠質衍生的神經因子、纖毛神經營養性因子以及神經營養素_ 3 (n e ο r 〇 t r 〇 p i n - 3 )，來治療阿滋海黙氏症病人，俾以增進退化中的神經元族群 7 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（f) 之存活。這些蛋白質在各種神經學疾病狀態上之臨床應用，受到大型蛋白質至神經条統標的之輸送困難性以及生物可用性之阻礙。相對地，具有神經營養性活性之免疫抑制性藥物傷相當地小，且展現出極佳的生物可用性與專一性。但是，當被慢性地投藥時，免疫抑制劑顯現出多種包括腎毒性在内之潛在的嚴重副作用，諸如腎小球過濾作用之損害、不可逆的間質纖維化（Kopp et ai (1991)，JL——_Am· Sco· Hephrol . · 1 6 2 );諸如自主性震顫之神經學缺陷，或諸如無定位的頭痛之非專一性的大腦絞痛病（De Groen et al (1 987 )，N. En^K J. Med" δ61);以及帶有由之而來的併發症之高血壓（lahan et al ( 1989)，tL— Engl > J. Med…321： 1725) ◦ 本發明提供含有小分子FKBP旋轉異構酶抑制子之非-免疫抑制性以及免疫抑制性六氫吡啶羧酸衍生物化合物，該等化合物在下列方面是非常有力者：增大神經突長出以及用於促進各種神經病理學狀況中之神經元的生長以及再生（其中可以促成神經元的修復），該等病症包括由物理性損害或疾病狀態（如糖尿病）所致之周邊神經損害、對中樞神經条統（脊髓與腦:)之物理性損害、與中風有闊的腦損害，以及供用於治療與神經退化有關的神經學疾病，包括有帕金森氏症、阿滋海黙氏症以及肌萎縮性側索硬化。發明^槪要説明本發明傷有關使用對FKBP-型免疫菲林（inuBunophi 1 in) (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 s_ϋ 五、發明説明（< ) 具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物以作為與免疫菲林蛋白質（待別是肽_基-脯胺醯基異構酶或旋轉異構酶）有關的酵素活性之抑制子的方法。本發明之一較佳的實施例是一種用以治療一動物體内之一神經學障礙的方法，該方法包括：對一動物投藥以一有效量之一對FKBP-型免疫葬林具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物，俾以剌激受損的周邊神經之生長或促進神經元的再生，其中該FKBP-型免疫_林展現旋轉異構酶活性而該六氫吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫葬林之旋轉異構酶活性。 1 本發明另一較佳的實‘施例是一種用以治療一動物體内之一神經學障礙的方法，該方法包括：對一動物投藥以一有效量之一對FKBP-型免疫葬林具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物加上一有效量之一擇自於下列群中的神經營養性因子：神經生長因子、腦衍生的生長因子、神經膠質衍生的神經因子、纖毛神經營養性因子以及神經營養素-3，俾以剌激受損的周邊神經之生長或促進神經元的再生*其中該FKBP-型免疫菲林展現旋轉異構酶活性而該六氫吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫菲林之旋轉異搆酶活性。本發明之再一較佳的實施例是一種用以剌激受損的周邊神經之生長的方法，該方法包括： (請先閲讀背面之注意事項再本頁) I 再、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（7) 對受損的周邊神經投藥以一有效量之一對FKBP-型免疫菲林具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物，俾以剌激或促進受損的周邊神經之生長，其中該FOP-型免疫葬林展現旋轉異構酶活性而該六氫吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫菲林之旋轉異構酶活性。本發明之又一較佳的實施例是一種用以剌激受損的周邊神經之生長的方法，該方法包括：對受損的周邊神經投藥以一有效量之一對FKBP-型免疫菲林具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物，俾以刺激受損的周邊神經之生長，其中該FKBP-型免疫菲林展現旋轉異構酶活性而該六氫吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫菲林之旋轉異構酶活性。本發明之另一較佳的實施例是一種用以促進動物體内的神經元之再生的方法，該方法包括：對一動物投藥以一有效量之一對FKBP-型免疫葬林具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物’俾以促進神經元的再生，其中該FKBP-型免疫菲林展現旋轉異構酶活性而該六氫吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫菲林之旋轉異構酶活性。本發明之又一較佳的實施例是一種用以預防動物體内之神經退化的方法，該方法包括：對一動物投藥以一有效量之一對FKBP _型免疫菲林本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（) 具有一專一性之神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物，俾以預防神經退化’其中該FKBP-型免疫菲林展現旋轉異構酶活性而該六氳吡啶羧酸衍生物會抑制該免疫_林之旋轉異構酶活性。圖式概要説明第1圖顯示在神經壓碎之後’於顔面核内之FKBP-12與 GAP-43。位在顔面核内之有闋於FKBP-12 (左側）與GAP_43 (右側）之niRΝΑ表現相對於時間期的在原位混交之比較。右側顔面核與該壓碎傺為同側的’而左側則為一未經操作之對照組（第1Β圖）。在一未經處理的對照組（左）上進行有關於FKBP-12之在原位混交，以及在神經壓碎（右）之後7天進行有關於鈣神經素A α , /3之在原位混交。實驗至少做3次之重覆而獲得類似之結果。第2圖顯示在神經壓碎之後，FKBP-12對顔面蓮動神經元之定位。亮視野光學顯微相片顯示在神經壓碎之後7天，FOP-12在顔面核之蓮動神經元内的在原位混交（第2Α圖），以及對照組顔面核之蓮動神經元的在原位混交（第2B圖） Ο 第3圖顯示在坐骨神經壓碎之後，腰脊髓蓮動神經元内之FKBP-12 mRNA的上升調節。在右坐骨神經壓碎之後7 天，有關於FKBP-12的在原位混交。上部（第3圖）顯示下方腰脊髓之前柱内的蓮動神經元之反應（以箭號示出）。對應的蓮動神經元匯集之亮視野光學顯徽相片示於底部：左側 (第3B圖）傺對側於神經壓碎，而右側（第3C圖）係同側於神本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

·—訂. 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 經壓碎。此實驗至少做3次之重覆而獲得類似之結果。第4圖顯示在坐骨神經壓碎之後1週及6週時，背根神經結内的FKBP與FKBP-12 inRNA之誘發。右圖顯示經由同側於被壓碎處理的坐骨神經之L4背根神經結的切片之FKBP-12 在原位混交之暗視野光學顯微相片，而左圖顯示_[3H]FK506 之自動放射顯影圖。此等結果傺為對每一時間點做3次之重覆。第5圖傷顯示右顔面神經之Μ麻蛋白損害。Nissl染色 (底部，第5A圖）顯示出在m麻蛋白注射至顔面神經内7天之後，右顔面核内的蓮動神經元産生過度的退化並伴隨著神經膠質之增生。上圖（第5B圖）在顔面神經/核之Μ麻蛋白損害之後7天，FKBP fflRNA的在原位混交。此實驗至少做 3次之重覆而獲得類似之結果。第6圖為在壓碎之後7天，坐骨神經節段内之PH] FK506 結合。此圖顯示出所取出的3mm長神經節段：縊痕表示在第7天所施加的縛線之位置，以供如方法中所敘述的6小時收集時間之用。遠端的縛線位置係位在離最初_壓碎位置有10mm遠之處。FKBP之前進的蓮送傺為124mm/天。實驗數據為平均值±S.E.M* (n = 3)。第7圖為FKBP在坐骨神經内之蓮送。經由一對照組（未處理的）坐骨神經和一經7天壓碎處理的坐骨神經之FKBP-12 在原位混交（第7A圖、第7B圖.)以及[3H] FK506之自動放射顯影（第7C圖、第7D圖）的暗視野光學顯微相片。箭號表示神經壓碎之位置。此實驗至少做3次之重覆而獲得類似之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 12 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

T—、1T 523410 A7 B7 五、發明説明（/0 ) 結果。第8圖顯示在有或無NGF (50ng/ml)之存在下’ PC-12 細胞内所維持的[3H] FK506結合之位準。對於每一時間點，n = 3。柱表示。第9圔顯示免疫抑制劑調節的PO 12細胞之神經突長出的增進作用。在NGF以及加有或未加有FK506或雷帕黴素之之存在下，經生長48小時的培養物的Hof f man位差光學顯微相Η (64)。第9A圖：生長於I Ong/iiil NGF内之PC-12細胞。第9B圖：生長於50ng/ml NGF内之PC-12細胞。第9C圖 :生長於 l.Ong/nil NGF 與 100nM FK506 内之 P012 細胞。第 9D 圔：生長於 l.〇ng/ml NGF 與 lOOnM FKBP 内之 PC-12 細胞。放大倍率200X。第10圖顯示FK506對PC-12細胞内之神經突長出的作用。在有或無lOOnM FK506之存在下，以各種濃度的NGF來處理培養物，並於48小時之時測量長出的神經突。長出之定量分析偽如方法中所述的，藉由計數具大於5m ffl之神經突起的細胞數目。對於每個實驗之各個點，η = 4 $且誤差傜以SEM表示之。第11圖顯示FK5 06對PC-12細胞内之神經突長出的潛在能力之濃度-反應關偽。以Ing/ml NGF與各種濃度的FK506 來處理細胞歴時48小時。如第10圖以及方法中所述來測定神經突長出反應。對於每個實驗之各値點，n = 4。Student 氏 t試驗，wp<(K 001。第12圖顯示背根神經結的外植體培養物上的[3H]FK506 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 Α? Β7 五、發明説明（//) 自動放射顯影。在經過26天的lOOng/nil NGF之培養後，過量的突起展現出豐富的FKBP締合的銀粒。自動放射顯影粒被ImM未標識的FK506撤除之。第1 3圖顯示使用不同物質而生長的背根神經結之相位差顯徼相片。第1 3 A圔：N G F 1 0 0 ri g / m 1 ;第1 3 B圖：F K 5 0 6 ImM;第13C圖：FK506 UM以及抗~NGF抗體；第13D圖：未加生長因子；第13E圖：PK506 IpM;第13F圖：FK506 UM 以及雷帕黴素ImM。標度尺為205Mm。NGF生成豐富的軸突長出（第13A圖），ImM FK506亦然（第13B圖）。FK506之作用在其濃度降至1PM時會實質地減低（第13E圖）。但是，使用 IpM FK506時之神經突長出要比無其存在（第13D圖）時為高。FK5 06作用亦會被抗-NGF抗體之加入所減少，而消除培養物内由非-神經元的細胞所産生的N G F之作用。因應於N G F (100ng/ml)(第13A圖）或UM FK506 (第13B圖）而呈大型束而發生之豐富的神經突看起來為白色的，而小型束或個別的神經突看起來為黑色的。非-·神經元的細胞、施旺氏細胞（Schwann cells)和某些成纖雒細胞對於IpM FK506 (第 13E圖）或抗-NGF抗體（第13C圖）之反應，相較於ImM FK506 ，要更為明顯。在培養物内由非-神經元的細胞所産生的 NGF，造成在未加生長因子下所看到的有限的軸突長出（第 1 3D圖）◦看起來為白色的大量數目之可折射的非-神經元的細胞傾向於會遮蔽少數的神經突（第1 3D圖）。在FK5〇6之存在下，雷帕黴素完全地抑制軸突長出（第13F圖）。顯徼相Η傺為源自於各個實驗狀況的12-30個神經結之代表。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0'〆297公釐）- Μ (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（/)) 所有實驗組之間的差異偽為高度可重覆的。第14圖FK506與雷帕黴素對NGF-調節的p〇12細胞内之神經突長出的作用。單獨以各種濃度之N G F或再加有1 〇〇 n μ FK506、100 ηΜ 雷帕黴素或 1〇〇n}4 WAY_i24,466 來處理 PC-12 細胞（繼代培養60次）。在96小時之後，測量神經突起長出 ’並將帶有較細胞直徑為長的突起之細胞計分為陽性。對於每個實驗之各個點，n = 4，且誤差傺以SEM表示之。第15圔顯示10-η莫耳濃度之（Α) ρκ5⑽與（β)雷帕黴素以及WAY*"124，466能強化PC-12細胞内由MGF (〇*5ng/ml) 所激發之神經突伸展的作用。在各種濃度的FK506 ( □)、雷帕黴素（）或WAY-124,466 ()之存在下，以0 . 5ng/m 1 NGF處理低繼代培養的pc-12細胞歴時4天。如第14圔所述來定量分析神經突表現。在〇.5ng/nd HGF (標識為L)與50 ng/mlNGF (標識為H)之存在下，神經突生成的位準被示出，俾達比較之目的。第1 6圖顯不以免疫|貞林配位子+ 0 ♦ 5 n g / m 1丨彳G F本身或 50ng/nil NGF處理的P012細胞之光學顯微相片。第17圖顯示免疫葬林減少了要於雞感覺神經結内生成最高的神經突伸展所需要的NGF之數量。從9-1〇天大的雞胚分離出整個背根神經結（DRG)外植物，並於5¾ C0 2環境内於37ΪΓ下將之培養於有薄層Matrige卜塗覆的12井培養盤上，該等培養盤内含加有1"胎牛血清和高«萄糖之L1 5 培養基，且該培養基内亦添加有1〇mM Ara C、盤尼西林與鏈黴素。以 lng/ml NGF、lng/ml MGF + lOOnM FK506或者 1〇〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7__ 五、發明説明（/彡） ng/nil NGF來處理感覺神經結歴時48小時，並計數神經元的突起旦將之照相。第18圖顯示FK506、雷帕黴素與WAY-124,466會強化感覺神經結的HGF-依賴型神經突生成。如第17圖所述來培養雞DRG外植物。對DRG外植物培養物加入以FK506、雷帕黴素與 WAY~124,466 (各為 ΙΟΟηΜ，加或不加（Klng/ml NGF) 。在48小時之後，定量分析神經突長出並將培養物照相。第19圖顯示促進雞背根神經結培養物之神經突長出的實施例111的光學顯徼相片。三個圖顯示在1ί>Μ濃度（左圖）、ΙΟΟρΜ濃度（中間圖）與ΙΟΟηΜ濃度（右圖）的實施例111之下的神經突長出。第20圖顯示促進背根神經結培養物之神經突長出的實施例17的光學顯微相片。三個圖顯示在IpM濃度（左圖）、 100PΜ濃度（中間圔）與100ηΜ濃度（右圖）的實施例17之下的神經突長出。第21圖顯示促進背根神經結培養物之神經突長出的實施例102的光學顯微相片。三値圖顯示在IpM濃度（左圖）、 ΙΟΟρΜ濃度（中間圖）與100nM濃度（右圖）的實施例102之下的神經突長出。發明^詳細説昍本發明之新穎的神經營養性六氫吡啶羧酸衍生物化合物對於FK506結合蛋白質（諸如FKBP-12)具有一親和力。有一專一性之新穎神經營養性化合物。當本發明之神經營養性化合物被結合至FKBP，其等被發現會意想不到地抑制該本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-16 - (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

訂1. 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/〆）結合蛋白質之脯醯基肽醯基順式-反式異構酶活性或旋轉異構酶活性，且會意想不到地剌激神經突生長。本發明之化合物可以呈衍生自無機或有機酸或鹼之鹽類形式被使用之。包含在該等酸性鹽類内者為如下述者：乙酸鹽己二酸鹽、藻朊酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、璟戊烷丙·酸鹽、二《萄酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、 2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽以及十一烷酸鹽。鹼性鹽類包括銨鹽類、鹼金屬鹽類（諸如鈉鹽與鉀鹽.）、鹼土金屬鹽類（諸如鈣鹽與鎂鹽）、與有機鹼之鹽類（諸如二環己基胺鹽、N -甲基-D - g 1 u e a m i n e )以及與胺基酸之鹽類（諸如精胺酸、離胺酸）等等。又，鹼性含氮基團可以諸如下列之試劑而予以四元化：低級烷基鹵化物 (例如甲基、乙基、丙基以及丁基氯化物、溴化物與碘化物），二烷基硫酸酯（例如二甲基、二乙基、二丁基以及二戊基硫酸酯），長鏈鹵化物（例如癸基、月桂基、肉登蔻基以及硬脂醯基氯化物、溴化物與碘化物），芳烷基鹵化物 (例如苄基、苯乙基溴化物）等等。藉此可以得到水-或油-溶性或可散浮的産物。本發明之神經營養性化合物可被週期性地投藥至一因本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） -17 - (請先閲讀背面之注意事項再_舄本頁) 衣. 太、?τ· 523410 A7 B7 五、發明説明（/s) 神經學障礙或其他原因而在進行治療之病人，其中希望能夠剌激諸如與神經退化有關的各種周邊神經病變以及神經學障礙内之神經元的再生與生長。本發明之化合物亦可被投藥至人類以外之哺乳動物以供各種哺乳動物的神經學障礙之治療。本發明之新穎化合物偽為旋轉異構酶活性之有力的抑制子並且具有一極佳·程度之神經營養性活性。此活性可用於受損的神經元之剌激、神經元再生作用之促進、神經退化作用之預防以及數種已知與神經元的退化和周邊神經病有關的神經學障礙之治療。可被治療之神經學障礙包括但不限於：三叉神經痛，舌咽神經痛，貝爾氏癱瘓，重症肌無力，肌營養不良，肌萎縮性側索硬化，進行性肌萎縮，進行性延髓遣傳的肌萎縮，脱出的、破裂的或脫垂的無脊柱盤症候群*頸椎骨離解，叢障礙9胸廓出口破壤症候群，諸如那些由鉛、達普松（d a P s 〇 n e)、壁蝨，ρ Γ 〇 y y r i a或 Gullain-Barrg症候群所引起之周邊神經病變’阿滋海黙氏症以及帕金森氏症。經濟部中央標準局員工消費合作社印製為達此等目的，本發明之化合物可以下列方式予以投藥之：口服地，腸道外地，吸入噴霧’局部地’直腸地，鼻部地，口頰地，陰道地，或經由一個呈含有傳統的無毒性藥學上可接受的載劑、佐劑與載體之劑量配方形式的植入的儲槽。此處所用的、、腸道外的〃此詞包括皮下的、靜脈内的、肌内的、腹腔内的、椎骨内的、室内的、胸骨内的以及顱内的注射或注入技術。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-18 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（/< ) 為能在治療上成為有效的中樞神經条統標的，當被周邊地投藥時，本案免疫菲林-藥物複合物必需能容易地穿過血腦障壁。不能穿過血腦障壁的本發明之化合物可藉由室内的途徑而被有效地投藥之。本案藥學組成物可呈一無菌可注射的製品之形式，例如一種無菌可注射的水性或含油的散浮液°此散浮液可依據本技藝已知的技術，使用適合的分散劑或濡濕劑以及散浮劑而予以配方之。該無菌可注射的製品亦可為一配於一無毒的腸道外可接受的稀釋劑或溶劑内之無鐘可注射的溶液或散浮液，例如一種配於U 3 - 丁二醇内之溶液。可被使用的可接受的載劑與溶劑中者有水、林格氏（Ringer^s)溶液以及等張的氯化銷溶液。此外，無菌的安定油被傳統地使用以作為一溶劑或散浮基質。為達此目的，可使用任何廠牌的安定油，包括合成的單》或雙-甘油二酸酯。諸如油酸及其甘油酯衍生物之脂肪酸發現有用在製備可注射的撖欖油或Μ麻油，特別是其等之聚環氯乙烯化形式。此等油溶液或散浮液亦可含有一種長鏈醇稀釋劑或分散劑。. 本案化合物可以例如呈膠囊或劑錠或如一水性散浮液或溶液之形狀而被口服地投藥之。就供口服用的劑錠之例而言’平常所用的載劑包括乳糖與玉米澱粉。諸如硬脂酸鎭之潤滑劑亦被典型地應用之。為供呈一膠囊形式之口服投藥’可用的稀釋劑包括乳糖及乾燥的玉米潑粉。當需要口服用之水性散浮液時，將活性組份與乳化劑和散浮劑組合之。若需要，可以添加某些香化劑和/或調味劑和/或染 β氏張尺度適财關家轉（CNS ) Α4規格（210X297公釐)-19 — (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 1訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 _ B7___ 五、發明説明（/^) 色劑。本發明之化合物亦可以呈供藥物的直腸投藥用之栓劑形式而被投藥之。此等組成物之製備可藉由令藥物與一適當的無刺激性賦形劑相混合，該賦形劑在室溫下為固體但在直腸溫度下則為液體，而因此會在直腸道内溶解並釋出藥物。此等物質包括椰子油、蜜蠟以及聚乙二醇。本發明之化合物亦可被光學地投藥之，特別是要予以治療的狀況渉及可藉由局部施藥而容易地接近之區域或器官，包括眼、皮膚或下腸胃道之神經學障礙。可容易地製備出供各個此等區域用之合適的局部配方。為供眼用，本案化合物可以被配方成配於等張的調過 pH值之無菌生理鹽水内之微小化的散浮液，或較佳地，配方成配於等張的調過pH值之無菌生理鹽水内之溶液，加有或未加有諸如节基a 1 k 〇 n i u in氯化物之防腐劑ϋ任擇地，為供眼用，本案化合物可被配方在一諸如凡士林之油膏内。為供皮膚之局部使用，本案化合物可以被配方在一含有被散浮或溶解的化合物之合適的油膏内，例如一種具有下列一或多者之混合物：礦物油、液體凡士林、白色凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯化合物、乳化蠟及水。任擇地，本案化合物可以被配方在一含有被散浮或溶解的化合物之合適的洗劑或乳霜内，例如一種具有下列一或多者之混合物：礦物油、山梨糖醇酐單硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟芳基醇、2 ~辛基十二烷醇、苄基醇以及水。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-20 - (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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523410 B7_____ 五、發明説明（ΛΓ) 、供下腸胃道用之局部應用可以一直腸栓劑配方（參照上述）或一適當的灌腸配方來産生效用。活性組份化合物在大約0. 1 mg至大約10, OOOmg之级數的劑量位準可供用於上述病症之治療，而較佳的位準是大約0 * 1 m g至大約1 , 0 0 0 m g。可與載劑物質結合而形成一個早一劑量形式之活性組份之數量，會隨要治療的宿主以及特定的投藥模式而變化。但是可以暸解到，對於任一特定的病人之一特定的位準會隨各種不同的因子而變化，包括所使用的特定化合物之活性、年齡、體重、一般的健康狀態、性別、飲食、投藥的時間、排洩之速率、藥物組合以及要治療的特定疾病之嚴重性和投藥的形式。本案化合物可和其他的神經營養性試劑，諸如神經營養性生長因子（NGF)、神經膠質衍生的生長因子、腦衍生的生長因子、纖毛神經營養性生長因子以及神經營養素~3 ，一起被投藥之。其他的神經營養性藥物之劑量位準將會視先前所述之因素以及該藥物組合之神經營養性有效性而定。方法海處理稈序坐骨神經壓碎此實驗證明在正常的周邊神經内之高FKBP位準以及其等在神經壓碎後之增高。若FK506於GAP-43之作用中與神經元的突起伸展係為生理上相關的，那麼吾人卽可能預期在周邊神經内會有實本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

、言 523410 組織 A7 B7 五、發明説明（/^) 質彳δ準的fkbp。於是，本案發明人測定大白鼠坐骨神經和分離自兩天大的大白鼠幼兒之生長錐内之[3H]FK506結合 ’ 1與得自於大腦皮質以及數種周邊組織之數值作比較。如1所述在未經固定的切片上進行[3H]FK506自動顯影 ’該等切Μ先予以解凍並空氣乾燥之，再於一包含有下列組份<£ I變衝液内予以預培育1小時：5 0 m Μ H e p e s、2 ffl g / m 1 牛血清白蛋白、5%乙醇以及（K 02% Tween 20，pH 7* 4。接而在室温下，於該預培育緩衝液内將該等切Η暴露於InM [3H]FK506 (86·5Ci/fflMol;DιιPont-NEE,Boston,MA)歷時1小時。非專一性結合之測定偽藉由加入UM FK506。在培育之後，於冰冷的預培育緩衝液内清洗玻片4x5分鐘並空氣乾燥之。接而令經放射標識的切片與氚敏感的底片或塗覆有Kodak NTB-2乳劑之蓋玻片並列之。表 I , 至坐骨神經與生長羅之[3H] FK506結合 U)在坐骨神經内之[3H]FK506結合 B in a X (p m ο 1 / κι g 蛋白 μ ) (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太 —訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製經質鼠鼠神皮白錐白骨腦腺臓大腦長大坐大胸脾的前生年生成新 105 0 2898 (B)在坐骨神經壓碎之後的[3H] FK506結合 B me X B ma x 蛋白質（化〇1/51!11〇節段:）（pmol/fflg) 31.8 ± 2,1 136,5 ± 15.7 21.2 40· 1 如方法中所述的來分析[3H]FK506結合。在表ΙΑ中，實驗被重覆3次而徧差值低於10¾。在表ΙΒ中，數值隹以奉岛值± S E M ( n = 3 )表示之。ii於別έ勺伞均i直， * P < 0* 0 0 1 (S t u d e n t 氏 t 試驗）。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（cns )M規格（2 ι〇χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 _ B7 五、發明説明U〇) 在所經經撿查的組織中，坐骨神經結合位準傺為最高者，要比大腦皮質所具者高些且比胸腺與脾臟（此等含有與淋巴細胞相關的FKBP)所具之位準要高大約1〇倍。參照表1 A。關於FKBP在神經再生中之角色的證據來自於本案發明人所進行的實驗，其中成年的大白鼠坐骨神經被壓碎，並於7天之後測定一個近處於神經壓碎區的5nm長之節段内的 [3H]FK506結合。以一由 R 〇 in p (1 η (1 2 in k / k g )與 K e t a m i n e (3 0 m g / k g ,)所構成的混合物將Sprague _Daw ley大白鼠（ 175-200g)麻醉。使用無菌技術，以寶石商鑷子2x30 sec，從莖突與乳突孔將顔面神經離其出口 2πιιτ遠之部分予以壓碎。使用相同的處理程序而將位在與中段股骨等高處之坐骨神經壓碎。在鄰近於壓碎處之節段的總結合是其所相較的對照組之四倍。由於在該鄰近的節段内總蛋白質被實質地增多，在該鄰近的節段内每毫克蛋白質的[3H] FK506結合僅增高兩倍。顔而神經壓磁此實驗證明顔面神經損害會增大FKBP與GAP-43之同時的表現。在顔面神經的壓碎之後，位在顔面神經核内的G AP-43 的mRN A位準增高。使用在原位的混交，本案發明人撿查在顔面神經的壓碎之後的FKBP、GAP-43與鈣神經素之mRNA位準。 (請先閱讀背面之注意事項再_舄本頁)

訂·

523410 A7 B7 五、發明説明（n/) 大白鼠被跨心臓地灌注以150-200ml冰冷的磷酸鹽-緩衝的生理鹽液（PBS, (Κ 1M，pH 7, 4)。移出組織並立即將之冰凍於異戊烷内（-80°C )。切出冷凍切H (1δ_厚），並將之置於塗覆有明顧之玻片上解凍之。如先前所述之方法，使用端部被標識以[35S]dATP之反訊息寡核苷酸探針來進行在原位的混交。對於FKBP，使用3個互補於下列掲露於Maki et al , (1990) , Proc, Nat 1 .

Ac.ad..^..._.Sc.i USA . 8 7 : 5 4 40 ™ 5 4 43 與 H S1: a n d a e r t e t a , (1990)，Nature , 348 ： 67 1 -674 (此等文獻在此併入本案以為參考文獻）之選殖出的cDNA區域的分開之寡核苷酸：7 0- 114、214-258與 441-485。對於 GAP-43，使用 3個互補於下列掲露於 Rosenthal , A. , et al (987)，EMBO J、，6_： 3641 -3646 (此文獻在此併入本案以為參考文獻）選殖出的 eDNA區域的分開的反訊息寡核苷酸：96 1 - 1 008、1081-1128 與1201-12 48。對於鈣神經素Α σ，使用互補於掲露於Ito e t a 1 , (1989 )，B i 〇chem > B ί 〇 p h y s > Res, C〇 nunu n , , 1 63_： 1492-1 497 (此文獻在此併入本案以為參考文獻）之核苷酸 1 363-1410與171 1 -1758的反訊息寡核苷酸，以及對於鈣神經素 A/3，使用掲露於 T* Kuno et al*(1989:)，B i 〇 cJmjiU· R—^ Res· Commuri.，165 ： 1 3 5 2 - 1 3 5 8 (此文獻在此併入本案以為參考文獻）之核苷酸1339-1386與1569- 1616 的反訊息寡核苷酸。將切片解凍並使之空氣乾燥，接而以配於PBS内之新鮮去聚合化的多聚甲酲内將之固定5分鐘。之後以P B S冼滌兩次，以配於三乙醇胺内並含（K 5 % N a C 1的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 舄太 .經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 ___ ___ B7 五、發明説明（》) 〇 · 25¾醋酸酐（ p[i 8 . 〇 )將切片乙薦化，並接而於經分级的醇内it行脫水，於氯仿内去脂5分鐘，以95%乙醇予以再水化’並使之空氣乾燥。在37t:下於含有下列組份之緩衝液内進行混交過夜：50¾去離子的甲醯胺、10%«聚糖硫酸酯 '' 4X SSC、IX Denhardt氏溶液、20mM磷酸鹽緩衝液、0.1 rag/ml鮭魚精子{)|^、酵母菌轉移RNA、10 —二硫蘇糖醇、2 · 0%/?-競基乙醇UMD)、L· OmM EDTA以及經標識的探針（2,〇〇〇,〇〇〇(^01/切片）。在混交之後，於室溫下令切片在IX SSC、1. (UBMD内洗滌歴時15分鐘，接而於55°C 下洗兩次，將之空氣乾燥並置於底片上或者浸在Kodak NTB-2乳劑内。觀察到FKBP與GAP-43表現之明顯的增進，而鈣神經素之表現則無明顯的變化。就在.顔面神經壓碎之後24小時起，FKBP表現明顯地在1至2週時即有呈波峰位準的增高，而 ml? N A濃度在第3週時實質地減少。在較高倍率下之撿查顯示出，相關於FKBP mRN A的銀粒之增高的位準局限在神經元的細胞本體（第2圖）。經解剖.的顔面核之北向沾移分析法確證了 FKBP專一性inRNA之增高的位準。GAP-43 mRNA位準跟隨一與F K B P之位準密切相闊的時間期。相對地，在所撿查的各時間點沒有偵测到鈣神經素表現之變化。將源自於經解剖的顔面核之細胞總RNA予以分離出。令含有10或20/ig的總RNA之樣品於一含有1¾瓊脂糖、2.0¾ 甲醒之凝膠上電泳，並將凝顧轉移至一位於l〇nM NaOH内之尼龍膜。針對FK5 06並藉由隨機引導（Priming)而被標識本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2l〇X297公釐）- 25 - (請先閱讀背面之注意事項再_舄本頁) 訂 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（>3) 有至一為1%1〇3〇0!11/以之[353]€1(：1?專一性活性的（^“探針，在42 °C下於一包含有下列組份之緩衝液内被混交過夜： 50¾甲醯胺、2X SSPE、7%SDS、（K5%Blot'to以及 lOOMg/'ml 鮭魚精子DNA。沾移物於（K 15)( SSC、0. 15«DS内在室溫下予以洗滌歷時20分鐘，並於65 t下洗灌2x15分鐘，接而將之暴於底Η歴時48096小時。在未受損害之側觀察到，相較於對照組，銀粒有一些微之增高。這與對側的神經元亦會對切開術（jUotomy )有反應之發現是相一致的。在顔面神經壓歳之後，大白鼠發展出一種顔面神經麻痺，這可由缺乏腮鬚移動而證實，並隨著3週的神經再生完成之後即産生功能的復原。在本案發明人之大白鼠中亦觀察到在神經壓歲之後腮鬚移動之喪失，並在3週之後有一功能之回復。因此，GAP-43與FKBP之增高的表現之時間期，與神經再生之過程是相關的。坐骨神經再牛此實驗證明與坐骨神經再生有關的FKBP和GAP-43之變化。在坐骨神經損害之後，GAP-43 mRNA位準於脊髓蓮動神經元和背根神經結神經元細胞内均被增高之。對於接受坐骨神經壓碎之大白鼠，本案發明人觀察到，在L4, 5 (第 3圔）下於蓮動神經元内以及在背根神經結神經元細胞内， FKBP之mRNA位準有一明顯的增高，這與已被報導的GAP-43 表現之增高（第4圖）傜相一致的。在背根神經結之原發性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再？^本頁)

、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 _____B7________ 五、發明説明U/) i®覺神經元内偵測到增高的FKBp，雖然在坐骨神經損害之後於蓮動神經元内無明顯的增高。增高的FKBP表現與再生之相闋性選擇性地被使用Μ麻蛋白之實驗予以進一步支持之。當被注射至周邊神經内， II麻蛋白被蓮送回已被破壞而無相闊的神經再生之細胞本體内°本案發明人依s t r e i t與K r e u t z b n e r g之方法ί S t r e i t e t a 1 ( 19 8 8 ), J , Comp. H ^ u r ο K , 268:248-263)，將配於〇· 5mI PBS與1%堅牢綠内之（K 5Mgg麻蛋白（RCA 60, Sigma，St * Louis，MO)注射至已在其他實驗中進行壓碎之相同位置的顔面神經内。在Μ麻蛋白處理之後第2、4及7天，本案發明人進行 FKBP mRHA的在原位混交定位化。在蓖麻蛋白處理之後未觀察到FKBP dNA之增高。在Μ麻蛋白處理以及神經壓碎之後會發生神經膠樣變性。在Μ麻蛋白處理之後沒有産生 FKBP mRNA之增高，符合顔面核内之FKBP mRNA的選擇性神經元定位化。存坐骨神經内> F K R P薄铁此實驗證明FKBP被快速地蓮送至坐骨神經内。在坐骨神經壓碎之後，雖然FOP mRNA有增但蓮動神經元内的FKBP蛋白質沒有增高之事實暗示該蛋白質被快速地蓮送至細胞本體外並進入神經突起内。這符合較早的發現：FKBP fflRNA被集中在含有低位準的FKBP蛋白質之小腦顆粒細胞内，而FKBP蛋白質被高度地集中在位於在小腦内並與衍生自顆粒細胞的平行纖維有關之分子層內。為了撿本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁) 訂 523410 A7 B7 五、發明説明（>o 查FKBP之可能的蓮送，本案發明人將坐骨神經壓碎並於7 天之後對鄰近壓碎處有1 〇與20 mm之遠的部位施以縳線。在縛線處理之後6小時，本案發明人監測距縳線位置3«遠之區域内的節段内之[3H]FK506結合（第6圖）。關於軸突蓮送實驗，遵照Tetz laf f等人之方法使用傳統的縛線技術。在坐骨神經壓碎之後1週，將兩個收集縛線（510縫線）置放在神經上並相距大約遠，且將最遠端的縳線放在離最初壓碎位置lOinni遠之處。6小時之後，如第5圖所示的，自該等收集縛線之近端、遠端及中間區域收集5-3mni的神經節段。藉由在10倍容積的50mM Tr is-HCi (PH 7,4)内均質化來製備該等節段以供[1]^506結合分析。在4 ':C下以15, 000xg來離心均質液歴時20分鐘，收集上澄液並使用孔瑪西籃（Coomassie blue)染料結合分析法（Pearce)來分析總蛋白質濃度。如（4)所述，於配於一最終容積為（K4ml分析緩衝液（含有50mM Tris-HCl (pH 7 * 4)、2 in g / m 1牛血清白蛋白、2 5 0 ρ Μ [3 Η ] F K 5 0 6以及濃度有變化的未標識的FK506)内並含有2Mg的總可溶性蛋白質之整體部分來進行[3H] FK506結合分析。在25¾下塔育60 分鐘之後，將0 . 3 5 m 1層放在一個0 · 8 m 1的L Η ~ 2 0 S e p h a d e X (P h a r m a c i a L K B )管柱上，並以0 · 4 in 1的分析緩衝液清洗之。收集洗提液並於一個閃爍計數器内計數之。結果示於第5圖中。在鄰近於離壓碎處遠的縛線之節段内之PH] FK506結合位準最高，幾乎為其他節段的四倍量。依據節段A-D内之[3H] FK506結合位準，本案發明本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再· — -tr^^ 本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（％) 人δ彳算F K B P之前進的蓮送速率。此為1 2 4 m m /天之速率大致丰目等於GAP-43之蓮送速率，而代表神經元蛋白質之最快的蓮送速率。為視觀在神經壓碎之後的FKBP蓄積，本案發明人施加一鬆弛的縳線以標示出坐骨神經之壓碎位置，並進行FKBP fflRNA之在原位混交以及[3H]FK5062自動放射顯影（第7圖）。大多數的FKBP irRNA以及[3H] FK506結合蓄積在緊鄰近箸 _碎之處。此等位準比對照組未壓碎的坐骨神經内所具者要高得多。在高放大倍率下之在原位混交以及自動放射顯影之撿查顯示出與神經元纖維有關的銀粒。在本案發明人無法明確地確認之細胞上亦坐落有銀粒，因而該等細胞有可能是施旺（Schwann)細胞、巨噬細胞或成纖維細胞。

E_C12細胞内的FOP 此實驗證明PC 12細胞含有FKBP，而且神經生長因子會增高FKBP位準。本案發明人藉由在鹼性狀況下以及在神經生長因子（NGF)之處理後，監測[3丨Π FK506至細胞之結合來撿查PC 12細胞内的FKBP之存在。 ?(：12細胞内的「〇『>位準像藉由[3〖丨]?1(506結合曲線之 Sea tchard分析而獲得者。從培養并刮出培養物並於10倍容積的 50mM Tris-HC1 (PH7.4)、ImM EDTA、lOOMg/ml 苯基甲基磺醯氟内，在4°C下以40,000xg予以離心歴時20分鐘。使用孔瑪西籃染料結合分析法來測定蛋白質，並以牛血清白蛋白作為一個標準。對配於一最終容積為0.4m 1分析緩衝液（:含有 50raM Tr is-HCl (pH7. 4)、2mg/inl BSA以及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再iPr本頁) 太、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明D^) 濃度有變化的未標識的FK506 )内並含有5Mg的可溶性蛋白質之樣品來進行 250pM [3H]二氫 FK506 (86 , 5C i/mmo 1 , DuPont/NEtO之結合：|在25t〕下培育60分鐘之後，將0*35 in 1層放在一個以分析緩衝液予以預平衡過的〇 · 8m 1的LH-20 S e p h a d e X (P h a r m a c i a L K B )管柱上。該管柱以 0 * 4 m 1 的分析緩予以進一步衝液清洗之，收集洗提液，將之與配方963 (DuPont/NEN)混合，並於一値Beckman閃爍計數器内計數之。專一性結合之測定傜藉由從[3 Η ] FK506總結合扣除掉。在未標識的FK506之存在下所獲得的結合。結果示於第8圖中。[3H]FK506飽和地結合至未處理的 PC-12細胞均質物。在典型的實驗中，大約有1 , 〇〇〇ephi被結合，而在1 Μ M F K 5 0 6之存在下的非專一性大約為1 5 0 c p in 。使用l-2nM FK506會發生50%的[3H]FK506結合抑制作用，這表示結合位置傺對應於真正的FKBP。[3H] FK506結合在NGF處理後顯著地增高◦顯著的增高在m 5小時之時是明顯的。在20小時之時的結合達致3倍，而在100小時之時明顯地有一溫和的再增加。 P C - 1 2細胞内的增加的神經空油展此實驗證明FK506與雷帕黴素會增加pc-12細胞之神經突伸展。在37Ϊ〕及5%C〇2下，將pC —丨2細胞維持在杜貝可氏改良的伊格氏培養基（DMEM)内，該培養基添加有10%熱去活化的馬血清以及5¾熱去活化的胎牛血清。關於NGF之分化，將IxlO5個細胞平盤培養在以5Mg/effl3的大白鼠尾部膠原蛋本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再^T本頁)

523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明d) 白塗覆過的35fflin培養井内，並使之貼附後再加入添加有2¾ 胎馬血清、NGF和/或FK506或雷帕黴素之培養基。關於神經突長出之定量分析，隨意抬取相片（每井3至4張），並計數具有長於m的突起之帶有突起的神經元。泊照者與計數者不知道實驗狀況。對於每個出示的數據點，進行4個分開的實驗並重覆2次。神經突偽從每張相片之大約100個細胞中予以鑑定出並計數之。因此，對於每値數據點偽計術源自於1200-1600個細胞之神經突。如所觀察的，NGF有力地剌激神經突長出，在In g/ml 下為半數的最高刺激作用，而在50-100ng/ffll下為最高量之增加（第9圔、第10圖）。FK506 (ΙΟΟηΜ)藉由增高對NGF 之敏感性而顯著地增高NGF之作用。因此，FK506可以減少達20 -50倍之激發最高量長出所需要的}(0卩濃度。在無卩{(506 之存在下，半數的最高量長出發生在lng/ml NGF，而在有 FK506之存在下，半數的最高量長出發生在（Klng/ml NGF 。在NGF之最高濃度（lO-lOOng/inl)下，FK506無法産生額外的神經突長出。 FK50 6之神經營養性作用傷相當有力的。在一次最局濃度的NGF (lng/m:l)之存在下’ FK506在lng/ml下會激發使用50ng/ml NGF所觀察到的相同最高量長出（第11圖）° FK506之半數的最高量作用發生在大約ΙΟΟρΜ。在無NGF之存在下，FK506無法激發神經突長出（第1〇圖.）。雷帕黴素是一種有力的免疫抑制劑’其不被認為是經由鈣神經素而發揮作用，但其可能會影響其他的磷酸化生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 太 ;—訂 523410 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（工7) 物階反應。雷帕黴素有力地逼阻經由FKBP與鈣神經素而發生的FK506之作用，據推測雷帕黴素係藉由作為在FKBP處之一種FK506拮抗劑而産生作用◦雷帕黴素（ImM)無法遏阻 FK506之神經營養性作用。相對地，雷帕黴素本身在InM下是神經營養性的，並提供主要的神經突長出。雷帕黴素與 FK5 0 6似乎是經由不同的途徑來發揮作用。因此，雷帕黴素增加突起之數目及其等之長度，而FK506主要是增加神經突長度。更甚者，FK506與雷帕黴素之作用似乎是可相加的。背根神經結此實驗證明FK506對於感覺神經結是神經營養性的。本案發明人撿查FK506在源自於16天大之大白鼠胚胎的背根神經結之初級培養物的作用。從懷孕的S p r a g u e - D a w 1 e y大白鼠移出Ε 1 6期之胚胎，並解剖出背根神經結。將整個背根神經結的外植體培養物培養在膠原蛋白塗覆過的3 5 m m培養井（F a 1 c ο η )内，使用N 2 培養基（以1 : 1比例混合的杜貝可氏改良的伊格氏培養基與漢氏（Haf s)培養基，並添加有黃體酮、Se、胰島素、腐胺、葡萄糖以及青黴素-鏈黴素），培養在37 υ及1 5¾ C0 2 環境下。以不同濃度的NGF和/或FK506或雷帕黴素或抗-NGF 抗體來處理感覺神經結。每隔2-3天使用Olympus ΙΜΤ-2倒立式顯微鏡在相位差下觀察神經結，並進行軸突長度之測量。各個神經結之軸突視野被分割成四値象限，並使用一個目鏡測微計來測量各個象限内之最長的軸突之微米長度本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 —___ B7 _ 五、發明説明) 。此等測量之平均值被拿來作為神經結之軸突長度。關於[3H]FK506自動放射顯影，令背根神經結培養物生長在以5Mg/cm3膠原蛋白塗覆過的凹室玻片上。以配於〇 · 1M磷酸鈉緩衝液（PH 7.4 )内之冰冷新鮮去聚合化的4%多聚甲醛將培養物固定在波片上歴時1小時、，之後以PBS洗滌兩次。經固定的培養物之P Η ] FK506檫識傜如下進行之。於一包含有下列組份之緩衝液内予以預培育該培養物：50 m Μ H e p e s、2 m g / in 1 牛血清白蛋白以及 0 * 0 2 % Ί w e e η 2 0 5 ρ Η 7·4。之後將之培育於含有InM [3H]FK506的相同分析緩衝液内。非專一性結合之測定偽藉由添加1/ιΜ未標識的FK506 。接而在乾燥之前，將玻片洗灘4x5分鐘，並將之與氚_敏感的底Η並放歷時10天。 PH]FK506結合位置之自動放射顯影顯示出，位在神經結内之FK506締合的銀粒之位準（第12圖）。在ImM未標識的FK5 06下，自動放射顯影粒被撤除而表示出結合專一性。如先前所報導的，NGF (100ng/nl)顯著地增加神經結突起的數目與長度（第13圔）。FK5.06 (ImM)本身會産生一類似的神經營養性作用，而低至InM的FK506會産生一顯著的生長增加。其會發揮一種FK506拮抗劑之作用的雷帕黴素 (UM)完全地逼阻FK506 (UM)之作用，因此FK506之作用展現出一種FKBP的藥物專一性特徵。當「1(506在無添加的《0?之存在下無法剌激？(：-12細胞之神經突長出時，FK506本身在感覺神經結内傺為神經營養性的。神經結内的施旺細胞可以製造NGF，而施旺細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明〇/) 所生成的傜受一種蛋白質磷酸化現象之調節。為確定是否 FK506本身之作用會渉及到内源性NGF之強化，本案發明人撿查針對NGF的抗體之影響（第13圖）。抗-NGF顯著地減少 F K 5 0 6 (Μ )之神經營養性作用ϋ該抗-M G F不是呈一毒性方式而作用，因為本案發明人觀察到，在有或無添加的NGF 之存在下，被暴於抗-NGF的細胞中沒有出現形態上的毒性證據。 FK506在剌激神經突長出上是非常有力的。低至1ΡΜ的 FK506會産生可偵測的增加作用。漸進地增大之長出出現在〇· 1與10nM FK506 (數據未示出），而最高量的長出需要的 FK506 〇在所有的NGF與FK506之濃度下的神經突長出之時間期偽類似的。有些長出在1天時即很明顯，而在大約5-6天時生長開始達至平高線。 FK5 06神經營養性作用涉及位在感覺神經結内之FKBP (FK506結合蛋白質），因為FK506之作用會被低濃度的雷帕黴素（F K 5 0 6在F K B P處之一種已知的括抗翔(）所逆轉。雷帕黴素在PC〜12細胞内無法遏胆FK506作用可能反映出雷帕黴素之分開的剌激性作用。關於雷帕黴素在12細胞内對神經突長出之剌激性作用並未即地明白。雷帕黴素的免疫抑制劑作用被認為傺渉及了 PK506所具者以外之不同的機制。雷帕黴素可以抑制會磷酸化S6核糖體次單位之S6激酶。雷帕黴素亦會抑制磷脂醯肌醇激酶。蛋白激酶C (PKC卜調節的磷酸化已被顯示於神經再生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再ΙΡτ本頁)

、一一-口 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（；>) 期間之突起長出。其他的證據暗示PKC在神經元的突起伸展中之抑制性作用。 GAP-43是一被高度集中在神經突内之顯著的鈣神經素基質，旦其磷酸化係受FKBP所調節。GAP-43可能未有直接地涉及神經突伸展，因為具低位準的GAP-43之P012細胞株展現出正常的神經突長出。但是，GAP-43及其磷酸化可能涉及於將神經突標地化，因為當神經突接近其等之標的時，經磷酸化的GA卜43之位準會被增高。GAP-43之磷酸化亦可能影響到會調節神經突伸展之Ca + 2的移動。經磷酸化的GAP-43會抑制磷脂醯肌醇雙-磷酸形成作用，這應會減少肌醇1，4，5 _三磷酸之位準以及相關的Ca + 2釋出。此外， GAP-43之磷酸化會減少其對calinodiiliri之親和力，所産生的結果是可結合至Ca + 2的自由cal mo dul in之釋出。免疫菲林可在鈣神經素以外之位置處發揮作用，該鈣神經素會影響到會調節神經突長出的Ca + 2。FKBP可結合至 ryanodine受體，該受體傺為一値Ca+2釋出通道。在骨骼肌肌質網内，FK506將FKBP從ryanodine受體解離出而促進 Ca〃誘發的Ca〃釋出機制。此外，FK506在其他包括FKBP25 類固醇受體以及其他未鑑定出的標的（諸如那些與FKBP 13 有關者）之位置處會發揮作用。因此，其他潛在的機制可能在神經突伸展中扮演某種角色。笄疮雜林^非-劳疼抑制型斑第痔沏制型配位子會刺激Ρ Π -1 2細_之神經突長出在本研究中，本案發明人詳細地檢查免疫葬林之多種本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35 - (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂1- 523410 A7 B7 五、發明説明（）3) 配位子對於PO 12細胞以及完整的雞感覺神經結内之神經突伸展的作用。本案發明人報導非"·免疫抑制型與免疫抑制型配位子在增加P〇 1 2細胞以及感覺神經結内之神經突長出上傺為非常有力的。在本案發明人之較早的研究中已發現免疫抑制劑會藉由使神經生長因子（HGF)之潛力增加大約10倍而剌激PC-12 細胞内的神經突長出（L y ο n s e t a 1 .，1 9 9 4)。在無添加的 NGF下，未觀察到神經營養性作用。在本發明研究中，本案發明人評估免疫抑制性藥物FK506與雷帕黴素在0. 1-100 .ng/ral的NGF之存在下，對於PC-12的神經突長出之作用。在無添加的NGF下，無一藥物會剌激神經突長出。在 O.lng/ral的NGF本身下，會産生一小量的神經突伸展，該量僅為在50ng/iiil下之顯著的最高量作用之15%。雷帕黴素會刺激神經突長出達到一較其他的藥物為高之程度，其在 O.lUng/ifll的NGF下會有3-4倍之剌激作用。由雷帕黴素所激發之增加作用的程度會隨較高濃度的NGF而減小，且在5-50ng/ml的NGF下是不具統計顯著性的。FK506亦為在較低的NGF濃度下具有神經營養性作用者，而其最高的2-5 倍之神經突長出的增進作用，是在〇.5ng/iEl的NGF下方為顯箸的。有三群在結構上與環孢菌素A、FK506和雷帕黴素相關的主要結構免疫抑制劑藥物。雖然FK506與璟孢菌素Α結合至明顯不同的免疫葬林蛋白質，此二者藉由抑制鈣神經素而發揮免疫抑制劑之作用。雷帕黴素以非常高的親和力結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再_馬本頁) %—訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 Α7 Β7 五、發明説明（乂〇合至FKBP-12，但該藥物-免疫葬林錯合物不會隨而結合至數神經素。相對地，免疫抑制作用傷源自於結合至一個最近被鑑定出並選殖出的蛋白質之雷帕黴素-FKBP-12錯合物，該蛋白質被命名為RAFT-1 (雷帕黴素與FK506之標的），亦被命名為 F R A P (S a b a t ί n i a n d S y n d e r，1 9 9 4 ; B r 〇 w η et a 1 , , 1994 ; Cher! et a L , 1994)。由於雷帕黴素有力地結合至FKBP-12但不會抑制鈣神經素，其可供作為FK506 之一拮抗劑。存在有雷帕黴素之非-免疫抑制型衍生物° 此等當中之一者，WAY-12L 466 (雷帕黴素之一個三烯衍生物）會以高親和力結合至FKBP-12並且抑制旋轉異構酶活性，但缺乏免疫抑制性作用◦環孢菌素A傺為一種大型璟狀十一肽。僅在位置6處之丙胺酸處加入一個甲基會形成一個不會抑制鈣神經素且缺乏免疫抑制性作用之試劑，雖然其會抑制環菲林之旋轉異搆酶活性至一類似於環孢菌素A 之程度（Me CsA ref)。為確定是否神經營養性作用會需要孝疫抑制性活性’ 本案發明人使用非-免疫抑制性WAY-124,466來比較FK506 、雷帕黴素以及璟孢鐘素A之神經營養性作用’並在PC - 1 2 細胞作一廣範圍的濃度之評估（第15圖、第16圖）。所有的研究像在0 t 5ng/ra 1 NGF之存在下予以進行的。如先前所觀察到的，FK506非常有力地剌激神經突長出，在〇下達致半數的最高量剌激作用，並在5 - 1 00 η Μ下達致最高量的剌激作用。雷帕黴素傜為撿查過的最有力之試劑，並且産生最高本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再ipc本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 37 523410 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明位準之神經突長出。在重覆的實驗中，50¾的最高量伸展在大約0 · 2-0，4 η Μ下即已明顯可見，而最高的作用顯現於大約10-ΙΟΟηΜ。使用雷帕黴素之最高的神經突伸展傺相當於50”/1111別？之最高的作用。1“¥-124,466亦為神經營養性的’但效力較弱並且産生一較雷帕黴素為低的最高剌激作用。使用WAY-124,466之半數的最高量刺激作用出現在大約10nM ’而最高量的剌激作用出現在丨⑽™〗，〇〇〇nM。因此’雷帕黴素比WAY-124, 466要強過大約1〇〇倍，類似於在結合至FKBP-12之效力要高出40倍（表I )。環孢_素A在剌激神經突長出上之效力實質上比FK506 或雷帕黴素為弱，這相應於其在抑制旋轉異搆酶活性上亦是實質上較弱的效力。使用環孢菌素/^之50%最高的神經突長出刺激作用出現在大約50ηΜ，而最高量的剌激作用出現在100ηΜ ’且在更高濃度的環孢菌素a下會有一降低的神經突長出。使用環孢鐘素A之最高的剌激作用傷為50ng/m 1 N G F的作用之大約6 1 %。使用各種不同的免疫菲林配位子和使用NGF的突起伸展之一般形式偽類似的。在會剌激50¾的最高量作用之濃度下，NGF (l-5ng/inl)，40-50%的細胞伸展出至少像細胞本體一樣長的突起，而15¾伸展出更長的突起，高出細胞本體的長度之3 -5倍。此形式在撿查過的各種不同的藥物偽類似的。雷帕黴素與MY-124,446傾向於引起每個細胞有比FK506所致者為多的數目之突起。環孢顏素A在數目及突起上傾向於居於中間。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) % 本 -訂1. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

523410 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7___五、發明説明由免疫菲林乏非-免疼抑制型廊免痔抑制型Κ位芊存雜背根神經結内所激發^神經空伸展在本案發明人之較早的研究中B觀察到免疫抑制劑在大白鼠背根神經結外植體内之神經營養性作用，在使用低至1ί>Μ的FK506時觀察到一顯著的神經突長出之增進作用。 (Lyons et al.，1994)。即令是無NGF存在，使用FK506仍有觀察到在大白鼠神經結内之神經營養性作用。在本發明研究中，本案發明人使用雞背根神經結之外植體，其等在神經長出之研究中偽較容易於供使用者。在無添加的NGF 下，本案發明人觀察到免疫雜林配位子藥物之最低的作用。雞細胞對於NGF要比PO 12細胞更為敏感，於是本案發明人使用0, Ing/ml的NGF來生成最低的神經突長出並用以證明免疫葬林配位子之神經營養性作用（第17圖、第18圖:）。從10天大的雞胚解剖出背根神經結。將整個神經結外植體培養在MatHge卜塗覆的12井培養盤上，該等培養盤内含添加有2mM谷醯胺與10¾胎牛血清之L iebovi tz L15加高《萄糖之培養基，且該培養基内亦添加有1〇mM Ara C，並將之培養在37 °C及15.¾ C〇2環境下。在24小時之後，以不同濃度的NGF ’、免疫菲林配位子或NGF加上.藥物之組合來處理感覺神經結。在藥物處理之後48小時，使用一値 Z e i s s A X i 〇 v e r t倒λα式顯微鏡在相彳iz差或Η 〇 f f m a η調節位差下觀察神經結。進行外植物之光學照相，並定量分析神經突長出。比DGR直徑為長之神經突被計數為陽性反應，並定量出每個實驗狀況之神經突總數。每井培養3 - 4個D R G s (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂 m 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（^;) ，且每種處理進行兩次重複。

各種不同的免疫菲林配位子在剌激神經結的神經突長：出上之相對的效力與其等在PC _ 12細胞上之效力是類似的 ◦因此，雷帕黴素是最有效力的試劑，其具一為1 η Μ之EC 5 〇值且比WAY-124,446要強過10倍，而FK.506展現一為1-2πΜ 之E C 5 β值D 在免疫_林配位子與NGF (100ng/m].)之最高有效濃度下，突起之數目上之最高增加，其等之長度與分枝是相當類似的。使用漸進地增加濃度之各種不同的藥物3吾人可觀察到一較高術目的突起，更廣的分枝以及更長之個別的突起。本案發明人藉由檢查[3H] FK508結合至重組型FKBP-12 之抑制作用而觀察到藥物結合至FKBP-12之效力。藥物對 F K B P -1 2之親和力與其等在剌激神經突長出之效力以及抑制旋轉異構酶活性上有一顯著的相似性。明顯地s神經突長出之刺激作用偽與鈣神經素抑制作用無闘的。鈣神經素抑制作用與免疫抑制劑作用極為符合’ W A Y ~ 1 2 4，4 4 6不是免疫抑制性的而且不會抑制鈣神經素°雷帕黴素是一個有力的免疫抑制劑，但是雷帕黴素—FKBP - 1 2錯合物會結合至 R A F T - 1 而開啓免疫抑制過程（S a b a t i n i a n d S y n d e r，1 9 9 4 ; S y n d e r. a n d S a b a t i n i，1 9 9 5 )。結果小方表.辽中 υ ______ (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） - 523410 A7 __B7_五、發明説明

表_1„免疫菲林配位子神經營養性對應於旋轉異構酶但非鈣神經素之抑制作用藥觀 [3H]FK506-FKBP-12(IC.n) 鈣神經素抑制作用旋轉異構酶 (Κι) 神經突長 (RDho) FK506 0 * 6nM 有 0.4ηΜ 0.5nM 雷帕黴素 0.5πΜ Μ 0.2ηΜ 0.5nM WAY-124,448 ΙΟ.ΟηΜ Μ 12.0πΜ lOnM 環孢菌素A (CsA) dhrr TiTr /\w 有 20ηΗ 50nM 本案發明人比較非-免疫抑制性免疫菲林配位子對m61 促進雞背根神經結之外植體培養物内的神經突長出之能力 (表III )。各値此等化合物不能夠抑制鈣神經素，但其等能與免疫_林FKBP-12相互作用而以表I中所列之抑制常數來抑制免疫菲林FKBP-12之旋轉異構酶活性。此等化合物在促進DRG Ts内的神經突長出之能力相應於其等抑制FKBP-12之旋轉異構酶活性的能力。 (請先閲讀背面之注意事項再_舄本頁) il衣· 太訂1· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表A免疫菲林配位子神經營養性對應於旋轉異構酶但非鈣神經素之抑制作用 _ [3H]FK506- 鈣神經素旋轉異構酶神經突長出藥物 FKBP-12(IC5n) 抑制作用 (Κι)__ (EDso) 實施例 12 8mM 無 250ηΜ 300πΜ 實施例 13 4μΜ 無 25ηΜ 80ηΜ 藥物在結合至免疫菲林、抑制免疫_林之旋轉異_ _ 活性以及剌激神經突長出之效力的密切相官性暗示旋_異構酶活性之抑制作用傺與該等藥物之神經營養性作用有關。該等藥物在剌激神經突長出以及結合至免疫葬林2胃常高的效力使得任何能解釋該神經營養性作用之標的# 不可能的。據信免疫菲林除旋轉異構酶以外之一生種^活‘性可為該等藥物所影響，俾以調節該神經營養性作用3 ® ® ，尚無該種活性被報導之。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 523410 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7__ 五、發明説明（W) 由於該等藥物之異常的效力以及旋轉異構酶抑制與神經營養性作用之間的密切相關性，本案發明人推論出旋轉異構酶抑制作用很可能涉及在神經營養性作用中。有多種蛋白質被報導是免疫菲林的旋轉異構酶活性之基質，包括 _ 原蛋白（Stein nmnn et al ·，1991)以及蓮鐵蛋白（Lodi sh a n d K i n g，1 9 9 1)。近來 5 r y a n o d i n e 受體及 IP - 3 受體（著名的細胞内鈣通道）之高度純化的製品，已被報導偽呈一與FKBP-12之錯合物形式。FKBP-12從此等錯合物之解離造成經通道變成會滲漏的（C a m e r ο n e t a 1 .，1 9 9 5 )。神經突伸展中涉及到鈣通量，因而在藥物的神經營養性作用中可能渉及到IP-3受體與ryanodine受體。由於該等藥物結合至IP-3受體對FKBP-12之相同位置處，吾人可假設該等藥物從FKBP-12移置該等通道。此處所研究的該等藥物之神經營養性作用在極低的濃度下作用，這表示其等相應於下列神經營養性蛋白質所具之效力：腦衍生的生長因子、神經營養素-3以及神經營養性生長因子。以下之實施例細為本發明之較佳實施例之例證，但不應被解釋為對本發明之限制。所有聚合物分子量傷為平均分子量。除非另有所提及，所有的百分比傜依據所製備的最終輸送条統或配方之重量百分比而計，且所有之總數等於100重量百分比。可供用於本發明之例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物包含有： -------_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） _\秘'一 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

、1T 523410 A7 B7 五、發明説明（么〇) 窨施例1

Way-124,45S 此例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傷掲露於0 c a i η e t a i " B i 〇 c h e Μ , B ί o p h y s , Res, C o m nui n …192 ( 3 ), 1 9 9 3 ° 該化合物傜由 P h i 1 H u g h e s 博士在 W y e t h - A y e r s t 藉由4-苯基-1，2，4™tr‘iaz〇nne™3, 5-done與雷帕黴素之反應而予以合成者。 (請先閱讀背面之注意事項 - 衣-- 再本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製

HAP-Pa 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）一,、务 523410 A7 ____ B7_____ 五、發明説明（么/) 此六氫吡啶羧酸衍生物化合物偽掲露於C h a k r a b 〇 r t y e t a 1 ·，m · a r〗rf B ΐ o 1 ·，March 1995, 2_: 157-161° 實施例;

此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傷掲露於Ikeda et a1·，L·, km. C h e m. Soe. , 116： 4143-4144，1994，並在此併入本案以為參考文獻。

實施例fi - Q 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物偽掲露於Wang et a 1 ” Bi-QQrga..n,l„c,,a,„〇„d MALc i n a 1 Chfimi^try Letters· 4_ (9) :1161-1166，1994 ’待別是化合物2a—2d，並在此併入本案以為參考文獻。實施例1 0 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製尺張 -紙本 CN /V 準標 I家國 j國 I中用一適

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規 4 A

一釐公 7 9 2 X Φ. 523410 A7 ___ B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明α/Λ) Jit例示的六氫吡啶羧酸衍生物，化合物i 〇，傺掲露於 Birkenshaw et al,, Β ί ο o r g a η ? π and Medicinal Chemistry 1 (2 1 ) : 2 5 0 1 - 2 5 0 6 , 1 9 9 4，並在此併人本案以為參考文獻。嘗施例1 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傺掲露於Ho U e t a 1 " Am. C h e m. See., 1 15: 9925-9938, 1993，待別是化合物4-14，並在此併入本案以為參考文獻。· 實施例2 ^^^ 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物像掲露於Caffery e t a 1 ·，BJ ο o r g a n i c and Medicine] C h e m 丨 s t r v Letters, i_ (21) =25 07-2510, 1994，並在此併入本案以為参考文獻。嘗施例3 1

McO 0Mc 此例示的六氫Dft啶羧酸衍生物，化合物3 1，傺掲露於 Teague e t a 1、，B i ο o r r a η i c and Medicinal Chemist ri Liters, i ( 10) : 1947-1950，1993，並在此併入本案以為參考文獻。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） '零 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 太 ;訂 523410 A7 B7__ 五、發明説明（么窨_例D -以此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傜掲露於 Y a m a s h i t a et a 1 . , Bioorg^nic and Medicinal

Ciiejai_s：t r y i, ^ 11； ^ r n , i (2 ) : 3 2 5 - 3 2 8，1 9 9 4，特別是化合物11、12與19，並在此併入本案以為參考文獻。

嘗旆例Μ - Ft R 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傷掲露於Ho 11 e t a 1 " B ί ο o r g a n i c and M ^ d i cinaj—Chemistry Letters, 4 (2):315_320，1994，特別是化合物 3-31 以及 23-24，並在此併入本案以為參考文獻。窨施例5 β - Μ 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傷掲露於Ho 11 e t a 1 " Bioorsanic and M ^ rl i e i π a i Chemistry Letters, ( 10) : 1977 - 1980, 1 993，待別是化合物3-15，並在此併入本案以為參考文獻。實旆例6 9 - 8 3 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物像掲露於Haruske e t a 1. , J t Med > Chem …3 5: 4284-4296，1992，待別是化合物 6、9-10、21-24、26、28、31-32以及 52-55，並在此併人本案以為參考文獻。富施例84 .

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 523410 A7 __B7_ 五、發明説明（_) 此例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傷掲露於Teague e t a K , B i ο o r r a π i c & Med . C h ^ m » Letters, 4_ (13)： 1581-1584，1994，並在此併入本案以為參考文獻。實施例85-Μ 此等例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傜掲露於 Stocks e t al·，B i ο 〇 r g a η i c & M ^ d » C h e m > Letters, 1 (12) : 1581 -1584，1994，特別是化合物 2、15-17，並在此併入本案以為參考文獻。實施例9 0 - 1 1 1 額外例示的六氫吡啶羧酸衍生物化合物傜敘述於合成途徑10，表1-5。合成途徑0 1 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 本

cch3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製實施例/化合物結構 5 2 = ¾ 7 Z = 0¾ 8 X = H, CH3 9 · X = 0 -

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（仏Γ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（必）合成途徑03 實施例/化合物編號結構 f

(請先閲讀背面之注意事項再邊馬本頁) 衣· 太經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

523410 A7 B7 五、發明説明（^?) 合成途徑04 表

實施例/化合物結構 24 - y=l 23 y=2 > 24 y=3 表2

Ο 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

實施例/化合物結構 25 n=l 2S n=2 27 n=3

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -f / 一 523410 A7 B7 五、發明説明Uf)合成途徑06 表1 實施例/化合物編號 35 3S 37

V (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 40 41 42 — 43 44 45 46 47 43 49 50 λ Ί< DA: ’Ό’Ό 訂1· 泉，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（切）表2 實施例/化合物編號結構 51 52

0

(請先閲讀背面之注意事項再本頁) kl衣· 太訂丨經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（^/) 合成途徑07 表1

5S 57 58 59 50 51 62 63 64

St X = OH X = OMe X = Oi Pr x = OBn x = OCH MePh x = OGi2CHCHPh x = OCH2CH2CH2(3,4-OMe2) Ph x = NHBn x = NKCH,CH,CH,Ph 表2

R R

MeBn 輕濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）曝 523410 A7 B7 五、發明説明（广Z) 表3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

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523410 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（Γ〆） r表3 、實施例 77

R, = CH2 (CO) -m-OCH3?H· R,- = CH2?h = OCH3

CH2 (CO)-3-naphthyl CH2Ph OCH,

實施例/化_^ 79 %|：結構 Ri. = ^0^13 Ph X = -CH=〇iR,1 = K Y = 〇C (〇) ?h 80 81 = m-OCH3?h X广备内、-CK=CH Y = OC(〇) CF3

Rlx Ro- Y =m-OCH3Ph |5Lj<i -CH=CHI = — 82 Ri : =m-OCH3Ph X = -CH=( 心1 =H Y = OCH2CH=CH2 8*3夕 rl : =m-OCH3Ph X = c=o 〜1 =H Y = Ph

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523410 A7 B7 五、發明説明（4 ) 合成途徑10

實施例 R = 90 3，4 -二氯基 91 3，4，5 _三甲氧基 92 Η 93 3_ (2,5™二甲氧基）苯丙基 94 3- (3,4-甲撑基_二氧基）苯丙基本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

經濟部中央標準局員工消費合作社印製實施例 R = 95 4~ (對-甲氧基）丁基 96 3_苯丙基 97 3 ~ (_淀基）-丙基 523410 A7 B7

五、發明説明（q) 表3 實施例 98 99 100 101 102 103 104 表4 實施例 105 106 107 表5 3-（iitt啶基）-丙基 1 , 7-二苯基~4™庚基 4 - (4 -甲氧基）丁基 1-(苯基-6-(4 -甲氣基-苯基）-4 -己基 3- (2, 5 ~二甲氯基）苯基丙基 3- (3，4-甲撑基-二氧基）苯丙基 1，5-二苯基戊基

R = 4 - (4 -甲氣基）丁基 3 _環己基丙基 3-苯基丙基 0^" ^Λο° 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製實施例 R = 108 3 -環己基丙基 109 3 -苯基丙基 110 4- (4-甲氧基.)丁基 111 1 , 7 -二苯基-4 -庚基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 523410 A7 B7 五、發明説明（#) 旋轉異構酶抑制孑之神經營養件作用表I中列出所請求的實施例之名單，以及其等如上所述對於誘發培養的感覺神經元之營養性作用。第1 9圖與第 20圖顯示實施例111與實施例17促進背根神經結培養物之神經突長出的光學顯徼相片。 Μ 試驗實施例之活體外效力旋轉異構酶抑神經營養性ED 5 〇爸例制作用K i，η Μ 雞 D R G s，in Μ 6 140 25 9 13 0.030 11 170 1 12 250 300 13 25 80 15 17 0.30 19 12 0.017 36 , >10,000 >10,000 41 1300 - 5000 50 >10,000 >10,000 Υ 1800 2500 Μ 28 200 39 90 93 75 35 94 70 8 95 1S5 5-10 96 740 10-20 97 -725 150 98 130 75 99 30 5 100 60 43 101 - 15 0.17 102 12 2.5 103 120 3 104 • 20 .01S 105 103 6 10S 7S0 1 107 210 .0.82 108 32 0.29 109 2 0 . 08 110 24 0.002 111 5 0.08 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）請先閲讀背 © 之注意事項

經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 523410 A7 B7 五、發明説明（rf) 實旆例化会物存神經再生的活體内椹型Φ :>沃桦坐#神經軸切開術（Axotomv) 將6週大的雄性Sprague-Dawley大白鼠麻醉，使其坐骨神經在與臀部等高處被暴露出，並以鑷子將之壓碎。就在損害之前對大白鼠皮下地投藥以測試化合物或載劑，且在隨後的18天每天予以投藥之。坐骨神經之切片以Ho 1 mes 銀染色法予以染色，俾以評估軸突數目，以及以Luxo丨堅牢籃法予以染色，俾以評估髓鞘形成。在損害之後1 8天，在以載劑處理的動物中，軸突的數目有一明顯的減少（相較於未受損的對照組，有50%的減少），且髓鞘形成之程度亦降低（相較於未受損的對照組，有90¾的降低）。相較於以載劑處理的動物，就在損害之前以及隨後的 18天每天予以投藥實施例12 (30mg/kg s,c.)或實施例13 (30mg/kg s.c·)，會造成顯著的軸突數目以及髓鞘形成之程度此二者之再生（相較於未受損的對照組，軸突數目分別有25¾與5¾的減少以及髓鞘形成之程度分別有65¾與50% 的降低）。實施例1 2與1 3之顯著的有效性與其等抑制旋轉異構酶活性以及剌激雞DRGs神經突長出之有力的活性是相一致的，並且其等在活體内之效力平等於在活體外之效力 (表I )。此等結果被顯示於第21圖中。* Sham 〃意指接受載劑但未受到損害的對照組動物；"載劑〃意指受到損害且只接受載劑（亦卽無藥物）的對照組動物。實施例1 2與1 3 顯示出與Sham處理的動物間之一明顯的類似性，這證實了此等化合物在活體内之有力的神經再生作用。此等實驗數本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

^--^----II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 523410 A7 B7 五、發明説明（&〇) 據之定量分析被顯示於表Π中處理組別 s h a 1 損害： +載劑（n ) +實施例12 (3 0 ra g / k g s . c +實施例13 (3 01 g / k g s . c 表 1 軸突數目U對照組） 1()0 50 75 100 髓磷脂位準 100 10 35 50 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 於是本發明業已經詳細説明，而明顯地，本發明可以多種方式而被變化之。該等變化將不會被視為有逸脱出本發明之精神及範疇，而且所有該等變化被認為是落在隨後所附申請專利範圍之範疇内。訂*--

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Claims

六、申請專利範圍第85 1 13075號專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：91年12月 1 · 種用於在神經元修復可被促進的神經病理學症狀中促進神經生長與再生的藥學組成物，其中該組成物包含一有效量之非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物以及一藥學上可接受之載劑，該非-免疫抑制性孓哌啶酸衍生物不包括FK506或雷帕黴素（Rapamycin)。 2. 一種用於治療一神經學障礙的藥學組成物，其中該組成物包含一有效量之非-免疫抑制性哌啶酸衍生物以及一藥學上可接受之載劑，該非-免疫抑制性孓哌啶酸衍生物不包括FK506或雷帕黴素（Rapamycin)。 3. 一種用於保護神經免於神經退化的藥學組成物，其中該組成物包含一有$文量之非-免疫抑制性2·定酸衍生物以及一藥學上可接受之載劑，該非_免疫抑制性孓哌啶酸衍生物不包括FK506或雷帕黴素（以肸⑺八比）。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物係與一有效量之額外神經營養性因子組合使用。 5·如申請專利範圍第4項之藥學組成物，其中該神經營養性因子係擇自於由下列所組成之群中：神經營養性生長因子、腦衍生性生長因子、神經膠質衍生性生長因子、纖毛神經營養性因子及神經營養素_3。 6如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物係選自於： 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍

-2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4·規格（210X297公釐） 523410 A B c D 六、申請專利範圍

其中η為1、2或3 ; 4-(4-曱氧基苯基）丁基（2S)-l-[2-(3,4,5-三曱氧基苯基）乙醯基]六氫_2_0比啶羧酸酯； 4-(4-曱氧基苯基）丁基（2S)-l-[2-(3,4,5-三甲氧基苯基）丙烯醯基]六氫-2-D比啶羧酸酯； 4-(4-曱氧基苯基）丁基（2S)-l-[2-(3,4,5-三曱氧基苯基）丙醯基]六氫-2-Dtt啶羧酸酯； 4-(4-曱氧基苯基）丁基（2S)-l-[2-氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基）乙醯基]六氫-2-D比啶羧酸酯；

3-環己基丙基（2S)-1-(3,3-二甲基-2-氧戊醯基）六氫-2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D a、申請專利範圍 B比啶羧酸酯； 3-苯丙基（2S)-l-(3,3-二甲基-2-氧戊醯基）六氫-^比口定敌酸S旨； 3-(3,4,5-三甲氧基苯基）丙基（2S)-l-(3,3-二甲基-2-氧戊酿基）六氫-2比咬魏酸酉旨； (lR)-2,2-二曱基-1-苯乙基 _3_ 丁烯基（2S)-l-(3,3-二甲基-2-氧戊醯基）六氫-1D比啶羧酸酯； (1R)-1，3-二苯基丙基（2S)-l-(3,3-二曱基-2-氧戊醯基) 六氫_2_0比σ定敌酸酉旨； (IR) -1-環己基-3-二苯基丙基（2S)-l-(3,3-二甲基-2-氧戊酿基）六氫-2-H比σ定緩酸酯； (IS) -1，3-二苯基丙基（2S)-l-(3,3-二曱基-2-氧戊醯基) 六氫-2-D比σ定叛酸酯； (13)-1-環己基-3-二苯基丙基（23)-1-(3,3-二甲基-2-氧戊醯基）六氫_2_D比啶羧酸酯； (22&3)-15，15-二曱基過氫吡啶基[2，1-(：][1，9,4]二噁唑環十九烯-1，12，16，17-四酮； (24&8)-17，17-二曱基過氫吡啶基[2,1-(^[1，9,4]二噁唾環廿一稀-1,14,1 8，19 -四酮； -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（210X297公楚·） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍

(311，411，23 38)-8-烯丙基-4，10-二曱基-3-[2-(3-〇比啶基）乙基]-l，3,4,5,6,7,8，ll，12，15，16，17，18,20,21，22,23,23a-十八氫-l4H-D比啶基[2，l-c][l，10,4]二噁唑環廿烯 -1，7，14，17，18-五酮； (311，411，2433)-8-烯丙基-4，10-二曱基-3-[2-(31比啶基）乙基]-1，3,4,5,6,7,8，11，12，14，15，16，17，18，19,21，22,23, 24,24a-廿氫卩比啶基[2，l-c][1，II,4]二噁唑環廿一烯 -1，7,14，18，19-五酮； (3R，4R，25aS)-8-烯丙基-4，10-二曱基-3-[2-(3-B比啶基）乙基]-1，3,4,5,6,7,8，11，12，15，16，17，18，19,20,22,23,24,25, 25&-廿氫-1411-卩比啶基[2，1_(：][1，12,4]二噁唑環廿二烯 -1，7，14，19,20-五酮；

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍其中η為1、2或3 ;

其中η為1、2或3 ;

(1R)-1-(3-苯曱基苯基）-3-苯丙基（lR)-2-(3,3-二曱基 -2-氧戊醯基）環己烷-1-羧酸酯； (lR)-l-[3-(二烯丙基胺基甲醯基）苯基]-3 -苯丙基 (lR)-2-(3,3-二曱基-2-氧戊醯基）環己烷-1-羧酸酯；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）六、申請專利範圍

乙基1-(2-氧基-3-苯基丙醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-丙酮醯基-2-脈啶羧酸酯；乙基1-(2-氧丁醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(3-甲基-2-氧丁醯基）·2-哌啶羧酸酯；乙基1-(4-曱基-2-氧丁醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(3,3-二甲基-2-氧丁醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(3,3-二甲基-2-氧戊醯基）-2-哌啶羧酸酯； 4-[2-(乙基氧羰基）哌啶基]-2,2-二曱基_3,4-二氧丁基乙酸酯；乙基1-[2-(2-經基四鼠-2H-2-D比喃基）-2 -氧乙酿基]-2 - .哌啶羧酸酯；乙基1-0(2-曱氧基四氫-2H_2-D比喃基）-2-氧乙醯基]-2-哌啶羧酸酯；乙基1-[2-(1-羥基環己基）-2-氧乙醯基]-2-哌啶羧酸酯；乙基1-[2-(1-曱氧基環己基）-2-氧乙醯基]-2-哌啶羧酸 m ；乙基1-(2-環己基-2-氧乙醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(2-氧基-2-哌啶乙醯基）_2_哌啶羧酸酯； -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）六、申請專利範圍乙基1-[2_(3,4·二氫-2H-6_Dtt喃基）-2-氧乙醯基]-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(2-氧基-2-苯基乙醯基）-2-哌啶羧酸酯；乙基1-(4 -甲基-2-氧基-1-硫氧基戊基）-2 -呢σ定竣酸S旨， 3-苯丙基1-(2-羥基-3,3-二曱基戊醯基）-2-哌啶羧酸 m ； (1R)-1-苯基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基）丙基l-(3,3-二曱基丁醯基）-2-哌啶羧酸酯； (1R)-1,3-二苯基丙基1-(苯曱基磺醯基）-2-哌啶羧酸 61 ； 3-(3,4,5-三甲氧基苯基）丙基1-(苯甲基磺醯基）-2-哌啶羧酸酯； l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二甲氧基-3,9，11-三甲基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3-曱基四氫-2H-2-卩比喃基）_2_氧乙醯基）_2_哌啶羧酸酯；甲基 l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二曱氧基-3,9，11-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3-甲基四氫-2H-2-Dtt喃基）-2-氧乙醯基）-2-哌啶羧酸酯；異丙基 l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二曱氧基-3,9，11-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3-曱基四氫-2H-2-D[±喃基）_2_氧乙醯基l·2· 哌啶羧酸酯； -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐) _ 六、申請專利範圍苯甲基 l-(2-[(2R，3R,6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二曱氧基-3,9,11-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-¾基-3-甲基四鼠比喃基）_2_乳乙S藍基）_2_ 哌啶羧酸酯； 1 - 苯乙基 l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二甲氧基-3,9，11-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3-曱基四氫-2H-2-I1比喃基）-2-氧乙醯基）_2_哌啶羧酸酯； (Z)-3- 苯基 -2- 丙烯基 1-(2-[(2ΙΙ，3ΙΙ，63)-6-[(23,3Ε，5Ε，7Ε，98，11ΙΙ)-2，13-二曱氧基-3,9，11-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3-曱基四氫-2H-2-D比喃基）_2_氧乙醯基）_2_哌啶羧酸酯； 3-(3,4- 二曱氧基苯基）丙基 l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E，5E，7E，9S，llR)-2，13-二曱氧基-3,9，Π-三曱基-12-氧基-3,5,7-十三烷三烯基]2· 羥基-3-曱基四氫-2H-2_D比喃基）_2_氧乙醯基）-2_哌啶羧酸酯； N2-苯曱基-l-(2-[(2R，3R，6S)-6-[(2S，3E,5E，7E，9S，llR)-2,13-二曱氧基-3,9,11-三曱基-12-氧基-3，5,7-十三烷三烯基]2-羥基-3 -曱基四氫-2H-2_D比喃基）_2_氧乙醯基）-2_ 哌啶羧酸酯； N2-(3- 苯丙 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍基）-1-(2-[(211，311，63)-6-[(28,3已，5£，7£，93，1111)-2，13-二曱氧基-3,9,11-二甲基-12 -氧基-3,5，7 -十二院三稀基]2-¾ 基-3-甲基四鼠-2H-2-D比喃基]-2-氧乙臨基）-2-(1¾°定竣酸酯；

其中R為甲基（Me)或苯甲基（Bn);

-ίο - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 申請專利範圍

I Ri )π Ο

裝其中η等於2 Ri = 訂· Ο

擎或 Ο

OCII3 R2=Phe-鄰-特丁基； -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍

Ri = :間-〇CH3Ph ; r3 = :Val-鄰-特丁基； Ri = =間-OCH3Ph， r3: =Leu-鄰-特丁基； Ri: =間-〇CH3Ph， =lieu-鄰-特丁基； :間-〇CH3Ph， R3 = =六氫-Phe-鄰-特丁基； Ri = :間-〇CH3Ph， r3: =丙稀基胺基丙酸-鄰-特丁基 Ri = =B-奈基’ r3 = 二Val-鄰-特丁基；

其中以丨=CH2(CO)-間-〇CH3Ph R4 = CH2Ph R5 =〇CH3 ;或 Ri = CH2(CO)-B-萘基 R4 = CH2Ph R5 二〇CH3 ; -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍

其中 Ri = m-OCH3Ph X =反式-CH=CH R4 = Η Υ =〇C(o)Ph ; R{ = OCH3Ph X =反式-CH=CH R4 - Η Y - OC(o)CF3 ； R! = m-CH3Ph X =反式-CH=CHI R4 =— Y =-; R! = m-CH3Ph X =反式-CH = CHI R4 = H -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS) A4規格（210X297公釐） 523410 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 Y =〇ch2ch = ch: R, = m-OCH3Ph X = C = 0 R4 = Η Y = Ph ；

HO, MeO •八 0 R 、NT

本紙張尺度適用中國國家標準（CMS) A4規格（210X297公釐）申清專利範圍其中 Ri : =Η， r2 Ri: =Η， r2 Ri : =Me， r2 〇Me 及 R3 = CH2〇Me ; H 及 R3 = H ; H 及 R3 = h ; ^ 二氣苯基）_2_丙烯基^3,3-二曱基_2-氧戊酿基）·2-哌啶羧酸酯； (Ε)·^(3,4,5-三曱氧基苯基）-2-丙烯基H3,3-二曱基孓氧戊醯基）_2_哌啶羧酸酯； (E) 3-苯基丙稀基ιρ，％二甲基_2-氧戍酿基）士哌啶羧酸酯； = 二曱氧基）_苯丙基）苯基）-2-丙烯基 1-(3，夂二曱基_2_氧戊醯基）_2_哌啶羧酸酯； 4-(4-曱氧基苯基）丁基^(2-氧基_2_笨基乙醯基）_2_哌啶羧酸酯；笨丙基1-(2-氧基-2-苯基乙酿基）-2-Β)^σ定致酸酯； 3-(3-吡啶基）丙基1-(2_氧基_2_苯基乙醯基）哌啶羧酸酯； 3- (3-〇比咬基）丙基^3,弘二曱基1氧戊醯基）_2-哌啶羧酸酯； 4- 苯基-1-(3-苯丙基）丁基1-(3,3-二甲基1氧戊醯基成啶羧酸酯； 4-(4-曱氧基苯基）丁基丨气父弘二曱基氧戊醯基）-2_ 哌咬繞酸酯； i-(4-曱氧基苯乙基）-4-苯丁基1-(3,3-二曱基氧戍醯 ___ 15 · 本纸張尺度適用中國HI家標準（CMS) A4規格（210X297公楚厂 '~一— ' 申請專利範圍基）-2-D麼啶羧酸酯； 3-(2,5 -二曱氧基苯基）丙基K(3,3 -二曱基-2-氧戊醯基）-2-_σ定叛酸酯； 3- (1，3-苯並間二氧雜環戊-5-烯）丙基卜（3,3-二曱基-2-氧戊醯基）-2·哌啶羧酸酯；笨乙基-3-苯丙基1-(3,3-二曱基_2_氧戊醯基）-2-哌啶羧酸酯； 4- (4-曱氧基苯基）丁基1-(2-環己基_2-氧乙醯基）-2-哌啶羧酸酯； 3-環己基丙基1-(2-環己基-2-氧乙醯基）-2-哌啶羧酸酯； 3-苯丙基1-(2-環己基-2-氧乙醯基）_2-哌啶羧酸酯； 3-¾己基丙基1-(3,3-二甲基-2-氧丁醯基）-2-哌啶羧酸酯；苯丙基1-(3,3-二甲基·2_氧丁醯基Η·呢啶羧酸酷； M4-甲氧基苯基）丁基^(3}二甲基|氧丁醯基）丄哌啶羧酸酯；以及基）·2·哌啶羧酸酯。如申請專利範圍第6項之藥學抑制性2·哌啶酸衍生物係與一因子共同使用。 4-笨基小(3-苯丙基）丁基W3,3_二甲基_2_氧丁酿組成物，其中該非-免疫有效量之一神經營養性、'、人似丹"P该神經營性因子係擇自於由下列所組成之群中：神經營養性 523410 * A8 B8 C8 -—__________D8 六、申請專利範m " '~一 ~ 長子細衍生性生長因子、神經膠質衍生性生長因子、纖毛神經營養性因子及神經營養素_3。申月專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少 75/。之轴大數目再生及至少％%之髓鞘形成恢復。 ίο.如申請專利範圍第4項之藥學組成物，#中使用該非-免疫抑制性2-呢啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少3 5%之髓鞘形成恢復。 11.如申請專利範圍第5項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少35%之髓鞘形成恢復。 12·如申明專利範圍第6項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少35%之髓鞘形成恢復。 13.如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少35%之髓鞘形成恢復。 14·如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少3 5%之髓鞘形成恢復。 I5·如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2_脈啶酸衍生物可提供至少 75%之軸突數目再生及至少50%之髓鞘形成恢復。 16.如申請專利範圍第4項之藥學組成物，其中使用該非-

523410 六、申請專利範圍至少75°/。之軸突數免疫抑制性2-卩成啶酸衍生物可提供目再生及至少5〇%之髓鞘形成恢復。 17. 18. 19. 如申請專利範圍第5項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2,啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少50%之髓鞘形成恢復。如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少50%之髓鞘形成恢復。如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少50%之髓鞘形成恢復。 20·如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其.中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可提供至少75%之軸突數目再生及至少50°/。之髓鞘形成恢復。 21·如申請專利範圍第丨至3項中任一項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2_哌啶酸衍生物可利用不超過200 nM'/辰度之該化合物而達成神經營養性ε〇5〇。 22·如申請專利範圍第4項之藥學組成物，其令使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過2〇〇 nM濃度之該化合物而達成神經營養性ED50。 23 ·如申明專利範圍第5項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過2〇〇濃度之該化合物而達成神經營養性ED50。 24·如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中使用該非_

本紙張尺度適财酬緒 523410 A B c D 申請專利範圍免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過2〇〇 nM濃度之该化合物而達成神經營養性ED5〇。 25·如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過2〇〇 nM濃度之这化合物而達成神經營養性。 26.如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-呢。定酸衍生物可利用不超過2〇〇 nM濃度之该化合物而達成神經營養性ed5〇。 2'如申請專利範圍第⑴項中任—項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2_呢。定酸衍生物可利用不超過35 nM濃度之該化合物而達成神經營養性ed^。 28. 如中請專利範圍第4項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2 -哌咬酸衍生物可利用不超過3 5 nm漢度之該化合物而達成神經營養性ed50。 29. 如申請專利範圍第5項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2 -峨咬酸衍生物可利用不超過3 5 n M濃度之該化合物而達成神經營養性ed50。 30. 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌唆酸衍生物可利用不超過^舰濃度之該化合物而達成神經營養性ed50。又 3!.如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中使用該非· 免疫抑制性2-哌咬酸衍生物可利用不超過^虛濃度之該化合物而達成神經營養性ed50。 32·如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其中使用該非-

523410 A8 B8 , C8 -〜~ -— D8__ 六、申請專利範m 免疫抑制性2_呢咬酸衍生物可利用不超過35 nM濃度之該化合物而達成神經營養性ED50。〇3·如中0月專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其 x非免疫抑制性2 -哌咬酸衍生物可利用不超认1 nM’辰度之该化合物而達成神經營養性。 34.如申請專利範圍第4項之藥學組成物，其中使用該非- 免疫抑制性2-哌。定酸衍生物可利用不超過1 nM濃度之該化合物而達成神經營養性ED50。 35·如申請專利範圍第5項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過丨nM濃度之該化合物而達成神經營養性E D 5 〇。 36·如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中使用該非-免疫抑制性入哌啶酸衍生物可利用不超過1 nM濃度之該化合物而達成神經營養性ed5()。 37·如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2-哌啶酸衍生物可利用不超過丨nM濃度之该化合物而達成神經營養性ed50。 3 8.如申味專利範圍第8項之藥學組成物，其中使用該非_ 免疫抑制性2 -哌咬酸衍生物可利用不超過1 濃度之該化合物而達成神經營養性ed50。 39.如申請專利範圍第丨至3項中任一項之藥學組成物，其中δ亥神經病理學症狀、神經退化或神經障礙係包括由物理性彳劳害或疾病狀態所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損害、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有 — —— - 20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ι〇χ297公复) ^ ------—

裝訂參 /、 T請專利範圍】之中風以及與神經退化有關之神經學障礙。 40·如申請專利範圍第4項之荜| ^ 、市卞組成物，其中該神經病理症狀#經退化或神經障礙係包括由物理性傷害或 ;、：、狀〜、所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損冑、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有關之中風以及與神經退化有關之神經學障礙。，申明專利範圍第5項之藥學組成物’其中該神經病理學症狀、神經退化或神經障礙係包括由物理性傷害或疾病狀態所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損害、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有關之中風以及與神經退化有關之神經學障礙。 4 2.如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中該神經病理學症狀、神經退化或神經障礙係包括由物理性傷害或疾病狀怨所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損害、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有關之中風以及與神轉退化有關之神經學障礙。 43.如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該神經病理學症狀、神經退化或神經障礙係包括由物理性傷害或疾病狀態所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損害、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有關之中風以及與神經退化有關之神經學障礙。 44·如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其中該神經病理學症狀、神經退化或神經障礙係包括由物理性傷害或疾病狀態所致之周邊神經病變、對腦部之物理性損 —：~—-21 - 本紙張尺度適用中國^標準（cNS) Α4規格了21〇χ297公楚)----- 申請專利範圍害、對脊髓之物理性損害、與腦部損害有關之中風以及與神經退化有關之神經學障礙。 45.如申請專利範圍第39項之藥學組成物其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌萎縮性側索硬化所組成之群組中。饭如申請專利範圍第4〇項之藥學組成物’其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌萎縮性側索硬化所組成之群組中。 4入如申請專利範圍第41項之藥學組成物，其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌萎縮性侧索硬化所組成之群組中。级T申請專利範圍第42項之藥學組成物，其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌萎縮性側索硬化所組成之群組中。 49.如申請專利範圍第43項之藥學組成物，其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌^ 細性側索硬化所組成之群組中。 5〇·如申請專利範圍第44項之藥學組成物，其中該神經學障礙係擇自於由阿滋海默氏症、帕金森氏症以及肌= 縮性側索硬化所組成之群組中。 -22-