SI20638A - Spojine, sestavki in metode za stimulacijo rasti in podaljševanja nevronov - Google Patents

Abstract

Opisane so spojine, ki inhibirajo peptidil-prolil izomerazno (rotamazno) encimsko aktivnost FK-506 vezavnega proteina (FKBP) in sestavki, ki obsegajo te spojine. Spojine za inhibiranje FKBP imajo biciklično (3.3.1), (4.3.1) ali policiklično azaamidno jedro. Farmacevtski sestavki, ki vsebujejo take spojine, pomagajo stimulirati izraščanje nevritov v živčnih celicah in povečajo regeneracijo živcev. Metode zdravljenja živčnih celic s takimi sestavki so koristne za pospešitev popravila nevronalne poškodbe, povzročene z boleznijo in telesno poškodbo.ŕ

Description

SPOJINE, SESTAVKI IN METODE ZA STIMULACIJO RASTI IN PODALJŠEVANJA NEVRONOV

NAPOTITEV NA SORODNO PRIJAVO

Ta prijava se nanaša na U.S. začasno prijavo št 60/093,299, vloženo 17. julija, 1998, na ime Katoh s sodelavci.

TEHNIČNO PODROČJE IN INDUSTRIJSKA UPORABNOST IZUMA

Pričujoči izum se nanaša na metode in farmacevtske spojine in sestavke za stimulacijo izraščanja nevritov v živčnih celicah, kar vodi do regeneracije živcev. Bolj natančno, sestavki obsegajo spojine, ki inhibirajo peptidil-prolil izomerazno (rotamazno) encimsko aktivnost, povezano s FK-506 vezavnim proteinom (FKBP). Metode obsegajo zdravljenje živčnih celic s sestavki, ki obsegajo spojino za inhibiranje rotamaze. Metode izuma lahko uporabimo, da pospešimo popravljanje poškodbe nevronov, ki jo je povzročila bolezen ali telesna poškodba.

OZADJE IZUMA

Imunofilini so družina topnih proteinov, ki služijo kot receptorji za pomembna imunosupresivna zdravila, kot so ciklosporin A, FK-506 in rapamicin. Zlasti pomemben imunofilin je FK-506 vezavni protein (FKBP). Za pregledni članek o vlogi imunofilinov v živčnem sistemu glej Solomon s sod., Immunophilins and the Nervous System, Nature Med., 1(1), 32-37 (1995).

FK-506 vezavni protein z molekulsko maso 12-kilo-Daltonov, FKBP12, z veliko afiniteto veže FK-506. Tako vezavo so direktno izmerili z uporabo mikrokalorimetrije in radioaktivno označenega FK-506, npr., [ H]dihidro-FK-506 (glej Siekierka s sod., Nature, 341, 755-57 (1989); in U.S. patent št. 5,696,135, Steinerja s sod.) in 32-[1-¹⁴C]-benzoil-FK-506 (glej

Harding s sod., Nature, 341, 758-60 (1989)). Vezavno afiniteto drugih spojin za FKBP se lahko določi direktno z mikrokalorimetrijo ali iz kompetitivnih vezavnih testov z uporabo bodisi 14 s tricijem ali s C označenega FK-506, kot je opisal Siekierka s sod. ali Harding s sodelavci.

-2-2FK-506 vezavni protein, FKBP12, sodeluje pri različnih pomembnih celičnih funkcijah. FKBP12 katalizira cis-trans izomerizacijo peptidil-prolil vezi. Ta peptidil-prolil izomerazna encimska aktivnost je navedena tudi kot rotamazna aktivnost. Tako aktivnost zlahka testiramo z metodami, ki so v stroki poznane (glej Fischer s sod., Biochim. Biophys. Acta 791, 87 (1984); Fischer s sod., Biomed. Biochim. Acta 43,1101 (1984); in Fischer s sod., Nature 337, 476-478 (1989)). U.S. patenta št 5,192,773 in 5,330,993 Armisteada s sod. navajata vezavne afinitete FKBP, ki so jih primerjali z rotamazo inhibitornimi aktivnostmi mnogih spojin.

FK-506 in spojine, ki vežejo FKBP, kompetitivno s FKBP stimulirajo izraščanje nevritov (aksonov) v živčnih celicah (glej U.S. patent št. 5,696,135 Steinerja s sod.). Lyons s sod. [Proč. Natl. Acad., Sci, USA, 91, 3191-95 (1994)) je pokazal, da FK-506 deluje tako, da poveča ali okrepi učinkovitost živčnega rastnega faktorja (NGF) pri stimulaciji izraščanja nevritov v celični liniji podganjega feokromocitoma. Zdi se, da je mehanizem stimulacije takega izraščanja nevritov 10- do 100-krat bolj učinkovit kot delovanje živčnega rastnega faktorja.

Učinkovitost za inhibicijo peptidil-prolil izomerazne (rotamazne) encimske aktivnosti FKBP s FK-506 in s spojinami, ki kompetitivno inhibirajo vezavo FK-506 na FKBP, empirično korelira z aktivnostjo za stimulacijo izraščanja nevritov. Zaradi tesne korelacije med inhibicijo rotamaze in nevrotrofičnim delovanjem je bilo predlagano, da rotamaza lahko pretvori proteinski substrat v obliko, ki pospešuje rast živcev (glej U.S. patent št. 5,696,135). Na primer, ugotovili so, da FKBP12 tvori vezane komplekse z intracelularnimi kalcijevimi ionskimi kanalčki-rianodin receptorjem (RyR) in inozitol 1,4,5-trifosfat receptorjem (IP3R) (Jayaraman s sod., J. Biol. Chem., 267, 9474-9477 (1992); Cameron s sod., Proč. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 1784-1788 (1995)), kar pomaga stabilizirati sproščanje kalcija. Za oba, RyR in IP3R so pokazali, da sta FK-506 in rapamicin zmožna disociirati FKBP12 iz teh receptorjev. V obeh primerih odluščenje FKBP12 vodi do povečanega prepuščanja kalcijevih kanalčkov in nižjih koncentracij intracelularnega kalcija. Predlagali so, da je pretok kalcija lahko povezan s stimulacijo izraščanja nevritov.

-3-3Poleg tega se FK-506--FKBP vezani kompleksi vežejo na in inhibirajo kalcinevrin, citoplazemsko fosfatazo. Fosfatazna aktivnost kalcinevrina je potrebna za defosforilacijo in poznejšo translokacijo v jedro nuklearnega faktorja aktiviranih T-celic (NF-AT) (glej Flanagan s sod., Nature, 352, 803-807 (1991)). NF-AT je transkripcijski faktor, ki sproži aktivacijo gena za interlevkin-2, kar potem povzroči proliferacijo T-celic; te stopnje so pomembne za aktivacijo imunskega odziva. Kalcinevrin inhibitorna aktivnost korelira z imunosupresivno aktivnostjo FK-506 in sorodnih spojin.

Vendar inhibicija kalcinevrina ne korelira s stimulacijo izraščanja nevritov. Zato so zaželene spojine, ki so močni inhibitorji rotamaze, toda niso močni inhibitorji kalcinevrina, ker morajo biti take spojine nevrotrofične toda ne imunosupresivne.

Taka nevrotrofična sredstva se zaželeno uporabljajo pri povečanju izraščanja nevritov in zato pri pospeševanju rasti in regeneracije nevronov pri različnih patoloških situacijah, kjer lahko pospešimo popravljanje nevronov, vključno s poškodbo perifernih živcev, povzročeno s poškodbo ali boleznimi, kot je sladkorna bolezen, poškodbo možganov, povezano s kapjo, in za zdravljenje nevroloških motenj, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo, vključno s Parkinsonovo boleznijo, Alzheimerjevo boleznijo in amiotrofično lateralno sklerozo (ALS). Nadalje je taka uporaba prednostna brez pridruženega učinka imunosupresije, zato, ker je dolgotrajna uporaba imunosupresantov povezana s stranskimi učinki, kot so zastrupljanje ledvic, nevrološki deficiti in vaskularna hipertenzija.

Poznani so različni inhibitorji rotamazne encimske aktivnosti, FKBP-vezavne spojine, ali spojine za moduliranje imunosti. Glej, npr., U.S. patente št. 5,192,773, 5,330,993, 5,516,797, 5,612,350, 5,614,547, 5,622,970, 5,654,332, 5,665,774, 5,696,135 in 5,721,256. Glej tudi mednarodne objave št. WO 96/41609, WO 96/40633 in WO 96/40140.

Z ozirom na različne motnje, ki jih lahko zdravimo s stimulacijo izraščanja nevritov in relativno malo močnih spojin, ki vežejo FKBP12, za katere vemo, da imajo to lastnost, ostaja potreba za dodatnimi nevrotrofičnimi, rotamazo vezavnimi spojinami. Zaželeno bodo take spojine imele fizikalne in kemijske lastnosti, ki bodo primerne za uporabo v farmacevtskih pripravkih, npr. biodostopnost, razpolovno dobo in učinkovito dajanje na aktivno mesto. Z ozirom na

-4-4želene lastnosti, imajo majhne organske molekule prednost pred proteini. Nadalje je zaželeno, da take spojine ne bodo imele imunosupresivne aktivnosti.

POVZETEK IZUMA

Predmet izuma je zagotoviti nevrotrofična sredstva z majhnimi molekulami. Dodaten predmet je pripraviti rotamazo vezavne spojine, ki niso imunosupresivna sredstva. Nadaljni predmet izuma je zagotovi učinkovite postopke za sintezo takih spojin, kakor tudi za njihovo sintezo koristnih intermediatov. Drug predmet izuma je zagotoviti metode za zdravljenje pacientov, ki imajo nevrološko poškodbo ali motnje, kot posledico, ali povezane s stanji, ki vključujejo (toda niso omejena na) nevralgije, mišično distrofijo, Bellovo paralizo (paralizo obraza), miastenijo gravis, Parkinsonovo bolezen, Alzheimerjevo bolezen, multiplo sklerozo, ALS, kap in ishemijo, povezano s kapjo, nevralno parapatijo in druge živčne degenerativne bolezni, bolezni motoričnih živčnih celic in poškodbe živcev, vključno s poškodbami hrbtenjače.

Take predmete smo dosegli s sredstvi pričujočega izuma, ki vežejo rotamazo, ki jih lahko uporabimo, da stimuliramo rast in regeneracijo nevronov. Dajanje teh sredstev posameznikom, ki potrebujejo terapevtsko stimulacijo rasti in regeneracije nevronov, zagotavlja učinkovite terapije pri različnih patoloških stanjih, kjer lahko pospešimo popravljanje nevronov, vključno s poškodbo perifernih živcev, povzročeno s poškodbo ali boleznijo kot je sladkorna bolezen, možgansko poškodbo, povezano s kapjo, in za zdravljenje nevroloških motenj, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo, vključno s Parkinsonovo boleznijo, Alzheimerjevo boleznijo in amiotrofično lateralno sklerozo.

V eni splošni izvedbi sredstva izuma, ki vežejo rotamazo, vključujejo spojine s splošno strukturno formulo (l-a):

-5-5-

(l-a) pri čemer:

R¹ je izbran izmed vodika, substituirane in nesubstituirane alkilne, alkenilne, arilne, C3-C8 11 12 13 cikloalkilne in C5-C7 cikloalkenilne skupine in C(R )(R )(R ), alkilna in alkenilna skupina sta opcijsko substituirani s C1-C4 alkilom, C2-C4 alkenilom, C4-C5 cikloalkenilom ali hidroksi, arilna skupina je opcijsko substituirana s halogenom, hidroksilom, NO2, CF3, C1-C6 alkilom, C2-C6 alkenilom, C-1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino ali fenilom in cikloalkilna in cikloalkenilna skupina sta opcijsko substituirani s C1-C4 alkilom, C2-C4 alkenilom, C1-C4 alkiloksi ali hidroksi in R¹¹ in R¹² sta vsak neodvisno nižji alkil ali R¹¹ in

13

R , skupaj z atomom na katerega sta vezana, tvorita cikloalkil in R je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)_n-0-W¹, kjer je n 0, 1, 2 ali 3, W¹ je R² ali C(O)R² in R² je C1-C3 alkil, opcijsko substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama;

X je izbran izmed vodika, ciano, C1-C2 alkiloksi, dimetoksimetila in kisika, kjer je, kadar je X kisik, C-X vez (to je vez, ki povezuje X na obročni ogljikov atom) dvojna vez; in

Y je izbran izmed vodika, alkila, alkenila in cikloalkila, alkilna, alkenilna in cikloalkilna skupina so na enem ali več položajih opcijsko substituirane s substituenti, izbranimi izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, arila, alkoksi, hidroksialkila, ariloksi, alkeniloksi, hidroksi, (CH₂)_p-O-W² in (CH₂)_p-N-W², kjer je p 0, 1 ali 2 in VV² je R³ ali C(O)R³, kjer je R³ alkil, alkenil ali aril, opcijsko substituiran z alkilom, arilom ali alkoksi; ali

X in Y, skupaj z dušikovim heteroatomom iz obročne strukture na katerega je Y vezan (prikazano v formuli (l-a)), tvorita 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, ki opcijsko vsebuje en dodaten heteroatom (to je, en heteroatom, razen prikazanega

-6-6dušikovega atoma iz obročne strukture), izbran izmed O in N, 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč je opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed J, K in L, ki so neodvisno kisik, C3-C5 cikloalkil ali C1-C5 alkil, opcijsko substituiran z enim ali dvema substituentoma, neodvisno izbranima izmed C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila ali dimetoksifenila, ali J in K združena tvorita fenilni obroč, opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in primernih substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla.

V alternativni splošni izvedbi je izum usmerjen na spojine s formulo (l-b);

pri čemer:

R¹ je izbran izmed vodika, substituirane in nesubstituirane alkilne, alkenilne, arilne, C3-Cq 11 12 13 cikloalkilne in C5-C7 cikloalkenilne skupine in C(R )(R )(R ), alkilna in alkenilna skupina sta opcijsko substituirani s C1-C4 alkilom, C2-C4 alkenilom, C4-C6 cikloalkenilom ali hidroksi, arilna skupina je opcijsko substituirana s halogenom, hidroksilom, NO2, CF3, C-|-C6 alkilom, C2-C6 alkenilom, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino ali fenilom in cikloalkilna in cikloalkenilna skupina sta opcijsko substituirani s C1-C4 alkilom, C2-C4 alkenilom, C1-C4 alkiloksi ali hidroksi in R¹¹ in R¹² sta vsak neodvisno nižji alkil ali R¹¹ in

13

R , skupaj z atomom na katerega sta vezana, tvorita cikloalkil in R je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)n-0-W¹, kjer je n 0, 1, 2 ali 3, W¹ je R² ali C(O)R² in R² je C1-C3 alkil, opcijsko substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama;

X in X sta vsak neodvisno izbrana izmed vodika, ciano, C1-C2 alkiloksi, dimetoksimetila in

1 2 kisika, kjer je, kadar je X ali X kisik, C-X vez (to je vez, ki povezuje X ali X na obročni

2 12 ogljikov atom) dvojna vez (to je, X ali λ je =0); ali X in X skupaj tvorita valenčno vez; in

-7-7Υ je izbran izmed vodika, alkila, alkenila in cikloalkila, alkilna, alkeniina in cikloalkilna skupina so opcijsko substituirane na enem ali več položajih s substituenti, izbranimi izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, arila, alkoksi, hidroksialkila, ariloksi, alkeniloksi, hidroksi, (CF^p-O-VV² in (CHp^-N-VV², kjer je p 0, 1 ali 2 in VV² je R³ ali C(O)R³, kjer je R³ alkil, alkenil ali aril, opcijsko substituiran z alkilom, arilom ali alkoksi; ali

2 eden izmed X in X v kombinaciji z Y, skupaj z dušikovim heteroatomom iz obročne strukture na katerega je Y vezan (prikazano v formuli (l-b)), tvori 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, ki opcijsko vsebuje en dodaten heteroatom (to je, en heteroatom poleg prikazanega dušikovega atoma iz obročne strukture), izbran izmed O in N, 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč je opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed J, K in L, ki so neodvisno kisik, C3-C5 cikloalkil ali C1-C5 alkil, opcijsko substituiran z enim ali dvema substituentoma, neodvisno izbranima izmed C3C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila ali dimetoksifenila, ali J in K združena tvorita fenilni obroč, opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in primernih substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla.

Sredstva izuma, ki inhibirajo rotamazo, vključujejo tudi farmacevtsko sprejemljive derivate takih spojin s formulo (l-a) ali (l-b).

Izum se nadalje nanaša na metode zdravljenja nevrološke poškodbe ali motenj, ki so posledica, ali povezane s stanji, ki vključujejo nevralgije, mišično distrofijo, Bellovo paralizo, miastenijo gravis, Parkinsonovo bolezen, Alzheimerjevo bolezen, multiplo sklerozo, amiotrofično lateralno sklerozo (ALS), kap in ishemijo, povezano s kapjo, nevralno parapatijo, druge nevralne degenerativne bolezni, bolezni motoričnih nevronov in poškodbe živcev, vključno s poškodbami hrbtenjače. Inventivne metode obsegajo dajanje terapevtsko učinkovite količine spojine s formulo (l-a) ali (l-b), ali njenega predzdravila, farmacevtsko aktivnega metabolita ali farmacevtsko sprejemljive (netoksične) soli pacientu, ki potrebuje tako zdravljenje. Take metode nadalje obsegajo dajanje sestavka, ki obsega učinkovito količino spojine s formulo (l-a) ali (l-b), ali njenega predzdravila, farmacevtsko aktivnega

-8-8metabolita ali farmacevtsko sprejemljive soli, v kombinaciji s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem ali razredčilom in/ali terapevtsko učinkovito količino nevrotrofičnega faktorja, izbranega izmed živčnega rastnega faktorja, inzulinskega rastnega faktorja in njegovih derivatov z manjšo aktivnostjo, kislinskega in bazičnega fibroblastnega rastnega faktorja, iz trombocitov dobljenih rastnih faktorjev, iz možganov dobljenega nevrotrofičnega faktorja, ciliarnih nevrotrofičnih faktorjev, iz glialne celične linije dobljenega nevrotrofičnega faktorja, nevrotrofina-3 in nevrotrofina 4/5, pacientu, ki potrebuje tako zdravljenje.

Izum se nanaša tudi na intermediate s formulami (II), (lil) in (V), ki so opisani spodaj in so koristni za pripravo spojin, ki modulirajo FKBP, s formulo (l-a) in (l-b). Izum se nadalje nanaša na postopke izdelave spojin z uporabo takih intermediatov.

Druge značilnosti, predmeti in prednosti izuma bodo postali razvidni iz sledečega podrobnega opisa izuma.

PODROBEN OPIS IN PREDNOSTNE IZVEDBE

FKBP-INHIBITORNA SREDSTVA IZUMA:

Kot je tu uporabljeno, imajo sledeči izrazi pomene, ki so definirani, razen, če ni drugače navedeno.

Izraz alkil pomeni razvejano ali ravnoverižno (linearno) parafinsko ogljikovodikovo skupino (nasičeno alifatsko skupino), ki ima od 1 do 10 ogljikovih atomov, ki jo na splošno lahko predstavimo s formulo C|<H2k+i. kjer je k celo število od 1 do 10. Primeri alkilov vključujejo metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, t-butil, pentil, n-pentil, izopentil, neopentil in heksil in njihove enostavne alifatske izomere. Izraz nižji alkil označuje alkil, ki ima od 1 do 8 ogljikovih atomov (to je, Cj-Ce alkil).

Izraz alkenil pomeni razvejano ali ravnoverižno olefinsko ogljikovodikovo skupino (nenasičeno alifatsko skupino, ki ima eno ali več dvojnih vezi), ki vsebuje 2 do 10 ogljikov.

-9-9Ponazorilni alkenili vključujejo etenil, 1-propenil, 2-propenil, 1 -butenil, 2-butenil, izobutenil in različne izomerne pentenile in heksenile (vključujoč tako cis kakor trans izomere).

Izraz alkoksi pomeni -O-alkil, kjer je alkil kot je definirano zgoraj. Nižji alkoksi” se nanaša na alkoksi skupine, ki vsebujejo alkilni del iz 1 do 4 ogljikovih atomov.

Izraz alkeniloksi” pomeni -O-alkenil, kjer je alkenil kot je definiran zgoraj.

Izraz “aril pomeni monocikličen ali policikličen aromatski obročni del, na primer, fenil, naftil, furil, tienil, pirolil, piridil, piridinii, pirazolii, imidazolil, pirazinil, tiazinil, oksadiazolil, H-tetrazol-5il, indolil, kinolinil, benzofuranil, benzotiofenil (tianaftenil) in podobno. Kjer je navedeno so taki arilni deli lahko opcijsko substituirani z enim ali več substituenti, na primer, halogenom (F, Cl, J, Br), nižjim alkilom, -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -O-nižjim alkilom, arilom, -O-arilom, aril-nižjim alkilom, -CO₂CH₃, -CONH₂, -OCH₂CONH₂, -NH₂, -SO₂NH₂, -OCHF₂, -CF₃, -OCF₃ in podobnimi. Arilni deli so tudi lahko substituirani z dvema substituentoma, ki tvorita most, na primer -O-(CH₂)_Z-O-, kjer je z celo število od 1 do 3.

Izraz aril-nižji alkil pomeni nižji alkil (kot je definiran zgoraj), substituiran z aritom.

Izraz ariloksi pomeni -O-aril, kjer je aril kot je definiran zgoraj.

Izraz cikloalkil pomeni monociklično ali policiklično karbociklično obročno strukturo, kjer ima vsak obroč od pet do sedem ogljikovih atomov in je nasičen. Primeri cikioalkilov vključujejo ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil in adamantil. Kjer je navedeno, je cikloalkil lahko substituiran z enim ali večimi primernimi substituenti, na primer, halogenom, alkilom, -OR ali -SR, kjer je R alkil ali aril.

Izraz cikloalkenil pomeni monociklično ali policiklično karbociklično obročno strukturo, kjer ima vsak obroč od pet do sedem ogljikovih atomov in vsaj en obroč je delno nenasičen ali ima vsaj eno dvojno vez.

-10-10Izraz heterocikel (ali koren hetero glede na obročno strukturo) pomeni obročno strukturo, ki vsebuje enega ali več heteroatomov (neogljikovih obročnih atomov), izbranih izmed O, N in S. Tako izraz heterocikloalkil pomeni cikloalkil v katerem je vsaj en obročni ogljikov atom nadomeščen s heteroatomom, izbranim izmed O, N in S.

Spojine izuma, ki inhibirajo rotamazo, so predstavljene s formulo (l-a) in (l-b), ki sta definirani zgoraj. Prednostno rotamazo inhibirajoče spojine inhibirajo rotamazno (peptidil-prolil izomerazno) encimsko aktivnost FKBP, zlasti FKBP12. Poleg tega spojine s formulo (l-a) in (l-b), rotamazo inhibirajoča sredstva izuma, vključujejo farmacevtsko sprejemljive derivate takih spojin, kot njihova predzdravila, farmacevtsko aktivne metabolite in farmacevtsko sprejemljive soli ali solvate.

V prednostnih izvedbah spojin, predstavljenih z zgornjima formulama (l-a) in (l-b), so X, X¹ in

12 X vodik ali kisik, ali X in X tvorijo valenčno vez.

V prednostnih spojinah, predstavljenih z zgornjima formulama (l-a) in (l-b), je Y alkil, ki ima enega ali več substituentov izbranih izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, arila, 2 2 alkoksi, hidroksialkila, aril-alkila, ariloksi, alkeniloksi, hidroksi, (CH2)p-0-W in (CH2)p-N-W , 2 3 3 3 pri čemer je p 0, 1 ali 2 in W je R ali C(O)R , kjer je R alkil, alkenil ali aril, opcijsko substituiran z alkilom, arilom ali alkoksi. V bolj prednostnih izvedbah je Y:

ali

-11-111 2

V drugih prednostnih izvedbah X, ali eden izmed X in X , in Y skupaj s katerimikoli vmesnimi obročnimi atomi tvorita substituiran ali nesubstituiran piperidinski ali piperazinski obroč.

Za spojine, predstavljene z zgornjo formulo (l-a) je R prednostno izbran izmed: 3,4,5r-(CH₂) trimetoksifenila; (^CH2)n W¹ , kj_er j_e m 1 ali 2 in n je 0, 1 ali 2; in C(R¹¹)(R¹²)(R¹³),

1112 13 kjer sta R in R neodvisno izbrana izmed metila in etila in R je izbran izmed H, OH,

1 2 nižjega alkila, arila in (CH2)n^-0-W , pri čemer je n 0, 1, 2 ali 3. V zgornjih formulah je W R

2 ali C(O)R , kjer je R prednostno C1-C3 alkil, opcijsko substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama.

Zlasti prednostne vrste spojin, ki so predstavljene z zgornjo formulo (l-a), so sledeče:

-12-12Zlasti prednostne vrste spojin, ki so predstavljene z zgornjo formulo (l-b) so sledeče:

-13-13Spojine izuma vključujejo tudi farmacevtsko sprejemljive derivate spojin s formulo (l-a) in (Ιό). Farmacevtsko sprejemljiv derivat označuje predzdravilo, farmacevtsko aktiven metabolit ali farmacevtsko sprejemljivo sol, ester, sol takega estra ali hidrat spojine tega izuma. Take spojine so, ko jih damo pacientu, zmožne direktno ali indirektno dajati spojino tega izuma ali njen metabolni preostanek ali produkt in s tem inhibirati rotamazno aktivnost FKBP ali pospešiti ali povečati izraščanje nevritov.

Spojine s formulo (l-a) in (l-b) lahko v farmacevtskih sestavkih uporabimo v obliki farmacevtsko sprejemljivih soli. Take soli prednostno dobimo iz anorganskih ali organskih kislin in baz. Ponazorilne soli s kislinami vključujejo acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, kafrat, kafrovsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocianat, tozilat in undekanoat. Ponazorilna soli z bazami vključujejo amonijeve soli, soli alkalijskih kovin, kot so natrijeve in kalijeve soli, soli zemljoalkalijskih kovin, kot so kalcijeve in magnezijeve soli, soli z organskimi bazami, kot so dicikloheksilaminske soli, N-metil-D-glukozaminska sol, in soli z aminokislinami, kot sta arginin in lizin. Bazične dušik vsebujoče skupine so tudi lahko kvatemizirane s takimi sredstvi kot so: nižji alkil halidi, kot metil, etil, propil in butil kloridi, bromidi ali jodidi; dialkil sulfati, kot dimetil, dietil, dibutil in diamil sulfati; dolgoverižni halidi, kot decil, lavril, miristil in stearil kloridi, bromidi in jodidi; in aralkil halidi, kot benzil in fenetil bromidi. Iz takih soli lahko pripravimo v vodi ali olju topne ali disperzibilne produkte.

Poleg tega lahko spojine izuma modificiramo z dodajanjem ustreznih funkcionalnih skupin, da povečamo selektivne biološke lastnosti. Take modifikacije, ki so v pristojnosti običajno izkušenega strokovnjaka, vključujejo tiste, ki povečajo biološko prodiranje v dani biološki sistem (na primer, kri, limfatični sistem, centralni živčni sistem), povečajo oralno razpoložljivost, povečajo topnost, da je omogočeno dajanje z injekcijo, spremenijo metabolizem in spremenijo hitrost izločanja.

-14-14Nekatere od tu opisanih spojin vsebujejo enega ali več asimetričnih centrov in zato lahko povzročijo nastanek enantiomerov, diastereoizomerov, rotamerov in drugih stereoizomernih oblik. Pričujoči izum predvidoma vključuje vse take možne stereoizomere, kakor tudi njihove racemne in optično čiste oblike. Optično aktivne (R) in (S) izomere lahko pripravimo z uporabo kiralnih sintonov ali kiralnih reagentov, ali pa jih ločimo z uporabo običajnih tehnik. Kadar tu opisane spojine vsebujejo olefinske dvojne vezi, je mišljeno, da vključujejo tako E in Z geometrijske izomere. Nadalje pričujoči izum predvidoma vključuje vse take možne rotamere, zlasti tiste, ki imajo okoli vezi različne orientacije, kot sledi:

o /\ .R'

N Ίί

Nadalje tu navedene kemijske formule lahko kažejo pojav tavtomerizma. Ker v specifikaciji slike formul lahko predstavljajo samo eno od možnih tavtomernih oblik, je potrebno razumeti, da izum obsega vsako tavtomerno obliko, ki je lahko proizvedena z uporabo razkritih orodij ali na poznan način, in ni omejen na neko tavtomerno obliko, ki je prikazana s formulami.

SINTEZNE METODE:

Spojine s formulo (l-a) lahko pripravimo iz spojin s formulo (III):

->31

I

Y (Ul)

V formuli (lil) je R izbran izmed vodika in opcijsko substituiranega alkila, alkenila, arila,

O o ¹¹ 30 I·

u.C(CH₂)_qR³⁰ u_CO(CH2)qR³⁰ 3θ cikloalkila, cikloalkenila, ' in , kjer je q 0 ali 1 in R je alkilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno

-15-15izbranimi izmed hidroksila, C-|-Cg alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila. X je vodik, ciano, C1-C2 alkiloksi, dimetoksimetil ali kisik, kjer je, kadar je X kisik, vez, ki povezuje X na obročni ogljikov atom, dvojna vez; in Y je vodik, alkilna, alkenilna ali cikloalkilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed alkilne, arilne, alkoksi, hidroksialkilne, ariloksi, alkeniloksi in hidroksi skupine, ki so nesubstituirane ali substituirane z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed hidroksila, C-|-Cg alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila, (CF^jp-O-VV² ali (CH2)p-N-W², kjer je p 0, 1 ali 2 in VV² je R³ ali 3 3

C(O)R , kjer je R alkilna, alkenilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvidno izbranimi izmed alkila, arila in alkoksi. Alternativno X in Y, skupaj z ogljikovim obročnim atomom in dušikovim heteroatomom na katerega sta vsak zase vezana, tvorita 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti J, K in L; kjer J, K in L predstavljajo substituente, neodvisno izbrane izmed kisika in C3-C5 cikloalkilne in C1-C5 alkilne skupine, ki sta nesubstituirani ali substituirani z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila in dimetoksifenila; ali kjer J in K skupaj tvorita fenilni obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla in neodvisno izbrani izmed halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-j-Cg alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila.

o ¹¹ ₃₁ h-coich^r³⁰

V prednostni izvedbi je R ' v , bolj prednostno benziloksikarbonil.

Zlasti prednostni primeri spojin s formulo (III) so:

-16-16kjer je Z benziloksikarbonil. Drugi prednostni primeri spojin s formulo (III) so:

kjer je Z benziloksikarbonil. Druga skupina prednostnih spojin s formulo (lil) sta:

OMe

OMe , kjer je Z benziloksikarbonil.

Nadaljnje prednostne spojine s formulo (lil) so izbrane izmed:

kjer je Z benziloksikarbonil.

Spojine s formulo (lil) vključujejo tiste s formulo (lll-a), ki jih lahko pod reducirnimi pogoji pretvorimo v spojine s formulo (lll-b).

-17-17-

Ο^Μ

V formuli (lll-a) je R izbran izmed opcijsko substituiranega alkila, alkenila, arila, cikloalkila, o

L_C(CH₂)_qR³⁰ . ^CO(CH₂)_qR³⁰ ‘ in ' v ,30.

cikloalkenila, ¹ in ·Ά , kjer je q 0 ali 1 in R je alkilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed hidroksila, C-j-Cg alkila, C2-C5 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila. V formulah (lll-a) in (lll-b) sta X in Y kot je definirano v formuli (l-a). Da dobimo spojino s formulo (l-a), spojino s formulo (lll-b) spojimo s spojino s formulo (IV):

OH (iv)

V formuli (IV) je R kot je definirano v formuli (l-a).

Spojine s formulo (lll-a) lahko pripravimo z uporabo spojin s formulo (II):

'N* 0^0% (II) o

I'

1-. ^CO(CH₂)_qR³⁰ _3θ

V formuli (II) je Z , pri čemer je q O ali 1 in R je alkilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed

-18-18hidroksila, C-|-C6 alkila, Cg-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila. Prednostno je Z benziloksikarbonil.

Spojine s formulo (l-b) lahko pripravimo iz spojin s formulo (V) po metodah, ki so analogne tistim, ki smo jih opisali zgoraj.

Spojine s formulo (V) vključujejo tiste s formulo (V-a), ki jih lahko pod reducirnimi pogoji pretvorimo v spojine s formulo (V-b):

O*”

N^y-:

Y X¹ (V-a)

Y X¹ x² (V-b)

V formulah (V), (V-a) in (V-b):

32 sta R in R kot je definirano za formule (lil), (lll-a) in (lll-b);

12 X in X sta vsak neodvisno vodik, ciano, C-J-C2 alkiloksi, dimetoksimetil ali =0, ali X in X skupaj tvorita valenčno vez; in

Y je kot je definirano za formule (lil), (lll-a) in (lll-b); ali

2 eden izmed X in X v kombinaciji z Y in ogljikovim obročnim atomom in dušikovim heteroatomom, na katera sta vsak zase vezana, in vsemi vmesnimi obročnimi atomi tvori 5do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti J, K in L, kjer je vsak J, K in L neodvisno izbran izmed kisika in C3-C5

-19-19cikloalkilne in C1-C5 alkilne skupine, ki sta nesubstituirani ali substituirani z enim aii več substituenti, neodvisno izbranimi izmed C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila in dimetoksifenila, ali J in K skupaj tvorita fenilni obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi izmed metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla, ki so neodvisno izbrani izmed halogena, hidroksila, NO2, CF3, Cj-Cg alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila.

Ponazorilne sinteze so opisane spodaj za pojasnitev prednostnih izvedb in značilnosti izuma.

Sledeči sintezni protokoli se nanašajo na intermediarne spojine in končne produkte, ki so identificirani v specifikaciji in v sinteznih shemah. Priprava različnih spojin pričujočega izuma je podrobno opisana z uporabo sledečih primerov, toda strokovnjakom bo zlahka razvidno, da so opisane kemijske reakcije na splošno uporabne za pripravo drugih spojin izuma, ki inhibirajo FKBP. Kadar, kot bo strokovnjaku razvidno, se reakcijo za izdelavo določenih spojin ne da uporabiti natančno tako, kot je opisano za izdelavo določenih spojin izuma, strokovnjak lahko zlahka ugotovi, glede na poznavanje stroke, da se želeno sintezo lahko uspešno izvede bodisi z izdelavo primernih modifikacij (npr., z ustreznim blokiranjem vmesnih ali zaščitnih skupin, z zamenjavo drugih običajnih reagentov ali z rutinskimi modifikacijami reakcijskih pogojev), ali da bo za pripravo take spojine primerna druga reakcija, ki je tu razkrita (ali analogna tej, ki je razkrita). Čeprav so določene zaščitne skupine (skupine, ki blokirajo reakcijo(e), z eno ali več pripadajočimi funkcionalnimi skupinami) ponazorjene v sintezah, ki so opisane spodaj, bodo strokovnjakom razvidne druge primerne zaščitne skupine, odvisno od funkcionalne skupine in posamezne uporabljene kemije. Glej npr. Greene and VVutz, πό

Protecting Groups in Chemical Synthesis (2 ed.), John Wiley & Sons, NY (1991).

Pri vseh sinteznih postopkih, ki so tu opisani (razen, če ni drugače navedeno), so izhodni materiali poznani, razpoložljivi, ali pa jih lahko zlahka pripravimo iz poznanih izhodnih materialov, vse temperature so navedene v stopinjah Celzija in vsi deli in procenti so utežni. Reagente smo kupili od komercialnih dobaviteljev kot so Aldrich Chemical Company ali Lancaster Synthesis Ltd. Reagenti in topila so bili komercialne standardne kakovosti in smo jih uporabili, kot so bili dobavljeni, s sledečimi izjemami: diklorometan (CH2CI2) smo pred

-20-20uporabo destilirali iz kalcijevega hidrida; tetrahidrofuran (THF) smo pred uporabo destilirali iz natrijevega benzofenon ketila; in metanol smo posušili preko 4-Angstrom-skih molekularnih sit.

Flash kolonsko kromatografijo smo izvedli z uporabo silikagela 60 (Merck Art 9385). ¹H-NMR (300 MHz) spektre smo merili v raztopinah CDCI3 in jih določili na inštrumentu Varian-300 z uporabo pogonske programske opreme Varian UNITYp/us300. Kemijske premike smo navedli v delih na milijon (ppm) navzdol od tetrametilsilana kot internega standarda in konstante spajanja podali v Hertzih. Za multipliciteto vrtenja smo uporabili sledeče okrajšave: br = širok, s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet in cm = kompleksen multiplet. Infrardeče (IR) spektre smo posneli na FTIR spektrometru Perkin-Elmer serija 1600 in so navedeni v valovnih številih (cm ¹). Elementna analiza je bila izvedena v Atlantic Microlab, Inc., Norcross, GA. Visoko ločljivostni masni spektri (HRMS) so bili izvedeni v Scripps Mass Spectra Laboratory, La Jolla, CA. Tališča smo določili na aparatu Mel-Temp II in so nepopravljena.

Razen, če ni drugače navedeno, smo spodaj prikazane reakcije izvedli pod pozitivnim pritiskom z balonom dušika (Ng) ali argona (Ar) pri sobni temperaturi v brezvodnih topilih in reakcijske bučke opremili z gumijasto septo za uvajanje substratov in reagentov s injekcijsko iglo. Steklovino smo posušili s segrevanjem. Analitsko tenkoplastno kromatografijo (TLC) smo izvedli na steklenih ploščah z na eni strani nanešenim silikagelom 60 F 254 (Analtech, 0.25 mm) in jih sprali s primernim razmerjem topil (v/v), kar je označeno, kjer je to potrebno. Reakcije smo testirali s TLC in jih ustavili tako kot smo presodili po porabi izhodnega materiala. Vrhove plošč smo vizualizirali z uporabo ultravijolične (UV) svetilke. Vizualizacijo lahko dosežemo tudi z uporabo barvil, kot so ninhidrin, amonijev molibdat, jodova (J2) komora ali reagent p-anizaldehid v spreju ali reagent, fosfomolibdenova kislina (Aldrich Chemical, 20 ut.% v etanolu), aktivirana s toploto.

Izdelave spojin smo tipično izvedli s podvojitvijo reakcijskega volumna z reakcijskim topilom ali ekstrakcijskim topilom in potem spiranjem z navedenimi vodnimi raztopinami z uporabo 25 vol.% ekstrakcijekega volumna (razen, če ni drugače navedeno). Raztopine s produktom smo posušili preko brezvodnega Na2SO4 pred filtracijo in odparevanjem topil pod znižanim tlakom

-21-21na rotacijskem evaporatorju, in to smo navedli kot topila smo odstranili v vakuumu. Flash kolonsko kromatografijo (Stili s sod., J. Org. Chem. 43:2923 (1978)) smo izvedli z uporabo silikagela 60 (Merck Art 9385): surovemu materialu v razmerju od okoli 20:1 do 50:1 (razen, če je navedeno drugače). Hidrogenolizo smo izvedli pri pritiskih, ki so navedeni v primerih ali pri sobnem pritisku.

Za pripravo spojin izuma lahko uporabimo reakcijske sheme, ki so opisane spodaj. Te sheme 32 vključujejo stopnje (v različnem vrstnem redu) zaščite (z zaščitno skupino R ) mostiščnega dušika, ki bo nosil substituent R¹ v končni spojini s formulo (l-a) ali (l-b), tvorbo [3.3.1 J ali [4.3.1] azaamidnega jedra in funkcionalizacijo piperazinskega ali 1,4-diazaheptanskega 1 2 obroča s substituenti X, ali X in X , in Y, da se tvorijo intermediarne spojine s formulo (lll-a) oz. (V-a):

f''// •4

Ο^Ν^Χ I

Y ^XN^Z>-x’ (l-a)

Y X' (V-a)

Take spojine s formulo (lll-a) in (V-a) pretvorimo v spojine s formulo (l-a) oz. (l-b) z:

(1) odstranitvijo zaščitne skupine R pod primernimi reducimimi pogoji (taki pogoji so strokovnjakom na tem področju na splošno zlahka razvidni, npr. v luči tistih, ki so podrobno opisani v primerih, ki so navedenini spodaj), da dobimo spojino s formulo (IIIb) ali (V-b); in (2) spajanjem nezaščitene spojine s formulo (lll-b) ali (V-b) z reagentom s formulo (IV):

O ,i. . -OH

O (iv) kjer je R kot je definirano zgoraj, pod primernimi pogoji za spajanje (taki pogoji so strokovnjakom na tem področju na splošno zlahka razvidni, npr. v luči tistih, ki so podrobno opisani v primerih, ki so navedeni spodaj);

-22-2232 da dobimo spojino s formulo (l-a) ali (l-b). Primerne zaščitne skupine R za dušik, vključujejo tiste, opisane spodaj, kakor tudi tiste, ki so na splošno poznane strokovnjakom na tem področju (glej, npr., Greene and Wutz, Protecting Gmups in Chemical Syr>thesis (2^nc* ed.), 32

John Wiley & Sons, NY (1991)). V sledečih sintezah je R prednostno zaščitna skupina benziloksikarbonil, ampak namesto njega se lahko uporabi druge primerne zaščitne skupine za dušik.

Shema 1:

Shema i, ki je predstavljena spodaj, je koristna za pripravo spojine 7 (in drugih spojin po analognih metodah, kot je zabeleženo v tabeli 1). V shemi 1 in v spodnjih primerih je Z benziloksikarbonil. Razen benziloksikarbonila lahko, kot zaščitne skupine za mostiščni dušik, uporabimo druge primerne dele molekul (glej Greene and Wutz).

I

H

NH₂/\) dioksan

Ac₂O dioksan

90°C

99% dobitek iz 1

IN

G ‘O

NaBH_{4 r} ^HCI (4N)

MeOH dioksan

80% surovi

BF₃OEt₂ (Et^SiH

CH₂CI₂

70% ‘N

H₂,1.013 bar

Pd/C 1 h

-23-23ο

A.

Vle O EDC.HCI

HOBT

TEA, CH₂CI₂

G

Fiperidin-1,2,6-trikarboksilne kisline 1-benzil ester (spojina 1)

HOOC N COOH Z

2,6-Piridin dikarboksilno kislino (25 g, 0.15 mol) smo raztopili v 2.0 M NaOH (154 ml) in H2O (30 ml) pri sobni temperaturi in dali v 500 ml Parr-ovo stekleničko. Dodali smo rodij na prašku aluminijevega oksida (5%, 1.87 g) in zmes 15 minut bistrili z argonom. Reakcijsko zmes smo stresali pod 3.79 bar vodika 48 ur. Suspenzijo smo filtrirali skozi kompaktiran celit in bister filtrat ohladili na 0°C. Z vrha smo k ohlajenemu filtratu v treh porcijah tekom 30 minut dodali benzil kloroformat (30.62 g, 0.18 mol) in pustili, da je raztopina dosegla sobno temperaturo ter jo mešali dodatnih 5 ur. Preostali benzil kloroformat smo iz zmesi ekstrahirali z dietil etrom. Vodno plast smo nakisali z 2N HCI in ekstrahirali z etil acetatom (EtOAc). EtOAc smo spustili preko kratkega sloja Na2SC>4 in uparili. Preostanek smo triturirali z EtOAc (20 ml) in dobljeno belo trdno snov zbrali z vakuumsko filtracijo, sprali z EtOAc (3 x 20 ml) in posušili na zraku, da smo dobili spojino 1 (38.3 g, 83% dobitek). Rf = 0.06 (10% ΜβΟΗ/ΟΗΟθ); ¹H NMR: δ 1.49 -1.73 (m, 4H), 1.96 - 2.03 (m, 2H), 4.48 - 4.65 (m, 2H), 5.10 (s, 2H), 7.26 - 7.35 (m, 5H).

2,4-Diokso-3-oksa-9-aza-bicikloi3.3.1lnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 2)

-24-24Piperidin-1,2,6-trikarboksilne kisline 1-benzil ester (spojina 1, 19.7 g, 64.11 mmol) smo suspendirali v anhidridu ocetne kisline (80 ml, 848 mmol) v suhi 250 ml bučki z okroglim dnom. Zmes smo mešali pri 70°C 30 minut, dokler ni nastala bistra raztopina. Preostali anhidrid ocetne kisline smo odstranili v vakuumu, da smo dobili spojino 2 (18.5 g, 100%) kot bistro olje. Material je bil zadosti dobre kvalitete, da smo ga uporabili v naslednji reakciji brez čiščenja. Produkt je bil občutljiv na vodo, zato smo ga pripravili za takojšnjo uporabo v naslednji stopnji. ¹H NMR: δ 1.57 - 2.01 (cm, 6H), 5.14 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 7.32 - 7.37 (m, 5H).

3-(2-Benziloksietin-2,4-diokso-3.9-diaza-biciklof3.3.1 lnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 3) '-Z

ΛΛ.

2,4-Diokso-3-oksa-9-aza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 2, 1.02 g, 3.52 mmol) smo raztopili v dioksanu (5 ml) in z vrha dodali 2-benziloksietilamin (0.50 g, 3.32 mmol). Zmes smo mešali pri sobni temperaturi 1 uro (h). Potem smo dodali anhidrid ocetne kisline (0.62 ml, 6.64 mmol) in reakcijsko zmes pustili segrevati pri temperaturi refluksa 5 ur. Dioksan smo uparili in flash kromatografsko čiščenje preostanka (20% EtOAc/heksan) je dalo spojino 3 (1.26 g, 90%) kot bledo rumeno olje: Rf (50% EtOAc/heksan): 0.80.

3-(2-Benziloksietil)-2-metoksi-4-okso-3,9-diaza-biciklor3.3.11nonan-9-kart)oksilne kisline benzil ester (spojina 4)

-25-253-(2-Benziloksietil)-2,4-diokso-3,9-diaza-biciklo[3.3.1 ]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 3, 0.46 g, 1.11 mmol) smo raztopili v metanolu (15 ml). Zmes smo ohladili na 0°C in z vrha v porcijah dodali NaBHLj. (0.06 g, 1.66 mmol). Reakcijsko zmes smo mešali 10 minut pri 0°C in potem dodali 4N HCI v dioksanu, da smo dobili pH v območju od 1 do 2, in reakcijsko zmes mešali preko noči pri sobni temperaturi. Metanol smo uparili in preostanek raztopili v EtOAc in zlili v nasičeno vodno raztopino NaHCO3 ter potem ekstrahirali z EtOAc (3 x 10 ml). Združene ekstrakte smo sprali s slanico (10 ml), spustili preko kratkega sloja Na2SO4 in topila uparili, da smo dobili spojino 4 (0.40 g, 85%, zmes izomerov) kot gosto bledo rumeno olje, ki je bilo zadosti dobre kvalitete, da smo ga uporabili v naslednji stopnji brez nadaljnjega čiščenja. Rf (40% EtOAc v heksanu)·. 0.45.

3-(2-Benziloksietil)-2-okso-3.9-diaza-biciklof3.3.1lnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 5)

Κ'Υζ cr

3-(2-Benziloksietil)-2-metoksi-4-okso-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 4, 0.34 g, 0.76 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (5 ml) v 25 ml bučki pod argonom. V reakcijsko bučko smo po kapljicah dodali BF3OEt2 (0.18 ml, 1.52 mmol) (sprostili so se hlapi) in nato trietilsilan (0.24 g, 1.52 mmol) in reakcijsko zmes mešali preko noči. CH2CI2 smo odparili in preostanek raztopili v EtOAc in sprali z nasičenim NaHCO3 (2x10 ml). Zmes smo ekstrahirali z EtOAc (3x10 ml). Organsko plast smo posušili preko Na2SO4 in koncentrirali. Čiščenje preostanka s flash kolonsko kromatografijo z 20% EtOAc v heksanu je dalo spojino 5 (0.27 g, 89%, 1:1 zmes enantiomerov) kot bistro olje. Rf = 0.42 (50% EtOAc v heksanu); ¹H NMR (glavni rotamer): δ 1.62 -1.72 (m, 6H), 3.25 - 3.50 (m, 2H), 3.68 - 3.90 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 7.26 - 7.34 (m, 10H).

3-(2-Benziloksi-etil)-3,9-diaza-biciklor3.3.1 lnonan-2-on (spojina 6)

-26-26-

3-(2-Benziloksietil)-2-okso-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 5, 0.15 g, 0.36 mmol) smo raztopili v MeOH (5 ml) in dodali paladij (10%) na aktiviranem ogljiku (0.03 g). Vodik smo dovajali preko balona 1 uro. Črno suspenzijo smo potem filtrirali skozi kompaktiran celit in metanol odstranili z visoko-vakuumskim rotacijskim evaporatorjem, da smo dobili spojino 6 (0.09 g, 90%) kot gosto olje, ki je bilo dovolj dobre kvalitete, da smo ga uporabili v reakciji spajanja brez nadaljnjega čiščenja.

1-r3-(2-Benziloksietil)-2-okso-3.9-diaza-biciklor3.3.nnon-9-il1-2-(3,4,5-trimetoksifeniD-etan1,2-dion (spojina 7)

3-(2-Benziloksietil)-3,9-diaza-biciklo[3.3.1 ]nonan-2-on (spojina 6,0.1 g, 0.36 mmol) in 2-okso3,4,5-trimetoksifenilocetno kislino (34.3 mg, 1.43 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (5 ml) in potem raztopino ohladili na 0°C. Dodali smo hidroksibenzotriazol hidrat (HOBt, 0.06 g, 0.43 mmol) in nato 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (EDC»HCI, 0.08 g, 0.43 mmol) in trietilamin (TEA, 0.06 g, 0.43 mmol). Reakcijsko zmes smo pustili, da je dosegla sobno temperaturo in raztopino mešali 6 ur. Hlapne snovi smo odstranili z visokovakuumskim rotacijskim uparevalnikom. Preostanek smo raztopili v EtOAc in sprali z 10% raztopino citronske kisline (10 ml) in nato z vodo (10 ml), nasičenim NaHCO3 (10 ml) in

-27-27slanico (10 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na₂SO4 in koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (30% EtOAc v heksanu) je dalo spojino 7 (0.14 g, 78%) kot bledo rumeno olje. Rf (50% EtOAc v heksanu) = 0.13; IR: 2941, 2870,1646, 1583, 1499, 1451, 1416, 1323, 1239, 1166,1127, 1007, 733 cm'¹; ¹H NMR (glavni rotamer): δ 1.60-2.18 (m, 6H), 3.21 - 3.29 (m, 1H), 3.50 (dd, 1H, J = 37, 12.5), 3.67 - 4.01 (m, 13H), 4.15 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 5.19 (s, 1H), 7.19 (d, 2H, J = 8.7), 7.26 - 7.37 (m, 5H); HRMS (M⁺H⁺): pričakovano 497.2288, opaženo 497.2274.

Shema 2:

Spojino 12 in analoge, ki so pokazani v tabeli 1, lahko na splošno pripravimo po metodi iz sheme 2. V tej sintezni shemi je Z benziloksikarbonil (npr., v spojinah 8, 9 in 10). Razen benziloksikarbonila lahko uporabimo tudi druge dele molekul, ki so primerni za uporabo kot zaščitne skupine za mostiščni dušik.

-28-28MeO ΟΜβ

·►

O N

N

OMe

OMe

3-[2-(2-Metoksifenil)-etill-2,4-diokso-3,9-diaza-biciklor3.3.1lnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 8) 'Me

2,4-Diokso-3-oksa-9-aza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 2, 1.00 g, 3.45 mmol), ki smo ga pripravili iz spojine 1, smo raztopili v dioksanu (1 ml) in z vrha dodali 2-metoksifenetilamin (0.50 ml, 3.45 mmol). Zmes smo mešali pri sobni temperaturi 1 uro. Po tem času smo dodali anhidrid ocetne kisline (0.65 ml, 6.9 mmol) in reakcijsko zmes segrevali pri temperaturi vrelišča 5 ur. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (20% EtOAc v heksanu) je dalo spojino 8 (1.23 g, 90% dobitek) kot bistro olje. Rf = 0.75 (50% EtOAc v heksanu), 0.66; ¹H NMR; δ 1.75 - 2.05 (m, 6H), 2.84 - 2.89 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 4.04 - 4.10 (m, 2H), 4.90 (brs, 2H), 5.16 (s, 2H), 6.78 - 6.83 (m, 2H), 7.05 (dd, 1H, J = 7.5, 1.6), 7.13 7.20 (m, 1 H), 7.33 - 7.41 (m, 5H).

2-Hidroksi-3-r2-(2-metoksi-fenil)-etiH-4-okso-3.9-diaza-biciklor3.3.nnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 9)

-29-29-

3-[2-(2-Metoksi-fenil)-etii]-2,4-diokso-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 8, 0.77 g, 1.82 mmol) smo raztopili v metanolu (18 ml). Zmes smo ohladili na 0°C in z vrha po porcijah dodali NaBH4 (0.14 g, 3.64 mmol). Reakcijsko zmes smo mešali 10 minut in jo potem previdno pogasili z vodo. MeOH smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo sprali z 10% citronsko kislino (5 ml), vodo (5 ml), nasičenim ΝθΗΟΟθ ( 5 ml) in slanico (5 ml) in na koncu spustili skozi kratek sloj Na2SO4- Topila smo odpadli, da smo dobili spojino 9 (0.65 g, 83%, zmes izomerov) kot bistro olje, ki je bilo dovolj dobre kvalitete, da smo ga v naslednji stopnji uporabili brez nadaljnjega čiščenja. Rf = 0.5 (50% EtOAc v heksanu).

Spojina 10

2-Hidroksi-3-[2-(2-metoksi-fenil)-etil]-4-okso-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 9, 0.65 g, 1.52 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (1 ml) in ohladili na 0°C. Dodali smo trifluoroocetno kislino (TFA, 0.59 ml, 7.64 mmol) in reakcijsko zmes preko noči mešali pri 23°C. Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek raztopili v EtOAc (10 ml) in sprali z NaHCO3 (10 ml) in slanico (10 ml). Organsko plast smo posušili preko Na2SO4 in koncentrirali. Preostanek smo očistili s flash kolonsko kromatografijo (40% EtOAc v heksanu), da smo dobili spojino 10 (0.54 g, 87%, en diastereomer) kot bistro olje. Rf

-30-30= 0.30 (50% EtOAc v heksanu); ¹H NMR: δ 1.69 - 2.06 (m, 6H), 2.72 - 3.10 (m, 3H), 3.83 (s, 3H), 4.55 - 5.27 (m, 6H), 6.73 - 6.85 (m, 2H), 7.03 - 7.34 (m, 6H).

Spojina 11

Adukt 10 (0.26 g, 0.64 mmol) smo raztopili v MeOH (5 ml) in dodali paladij (10%) na aktiviranem ogljiku (0.05 g). Vodik smo s pomočjo balona dovajali 1 uro. Črno suspenzijo smo potem filtrirali skozi kompaktiran celit in metanol odstranili z visoko-vakuumskim rotacijskim uparevalnikom, da smo dobili spojino 11 (0.13 g, 76%) kot gosto olje, ki je bilo dovolj dobre kakovosti, da smo ga v naslednji stopnji uporabili brez nadaljnjega čiščenja.

Spojina 12

Adukt 11 (0.13 g, 0.48 mmol) in 2-okso-3,4,5-trimetoksifenil ocetno kislino (0.14 g, 0.57 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (5 ml) in raztopino ohladili na 0°C. Dodali smo HOBt (0.08 g, 0.57 mmol) in nato EDC«HCI (0.11 g, 0.57 mmol) in TEA (0.08 ml, 0.57 mmol). Reakcijsko zmes smo pustili, da je dosegla sobno temperaturo, in raztopino mešali 6 ur. Hlapne snovi smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek raztopili v EtOAc in sprali z 10% raztopino citronske kisline (10 ml) in nato z vodo (10 ml), nasičenim vodnim NaHCO3 (10 ml) in slanico (10 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na2SO4 in jih potem koncentrirali.

-31-31Flash kromatografsko čiščenje preostanka (30% EtOAc v heksanu) je dalo spojino 12 kot rumeno olje (0.19 g, 83%). Rf = 0.42 (50% EtOAc v heksanu); IR: 2941, 2838, 1645, 1584, 1502,1453,1329, 1265,1164,1128,1074, 1003, 734 cm'¹; ¹H NMR (glavni rotamer): δ 1.89

- 2.19 (m, 6H), 2.70 - 3.20 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 3.68 - 3.90 (m, 9H), 4.56 - 4.67 (m, 2H), 4.94

- 5.01 (m, 1H), 5.21 (s, 1H), 5.75 (s, 1H), 6.23 (d, 1H, J = 7.5), 6.36 - 6.46 (m, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 7.26 - 7.31 (m, 1H); HRMS (M⁺Na⁺): pričakovano 517.1951, opaženo 517.1951.

Shema 3:

Spojine, kot je spojina 15 spodaj, in druge sorodne spojine, kot je pokazano v tabeli 1, lahko pripravimo po splošni metodi iz sheme 3, kjer je Z primerna zaščitna skupina za dušik, kot je benziloksikarbonil.

-32-322_l4-Diokso-3-(4-fenilbutil)-3,9-diaza-biciklo[3.3.1lnonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 13)

[3.3.1 jAnhidrid 2 (0.54 g, 1.89 mmol, pripravljen iz pojine 1) smo raztopili v 1 ml dioksana. Z vrha smo dodali 4-fenilbutilamin (0.28 g, 1.89 mmol). Zmes smo mešali pri sobni temperaturi 1 uro. Po tem času smo dodali anhidrid ocetne kisline (0.62 ml, 3.78 mmol) in reakcijsko zmes segrevali pri temperaturi vrelišča 5 ur. Dioksan smo odparili in flash kromatografsko čiščenje preostanka (40% EtOAc v heksanu) je dalo spojino 13 (0.75 g, 95% dobitek) kot brezbarvno gosto olje. Rf = 0.66 (40% EtOAc v heksanu); IR: 2935, 2863,1710, 1688, 1430, 1341, 1311, 1256, 1126, 1096, 1069, 749, 699 cm'¹; ¹H NMR: δ 1.41 -2.04 (m, 8H), 2.61 (t, 2H, J = 6.9), 3.79 (t, 2H, J = 6.9), 4.96 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 7.14 - 7.37 (m, 10H).

3-(4-Fenilbutil)-3,9-diaza-biciklo[3.3.1 lnonan-2,4-dion (spojina 14)

2,4-Diokso-3-(4-fenilbutil)-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-9-karboksilne kisline benzil ester (spojina 13, 0.57 g, 1.36 mmol) smo raztopili v THF (3 ml) in dodali 10% paladij na aktiviranem ogljiku (0.12 g). Vodik smo s pomočjo balona dovajali 1 uro. Črno suspenzijo smo potem filtrirali skozi kompaktiran celit in THF odstranili z visoko-vakuumskim rotacijskim

-33-33uparevalnikom, da smo dobili spojino 14 (0.36 g, 92%) kot gosto olje, ki je bilo dovolj dobre kakovosti, da smo ga uporabili v naslednji stopnji brez nadaljnjega čiščenja.

9-(Qkso-(3,4,5-trimetoksifenil)-acetin-3-(4-fenil-butil)-3,9-diaza-biciklof3.3.nnonan-2,4-dion (spojina 15)

3-(4-Fenilbutil)-3,9-diaza-biciklo[3.3.1]nonan-2,4-dion (spojina 14, 0.42 g, 1.47 mmol) in 2okso-3,4,5-trimetoksifenilocetno kislino (0.35 g, 1.47 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (5 ml) in raztopino ohladili na 0°C. Dodali smo HOBt (0.21 g, 1.54 mmol) in nato EDOHCI (0.30 g, 1.54 mmol) in TEA (0.15 g, 1.47 mmol). Reakcijsko zmes smo pustili, da je dosegla sobno temperaturo in jo mešali 5 ur. Hlapne snovi smo odstranili z uporabo visoko-tlačnega rotacijskega uparevalnika. Preostanek smo raztopili v EtOAc in sprali z 10% raztopino citronske kisline (10 ml) in nato z vodo (10 ml), nasičenim NaHCO3 (10 ml) in slanico (10 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na2SO4 in koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (30% EtOAc v heksanu) je dalo spojino 15 kot bledo rumeno trdno snov (0.25 g, 34%, en izomer). Tališče = 101-103°C; Rf = 0.32 (50% EtOAc v heksanu); IR: 2939, 2866, 1739, 1682, 1651, 1582, 1503, 1454, 1416, 1361, 1337, 1243, 1167, 1126, 1067, 991, 914, 862 cm ¹; ¹H NMR (glavni rotamer): δ 1.56 - 1.64 (m, 5H), 1.93 - 2.01 (m, 5H), 2.61 2.66 (m, 2H), 3.80 - 3.85 (m, 2H), 3.95 (s, 9H), 4.51 (brs, 1H), 5.46 (brs, 1H), 7.14 - 7.29 (m, 7H); HRMS (M⁺H⁺): pričakovano 509.2288, opaženo 509.2275; EA: izračunano, C (66.13), H (6.34), N (5.51); ugotovljeno, C (66.00), H (6.37), N (5.50).

Shema 4:

-34-34Shema 4 je koristna za pripravo spojin s formulo 18 in podobnih spojin, kot je navedeno v tabeli 1 (npr., z variiranjem arilmetilbromidnega reagenta, ki smo ga uporabili v prvi stopnji).

V formuli 18 so R3, R4, R5, Rq in R7 vsak neodvisno H ali katerikoli primeren substituent, povezan na obročno jedro preko O, N, C ali S. V zgornjih formulah je Z zaščitna skupina, kot je benziloksikarbonil.

Spojino 16 pustimo reagirati z aril-substituiranim bromometanom v prisotnosti natrijevega hidrida in DMF, da dobimo spojino 17. Spojina 17 potem reagira z žvepleno kislino, da dobimo spojino s formulo 18. Spojine s formulo 18 pretvorimo v spojine s formulo (l-a) z odstranitvijo zaščitne skupine Z in spajanjem nastalega produkta s spojino s formulo (IV).

-35-35-

-36-36Končna stopnja spajanja z reagentom s formulo (IV) pretvori spojino 31 v želeno spojino s formulo (l-a). Ta shema je deloma uporabna za pripravo spojin, kot so tiste spojine, ki so identificirane v tabeli 1 spodaj.

Shema 6:

Shema 6 je koristna za pripravo spojine 159 in drugih sorodnih spojin, kot je prikazano v tabeli 1.

HOOC

COOH

Z

ACjO 60 °C

MeOH

n.

MeOOC N COOH (ΛοΛ)

232 ^x^SiMe₃

-2e (4.2F/mol)

->NaOMe/MeOH

MeOOC

233

OMe

TiCI₄ CH2CI2 -78 °C

MeOOC tjl Z

Oso₄-nmmo

-j aceton-voda

234

MeOOC^	7-	OH VOdnl X N3J04
235	Z	OH eter

	-CHO	TMOF/TsOH
MeOOC tjl		95 °C. 5h
Z
236

MeOOC

237 'Me 'OMe vodni

NaOH

HOOC

-►

Z

238

EDC.HCI

HOBt

CH₂Cl2

239 '^Me PPTS/toluen BocaO °^Me 80-90 °C ^{_ H}2^/Pd<

2h dioksan

240

Boc

1.4M HCI/dioksan

->2- MeO_

MeOV-%_H

MeO O

EDC.HCI

DMAP

CHsCb

-37-37-

Piperidin-1,2,6-trikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina 232)

2,4-Diokso-3-oksa-9-aza-biciklo[3.3.1 ]nonan-9-karboksi,ne kisline benzil ester (spojina 2, 10 g, 34.51 mmol) smo raztopili v metanolu (50 ml). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 2 uri. MeOH smo odparili, da smo dobili spojino 232 (10 g, 96%). Rf = 0.47 (10% MeOH/CH2Cl2). Material je bil dovolj dobre kakovosti, da smo ga v naslednji reakciji uporabili brez čiščenja.

6-Metoksi-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1 -benzil ester 2-metil ester (spojina 233)

Piperidin-1,2,6-trikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina 232, 10 g, 31.15 mmol) smo raztopili v metanolu (80 ml). Dodali smo 1M raztopino natrijevega metoksida v metanolu (20 ml). Uporabili smo konstanten tok (z uporabo platinastih elektrod) 0.3 A za 1.96 ure, ob uporabi v celoti 4.17 F/mol. Metanol smo odparili. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (1:2 EtOAc/heksan) je dalo spojino 233 (9.14 g, 95%). Rf = 0.9 (10% MeOH/CH₂CI₂).

6-Alil-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina 234)

6-Metoksi-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina 233, 1,04 g, 3.39 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (10 ml) in raztopino ohladili na -78°C ob uporabi kopeli iz mešanice suhega ledu in acetona. Tekom 1 minute smo po kapljicah dodali 1M raztopino T1CI4 ^v CH2CI2 (3.7 ml) in nato aliltrimetilsilan (1.61 ml, 10.14 mmol). Kopel smo zamenjali za vodno kopel in reakcijsko zmes mešali 2 uri. Reakcijsko zmes smo zlili v slanico (50 ml) in

-38-38ekstrahirali s CHCI3 (2 x 50 ml). Združeni organski plasti smo sprali z nasičeno raztopino NaHCO3 (50 ml) in na koncu posušili preko Na2SO4. Topilo smo uparili in preostanek očistili s flash kolonsko kromatografijo (1:5 EtOAc/heksan), da smo dobili spojino 234 (0.91 g, 84%). Rf = 0.78 (1:2 EtOAc/heksan).

6-(2,3-Dihidroksi-Dropih-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina

6-Alil-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1 -benzil ester 2-metil ester (spojina 234, 0.087 g, 0.2 mmol) smo raztopili v acetonu (2 ml) in vodi (0.25 ml). Dodali smo N-metilmorfolin oksid (0.068 g, 0.58 mmol) in nato 2.5% raztopino OSO4 v t-BuOH (0.14 ml). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 14 ur. Ob mešanju smo dodali natrijev pirosulfat (0.3 g) v vodi (1 ml) in nastalo raztopino filtrirali skozi celit in sprali z etanolom (10 ml). Topila smo odstranili in preostanek očistili s flash kolonsko kromatografijo (100% EtOAc), da smo dobili spojino 235 (0.086 g, 89% kot zmes izomerov). Rf = 0.12 in 0.06 (2:1 EtOAc/heksan).

6-(2-Qkso-etin-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1 -benzil ester 2-metil ester (spojina 236)

6-(2,3-Dihidroksi-propil)-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina 235, 0.614 g, 1.75 mmol) smo raztopili v Et20 (20 ml) in ohladili na 0°C. Dodali smo deset procentno vodno raztopino NaJO4 (4 ml) in reakcijsko zmes mešali 1 uro. Reakcijsko zmes smo zlili v slanico (15 ml) in ekstrahirali z Et2O (3 x 20 ml). Združeno organsko plast smo nadalje sprali z vodnim NaS2O3 (10 ml), nasičeno raztopino NaHCO3 (10 ml), slanico (10 ml) in na koncu posušili preko MgSO4- Topila smo odstranili, da smo dobili spojino 236 (0.53 g, 95%). Rf = 0.67 (1:1 EtOAc/heksan). Material je bil dovolj dobre kvalitete, da smo ga v naslednji reakciji uporabili brez čiščenja.

6-(2,2-Dimetoksi-etil)-piperadin-1,2-dikarboksilne kisline 1 -benzil ester 2-metil ester (spojina

6-(2-Okso-etil)-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1 -benzil ester 2-metil ester (spojina 236, 0.4 g, 1.25 mmol), trimetil ortoformat (5 ml) in p-toluensulfonske kisline monohidrat (0.03 g) smo

-39-39zdužili in reakcijsko zmes mešali pri sobni temperaturi 12 ur. Dodali smo vodni NaHCO₃ (25 ml) in reakcijsko zmes ekstrahirali s CHCI₃ (3 x 100 ml). Združene organske plasti smo posušili preko MgSO4 in koncentrirali. Preostanek smo očistili s flash kromatografijo (1:2 EtOAc/heksan), da smo dobili spojino 237 (0.441 g, 96%). Rf = 0.75 (1:1 EtOAc/heksan).

2-(2.2-Dimetoksi-etil)-6-fenetilkarbamoil-piperidin-1-karboksilne kisline benzil ester (spojina

239)

6-(2,2-Dimetoksi-etil)-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina

237, 0.350 g, 0.96 mmol) smo raztopili v metanolu (5 ml) in 2N NaOH (4 ml). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 8 ur. Metanol smo odparili in preostanek raztopili v Et₂O in sprali s 5% KHSO4 (10 ml), slanico (10 ml), posušili preko Na₂SO4 in koncentrirali, da smo dobili spojino 238 (0.335 g, 0.96 mmol), ki smo jo v naslednji reakciji uporabili brez nadaljnjega čiščenja.

6-(2,2-Dimetoksi-etil)-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester 2-metil ester (spojina

238, 0.335 g, 0.96 mmol) in fenetil amin (0.14 g, 1.15 mmol) smo raztopili v CH₂CI₂ (20 ml). Dodali smo HOBt (0.156 g, 1.15 mmol) in nato EDOHCI (0.221 g, 1.15 mmol). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 18 ur. Dodali smo nasičeno raztopino NaHCO₃ (25 ml) in potem ekstrahirali s CHCI3 (2 x 50 ml). Združeni organski plasti smo posušili preko Na₂SO4 in potem koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan v razmerju 1:1) je dalo spojino 239 (0.374 g, 86%). Rf = 0.47 (1:1 EtOAc/heksan).

2-Okso-3-fenetil-3,10-diaza-biciklo[4.3.11dekan-10-karboksilne kisline terc-butil ester (spojina

2-(2,2-Dimetoksi-etil)-6-fenetilkarbamoil-piperidin-1-karboksilne kisline benzil ester (spojina 239, 0.297 g, 0.65 mmol) smo raztopili v toluenu (15 ml) in bučko potopili v oljno kopel s temperaturo 80°C. Dodali smo piridinijev p-toluen sulfonat (0.0120 g, 0.05 mmol) in reakcijsko zmes mešali pri 80°C 2 uri. Po tem času smo reakcijsko zmes ohladili in nastalo oborino odstranili s filtracijo. Toluen smo odparili in preostanek raztopili v dioksanu (10 ml). Dodali smo N-(terc-butoksikarbonil) anhidrid (0.285 g, 1.31 mmol) in 10% paladija na aktiviranem

-40-40ogljiku (0.1 g). Vodik smo dovajali preko Parrovega aparata in reakcijsko zmes stresali pri 3.45 bar 12 ur. Črno suspenzijo smo potem filtrirali skozi kompaktiran celit in odstranili dioksan. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (1:2 EtOAc/heksan) je dalo spojino 240 (0.211 g, 90%). Rf = 0.31 (1:2 EtOAc/heksan).

-(2-Okso-3-fenetil-3,10-diaza-biciklor4.3.1 ldek-10-ih-2-(3,4,5-trimetoksi-feni0-etan-1,2-dion (spojina 159)

2-Okso-3-fenetil-3,10-diaza-biciklo[4.3.1]dekan-10-karboksilne kisline terc-butil ester (spojina 240, 0.204 g, 0.56 mmol) smo raztopili v 4M HCI v dioksanu (3 ml) in raztopino mešali pri sobni temperaturi 1 uro. Topilo smo odstranili in preostanek raztopili v CHCI3 (50 ml), sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, posušili preko NaSO4 in koncentrirali, da smo dobili belo trdno snov (0.142 g, 0.55 mmol), ki smo jo raztopili v CH2CI2 (10 ml). Dodali smo 3,3-dimetil-2okso-pentanojsko kislino (0.131 g, 0.54 mmol), EDOHCI (0.126 g, 0.66 mmol) in 4-DMAP (0.081 g, 0.66 mmol) in reakcijsko zmes mešali pri sobni temperaturi 18 ur. Hlapne snovi smo odstranili z visoko-vakuumskim uparevalnikom in preostanek raztopili v EtOAc in sprali z vodo (10 ml), 1N raztopino HCI (20 ml), nasičenim NaHCO3 (20 ml) in slanico (20 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na2SO4 in koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan, 2:1) je dalo končno spojino 159 (0.120 g, 45% dobitek). Rf = 0.4 (EtOAc/heksan, 2:1).

Shema 7:

Spojino 162 in podobne spojine lahko pripravimo kot je opisano spodaj.

HOOC t[J 238 ²

Me

Y)Me

1)H₂, Pd-C MeOH

2) FmocCI, NaHCO3 dioksan

100°C 1.5h

PPTS/toluen

-41-41244

moc

2.

1.NaOMe/MeOH

EDC.HCI

HOBt

CH₂CI₂

MeO O

OMe

OMe 'OMe

2-(2,2-Dimetoksi-etil)-6-(4-fenil-butilkarbamoil)-piperidin-1 -karboksilne kisline benzil ester (spojina 242)

6-(2,2-Dimetoksi-etil)-piperidin-1,2-dikarboksilne kisline 1-benzil ester (spojina 238, 1 g, 2.85 mmol) in 4-fenilbutil amin (0.51 g, 3.42 mmol) smo raztopili v CH2CI2 (60 ml). Dodali smo HOBt (0.462 g, 3.42 mmol) in nato EDC*HCI (0.655 g, 3.42 mmol). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 12 ur. Dodali smo nasičen NaHCO3 (25 ml) in reakcijsko zmes ekstrahirali s CHCI3 (2 x 50 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na2SO4 in potem koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan, 1:1) je dalo spojino 242 (1.294 g, 94%). Rf = 0.62 (EtOAc/heksan, 1:1).

2-(2,2-Dimetoksi-etil)-6-(4-fenil-butilkarbamoil)-piperidin-1-karboksilne kisline 9H-fluoren-9ilmetil ester (spojina 243)

2-(2,2-Dimetoksi-etil)-6-(4-fenil-butilkarbamoil)-piperidin-1 -karboksilne kisline benzil ester (spojina 242, 0.887 g, 1.83 mmol) smo raztopili v metanolu (50 ml). Dodali smo paladij (10%) na aktiviranem ogljiku (0.09 g). Vodik smo dovajali s pomočjo Parrovega aparata in reakcijsko zmes stresali pri 3.45 bar 15 ur. Črno suspenzijo smo potem filtrirali skozi kompaktiran celit in metanol odstranili. Preostanek smo raztopili v dioksanu (25 ml). Dodali smo 9-fiuorenilmetil kloroformat (0.473 g, 1.83 mmol) in nato NaHCC>3 (0.307 g, 3.66 mmol), raztopljen v vodi (7 ml). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 10 ur, jo zlili v raztopino ledu in 5% KHSO4 in potem ekstrahirali s CHCI3 (2 x 100 ml). Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan, 1:2) je dalo spojino 243 (1.050 g, 100%). Rf = 0.59 (EtOAc/heksan, 1:1).

-42-422-Okso-3-(4-fenil-butil)-3.10-diaza-biciklof4.3.11dek-4-en-1O-karboksilne kisline 9H-fluoren-9metil ester (spojina 244)

2-(2,2-Dimetoksi-etil)-6-(4-fenil-butilkarbamoil)-piperidin-1 -karboksilne kisline 9-H-fluoren-9ilmetil ester (spojina 243, 1 g, 1.75 mmol) smo raztopili v toluenu (25 ml). Dodali smo piridinijev p-toluen sulfonat (0.02 g, 0.08 mmol) in reakcijsko zmes mešali pri 100°C 2 uri. Po tem času smo reakcijsko zmes ohladili, toluen odparili in preostanek raztopili v EtOAc (75 ml), sprali z nasičeno raztopino NaHCO3 (25 ml) in posušili preko Na2SO4- Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan, 1:2) je dalo spojino 244 (0.770 g, 87%). Rf = 0.5 (EtOAc/heksan, 1:2).

-f2-Okso-3-(4-fenil-butil)-3,10-diaza-biciklor4.3.11dek-4-en-10-il1-2-(3.4.5-trimetQksi-fenil)etan-1,2-dion (spojina 162)

2-Okso-3-(4-fenil-butil)-3,10-diaza-biciklo[4.3.1 ]dek-4-en-10-karboksilne kisline 9H-fluoren-9ilmetil ester (spojina 244, 0.740 g, 1.46 mmol) smo raztopili v metanolu (15 ml) in dodali 1N raztopino NaOMe v metanolu (2.5 ml). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 2 uri. Hlapne snovi smo odstranili in produkt ekstrahirali s CHCI3, posušili preko Na2SO4 in koncentrirali do bele oborine, ki smo jo raztopili v CHCI3 (10 ml). Dodali smo 3,3-dimetil-2okso-pentanojsko kislino (0.141 g, 0.58 mmol), HOBt (0.080 g, 0.58 mmol), EDOHCI (0.113 g, 0.58 mmol) in TEA (0.082 ml, 0.58 mmol) in reakcijsko zmes mešali pri sobni temperaturi 18 ur. Hlapne snovi smo odstranili z uporabo visoko-vakuumskega uparevalnika in preostanek raztopili v EtOAc in sprali z 10% raztopino citronske kisline (10 ml) in nato z vodo (10 ml), nasičenim NaHCO3 (10 ml) in slanico (10 ml). Združene organske plasti smo posušili preko Na2SO4 in koncentrirali. Flash kromatografsko čiščenje preostanka (EtOAc/heksan, 1:1) je dalo spojino 162 (0.122 g, 50%). Rf (EtOAc/heksan, 1:1): 0.122.

BIOKEMIJSKI IN BIOLOŠKI TESTI:

Za določitev aktivnosti spojin pričujočega izuma lahko uporabimo raznovrstne teste in tehnike. Aktivnost spojine izuma za stimulacijo izraščanja nevritov se direktno nanaša na

-43-43njeno vezavno afiniteto za FKBP12 in njeno zmožnost, da inhibira FKBP12 rotamazno aktivnost. Zato da določimo te zadnje lastnosti lahko uporabimo teste, ki so v stroki poznani za merjenje vezave ligandov in aktivnosti encimov. Testi za stimulacijo izraščanja nevritov so opisani spodaj.

Na primer, spojine lahko testiramo, da določimo njihovo nevrotrofično aktivnost, z uporabo metode, ki jo je opisal Lyons s sod., Proč. Natl. Acad. Sci., 91:3191-3195 (1994). Pri tem testu za izraščanje nevritov na podganjem feokromocitomu, podganje feokromocitomne celice PC12 vzdržujemo pri 37°C in 5% CO2 v Dulbeccovem modificiranem Eaglesovem mediju (DMEM), ki mu dodamo 10% s toploto inaktivirani konjski serum in 5% s toploto inaktivirani fetalni goveji serum. Celice potem nanesemo na plošče v količini 10 na 35 mm 2 jamico za gojenje celičnih kultur s kolagenom iz podganjega repa v količini 5 mg/cm in jih pustimo, da se pritrdijo. Gojišče potem zamenjamo z DMEM, ki mu dodamo 2% konjski serum, 1% fetalni goveji serum, živčni rastni faktor (NGF) in/ali različne koncentracije testnih spojin. Kontrolnim kulturam damo NGF bre2 katerekoli od testnih spojin.

Druga ponazoriina metoda, ki jo lahko uporabimo za merjenje učinkovitosti za stimulacijo izraščanja nevritov je test na podganjih dorzalnih bazalnih ganglijih. Pri tem testu seciramo dorzalne bazalne ganglije iz 16 dni starih Sprague-Dawley podganjih zarodkov. Senzorične ganglije potem gojimo v s kolagenom obloženih 35 mm Falconovih posodah z gojiščem N-2 (DMEM/Ham's F12, 1:1) pri 37°C v okolju s 15% CO2. Gojišču dodamo selen, progesteron, inzulin, putrescin, glukozo, penicilin in streptomicin. Ganglije potem obdelamo z različnimi koncentracijami NGF (0-100 ng/ml) in testno spojino. Senzorične ganglije opazujemo vsake dva do tri dni pod fazno kontrastnim mikroskopom in merimo dolžine aksonov. Glej Lyons s sod., PNAS, 91:3191-3195 (1994).

Za merjenje aktivnosti spojin pričujočega izuma lahko uporabimo druge primerne teste. Na primer, imunosupresivno aktivnost lahko ocenimo z merjenji inhibicije kalcinevrin fosfatazne aktivnosti s kompleksi spojin izuma, vezanimi na FKBP (Babine s sod., Bioorg. Med. Chem. Leti., 6, 385-390, 1996). Fosfopeptid fosfatazno aktivnost kalcinevrina testiramo pri 30°C z uporabo kontinuirno združenega spektrofotometričnega testa (Etzkom s sod., Biochemistry, 32, 2380, 1994) in fosforiliranega 19-memega peptidnega substrata, dobljenega iz

-44-44regulatome podenote (Rn) od cAMP odvisne protein kinaze. Testna zmes vsebuje 50 mM MOPS (pH 7.5), 0.1 M NaCI, 6 mM MgCl2> 0.5 mg/ml govejega serumskega albumina, 0.5 mM ditiotreitol, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, ²⁰ μΜ fosforiliran R|| peptid, 20 nM humani rekombinanti kalclnevrin, 40 nM kalmodulin, 10 pg/ml purin ribonukleozid fosforilaze in 200 μΜ metiltiogvanozin, kot je opisal Etzkom s sod., in 1% dimetilsulfoksid (DMSO) kot pomožno topilo in 100 μΜ FKBP. Spojine testiramo za od FKBP odvisno inhibicijo kalcinevrina pri njihovi maksimalni topnosti. Pod temi pogoji smo izmerili, da je za inhibicijo humanega rekombinantnega kalcinevrina s FKBP-FK506 navidezna konstanta inhibicije 43 nM.

Vezavo spojin na FKBP lahko merimo direktno z uporabo mikrokalorimetrije. Kalorimetrične titracije izvedemo z uporabo inštrumenta MCS-ITC (MicroCal Inc., Northhampton, MA). Titracije lahko izvedemo kot sledi. Proteinski dializat 15 minut degaziramo z uporabo opreme MicroCal. Osnovno raztopino inhibitorja dodamo k pomožnemu topilu (tipično DMSO) in degaziranemu dializatu in nato raztopino kratek čas sonificiramo, da proizvedemo končne raztopine inhibitorja za uporabo pri titracijah. Končne raztopine inhibitorja so v koncentracijskem območju od 10 do 80 μΜ. Dializiran protein dodamo k pomožnemu topilu in degaziranemu dializatu, da dobimo raztopine FKBP12 v koncentracijskem območju 200 do 1600 μΜ. Ko z uporabo degaziranega dializata pripravimo obe vrsti raztopin, raztopin dodatno več ne degaziramo. Pomožno topilo dodamo k proteinskim raztopinam, da vzdržujemo določeno koncentracijo pomožnega topila skozi ves potek titracije. Protein titriramo v inhibitor z uporabo 125-μΙ injekcijske brizgalke. Titracije izvedemo z ligandom v celici zaradi majhne topnosti inhibitorjev. Tipično predhodnemu 2-μΙ injiciranju sledi petnajst 8-μΙ injiciranj, izvedenih pri različnih injicimih intervalih. Za vsako titracijo izvedemo celotni niz kontrol redčenja. K degaziranemu dializatu dodamo ustrezen volumen pomožnega topila, da dobimo zapufrano raztopino pomožnega topila, ki jo uporabimo, da dobimo viške razredčitve reaktantov. Po korigiranju viškov razredčitve in neupoštevanju predhodnega injiciranja, določimo prileganje rezultatov titracij z uporabo modela One Set of Sites Model v računalniškem programskem paketu ORIGIN, s katerim je inštrument opremljen.

Kot smo direktno izmerili s mikrokalorimetrijo smo ugotovili, da vezanje na FKBP dobro korelira z učinkovitostjo za inhibicijo rotamazne reakcije, kar zlahka testiramo po metodah, ki so v stroki poznane (glej, npr., Fischer s sod., Biochim. Biophys. Acta, 791, 87 (1984);

-45-45Fischer s sod., Biomed. Biochim. Acta, 43,1101 (1984); Fischer s sod., Nature, 337, 476-478 (1989); Siekierka s sod., Nature, 341, 755-57 (1989); U.S. patent št. 5,696,135; in Harding s sod., Nature, 341, 758-60 (1989)).

Pri testu inhibicije rotamaze spektrofotometrično sledimo izomerizaciji umetnega substrata Nsukcinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida. Test vključuje cis obliko substrata, FKBP12, spojino, ki jo testiramo in himotripsin. Himotripsin je zmožen cepiti p-nitroanilin iz trans oblike substrata, toda ne iz cis oblike. Sproščanje p-nitroanilina merimo spektrofoto-metrično. Z uporabo tega testa smo k cis-N-sukcinil-alanin-alanin-prolin-fenilalanin-para-nitroanilinu dodali različne količine FKBP rotamazo-inhibirajočih spojin s formulo (l-a) ali (l-b) (Bachem, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505) v prisotnosti FKBP12 in himotripsina. Spektrofotometričnim meritvam koncentracij p-nitroanilina je sledila ocena vrednosti navidezne Kj, kar je zagotovljeno v tabeli 1 spodaj.

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
			oCH’	1	2	0.160
		0
7		u	0 CH3 θ Ά -O HjC l
			u
			-o	2		0.027
12
			1 'C*3
	V/
		^0 0	°CH3

-46-46-

-47-47-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	N(nav.) rotamaze (μΜ)
36		v X	P: X0	3	1	0.445
37		A	CrCHa ° / V chj ', γ o L?	3	4	0.222
38	L	O-CH3 ute U CH, /γ/γ/γ I ]	3	1	0.298
39	CH, / 3 o o—ch3 H-o o h/ 'CH' ΓΤΑ ° ( N N—s. ch2	1	2	0.398

-48-48-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Ki(nav.) rotamaze (μΜ)
40		1	2	0.690
41	0^	ό	H^0 CH, ° dfAJC», 0	1	2	5.8
42	od	0 CH, ζ//ίΐσ->	1	2	2.2
43	d H3	v v C·’^	HC 3 0 CH, o A> 0 00 r<<O j	1	2	NI

-49-49-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
			η,ο, f A	CH. 1 3 .o	1	2	3.0
44
				'/-/CH3
		v ό	11^	0
	o' I	0
			-o	CV	1	2	0.58
			fU3	XO
45			'cf™3
		N	0 r
	(G		ll
		k		JI
			^CH
				ch3	1	2	0.448
			n M	1 ,0
46
			K/K Λ	s^CH,
				0
	J		0 f-	|1
				1)
			O
			\ H	^-CH3
			CH,

-50-50-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	N(nav.) rotamaze (μΜ)
		H’%	ch3	1	2	0.2
47		h ril	0
	0^		0 k'
	k		J
	l	0
			^-CH3
		ch3
		0		2	2	1.6
48
	/ \ \ / u	CHa
		Λ\ II o o <	CHj
	/ 0	ch3		2	2	0.08
49	o
	( ?	ch3 1 J ,0 <0^3
	0	Ϊ v
		o-	ch3

-51-51-

Tabela 1
Spojina				Molekulama	Priprava po	Število	Ki(nav.)
številka				struktura	shemi št.	izomerov	rotamaze (μΜ)
					H C. 3 \ CH I I	1	2	0.56
50				o
	)	V k / N		γΚΛο^π, 0
				,1	ov
					OH
51				£	HsCk 0 CH, X-	1	4	4
		cr			0 n
	HC<
						H,C. 3 s0 CH, I I	1	4	5
53						? ά°
	HJC\	J	V v Λ	.co
							1	2	6*
54	V	/^0

-52-52-

-53-53-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ
58	ν'		CH, [J CH3 po ΌΗ	1	2	3.0
59	&	V k	ch3 K iCH3 ’oo ΌΗ	1	2	3.8
60	S s z	v	1+C CHj ,00	1	2	3.0
61		rvv \ / /	CH, CH3 ίχΎ», :x)	1	2	0.79

-54-54-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
62	“ CC	1	2	0.16
63	” CO	1	2	3.1
64	/ ch3 o o C CH,	2	2	0.62
65	HjC 0 z-cccc° 0 0	2	2	0.175

-55-55-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
66	0 kCH3	2	2	16
67	/~x\ ]° ch, ° 0	2		0.88
68	ί	C^y \ / /	CH3 CH3 k JjO	1	2	2.5
69	0?	v %r ό	o	1	2	33

-56-56-

-57-57-

-58-58-

-59-59-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Ki(nav.) rotamaze (μΜ)
79	°\J CHj <> 0	1 ali 2	4	0.7
80	Χχ 0 H3C	1	4	1.8
81	(· \ c/	CH3 CH .-CH, XXv £Lo	1	2	1.1
82	cT	iXXv'	2	2	3

-60-60-

-61-61-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	N(nav.) rotamaze (μΜ)
88	Avl ° 0 vM1 O'CX	2	2	0.217
89	/T\ / ° < JI ch3 0 o k ch3	2	2	3.2
90	h3c-o °( N N-7 0	5	2	>50
91	HjC-0 ^ΧΧά rN I/ A° ^0	5	2	0.22

-62-62-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	K|(nav.) rotamaze (μΜ)
92	CH3 °Λ ° $ H£ I II /	5	2	0.13
93	O I CH, 0 0 CH, H£ II \ 'σ^ζ\Α / 0 0 o	4	4	0.17
94	HA /°43 Mf,» F 0 0	4	4	31.4
95	FP« 'CO	1	2	1.2
96	S CH, Af° V I Uv	1 ali 2	2	1.4

-63-63-

-64-64-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
102	0^	Y	Leu	1	2	0.69
103	t/	r/ γ	Αύ°-«	1	2	1.2
104		5	2	1.4
105	CH,^ HAO M haAXa A ΪΜ>° M 0	5	2	0.35
106	HA « o HM °( N N—7 FA 0	5	2	>50

-65-65-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
107	H C Ω H A T λ	5	2	NI
	O	A /“V.
	o/ K ° ( N N—7 \l/
		\\ 0
			0 G	1	2	0.061
108
	f		0 f^f° I
		p
		Γ ^=CH
		o— s?
			1	2	0.049
		p n
109	rf	V A	vA
	k	akGaJ
	l	G
		k

-66-66-

-67-67-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
113	o	4	2	ND
114	M, 0	4	2	ND
115	0	-Z k	A<k Ί° rX ch3 ch3	5		>20
116		V k	0 /0	5	2	0.96

-68-68-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
117		v v s (	ž 0 ch3 Ί ω	5	2	0.084
118	z	v k	o fo	5	2	1
119		J s c	ί5 Λ I I CBj CBj	5		>40

-69-69-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Ki(nav.) rotamaze (μΜ)
120	~ΙΪ	ζ CH3 /o	1	2	2.5
121		d	° 0 k	5	2	0.78
122	J-	\ / /	n^O CH, ° Ar° 0 L l| ca 0	5	2	0.15
123	0^	v k	o o	5	2	1.2

-70-70-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
124		pARqr 0 0 kA sA o	5	2	0.38
125	.“R °( N N—' M 0	4	2	0.85
126	HR HR	r{-” A 0	4	2	5
127	^0 O 1 °~(^F pij ° /=< F MRkJ CH, 0( n h_/ M 0	4	2	2.6
128	γ /kk o	4	2	2

-71-71-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
129	FF ° Jk / HjC Γ 1 J rMr, R, Λ o	4	2	0.37
130	FF °(N ti—'\-F VZ/ F p 0	4	2	10
131	MA HA	F F 0 r-/' rr N N-' \-F Λ, FF	4	2	NI
132	HR «R	o-fk ° r=( F R \ V R o	4	2	>20
133	RR F r° o /=ZfF ^RfVR R 0	4	2	3.9

-72-72-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
134	/°T’F il Π I? / \ F t; 0	4	2	10
135	<J	3' N C	3P°OXCH3 0 *) •γ	5	2	1.4
136	(f	k	' 0 °^ch3	4		2.4
137	^ch3 M/ >AV F F F	4		9.7

-73-73-

-74-74-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
					5		4
			o	0
141		-f/	k
		k		0 Ίι f
			k	kkk
				0^	5	2	0.054
142			0
	J	v u/	b 'ch3
		v	V'-
				^CHa
					5	2	0.19
			0	o
143			k
		v	k	0 0 kvk
			0	T
				<λ CH3

-75-75-

-76-76-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
148	HR HR	F F Rh- < FF 0	4	2	NI
149	HRf c	S o UrO °\/rv FF 0	4	2	>50
150		V 'tl	. 0 CH, iO	5	2	1.5
151		-i/ v L	/P«·' OR ^ch3	5	2	0.53

-77-77-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Ki(nav.) rotamaze (μΜ)
				5	2	2.8
152		A
		v k	Ύ /M
			ίυ
			O-01’	1	2	0.52
153			o ArQ'CH
		V	'\A/A 0 <*>
		0
			o'c^	1	2	0.244
154			A /<x o A Y ch3
		V rT	LAAo 0 A f2
	\	0	H
			0

-78-78-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	N (nav.) rotamaze (μΜ)
155		v k	k	5	2	1.2
156		k X N L	° ( \ Vn γ M ^pcp0'013 Os ch3	5	2	1.5
157	“ή- P V, OH, o '—'	5	2	1.6
158	U o P ^•aIa r» °( XN N-/	5	2	0.776

-79-79-

Tabela 1
Spojina			Molekulama	Priprava po	Število	Ki(nav.)
številka			struktura	shemi št.	izomerov	rotamaze (μΜ)
			och3 \ och3	6	1	0.76
159			° 0CH3
		n XN
		Z	TC
			U
			och3 C0OCH3	6	1	0.239
160
		\A° %-/
			0
				6	1	5
			u G
161			<w<
	J	kN~/
			(3

-80-80-

Tabela 1
Spojina številka	Molekulama struktura	Priprava po shemi št.	Število izomerov	Kj(nav.) rotamaze (μΜ)
162	cP	och3 K>0CH3 pžA”' Pl-P ^0	7	1	0.347
163	Jx>° CK N—v C)	6	1	0.381
164	CT	och3 r\ocH3 H	6	1	3.3

-81-81-

Zaznamki: NI = pri testiranih koncentracijah ni inhibicije; ND = ni določeno

FARMACEVTSKI SESTAVKI IN ZDRAVLJENJA:

FKBP inhibitorna sredstva izuma, kot so spojine, ki so ponazorjene zgoraj, lahko uporabimo za pripravo farmacevtskih sestavkov, kot so sestavki, ki so opisani spodaj.

Farmacevtski sestavki tega izuma obsegajo učinkovito spojino za stimulacijo izraščanja nevritov s formulo (l-a) ali (l-b) in inerten, farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo. Farmacevtski sestavki lahko dodatno obsegajo nevrotrofični faktor. Sestavke za različne načine uporabe pripravimo v enotno odmerjenih oblikah.

V eni izvedbi so zagotovljeni učinkoviti nivoji nepeptidnih, rotamazo inhibitornih spojin, tako, da so zagotovljeni terapevtski učinki, ki vključujejo regulacijo FKBP. Z učinkoviti nivoji spojin so mišljeni nivoji pri katerih je regulirana tudi minimalna vezava FKBP s FKBP12. Spojine lahko dajemo v obliki predzdravila, ki je na splošno namenjeno za povečanje absorpcije in se cepi in vivo, da se tvori aktivna komponenta. Učinkovite nivoje lahko dosežemo tudi z dajanjem farmacevtsko aktivnih metabolitov (produktov metabolnih pretvorb) spojine.

-82-82Spojino s formulo (l-a) ali (l-b) dajemo v primerni odmerjeni obliki, ki jo pripravimo s kombiniranjem terapevtsko učinkovite količine (to je, dovolj učinkovitega nivoja, da se doseže želen terapevtski učinek skozi regulacijo FKBP) spojine s formulo (l-a) ali (l-b) (kot aktivne sestavine) s standardnimi farmacevtskimi nosilci ali razredčili po konvencionalnih postopkih. Ti postopki lahko vključujejo mešanje, granuliranje in stiskanje ali raztapljanje sestavin kot je primemo, da dobimo želen pripravek.

Uporabljeni farmacevtski nosilec je lahko v primerni obliki, na primer, bodisi trdni ali tekoči. Ponazorilni trdni nosilci vključujejo laktozo, tera albo, sukrozo, smukec, želatino, agar, pektin, akacijo, magnezijev stearat, stearinsko kislino in podobno. Ponazorilni tekoči nosilci vključujejo sirup, arašidovo olje, olivno olje, vodo in podobno. Podobno lahko nosilec ali razredčilo vključuje material z zapoznelim sproščanjem, ki je v stroki poznan, kot gliceril monostearat ali gliceril distearat, sam ali z voskom, etitcelulozo, hidroksipropilmetilcelulozo, metilmetakrilat ali podobno.

Uporabimo lahko različne farmacevtske oblike. Na primer, če uporabimo trden nosilec, pripravek lahko tabletiramo, damo v trdo želatinsko kapsulo v obliki praška ali peleta ali oblikujemo v majhno okroglo tableto ali pastilo. Količina trdnega nosilca lahko variira, toda prednostno bo od okoli 25 mg do okoli 1 g. Če uporabimo tekoč nosilec bo pripravek prednostno v obliki sirupa, emulzije, mehke želatinske kapsule, sterilne raztopine za injiciranje ali suspenzije v ampuli ali viali, ali nevodne tekoče suspenzije.

Da dobimo stabilno vodotopno odmemo obliko, farmacevtsko sprejemljivo sol spojine s formulo (l-a) ali (l-b) lahko raztopimo v vodni raztopini organske ali anorganske kisline, kot je 0.3 M raztopina jantarne kisline, ali bolj prednostno citronske kisline. Če topna oblika soli ni na voljo, spojino s formulo (l-a) ali (l-b) lahko raztopimo v primernem pomožnem topilu ali kombinaciji pomožnih topil. Primeri ustreznih pomožnih topil vključujejo alkohol, propilen glikol, polietilen glikol 300, polisorbat 80, glicerin in podobno pri koncentracijah, ki se gibljejo od 0 do 60 % celotnega volumna. V prednostni izvedbi aktivno spojino s formulo (l-a) ali (l-b) raztopimo v DMSO in razredčimo z vodo. Sestavek je lahko tudi v obliki raztopine iz oblike soli aktivne sestavine v primernem vodnem vehiklu, kot je voda ali izotonična slanica ali raztopina dekstroze.

-83-83Upoštevalo se bo, da dejanski prednostni odmerki spojin s formulo (l-a) in (l-b), ki se uporabljajo v sestavkih tega izuma, lahko variirajo glede na določen kompleks, ki se uporablja, določen formuliran sestavek, način uporabe in določeno mesto ter gostitelja in bolezen, ki jo je potrebno zdraviti. Optimalne odmerke za dano vrsto pogojev lahko določijo strokovnjaki na tem področju z uporabo običajnih testov za določanje odmerjanja zdravil, na primer, glede na tu zagotovljene eksperimentalne podatke. Za oralno dajanje se za običajni dnevni odmerek na splošno uporablja, od okoli 0.001 do okoli 1000 mg/kg telesne teže, s tem, da v primernih intervalih ponavljamo potek zdravljenja. Za ljudi lahko začetno farmakokinetiko določimo iz podganjega modela, kot ga je opisal Gold s sod., Experimental Neumlogy, 147:269-278 (1997).

Farmacevtske sestavke, ki vsebujejo aktivne spojine pričujočega izuma se lahko izdela na način, ki je na splošno poznan, na primer, s pomočjo običajnih postopkov mešanja, raztapljanja, granuliranja, izdelovanja dražejev, drobljenja, izdelovanja emulzij, polnjenja kapsul, zajemanja v nosilne snovi ali liofiliziranja. Farmacevtski sestavki so lahko formulirani na običajen način z uporabo enega ali več fiziološko sprejemljivih nosilcev, ki obsegajo ekscipiente in/ali pomožne snovi, ki pomagajo pri procesiranju aktivnih spojin v pripravke, ki se lahko farmacevtsko uporabljajo. Seveda je primerna formulacija odvisna od izbranega načina uporabe zdravila.

Za oralno dajanje so spojine lahko zlahka formulirane s kombiniranjem aktivnih komponent s farmacevtsko sprejemljivimi nosilci, ki so v stroki poznani. Taki nosilci omogočajo, da so spojine izuma formulirane kot tablete, pilule, dražeji, kapsule, tekočine, geli, sirupi, gošče, suspenzije in podobno, da jih pacienti, ki jih je potrebno zdraviti, jemljejo oralno. Farmacevtske pripravke za oralno uporabo lahko dobimo s kombiniranjem aktivne spojine s trdnim ekscipientom, opcijskim drobljenjem nastale zmesi in procesiranjem zmesi iz granul, po dodatku primernih pomožnih snovi, če je zaželeno, da dobimo jedra za tablete ali jedra za dražeje. Primerni ekscipienti vključujejo, na primer, polnila kot so sladkorji, vključno z laktozo, sukrozo, manitolom ali sorbitolom; in celulozne pripravke kot so koruzni škrob, pšenični škrob, rižev škrob, krompirjev Škrob, želatina, guma tragakant, metil celuloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijeva karboksimetilceluloza in/ali polivinilpirolidon (PVP). Če je zaželeno se

-84-84lahko doda dezintegracijska sredstva, kot zamrežen polivinilpirolidon, agar ali algininsko kislino ali njeno sol kot je natrijev alginat.

Jedra za dražeje zagotovimo s primernimi oblogami. Za ta namen lahko uporabimo koncentrirane sladkorne raztopine, ki lahko opcijsko vsebujejo arabski gumi, polivinilpirolidon, Carbopol gel, polietilen glikol in/ali titanijev dioksid, raztopine lakov in primerna organska topila ali mešanice topil. Barvila ali pigmente lahko k oblogam za tablete ali dražeje dodamo za identifikacijo, ali da označimo različne kombinacije odmerkov aktivnih spojin.

Oblike farmacevtskih pripravkov, ki se lahko uporabljajo oralno, vključujejo kapsule z zapiralnim mehanizmom push-fit, izdelane iz želatine, kakor tudi mehke, zaprte kapsule, izdelane iz želatine in mehčalca, kot je glicerol ali sorbitol. Push-fit kapsule lahko vsebujejo aktivne sestavine v primesi s polnilom, kot je laktoza, vezivi, kot so škrobi in/ali lubrikanti, kot je smukec ali magnezijev stearat, in opcijsko stabilizatorji. V mehkih kapsulah so aktivne spojine lahko raztopljene ali suspendirane v primernih tekočinah, kot so maščobna olja, tekoči parafin ali tekoči polietilen glikoli. Poleg tega so lahko dodani stabilizatorji. Vse formulacije za oralno dajanje morajo biti v odmerkih, ki so primerni za tako uporabo. Za oralno dajanje so sestavki lahko na običajen način formulirani v obliki tablet ali pastil.

Primer za pripravo oralnega farmacevtskega sestavka tega izuma je kot sledi: 100 mg spojine s formulo (l-a) ali (l-b) pomešamo s 750 mg laktoze in zmes inkorporiramo v oralno enotnoodmerjeno obliko, kot je trda želatinska kapsula, ki je primerna za oralno dajanje.

Za dajanje z inhalacijo spojine po pričujočem izumu običajno vnašamo v obliki aerosolnega pršila s pripravki pod tlakom ali nebulatorja z uporabo primernega potisnega plina, na primer, diklorodifluorometana, triklorofluorometana, diklorotetrafluoroetana, ogljikovega dioksida ali drugega primernega plina. V primeru pršila pod pritiskom, je odmerjena enota lahko določena tako, da je zagotovljen ventil, za vnašanje izmerjene količine. Kapsule in vložki iz, na primer, želatine za uporabo v inhalatorju ali insuflatorju so lahko formulirani tako, da vsebujejo uprašeno zmes spojine in primerne podlage za praške, kot sta laktoza ali škrob.

-85-85Spojine so lahko formulirane za parenteralno dajanje z injekcijo, na primer, z injekcijo večje pilule ali kontinuime infuzije. Formulacije za injiciranje so lahko v enotno odmerjeni obliki, na primer, v ampulah ali več-odmemih vsebnikih z dodanim konzervansom. Sestavki so lahko v obliki suspenzij, raztopin ali emulzij v oljnih ali vodnih vehiklih in lahko vsebujejo sredstva za tvorbo formulacij, kot so suspendima, stabilizacijska in/ali disperzijska sredstva.

Za injiciranje so sredstva izuma lahko formulirana v vodnih raztopinah, prednostno v fiziološko kompatibilnih pufrih, kot so Hanksova raztopina, Ringerjeva raztopina ali fiziološki pufer slanice. Za transmukozalno dajanje, penetrante, ki so primerni za prodiranje skozi oviro, uporabimo v formulaciji in jih lahko izberemo izmed tistih, ki so poznani v stroki.

Farmacevtske formulacije za parenteralno dajanje vključujejo vodne raztopine aktivnih spojin v vodotopni obliki. Dodatno lahko pripravimo suspenzije aktivnih spojin kot primerne oljne suspenzije za injekcije. Primerna lipofilna topila ali vehikli za pripravo takih formulacij vključujejo maščobna olja, kot sezamovo olje, ali estre maščobnih kislin, kot etil oleat ali trigliceride ali liposome. Vodne suspenzije za injekcije lahko vsebujejo substance, ki povečajo viskoznost suspenzije, kot natrijevo karboksimetilceluloza, sorbitol ali dekstran. Opcijsko suspenzija lahko vsebuje tudi primerne stabilizatorje ali sredstva, ki povečajo topnost spojin, tako da omogočajo pripravo močno koncentriranih raztopin.

Parenteralni farmacevtski sestavek tega izuma, ki je primeren za dajanje z injekcijo, lahko pripravimo kot sledi: 100 mg spojine s formulo (l-a) ali (l-b) zmešamo z 10 ml lipofilnega topila, kot je maščobno olje, in zmes kot emulzijo inkorporiramo v enotno odmerjeno obliko, primerno za dajanje z injekcijo.

Alternativno je aktivna sestavina pred uporabo lahko v obliki praška za sestavljanje s primernim vehiklom, na primer, sterilno vodo brez pirogena. Spojine so lahko formulirane tudi v rektalnih sestavkih kot svečke ali zadrževalni klistirji, na primer, ki vsebujejo običajne podlage za svečke, kot je kakavovo maslo ali druge gliceride.

Razen formulacij, ki smo jih že prej opisali, so spojine lahko formulirane kot uskladiščen pripravek. Take dolgo delujoče formulacije lahko damo z vstavitvijo (na primer, subkutano ali

-86-86intramuskulamo) ali z intramuskulamo injekcijo. Na primer, spojine so lahko formulirane s primernimi polimernimi ali hidrofobnimi materiali (na primer, kot emulzija v sprejemljivem olju) ali ionsko izmenjevalnimi smolami ali kot slabo topni derivati, na primer, kot slabo topna sol.

Primeren farmacevtski nosilec za hidrofobne spojine izuma je sistem s pomožnim topilom, ki obsega benzil alkohol, nepolamo površinsko aktivno snov, organski polimer, ki se meša z vodo, in vodno fazo. Sistem s pomožnim topilom je lahko VPD sistem s pomožnim topilom (VPD je raztopina 3 vol.% benzil alkohola, 8 vol.% nepolame površinsko aktivne snovi polisorbata 80 in 65 vol.% polietilen glikola 300, ki jo v absolutnem etanolu dopolnimo do ustreznega volumna). VPD sistem s pomožnim topilom (VPD:5W) se sestoji iz VPD raztopine, ki je v razmerju 1.1 razredčena s 5% dekstrozo v vodni raztopini. Ta sistem s pomožnim topilom dobro raztaplja hidrofobne spojine in sam pri sistemskem dajanju proizvaja nizko toksičnost. Seveda razmerja sistema s pomožnim topilom lahko precej variirajo brez, da bi se uničile njegove topnostne in toksične značilnosti. Nadalje lahko speminjamo identiteto komponent pomožnega topila: na primer, namesto polisorbata 80 lahko uporabimo druge nizko toksične nepolarne površinsko aktivne snovi; lahko variiramo velikost frakcije polietilen glikola; polietilen glikol lahko nadomestijo drugi biokompatibilni polimeri, na primer, polivinilpirolidon; in dekstrozo lahko nadomestijo drugi sladkorji ali polisaharidi.

Alternativno lahko za dajanje hidrofobnih farmacevtskih spojin uporabimo druge sisteme. Liposomi in emulzije so dobro poznani primeri vehiklov ali nosilcev za dajanje hidrofobnih zdravil. Lahko uporabimo tudi določena organska topila, kot je dimetilsulfoksid, čeprav običajno za ceno večje toksičnosti. Nadalje spojine lahko damo z uporabo sistema s podaljšanim sproščanjem, kot so polprepustne matrike trdnih hidrofobnih polimerov, ki vsebujejo terapevtska sredstva. Uvedeni so bili različni materiali za podaljšano sproščanje in jih strokovnjaki na tem področju poznajo. Kapsule s podaljšanim sproščanjem lahko, odvisno od njihove kemijske narave, sproščajo spojine za obdobje od nekoliko tednov do preko sto dni. Odvisno od kemijske narave in biološke stabilnosti terapevtskega reagenta lahko za stabilizacijo proteinov uporabimo dodatne strategije.

-87-87Farmacevtski sestavki lahko obsegajo tudi nosilce ali ekscipiente s trdno ali gelsko fazo. Primeri takih nosilcev ali ekscipientov vključujejo kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, različne sladkorje, škrobe, celulozne derivate, želatino in polimere, kot so polietilen glikoli.

V stroki so biti identificirani številni nevrotrofični faktorji in kateregakoli od teh faktorjev lahko uporabimo v sestavkih izuma. Kot je tu uporabljeno, se izraz nevrotrofični faktor nanaša na snovi, ki so zmožne stimulirati rast ali proliferacijo živčnega tkiva (ampak niso vključene FKBP-rotamazo inhibirajoče spojine izuma), na primer, živčni rastni faktor (NGF), inzulinski rastni faktor (IGF-1) in njegovi derivati z manjšo aktivnostjo (glGF-1), kislinski in bazični fibroblastni rastni faktor (aFGF oz. bFGF), iz trombocitov dobljeni rastni faktorji (PDGF), iz možganov dobljeni rastni faktorji (BDNF), ciliami nevrotrofični rastni faktorji (CNTF), iz glialne celične linije dobljeni nevrotrofični faktor (GDNF), nevrotrofin-3 (NT-3) in nevrotrofin 4/5 (NT4/5). Farmacevtski sestavki lahko kot aktivne sestavine, poleg enega ali več sredstev izuma, vključujejo enega ali več takih nevrotrofičnih faktorjev. Najbolj prednosten nevrotrofični faktor za uporabo v sestavkih tega izuma je NGF.

Druge komponente farmacevtsko sprejemljivih sestavkov tega izuma lahko vključujejo benzil alkohol ali druge primerne konzervanse, absorpcijske promotorje, da povečajo biodostopnost, fluoroogljike in/ali druga običajna sredstva za raztapljanje ali dispergiranje.

Farmacevtski sestavek vsebuje celotno količino aktivne sestavine (sestavin), ki je zadostna, da doseže predviden terapevtski učinek. Bolj natančno, farmacevtski sestavek vsebuje terapevtsko učinkovito količino (to je količino, ki je tako učinkovita, da prepreči razvoj ali zmanjša obstoječe simptome bolezni ali stanja, posredovanega s FKBP) FKBP-inhibitornega sredstva izuma. Celotne količine FKBP-inhibitornega sredstva izuma in vsak opcijski nevrotrofični faktor, ki ga za izdelavo enoodmerne oblike lahko kombiniramo z nosilnimi materiali, bodo variirali odvisno od gostitelja, ki se zdravi in določenega načina uporabe. Sestavki izuma, prednostno vsak vsebuje tako FKBP-inhibitomo sredstvo kot nevrotrofični faktor, s FKBP-inhibitomim sredstvom delujejo tako, da povečajo aktivnost nevrotrofičnega faktorja za povečanje stimulacije izraščanja nevritov. Količina nevrotrofičnega faktorja v takih sestavkih je s pridom manjša, kot količina, potrebna pri monoterapiji ob uporabi samo faktorja. Prednostno so sestavki formulirani tako, da se pacientu, ki prejema sestavke, da

-88-88odmerek FKBP12-inhibitomega sredstva med 0.01 do 100 mg/kg telesne teže/dan in odmerek nevrotrofičnega faktorja med 0.01 do 100 pg/kg telesne teže/dan.

Farmacevtski sestavek izuma lahko uporabimo pri metodi inhibiranja rotamazne encimske aktivnosti FK-506 vezavnega proteina, ki obsega dajanje sestavka pacientu. Inventivne sestavke lahko uporabimo tudi za stimulacijo rasti nevritov v živčnih celicah, da stimuliramo regeneracijo živcev ali da pospešimo regeneracijo nevronov. Prednostno sestavek nadalje obsega nevrotrofični faktor.

Medtem ko je bil izum ponazorjen z referenco k specifičnim in prednostnim izvedbam, bodo strokovnjaki na tem področju uvideli, na primer, z rutinskim eksperimentiranjem in izvajanjem izuma, da se lahko izdela variacije in modifikacije. Na primer, običajni strokovnjaki na tem področju lahko uvidijo, da se lahko izdela prave variacije ali substitucije k spojinam s formulo (l-a) in formulo (l-b), ne da bi na škodljiv način vplivali na njihovo učinkovitost v farmacevtskih sestavkih. Tako je predvideno, da izum ni omejen z zgornjim opisom, ampak, daje definiran z dodanimi zahtevki in njihovimi ekvivalenti.

Claims (26)

1. Spojina s formulo:

Y pri čemer:

R¹ je: vodik; arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-j-Cg alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila;

alkilna ali alkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz C1-C4 alkila, C2-C4 alkenila, C4-C6 cikloalkenila in hidroksi; C3-C3 cikloalkilna ali C5-C7 cikloalkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz 11 12 13 11

C1-C4 alkila, C2-C4 alkenila, C1-C4 alkiloksi in hidroksi; ali C(R )(R )(R ), kjer sta R in 12 11 12

R vsak neodvisno nižji alkil ali R in R , skupaj z atomom na katerega sta vezana,

13 1 1 tvorita cikloalkil in R je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)n-0-W , kjer je n 0,1,2 ali 3 in W je

2 2 2

R ali C(O)R , pri čemer je R C1-C3 alkil, nesubstituiran ali substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama;

X je vodik, ciano, C-1-C2 alkiloksi, dimetoksimetil ali O=; in

Y je: vodik; alkilna, alkenilna ali cikloalkilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkilne, arilne, alkoksi, hidroksialkilne, ariloksi, alkeniloksi in hidroksi skupine, ki so nesubstituirane ali substituirane z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz hidroksila, C1-C6 alkila, C2-C5 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila; ali (CH2)_p-O-W² ali (CH2)_p-N-W², kjer je p 0, 1 ali 2 in VV² je R³ ali C(O)R³, pri čemer je R³

-90-90alkilna, alkenilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkila, arila in alkoksi;

ali X in Y, skupaj z ogljikovim obročnim atomom in dušikovim heteroatomom na katera sta vsak zase vezana, tvorita 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti J, K in L; kjer J, K in L predstavljajo substituente, neodvisno izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz kisika in C3-C5 cikloalkilne in C1-C5 alkilne skupine, ki sta nesubstituirani ali substituirani z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila in dimetoksifenila; ali J in K skupaj tvorita fenilni obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kislika, dušika, ogljika ali žvepla in neodvisno izbrani iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-j-C6 alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila;

ali farmacevtsko sprejemljiv derivat navedene spojine.

2. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je F? aril, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-|-C6 alkila, Cg-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila.

3. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je R¹ izbran iz skupine, ki je sestavljena iz adamantila, naftila, indolila, furila, tienila, piridila in fenila, fenil ima od enega do tri substituente, neodvisno izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-|-Cg alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila.

4. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 3, pri čemer je R¹ 3,4,5trimetoksifenil.

5. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je R¹

-91-91Γ— (CH₂) 'R(CH₂)_nW¹ kjer je m 1 ali 2, n je 0,1 ali 2 in W¹ je kot je definirano v zahtevku 1.

6. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je R¹ 11 12 13 11 12

C(R )(R )(R ), kjer: R in R , skupaj z atomom na katerega sta vezana, tvorita

13 1 ciklopentil ali cikloheksil; in R je izbran izmed H, OH, nižjega alkila, arila in (CH2)n-0-W ,

12 2 2 kjer je n 0, 1, 2 ali 3 in W je R ali C(O)R , kjer je R C1-C3 alkil, nesubstituiran ali substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama.

7. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 6, pri čemer je R^ izbran iz skupine, ki je sestavljena iz:

(CH₂)_m O

-(CH₂)_m 'O'

8. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je R^ C(R¹¹)(R¹²)(R¹³), kjer: sta R¹¹ in R¹² vsak neodvisno metil ali etil; in R¹³ je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)n-0-W¹, kjer je n 0,1,2 ali 3 in W¹ je R² ali C(O)R², kjer je R² C1-C3 alkil, nesubstituiran ali substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama.

9. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 8, pri čemer je R¹ izbran iz skupine, ki je sestavljena iz:

-92-92-

10. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je Y alkil, substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkila, arila, alkoksi, hidroksialkila, ariloksi, alkeniloksi, hidroksi, (Ch^p-O-VV² in (CH2)p-NVV² , kjer: je p 0, 1 ali 2; in VV² je R³ ali C(O)R³, pri čemer je R³ alkil, alkenil, aril-alkil ali aril, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkila, arila in alkoksi.

11. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 10, pri čemer je Y izbran iz skupine, ki je sestavljena iz:

12. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer X in Y, skupaj z ogljikovim obročnim atomom in dušikovim heteroatomom na katera sta vsak zase vezana, tvorita nesubstituiran ali substituiran 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, ki ima opcijsko, poleg navedenega dušikovega heteroatoma, en dodaten heteroatom, izbran iz skupine, ki je sestavljena iz O in N.

-93-9313. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 12, pri čemer je navedeni 5-7členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč izbran izmed piperidina in piperazina.

14. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 1, pri čemer je navedena spojina izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz:

-94-94·

-95-95-

-96-96- ch₃

-97-97- ch₃

-99-99-

-100100-

-101-101-

-102-102-

-103-103-

-104-104-

-105-105-

-106106

-107-107-

-108108

Ο

-109-109-

-110-110-

-111-111-

-112112

-113-113

-114-114-

-115-115-

-116-116-

15. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku spojina izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz:

pri čemer je navedena

16. Farmacevtski sestavek, ki obsega: sredstvo za inhibiranje rotamaze, ki obsega terapevtsko učinkovito količino vsaj ene spojine ali farmacevtsko sprejemljivega derivata po zahtevku 1; in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

-117-11717. Farmacevtski sestavek po zahtevku 16, ki nadalje obsega nevrotrofični faktor.

18. Uporaba terapevtsko učinkovite količine spojine ali farmacevtsko sprejemljivega derivata po zahtevku 1 za izdelavo zdravila za zdravljene nevrološke motnje pri pacientu.

19. Uporaba po zahtevku 18, pri čemer je nevrološka motnja izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz periferalnih nevropatij, ki jih povzročijo telesna poškodba ali bolezensko stanje, telesna poškodba možganov, telesna poškodba hrbtenjače, kap, povezana s poškodbo možganov, in nevrološke motnje, ki se nanašajo na nevrodegeneracijo.

20. Uporaba po zahtevku 18, pri čemer je nevrološka motnja Parkinsonova bolezen, Alzheimerjeva bolezen ali amiotrofična lateralna skleroza.

21. Uporaba nevrotrofičnega faktorja po zahtevku 18, izbranega iz skupine, ki je sestavljena iz živčnega rastnega faktorja, inzulinskega rastnega faktorja in njegovih derivatov z manjšo aktivnostjo, kislinskega in bazičnega fibroblastnega rastnega faktorja, iz trombocitov dobljenih rastnih faktorjev, iz možganov dobljenega nevrotrofičnega faktorja, ciliarnih nevrotrofičnih faktorjev, iz glialne celične linije dobljenega nevrotrofičnega faktorja, nevrotrofina-3 in nevrotrofina 4/5 za izdelavo zdravila.

22. Postopek izdelave spojine ali farmacevtsko sprejemljivega derivata po zahtevku 1, ki obsega:

(a) pretvarjanje spojine s formulo (lll-a):

i (lll-a) pri čemer

-118-11832

R je izbran iz skupine, ki je sestavljena iz opcijsko substituiranega alkila, alkenila, arila,

O o ¹¹ 30 II j^CiCHa^R³⁰ 5^CO(CH₂)_qR³⁰ cikloalkila, cikloalkenila, in , kjer je q 0 ali 1 in R³⁰ je alkilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz hidroksila, Ο-ι-Οθ alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila;

X je: vodik; ciano; C1-C2 alkiloksi; dimetoksimetil; ali kisik, kjer je, kadar je X kisik, vez, ki povezuje X na obročni ogljikov atom, dvojna vez; in

Y je: vodik; alkilna, alkenilna ali cikloalkilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkilne, arilne, alkoksi, hidroksialkilne, ariloksi, alkeniloksi in hidroksi skupine, ki so nesubstituirane ali substituirane z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz hidroksila, Ο-|-θ6 alkila, C2-Cg alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila; ali (CH₂)_P-O-W² ali (CH₂)_p-N-W², kjer je p 0, 1 ali 2 in VV² je R³ ali C(O)R³, pri čemer je R³ alkilna, alkenilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkila, arila in alkoksi;

ali X in Y, skupaj z ogljikovim obročnim atomom in dušikovim heteroatomom na katera sta vsak zase vezana, tvorita 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti J, K in L; kjer J, K in L predstavljajo substituente, neodvisno izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz kisika in C3-C5 cikloalkilne in C1-C5 alkilne skupine, ki sta nesubstituirani ali substituirani z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila in dimetoksifenila; ali kjer J in K skupaj tvorita fenilni obroč, nesubstituiran ali substituiran z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla in neodvisno izbrani iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3,

-119-119Cj-C6 alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila;

pod reducimimi pogoji v spojino s formulo (lll-b):

N

O^N' 'X l-b) pri čemer sta X in Y kot je definirano zgoraj; in (b) spajanje navedene spojine s formulo (lll-b) s spojino s formulo (IV):

O ^u (iv) pri čemer je R^: vodik; arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2,

CF3, C-|-C6 alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila; alkilna ali alkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz C1-C4 alkila, C2-C4 alkenila,

C4-C6 cikloalkenila in hidroksi; C3-C8 cikloalkilna ali C5-C7 cikloalkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz C1-C4 alkila, C2-C4 alkenila, C1-C4 alkiloksi in hidroksi; ali

C(r1¹)(R¹2)(R¹3), kjer sta R¹^ in R¹² vsak neodvisno nižji alkil ali R¹¹ in R¹², skupaj z atomom na katerega sta vezana, tvorita cikloalkil in R je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)n^_O·

1 12 2 2

W , kjer je n 0, 1, 2 ali 3 in W je R ali C(O)R , pri čemer je R C-j -C3 alkil, nesubstituiran ali substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama.

-120-12023. Postopek po zahtevku 22, pri čemer je spojina s formulo (lll-a) izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz:

kjer je Z benziloksikarbonil.

24. Postopek po zahtevku 22, pri čemer je spojin s formulo (lll-a) izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz:

kjer je Z benziloksikarbonil.

25. Postopek po zahtevku 22, pri čemer je spojina s formulo (lll-a) kjer je Z benziloksikarbonil.

26. Postopek po zahtevku 22, pri čemer je spojina s formulo (lll-a) izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz:

-121-121- kjer je Z benziloksikarbonil.

27. Postopek po zahtevku 22, ki nadalje obsega: pretvarjanje spojine s formulo (II):

(II) o

II 30

U._CO(CH₂),R³° ₃₀ pri čemer je Z h , kjer je q 0 ali 1 in R je alkilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz hidroksila, Ο-|-θ6 alkila, C2-C6 alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila, v navedeno spojino s formulo (IIl-a).

28. Spojina s formulo:

-122-122- pri čemer:

R¹ je: vodik; arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz halogena, hidroksila, NO2, CF3, C-|-C6 alkila, C2-C6-alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi, amino in fenila; alkilna ali alkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz G1-C4 alkila, C2-C4 alkenila, C4-C6 cikloalkenila in hidroksi; Cg-Cg cikloalkilna ali C5-C7 cikloalkenilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz

C1-C4 alkila, C2-C4 alkenila, C1-C4 alkiloksi in hidroksi; ali C(R¹¹)(R¹²)(R¹³)> kjer sta R¹¹ in

12 11 12

R vsak neodvisno nižji alkil ali R in R , skupaj z atomom na katerega sta vezana, tvorita cikloalkil in R¹³ je H, OH, nižji alkil, aril ali (CH2)_n-0-W¹, kjer je n 0, 1,2 ali 3 in W¹ je

2 2 2

R ali C(O)R , pri čemer je R C1-C3 alkil, nesubstituiran ali substituiran z eno ali dvema metoksi skupinama;

1 9 1 2

X in x sta vsak neodvisno vodik, ciano, C1-C2 alkiloksi, dimetoksimetil ali =0; ali X in X skupaj tvorita valenčno vez; in

Y je: vodik; alkilna, alkenilna ali cikloalkilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkilne, arilne, alkoksi, hidroksialkilne, ariloksi, alkeniloksi in hidroksi skupine, ki so nesubstituirane ali substituirane z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz hidroksila, C-|-C6 alkila, C2-Cg-alkenila, C1-C4 alkiloksi, C2-C4 alkeniloksi, benziloksi, fenoksi in fenila; ali (CH2)_p-O-W² ali (CH2)_p-N-W², kjer je p O, 1 ali 2 in VV² je R³ ali C(O)R³, pri čemer je R³ alkilna, alkenilna ali arilna skupina, nesubstituirana ali substituirana z enim ali več substituenti, neodvisno izbranimi iz skupine, ki je sestavljena iz alkila, arila in alkoksi; ali

-123-123eden izmed X¹ in X² v kombinaciji z Y, skupaj s dušikovim heteroatomom iz obročne strukture na katerega je Y povezan, tvori 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč, ki opcijsko vsebuje en dodaten heteroatom, izbran izmed O in N, 5- do 7-členski nasičen ali nenasičen heterociklični obroč je opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed J, K in L, ki so neodvisno kisik, C3-C5 cikloalkil ali C1-C5 alkil, opcijsko substituiran z enim ali dvema substituentoma, neodvisno izbranima izmed C3-C5 cikloalkila, metoksi, metoksifenila ali dimetoksifenila, ali J in K skupaj tvorita fenilni obroč, opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi izmed metoksi, trifluorometila, trifluorometoksi in primernih substituentov, ki so na fenilni obroč povezani preko kisika, dušika, ogljika ali žvepla;

ali farmacevtsko sprejemljiv derivat navedene spojine.

29. Spojina ali farmacevtsko sprejemljiv derivat po zahtevku 28, pri čemer je navedena spojina izbrana iz skupine, ki je sestavljena iz: