WO2000026188A1 - Cycloheximid-derivate, die die regeneration von nervengewebe beeinflussen - Google Patents

Cycloheximid-derivate, die die regeneration von nervengewebe beeinflussen Download PDF

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WO2000026188A1
WO2000026188A1 PCT/EP1999/008267 EP9908267W WO0026188A1 WO 2000026188 A1 WO2000026188 A1 WO 2000026188A1 EP 9908267 W EP9908267 W EP 9908267W WO 0026188 A1 WO0026188 A1 WO 0026188A1
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WO
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radical
cycloheximide
mmol
compound according
alkyl
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PCT/EP1999/008267
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French (fr)
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Gunter Fischer
Gerhard KÜLLERTZ
Claudia Christner
Ralf Wyrwa
Susanne Grabley
Ralf Thiericke
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Hans-Knöll-Institut Für Naturstoff Forschung E.V.
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention is therefore based on the object of providing compounds which can be used for the therapy of nerve degeneration diseases without causing toxic side effects in cells, in particular in humans.
  • R 1 represents an amino acid residue or oligopeptide residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compounds according to the invention have a molecular weight less than about 2000 g / mol, preferably less than 1000 g / mol and particularly preferably less than about 750 g / mol.
  • the compound cycloheximide-N-ethanoic acid ethyl ester (substance 5) has a molecular weight of 367.4.
  • the advantageous properties of the compounds according to the invention are due to the fact that they have an affinity for FK506-binding proteins and are preferably able to do so Inhibiting peptidylprolyl cis / trans isomerase activity of the FK506 binding protein. Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention relates to the compounds described above which are able to inhibit the peptidylprolyl cis / trans isomerase activity of the FK506-binding proteins. How this inhibitory effect of the compounds according to the invention can be determined has already been explained above.
  • Another feature of the invention is the advantageous property that at least the majority of the aforementioned compounds have a low toxicity; see also Example 3 below.
  • the aforementioned compounds have a lower toxicity to eukaryotic cell lines compared to cycloheximide.
  • Compounds with the preferred IC 50 values described above are particularly preferred.
  • the present invention further relates to pharmaceutical compositions which contain a compound according to the invention, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers include, for example, phosphate-buffered salt solutions, water, emulsions, such as, for example, oil / water emulsions, sterile solutions, etc.
  • Compositions which contain such carriers can be formulated by customary processes.
  • the compounds of formula (1) are prepared in conventional dosage forms by combining a compound of formula (1) with standard pharmaceutical carriers according to conventional methods.
  • the compounds of formula (1) can also be administered in conventional dosages in combination with a known, second therapeutically active compound. Depending on the desired agent, these processes can also include mixing, granulating and pressing or dissolving the ingredients.
  • the pharmaceutical carrier used can be, for example, either a solid or a liquid.
  • a suitable topical anti-inflammatory dose of an active ingredient i.e. a compound of formula (1) is 0.1 mg to 150 mg and is administered one to four times, preferably two to three times a day.
  • the topical compounds of the invention comprise an active ingredient, together with one or more compatible carrier (s) therefor and, optionally, other therapeutic ingredient (s).
  • the carrier (s) must be “compatible” in the sense that they are compatible with the other ingredients of the formulation and are therefore not harmful to the recipient.
  • bactericidal and fungicidal agents which can suitably be included in the drops are phenylmercury nitrate or acetate (0.002%), benzalkonium chloride (0.01%) and chlorhexidine acetate (0.01%).
  • Suitable Suitable solvents for the preparation of an oily solution include glycerin, dilute alcohol and propylene glycol.
  • the formulation may include a suitable surfactant, such as an anionic, cationic or non-ionic surfactant, such as sorbitan esters or polyoxyethylene derivatives thereof.
  • a suitable surfactant such as an anionic, cationic or non-ionic surfactant, such as sorbitan esters or polyoxyethylene derivatives thereof.
  • Suspending agents such as natural rubbers, cellulose derivatives or inorganic materials such as silicas containing silicic acid and other ingredients such as lanolin can also be present.
  • parenteral means intravenous, intramuscular, subcutaneous, intranasal, intrarectal, intravaginal or intraperitoneal administration.
  • the sub- cutaneous and intramuscular forms of parenteral administration are usually preferred. Suitable dosage forms for this administration can be made by conventional techniques.
  • the daily oral dosage schedule preferably ranges from about 0.05 to about 80 mg / kg total body weight, preferably from about 0.1 to 30 mg / kg, more preferably from about 0 5 to 15 mg / kg.
  • the daily parenteral dosage regimen preferably ranges from about 0.05 to about 80 mg per kilogram (kg) of total body weight, preferably from about 0.1 to about 30 mg / kg, and more preferably from about 0.5 to 15 mg / kg.
  • the form and property of the pharmaceutically acceptable carrier or diluent is determined by the amount of drug to be combined, the route of administration and other well-known variables.
  • the dosage depends on many factors, e.g. the sex, weight, age of the patient, as well as the type of compound specifically administered, the type of administration, etc. In general, the daily dose is 1 ⁇ g to 10 mg units per day. In connection with the intravenous injection of the compound of the substance class of the compounds according to the invention, dosages of about 1-40 mg / kg body weight per day are common.
  • the compositions can be administered locally or systemically. In general, administration will be parenteral, e.g. intravenously. After surgery, local administration can e.g. be preferred over a patch with depot effect. After surgical interventions, however, it may also be advantageous to place the local administration directly in the vicinity of the nerve tissue to be influenced for growth, e.g.
  • the present invention further relates to the use of a compound according to the invention or a compound which has the abovementioned properties of Compounds according to the invention have, for example, the property of inhibiting the peptidylprolyl cis / trans isomerase activity of the FK506-binding protein, having a low toxicity and having a therapeutic effect, in particular on the regeneration of nerves, for producing a pharmaceutical composition for the treatment of nerve cell diseases.
  • such compounds can also be found by considering their structure.
  • three-dimensional and / or crystallographic structural analyzes of the compounds according to the invention can be used to design the active compounds according to the invention.
  • Such approaches have already been tried with other systems, see for example Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558.
  • xenobiotic active ingredients can be identified that cannot or cannot be derived directly from cycloheximide. The biological properties of such compounds can be tested, for example, in accordance with the exemplary embodiments below.
  • the compounds according to the invention can also be administered together with known active substances which promote nerve regeneration.
  • the cycloheximide derivatives according to the invention can e.g. are administered (a) in the event of expected strokes or other nerve cell damage as a preventive dose to avoid or limit this nerve cell damage, (b) to promote the nerve growth of nerve tracts interrupted as a result of surgery or accident-related and (c) to treat general nerve cell damage caused by regeneration can be alleviated or cured.
  • the pictures show:
  • Illustration 1
  • cycloheximide 250 mg (0.89 mmol) cycloheximide are dissolved in 5 ml acetone. 210 mg (1.52 mmol) of K 2 CO 3 , 20 mg (0.08 mmol) of 18-crown-6 and 0.20 mg (1.35 mmol) of 4-bromobutyronitrile are added to the solution with stirring. Then at
  • Substance 14 cycloheximide-N-3-propionic acid (4-aminocyclohexyl) amide * CF 3 COOH 100 mg chlorotrityl resin (0.93 mmol / g, from NovaBiochem), 250 mg (2.19 mmol) 1, 4-trans-diaminocyclohexane, 2 ml of CH 2 CI 2 and 1 ml of diisopropylethylamine (DIEA) are reacted at RT for 12 h. It is then washed three times with 2 ml of CH 2 Cl 2 , MeOH and ether. The resin is taken up in 2 ml of N-methylpyrrolidone (NMP).
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • Substance 15 cycloheximide-N-3-valeric acid (4-aminocyclohexyl) amide * CF 3 COOH 100 mg chlorotrityl resin (0.93 mmol / g, from NovaBiochem), 250 mg (2.19 mmol) 1, 4-trans-diaminocyclohexane, 2 ml CH 2 CI 2 and 1 ml DIEA are reacted at RT for 12 h. It is then washed three times with 2 ml of CH 2 Cl 2 , MeOH and ether. The resin is taken up in 2 ml of NMP.
  • Substance 16 Cycloheximide-N-ethanoic acid ethyl ester-adamantyl urethane 140 mg (0.38 mmol) of cycloheximide-N-ethanoic acid ethyl ester are dissolved in 3 ml of CH 2 Cl 2 . 67 mg (0.38 mmol) adamantyl isocyanate, 10 mg (0.18 mmol) NH 4 CI and ITrops CF 3 COOH are added to the solution with stirring. The mixture is then stirred at 30 ° C. After 4 h, the reaction mixture is filtered and concentrated in vacuo.
  • Substance 17 Cycloheximide-N-ethanoic acid ethyl ester-2-bromethyl urethane 140 mg (0.38 mmol) of cycloheximide-N-ethanoic acid ethyl ester are dissolved in 3 ml of CH 2 Cl 2 . 57 mg (0.38 mmol) of 2-bromoethyl isocyanate, 10 mg (0.18 mmol) of NH 4 CI and 1 drop of CF 3 COOH are added to the solution with stirring. The mixture is then stirred at 30 ° C. After 4 h, the reaction mixture is filtered and concentrated in vacuo.
  • the oily product is taken up in 20 ml CHCI 3 / ethyl acetate (2: 1). The solution is worked up by column chromatography. As a sta tional phase, SiO 2 (230-400 mesh) is used. CHCI 3 /
  • Substance 18 Cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid ala-ala (OH) 100 mg chlorotrityl resin (0.93 mmol / g, from NovaBiochem), 87 mg (0.28 mmol) Fmoc-Ala (OH), 2 ml CH 2 CI 2 and 1 ml DIEA are reacted at RT in 6 h. Then 0.5 ml of MeOH is added and after 30 min, three times with 1 ml of CH 2 CI 2 . It is then treated for 1 h with 40% piperidine solution in DMF and washed three times with 1 ml of NMP, i-PrOH, ether. The resin is taken up in 2 ml of NMP.
  • Substance 19 Cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid val-ala (OH)
  • Trp OH
  • Fmoc-Ala OH
  • Substance 21 cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid - ile-ala (OH)
  • Substance 22 cycloheximide-N-co-undecanoic acid-met-ala (OH)
  • Substance 23 Cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid - gly-ala (OH)
  • Substance 24 Cycloheximide-N-co-undecanoic acid ala-val (OH)
  • Substance 27 Cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid ile val (OH)
  • Substance 28 Cycloheximide-N-c ⁇ -undecanoic acid-met-val (OH)
  • Substance 29 Cycloheximide-N- ⁇ -undecanoic acid gly-val (OH)
  • the inhibition constants of cycloheximide and some derivatives against the PPIase FKBP12 are determined using a protease-coupled PPIase assay
  • Figure 1 shows an example of the inhibition kinetics for 5 according to Example 2. Typical inhibition constants are listed in Tables 1 and 2.
  • EXAMPLE 3 Cytotoxicity measurement of the cycloheximide derivatives
  • Compounds according to the invention can be classified on the basis of their toxic effects on eukaryotic lines.
  • Cells that die from the addition of cycloheximide are particularly suitable for classification in eukaryotic cell assays.
  • the cytotoxic properties of the compounds according to the invention were characterized using the CHX-sensitive standard cell lines HeLa, mouse fibroblasts L-929 and human leukemia cells K-562. To quantify the influence of CHX or its derivatives on the cell assay, the active substance concentration is determined which leads to the death of 50% of the cells (IC 50 ).
  • the compounds according to the invention can also be characterized on the basis of their action on the regeneration of the sciatic nerve in rats.
  • four-month-old female albino rats (Han: WIST) were given an etheric rush and anesthetized intramuscularly in combination with Rompun (16 mg / kg) and Ketavet (125 mg / kg) in accordance with their body weight.
  • the sciatic nerve was prepared after a skin incision, cut into its distal branches before being separated, and then restored to its continuity microsurgically by three epineural nerve sutures.
  • the seam was covered with BASIC (bacterial synthesized cellulose).
  • BASIC bacterial synthesized cellulose
  • the material also has a depot function for the test substances applied to the lesion site once after the operation.
  • the skin was closed by means of a continuous suture.
  • the animals were subjected to a weekly assessment of their gait behavior over a period of 10 weeks. The evaluation was carried out according to the following criteria:
  • the condition of the operated leg was assessed by awarding points: -1 (negative), 0 (unremarkable) and +1 (positive). The points were calculated after the experiment.
  • the animal provided for in the test protocol was anesthetized again and the M. ext. digit. longus as well as the N. peroneus profundus and the N. ischiaticus in the area of the sheathing for specimen extraction.
  • the corresponding preparations from the opposite side were obtained for a direct comparison.
  • the removed muscles were weighed, frozen in liquid nitrogen and cut into 30 ⁇ m thick sections (FRIGOCUT).
  • the histological evaluation of the sections was carried out by light microscopy after staining with acetylthiocholine iodide.
  • the removed nerve pieces were processed histologically and the cross-sectional preparations obtained were evaluated by light microscopy (myelination, neuromuscular end plates).

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Abstract

Beschrieben werden neue Verbindungen der allgemeinen Formel (1), in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet, jedes R12 unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N-NR2R3 ausgewählt wird, R7 einen Rest -OH, OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9, -OC(S)NHR9 oder O(CHR12)nR10 darstellt, und R10 einen Rest -NHR?2, -NR2R3¿, -C(O)OR2, -C(S)OR2, -C(O)NR2R3, -CN, NR?2C(O)NR2R3¿, -OC(O)NR?2R3, -NR2C(S)NR2R3¿, -OC(S)N R2R3 oder C(O)NHR11 darstellt, die in der Lage sind, die Regeneration von Nervengewebe zu beeinflussen, ebenso wie pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten, und deren Anwendung zur Behandlung von defektem Nervengewebe.

Description

Cycloheximid-Derivate, die die Regeneration von Nervengewebe beeinflussen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cycloheximid-Derivate und pharmakolo- gisch verträgliche Salze davon, die die Regeneration von Nervengewebe bei Säugetieren beeinflussen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen die solche Verbindungen enthalten. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorgenannten Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von beschädigten Nervenzellen.
Um Nervenwachstumsfaktoren zu finden besteht eine der Strategien darin, die Prozesse zu beschreiben, die während des Wachstums von Nervenzellgewebe ablaufen. Insbesondere wird versucht die teilnehmenden Stoffe (Faktoren, Rezeptoren) molekular zu charakterisieren. Darauf aufbauend wird in entsprechenden Nervenzellwachstumstests untersucht ob Konzentrationsveränderungen dieser Stoffe mit Nervenzellwachstum einher geht. So wurde z.B. für Nervenwachs- tumsfaktor NGF (Hutsai, J. Neurose. Res. 39 (1994), 634-645) und seine möglichen Rezeptoren trka und p75(NGFR) (Maeda, Molekular Brain Research 37 (1996), 166-174), als auch für das Neuropeptid Galanin und ein vasoaktives inte- stinales peptid (VIP) (Klimaschewski, Neurose. Letter 195 (1995), 133-136) eine solche Beziehung gefunden. Ein Einfluß auf die Nervenzellgeweberegeneration (maximal etwa 10%) konnte im PC12-Zell-Modell nur für VIP, nicht aber für Galanin gefunden werden. Auch für die Verbindung Veratrylguanidinmethansulfonat (VGT) konnte eine Stimulation der Regeneration von defekten Nervengewebe nachgewiesen werden. Der Effekt war vergleichbar mit der Wirkung von NGF (Becherer, Neurochem. Int. 26 (1995), 245-254).
Zu einem neuen Ansatz in der Suche nach Nervenzellwachstumsfaktoren führte die Entdeckung, daß die Konzentrationen von FKBP12 mRNA nach Läsionen von Nervengewebe sehr stark erhöht sind (Lyons, J. Neurose. 15 (1995), 2985-2994), und daß die Gabe von FKBP12-lnhibitoren die bisher bekannten NGF-Effekte um eine Faktor von etwa 100 erhöht. Da FKBP12-lnhibitoren wie FK506, und seine therapeutischen Effekte, insbesondere seine Nebenwirkungen umfangreich bekannt waren, führte diese Entdeckung zur Suche nach FKBP12-lnhibitoren, von denen therapeutisch nutzbare Nervenregenerationseffekte ausgehen, die aber nicht die nachteiligen Nebenwirkungen der bekannten FKBP12-lnhibitoren aufweisen. Eine Übersicht über solche bekannten Inhibitoren ist z.B. in Hamilton G.S. and Steiner, J.P. Current Pharmac. Design 3 (1997), 405-428 zusammenfassend dargestellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die für die Therapie von Nervendegenerationskrankheiten verwendet werden können, ohne daß toxische Nebenwirkungen in Zellen, insbesondere beim Menschen verursacht werden.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patenansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Cycloheximid-Derivat der allgemeinen Formel (1 ):
10
Figure imgf000005_0001
—
in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet, jedes R12 unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N-NR2R3 ausgewählt wird, wobei
R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, CH3, einen Aralkylrest, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit R6 oder R10 substituierten Cycloalkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit R6 oder R10 substituierten Heterocycloalkyl- oder Heteroarylrest, bei denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Ring durch O, S oder NR5 ersetzt sind oder einen Rest -A-X-B darstellen, oder
R2 und R3 zusammen einen Alkylrest darstellen, der mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 3- bis 5-gliedrigen Ring bilden, der gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten R6 aufweist, wobei gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffe des Alkylenrestes durch -O-, -S-, -NR5-, Cycloalkylen, Heterocycloalkyien, Arylen oder Heteroarylen ersetzt sind, wobei R5 ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder einen Arylrest darstellt, R6 für Alkyl, Aryl, OR5, C(O)OR5, CN oder ein Halogenatom steht und R5 wie vorstehend definiert ist, A einen Alkylenrest und B einen Alkylrest darstellt, X für -O-, -S-, -NR5-, Cycloalkylen, Heterocycloalkyien, Arylen, Heteroarylen oder eine Einfachbindung steht und R5 wie vorstehend definiert ist, R7 einen Rest -OH, -OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9, -OC(S)NHR9 oder -
O(CHR12)nR10 darstellt, wobei
R9 einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit R6 substituiertes Aryl- oder He- teroarylrest, bei dem ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Ring durch O, S oder
NR5 ersetzt sind, oder einen Rest -A-X-B darstellt, wobei A, B, X, R5 und R6 wie vorstehend definiert sind, und
R10 einen Rest -NHR2, -NR2R3, -C(O)OR2, -C(S)OR2, -C(O)NR2R3, -CN, -
NR2C(O)NR2R3, -OC(O)NR R3, -NR2C(S)NR2R3, -OC(S)N R2R3 oder -C(O)NHR11 darstellt, wobei R2 und R3 wie vorstehend definiert sind und
R1 für einen Aminosäurerest oder Oligopeptidrest steht, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß der Wirkstoff Cycloheximid (CHX) und von diesem Wirkstoff abgeleitete Derivate die Pepti- dylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität von Peptidylprolyl cis/trans Isomerasen (PPIasen) vom FK506-bindenden Typ (FKBPs) hemmen können und auf dem überraschenden Befund, daß diese Derivate im Vergleich zu Cycloheximid nur geringe Toxizität gegenüber eukaryotischen Zellinien aufweisen. Diese Verbindungen können daher als Therapeutika zur Regeneration von Nervengewebe bei Säugetieren, insbesondere beim Menschen genutzt werden.
Der Begriff "Peptidylprolyl cis/trans Isomerasen" (PPIasen, EC 5.2.1.8) bezieht sich auf eine Gruppe von Enzymen, welche die Interkonversion von eis und trans Isomeren von Peptidylprolylbindungen katalysieren können. Entdeckt wurden diese Enzyme ursprünglich als Katalysatoren dieser Interkonversion in Oligopeptid- substraten1). Die Einteilung dieser Enzyme erfolgt vorwiegend mittels Aminosäure- Sequenzvergleichen aber auch entsprechend ihrer Inhibierbarkeit mit niedermolekularen Inhibitoren2'. So werden die als Cyclophiline bezeichneten PPIasen durch den Wirkstoff Cyclosporin A (CsA) und die unter dem Begriff FKBPs zusammengefaßten PPIasen durch den Wirkstoff FK506 inhibiert. Beide Wirkstoffe zeigen immunsuppressive Eigenschaften3'. Verschiedene Untersuchungen belegen, daß die immunsuppressiven Eigenschaften dieser Wirkstoffe über die Bildung temärer Komplexe zwischen PPIase, ihrem Inhibitor und weiteren Partnern erreicht wird. So können sowohl der Enzym-Inhibitor-Komplex FKBP12- FK506, als auch der Komplex Cyclophilin-CsA an Calcineurin, eine Proteinphos- phatase binden und so die Signalkaskade, die zur T-Zeil-vermittelten Proliferation führen kann, inhibieren. In ähnlicher Weise kann der Komplex aus FKBP12 und dem PPIase-lnhibitor Rapamycin mit dem RAFT1/FRAP Protein wechselwirken und so die Signalkaskade des IL-2 Rezeptors inhibieren.
Neben diesen immunsuppressiven Eigenschaften sind auch Wirkungen für PPIa- se-lnhibitoren bekannt, die zur Regeneration beeinträchtigter Nervenzellen führen können4'. Daneben wurde der Effekt der Unterdrückung der durch FKBP12 vermittelten Hemmung der Autophosphorilierung des EGF-Rezeptors durch FKBP12- Inhibitoren wie Rapamycin und FK506 beschrieben5'. FKBP12 bzw. FKBP12.6 modulieren den Kalzium-Ausstrom durch multiple intrazelluläre Kalzium-Kanäle, wie den tetrameren Ryanodin-Rezeptoren der Skelettmuskel- bzw. Herzmuskelzellen. Abdissoziation des rezeptorgebundenen FKBPs durch FKBP12-lnhibitoren, z.B. die Wirkstoffe FK506 und Rapamycin, führt zur DeStabilisierung der Kalzium- Kanäle2'.
Die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität kann (a) sehr einfach mittels isomerspezifischer Proteolyse mittels für den Assay geeigneter isomerspezifischer Proteasen und geeigneter, eine Peptidylprolyl - Bindung enthaltener Substrate nachgewiesen werden6', wie dies im Ausführungsbeispiel (2) beschrieben wird. Der Nachweis dieser Aktivität kann aber auch mittels anderer Verfahren, wie z.B. (b) mittels isomerspezifischer, spektroskopischer Unterschiede7' oder (c) anhand der Katalyse der Renataurierung geeigneter Proteine8', oder (d) durch Beobachten der unterschiedlichen isomerspezifischen Mobilität9', aber z.B. auch anhand der (e) isomerspezifischen chemischen Verschiebung bei Anwendung der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR)10', geführt werden. Wenn der Zusatz von Wirkstoffen zu einem der oben aufgeführten Tests zu einer Verminderung der durch PPIase katalysierten Reaktionsgeschwindigkeit führt, werden diese Wirkstoffe als PPIase-lnhibitoren bezeichnet, wie dies im Ausführungsbeispiel (2) exemplarisch gezeigt wird. Durch Variation der für den jeweiligen Assay eingesetzten PPIase kann die PPIase-Spezifität des Inhibitors beurteilt werden. Die Inhibitorkonzentration, welche die PPIase-vermittelte Katalyse um 50% inhibiert, wird als IC50-Wert bezeichnet. Inhibierungskonstanten (KrWerte) werden mittels üblicher Methoden11' ermittelt.
Zu den Wirkstoffen, welche diese PPlase-Aktivität in mindestens einer der oben aufgeführten Nachweismethoden vermindern können, gehören die Wirkstoffe Cy- closporin A, FK506 und Rapamycin12). Dabei inhibieren die Wirkstoffe FK506 und Rapamycin PPIasen, die zu den FKBPs gezählt werden. Während die Familie der FKBPs durch das Vermögen charakterisiert wird, FK506 bzw. Rapamycin spezifisch zu binden, gibt es auch Vertreter von FKBPs, die entsprechend ihrer Aminosäuresequenzhomologie zu den FKBPs gezählt werden, aber nur eine geringe Affinität zu diesen Wirkstoffen aufweisen. Bisher war unbekannt, das Cycloheximid oder eines seiner Derivate, deren Darstellung exemplarisch in Ausführungsbeispiel (1 ) beschrieben wird, PPIasen vom FKBP-Typ inhibieren können.
Cycloheximid (4-[2-(3,5-Dimethyl-2-oxocyclohexyl)-2-hydroxy-ethyl]-2,6-piperidin- dion; Molekulargewicht: 281 ,34; Schmelzpunkt: 119-121 °) wurde 1947 als Begleiter des Streptomycins aus Streptomyces griseus isoliert. Es wirkt in starker Verdünnung gegen viele Hefen, pilzbedingte Hautkrankheiten u. parasitäre Pilze, wie z.B. Erreger der Braunfleckigkeit von Pfirsichen, Blattflecken von Kirschen usw., weniger gegen Bakterien13'. Nach Jackson14' und anderen hemmt Cycloheximid die Protein-Biosynthese und wirkt auf Eukaryoten toxisch15'. Cycloheximid findet Verwendung als Fungizid im Obstbau. Es konnte aber auch gezeigt werden, daß nicht-toxische Dosen von CHX andere zusätzliche Effekte verursachen können:
So beschreiben z.B. Akagawa et al16' mittels kinetischer Analysen daß die Suppression der Induktion bestimmter als „Hitze/Schock"-Gene bezeichneter DNA- Sequenzen durch CHX sich von den durch die Inhibition der Proteinsynthese hervorgerufenen Effekten bei tierischen Ei-Zellen unterscheiden läßt. Diese differenzierte Wirkung von CHX konnte auch in Tabak-Zellen auf mRNA-Ebene gefunden werden. So beschreiben Imanishi et al17) die selektive Blockierung bzw. Aktivierung bestimmter mRNAs durch CHX.
Zahlreiche Untersuchungen befassen sich mit CHX-Effekten auf Neuronen. Castagne und Clarke18' können mittels in vivo Untersuchungen an retinalen Ganglionzellen zeigen, daß CHX den durch Axotomie eingeleiteten Zelltod inhibiert. Kharlamov et al19', die ein phototrombisches in vivo Modell an Ratten nutzen, demonstrierten ebenfalls, daß CHX Läsionen des Hirns, die üblicherweise in diesem Modell durch Bestrahlung ausgelöst werden, vermindert. Die vor dem Zelltod schützende Eigenschaft des CHX wurde auch an Leberzellen der Ratte gezeigt20'. Diese therapeutisch wünschenswerte Wirkung von CHX, die letztendlich sekundär zur Verringerung von Zellschäden führt, die durch andere primäre Faktoren hervorgerufen wurden, kann mittels CHX aufgrund seiner oben beschriebenen hohen Toxizität nur bedingt therapeutisch genutzt werden.
Die Inhibierung der Peptidylprolyl cis/trans Isomeraseaktivität von PPIasen durch CHX oder seine Derivate und die Existenz von CHX-Derivaten, die sowohl die PPIase-Aktivität inhibieren können und gleichzeitig, verglichen mit CHX nur geringe toxische Wirkung auf eukaryotische Zelllinien zeigen, wie dies im Ausführungsbeispiel (3) gezeigt wird, die aber auch dadurch gekennzeichnet sind, daß diese erfindungsgemäßen Substanzen bei Anwendung therapeutischer K .izentrationen, therapeutischer geeigneter Formulierungen und therapeutisch geeigneter Applikationsformen regenerative Wirkungen auf Nervenzellgewebe aufweisen, wie dies im Ausführungsbeispiel (4) gezeigt wird, sind bisher nie beschrieben worden.
Aus dem oben gesagten ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen die Regeneration von Nervenzellgewebe stimulieren können und durch ihre verglichen mit CHX geringe Toxizität in der Therapie von Krankheiten eingesetzt werden können, die mit der Schädigung des Nervenzellgewebes in Verbindung stehen. Vorzugsweise ist die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindung mäßig bis gering und vorzugsweise nicht gegeben gemäß den Kriterien in nachfolgendem Beispiel 3. Vorteilhafterweise liegt der IC50-Wert bei 50-100 μg/ml, besonders bevorzugt bei einem IC50-Wert von 100-200 μg/ml und ganz besonders bevorzugt bei einem IC50-Wert von über 200 μg/ml.
Die regenerativen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen auf Nervenzellgewebe können nach herkömmlichen Methoden bestimmt werden, beispielsweise wie im Ausführungsbeispiel 4 gezeigt.
In der vorgenannten Formel (1 ) ist n vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 10. Bevorzugte Definitionen für R1 sind O, NOH, N-NHPh, N-NHCH3, N-Alkyi und N- Benzyl. R7 steht vorzugsweise für OH, O(CHR12)nR10 oder O(CO)CH3. Bevorzugt steht R 0 für C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2 und C(O)NHR11. R 2 bedeutet vorzugsweise ein Wasserstoffatom, CH3 oder C2H5.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verbindung der vorgenannten Formel (1) sind Verbindungen für die gilt:
(a) n = 1 , 2, 3; R1= O; R7= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)CH3; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R 2= H, CH3, C2H5; oder
(b) n = 3-10; R = O; R7= OH; R10= C(O)NHR11, R11= Aminosäurerest, Oligopep- tidrest; R12= H, CH3, C2H5; oder
(c) n = 1 , 2, 3; R = O; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5; oder
(d) n = 1 , 2, 3; R1= NOH, N-NHPh, N-NHCH3, N-Alkyl, N-Benzyl; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5; oder
(e) n = 1 , 2, 3; R1= O; R7= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)NH-Alkyl, OC(O)NH- Cycloalkyl, OC(O)NH-Aryl; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5. Bevorzugte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung und die folgenden Verbindungen 1 bis 39 gemäß Formel 1:
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11
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Verbindung 18-29
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In den vorstehenden Formeln der erfindungsgemäßen Verbindungen und im Folgenden bedeuten Alkyl einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest insbesondere CrC8-Alkyl bzw. durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, CN, NO2, S, O, C(O) substituiertes Alkyl. In den vorstehenden Formeln der erfindungsgemäßen Verbindungen und im Folgenden bedeuten Cycloalkyl insbesondere C4-C7-Cycloalkyl bzw. bi- und tricyclische Systeme, die durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, CN, NO2, S, O, C(O) substituiert sein können. Aryl bedeutet insbesondere Phenyl bzw. durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, CN, NO2, C(O) substituiertes Aryl und Heteroaryl insbesondere sechsgliedrige Aromaten, die Stickstoff enthalten bzw. fünf- gliedrige Aromaten, die Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten. Oligopeti- dreste bedeuten bevorzugt Reste aus 2-5 kondensierten Aminosäuren. Halogen bedeutet F, Cl, Br und I.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Molekulargewicht kleiner als etwa 2000 g/Mol, vorzugsweise kleiner als 1000 g/Mol und insbesondere bevorzugt kleiner als etwa 750 g/Mol. Beispielsweise hat die erfindungsgemäße Verbindung Cycloheximid-N- ethansäureethylester (Substanz 5) ein Molekulargewicht von 367.4.
Wie bereits vorstehend aufgeführt, wird angenommen, ohne daran zu denken, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, daß die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen darauf zurückzuführen sind, daß sie eine Affinität zu FK506-bindende Proteine besitzen und vorzugsweise in der Lage sind, die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität des FK506-bindenden Proteins zu inhibieren. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform die oben beschriebenen Verbindungen, die in der Lage sind die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität des FK506-bindende Proteine zu inhibieren. Wie diese inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmt werden kann, ist bereits vorstehend ausgeführt worden. Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal ist die vorteilhafte Eigenschaft, daß zumindest der größte Teil der vorgenannten Verbindungen eine geringe Toxizität aufweist; siehe auch das nachfolgende Beispiel 3. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die vorgenannten Verbindungen im Vergleich zu Cycloheximid eine geringere Toxizität gegenüber eukaryotischen Zelllinien auf. Dabei sind Verbindungen mit den oben beschriebenen bevorzugten IC50-Werten besonders bevorzugt.
Weiterhin zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise dadurch aus, in der Lage zu sein, bei Anwendung in therapeutischen Mengen, die Regeneration von Nerven therapeutisch zu beeinflussen, d. h. vorzugsweise die Nervenregeneration zu stimulieren oder unterstützend zu begleiten; siehe auch das nachfolgende Ausführungsbeispiel 4.
Im Hinblick auf die vorteilhaften therapeutischen Eigenschaften und die geringe Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen betrifft die vorliegende Erfindung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann geläufig und umfassen beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, sterile Lösungen etc.. Zusammensetzungen, die derartige Träger enthalten, können nach gängigen Verfahren formuliert werden. Die Verbindungen der Formel (1 ) werden in herkömmlichen Dosierungsformen hergestellt, indem eine Verbindung der Formel (1 ) mit pharmazeutischen Standard-Trägern gemäß herkömmlichen Verfahren kombiniert wird. Die Verbindungen der Formel (1) können auch in herkömmlichen Dosierungen in Kombination mit einer bekannten, zweiten therapeutisch wirksamen Verbindung verabreicht werden. Diese Verfahren können - je nach gewünschtem Mittel - auch das Mischen, Granulieren und Pressen oder Lösen der Inhaltsstoffe beinhalten. Der eingesetzte pharmazeutische Träger kann z.B. entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele für feste Träger sind Lactose, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Gummiarabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispiele für flüssige Träger sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Wasser und dergleichen. Entsprechend kann der Träger oder das Verdünnungsmittel im Fachgebiet bekannte Zeitverzögerungsmaterialien enthalten, wie Glyce- rylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit einem Wachs. Mann kann eine große Vielzahl pharmazeutischer Formen einsetzen. Wenn somit ein fester Träger verwendet wird, dann kann das Mittel tablettiert werden, in eine Hartgelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform gefüllt oder in Form einer Pastille ("Troche" bzw. "Lozenge") gebracht werden. Die Menge des festen Trägers variiert stark, reicht jedoch vorzugsweise von etwa 25 mg bis etwa 1 g. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, hat das Mittel die Form eines Sirups, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit, wie eine Ampulle oder eine nichtwäßrige flüssige Suspension.
Die Menge einer Verbindung der Formel (1 ), die für eine therapeutische Wirkung bei topischer Verabreichung erforderlich ist, variiert bei allen hier offenbarten Gebrauchsverfahren in Abhängigkeit von der ausgewählten Verbindung und der Art und Stärke der Nervenzellschädigungen, und vom behandelten Patienten und liegt schließlich im Ermessen des Arztes. Eine geeignete topische entzündungshemmende Dosis eines Wirkstoffes, d.h. einer Verbindung der Formel (1), beträgt 0,1 mg bis 150 mg und wird ein- bis viermal, bevorzugt zwei- bis dreimal täglich verabreicht.
Topische Verabreichung bedeutet nicht-systemische Verabreichung und beinhaltet die Anwendung einer Verbindung der Formel (1 ) extern auf die Epidermis, in die Mundhöhle und das Eintropfen dieser Verbindung in Ohr, Auge und Nase, und an Stellen, bei denen die Verbindung nicht signifikant in den Blutstrom eintritt. Systemische Verabreichung bedeutet oral, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung. Es ist zwar möglich, den Wirkstoff allein als Rohchemikalie zu verabreichen, bevorzugt wird er jedoch als pharmazeutische Formulierung dargereicht. Der Wirkstoff kann für die topische Verabreichung 0,001 % bis 10% (Gew./Gew.), z.B. 1 bis 2 Gew.% der Formulierung, umfassen, obwohl er bis zu 10% (Gew./Gew.), jedoch vorzugsweise nicht mehr als 5% (Gew./Gew.) und stärker bevorzugt von 0,1% bis 1 % (Gew./Gew.) der Formulierung umfassen kann.
Die erfindungsgemäßen topischen Verbindungen umfassen einen Wirkstoff, zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Träger(n) dafür und wahlweise (einen) andere(n) therapeutische(n) lnhaltsstoff(e). Der/die Träger muß/müssen in dem Sinne "verträglich" sein, daß er/sie mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist/sind und für den Empfänger daher nicht schädlich ist/sind.
Die zur topischen Verabreichung geeigneten Formulierungen sind u.a. flüssige oder halbflüssige Mittel, die die Haut bis zum Wirkort durchdringen können, wie Einreibemittel, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und Tropfen, die sich zur Verabreichung an Auge, Ohr oder Nase eignen.
Die erfindungsgemäßen Tropfen können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen, und können durch Lösen des Wirkstoffs in einer geeigneten wäßrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder eines anderen geeigneten Konservierungsmittels hergestellt werden, und enthalten vorzugsweise auch ein grenzflächenaktives Mittel. Die entstandene Lösung kann dann durch Filtration geklärt werden, in einen geeigneten Behälter überführt werden, der dann verschlossen und durch Autoklavieren oder Halten bei 98-100°C für eine halbe Stunde sterilisiert wird. Die Lösung kann alternativ durch Filtration sterilisiert und über ein keimfreies Verfahren in den Behälter überführt werden. Beispiele für bakterizide und fungizide Mittel, die geeigneterweise in die Tropfen aufgenommen werden können, sind Phenylquecksilbemitrat oder -acetat (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Geeig- nete Lösungsmittel für die Herstellung einer öligen Lösung sind u.a. Glycerin, verdünnter Alkohol und Propylenglycol.
Erfindungsgemäße Lotionen beinhalten solche, die sich zum Aufbringen auf die Haut oder ins Auge eignen. Eine Augenlösung kann eine sterile wäßrige Lösung umfassen, die gegebenenfalls ein Bakterizid enthält, und durch Verfahren hergestellt werden kann, die denen zur Herstellung von Tropfen ähneln. Lotionen und Einreibemittel zum Aufbringen auf die Haut können auch ein Mittel enthalten, das das Trocknen beschleunigt und die Haut kühlt, wie Alkohol oder Aceton, und/oder ein Feuchthaltemittel, wie Glycerin oder ein Öl, wie Rhizinusöl oder Erdnußöl.
Erfindungsgemäße Cremes, Salben oder Pasten sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffes für die äußere Anwendung. Sie können hergestellt werden, indem der Wirkstoff in feinteiliger oder pulverisierter Form, allein oder in Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit, mittels geeigneter Maschinerie, mit einer fettigen oder nichtfettigen Basis gemischt wird. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe umfassen, wie Hart-, Weich- oder Flüssigparaffin, Glycerin, Bienenwachs, eine Metallseife; einen Schleimstoff, ein Öl natürlichen Ursprungs, wie Mandel-, Mais-, Erdnuß-, Rhizinus- oder Olivenöl, Wollfett oder dessen Derivate, oder eine Fettsäure, wie Stearinsäure oder Oleinsäure, zusammen mit einem Alkohol, wie Propylenglykol oder Makrogelen. Die Formulierung kann ein geeignetes grenzflächenaktive Mittel beinhalten, wie ein anionisches, kationisches oder nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, wie Sorbitanester oder Po- lyoxyethylenderivate davon. Suspendierungsmittel, wie Naturkautschuke, Cellulo- sederivate oder anorganische Materialien wie kieselsäurehaltige Siliziumdioxide und andere Inhaltsstoffe, wie Lanolin, können ebenfalls enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können durchgeführt werden, indem der erfindungsgemäße Wirkstoff beispielsweise parenteral verabreicht wird. Der hier verwendete Begriff "parenteral" steht für intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intranasale, intrarektale, intravaginale oder intraperitoneale Verabreichung. Die sub- kutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung werden gewöhnlich bevorzugt. Die geeigneten Dosierungsformen für diese Verabreichung können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.
Bei allen hier offenbarten Gebrauchsverfahren für die Verbindungen der Formeln (1 ) reicht das tägliche orale Dosierungsschema vorzugsweise von etwa 0,05 bis etwa 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht, vorzugsweise von etwa 0,1 bis 30 mg/kg, stärker bevorzugt von etwa 0,5 bis 15 mg/kg. Das tägliche parenterale Dosierungsschema reicht vorzugsweise von etwa 0,05 bis etwa 80 mg pro Kilogramm (kg) Gesamtkörpergewicht, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 30 mg/kg, und stärker bevorzugt von etwa 0,5 bis 15 mg/kg.
Die Verbindungen der Formel (1 ) können auch durch Inhalierung verabreicht werden. "Inhalierung" bedeutet intranasale und orale Inhalierungsverabreichung. Geeignete Dosierungsformen für diese Verabreichung, wie Aerosolformulierung oder ein Meßdosis-Inhalator, können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Die bevorzugte tägliche Dosierungsmenge einer Verbindung der Formel (1 ), die für alle hier offenbarten Verfahren durch Inhalierung verabreicht wird, reicht von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 1 mg/kg pro Tag.
Der Fachmann weiß, daß die Form und die Eigenschaft des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels von der zu kombinierenden Wirkstoffmenge, dem Verabreichungsweg und anderen wohlbekannten Variablen bestimmt wird.
Der Fachmann weiß auch, daß die optimale Menge und der optimale Abstand von Einzeldosierungen einer Verbindung der Formel (1 ) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon von der Art und dem Ausmaß des zu behandelnden Leidens, der Verabreichungsform, dem Verabreichungsweg und der Verabreichungsstelle und dem jeweils behandelten Patienten bestimmt wird, und daß diese Optimalwerte durch herkömmliche Techniken bestimmt werden können. Der Fachmann ist sich auch darüber bewußt, daß der optimale Behandlungsver- lauf, d.h. die Anzahl der Dosen einer Verbindung der Formel (1) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, die täglich für eine bestimmte Anzahl von Tagen gegeben werden, vom Fachmann über herkömmliche Behandlungsver- laufs-Bestimmungstest bestimmt werden kann.
Die Dosierung hängt dabei von vielen Faktoren ab, z.B. dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Alter des Patienten, sowie der Art der speziell verabreichten Verbindung, der Art der Verabreichung etc.. Im allgemeinen liegt die täglich verabreichte Dosis bei 1 μg bis 10mg Einheiten pro Tag. Im Zusammenhang mit der intravenösen Injektion von der Verbindung der Substanzklasse der erfindungsgemäßen Verbindungen sind Dosierungen von etwa 1-40 mg/kg Körpergewicht pro Tag gängig. Die Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verabreicht werden. Im allgemeinen wird die Verabreichung parenteral erfolgen, z.B. intravenös. Nach chirurgischen Eingriffen kann eine lokale Verabreichung z.B. über ein Pflaster mit Depotwirkung bevorzugt sein. Nach chirurgischen Eingriffen kann es aber auch von Vorteil sein, die lokale Verabreichung unmittelbar in die Nähe des zum Wachstum zu beeinflussenden Nervengewebes zu verbringen, z.B. mittels einer Drainage oder eines örtlichen Trägermaterials. Das Trägermaterial weist dabei die Beschaffenheit auf, daß es geeignet ist, den zu verabreichenden Wirkstoff unmittelbar in einer therapeutisch gewünschten Zeit- und Dosis-abhängigen Weise an den Wirkort zu verbringen. Eine weitere Eigenschaft kann sein, daß das Trägermaterial durch körpereigene Prozesse abbaubar ist, so daß kein weiterer chirurgischer Eingriff zur Entfernung des Trägermaterials notwendig ist. Es kann aber auch von Vorteil sein, solches Trägermaterial einzusetzen, welches nach der erwünschten Wirkung einer Nervenregeneration durch geeignete chirurgische Maßnahmen wieder entfernt wird.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einer Verbindung, die die vorgenannten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen aufweist, beispielsweise die Eigenschaft, die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität des FK506 bindenden Proteins zu inhibieren, eine geringe Toxizität aufzuweisen und therapeutische Effekt insbesondere auf die Regeneration von Nerven zu entfalten zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Nervenzellkrankheiten. Neben der chemischen Derivatisierung der oben beschriebenen Verbindungen können solche Verbindungen auch durch Überlegungen zu deren Struktur aufgefunden werden. Beispielsweise können dreidimensionale und/oder kristallografische Strukturanalysen der erfindungsgemäßen Verbindungen insbesondere derjenigen, die besonders geringe Toxizität und eine hohe Wirkung auf die Regeneration von Nervengewebe zeigen, zum Design von erfindungsgemäßen Wirkstoffen dienen. Solche Ansätze sind bereits mit anderen Systemen erprobt, siehe beispielsweise Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558. Weiterhin können xenobiotische Wirkstoffe identifiziert werden, die nicht oder nicht unmittelbar von Cycloheximid abgeleitet werden können. Die biologischen Eigenschaften solcher Verbindungen können beispielsweise gemäß den nachfolgenden Ausführungsbeispielen getestet werden.
Es sind ferner eingeschlossen alle Verbindungen, die in einer Pro-Form verabreicht werden können und im Körper in eine der wirksamen und wie oben definierten Strukturen metaboiisiert werden können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder an diesen orientierte Derivate können von dem Fachmann bekannterweise hergestellt werden (siehe z.B. Piatak D.M. et. al. (1986), J. Med. Chem. 29, 50-54).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden zum Beispiel hergestellt, indem in bekannter Weise
(a) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Dimethylformamid, bei Raumtemperatur mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 zu den entsprechenden N-Alkyl- bzw. N,O-Bisalkylverbindungen umgesetzt werden. (b) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Aceton, bei Raumtemperatur mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz kata- lytischer Mengen an Kronenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-Alkyl- bzw. N,O-Bisalkylverbindungen umgesetzt werden.
(c) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Aceton, bei Siedehitze mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz katalytischer Mengen an Kronenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-Alkyl- bzw. N,O-Bisalkylverbindungen umgesetzt werden.
(d) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Dimethylformamid, bei Raumtemperatur mit an Trägermaterialien (übliche Harze für Festphasenreaktionen) gebundenen Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz katalytischer Mengen an Kronenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-Alkylverbindungen umgesetzt und in gewohnter Weise vom Träger abgespalten werden.
(e) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Pyridin, bei Raumtemperatur mit Carbonsäureanhydriden zu den entsprechenden Estern umgesetzt werden.
(f) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem Gemisch aus Pyridin/H2O (2:1 ), bei Raumtemperatur mit Hydroxyla- min-Hydrochloriden zu den entsprechenden Oximen umgesetzt werden.
(g) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Methanol, bei Raumtemperatur mit Hydrazinen zu den entsprechenden Hydrazonen umgesetzt werden.
(h) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Methanol, bei Raumtemperatur mit primären Aminen zu den entsprechenden Azomethinen umgesetzt werden.
(i) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methylenchlorid, bei Raumtemperatur mit Isocyanaten und einem geeigne- ten Katalysator, wie zum Beispiel HCI, zu den entsprechenden Urethanen umgesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit bekannten, nervenregenerationsfördemden Wirkstoffen verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Cycloheximid-Derivate können z.B. verabreicht werden (a) bei zu erwartenden Schlaganfällen oder sonstigen Nervenzellschädigungen als vorbeugende Gabe zur Vermeidung oder Begrenzung dieser Nervenzellschädigungen, (b) zur Förderung des Nervenwachstums von infolge chirurgischer Eingriffe bzw. unfallbedingt unterbrochener Nervenbahnen und (c) zur Behandlung allgemeiner Nervenzellschädigungen, die durch Regeneration gelindert oder geheilt werden können.
Die Abbildungen zeigen:
Abbildung 1 :
Inhibierung von hrFKBP12 durch Substanz 5: Puffer: 35 mM HEPES (pH 7.8); Substrat: 69.8 μM Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-(4-) NA; Protease: 1.7 mg/ml α- Chymotrypsin; 16 nM rhFKPB12, Effektor: Substanz 3, Stammlösung 10 mg/ml in Ethanol, Konzentration im Meßansatz 250-0.1 μM; Temp.: 10°C.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Der Fachmann kann ohne weitere Ausarbeitung anhand der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung im vollsten Ausmaß nutzen. Die nachstehenden Beispiele werder daher nur als Veranschaulichung und keineswegs als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung gegeben. BEISPIEL 1 : In vitro Synthese von Derivaten des Cyloheximids
Alle Substanzen wurden mittels konventioneller, dem Fachmann allgemein bekannter, chemischer Verfahren unter Verwendung kommerziell verfügbaren Cyclo- heximids so hergestellt, wie es für die Substanzen 1 - 29 beispielhaft angegeben wird:
Substanz 1: Cycloheximid-N-4-butansäureethylester
500 mg (1.78 mmol) Cycloheximid werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 414 mg (3.0 mmol) K2CO3 und 390 mg (2.0 mmol) 4-Brombuttersäureethylester gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h wird die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt und das feste Produkt in 10 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Unlösliche Bestandteile werden abfiltriert und die Lösung säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / Essigsäureethylester (EE) (2:1 ). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 197 mg (27.8 %), farbloses, zähflüssiges Öl. Analyse: (C21H35NO6, M = 397.52 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 397.8 m/e; Ber.: C 63.45, H 8.87, N 3.52, Gef.: C 63.60, H 8.84, N 3.34%. 1H-NMR (CDCI3): δ 0.85-1.10 (d + t, 6 H, J(d) = 6.4 Hz); 1.24 (d, 3 H, J = 7.2 Hz);
1.8-3.4 (m, 21 H); 3.68 (m, 1 H); 3.91 (t, 2 H, J = 6.6 Hz); 4.05
(m, 1 H). 3C-NMR (CDCI3): δ 14.1 (s, CH3CHCO); 15.1 (s, CH3CH2); 18.3 (s,
CH3CH(CH2)2);170.9 (s, COO); 172.3 (s, CO-NH); 172.3 (s,
CO-
NH); 216.5 (s, CH-CO-CH). Substanz 2: Cycloheximid-N,0-bis-4-butansäureethylester
Die Aufarbeitung der 1. Fraktion ergibt Cycloheximid-N,O-bis-4-butansäure- ethylester.
Ausbeute: 83 mg (9.1 %), farbloses, zähflüssiges Öl.
Analyse: (C27H43NO8, M = 509.65 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 509.8 m/e;
Ber.: C 63.63, H 8.50, N 2.75, Gef.: C 63.42, H 8.74, N 2.94%.
Substanz 3: Cycloheximid-N-4-butansäurenitril
250 mg (0.89 mmol) Cycloheximid werden in 5 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 210 mg (1.52 mmol) K2CO3 , 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 und 0.20 mg (1.35 mmol) 4-Brombuttersäurenitril gegeben. Anschließend wird bei
Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h werden unlösliche Bestandteile abfiltriert und die Reaktionsmischung wird im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 10 ml CHCI3/Essigester (1 :1 ) aufgenommen und die Lösung säulen- chromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / Essigester (1 :1). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 125 mg (40.3 %), farbloses, zähflüssiges Öl.
Analyse: (C19H28N2O4, M = 348.44 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 349.6 m/e;
Ber.: C 65.49, H 8.10, N 8.04, Gef.: C 65.20, H 8.04, N 8.18%.
Substanz 4: Cycloheximid-N-methyl-p-benzoesäurenitril
300 mg (1.07 mmol) Cycloheximid werden in 3 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 250 mg (1.81 mmol) K2CO3 , 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 und 250 mg (1.27 mmol) 4-Brommethylbenzoesäurenitril gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h werden unlösliche Bestandteile abfiltriert und die Reaktionsmischung wird im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 10 ml CHCI3/Essigester (1 :1 ) aufgenommen und die Lösung säulen- chromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / Essigester (1 :1 ). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 135 mg (40.3 %), farbloses, zähflüssiges Öl.
Analyse: (C23H28N2O4, M = 396.48 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 398.1 m/e;
Ber.: C 65.49, H 8.10, N 8.04, Gef.: C 65.20, H 8.04, N 8.18%.
1H-NMR (CDCI3): δ 0.98 (d, 3 H, J = 6.4 Hz); 1.24 (d, 3 H, J = 7.1 Hz); 1.50- 3.60 (m, 14 H); 4.19 (m, 1 H); 4.94 (s, 2 H); 7.51-7.67 (m, 4 H). 3C-NMR (CDCI3): δ 14.0 (s, CH3CHCO); 21.1 (s, CH3CH(CH2)2);
118.6 (s, CN); 129.2, 131.2, 132.4, 133.5 (s, C6H4); 171.9 (s, CO-NH); 172.1 (s, CO-NH); 216.5 (s, CH-CO-CH).
Substanz 5: Cycloheximid-N-ethansäureethylester
5.0 g (17.8 mmol) Cycloheximid werden in 35 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 3.0 g (21.6 mmol) K2CO3 , 100 mg (0.38 mmol) 18-Crown-6 und 3 ml (27.0 mmol) 2-Bromessigsäureethylester gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 20 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / EE (2:1 ). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 4.3 g (65.7 %), farblose Kristalle (EE), Fp = 100-101 °C, [α]D= 8.7°
(Pyridin). Analyse: (C19H2gNO6, M = 367.45 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 368.8 m/e; Ber.: C 62.11 , H 7.96, N 3.81 , Gef.: C 61.99, H 7.91 , N 3.87%. 1H-NMR (CDCI3): δ 0.99 (d, 3 H, J = 6.4 Hz); 1.20-1.35 (d+t, 6 H, J(d) = 7.2 Hz, J(t)
= 7.2 Hz); 1.55-2.95 (m, 14 H); 4.10-4.30 (q+m, 3 H, J(q) = 7.1
Hz); 4.49 (s, 2 H). 13C-NMR (CDCI3): δ 14.0 (s, CH3CHCO); 14.1 (s, CH3CH2); 18.3 (s, CH3CH); 40.5
(s, CH2COO); 61.4 (s, CH2O); 66.5 (s, CHOH); 167.9 (s, COO);
171.6 (s, CO-NH); 171.8 (s, CO-NH); 216.4 (s, CH-CO-CH). Substanz 7: Cycloheximid-N-ethansäureamid
500 mg (1.78 mmol) Cycloheximid werden in 10 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 420 mg (3.04 mmol) K2CO3 , 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 und 270 mg (1.96 mmol) 2-Bromessigsäureamid gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 15 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / EE (2:1 ). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 210 mg (34.8 %), farbloses, amorphes Pulver. Analyse: (C17H26N2O5, M = 338.41 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 339.7 m/e; Ber.: C 60.34, H 7.74, N 8.28, Gef.: C 60.17, H 7.77, N 8.02%. 1H-NMR (CDCI3): δ 0.97 (d, 3 H, J = 6.4 Hz); 1.23 (d, 3 H, J = 7.1 Hz); 1.55-
2.90 (m, 14 H); 4.15 (m, 1 H); 4.43 (s, 2 H); 5.80-6.20
(m, 2 H). 13C-NMR (CDCI3): δ 14.2 (s, CH3CHCO); 18.3 (s, CH3CH); 40.4 (s, CH2COO);
66.5 (s, CHOH); 169.6 (s, COO); 172.1 (s, CO-NH);
172.3 (s, CO-NH); 216.3 (s, CH-CO-CH).
Substanz 9: Cycloheximid-N-3-propionsäuremethylester
500 mg (1.78 mmol) Cycloheximid werden in 40 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 2.0 g (14.5 mmol) K2CO3, 100 mg (0.38 mmol) 18-Crown-6 und 2.5 ml (22.9 mmol) 3-Brompropionsäuremethylester gegeben. Anschließend wird unter Rühren 72 h zum Sieden erhitzt. Danach wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Produkt wird in 15 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3/ EE (2:1 ). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 220 mg (33.6 %), farbloses zähflüssiges Öl. Analyse: (C19H29NO6, M = 367.45 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 368.9 m/e; Ber.: C 62.11 , H 7.96, N 3.81 , Gef.: C 61.89, H 7.93, N 3.73%.
Substanz 10: Cycloheximid-N-3-propionsäureethylester
500 mg (1.78 mmol) Cycloheximid werden in 40 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 2.0 g (14.5 mmol) K2CO3, 100 mg (0.38 mmol) 18-Crown-6 und 2.5 ml (20.0 mmol) 3-Brompropionsäureethylester gegeben. Anschließend wird unter Rühren 72 h zum Sieden erhitzt. Danach wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Produkt wird in 15 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3/ EE (2:1). Die zweite Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 110 mg (16.2 %), farbloses zähflüssiges Öl. Analyse: (C20H31NO6, M = 381.47 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 382.8 m/e; Ber.: C 62.97, H 8.19, N 3.67, Gef.: C 62.84, H 8.03, N 3.72%.
Substanz 11: Cycloheximid-N-(+/-)-2-propionsäureethylester 500 mg (1.78 mmol) Cycloheximid werden in 20 ml Aceton gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 420 mg (3.04 mmol) K2CO3 , 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 und 1.75 ml (13.5 mmol) (+/-)-2-Brompropionsäureethylester gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 20 ml CHCI3/Essigester (2:1) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet und elu- iert wird mit CHCI3/ EE (2:1 ). Die dritte Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 110 mg (16.2 %), farbloses zähflüssiges Öl. Analyse: (C20H31NO6, M = 381.47 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 382.9 m/e; Ber.: C 62.97, H 8.19, N 3.67, Gef.: C 62.84, H 8.03, N 3.72%. Substanz 13: Cycloheximid-N, 0-bis-(+/-)-2-propionsäureethylester
Die Aufarbeitung der 2. Fraktion ergibt Cycloheximid-N, O-bis-4-butansäure- ethylester.
Ausbeute: 73 mg (9.1 %), farbloses, zähflüssiges Öl.
Analyse: (C25H39NO8, M = 481.59 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 483.0 m/e;
Ber.: C 62.35, H 8.16, N 2.91 , Gef.: C 62.22, H 8.14, N 2.81%.
Substanz 14: Cycloheximid-N-3-propionsäure(4-aminocyclohexyl)amid*CF3COOH 100 mg Chlorotrityl-Harz (0.93 mmol/g, Fa. NovaBiochem), 250 mg (2.19 mmol) 1 ,4-trans-Diaminocyclohexan, 2 ml CH2CI2 und 1 ml Diisopropylethylamin (DIEA) werden 12 h bei RT umgesetzt. Anschließend wird dreimal mit je 2 ml CH2CI2, MeOH, Ether gewaschen. Das Harz wird in 2 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) aufgenommen. Dazu werden 80 mg (0.52 mmol) 3-Brompropionsäure, 120 mg (0.78 mmol) Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 85 μl (0.55 mmol) Diisopropylcarbodiimid (DIC) gegeben. Nach 12 h schütteln bei RT wird filtriert und wie oben gewaschen. Das Harz wird in 4 ml Aceton und 1 ml CH2CI2 aufgenommen und 48 h bei 35°C mit 100 mg (0.36 mmol) Cycloheximid, 200 mg (1.45 mmol) K2CO3 und 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 umgesetzt. Anschließend wird zweimal mit je 3 ml Aceton und dann weiter wie oben gewaschen. Die Substanz wird auf gewohnte Weise mit 5%iger Trifluoressigsäure in CH2CI2 vom Harz abgespalten und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 23 mg (43.9 %); weißes Pulver. Analyse: (C26H40F3N3O7, M = 563.62 g/mol);
MALDI-TOF-MS: [M-CF3COO ]+= 450.8 m/e.
Substanz 15: Cycloheximid-N-3-valeriansäure(4-aminocyclohexyl)amid*CF3COOH 100 mg Chlorotrityl-Harz (0.93 mmol/g, Fa. NovaBiochem), 250 mg (2.19 mmol) 1 ,4-trans-Diaminocyclohexan, 2 ml CH2CI2 und 1 ml DIEA werden 12 h bei RT umgesetzt. Anschließend wird dreimal mit je 2 ml CH2Cl2, MeOH, Ether gewaschen. Das Harz wird in 2 ml NMP aufgenommen. Dazu werden 95 mg (0.52 mmol) 5- Bromvaleriansäure, 120 mg (0.78 mmol) HOBt und 85 μl (0.55 mmol) DIC gegeben. Nach 12 h schütteln bei RT wird filtriert und wie oben gewaschen. Das Harz wird in 4 ml Aceton und 1 ml CH2CI2 aufgenommen und 48 h bei 35°C mit 100 mg (0.36 mmol) Cycloheximid, 200 mg (1.45 mmol) K2CO3 und 20 mg (0.08 mmol) 18- Crown-6 umgesetzt. Anschließend wird zweimal mit je 3 ml Aceton und dann weiter wie oben gewaschen. Die Substanz wird auf gewohnte Weise mit 5%iger Trif- luoressigsäure in CH2CI2 vom Harz abgespalten und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 21 mg (38.2 %); weißes Pulver. Analyse: (C^H^F^O^ M = 591.67 g/mol);
MALDI-TOF-MS: [M-CF3COOT= 479.3 m/e.
Substanz 16: Cycloheximid-N-ethansäureethylester-adamantylurethan 140 mg (0.38 mmol) Cycloheximid-N-ethansäureethylester werden in 3 ml CH2CI2 gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 67 mg (0.38 mmol) Adamantylisocya- nat, 10 mg (0.18 mmol) NH4CI und ITropfen CF3COOH gegeben. Anschließend wird bei 30°C gerührt. Nach 4 h wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 20 ml CHCI3/Essigester (2:1 ) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als stationäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 / EE (2:1 ). Die Fraktion wird im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 78 mg (37.7 %), weißes Pulver .
Analyse: (C30H44N2O7, M = 544.69 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 546.4 m/e; Ber.: C 66.15, H 8.14, N 5.14, Gef.: C 65.99, H 7.95, N 4.89%.
Substanz 17: Cycloheximid-N-ethansäureethylester-2-bromethylurethan 140 mg (0.38 mmol) Cycloheximid-N-ethansäureethylester werden in 3 ml CH2CI2 gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 57 mg (0.38 mmol) 2- Bromethylisocyanat, 10 mg (0.18 mmol) NH4CI und 1 Tropfen CF3COOH gegeben. Anschließend wird bei 30°C gerührt. Nach 4 h wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingeengt. Das ölige Produkt wird in 20 ml CHCI3/Essigester (2:1) aufgenommen. Die Lösung wird säulenchromatographisch aufgearbeitet. Als sta- tionäre Phase wird SiO2 (230-400 mesh) verwendet. Als Laufmittel dient CHCI3 /
EE (2:1 ). Die Fraktion wird im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 67 mg (34 %)
Analyse: (C22H33BrN2O7, M = 517.49 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 518.8 m/e;
Ber.: C 51.06, H 6.43, N 5.41 , Gef.: C 51.23, H 6.71 , N 5.27%.
Substanz 18: Cycloheximid-N-ω-undecansäure-ala-ala(OH) 100 mg Chlorotrityl-Harz (0.93 mmol/g, Fa. NovaBiochem), 87 mg (0.28 mmol) Fmoc-Ala(OH), 2 ml CH2CI2 und 1 ml DIEA werden in 6 h bei RT umgesetzt. Anschließend werden 0.5 ml MeOH zugesetzt und nach 30 min wird dreimal mit je 1 ml CH2CI2. Danach wird 1 h mit 40%iger Piperidin-Lösung in DMF behandelt und dreimal mit je 1 ml NMP, i-PrOH, Ether gewaschen. Das Harz wird in 2 ml NMP aufgenommen. Dazu werden 87 mg (0.28 mmol) Fmoc-Ala(OH), 64 mg (0.42 mmol) HOBt und 46 μl (0.30 mmol) DIC gegeben. Nach 12 h schütteln bei RT wird filtriert. Mit 40%iger Piperidin-Lösung in DMF wird 1 h behandelt und dreimal mit je 1 ml NMP, i-PrOH, Ether gewaschen. Das Harz wird in 3 ml Aceton und 1 ml CH2CI2 aufgenommen und 72 h bei 35°C mit 100 mg (0.36 mmol) Cycloheximid, 200 mg (1.45 mmol) K2CO3 und 20 mg (0.08 mmol) 18-Crown-6 umgesetzt. Anschließend wird zweimal mit je 3 ml Aceton. Das Harz wird in CH2CI2 aufgenommen, abdekantiert, filtriert und dann weiter wie oben gewaschen. Die Substanz wird auf gewohnte Weise mit 5%iger Trifluoressigsäure in CH2CI2 vom Harz abgespalten und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 19 mg; weißes Pulver. Analyse: (M = 607.88 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 609.3 m/e.
Substanz 19: Cycloheximid-N-ω-undecansäure-val-ala(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Val(OH) und Fmoc-Ala(OH).
Ausbeute: 15 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 635.99 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 637.8 m/e. Substanz 20: Cycloheximid-N-co-undecansäure — trp-ala(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Trp(OH) und Fmoc- Ala(OH).
Ausbeute: 17 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 723.02 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 725.0 m/e.
Substanz 21: Cycloheximid-N-ω-undecansäure — ile-ala(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc- lle(OH) und Fmoc-Ala(OH).
Ausbeute: 11 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 649.77 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 652.3 m/e.
Substanz 22: Cycloheximid-N-co-undecansäure- met-ala(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Met(OH) und Fmoc-Ala(OH).
Ausbeute: 9 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 667.91 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 670.5 m/e.
Substanz 23: Cycloheximid-N-ω-undecansäure — gly-ala(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Gly(OH) und Fmoc-Ala(OH).
Ausbeute: 11 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 593.76 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 595.0 m/e.
Substanz 24: Cycloheximid-N-co-undecansäure-ala-val(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Ala(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 7 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 635.99 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 638.2.0 m/e. Substanz 25: Cycloheximid-N-αy-undecansäure-val-val(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Val(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 14 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 664.09 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 666.3 m/e.
Substanz 26: Cycloheximid-N-co-undecansäure-trp-val-(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Trp(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 17 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 751.12 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 753.6 m/e.
Substanz 27: Cycloheximid-N-ω-undecansäure-ile- val(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc- lle(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 12 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 678.07 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 680.1 m/e.
Substanz 28: Cycloheximid-N-cυ-undecansäure-met-val(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Met(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 12 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 696.10 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 698.4 m/e.
Substanz 29: Cycloheximid-N-ω-undecansäure-gly-val(OH)
Die Synthese erfolgte analog der Vorschrift für Substanz 18 ausgehend von Fmoc-
Gly(OH) und Fmoc-Val(OH).
Ausbeute: 7 mg; weißes Pulver.
Analyse: (M = 621.96 g/mol); MALDI-TOF-MS: [M+H]+= 623.9 m/e. BEISPIEL 2: Bestimmung der Inhibitionskonstanten der Derivate von Cyclo- hex-imid
Die Bestimmung von Inhibitionskonstanten von Cycloheximid und einigen Derivaten gegenüber der PPIase FKBP12 erfolgt mittels Protease-gekoppeltem PPIase- Assay
Puffer: 35 mM HEPES (pH 7.8), 1200 μl
Substrat: Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-(4-) Nitroanilid (BACHEM)
Stammlösung 10 mg/ml in DMSO, Konzentration im Meßansatz 69.8 μM Hiifsprotease: α-Chymotrypsin (Rind), 400 U/mg protein, (MERCK),
Stammlösung 50 mg/ml, Konzentration im Meßansatz 1.7 mg/ml Enzym: humanes FKBP12 (recombinant aus E. coli) Stammlösung 25 μM,
Konzentration im Meßansatz 16 nM Effektoren: Effektor-Stammlösung 10 mg/ml in Ethanol, Konzentration im Meßansatz zwischen 1000 und 0.01 μM Temperatur: 10°C.
Die Effektoren wurden im Inkubationsansatz 5 min vorinkubiert, die Reaktion wurde unmittelbar darauf durch Zugabe von 10 μl der Hiifsprotease gestartet. Meßinstrument: Hewlett Packard UV/VIS Spektrophotometer HP 8452A, Wellenlänge 390 nm
Die kinetische Analyse erfolgte mittels „SigmaPlot" (Scientific Graphing System Vers. 2.0,Jandel Corp.)
Abbildung 1 zeigt exemplarisch die Inhibierungskinetik für 5 entsprechend Beispiel 2. Typische Inhibitionskonstanten sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. BEISPIEL 3: Zytotoxizitätsmessung der Cycloheximid-Derivate
Erfindungsgemäße Verbindungen lassen sich anhand ihrer toxischen Effekte auf eukaryotische Zeilen klassifizieren. Zur Klassifizierung im eukaryotischen Zellas- say sind solche Zellen besonders gut geeignet, die durch die Zugabe von Cycloheximid absterben. Die Charakterisierung der zytotoxischen Eigenschaften der entdeckungsgemäßen Verbindungen erfolgte mit den CHX-sensitiven Standard- zellinien HeLa, Mausfibroblasten L-929 und Humanleukämiezellen K-562. Zur Quantifizierung des Einflusses von CHX oder seiner Derivate auf den Zellassay wird diejenige Wirkstoffkonzentration bestimmt, die zu einem Absterben von 50% der Zellen führt (IC50). Die Klassifizierung der Verbindungen entsprechend ihrer Zytotoxizität wurde nach folgenden Kriterien vorgenommen: sehr hoch: ιc50 < 5 μg/ml hoch: IC50 = 50 - 5 μg/ml mäßig: IC50 = 50 - - 100 μg/ml mäßig/gering: IC50 = 100 - - 200 μg/ml gering/nicht: ιc50 > 200μg/ml
Tabelle 1:
Figure imgf000036_0001
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Tabelle 2:
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Zytotoxizitäten ausgewählter Verbindungen sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt.
BEISPIEL 4: Nervenzellregenerative Wirkung von Cycloheximid-Derivaten:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich auch anhand ihrer Wirkung auf die Regeneration des Nervus ischiadicus von Ratten charakterisieren. Dazu wurden vier Monate alte weibliche Albino-Ratten (Han:WIST) in einen Ätherrausch versetzt und entsprechend ihrem Körpergewicht mit Rompun (16 mg/kg) und Ke- tavet (125 mg/kg) in Kombination intramuskulär narkotisiert. Der Nervus ischiadicus wurde nach einem Hautschnitt präpariert, vor der Auftrennung in seine distalen Äste durchtrennt und anschließend mikrochirurgisch durch drei epineurale Nervennähte in seiner Kontinuität wiederhergestellt. Die Naht wurde mit BASIC (bac- terial synthesized cellulose) ummantelt. Das Material übt gleichzeitig eine Depotfunktion für die unmittelbar nach der Operation einmalig auf die Läsionsstelle applizierten Testsubstanzen aus. Beispielhaft für die entdeckungsgemäßen Verbindungen wurde Cycloheximid-N-ethansäureethylester 5 in 10% DMSO/H2O gelöst und in Dosen von 30 (n=4/7) und 60 (n=3) mg/kg Ratte in 50 μl Lösungsmittel am Tiermodell getestet. Als Negativkontrolle (n=3/6) wurden entsprechende Dosen des Dipeptids Ala-Ala-OH verwendet. Als Positivkontrolle diente der FKBP- Inhibitor FK506 (1mg/kg; n=3), dessen neuroregenerative Wirkung bereits beschrieben wurde. Der Hautverschluß erfolgte mittels fortlaufender Naht. In einem Zeitraum von 10 Wochen wurden die Tiere einer wöchentlichen Begutachtung des Gangverhaltens unterzogen. Die Bewertung wurde nach folgenden Kriterien vorgenommen:
- Koordination der Beinbewegung
- Belastung/Schonung des operierten Beines
- Belastungsschwerpunkt (Fußzehen-/-fersenbelastung) - Zehenstellung
- Beweglichkeit des Fußes und der Zehen (z.B. Versteifung)
Dabei erfolgte jeweils eine Einschätzung des Zustandes des operierten Beines durch Punktvergabe: -1 (negativ), 0 (unauffällig) und +1 (positiv). Die Punkte wurden nach Versuchsablauf verrechnet.
Nach 10 Wochen wurde das nach Versuchsprotokoll vorgesehene Tier erneut narkotisiert und der M. ext. digit. longus sowie der N. peroneus profundus und der N. ischiaticus im Bereich der Ummantelung zur Präparategewinnung entfernt. Zusätzlich wurden für einen direkten Vergleich die entsprechenden Präparate der Gegenseite gewonnen. Die entnommenen Muskeln wurden gewogen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in 30 μm dicke Serienschnitte (FRIGOCUT) geschnitten. Die histologische Auswertung der Schnitte erfolgte lichtmikroskopisch nach Ace- tylthiocholinjodid-Färbung. Die entnommenen Nervenstücke wurden histologisch aufgearbeitet und die erhaltenen Querschnittpräparate lichtmikroskopisch ausgewertet (Myelinisierung, neuromuskuläre Endplatten).
Tabelle 3
Figure imgf000041_0001
Die Ergebnisse der Begutachtung des Gangverhaltens der Versuchstiere und des Vergleichs des Gewichtes der M. ext. digit. longi sind in Tabelle 3 exemplarisch für die Substanz 5 bei einer applizierten Dosis von 30 mg/kg dargestellt.
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Claims

Patentansprüche
Cycloheximid-Derivat der allgemeinen Formel (1 ):
10
Figure imgf000045_0001
— R
in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet, jedes R12 unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N-NR2R3 ausgewählt wird, wobei
R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, CH3, einen Aral- kylrest, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit R6 oder R10 substituierten Aryl- oder Cycloalkylrest, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mir R6 oder R10 substituierten Heterocycloalkyl- oder Heteroarylrest, bei denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Ring durch O, S oder NR5 ersetzt sind oder einen Rest -A-X-B darstellen, oder R2 und R3 zusammen einen Alkylrest darstellen, der mit dem Stickstoffa- tom, an das sie gebunden sind, einen 3- bis 5-gliedrigen Ring bilden, der gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten R6 aufweist, wobei gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffe des Alkylenrestes durch -O-, - S-, -NR5-, Cycloalkylen, Heterocycloalkyien, Arylen oder Heteroarylen ersetzt sind, wobei
R5 ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder einen Arylrest darstellt, R6 für Alkyl, Aryl, OR5, C(O)OR5, CN oder ein Halogenatom steht und R5 wie vorstehend definiert ist, A einen Alkylenrest und B einen Alkylrest darstellt,
X für -O-, -S-, -NR5-, Cycloalkylen, Heterocycloalkyien, Arylen, Heteroarylen oder eine Einfachbindung steht und R5 wie vorstehend definiert ist, R7 einen Rest -OH, -OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9, -OC(S)NHR9 oder O(CHR12)nR10 darstellt, wobei
R9 einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit R6 substituiertes Aryl- oder Heteroarylrest, bei dem ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Ring durch O, S oder NR5 ersetzt sind, oder einen Rest -A-X-B darstellt, wobei A, B, X, R5 und R6 wie vorstehend definiert sind, und R10 einen Rest -NHR2, -NR2R3, -C(O)OR2, -C(S)OR2, -C(O)NR2R3, -CN, - NR2C(O)NR2R3, -OC(O)NR2R3, -NR2C(S)NR2R3, -OC(S)N R2R3 oder - C(O)NHR11 darstellt, wobei R2 und R3 wie vorstehend definiert sind und R11 für einen Aminosäurerest oder Oligopeptidrest steht, oder ein pharmazeutischverträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1 , nämlich eine Verbindung der Formel (1 ) für die gilt
(a) n = 1 , 2, 3; R1= O; R7= OH, O(CHR 2)nR10, OC(O)CH3; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5; oder
(b) n = 3-10; R = O; R7= OH; R10= C(O)NHR11, R11= Aminosäurerest, Oligopeptidrest; R12= H, CH3, C2H5; oder
(c) n = 1 , 2, 3; R1= O; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R1 = H, CH3, C2H5; oder
(d) n = 1 , 2, 3; R1= NOH, N-NHPh, N-NHCH3, N-Alkyl, N-Benzyl; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5; oder (e) n = 1 ,
2, 3; R = O; R7= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)NH-Alkyl, OC(O)NH- Cycloalkyl, OC(O)NH-Aryl; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2; R12= H, CH3, C2H5.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 mit der Formel:
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0003
Verbindung 18-29
Figure imgf000049_0002
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit einem Molekulargewicht kleiner als etwa 2000 g/Mol, vorzugsweise kleiner als 1000 g/Mol.
5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei das Molekulargewicht kleiner als etwa 750 g/Mol ist.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität des FK506 bindenden Proteins inhibieren kann.
7. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regeneration von Nerven.
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von beschädigtem Nervenzellgewebe.
10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfassend die Umsetzung von Cycloheximid oder eines Derivates an einem polymeren Träger.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der polymere Träger Chlorotrityl-Harz ist.
12. Verwendung einer Verbindung mit einer Affinität zu FK506 bindendem Protein, einem Molekulargewicht kleiner 2000 g/Mol, welche die Peptidylprolyl cis/trans Isomerase Aktivität des FK506 bindenden Proteins inhibie- ren kann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von beschädigtem Nervenzellgewebe.
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