DE60016622T2

DE60016622T2 - Hydroxamsäurederivat als inhibitor der produktion von löslichem menschlichem cd23

Info

Publication number: DE60016622T2
Application number: DE60016622T
Authority: DE
Inventors: Andrew Harlow FALLER; John Gerard Harlow WARD
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: DK1224164T3; KR20020044578A; BR0015082A; JP3922431B2; HUP0203270A2; GB9925470D0; GC0000142A; CO5261576A1; CA2389319A1; TW561141B; NO20021965D0; NZ518566A; PE20010898A1; CZ20021424A3; ES2233474T3; PT1224164E; DE60016622D1; PL356524A1; JP2003512450A; CN1182107C

Description

Diese Erfindung betrifft einen neuen Inhibitor der Produktion von löslichem menschlichen CD23 und seine Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, welche mit einer Überproduktion von löslichem CD23 (s-CD23) in Zusammenhang stehen wie Autoimmunerkrankung, Entzündung und Allergie. CD23 (der Niedrigaffinitäts-IgE-Rezeptor FceRII, Blast 2) ist ein 45 kDa Typ II-Integralprotein, welches auf der Oberfläche einer Vielzahl von adulten Zellen, einschließlich B- und T-Lymphozyten, Makrophagen, natürlichen Killerzellen, Langerhans-Zellen, Monozyten und Plättchen (Delespesse et al, Adv Immunol, 49 [1991] 149–191), exprimiert wird. Es gibt auch ein zu CD23 ähnliches Molekül auf Eosinophilen (Grangette et al, J Immunol, 143 [1989] 3580–3588). CD23 wurde mit der Regulation der Immunantwort in Verbindung gebracht (Delespesse et al, Immunol Rev, 125 [1992] 77–97). Menschliches CD23 kommt in zwei unterschiedlich regulierten Isoformen a und b vor, welche sich nur in den Aminosäuren am intrazellulären N-Terminus unterscheiden (Yokota et al, Cell, 55 [1988] 611–618). Im Menschen wird die konstitutive Isoform a nur auf B-Lymphozyten gefunden, wogegen Typ b, welcher durch IL4 induzierbar ist, auf allen Zellen, die zur Exprimierung von CD23 in der Lage sind, gefunden wird.
Es ist bekannt, dass intaktes, zellgebundenes CD23 (i-CD23) einer Abspaltung von der Zelloberfläche unterliegt, was zur Bildung einer Anzahl von gut definierten löslichen Fragmenten (s-CD23) führt, welche als ein Ergebnis einer komplexen Sequenz von proteolytischen Ereignissen hergestellt werden, wobei der Mechanismus davon noch schlecht verstanden wird (Bourget et al, J Biol Chem, 269 [1994] 6927–6930). Obwohl es noch nicht bewiesen ist, wird postuliert, dass die löslichen Hauptfragmente (Mr 37, 33, 29 und 25 kDa) dieser proteolytischen Ereignisse, wobei alle die bei i-CD23 gewöhnlich vorliegende C-terminale Lectindomäne behalten, aufeinanderfolgend über eine anfängliche Produktion des 37 kDa Fragments auftreten (Letellier et al, J Exp Med, 172 [1990] 693–700). Ein alternativer intrazellulärer Spaltungsweg führt zu einem stabilen 16 kDa Fragment, welches sich von der C-terminalen Domäne von i-CD23 unterscheidet (Grenier-Brosette et al, Eur J Immunol, 22 [1992] 1573-1577).
Mehrere Aktivitäten wurden dem membrangebundenen i-CD23 beim Menschen zugeschrieben, wobei sich zeigte, dass alle eine Rolle bei der IgE-Regulation spielen. Besondere Aktivitäten schließen ein: a) Antigenpräsentation, b) IgE vermittelte Eosinophilzytotoxizität, c) ,Homing' von B-Zellen zu Keimzentren von Lymphdrüsen und Milz, und d) Regulation der IgE-Synthese nach unten (Delespesse et al, Adv Immunol, 49 [1991] 149–191). Die drei löslichen CD23-Fragmente mit höherem Molekulargewicht (Mr 37, 33 und 29 kDa) weisen multifunktionelle Cytokineigenschaften auf, wobei es scheint, dass sie eine Hauptrolle bei der IgE-Produktion spielen. Folglich wird die übermäßige Produktion von s-CD23 mit der Überproduktion von IgE in Verbindung gebracht, dem Kennzeichen von allergischen Erkrankungen wie exogen-allergischem Asthma, Rhinitis, allergischer Bindehautentzündung, Ekzem, atopischer Dermatitis und anaphylaktischem Schock (Sutton und Gould, Nature, 366 [1993] 421–428). Andere biologische Wirkungen, welche s-CD23 zugeschrieben werden, schließen die Stimulierung des Wachstums von B-Zellen und die Induzierung der Freisetzung von Mediatorsubstanzen von Monozyten ein. So wurden erhöhte Spiegel von s-CD23 im Serum von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie B (Sarfati et al, Blood, 71 [1988] 94–98) und in der Gelenkschmiere von Patienten mit rheumatoider Arthritis (Chomarat et al, Arthritis and Rheumatism, 36 [1993] 234–242) beobachtet. Dass CD23 bei Entzündung eine Rolle spielt, wird in einer Anzahl von Quellen vorgeschlagen. Erstens wurde berichtet, dass s-CD23 zuerst an extrazelluläre Rezeptoren bindet, welche, wenn sie aktiviert sind, in zellvermittelte Ereignisse von Entzündung einbezogen sind. Es wird berichtet, dass so s-CD23 direkt die Freisetzung von TNF, IL-1 und IL-6 bei Monozyten aktiviert (Armant et al, Band 180, J. Exp. Med., 1005–1011 (1994)). Es wurde berichtet, dass CD23 mit den B2-Integrinadhäsionsmolekülen, CD11b und CD11c auf Monozyt/Makrophage wechselwirkt (S. Lecoanet-Henchoz et al, Immunity, Band 3; 119–125 (1995)), welche die Freisetzung von NO2^-, Wasserstoffperoxid und Cytokin (IL-1, IL-6 und TNF) auslösen. Schließlich induzieren IL-4 oder IFN die Expression von CD23 und seine Freisetzung als s-CD23 durch menschliche Monozyten. Eine Ligierung des membrangebundenen CD23-Rezeptors mit IgE/anti-IgE-Immunkomplexen oder anti-CD23 mAb aktiviert die Produktion von cAMP und IL-6 und die Produktion von Thromboxan B2, was eine rezeptorvermittelte Rolle von CD23 bei Entzündung zeigt.
Wegen dieser verschiedenen Eigenschaften von CD23 sollten Verbindungen, welche die Produktion von s-CD23 inhibieren, zweifache Wirkungen aufweisen, a) Erhöhen der negativen Rückkopplungsinhibierung der IgE-Synthese durch Aufrechterhalten von Levels von i-CD23 auf der Oberfläche von B-Zellen, und b) Inhibieren der Immunstimulatorcytokinaktivitäten von löslichen Fragmenten von s-CD23 mit höherem Molekulargewicht (Mr 37, 33 und 29 kDa). Zusätzlich sollte die Inhibierung der CD23-Abspaltung die durch s-CD23 induzierte Monozytenaktivierung und Mediatorsubstanzproduktion einschränken, wobei die Entzündungsreaktion verringert wird.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 96/02240 (SmithKline Beecham plc) offenbart, dass Verbindungen, welche die Wirkung von Matrixmetallproteasen (z.B. Kollagenase, Stromelysin und Gelatinase) inhibieren, wirksame Inhibitoren der Freisetzung von menschlichem löslichem CD23, welches in Säugerzellkultursysteme transfiziert wurde, sind.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited) offenbart, dass bestimmte Verbindungen der Formel (A) Matrixmetallproteaseaktivität aufweisen:
Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 99/67201 (SmithKline Beecham plc) offenbart, dass bestimmte Verbindungen der Formel (I) wirksame Inhibitoren der Freisetzung von menschlichem löslichem CD23, welches in Säugerzellkultursysteme transfiziert wurde, sind:
Nun wurde überraschenderweise gefunden, dass bestimmte Verbindungen der Formel (I) eine unerwartet gute Bioverfügbarkeit aufweisen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der vorstehenden Formel (I) bereit, wobei

n 0 ist;
R Isopropyl ist;
R¹ Naphthylmethyl ist;
R² t-Butyl ist; und
R³ Methyl ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Verbindung der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Allergie, entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, die mit der Überproduktion von s-CD23 einhergehen, bereit.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Allergie, entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, die mit der Überproduktion von s-CD23 einhergehen, bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung der Verbindung der Erfindung an einen Menschen oder einen von Mensch verschiedenen Säuger, welche dessen bedürfen, umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein Arzneimittel zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Allergie, entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, die mit der Überproduktion von s-CD23 einhergehen, bereit, welches die Verbindung der Erfindung und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür umfasst.
Besondere entzündliche Erkrankungen schließen CNS-Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, Multiple Sklerose, und Multiinfarktdemenz sowie die durch Entzündung vermittelten Folgeerscheinungen von Schlaganfall und Schädeltrauma ein.
Es wird als selbstverständlich angesehen, dass die pharmazeutisch verträglichen Salze, Solvate und anderen pharmazeutisch verträglichen Derivate der Verbindung der Erfindung auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Salze der Verbindungen der Formel (I) schließen zum Beispiel Säureadditionssalze ein, die sich von anorganischen oder organischen Säuren ableiten, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Hydroiodide, p-Toluolsulfonate, Phosphate, Sulfate, Acetate, Trifluoracetate, Propionate, Citrate, Maleate, Fumarate, Malonate, Succinate, Lactate, Oxalate, Tartrate und Benzoate.
Salze können auch mit Basen gebildet werden. Solche Salze schließen Salze ein, die sich von anorganischen oder organischen Basen ableiten, zum Beispiel Alkalimetallsalze wie Natrium- oder Kaliumsalze, und organische Aminsalze wie Morpholin-, Piperidin-, Dimethylamin- oder Diethylaminsalze.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäße Verbindung sowohl vorteilhafte Absorptionseigenschaften in-vivo über den oralen Verabreichungsweg zeigt als auch ein potenter und selektiver Inhibitor der CD23-Prozessierung ist.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann durch die Verwendung eines jedweden geeigneten herkömmlichen Verfahrens hergestellt werden, zum Beispiel in Analogie mit den Verfahren, die in der Patentveröffentlichung WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited) offenbart werden.
Demgemäß stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Erfindung, wie vorstehend definiert, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Entfernen einer Schutzgruppe aus einer Verbindung der Formel (II)
wobei X eine Schutzgruppe wie Benzyl oder Trimethylsilyl ist oder
(b) Umsetzen einer Verbindung der Formel (III):
wobei die Hydroxygruppe gegebenenfalls geschützt ist mit Hydroxylamin oder einem Salz davon.

Die Verbindungen der Formeln (II) und (III) sind neu und stellen eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar.
Die Verbindung der Formel (II) kann aus der Verbindung der Formel (III) durch Umsetzung mit einem geschützten Hydroxylamin hergestellt werden. Die Verbindung der Formel (III) mit einer geschützten Hydroxygruppe kann durch Hydrolyse in die ungeschützte Verbindung der Formel (III) umgewandelt werden.
Geeignete Schutzgruppen für eine Hydroxamsäure sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyl und t-Butyldimethylsilyl ein.
Geeignete Schutzgruppen für eine Carbonsäure sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen t-Butyl, Benzyl und Methyl ein.
Die Verbindung der Formel (III) kann hergestellt werden durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (IV) oder (IVa):
wobei Y eine Schutzgruppe für Carboxyl ist mit einer Verbindung der Formel (V):
Wenn (IVa) verwendet wird, kann dann eine darauffolgende Alkylierung der Hydroxylgruppe erforderlich sein.
Die Verbindung der Formel (IV) kann hergestellt werden durch Schützen einer entsprechenden Verbindung, in welcher Y ein Wasserstoff ist, welche ihrerseits hergestellt werden kann durch:

(a) Umsetzen einer Verbindung der Formel (VI):
wobei R¹ wie hier vorstehend definiert ist und Z eine Schutzgruppe für Carboxyl ist mit einem Alkylierungsmittel; und
(b) Entfernen der Schutzgruppen.

Die Verbindung der Formel (VI), wobei Z ein Wasserstoff ist, kann durch Umsetzen eines Diesters (wie der Dimethyl- oder Diethylester) von 2-Hydroxybernsteinsäure mit einer Verbindung der Formel R¹X' in der Gegenwart einer starken Base wie Lithiumdiisopropylamid, wobei R¹ Naphthylmethyl ist, X' eine Abgangsgruppe wie Brom oder Iod ist, und dann Hydrolysieren der resultierenden Verbindung, um die Esterreste zu entfernen, hergestellt werden.
Die Isomere, einschließlich Stereoisomere, der Verbindung der vorliegenden Erfindung können als Gemische von solchen Isomeren oder als einzelne Isomere hergestellt werden. Die einzelnen Isomere können über jedwedes geeignete Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel können einzelne Stereoisomere über stereospezifische chemische Synthese ausgehend von chiralen Substraten oder über Trennen von Gemischen von Diastereomeren unter Verwendung von bekannten Verfahren hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erf indung Verbindungen der Formel (IA) bereit:
Es ist bevorzugt, dass die Verbindungen in im Wesentlichen reiner Form isoliert werden.
Wie hier berichtet wird, weist ein Inhibitor der Produktion von löslichem menschlichem CD23 nützliche medizinische Eigenschaften auf. Bevorzugt werden die aktiven Verbindungen als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen verabreicht.
Die Zusammensetzungen werden bevorzugt für die orale Verabreichung angepasst. Jedoch können sie für andere Arten von Verabreichung angepasst werden, zum Beispiel in der Form eines Sprays, Aerosols oder eines anderen herkömmlichen Verfahrens für Inhalation zur Behandlung von Erkrankungen der Atemwege; oder für parenterale Verabreichung für Patienten, welche an Herzinsuffizienz leiden. Andere alternative Arten von Verabreichung schließlich sublinguale oder transdermale Verabreichung ein.
Die Zusammensetzungen können in der Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granula, Pastillen, Zäpfchen, rekonstituierbaren Pulvern, oder flüssigen Zubereitungen wie oralen oder sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen sein.
Um eine Stetigkeit der Verabreichung zu erhalten, ist es bevorzugt, dass eine Zusammensetzung der Erfindung in der Form einer Einheitsdosis vorliegt.
Einheitsdosisdarreichungsformen für orale Verabreichung können Tabletten und Kapseln sein und können herkömmliche Exzipienten wie Bindemittel zum Beispiel Sirup, Gummiarabikum, Gelatine, Sorbit, Tragant, oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe zum Beispiel Laktose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Tablettierungsgleitmittel zum Beispiel Magnesiumstearat; Sprengmittel zum Beispiel Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Natriumstärkeglykolat oder mikrokristalline Cellulose; oder pharmazeutisch verträgliche Netzmittel wie Natriumlaurylsulfat enthalten.
Die festen oralen Zusammensetzungen können über herkömmliche Verfahren von Mischen, Füllen oder Tablettieren hergestellt werden. Wiederholte Mischungsvorgänge können zur Verteilung des Wirkstoffes überall in jenen Zusammensetzungen, welche große Mengen an Füllstoffen verwenden, verwendet werden. Solche Vorgänge sind natürlich üblich auf dem Fachgebiet. Die Tabletten können gemäß Verfahren, welche in der normalen pharmazeutischen Praxis gut bekannt sind, überzogen werden, insbesondere mit einem magensaftresistenten Überzug.
Orale flüssige Zubereitungen können in der Form von zum Beispiel Emulsionen, Sirupen, oder Elixieren sein oder können als ein trockenes Produkt für Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung dargereicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Zusatzstoffe wie Suspendiermittel zum Beispiel Sorbit, Sirup, Methylcellulose, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel, hydrierte Speisefette; Emulgiermittel zum Beispiel Lecithin, Sorbitanmonooleat, oder Gummiarabikum; nicht-wässrige Vehikel (welche Speiseöle einschließen können) zum Beispiel Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester wie Ester von Glycerin, Propylenglycol, oder Ethylalkohol; Konservierungsstoffe zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure; und, falls gewünscht, herkömmliche Geschmacksstoffe oder farbgebende Mittel enthalten.
Für parenterale Verabreichung werden Fluideinheitsdosierungsformen unter Verwendung der Verbindung und eines sterilen Vehikels hergestellt und können, abhängig von der verwendeten Konzentration, entweder in dem Vehikel suspendiert oder gelöst sein. Bei der Herstellung von Lösungen kann die Verbindung vor dem Abfüllen in eine) geeignetes) Fläschchen oder Ampulle und Versiegeln in Wasser für Injektion gelöst und steril filtriert werden. Vorteilhafterweise können Zusatzstoffe wie ein Lokalanästhetikum, ein Konservierungsstoff und puffernde Mittel in dem Vehikel gelöst werden. Um die Stabilität zu erhöhen, kann die Zusammensetzung nach dem Abfüllen in das Fläschchen gefroren werden und das Wasser kann unter Vakuum entfernt werden. Parenterale Suspensionen werden im Wesentlichen in der gleichen Weise hergestellt, außer, dass die Verbindung in dem Vehikel suspendiert anstatt gelöst wird und eine Sterilisation nicht über Filtration erreicht werden kann. Die Verbindung kann über Einwirkung von Ethylenoxid vor dem Suspendieren in dem sterilen Vehikel sterilisiert werden. Vorteilhafterweise ist ein oberflächenaktives Mittel oder ein Netzmittel in der Zusammensetzung eingeschlossen, um eine einheitliche Verteilung der Verbindung zu ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch geeigneterweise für eine Verabreichung in den Atemwegen als ein Schnupfmittel oder ein Aerosol oder eine Lösung für einen Zerstäuber, oder als ein mikrofeines Pulver zur Insufflation, alleine oder in Kombination mit einem inerten Träger wie Laktose, dargereicht werden. In einem solchen Fall weisen die Teilchen der aktiven Verbindung geeigneterweise Durchmesser von weniger als 50 Mikron, bevorzugt weniger als 10 Mikron zum Beispiel Durchmesser im Bereich von 1 bis 50 Mikron, 1 bis 10 Mikron oder 1 bis 5 Mikron auf. Wo es angebracht ist, können kleine Mengen von anderen Antiasthmatika und Bronchodilatatoren zum Beispiel sympathikomimetische Amine wie Isoprenalin, Isoetarin, Salbutamol, Phenylephrin und Ephedrin; Xanthinderivate wie Theophyllin und Aminophyllin und Corticosteroide wie Prednisolon und Adrenalstimulanzien wie ACTH eingeschlossen sein.
Die Zusammensetzungen können 0,1 Gew.-% bis 99 Gew.-%, bevorzugt 10 bis 60 Gew.-%, des aktiven Materials enthalten, abhängig vom Verfahren der Verabreichung. Ein bevorzugter Bereich für Inhalationsverabreichung ist 10 bis 99%, insbesondere 60 bis 99%, zum Beispiel 90, 95 oder 99%.
Formulierungen von mikrofeinen Pulvern können geeigneterweise in einem Aerosol als eine festgelegte Dosis oder mittels einer geeigneten Vorrichtung, die durch die Atmung aktiviert wird, verabreicht werden.
Geeignete Dosieraerosolformulierungen umfassen herkömmliche Treibmittel, Colösungsmittel wie Ethanol, oberflächenaktive Mittel wie Oleylalkohol, Gleitmittel wie Oleylalkohol, Trockenmittel wie Calciumsulfat und Dichte verändernde Mittel wie Natriumchlorid.
Geeignete Lösungen für einen Zerstäuber sind isotonische sterilisierte Lösungen, welche gegebenenfalls zum Beispiel auf einen pH-Wert zwischen 4 und 7 gepuffert sind und bis zu 20 mg/ml Verbindung, aber allgemeiner 0,1 bis 10 mg/ml, enthalten, zur Verwendung mit Standardzerstäubungsausrüstung.
Eine wirksame Menge wird von der relativen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, der Schwere der behandelten Erkrankung und dem Gewicht des Patienten abhängen. Geeigneterweise kann eine Einheitsdosisform einer Zusammensetzung der Erfindung 0,1 bis 1000 mg einer Verbindung der Erfindung (0,001 bis 10 mg über Inhalation) und gebräuchlicher 1 bis 500 mg zum Beispiel 1 bis 25 oder 5 bis 500 mg enthalten. Solche Zusammensetzungen können ein- bis sechsmal pro Tag, gebräuchlicher zwei- bis viermal pro Tag, in einer Weise verabreicht werden, dass die tägliche Dosis für einen erwachsenen Menschen mit 70 kg 1 mg bis 1 g und spezieller 5 bis 500 mg beträgt. Dies liegt im Bereich von etwa 1,4 × 10^–2 mg/kg/Tag bis 14 mg/kg/Tag und spezieller im Bereich von etwa 7 × 10^–2 mg/kg/Tag bis 7 mg/kg/Tag.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung, schränkt sie aber in keiner Weise ein.
BIOLOGISCHE TESTVERFAHREN
Verfahren 1: Das Vermögen von Testverbindungen zur Inhibierung der Freisetzung von löslichem CD23 wurde über die Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht.
Test auf Abspaltungsaktivität von CD23 von RPMI 8866 Zellmembranen
Plasmamembrane von RPMI 8866 Zellen, eine menschliche Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zelllinie (Sarfati et al., Immunology 60 [1987] 539–547), welche hohe Levels von CD23 exprimiert, werden unter Verwendung eines wässrigen Extraktionsverfahrens gereinigt. In Homogenisierungspuffer (20 mM HEPES pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT) wieder suspendierte Zellen werden über N₂-Kavitation in einer Parr-Druckapparatur aufgeschlossen und die Plasmamembranfraktion gemischt mit anderen Membranen wird über Zentrifugation bei 10.000xg gewonnen. Das leichte Pellet wird in 0,2 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7,2 unter Verwendung von 2 ml pro 1 bis 3 g feuchte Zellen wieder suspendiert und das Kernpellet wird verworfen. Die Membrane werden weiter fraktioniert durch Aufteilen zwischen Dextran 500 (6,4% w/w) und Polyethylenglycol (PEG) 5000 (6,4% w/w) (Ref.) bei 0,25 M Saccarose in insgesamt 16 g pro 10 bis 15 mg Membranproteine [Morre und Morre, BioTechniques 7, 946–957 (1989)]. Die Phasen werden über eine kurze Zentrifugation bei 1.000xg getrennt und die (obere) PEG-Phase wird gesammelt, drei- bis fünffach mit 20 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,4 verdünnt und bei 100.000xg zentrifugiert, um in dieser Phase Membrane zu gewinnen. Das Pellet wird wieder in Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert und besteht aus drei- bis vierfach angereicherten Plasmamembranen sowie aus anderen Zellmembranen (z.B. Lysosomen, Golgiapparat). Die Membrane werden in Aliquote aufgeteilt und bei –80°C gelagert. Eine Fraktionierung mit 6,6% Dextran/PEG führt zu zehnfach angereicherten Plasmamembranen.
Die fraktionierten Membrane werden bei 37°C für Zeiten von bis zu 4 Std. inkubiert, um Fragmente von CD23 herzustellen, welche von der Membran über Filtration in Durapore-Filterplatten (Millipore) mit 0,2 Mikron nach Abstoppen des Tests mit 5 μM Zubereitung 1 von P 30994 abgetrennt werden. Das von der Membran freigesetzte s-CD23 wird unter Verwendung des EIA Kit von The Binding Site (Birmingham, UK) oder eines ähnlichen Kit unter Verwendung von MHM6 anti-CD23 mAk [Rowe et al., Int. J. Cancer, 29, 373–382 (1982)] oder eines anderen anti-CD23 mAk als den einfangenden Antikörper in einem Sandwich-EIA bestimmt. Die Menge des löslichen CD23, welche von 0,5 μg Membranprotein in einem Gesamtvolumen von 50 μl Phosphat gepufferter Salzlösung hergestellt wurde, wird über EIA gemessen und mit der Menge verglichen, welche in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an Inhibitoren hergestellt wurde. Inhibitoren werden in Lösungen von Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereitet und die Endkonzentration an DMSO ist nicht größer als 2%. IC₅₀-Werte werden über Anpassen von Kurven als die Konzentration bestimmt, wo 50% Inhibierung der Produktion von s-CD23 beobachtet wird, relativ zum Unterschied bei s-CD23 zwischen Kontrollen, welche ohne Inhibitor inkubiert wurden.
Ergebnisse
N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid ergab einen IC₅₀-Wert von 60 nM im vorstehenden Test.
Verfahren 2: Das Vermögen von Testverbindungen zur Inhibierung von Kollagenase wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht.
Test auf Kollagenaseinhibierung
Die Wirksamkeit von Verbindungen, als Inhibitoren von Kollagenase zu wirken, wurde über das Verfahren von Cawston und Barrett (Anal. Biochem. 99, 340–345, 1979), welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, bestimmt, wobei eine 1 mM Lösung des getesteten Inhibitors oder Verdünnungen davon bei 37°C für 18 Std. mit Kollagen und menschlicher rekombinanter Kollagenase, aus Synoviafibroblasten kloniert, exprimiert in und gereinigt aus E. Coli (gepuffert mit 150 mM Tris, pH-Wert 7,6, enthaltend 15 mM Calciumchlorid, 0,05% Brij 35, 200 mM Rinder-Natriumchlorid und 0,02% Natriumazid), inkubiert wurden. Das Kollagen war ein acetyliertes ³H-Typ 1-Kollagen, welches über das Verfahren von Cawston und Murphy hergestellt wurde (Verfahren in Enzymology 80, 711, 1981). Die Proben wurden zentrifugiert, um unverdautes Kollagen abzuscheiden, und ein Aliquot des radioaktiven Überstands wurde für einen Test an einem Szintillationszähler als ein Maß für die Hydrolyse entnommen. Die Kollagenaseaktivität in der Gegenwart von 1 mM Inhibitor oder einer Verdünnung davon wurde mit der Aktivität in einer Kontrolle ohne Inhibitor verglichen und die Ergebnisse wurden als die Konzentration angegeben, welche 50% der Kollagenase beeinflusst (IC₅₀-Wert).
Verfahren 3: Das Vermögen von Testverbindungen zur Inhibierung von TNF-Freisetzung wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht.
Test zur Inhibierung der Freisetzung von TNFα aus menschlichen Monozyten, stimuliert über Lipopolysaccharid (LPS)-Endotoxin
Menschliche Monozyten, welche in mit 10% fötalem Kälberserum ergänztem RPMI 1640 Medium kultiviert wurden, werden bei 1.000xg für 5 Min. zentrifugiert und dann im Medium mit 2 × 10⁶ Zellen/ml wieder suspendiert. Die Zellsuspension wird auf Platten mit 24 Vertiefungen in Aliquote von 1 ml pro Vertiefung aufgeteilt. Die zu testenden Verbindungen werden in purem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und mit einer Endkonzentration an DMSO von 0,1% zu der Kultur gegeben. Die Verbindungen werden zu den Zellen in den Wells in dreifacher Ausführung gegeben. Die TNFα-Freisetzung wird durch Zugabe von LPS zu den Zellen in einer Endkonzentration von 200 ng/ml stimuliert. Geeignete Kontrollkulturen werden auch in dreifacher Ausführung etabliert. Die Platten werden für 18 bis 20 Std. bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert, dann bei 1.000xg für 5 Min. zentrifugiert. Ein spezifischer ELISA für menschliches TNFα (SmithKline Beecham) wird zur Messung der TNF-Levels in den zellfreien Kulturüberständen verwendet.
Ergebnisse
N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid zeigte keine Wirkung auf die TNF-Freisetzung bei 10 μM.
Verfahren 4: Die Bioverfügbarkeit von Testverbindungen wurde unter Verwendung der folgenden Bioäquivalenzstudien untersucht.
Eine Studie zur Einschätzung der i.v. pharmakokinetischen Parameter und oralen Bioverfügbarkeit bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten
Diese Studie wurde unter Verwendung eines Cross-Over-Designs an vier unterschiedlichen Studientagen durchgeführt. Drei Ratten erhielten chirurgisch implantierte Oberschenkelvenenkatheter für eine Infusion von Testmolekülen mindestens drei Tage vor dem Beginn der Studie. Alle Dosen in dieser Studie wurden unter Verwendung einer kristallinen Testverbindung hergestellt.
Am Studientag eins erhielten die Tiere (gefüttert) die Testverbindung als eine intravenöse Infusion innerhalb von 30 Min. mit einer Zieldosierung von 4,0 μMol/kg (4,0 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 20 %igem wässrigem Encapsin^® (pH-Wert = 8,0) hergestellt und enthielt 1% DMSO. Encapsin^® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) ist Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, ein cyclisches Oligosaccharid, welches zur Erhöhung der Löslichkeit von Verbindungen verwendet wird, die ansonsten eine Formulierung unter Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln erfordern würden.
Am Studientag zwei erhielten die Tiere (gefastet) die Testverbindung als eine Lösung mit einer Zieldosierung von 8 μMol/kg über orale Verabreichung (16 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 5 %iger wässriger Succinatschweinegelatine (pH-Wert 7,5) hergestellt und enthielt 1% DMSO.
Blutproben wurden von einer lateralen Schwanzvene gesammelt. Ein Aliquot von 25 μl von jeder Vollblutprobe wurde zu 25 μl Wasser gegeben und man ließ für ungefähr 5 Min. auf Eis stehen, um eine vollständige Hämolyse zu ermöglichen; die Proben wurden dann bis zur Analyse gefroren gelagert. Die Blutkonzentrationen der Testverbindung wurden über LC/MS/MS (LLQ = 10,0 ng/ml) quantifiziert. Es wurden sowohl nicht-kompartimentierte als auch kompartimentierte pharmakokinetische Analysen auf diesen Daten unter Verwendung von WinNonlin durchgeführt, um die geeigneten i.v. pharmakokinetischen Parameter zu gewinnen. Verschiedene kompartimentierte Modelle und Gewichtungsbeispiele wurden verwendet; ein Zweikompartiment-Modell mit einer Ausscheidung 1. Ordnung aus dem zentralen Kompartiment und einer iterativen Gewichtung nach den kleinsten Quadraten mit einem Gewicht von 1/Y² stellte den besten Fit für die beobachteten Daten gemäß den Standardmodell-Auswahlkriterien (d.h. Akaike's Information-Kriterium, Schwartz-Kriterium, und die Summe der quadratischen Reste) bereit. Pharmakokinetische Parameter wurden unter Verwendung des Kompartimentmodells mit dem besten Fit berechnet; alle Berechnungen, welche die Verwendung von AUC-Werten (einschließlich Bioverfügbarkeit) erforderten, wurden unter Verwendung des AUC-Wertes durchgeführt, der aus der nicht-kompartimentierten Analyse gewonnen wurde.
Eine Studie zur Einschätzung der i.v. pharmakokinetischen Parameter und oralen Bioverfügbarkeit bei männlichen Beagle-Hunden
Diese Studie wurde unter Verwendung eines Cross-Over-Designs an zwei unterschiedlichen Studientagen, sieben Tage voneinander getrennt, durchgeführt. Drei männliche Beagle-Hunde wurden in dieser Studie verwendet. An jedem Studientag wurde vorübergehend ein Katheter in eine V. cephalica zum Sammeln von Blut gesetzt; nur am Studientag eins wurde auch vorübergehend ein Katheter in eine V. saphena für eine i.v. Infusion gesetzt.
Am Studientag eins erhielt jedes Tier die Testverbindung (2,0 μMol/kg Zieldosis) als eine intravenöse Infusion innerhalb von 1 Std. (4,0 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 20 %igem wässrigem Encapsin^® (pH-Wert = 8,0) hergestellt und enthielt 1% DMSO. Encapsin^® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) ist Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, ein cyclisches Oligosaccharid (7 Glukoseeinheiten), welches zur Erhöhung der Löslichkeit bei der Herstellung der Dosislösungen verwendet wird, die ansonsten eine Formulierung unter Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln erfordern würden.
Am Studientag zwei erhielt jedes Tier die Testverbindung (6,0 μMol/kg Zieldosis) über orale Verabreichung (8,0 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 5 %iger wässriger Succinatschweinegelatine (pH-Wert 7,5) hergestellt und enthielt 1% DMSO.
Die Plasmakonzentrationen der Testverbindung wurden über LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/ml) quantifiziert. Es wurden nicht-kompartimentierte Verfahren zur Analyse der Daten von Plasmakonzentration gegen Zeit verwendet.
Eine Studie zur Einschätzung der i.v. pharmakokinetischen Parameter und oralen Bioverfügbarkeit bei männlichen Cynomolgus-Affen
Diese Studie wurde unter Verwendung eines Cross-Over-Designs an zwei unterschiedlichen Studientagen, sieben Tage voneinander getrennt, durchgeführt. Drei männliche Cynomolgus-Affen wurden für diese Studie verwendet. An beiden Studientagen wurde ein Katheter in eine V. saphena zum Sammeln von Blutproben gesetzt. Am Studientag eins wurde auch vorübergehend ein Katheter in eine kontralaterale V. saphena für eine i.v. Infusion gesetzt.
Am Studientag eins erhielt jedes Tier (gefastet) die Testverbindung (2,0 μMol/kg Zieldosis) als eine intravenöse Infusion innerhalb von 1 Std. (4,0 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 20 %igem wässrigem Encapsin^® (pH-Wert = 8,0) hergestellt und enthielt 1% DMSO. Encapsin^® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) ist Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, ein cyclisches Oligosaccharid (7 Glukoseeinheiten), welches zur Erhöhung der Löslichkeit bei der Herstellung der Dosislösungen verwendet wird, die ansonsten eine Formulierung unter Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln erfordern würden.
Am Studientag zwei erhielt jedes Tier (gefastet) die Testverbindung (6,0 μMol/kg Zieldosis) über orale Verabreichung (8,0 ml/kg). Die Dosislösung wurde in 5 %iger wässriger Succinatschweinegelatine (pH-Wert 8,0) hergestellt und enthielt 1% DMSO.
Blutproben wurden aus dem Oberschenkelvenenkatheter erhalten; Plasma wurde über Zentrifugation isoliert. Die Plasmakonzentrationen der Testverbindung wurden über LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/ml) quantifiziert. Es wurden nicht-kompartimentierte Verfahren zur pharmakokinetischen Analyse der Daten von Plasmakonzentration gegen Zeit verwendet.
Ergebnisse
Die Ergebnisse für N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid werden mit jenen für N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-propoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethoxyamid (offenbart in WO 99/67201 (SmithKline Beecham) verglichen.
Herstellung a) 3S-t-Butozycarbonyl-2R-(2-naphthylmethyl)propiolacton
t-Butyl-(3R)-carboxy-4-(2-naphthyl)butyrate (10 g, 31,9 mMol) in THF (160 ml) wurde bei –70°C unter Argon gerührt und Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (63,7 ml 1 M Lösung in THF, 63,7 mMol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde zwischen –60°C und –70°C für 1 Std. gerührt und dann auf –80°C gekühlt und N-Iodsuccinimid (7,17 g, 31,9 mMol) in THF (20 ml) wurde über eine Kanüle zugegeben. Man ließ das Gemisch auf ~ –30°C über 1 Std. erwärmen und es wurde dann mit gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung abgestoppt. Ethylacetat wurde zugegeben und das 2-Phasen-Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Std. schnell gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (2×) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5 %iger Natriumthiosulfat-Lösung und Salzlösung gewaschen und dann getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft. Chromatographie an Kieselsäuregel (Elution mit 10% Ethylacetat in Hexan) und Verreiben des gewonnenen Produkts mit Hexan ergaben 5,70 g eines weißen Feststoffes (63%).
MS (AP + ve) M+Na = 335.
¹H NMR (CDCl₃): 1,31 (9H, s), 3,29 (1H, dd, J = 8,5, 14,6 Hz), 3,38 (1H, dd, J = 6,1, 14,6 Hz), 4,06 (1H, m), 4,45 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,48 (2H, m), 7,68 (1H, s), 7,82 (3H, m). Beispiel N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid a) N'-[4-(t-Butoxy)-3S-hydroxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinbenzylester
tert-Leucinbenzylester-TFA-Salz (6,49 g) wurde mit wasserfreiem Kaliumcarbonat (2,89 g) in THF (100 ml) für 20 Min. gerührt. HOAT (2,24 g) und 3S-t-Butoxycarbonyl-2R-(2-naphthylmethyl)propiolacton (4,66 g, 14,94 mMol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde für weitere 72 Std. gerührt (zusätzliches HOAT (1,02 g) wurde nach 48 Std. zugegeben). Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit THF gut gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden zu einem Schaum eingedampft, der in EtOAc gelöst und mit 0,5 M HCl, gesätt. wässr. NaHCO₃ (2×), Wasser und Salzlösung gewaschen; getrocknet (MgSO₄) und zu einem Gummi eingedampft wurde, welches in Hexan/Et₂O kristallisiert wurde, wobei das Produkt als ein weißer Feststoff, 6,35 g (80%), erhalten wurde.
¹H NMR (DMSO-d₆): 0,88 (9H, s), 1,40 (9H, s), 2,88 (1H, dd, J = 13,5, 6 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 13,5, 8,5 Hz), 3,19 (1H, m), 3,92 (1H, t, J ≈ 6,5 Hz), 4,18 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,77 (1H, d, J = 12,5 Hz), 4,84 (1H, d, J = 12,5 Hz), 5,53 (1H, d, J = 7,5), 7,24 (2H, m), 7,30–7,37 (4H, m), 7,45 (2H, m), 7,65 (1H, s), 7,77–7,87 (3H, m), 8,09 (1H, d, J ≈ 9 Hz). b) N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinbenzylester
Zu einer Lösung von N'-[4-(t-Butoxy)-3S-hydroxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinbenzylester (3,0 g, 5,62 mMol) in 1,2-Diethoxyethan (75 ml) wurde NaH (60 %ige Suspension in Paraffin; 0,27 g) gegeben, nach Rühren für 2 bis 3 Min. wurde eine Lösung von ⁱPrOTf in Pentan (~ 30% w/w; 6 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 25 Min. bei RT gerührt und weiteres NaH (0,054 g) und ⁱPrOTf-Lösung (3 ml) wurden zugegeben. Nach Rühren für weitere 25 Min. wurde ein zusätzlicher Eintrag von sowohl NaH (0,054 g) als auch ⁱPrOTf (3 ml) zugegeben. Nach Rühren für weitere 20 Min. wurde 0,5 M HCl zugegeben und das Gemisch wurde mit EtOAc (2×) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit gesätt. wässr. NaHCO₃, Wasser und Salzlösung gewaschen; getrocknet (MgSO₄) und zu einem Gummi eingedampft, welches über Chromatographie an Kieselsäure (Hexan/Et₂O) gereinigt wurde, wobei das Produkt als ein nahezu farbloses Gummi, 1,33 g (41%), erhalten wurde.
MS (ES + ve) M+H = 576, M+Na = 598.
¹H NMR (CDCl₃): 0,87 (9H, s), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,49 (9H, s), 2,87–3,00 (2H, m), 3,10–3,22 (1H, m), 3,69 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 4,00 (1H, d, J = 6,5 Hz), 4,36 (1H, d, J = 9Hz), 4,57 (1H, d, anscheinend J = 12,5 Hz), 4,63 (1H, d, anscheinend J = 12,5 Hz) (zwei Hälften von Abq), 6,50 (1H, d, J = 9 Hz), 7,15–7,19 (2H, m), 7,27–7,40 (4H, m), 7,40–7,45 (2H, m), 7,60 (1H, s), 7,72–7,80 (3H, m). c) N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucin
N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinbenzylester (1,33 g, 2,31 mMol) wurde bei Atmosphärendruck in MeOH (38 ml) mit Pd-BaSO₄-Katalysator (0,67 g) für 1 Std. hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und gut mit MeOH gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden eingedampft, wobei das Produkt als ein Schaum, 1,09 g (97%), erhalten wurde.
MS (ES + ve) M+H = 486, M+Na = 508.
¹H NMR (DMSO-d₆): 0,92 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,42 (9H, s), 2,75 (1H, dd, J = 14,4 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 14, 9,5 Hz), 3,21 (1H, m), 3,57 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,93 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,10 (1H, d, J = 9 Hz), 7,29 (1H, m), 7,44 (2H, m), 7,62 (1H, s), 7,74–7,84 (3H, m), 7,90 (1H, d, J ≈ 9 Hz), 12,3 5 (1H, v. br.). d) N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid
N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucin (1,09 g, 2,24 mMol) wurde in DMF (29 ml) gelöst und mit HOAT (0,61 g) und DEC (0,86 g) behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Min. gerührt und Methylamin-Hydrochlorid (0,61 g) und N-Methylmorpholin (0,74 ml) wurden dann zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere 2 Std. gerührt und dann im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und aufeinanderfolgend mit 0,5 M HCl, gesätt. wässr. NaHCO₃, Wasser und Salzlösung gewaschen; getrocknet (MgSO₄) und zu einem Gummi eingedampft, welches über Chromatographie an Kieselsäure (Hexan/EtOAc) gereinigt wurde. Das Produkt wurde als ein Gummi, 0,77 g (69%), erhalten.
MS (ES + ve) M+H = 499, M+Na = 521.
¹H NMR (DMSO-d₆): 0,84 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,45 (9H, s), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 2,74 (1H, dd, J = 13,5, 4,5 Hz), 2,93 (1H, dd, J = 13,5, 10 Hz), 3,17 (1H, m), 3,56 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 3,94 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,06 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,25 (1H, br. m), 7,28 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,44 (2H, m), 7,59 (1H, m), 7,67 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,74–7,86 (3H, m). e) N'-[4-Hydroxy-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid
N'-[4-(t-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid (0,77 g, 1,544 mMol) wurde in TFA (11 ml) und DCM (22 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 2,5 Std. gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft und mit Toluol wieder eingedampft. Verreiben des Rückstandes mit Ether/Hexan ergab das Produkt als einen gebrochen weißen Feststoff, 0,67 g (98%).
MS (ES + ve) M+H = 443, M+Na = 465.
¹H NMR (DMSO-d₆): 0,85 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 2,78 (1H, dd, J = 14,5 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 14, 10,5 Hz), 3,18 (1H, m), 3,58 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 4,00 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,05 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,20 (1H, q, J = 4,5 Hz), 7,29 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,42–7,46 (2H, m), 7,59 (1H, d, J = 9 Hz), 7,60 (1H, s), 7,74–7,84 (3H, m), 12,87 (1H, br. s). f) N'-[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid
N'-[4-Hydroxy-3S-isopropoxy-2R-(2-naphthylmethyl)succinyl]-S-tert-leucinmethylamid (0,67 g, 1,514 mMol) wurde in DMF (20 ml) gelöst und mit HOAT (0,41 g) und DEC (0,58 g) behandelt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 5 Min. gerührt und Hydroxylamin-Hydrochlorid (0,32 g) und N-Methylmorpholin (0,5 ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Std. gerührt und wurde dann im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen EtOAc und gesätt. wässr. NaHCO₃ (2×), Wasser (2×) und Salzlösung aufgeteilt; getrocknet (MgSO₄) und zu einem Feststoff eingedampft, der mit Ether verrieben wurde, wobei das Produkt als ein weißer Feststoff, 0,51 g (74%), erhalten wurde.
MS (ES + ve) M+H = 458, M+Na = 480.
¹H NMR (DMSO-d₆): 0,84 (9H, s), 1,00 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,04 (3H, d, J = 6,0 Hz), 2,02 (3H, d, J = 5 Hz), 2,65 (1H, dd, J = 14,4 Hz), 2,83 (1H, dd, J = 14, 11,5 Hz), 3,18 (1H, m), 3,52 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,90 (1H, d, J = 9 Hz), 4,01 (1H, d, J = 9 Hz), 6,93 (1H, q, J = 5 Hz), 7,25 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,44 (2H, m), 7,53 (1H, d, J = 9 Hz), 7,57 (1H, s), 7,75–7,85 (3H, m), 9,08 (1H, s), 10,89 (1H, br. s).

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei R Isopropyl ist; n 0 ist; R¹ Naphthylmethyl ist; R² t-Butyl ist; und R³ Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die eine Verbindung der Formel (IA) ist:
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Allergie, entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, die mit der Überproduktion von s-CD23 einhergehen.
Arzneimittel zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Allergie, entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, die mit der Überproduktion von s-CD23 einhergehen, welches eine Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Verfahren umfasst: (a) Entfernen einer Schutzgruppe aus einer Verbindung der Formel (II)
wobei X eine Schutzgruppe wie Benzyl oder Trimethylsilyl ist oder (b) Umsetzen einer Verbindung der Formel (III):
wobei die Hydroxygruppe gegebenenfalls geschützt ist mit Hydroxylamin oder einem Salz davon.
Verbindung der Formel (II) wie in Anspruch 5 definiert.
Verbindung der Formel (III) wie in Anspruch 5 definiert.