CZ20021424A3

CZ20021424A3 - Derivát hydroxamové kyseliny jako inhibitor tvorby rozpustné lidské CD23

Info

Publication number: CZ20021424A3
Application number: CZ20021424A
Authority: CZ
Inventors: Andrew Faller; John Gerard Ward
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2002-09-11
Also published as: US6673965B1; SI1224164T1; NO20021965L; HUP0203270A2; DE60016622D1; NO20021965D0; AR026244A1; WO2001030747A1; DK1224164T3; CO5261576A1; BR0015082A; IL149364A0; AU1389501A; JP2003512450A; US20040077727A1; UY26416A1; PE20010898A1; PT1224164E; CN1182107C; AU766072B2

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového inhibitoru tvorby rozpustné lidské CD23 a jeho použití při léčbě stavů spojených s nadprodukcí rozpustné CD23 (s-CD23), jako jsou nemoci autoimunitního systému, záněty a alergie.

Dosavadní stav techniky

CD23 (FceRII receptor IgE s nízkou afinitou) je celistvý protein typu II s molekulovou hmotností 45 000 daltonů (Da) exprivovaný na povrchu různorodých zralých buněk, včetně lymfocytů B a T, makrofágů, přírodních buněk-zabíječů, Langerhansových buněk, monocytů a krevních destiček (Delespesse a kol., Adv. Immunol. 4 9, 149 až 191 (1991)).

Existují také molekuly podobné CD23 v eosinofilech (Grangette a kol., J. Immunol. 143, 3580 až 3588 (1989)). CD23 je zapojen do řízení imunitní odezvy (Delespesse a kol., Immunol. Rev. 125, 77 až 97 (1992)) . Lidská CD23 existuje ve dvou odlišně uspořádaných isoformách a a b, které se liší pouze v aminokyselinách na vnitrobunečném N-konci (Yokota a kol., Cell 55, 611 až 618 (1988)). V člověku se konstituční isoforma vyskytuje pouze v B-lymfocytech, zatímco typ b, indukovatelný pomocí IL4, se vyskytuje na všech buňkách schopných exprese CD23.

O intaktní, na buňku vázané CD23 (Í-CD23) je prodělává odštěpení z povrchu buňky, což vede množství dobře definovaných rozpustných fragmentů které jsou vytvářeny jako výsledek komplexní známo, že k tvorbě (S-CD23), sekvence proteolytického jevu, jehož mechanisus je stále ještě

- í neúspěšně pochopen (Bourget a kol., J. Biol. Chem. 269, 6927 až 6930 (1994)). Ačkoliv to nebylo ještě prokázáno, předpokládá se, že větší rozpustné fragmenty (molekulová hmotnost (Mr) 37, 33, 29 a 25 kDa) z těchto proteolytických jevů, z nichž všechny si zachovávají na C-konci lektinovou doménu společnou s Í-CD23, vznikají postupně cestou počáteční tvorby 37-kDa fragmentu (Letellier a kol., J. Exp. Med. 172, 693 až 700 (1990)). Alternativně cesta vnitrobuněčného štěpení vede k stabilnímu 16-kDa fragmentu lišícímu se od Í-CD23 v doméně C-konce (Grenier-Brosette a kol., Eur. J. Immunol. 22, 1573 až 1577 (1992) ) .

Několik druhů působení v lidech Í-CD23 vázané k membráně lidí, přičemž ukázalo, že hrají úlohu při regulaci IgE zahrnuj i:

je připisováno u všech z nich se Specifická působení

a) presentaci antigenu,

b) eosinofilovou cytotoxicitu zprostředkovanou IgE,

c) navádění B buněk do zárodečných center lymfatických uzlin a sleziny a

d) zpomalení syntézy IgE (Delespesse a kol., Adv. Immunol. 4 9, 149 až 191 (1991)). Tři rozpustné fragmenty CD23 o vyšší molekulové hmotnosti (Mr 37, 33 a 29 kDa) vykazují multifunkční cytokinové vlastnosti, u kterých se zdá, že hrají hlavní roli při produkci IgE. Tudíž nadměrná tvorba S-CD23 má původ v nadprodukci IgE, znaku alergických nemocí, jako jsou vnějšími podněty vyvolané astma, rinitida, alergický zánět spojivek, ekzém, atopická dermatitida a anafylaxie (Sutton a Gold, Nátuře 366, 421 až

428 (1993)). Další biologické účinky přičítané S-CD23 zahrnují

'-.í^^^í^sjíž^seštóísteissÍéáéfe^^^iéie^^^^^ítešsš^i^^tóí*^ stimulaci růstu B buněk a indukování uvolnění mediátorů z monocytů. Tudíž byly pozorovány zvýšené hladiny S-CD23 v séru pacientů trpících chronickou lymfocytickou leukémií B (Sarfati a kol., Blood 71, 94 až 98 (1988)) a v synoviálních tekutinách pacientů s kloubním revmatismem (Chomarat a kol., Arthritis and Rheumatism 3 6, 234 až 242 (1993)) . Úloha CD23 při zánětu je naznačována množstvím pramenů. Za prvé se uvádí, že S-CD23 se váže k mimobuněčným receptorům, které když jsou aktivovány jsou zapojeny do buňkami přenášených zánětlivých jevů. Tudíž se uvádí, že S-CD23 přímo aktivuje uvolňování monocytů TNF, IL-1 a IL-6 (Armant a kol., J. Exp. Med. 180, 1005 až 1011 (1994)). Uvádí se, že CD23 na sebe vzájemně působí s adhezivními molekulami integrinu B2, CDllb a CDllc na monocytu/makrofágu (S. Lecoanet-Henchoz a kol., Immunity 3, 119 až 125 (1995)), které dávají podnět k uvolňování NO2', peroxidu vodíku a cytokinu (IL-1, IL-6 a TNF) . Nakonec IL-4 nebo IFN indukují expresi CD23 a její uvolňování, jako S-CD23 lidskými monocyty. Lígace k membráně vázaného receptoru CD23 pomocí imunitního komplexu IgE/anti-IgE nebo anti CD23 mAb aktivuje produkci cAMP a 11-6 a tvorbu tromboxanu B2, čímž demonstruje receptorem zprostředkovanou roli CD23 při zánětu.

Z důvodu těchto proměnlivých vlastností CD23, sloučeniny, které inhibují tvorbu S-CD23 vykazují dvojnásobná působení:

a) zesílení negativní zpětné vazby inhibice syntézy IgE udržováním hladin Í-CD23 na povrchu B buněk a

b) inhibici imunostimulačnich cytokinových účinků rozpustných fragmentů CD23 o vyšší molekulové hmotnosti (Mr 37, 33 a 29 kDa).

Navíc inhibice odštěpení CD23 může zmírnit aktivaci monocytů a tvorbu mediátorů indukovanou CD23, a tudíž snížit odezvu na zánět.

Mezinárodní patentová přihláška č. WO 96/02240 (Smithkline Beecham plc) uvádí ve známost, že sloučeniny, které inhibují působení matrixových metaloproteáz (např. kolagenázy, stromelysinu a želatinázy) jsou účinnými inhibitory uvolňování lidské rozpustné CD23 transfekované do systému kultury savčích buněk.

Mezinárodní patentová přihláška č,

WO

Biotech Pharmaceuticals Limited) uvádí ve sloučeniny obecného vzorce metaloproteázy:

(A) vykazují

97/02239 (British známost, že jisté účinky matrixové

Mezinárodní patentová přihláška č. WO 99/67201 (Smithkline Beecham plc) uvádí ve známost, že jisté sloučeniny obecného vzorce (I) jsou účinnými inhibitory uvolňování lidské rozpustné CD23 transfekované do systémů kultur savčích buněk:

zjištěno, že jisté neočekávaně dobrou

Nyní bylo překvapivě obecného vzorce (I) mají dostupnost.

sloučeniny biologickou

Podstata vynálezu

Podle toho poskytuje předkládaný vynález sloučeninu obecného vzorce (I) uvedeného výše, ve kterém:

n j e 0 ;

R je isopropyl;

R¹ je naftylmethyl;

R² je terc-butyl; a

R³ je methyl.

Podle dalšího aspektu poskytuje předkládaný vynález použití sloučeniny podle tohoto vynálezu pro výrobu léčiva pro léčbu nebo prevenci poruch, jako jsou alergie, zánětlivé poruchy a nemoci autoimunitního systému, do kterých je zapojena nadprodukce S-CD23.

Další aspekt tohoto vynálezu poskytuje způsob léčení nebo prevenci poruch, jako jsou alergie, zánětlivé poruchy a nemoci autoimunitního systému, do kterých je zapojena nadprodukce S-CD23, přičemž tento způsob zahrnuje podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu, člověku nebo savci, který není člověkem, který to potřebuje.

Tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci poruch, jako jsou alergie, zánětlivé poruchy a nemoci autoimunitního systému, do kterých je zapojena nadprodukce s-CD23, který obsahuje sloučeninu podle tohoto vynálezu a popřípadě její farmaceuticky přijatelný nosič.

Specifické zánětlivé poruchy zahrnují poruchy centrálního nervového systému, jako jsou Alzheimerova nemoc, roztroušená skleróza a multiinfarktální demence, stejně jako zánět vyvolaný jako následek mrtvice a poškození mozku.

Rozumí se, že farmaceuticky přijatelné soli, solváty a jiné farmaceuticky přijatelné deriváty sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou také do předkládaného vynálezu zahrnuty.

Soli sloučenin obecného vzorce (I) zahrnuji například adiční soli kyselin odvozené od anorganických nebo organických kyselin, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, p-toluensulfonáty, fosfáty, sulfáty, acetáty, trifluoracetáty, propionáty, citráty, maleáty, fumaráty, malonáty, sukcináty, laktáty, oxaláty, tartaráty a benzoáty.

Soli mohou být také vytvářeny s bázemi. Takové solí zahrnují soli odvozené od anorganických nebo organických bází, například soli alkalických kovů, jako jsou soli sodné nebo draselné, a soli organických aminů, jako jsou soli morfolinové, piperidinové, dimethylaminové nebo diethylaminové.

Překvapivě bylo zjištěno, že sloučenina podle předkládaného vynálezu vykazuje prostřednictvím orální cesty výhodné in-vivo absorpční vlastnosti, stejně jako je silným a selektivním inhibitorem na CD23.

Sloučenina podle tohoto vynálezu může být připravena použitím jakékoliv vhodné běžné metody, například analogicky s metodami popsanými v patentové publikaci WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited).

Podle toho v dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob výroby sloučeniny podle tohoto vynálezu popsané dříve, kterýžto způsob zahrnuje:

a) zbavení ochrany sloučeniny obecného vzorce (II)

(II) ve kterém

X je chránící skupina, jako je benzyl nebo trimethylsilyl, nebo

b) reakci sloučeniny obecného vzorce (III)

H

N

NHMe (III)

HO ve kterém je hydroxyskupina popřípadě chráněna, s hydroxylaminem nebo jeho solí.

Sloučeniny obecného vzorce (II) a (III) jsou nové a tvoří další aspekt tohoto vynálezu.

Sloučenina obecného vzorce (II) může být připravena ze sloučeniny obecného vzorce (III) reakcí s chráněným hydroxylaminem. Sloučenina obecného vzorce (III), která má jednu chráněnou hydroxyskupinu, může být hydrolýzou přeměněna na nechráněnou sloučeninu obecného vzorce (III) .

Vhodné ochranné skupiny pro hydroxamovou kyselinu jsou v oboru dobře známé a zahrnují benzyl, trimethylsilyl, terc-butyl a terc-butyldimethylsilyl.

Vhodné ochranné skupiny pro karboxylové kyseliny jsou v oboru dobře známé a zahrnují terc-butyl, benzyl a methyl.

Sloučenina obecného vzorce reakcí sloučeniny obecného vzorce (III) může být (IV) nebo (IVa) připravena

(IV)

(IVa)

Wí4£ÁSiírtfcSW^í«4Sí^^ ve kterýchžto vzorcích

Y je ochraná skupina karboxylové skupiny, se sloučeninou obecného vzorce (V)

Jestliže je použita sloučenina (IVa) potom může být potřebná následná alkylace hydroxylové skupiny.

Sloučenina obecného vzorce (IV) může být připravena pomoci ochrany odpovídájici sloučeniny, ve které Y je vodik, která může být naopak připravena pomoci:

a) reakce sloučeniny obecného vzorce (VI)

ve kterém

R¹ má význam uvedený dřivé a

Z je chránící skupina karboxylové skupiny, s alkylačním činidlem; a

b) odstranění chránících skupin.

Sloučenina obecného vzorce (VI), ve kterém Z je vodík, může být připravena reakcí diesteru (jako je dimethyl- nebo diethylester) kyseliny 2-hydroxyjantarové se sloučeninou obecného vzorce F^X' za přítomnosti silné báze, jako je lithiumdiisopropylamid, ve kterém R¹ je naftylmethyl a X' je odstupující skupina jako je brom nebo jod, a potom hydrolyzováním výsledné sloučeniny pro odstranění esterových skupin.

Isomery, včetně stereoisomerů, sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jako směsi takových isomerů nebo jako jednotlivé isomery. Jednotlivé isomery mohou být připraveny jakoukoliv vhodnou metodou, například mohou být jednotlivé stereoisomery připraveny stereospecifickou chemickou syntézou vycházející z chirálních substrátů nebo dělením směsí diastereoisomerů za použití známých metod. Ve výhodném aspektu, poskytuje vynález sloučeniny obecného vzorce (IA)

Je výhodné, že sloučeniny jsou izolovány v podstatě v čisté formě.

Jak je zde uvedeno, má inhibitor tvorby rozpustné lidské CD23 užitečné léčebné vlastnosti. Výhodně jsou aktivní sloučeniny podávány jako farmaceuticky přijatelné prostředky.

Prostředky jsou výhodně upraveny pro orální podávání. Avšak mohou být upraveny pro jiné způsoby podávání, například ve formě spreje, aerosolu nebo jiným běžným způsobem pro inhalaci, pro léčení poruch dýchacích cest; nebo parenterální podávání pacientům trpícím srdečním selháním. Jiné alternativní způsoby podávání zahrnují sublingvální nebo transdermální podávání.

Prostředek může být ve formě tablet, kapslí, prášků, granulí, pastilek, čípků, rekonstituovatelných prášků nebo kapalných přípravků, jako jsou orální nebo sterilní parenterální roztoky nebo suspenze.

Pro dosažení shodnosti při podávání je výhodné, když prostředek podle tohoto vynálezu je ve formě jednotkové dávky.

Formami představujícími jednotkovou dávku pro orální podávání mohou být tablety a kapsle a mohou obsahovat běžné excipienty, jako jsou pojivá, například sirup, arabskou gumu, želatinu, sorbitol, tragant nebo polyvinylpyrrolidon; plniva, například laktózu, cukr, kukuřičný škrob, fosforečnan vápenatý, sorbitol nebo glycin; tabletovací mazadla, například stearát hořečnatý; činidla usnadňující rozpad, například natriumglykolát škrobu nebo nebo farmaceuticky přijatelná škrob, polyvinylpyrrolidon, mikrokrystalickou celulózu;

zvlhčovadla, jako je laurylsulfát sodný.

Orální prostředky v pevné formě mohou být připraveny běžnými metodami míchání, plnění nebo tabletování. Opakované míchací operace mohou být využity pro distribuci aktivního činidla v těch prostředcích, které používají velká množství plniv. Takové operace jsou ovšem v oboru běžné. Tablety mohou být povlečeny podle způsobů dobře známých v běžné farmaceutické praxi, zvláště enterickým povlakem.

Orální kapalné přípravky mohou být ve formě například emulzí, sirupů nebo elixírů nebo mohou být presentovány jako suché produkty pro rekonstituci vodou nebo jinými vhodnými vehikuly před použitím. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat běžná aditiva, jako jsou suspenzní činidla, například sorbitol, sirup, methylcelulóza, želatina, hydroxyethylcelulóza, karboxymethylcelulóza, gel stearátu hlinitého, hydrogenované jedlé tuky; emulgační činidla, například lecithin, sorbitanmonooleát nebo arabská guma; nevodná vehikula (která mohou obsahovat jedlé oleje), například mandlový olej, frakcionovaný kokosový olej, estery olejů, jako jsou estery glycerinu, propylenglykolu nebo ethylakoholu; konzervační činidla, například methyl- nebo propyl-p-hydroxybenzoát nebo kyselina sorbová; a je-li to žádoucí, běžné příchuti nebo barviva.

Pro parenterální podávání jsou tekuté formy jednotkové dávky připraveny při použití sloučeniny a sterilního vehikula, a v závislosti na použité koncentraci mohou být buď suspendovány nebo rozpuštěny ve vehikulu. Při přípravě roztoků může být sloučenina rozpuštěna pro injekci ve vodě a sterilizována filtrací před plněním do vhodné lékovky nebo ampule a neprodyšným uzavřením. Výhodně, adjuvans, jako je lokální anestetikum, konzervační a pufrovací činidla, mohou být rozpuštěna ve vehikulu. Pro posílení stability může být prostředek po naplnění do lékovky zmrazen a voda odpařena ve vakuu. Parenterální suspenze jsou připravovány v podstatě stejným způsobem, kromě toho, že sloučenina je místo rozpuštění ve vehikulu suspendována a sterilizace nemůže být provedena filtrací. Sloučenina může být před suspendováním ve sterilním vehikulu sterilizována pomocí působení ethylenoxidu. Výhodně, je pro zajištění jednotné distribuce sloučeniny v prostředku obsaženo povrchově aktivní nebo zvlhčovači činidlo.

Prostředky podle tohoto vynálezu mohou být také vhodně presentovány pro dávkování do dýchacího traktu jako šňupací prášek nebo aerosol nebo roztok do rozprašovače, nebo jako mikrojemný prášek pro insuflaci, samotný nebo v kombinaci s inertním nosičem, jako je laktóza. V takovém případě částice aktivní sloučeniny mají výhodně průměry menší než 50 pm, výhodně menší než 10 pm, například průměry v rozmezí od 1 do 50 pm, od 1 do 10 pm nebo od 1 do 5 pm. Kde je to vhodné, mohou být obsažena malá množství jiných antiastmatik a bronchodilátorů, například sympatomimetických aminů, jako jsou isoprenalin, isoetharin, salbutamol, fenylefrin a efedrin; derivátů xanthinu, jako jsou theofylin a aminofylin a kortikosteroidů, jako jsou prednisolon a adrenalinových stimulantů, jako je ACTH.

Prostředky mohou obsahovat od 0,1 % do 99 % hmotnostních, výhodně od 10 do 60 % hmotnostních, aktivní látky, v závislosti na způsobu podávání. Výhodné rozmezí pro podávání inhalací je od 10 do 99 %, zvláště od 60 do 99 %, například 90, 95 nebo 99 %.

Mikrojemné práškové prostředky mohou být vhodně podávány v aerosolu jako odměřovaná dávka nebo prostřednictvím zařízení vhodně aktivujícího dýchání.

Vhodné dávkově odměřované aerosolové prostředky obsahují běžné propelanty, korozpouštědla, jako jsou ethanol, povrchově aktivní činidla, jako je oleylalkohol, mazadla jako je oleylalkohol, vysoušeči prostředky, jako je síran vápenatý a modifikátory hustoty, jako je chlorid sodný.

Vhodnými roztoky pro nebulizer jsou isotonické sterilizované roztoky, popřípadě pufrované, při pH například mezi 4 až 7, obsahující až do 20 mg/ml sloučeniny, ale obvykleji od 0,1 do 10 mg/ml, pro použití v standardním rozprašovacím zařízení.

Účinné množství bude záviset na relativní účinnosti sloučenin podle předkládaného vynálezu, závažnosti poruchy, která má být léčena a hmotnosti trpícího. Vhodně, může forma jednotkové dávky prostředku podle tohoto vynálezu obsahovat od 0,1 do 1 000 mg sloučeniny podle tohoto vynálezu (od 0,001 do 10 mg cestou inhalace) a obvykleji od 1 do 500 mg, například od 1 do 25 nebo od 5 do 500 mg. Takový prostředek může být podáván od 1-krát do 6-krát denně, obvykleji od 2-krát do 4-krát denně, takovým způsobem, že denní dávka je od 1 mg do 1 g pro 70kg dospělého člověka a obzvláště od 5 do 500 mg. To je v rozmezí od asi 1,4 x 10~² mg/kg za den do 14 mg/kg za den a obzvláště v rozmezí od asi 7 χ 10² mg/kg za den do 7 mg/kg za den.

Následující příklady ilustrují tento vynález, ale žádným způsobem ho neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Metody biologických zkoušek

Postup 1

Schopnost zkoušené sloučeniny inhibovat uvolňování rozpustné CD23 se zkoumá za využití následujícího postupu

Zkouška membrány buněk RPMI 8866 na aktivitu odštěpování CD23

RPMI 8866, Epstein-Barrova

Plazmové membrány transformovaných B-buněk linie viru které vodné ml na 1 až tvořené jádry z buněk lidského (Sarfati a kol., Immunology 60, 539 až 547 (1987)), vykazují vysoké hladiny CD23, se čistí za použití extrakční metody. Buňky resuspendované v homogenizačním pufru (20 mM HEPES o pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT) se rozbíjí pomocí kavitace N₂ v Parrově tlakové lahvi a frakce plazmových membrán smíchaná s jinými membránami se získá pomocí odstředění při 10 000 x g. Lehké pelety se resuspendují v 0,2M roztoku fosforečnanu draselného, pH 7,2, při použití 2 3 g smočených buněk a odstraní se pelety Membrány se dále frakcionují rozdělením mezi dextran 500 (6,4% hmotnost/hmotnost) a polyethylenglykol (PEG) 5000 (6,4% hmotnost/hmotnost) (odkaz) v 0,25 M sacharózy v celkovém množství 16 g na 10 až 15 mg proteinů membrány (Morre a Morre, BioTechniques, ý, 946 až 957 (1989) ) . Fáze se oddělí pomocí krátkého odstředění při 1 000 x g a PEG (horní fáze) se zachytí, zředí 3- až 5-krát 20mM roztokem pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,4 a odstředí se při 100 000 x g, přičemž se získají membrány obsažené v této fázi. Pelety se resuspendují v fosforečnanem pufrovaném fyziologickém roztoku a složení je 3- až 4-krát obohacené plazmové membrány stejně jako jiné buněčné membrány (např. lysosomy, Golgi). Membrány se dělí na alikvoty a skladují se při -80 °C. Frakcionace v 6,6% směsi dextran/PEG poskytuje výtěžek 10-krát obohacených plazmových membrán.

Frakcionované membrány se inkubují při 37 °C po dobu až 4 hodin, čímž se získají fragmenty CD23, které se oddělí od membrány filtrací na 0,2-mikrometrových filtračních plotnách Durapor (Millipore), po zastavení zkoušky pomocí .5 μΜ přípravku 1 z P 30994, se stanoví S-CD23 uvolněná z membrány za použití soupravy EIA od The Binding Site (Birmingham, Velká Británie) nebo podobné soupravy využívající MHM6 anti-CD23 mAb (Rowe a kol., Int. J. Cancer 2 9, 373 až 382 (1982)) nebo jiné anti-CD23 mAb jako vazebnou protilátku v sendvičové EIA. Množství rozpustné CD23, které se vytvoří z 0,5 pg proteinu membrány v celkovém objemu 50 μΐ fosforečnanem pufrovaného fyziologického roztoku se měří pomocí EIA a srovnává se s množstvím vytvořeným za přítomnosti různých koncentrací inhibitorů. Inhibitory se připravují v roztocích vody nebo dimethylsulfoxidu (DMSO) a konečná koncentrace DMSO není větší než 2 %. Veličiny ICso se stanovují pomocí sestavení křivky jako koncentrace, kde je pozorována 50% inhibice produkce S-CD23 ve vztahu k rozdílu v produkci S-CD23 mezi kontrolními vzorky inkubovanými bez inhibitoru.

Výsledky

N'- [4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(naftylmethyl)-sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid dává při výše uvedené zkoušce IC₅₀ 60 nm.

Postup 2

Schopnost zkoušené sloučeniny inhibovat kolagenázu se zkoumá za využití následujícího postupu.

Zkouška inhibice kolagenázy :· v :<·

Síla sloučenin působit jako inhibitory kolagenázy se stanovuje pomocí metody, kterou vyvinuli Crawston a Barrett (Anal. Biochem. 99, 340 až 345 (1979), zde zahrnuté ve formě odkazu, čímž je zkoušen lmM roztok inhibitoru nebo jeho zředění (pufrované 150mM Tris, pH 7,6, obsahující 15 mM chloridu vápenatého, 0,05 % Brij 35, 200 mM chloridu sodného a

0,02 % azidu sodného), které se inkubují 18 h při 37 °C s kolagenem a lidskou rekombinantní kolagenázou ze synoviálních fibroblastů z E.Coli klonovaných, exprimovaných a čištěných. Kolagen je acetylovaný hovězí kolagen ³H typu 1, který se připraví metodou, kterou popsal Cawston a Murphy (metody uvedené v Enzymology 80, 711 (1981)) . Vzorky se odstředí k sedimentaci nedigerovaného kolagenu a část radioaktivního supernatantu se odebere pro zkoušku na scintilačním čítači jako míry hydrolýzy. Aktivita kolagenázy za přítomnosti 1 mM inhibitoru nebo jeho zředění se srovnává s aktivitou v kontrolním vzorku bez inhibitoru a výsledky se uvádějí jako koncentrace, která způsobí 50% obsah kolagenázy (IC₅₀) .

Postup 3

Schopnost zkoušených sloučenin inhibovat uvolňování TNF se zkoumá za využití následujícího postupu

Zkouška inhibice uvolňování TNF_a z lidských monocytů stimulovaná lipopolysacharidovým (LPS) endotoxinem

Lidské monocyty, kultivované v prostředí RPMI 1640 doplněné 10% fetálním telecím sérem, se 5 minut odstřeďuje při 1000 x g a potom se resuspendují v prostředí na 2 x 10⁶buněk/ml. Suspenze buněk se rozdělí do 24-jamkových ploten, 1 ml na jamku. Sloučeniny, které se mají zkoušet, se rozpustí v čistém dimethylsulfoxidu (DMSO) a přidají se ke kultuře s výslednou koncentrací DMSO v hodnotě 0,1 %. Sloučeniny se přidají k buňkám v jamkách triplicitně. Uvolňování TNF_a se stimuluje přidáním LPS k buňkám ve výsledné koncentraci 200 ng/ml. Triplicitně se také stanoví výsledky pro vhodné kontrolní kultury. Plotny se inkubu j i po dobu 18 až 20 hodin při 37 °C, s 5 % CO2, potom se 5 minut odstřeďují při 1000 x g. Specifická ELISA pro lidskou TNF_a (SmithKline Beecham) se používá pro měření hladin TNF v supernatantech neobsahujících buněčnou kulturu.

Výsledky

Ν' -[4-(N-hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamin nevykazuje žádný účinek na uvolňování TNF při 10μΜ.

Postup 4

Biologická dostupnost zkoušených sloučenin se zkoumá za použití následujících studií biologické rovnováhy

Studie pro odhad nitrožilních farmakokinetických parametrů a orální biologické dostupnosti na samcích krys kmene Sprague Dawley

Tato studie se provádí za aplikace křížového uspořádání na 4 samostatné studijní dny. Třem krysám se chirurgicky implantují katetry do stehenní žíly pro infuzi molekul zkoušené sloučeniny po nejméně 3 dny před zahájením studie. Všechny dávky při této studii se připravují za použití zkoušené sloučeniny v krystalické formě.

V den studie číslo jedna, obdržela zvířata (krmená) zkoušenou sloučeninu jako 30-minutovou nitrožilní infuzi v cílové dávce 4,0 pmol/kg (4,0 ml/kg). Roztok dávky se připraví ve 20% vodném Encapsinu® (pH =8,0) a obsahuje 1 % DMSO. Encapsin® (Cerestar USA lne., Hammond, IN) je hydroxylpropyl-beta-cyklodextrin, cyklický oligosacharid používaný pro zvýšení rozpustnosti sloučenin, které by jinak vyžadovaly prostředky s použitím nevodných rozpouštědel.

V den studie číslo dvě, zvířata (hladovějící) dostala zkoušenou sloučeninu jako roztok v cílové dávce 8 pmol/kg orální výživou žaludeční sondou (16 ml/kg). Roztok dávky se připravuje v 5% vodné sukcionované vepřové želatině (pH = 7,5) a obsahuje 1 % DMSO.

Vzorky krve se odebírají z laterální ocasní žíly. 25-μ1 alikvot z každého vzorku celkové krve se přidá k 25 μΐ vody a nechají se pro usnadnění úplné hemolýzy stát na ledu po přibližně 5 minut; vzorky se potom do doby analýzy skladují v zmrazeném stavu. Koncentrace zkoušené sloučeniny v krvi se kvantifikují pomocí kapalné chromatografie (LC))/hmotnostní spektroskopie (MS) /hmotnostní spektroskopie MS (LLQ = 10,0 ng/ml). Pro získání odpovídajících nitrožilních farmakokinetických parametrů se na tyto údaje aplikují jak nestrukturální tak strukturální farmakokinetické analýzy za využití softwaru WinNonlin. Používají se různé strukturální modely a vážené vzory; dvoustrukturní model s eliminací prvního řádu z centrální struktury a opakovaným vážením nejmenších čtverců s váhou z 1/Y² poskytuje nejlépe odpovídající výsledky k naměřeným údajům, podle standardního modelu vybraných kriterií (tj Schwartzovo kriterium a

Akaikeovo informační kriterium, součet čtverců zbytků).

Farmakokinetické parametry se vypočítají za použití nejlépe odpovídajícího strukturálního modelu; všechny výpočty, které vyžadují použití AUC hodnot (včetně biologické dostupnosti) se provádějí za použití AUC hodnot získaných z nestrukturální analýzy.

Studie pro odhad nitrožilních farmakokinetických parametrů a orální biologické dostupnosti u psů beaglů samčího pohlaví

Tato studie se provádí za použití křížového uspořádání na studie dvou samostatných dní, sedm dní od sebe vzdálených. Pro tuto studii se používají tři samčí psi beaglové. Každý den studie se pro odběr krevních vzorků do hlavové žíly dočasně zavede katetr; katetr se pro nitrožilní infuzi dočasně zavede také do safenózní žíly.

V den studie číslo jedna, dostává každé zvíře zkoušenou sloučeninu (2,0 gmol/kg cílové dávky) jako 1-hodinovou nitrožilní infuzi(4,0 ml/kg). Roztok dávky se připraví ve 20% vodném Encapsinu® (pH =8,0) a obsahuje 1 % DMSO. Encapsin® (Cerestar USA lne., Hammond, IN) je hydroxylpropyl-beta-cyklodextrin, cyklický oligosacharid (7 glukózových jednotek) používaný pro zvýšení rozpustnosti sloučenin, které by jinak vyžadovaly prostředek s použitím nevodných rozpouštědel.

V den studie číslo dvě, dostalo každé zvíře zkoušenou sloučeninu (6,0 pmol/kg cílové dávky) orální výživou žaludeční sondou (8,0 ml/kg). Roztok dávky se připravuje v 5% vodné sukcionované vepřové želatině (pH =7,5) a obsahuje 1 % DMSO.

Koncentrace zkoušené sloučeniny v plazmě se kvantifikují pomocí LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/ml). Pro analýzu koncentrací v plazmě proti časovým údajům se používají nestrukturální metody.

Studie pro odhad nitrožilních farmakokinetických parametrů a orální biologické dostupnosti u samců opic rodu cynomolgus

Tato studie se provádí za použití křížového uspořádání na studie dvou samostatných dní, sedm dní od sebe vzdálených. Pro tuto studii se používají tři samci opic rodu cynomolgus. Oba dny studie se pro odběr krevních vzorků zavede do safenózní žíly katetr. V den studie číslo jedna se pro nitrožilní infuzi dočasně zavede katetr také do kontralaterální safenózní žíly.

V den studie číslo jedna, dostává každé zvíře (hladovějící) zkoušenou sloučeninu (2,0 pmol/kg cílové dávky) jako 1-hodinovou nitrožilní infuzi (4,0 ml/kg). Roztok dávky se připraví ve 20% vodném Encapsinu® (pH =8,0) a obsahuje 1 % DMSO. Encapsin® (Cerestar USA lne., Hammond, IN) je hydroxylpropyl-beta-cyklodextrin, cyklický oligosacharid (7 glukózových jednotek) používaný pro zvýšení rozpustnosti sloučenin, které by jinak vyžadovaly prostředek s použitím nevodných rozpouštědel.

V den studie číslo dvě, dostalo každé zvíře (hladovějící) zkoušenou sloučeninu (6,0 pmol/kg cílové dávky) zkoušenou sloučeninu orální žaludeční sondou (8,0 ml/kg). Roztok dávky se připravuje v 5% vodné sukcionované vepřové želatině (pH = 7,5) a obsahuje 1 % DMSO.

Krevní vzorky se získají z katetru zavedeného do stehenní žíly; plazma se izoluje pomocí odstředění. Koncentrace zkoušené sloučeniny v plazmě se kvantifikují pomocí LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/ml). Pro farmakokinetickou analýzu koncentrací v plazmě proti časovým údajům se používají nestrukturální metody.

Výsledky

Výsledky pro N'-[4-(N-hydroamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid se srovnávají s výsledky pro N'-[4-(N-hydroxyamino)-3S-propoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methoxyamid (popsáno ve WO 99/67201 (SmithKline Beecham)).

l#»*<š»$frš*s

Struktura

IC₅₀		Γ J γ II		JU ’
(základní	C	)		O 0 aAAA HOHbT tt X NHOH
molekulová	HOHET	VyV	^XNHMe
hmotnost)		2 ° >k		i
[cLogP]		0,04
	(457,57) [2	596]	(473,57) [4,659]
				(strukturní analýza)
Studie	krysa	pes	opice	opice
Craax	13351296	14141465	10111175	13591464
(ng/ml)	nitrožil-	nitrožilní	nitrožilní	nitrožilní dávka -
	ní dávka	dávka =	dávka =	0,99 mg/kg
	= 2,0	0,96 mg/kg	0,92 mg/kg
	mg/kg
Ti/2 (min)	10,815,3	252;259;49°	691;85,1;	5,3211,14 (a)
	(a)		208^b
(MRT)	2341139	(64,4139,7)		3111106 (β)
	(β)		(311;59,5;
	(128177)		68,l^b)	(115162)
CL	26,418,5	10,614,5	14,713,6	10,413,7
(ml/min/kg )
Vdss	3,2511,70	0,56310,204	4,09;l,ll;	1,1610,57
(litr/kg)			0,827^b
Orální F^a	50,6110,6	29,013,7	21,l;6,0;2	1,4 ; 6,0; 1,9^b
(%)	(roztok	perorální	2,5^b	perorální dávka = 2,8
	3,7	dávka = 2,7	(roztok	mg/kg
	mg/kg)	mg/kg	2,8 mg/kg)

Zkratky: C_max - maximální koncentrace dosažená po nitrožilní infuzi; Ti/2 - poločas; MRT - střední čas doby zdržení molekuly zkoušené sloučeniny; CL - systémová clearance plazmy; Vd_ss ustálený stav distribučního objemu; F - procentické vyjádření biologické dostupnosti.

^a - biologická dostupnost se počítá dělením normalizované dávky AUCo-t (kde t je poslední časový okamžik se zjistitelnou koncentrací zkoušené sloučeniny z orálního segmentu (v případě studie na krysách) nebo měřitelné koncentrace účinné látky z orální nebo intraduodenální větve studie (studie na psu nebo opici) normalizovanozou dávkou AUCo-t z nitrožilního segmentu a vynásobením stem.

^b - individuální hodnoty zanesené z důvodu velké variability; zvířata jsou vždy zanesena ve stejném pořadí.

Přípravy

a) 3S-terc-Butoxykarbonyl-2R-(2-naftylmethyl)propiolakton terc-Butyl-(3R)-karboxy-4-(2-naftyl)butyrát (10 g, 31,9 mmol) v THF (160 ml) se míchá při -70 °C v argonové atmosféře a po kapkách se přidá lithium-bis(trimethylsilyl)amid (63,7 ml IM roztoku v THF, 63,7 mmol). Směs se míchá při teplotě mezi -60 a -70 °C 1 h a potom se ochladí na -80 °C a zaváděcí sondou se přidá N-jodsukcinimid (7,17 g, 31,9 mmol) v THF (20 ml). Směs se nechá ohřát na asi -30 °C během lha potom se hasí nasyceným roztokem chloridu amonného. Přidá se ethyl-acetát a 2-fázová směs se rychle míchá při teplotě místnosti 1,5 h.

Vrstvy se oddělí a vodná fáze se extrahuje ethyl-acetátem (2x) a spojené organické vrstvy se promyjí 5% roztokem thiosíranu sodného a roztokem chloridu sodného a potom se suší (Na₂SO₄) a odpaří. Chromatografie na silikagelu (eluce 10% ethyl-acetátem v hexanu) a triturace získaného produktu s hexanem poskytuje 5,70 g pevné bílé látky (63 %).

Hmotnostní spektroskopie - MS (AP +ve) M+Na = 335.

^ΧΗ NMR (CDCls) : 1,31 (9H, s) , 3,29 (1H, dd, J = 8,5, 14,6 Hz), 3,38 (1H, dd, J = 6,1, 14,6 Hz), 4,06 (1H, m), 4,45 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,48 (2H, m), 7,68 (1H, s), 7,82 (3H, m).

Příklad

Ν' -[4-(N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamíd

a) Benzylester N'-[4-(terc-butoxy)-3S-hydroxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucinu

Sůl benzylesteru terc-leucinu s TFA (6,49 g) se míchá s bezvodým uhličitanem draselným (2,89 g) v THF (100 ml) 20 min. Přidá se HOAT (2,24 g) a 3S-terc-butoxykarbonyl-2R-(2-naftylmethyl)propiolakton (4,66 g, 14,94 mmol) a směs se míchá dalších 72 h (dodatečný HOAT (1,02 g) se přidá po 48 h). Pevná část se odfiltruje a dobře promyje THF. Spojené filtráty se odpaří do pěny, která se rozpustí v EtOAc a promyje 0,5M

HC1, nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ (2x), vodou a roztokem chloridu sodného; suší se (MgSO₄) a odpaří do gumovité látky, která se krystalizuje ze směsi hexan/Et2O za získání produktu jako pevné bílé látky, 6,35 g (80 %).

^ΧΗ NMR (DMSO-de) : 0,88 (9H, s) , 1,40 (9H, s) , 2,88 (1H, dd, J = 13,5, 6 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 13,5, 8,5 Hz), 3,19 (1H, m) , 3,92 (1H, t, J □ 6,5 Hz), 4,18 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,77 (1H, d, J = 12,5 Hz), 4,84 (1H, d, J = 12,5 Hz), 5,53 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,24 (2H, m) , 7,30 až 7,37 (4H, m) , 7,45 (2H, m) , 7,65 (1H, s), 7,77 až 7,87 (3H, m), 8,09 (1H, d, J = 9 Hz).

b) Benzylester N'- [4-(terc-butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucinu

K roztoku benzylesteru N'-[4-(terc-butoxy)-3S-hydroxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucinu (3,0 g, 5,62 mmol) v 1,2-diethoxyethanu (75 ml) se přidá NaH (60% suspenze v parafinu, 0,27 g) , po míchání trvajícím 2 až 3 minuty se přidá roztok ^xPrOTf v pentanu (~30% hmotnost/hmotnost, 6 ml) . Směs se míchá 25 min při teplotě místnosti a přidá se další NaH (0,054 g) a ^xPrOTf (3 ml). Po míchání dalších 20 minut se přidá roztok 0,5M HC1 a směs se extrahuje (2x) EtOAc. Spojené extrakty se promyjí nasyceným vodným NaHCO₃, vodou a roztokem chloridu sodného; suší se (MgSO₄) a odpaří do gumovité látky, která se čistí chromatograficky na oxidu křemičitém (hexan/Et20) za získání produktu jako téměř bezbarvé gumovité látky, 1,33 g (41 %).

Hmotnostní spektroskopie - MS (ES +ve) M+H = 576, M+Na - 598.

^XH NMR (CDC1₃) :	0,87	(9H, s), 1,09	(3H,	d, J	= 6,0 Hz), 1,21
(3H, d, J = 6,0	Hz) ,	1,49 (9H, s),	2,87	až 3,	00 (2H, m), 3,10
až 3,22 (1H, m),	3,69	(1H, 7-tet, J	= 6,	0 Hz)	, 4,00 (1H, d, J
= 6,5 Hz), 4,36	(1H,	d, J = 9 Hz) ,	4,57	(1H,	d, zdánlivé J =
12,5 Hz) , 4,63	(1H,	d, zdánlivé J	= 12,5 Hz) (dvě poloviny
Abq), 6,50 (1H,	d, J	- 9 Hz), 7,15	až	7,19	(2H, m) , 7,27 až
7,40 (4H, m), 7,	40 až	7,45 (2H, m),	7,60	(1H,	s), 7,72 až 7,80

(3H, m) .

c) N' -[4-(terc-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin

Benzylester Ν' -[4-(terc-butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucinu (1,33 g, 2,31 mmol) se hydrogenuje při atmosférickém tlaku v MeOH (38 ml) pomocí katalyzátoru Pd-BaSO₄ (0,67 g) po 1 h. Katalyzátor se odfiltruje a dobře promyje MeOH. Spojené filtráty se odpaří za získání produktu jako pěny, 1,09 g (97 %) .

Hmotnostní spektroskopie - MS (ES +ve) M+H = 486, M+Na = 508.

^XH NMR (DMSO-d₆) : 0,92 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,42 (9H, s), 2,75 (1H, dd, J = 14,4 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 14, 9,5 Hz), 3,21 (1H, m) , 3,57 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,93 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,10 (1H, d, J = 9 Hz), 7,29 (1H, m) , 7,44 (2H, m) , 7,62 (1H, s), 7,74 až 7,84 (3H, m), 7,90 (1H, d, J ~ 9 Hz), 12,35 (1H, velmi široký).

d) Ν' -[4-(terc-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl] -S-terc-leucin-methylamid

(3H,	d, J	= 6,0	Hz)
2,74	(1H,	dd, J
Hz) ,	3,17	(1H, m) ,
= 8,	5 Hz) ,	r 4,06	(1H,
(1H,	dd,	J = 8,	5,
(1H,	d, J	= 8,5	Hz) ,

N^f-[4-(terc-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin (1,09 g, 2,24 mmol) se rozpustí v DMF (29 ml) a zpracuje s HOAT (0,61 g) a DEC (0,86 g) . Směs se míchá při teplotě místnosti 20 min a potom se přidá methylamin-hydrochlorid (0,61 g) a N-methylmorfolin (0,74 ml). Směs se míchá po další 2 h a potom se odpařuje ve vakuu. Odparek se rozpustí v EtOAc a promyje postupně 0,5M HCl, nasyceným vodným roztokem NaHCO₃, vodou a roztokem chloridu sodného; suší se (MgSO₄) a odpaří se do gumovité látky, které se čistí chromatografií na oxidu křemičitém (hexan/EtOAc). Produkt se získá jako gumovitá látka 0,77 g (69 %).

Hmotnostní spektroskopie - MS (ES +ve) M+H = 499, M+Na = 521.

^XH NMR (DMSO-d₆) : 0,84 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 1,45 (9H, s), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 3,5, 4,5 Hz), 2,93 (1H, dd, J = 13,5, 10 ,56 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 3,94 (1H, d, J d, J = 9,5 Hz), 7,25 (1H, široký m), 7,28 ,5 Hz), 7,44 (2H, m) , 7,59 (1H, m) , 7,67 7,74 až 7,86 (3H, m).

e) Ν' -[4-Hydroxy-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid

Ν' -[4-(terc-Butoxy)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid (0,77 g, 1,544 mmol) se rozpustí v TFA (11 ml) a DCM (22 ml) a míchá se při teplotě místnosti 2,5 h. Roztok se odpaří ve vakuu a znovu odpaří s toluenem. Triturací odparku se směsí ether/hexan se získá produkt jako bělavá pevná látka, 0,67 g (98 %) .

Hmotnostní spektroskopie - MS (ES +ve) M+H = 443, M+Na = 465.

^XH NMR (DMSO-de) : 0,85 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 2,78 (1H, dd, J = 14,5 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 14, 10,5 Hz), 3,18 (1H, m), 3,58 (1H, 7-tet, J = 6 Hz), 4,00 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,05 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,20 (1H, q, J = 4,5 Hz), 7,29 (1H, dd, J - 8,5, 1,5 Hz), 7,42 až 7,46 (2H, m) , 7,59 ) 1H, d, J = 9 Hz), 7,60 (1H, s), 7,74 až 7,84 (3H, m), 12,87 (1H, široký s).

f) N' - [4-N-Hydroxyamino)-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid

Ν' -[4-Hydroxy-3S-isopropoxy-2R-(2-naftylmethyl)sukcinyl]-S-terc-leucin-methylamid (0,67 g, 1,514 mmol) se rozpustí v DMF (20 ml) a zpracuje se s HOAT (0,41 g) a DEC (0,58 g) .

Roztok se míchá při teplotě místnosti 5 min a přidá se hydroxylamin hydrochlorid (0,32 g) a N-methylmorfolin (0,5 ml). Směs se míchá při teplotě místnosti 2 h a pak se odpařuje ve vakuu. Odparek se rozdělí mezi EtOAc a nasycený vodný NaHCO3 (2x) , vodu (2x) a roztok chloridu sodného; suší se (MgSO₄) a odpaří se do pevné látky, která se trituruje s etherem pro získání produktu jako pevné bílé látky, 0,51 g (74 %) .

Hmotnostní spektroskopie - MS (ES +ve) M+H = 458, M+Na = 480. IjMŘ (DMSO-de): 0,84 (9H, s), 1,00 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,04

(3H,	d, J = 6,0	Hz) ,	2,02 (3H, d, J =	5 Hz) ,	2, 65	(1H, dd,	J =
.1^4	Hz), 2,83	(1H,	dd, J = 14, 11,5	Hz) , 3	,18	(1H, m),	3,52
(1H,	7-tet, J =	6,0	Hz), 3,90 (1H, d,	J = 9	Hz) ,	4,01 (1H	, d,
J =	9 Hz), 6,93	(1H,	q, J = 5 Hz), 7,	25 (1H,	dd,	J = 8,5,	1,5
Hz) ,	7,44 (2H,	m) , 7	,53 (1H, d, J = 9	Hz) , 7	,57	(1H, s),	7,75

až 7,85 (3H, m), 9,08 (1H, s), 10,89 (1H, široký s).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina obecného vzorce (I):

(I) ve kterém

R je isopropyl;

n j e 0 ;

R¹ je naftylmethyl;

R² je terc-butyl; a

R³ je methyl.
2. Sloučenina podle nároku 1, která je sloučeninou obecného vzorce (IA)
3. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci poruch, jako jsou alergie, zánětlivé poruchy a nemoci autoimunitního systému, do kterých se zapojuje nadprodukce S-CD23.

(upravená strana)
4. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci poruch, jako jsou alergie, zánětlivé poruchy a nemoci autoimunitního systému, do kterých se zapojuje nadprodukce S-CD23, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 nebo 2 a popřípadě její farmaceuticky přijatelný nosič.
5. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) zbavení ochrany sloučeniny obecného vzorce (II) (II) ve kterém

X je chránící skupina, jako je benzyl nebo trimethylsilyl, nebo

b) reakci sloučeniny obecného vzorce (III)

O

O

HO

NHMe (III) » j tpUptffeV '•‘t·*^*.** -—· ··' M «••-W’ *· ’ΐ ' rt» ~1 * -, ř* » ✓ ·*-» » f ‘ O^_r ’-»->* Λ -u» % -v·. . r t*,. n «4 JV-» »Wř ^φ»·Λ^«ν(^«ί«·ί^4ίϊίΐ

33 ' . > )

(upravená strana) ve kterém je hydroxyskupina, popřípadě chráněná, s hydroxylaminem nebo jeho solí.

7.

Sloučenina obecného vzorce (II) podle nároku 6.