DE60205035T2

DE60205035T2 - Zur behandlung von autoimmunerkrankungen und allergien geeignete sulfonderivate

Info

Publication number: DE60205035T2
Application number: DE60205035T
Authority: DE
Inventors: John Desmond BEST; Gordon Bruton; Sidney Barry ORLEK
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 2001-11-27
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2022-11-26
Also published as: AR037426A1; TW200303746A; DE60205035D1; WO2003045922A1; ATE299497T1; US20050070572A1; US7038055B2; ES2243783T3; AU2002365510A1; EP1448529B1; GB0128376D0; JP2005513034A; EP1448529A1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Inhibitoren der Bildung von löslichem humanem CD23 und ihre Verwendung in der Behandlung von Zuständen, die mit einer übermäßigen Produktion von löslichem CD23 (s-CD23) verbunden sind, wie zum Beispiel Autoimmunkrankheit und Allergie.
CD23 (der IgE-Rezeptor mit geringer Affinität FceRII, Blast 2) ist ein integrales Protein vom Typ II mit 45 kDa, das auf der Oberfläche einer Vielzahl von reifen Zellen exprimiert wird, die B- und T-Lymphozyten, Makrophagen, natürliche Killerzellen, Langerhans-Zellen, Monozyten und Blutplättchen einschließen (Delespesse et al., Adv. Immunol., 49 [1991] 149–191). Es gibt ebenfalls ein CD23-artiges Molekül auf Eosinophilen (Grangette et al., J. Immunol., 143 [1989] 3580–3588). CD23 wurde mit der Regulierung der Immunreaktion in Verbindung gebracht (Delespesse et al., Immunol. Rev. 125 [1992] 77–97). Humanes CD23 existiert als zwei differentiell regulierte Isoformen, a und b, die sich nur in den Aminosäuren am intrazellulären N-Terminus unterscheiden (Yokota et al., Cell, 55 [1988] 611–618). Im Menschen wird die konstitutive a-Isoform nur auf B-Lymphozyten gefunden, wohingegen Typ b, der durch IL4 induzierbar ist, auf allen Zellen gefunden wird, die CD23 exprimieren können.
Intaktes, zellgebundenes CD23 (i-CD23) ist dafür bekannt, eine Abspaltung von der Zelloberfläche zu erfahren, die zur Bildung einer Anzahl von wohldefinierten löslichen Fragmenten führt (s-CD23), die als Ergebnis einer komplexen Sequenz von proteolytischen Ereignissen erzeugt werden, deren Mechanismus bislang nur unzureichend verstanden wird (Bourget et al., J. Biol. Chem., 269 [1994] 6927–6930). Obwohl es bislang unbewiesen ist, wird postuliert, daß die hauptsächlichen löslichen Fragmente (Mr 37, 33, 29 und 25 kDa) dieser proteolytischen Ereignisse, die alle die mit i-CD23 gemeinsame C-terminale Lectindomäne beibehalten, sequentiell über eine anfängliche Bildung des 37 kDa-Fragments auftreten (Letellier et al., J. Exp. Med., 172 [1990] 693–700). Ein alternativer intrazellulärer Spal tungsreaktionsweg führt zu einem stabilen 16 kDa-Fragment, das sich in der C-terminalen Domäne von i-CD23 unterscheidet (Grenier-Brosette et al., Eur. J. Immunol., 22 [1992], 1573–1577).
Mehrere Aktivitäten wurden membrangebundenem i-CD23 bei Menschen zugeschrieben, für die alle gezeigt wurde, daß sie eine Rolle in der IgE-Regulierung spielen. Besondere Aktivitäten schließen die folgenden ein: a) Antigendarstellung, b) IqE-vermittelte Eosinophilcytotoxizität, c) B-Zell-Homing zu Keimzentren von Lymphknoten und Milz und d) Abregulierung der IgE-Synthese (Delespesse et al., Adv. Immunol., 49 [1991] 149–191). Die drei löslichen CD23-Fragmente mit höherem Molekulargewicht (Mr 37, 33 und 29 kDa) besitzen multifunktionelle Cytokineigenschaften, die eine Hauptrolle in der IgE-Produktion zu spielen scheinen. Daher wurde die übermäßige Bildung von s-CD23 mit der Überproduktion von IgE in Verbindung gebracht, dem Kennzeichen allergischer Krankheiten, wie zum Beispiel von extrinsischem Asthma, Rhinitis, allergischer Konjunktivitis, Ekzem, atopischer Dermatitis und Anaphylaxe (Sutton und Gould, Nature, 366 [1993] 421–428).
Andere biologische Aktivitäten, die s-CD23 zugeordnet wurden, schließen die Stimulation des B-Zellwachstums und die Induktion der Freisetzung von Mediatoren aus Monozyten ein. So wurden erhöhte Spiegel von s-CD23 im Serum von Patienten mit B-chronischer Lymphozytenleukämie (Sarfati et al., Blood, 71 [1988] 94–98) und in den Synovialflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider Arthritis beobachtet (Chomarat et al., Arthritis and Rheumatism, 36 [1993] 234–242). Daß es eine Rolle für CD23 bei Entzündung gibt, wird durch eine Anzahl von Quellen nahegelegt. Zuerst wurde berichtet, daß sCD23 an extrazelluläre Rezeptoren bindet, die bei Aktivierung an zellvermittelten Ereignissen der Entzündung beteiligt sind. So wird berichtet, daß sCD23 direkt die TNF-, IL-1- und IL-6-Freisetzung aus Monozyten aktiviert (Armant et al., Bd. 180, J. Exp. Med., 1005–1011 (1994)). Es wurde berichtet, daß CD23 mit den B2-Integrin-Adhäsionsmolekülen CD11b und CD11c an Monozyten/Makrophagen wechselwirkt (S. Lecoanet-Henchoz et al., Immunity, Bd. 3; 119–125 (1995)), die die Freisetzung von NO₂ ^–, Wasserstoffperoxid und Cytokin (IL-1, Il-6 und TNF) auslösen. Schließlich induzieren IL-4 oder IFN die Expression von CD23 und seine Freisetzung als sCD23 durch humane Monozyten. Die Ligation des membrangebundenen CD23-Rezeptors mit IgE/anti-IgE-Immunkomplexen oder anti-CD23-mAb aktiviert die cAMP- und IL-6-Produktion und Thromboxan-B2-Bildung, was eine Rezeptor-vermittelte Rolle von CD23 in der Entzündung zeigt.
Wegen dieser verschiedenen Eigenschaften von CD23 sollten Verbindungen, die die Bildung von s-CD23 inhibieren, zweifache Wirkungen aus a) einer Steigerung der negativen Rückkopplungsinhibierung der IgE-Synthese durch Aufrechterhalten der Spiegel von i-CD23 auf der Oberfläche von B-Zellen und b) einer Inhibierung der immunstimulatorischen Cytokinaktivitäten von löslichen Fragmenten mit höherem Molekulargewicht (Mr 37, 33 und 29 kDa) von s-CD23 haben. Zusätzlich sollte die Inhibierung der CD23-Spaltung die sCD23-induzierte Monozytenaktivierung und Mediatorbildung lindern und dadurch die inflammatorische Reaktion reduzieren.
WO 99/06361 (Abbott) und WO 00/12478 (Zeneca Limited) beschreiben eine Reihe von Verbindungen, die reverse Hydroxamatsulfonyl- und -sulfonamid-Verbindungen einschließen, zur Verwendung als Metalloproteinase-Inhibitoren.
WO 99/38843 (Darwin Discovery Limited) offenbart einen generischen Umfang von Verbindungen, die unter anderem nützlich in der Behandlung von Zuständen sind, die durch Enzyme vermittelt werden, die an der Abgabe von CD23 beteiligt sind, und umfaßt Verbindungen der Formel (A):
worin B, R¹ und R² aus einer Reihe organischer Gruppen ausgewählt sind.
PCT EP 01/05798 (SmithKline Beecham p.l.c.) offenbart Verbindungen, die nützlich in der Behandlung und Prophylaxe von Zuständen sind, die durch Enzyme vermittelt werden, die an der Abgabe von CD23 beteiligt sind, und umfaßt Verbindungen der Formel (B):
worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist und R¹ Bicyclyl oder Heterobicyclyl ist.
Erfindungsgemäß wird eine Verbindung der Formel (I) bereitgestellt:
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen wie Allergie, allergischem Asthma, atopischer Dermatitis und anderen atopischen Krankheiten; inflammatorischen Störungen; und Autoimmunkrankheit bereit, an denen die Überproduktion von s-CD23 beteiligt ist.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen wie Allergie, allergischem Asthma, atopischer Dermatitis und anderen atopischen Krankheiten; inflammatorischen Störungen; und Autoimmunkrankheit bereit, an denen die Überproduktion von s-CD23 beteiligt ist, und die eine Verbindung der Formel (I) und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür umfaßt.
Besondere inflammatorische Störungen schließen ZNS-Störungen, wie Alzheimer-Krankheit, multiple Sklerose und Multiinfarktdemenz, sowie entzündungsvermittelte Folgekrankheit von Schlaganfall und Schädeltrauma ein.
Die vorliegenden Erfinder haben überraschend festgestellt, daß die erfindungsgemäße Verbindung ein hochwirksamer und -selektiver Inhibitor der CD23-Reifung mit wenig oder keiner Aktivität als Inhibitor von Matrixmetalloproteasen ist.
Es versteht sich, daß die pharmazeutisch akzeptablen Salze, Solvate und anderen pharmazeutisch akzeptablen Derivate der Verbindung der Formel (I) ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Salze von Verbindungen der Formel (I) schließen zum Beispiel Säureadditionssalze ein, die aus anorganischen oder organischen Säuren stammen, wie zum Beispiel Hydrochloride, Hydrobromide, Hydroiodide, p-Toluol-sulfonate, Phosphate, Sulfate, Acetate, Trifluoracetate, Propionate, Citrate, Maleate, Fumarate, Malonate, Succinate, Lactate, Oxalate, Tartrate und Benzoate.
Salze können ebenfalls mit Basen gebildet werden. Solche Salze schließen Salze ein, die aus anorganischen oder organischen Basen stammen, zum Beispiel Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze, und organi sche Aminsalze, wie Morpholin-, Piperidin-, Dimethylamin- oder Diethylaminsalze.
Die Verbindungen der Erfindung können unter Verwendung jedes angemessenen herkömmlichen Verfahrens hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) wie hier oben definiert bereit, wobei das Verfahren die folgende Schritte umfaßt:

(a) Entschützen einer Verbindung der Formel (II):
worin P eine Schutzgruppe ist, die aus Benzyl, Tetrahydropyranyl oder p-Methoxybenzyl ausgewählt ist, oder
(b) Formylieren einer Verbindung der Formel (III):
oder
(c) Oxidieren einer Verbindung der Formel (X):

Verbindungen der Formel (II), (III) und (X) sind neu und bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die folgenden Reaktionsschemata veranschaulichen die Verfahren, die zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) verwendet werden können.
Reaktionsschemata
Ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) ist in Schema 1 gezeigt. Das Thiol (VIII) kann aus dem entsprechenden Halogenid, wie zum Beispiel dem Bromid (IX), unter Verwendung der von Choi and Yoon, Synthesis, 1995, 373 beschriebenen Verfahren hergestellt und zu (VII) durch Reaktion mit einem geeigneten Halogenmethylketon, wie zum Beispiel dem Brommethylketon, in Gegenwart einer Base wie Triethylamin umgewandelt werden. Das Keton (VII) kann mit einem geeignet O-geschützten Hydroxylamin umgesetzt werden. wenn zum Beispiel die Schutzgruppe (P) Benzyl ist, kann die Reaktion mit O-Benzylhydroxylamin unter Standardbedingungen verwendet werden, um Oxim (VI) herzustellen, das zu (V) mit einem geeigneten Reduktionsmittel, zum Beispiel Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid in Essigsäure, reduziert werden kann. Die Formylierung von (V) unter Verwendung von gemischtem Anhydrid aus Ameisensäure und Essigsäure gefolgt von Oxidation mit m-Chlorperbenzoesäure liefert (II), das unter geeigneten Bedingungen entschützt werden kann.
Schema 1
Verbindungen der Formel (I) können ebenfalls wie in Schema 2 beschrieben hergestellt werden. Das Keton (VII) kann mit Hydroxylamin unter Standardbedingungen umgesetzt werden, um ein Oxim (XII) zu ergeben, das bei Reduktion mit einem geeigneten Reduktionsmittel wie Natriumcyanoborhydrid in Essigsäure das Hydroxylamin (XI) liefert, das durch Behandlung mit dem gemischten Anhydrid aus Ameisensäure und Essigsäure gefolgt von Kaliumcarbonat und Methanol formyliert und wie zuvor für Schema 1 beschrieben oxidiert werden kann.
Schema 2
Die erfindungsgemäße Verbindung kann als Mischung der Isomere oder als individuelles Isomer hergestellt werden. Das individuelle Isomer kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel können individuelle Stereoisomere durch stereospezifische chemische Synthese ausgehend von chiralen Substraten oder durch Trennung von Mischungen der Enantiomere oder von Mischungen der Diastereomere unter Verwendung bekannter Verfahren, wie zum Beispiel chirale präparative HPLC, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Trennung von Verbindungen der Formel (I), die racemisch sind, zu einzelnen Enantiomeren durch Umwandlung in ein geeignetes Ester-Derivat, wie zum Beispiel das O-Methylmandelsäure-Derivat, gefolgt von Trennung unter Verwendung von chromatographischen Standardverfahren und anschließendes Entschützen erreicht werden.
In einem bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel (IA) bereit:
In einem anderen bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel (IB) bereit:
Verbindungen der Formel (I) können in chiral reiner Form unter Verwendung der in Schema 3 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Bei der Herstellung von Verbindungen der Formel (IA) kann zum Beispiel ein geeignet geschützter chiraler Aminoalkohol (XIXA) zum entsprechenden Thioacetat (XVIIIA) unter Mitsunobu-Bedingungen, zum Beispiel unter Verwendung von Triphenylphosphin oder Tributylphosphin in Kombination mit Di-t-butylazodicarboxylat oder Diethylazodicarboxylat, umgewandelt werden. Das Thioacetat (XVIIIA) kann in situ zu einem Thiol und dann zum Sulfid (XVIIA) umgewandelt werden. Alternativ kann die Alkoholgruppe in (XIXA) zu einer Abgangsgruppe, wie zum Beispiel einem Tosylat oder Bromid, umgewandelt und mit dem entsprechenden Thioacetat oder Thiol, wie zum Beispiel Chinolin-3-yl-methanthiol oder -thioacetat, in Gegenwart einer geeigneten Base wie Natriumhydroxid umgesetzt werden, um (XVIIA) zu ergeben. Die Oxidation von (XVIIA) zum Sulfon (XVIA) kann mit einem geeigneten Oxidationsmittel wie MCPBA gefolgt von Entschützen durchgeführt werden. Das Entschützen unter Standardbedingungen, wie zum Beispiel Trifluoressigsäure oder Hydrogenchlorid in Dioxan, liefert (XVA), das zu (XIVA) umgewandelt und zum Oxaziridin (XIIIA) unter Verwendung etablierter Verfahren, zum Beispiel mit m-Chlorperbenzoesäure, oxidiert werden kann. Die Umwandlung des Oxaziridins (XIIIA) zu (IIIA) wird bevorzugt unter Verwendung von Salzsäure durchgeführt. Die Formylierung von (IIIA) kann unter Verwendung von standardmäßiger Formylierungsmethodik, wie zum Beispiel Reaktion mit dem gemischten Anhydrid aus Ameisensäure und Essigsäure, durchgeführt werden.
Schema 3
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (IIIA) in chiral reiner Form ist in Schema 4 gezeigt. Das chirale Amin (XVA) kann mit Cyanomethylbromid oder Cyanomethyliodid alkyliert werden, um das Cyanomethylamin (XXA) zu ergeben, das zu (IIIA) unter Verwendung der von Tokuyama et al. beschriebenen Verfahren umgewandelt wird, Synthesis, 2000, 9, 1299.
Schema 4
Alternativ kann das Amin (XVA) direkt mit Benzoylperoxid oxidiert werden, um ein Benzoylhydroxylamin (XXIA) wie in Schema 5 gezeigt zu ergeben, wobei das von Phanstiel beschriebene Verfahren verwendet wird, J. Org. Chem., 1997, 62, 8104. Letztere Verbindung kann mit dem gemischten Anhydrid aus Ameisensäure und Essigsäure formyliert und dann zum Beispiel mit Ammoniak in Methanol entschützt werden, um (IA) zu ergeben.
Schema 5
Verbindungen der Formel (IB) können in einer analogen Weise aus den entsprechenden chiralen Vorstufen synthetisiert werden.
Verbindungen der Formel (III) können ebenfalls unter Verwendung des in Schema 6 gezeigten Wegs hergestellt werden. Der Alkohol (XXIV) kann durch Reduktion des Ketons (VII) unter Standardbedingungen, zum Beispiel Boran in THF, erhalten werden. Nach Bedarf kann der Alkohol (XXIV) durch Reaktion des Halogenalkohols (XXVI) mit (XXV) hergestellt werden. Die Oxidation zum Sulfon (XXIII) kann wie zuvor beschrieben durchgeführt werden, gefolgt von Eliminierung unter Verwendung von Methansulfonylchlorid und Triethylamin oder unter Mitsunobu-Bedingungen, um (XXII) zu ergeben. Die Zugabe von Hydroxylamin zum ungesättigten Sulfon (XXII) liefert (III).
Schema 6
Halogenmethylketone können durch Bromierung eines Methylketons unter Verwendung von Brom in Methanol erhalten werden, wie beschrieben von Gaudry und Marquet, Org. Synth., 1976, 55, 24. Alternativ können Brommethylketone aus den entsprechenden Diazoketonen durch Reaktion mit Hydrogenbromid unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden. Verbindungen der Formel (IX) können durch Standardverfahren erhalten werden, zum Beispiel durch Bromierung von 3-Methylchinolin mit N-Bromsuccinimid in Kohlenstofftetrachlorid. Die Bromierung von chinolinhaltigen Vorstufen mit N-Bromsuccinimid wird bevorzugt in Gegenwart einer Säure, wie zum Beispiel Essigsäure, durchgeführt. Alternativ kann Chinolin-3-yl-methanol zu einer Verbindung der Formel (IX) unter Verwendung von standardmäßigen Halogenierungsverfahren, z.B. unter Verwendung von Phosphorpentachlorid oder Thionylchlorid, oder durch Umwandlung zum Mesylat gefolgt von Behandlung mit Lithiumbromid in Aceton umgewandelt werden.
Geschützte Aminoalkoholvorstufen sind entweder kommerziell erhältlich oder können über Standardwege hergestellt werden, zum Beispiel aus den entsprechenden Aminosäuren, wie beschrieben von Ho et al., Tet. Lett., 1993, 34(41), 6513.
Geeignete Aminosäure-Derivate können aus Aziridin-Vorstufen hergestellt werden, z.B. wie beschrieben von Nakajima et al., Bull. Soc. Chim. Japan, 1982, 55, 3049.
Die Ausgangsstoffe und anderen Reagenzien sind kommerziell erhältlich oder können durch allgemein bekannte und herkömmliche Verfahren synthetisiert werden.
Es ist bevorzugt, daß die Verbindungen in im wesentlichen reiner Form isoliert werden.
Wie hier angegeben wurde, besitzt ein Inhibitor der Bildung von löslichem humanem CD23 nützliche medizinische Eigenschaften. Bevorzugt werden die aktiven Verbindungen als pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen verabreicht.
Die Zusammensetzungen werden bevorzugt zur oralen Verabreichung angepaßt. Jedoch können sie für andere Verabreichungsmodi angepaßt werden, zum Beispiel in Form eines Sprays, Aerosols oder für ein anderes herkömmliches Verfahren zur Inhalation, zur Behandlung von Störungen der Atemwege; oder zur parenteralen Verabreichung für Patienten, die an Herzversagen leiden. Andere alternative Verabreichungsmodi schließen die sublinguale oder transdermale Verabreichung ein.
Die Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granalien, Lutschtabletten, Suppositorien, rekonstituierbaren Pulvern oder flüssigen Zubereitungen, wie zum Beispiel oralen oder sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sein.
Um eine Konsistenz der Verabreichung zu erhalten, ist es bevorzugt, daß eine Zusammensetzung der Erfindung in Form einer Einheitsdosis ist.
Einheitsdosisdarreichungsformen zur oralen Verabreichung können Tabletten und Kapseln sein und können herkömmliche Exzipienten enthalten, wie Bindemittel, zum Beispiel Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Traganthharz oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Tablettierungsschmiermittel, zum Beispiel Magnesiumstearat; Sprengmittel, z.B. Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Natriumstärkeglykolat oder mikrokristalline Cellulose; oder pharmazeutisch akzeptable Benetzungsmittel, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat.
Die festen oralen Zusammensetzungen können durch herkömmliche Verfahren aus Vermischen, Einfüllen oder Tablettieren hergestellt werden. Wiederholte Mischarbeitsgänge können verwendet werden, um den Wirkstoff in denjenigen Zusammensetzungen zu verteilen, die große Mengen an Füllstoffen verwenden. Solche Arbeitsgänge sind selbstverständlich herkömmlich auf diesem Gebiet. Die Tabletten können gemäß Verfahren überzogen werden, die in der normalen pharmazeutischen Praxis allgemein bekannt sind, insbesondere mit einem enterischen Überzug.
Orale flüssige Zubereitungen können in Form von zum Beispiel Emulsionen, Sirupen oder Elixieren sein oder können als trockenes Produkt zur Rekonstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Additive enthalten, wie zum Beispiel Suspendiermittel, zum Beispiel Sorbit, Sirup, Methylcellulose, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel, hydrierte eßbare Fette; Emulgatoren, zum Beispiel Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nicht-wäßrige Träger (die eßbare Öle einschließen können), zum Beispiel Mandelöl, fraktioniertes Kokosöl, ölige Ester, wie zum Beispiel Ester von Glycerin, Propylenglykol oder Ethylalkohol; Konservierungsmittel, zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure; und nach Wunsch herkömmliche Geschmacks- und Färbemittel.
Zur parenteralen Verabreichung werden flüssige Einheitsarzneiformen unter Verwendung der Verbindung und eines sterilen Trägers hergestellt und können in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration entweder im Träger suspendiert oder gelöst sein. Bei der Herstellung von Lösungen kann die Verbindung in Wasser zur Injektion gelöst und filtersterilisiert werden, bevor sie in ein geeignetes Fläschchen oder eine Ampulle gefüllt und versiegelt wird. Vorteilhaft können Hilfsstoffe, wie zum Beispiel ein Lokalanästhetikum, ein Konservierungsmittel und Puffermittel, im Träger gelöst werden. Zur Erhöhung der Stabilität kann die Zusammensetzung nach dem Einfüllen in das Fläschchen eingefroren und das Wasser unter Vakuum entfernt werden. Parenterale Suspensionen werden in der im wesentlichen gleichen Weise hergestellt, außer daß die Verbindung im Träger suspendiert anstelle gelöst wird und die Sterilisation nicht durch Filtration erreicht werden kann. Die Verbindung kann durch Kontakt mit Ethylenoxid vor dem Suspendieren im sterilen Träger sterilisiert werden. Vorteilhaft wird ein Tensid oder Benetzungsmittel in der Zusammensetzung eingeschlossen, um die gleichmäßige Verteilung der Verbindung zu erleichtern.
Zusammensetzungen dieser Erfindung können ebenfalls in geeigneter Weise zur Verabreichung in die Atemwege als Schnupfmittel oder Aerosol oder Lösung für einen Vernebler oder als ein mikrofeines Pulver zur Insufflation angeboten werden, allein oder in Kombination mit einem inerten Träger wie Lactose. In einem solchen Fall haben die Partikel des Wirkstoffs in geeigneter Weise Durchmesser von weniger als 50 μm, bevorzugt weniger als 10 μm, zum Beispiel Durchmesser im Bereich von 1–50 μm, 1–10 μm oder 1–5 μm. Nach Bedarf können kleine Mengen anderer Antiasthmatika und Bronchodilatatoren, zum Beispiel sypathomimetische Amine, wie Isoprenalin, Isoethanrin, Salbutamol, Phenylephrin und Ephedrin; Xanthin-Derivate, wie Theophyllin und Aminophyllin, und Kortikosteroide wie Prednisolon und adrenale Stimulantien wie ACTH eingeschlossen werden.
Die Zusammensetzungen können 0,1 bis 99 Gew.-%, bevorzugt 10 bis 60 Gew.-% Wirkstoff enthalten, abhängig von der Verabreichungsmethode. Ein bevorzugter Bereich für die inhalierte Verabreichung ist 10–99%, speziell 60–99%, zum Beispiel 90, 95 oder 99%.
Mikrofeine Pulverformulierungen können geeignet in einem Aerosol als abgemessene Dosis oder mittels einer geeigneten atemaktivierten Vorrichtung verabreicht werden.
Geeignete Dosieraerosolformulierungen umfassen herkömmliche Treibmittel, Cosolventien wie Ethanol, Tenside wie Oleylalkohol, Schmiermittel wie Oleylalkohol, Trockenmittel wie Calciumsulfat und Dichtemodifizierer wie Natriumchlorid.
Geeignete Lösungen für einen Vernebler sind isotonische sterilisierte Lösungen, gegebenenfalls gepuffert, zum Beispiel auf pH 4–7, die bis zu 20 mg/ml der Verbindung enthalten, aber allgemeiner 0,1 bis 10 mg/ml, zur Verwendung mit einer Standardverneblerausrüstung.
Eine wirksame Menge wird von der relativen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, von der Schwere der behandelten Störung und dem Gewicht des Erkrankten abhängen. In geeigneter Weise kann eine Einheitsarzneiform einer Zusammensetzung der Erfindung 0,1 bis 1000 mg einer Verbindung der Erfindung (0,001 bis 10 mg über Inhalation) und gewöhnlicher 1 bis 500 mg, zum Beispiel 1 bis 25 oder 5 bis 500 mg, enthalten. Solche Zusammensetzungen können 1- bis 6-mal täglich verabreicht werden, gewöhnlicher 2- bis 4-mal täglich, in einer solchen Weise, daß die tägliche Dosis 1 mg bis 1 g für einen erwachsenen Menschen mit 70 kg ist, und insbesondere 5 bis 500 mg, d.h. im Bereich von ca. 1,4 × 10^–2 mg/kg/Tag bis 14 mg/kg/Tag und insbesondere im Bereich von ca. 7 × 10^–2 mg/kg/Tag bis 7 mg/kg/Tag.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, aber beschränken sie in keiner Weise.
Herstellung 1: 3-Chlormethylchinolinhydrochlorid
Schritt 1: 3-Chinolylmethanol – Chinolin-3-carboxaldehyd (13,18 g) in Ethanol (260 ml) wurde auf 0°C gekühlt, gefolgt von portionsweiser Zugabe von Natriumborhydrid (1,62 g). Die Temperatur wurde für 15 min auf 0°C gehalten, gefolgt von Zugabe von 6 N HCl (28 ml), wobei die Temperatur der Reaktion zwischen 0 und 5°C gehalten wurde. Die Lösung wurde dann mit 1 M NaOH neutralisiert. Die rohe Reaktionsmischung wurde zur Entfernung von Ethanol zur Trockene gestrippt, und der Rückstand wurde zwischen Wasser und EtOAc aufgetrennt. Die EtOAc-Schicht wurde dann getrocknet (MgSO₄) und an Kieselgel absorbiert und chromatographiert (Flash-Kieselgel, Stufengradient: 0–100% EtOAc/Hexan), um die Untertitelverbindung als weißen Feststoff (9,85 g) zu ergeben.
Schritt 2: 3-Chlormethylchinolinhydrochlorid – 3-Chinolyl methanol (9,85 g) wurde in trockenem Benzol (200 ml) aufgenommen und gerührt, gefolgt von Zugabe von Thionylchlorid (14,69 ml). Ein unmittelbarer gelber Niederschlag wurde erhalten. Das Rühren wurde bei RT für 2 h beibehalten. Ein hellgelber Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet, um die Untertitelverbindung (13 g) zu ergeben.
Beispiel 1: N-[(2S,3R)-3-methoxy-1-(chinolin-3-yl-methansulfonyl)butan-2-yl]hydroxyformamid
Schritt 1: (2S,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutansäure
Eine eiskalte Lösung aus (2S,3R)-2-Amino-3-methoxybutansäure (1,04 g) in 1,4-Dioxan (10 ml) und 1 M Natriumhydroxid (7,82 ml) wurde mit Di-t-butyldicarbonat (1,88 g) behandelt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit Hexan (3 × 5 ml) gewaschen, mit 5%iger Zitronensäurelösung angesäuert und mit Ethylacetat (25 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und eingedampft, um die Untertitelverbindung (1,81 g) zu ergeben.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5,3 (1H, m), 4,35 (1H, m), 3,98 (1H, d, J = 6,5 Hz), 3,39 (3H, s), 1,46 (9H, s), 1,21 (3H, d, J = 6,5 Hz).
Schritt 2: (2R,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutanol
Eine gerührte Lösung aus (2S,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutansäure (1,75 g) in trockenem THF (20 ml) bei –10°C wurde mit N-Methylmorpholin (0,83 ml) und Isobutylchlorformiat (0,98 ml) behandelt. Nach 30 min wurde die Mischung filtriert und in Eis erneut gekühlt. Eine Lösung aus Natriumborhydrid (0,285 g) in Wasser (5 ml) wurde hinzugegeben und die Mischung für 1 h gerührt. Nach Ansäuern auf pH 3 mit 1 M Salzsäure wurde die Mischung mit Ethylacetat (20 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser (2 × 10 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft, um die Untertitelverbindung (1,2 g) zu liefern.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5,1 (1H, m), 3,59–3,75 (4H, m), 3,33 (3H, s), 1,45 (9H, t), 1,18 (3H, d, J = 6,8 Hz).
Schritt 3: (2S,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutylthioacetat
Eine eiskalte Lösung aus Triphenylphosphin (2,75 g) in THF (40 ml) wurde tropfenweise mit Diisopropylazodicarboxylat (2,07 ml) behandelt und für 30 min gerührt. Eine Lösung aus (2R,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutanol (1,15 g) und Thioessigsäure (0,75 ml) in THF (10 ml) wurde hinzugetropft. Die Reaktion wurde auf RT über Nacht erwärmen gelassen und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hexan (150 ml) extrahiert, eingedampft und Flash-chromatographiert (Kieselgel, Stufengradient: 0–5% EtOAc/MDC), um die Untertitelverbindung (1,24 g) zu ergeben.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 4,82 (1H, breit d), 3,66 (1H, m), 3,42 (1H, m), 3,31 (3H, s), 2,96–3,18 (2H, m), 2,32 (3H, s), 1,42 (9H, s), 1,13 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 4: (2S,3R)-2-(N-t-Butoxycarbonylamino)-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfanyl)butan
Eine gerührte Mischung aus (2S,3R)-2-N-t-Butoxycarbonylamino-3-methoxybutylthioacetat (1,05 g) und 3-Chlormethylchinolinhydrochlorid (0,61 g) in Methanol (50 ml) bei RT wurde tropfenweise mit 1 M Natriumhydroxid (5,7 ml) behandelt und über Nacht gerührt. Die Mischung wurde zu einem geringen Volumen eingeengt und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (10 ml) verdünnt. Nach Extraktion mit MDC (2 × 10 ml) wurden die vereinigten Extrakte getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde Flash-chromatographiert (Kieselgel, Stufengradient: 15–30% EtOAc/MDC), um die Untertitelverbindung (1,31 g) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 377 (MH⁺);
¹H-NMR δ (CDCl₃): 8,9 (1H, m), 8,1 (2H, m), 7,79 (1H, d, J = 8 Hz), 7,69 (1H, t, J = 8 Hz), 7,56 (1H, t, J = 8 Hz), 4,87 (1H, breit d), 3,91 (2H, s), 3,68 (2H, m), 3,27 (3H, s), 2,55 (2H, m), 1,46 (9H, s), 1,15 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 5: (2S,3R)-2-(N-t-Butoxycarbonylamino)-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butan
Eine eiskalte Lösung aus (2S,3R)-2-(N-t-Butoxycarbonylamino)-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfanyl)butan (1,3 g) in MDC (20 ml) wurde mit 50%iger 3-Chlorperoxybenzoesäure (2,1 g) behandelt und die Mischung für 1 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%igem Natriumthiosulfat (10 ml), gefolgt von gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (10 ml) abgeschreckt. Nach 5 min wurde die organische Phase aufgefangen, getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Ethylacetat-Hexan-Mischungen kristallisiert, um die Untertitelverbindung (1 g) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 397 (MNa⁺);
¹H-NMR δ (CDCl₃): 8,9 (1H, m), 8,3 (1H, d, J = 2 Hz), 8,1 (1H, d, J = 8 Hz), 7,83 (1H, d, J = 8 Hz), 7,75 (1H, t, J = 8 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8 Hz), 5,04 (1H, breit), 4,6 (2H, m), 4,2 (1H, m), 3,71 (1H, m), 3,31 (3H, s), 3,17 (2H, m), 1,55 (9H, m), 1,19 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 6: (2S,3R)-2-Amino-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butandihydrochlorid
Eine gerührte Lösung aus (2S,3R)-2-(N-t-Butoxycarbonylamino)-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butan (1 g) in MDC (10 ml) bei RT wurde mit 4 M Hydrogenchlorid in Dioxan (10 ml) behandelt. Nach 1 h wurde die Mischung eingedampft, um die Untertitelverbindung (0,93 g) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 309 (MH⁺);
¹H-NMR δ (DMSO-d6): 9,04 (1H, m), 8,71 (1H, s), 8,3 (3H, breit S), 8,2 (2H, m), 7,91 (1H, t, J = 8 Hz), 7,78 (1H, t, J = 8 Hz), 5,08 (2H, m), 3,3–3,88 (4H, m), 3,31 (3H, s), 1,7 (2H, m), 1,19 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 7: (2S,3R)-2-(N-Cyanomethylamino)-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butan
Eine Mischung aus (2S,3R)-2-Amino-3-methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butandihydrochlorid (0,93 g), Bromacetonitril (0,41 ml) und N-Ethyldiisopropylamin (1,7 ml) in Acetonitril (15 ml) wurde für 16 h refluxiert, abgekühlt und eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen MDC (15 ml) und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (15 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde aufgefangen und die wäßrige mit MDC (15 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten MDC-Phasen wurden getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde Flash-chromatographiert (Kieselgel, Stufengradient: 70–100% EtOAc/Hexan), um die Untertitelverbindung (0,59 g) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 348 (MH⁺);
¹H-NMR δ (CDCl₃): 8,91 (1H, m), 8,3 (1H, d, J = 2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8 Hz), 7,87 (1H, d, J = 8 Hz), 7,78 (1H, t, J = 8 Hz), 7,60 (1H, t, J = 8 Hz), 4,55 (2H, s), 3,4–3,88 (4H, m), 3,33 (3H, s), 2,93–3,28 (2H, m), 2,18 (1H, m), 0,93 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 8: (2S,3R)-N-[3-Methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butan-2-yl]hydroxylamin
Eine eiskalte gerührte Lösung aus (2S,3R)-3-Methoxy-2-(N-cyanomethylamino)-1-(3-chinolylmethansulfonyl)butan (590 mg) in MDC (20 ml) wurde mit 4-Toluolsulfonsäuremonohydrat (50 mg) und 70%iger 3-Chlorperoxybenzoesäure (281 mg) behandelt. Nach 45 min wurde die Reaktion mit 10%igem Natriumthiosulfat (5 ml), gefolgt von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5 ml) abgeschreckt. Nach 5 min wurde die organische Schicht aufgefangen und die wäßrige mit MDC (10 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten MDC-Phasen wurden getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (10 ml) gelöst, mit 4-Toluolsulfonsäuremonohydrat und Hydroxylaminhydrochlorid (2,36 g) behandelt und für 1,5 h auf 60°C erwärmt. Die abgekühlte Lösung wurde eingedampft und dann in Wasser (5 ml) und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5 ml) gelöst. Nach Extraktion mit MDC (2 × 5 ml) wurden die vereinigten Extrakte getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde Flash-chromatographiert (Kieselgel, Stufengradient: 80–100% Ethylacetat in Hexan), um die Untertitelverbindung (305 mg) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 325 (MH⁺);
¹H-NMR δ (CDCl₃): 8,91 (1H, m), 8,32 (1H, d, J = 2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 8 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8 Hz), 7,76 (1H, t, J = 8 Hz), 7,6 (1H, t, J = 8 Hz), 4,83 (1H, breit), 4,58 (2H, m), 3,0–3,7 (4H, m), 3,38 (3H, s), 0,92 (3H, d, J = 6,3 Hz).
Schritt 9: N-[(2S,3R)-3-Methoxy-1-(chinolin-3-yl-methansulfonyl)butan-2-yl]-N-hydroxyformamid
(2S,3R)-N-[3-Methoxy-1-(3-chinolylmethansulfonyl)-2-butyl]hydroxylamin (300 mg) wurde in einer vorgemischten Lösung aus Essigsäureanhydrid (2 ml) und Ameisensäure (6 ml) gelöst und über Nacht stehengelassen. Die Reaktion wurde eingedampft und dann aus Chloroform (2 × 5 ml) erneut eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (5 ml) erneut gelöst, mit Kaliumcarbonat (639 mg) behandelt und für 54 min gerührt und dann eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) erneut gelöst und der pH mit 1 M Salzsäure auf 7 eingestellt. Nach Extraktion mit MDC (2 × 5 ml) wurden die vereinigten Extrakte getrocknet (MgSO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde chromatographiert (säuregewaschenes Kieselgel, 3% MeOH/MDC), um die Titelverbindung (232 mg) zu ergeben.
MS (APCI +ve-Ion) 353 (MH⁺);
¹H-NMR δ [(CD₃)₂SO] 9,9 und 9,7 (1H, 2xs Rotamere), 8,83 (1H, m), 8,38 (1H, d, J = 2 Hz), 8,32 und 8,0 (1H, 2xs Rotamere), 8,03 (2H, m), 7,81 (1H, t, J = 8 Hz), 7,66 (1H, t, J = 8 Hz), 4,85 und 7,22 (1H, 2xs Rotamere), 4,76 (2H, m), 3,7–3,3 (3H, m), 3,25 (3H, s), 1,15 (3H, m Rotamere).
Beispiel 2: N-[(2R,3S)-3-Methoxy-1-(chinolin-3-yl-methansulfonyl)butan-2-yl]-hydroxyformamid
Die Verbindung von Beispiel 2 wurde aus (2R,3S)-2-Amino-3-methoxybutansäure unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Biologische Testverfahren
Verfahren 1: Die Fähigkeit von Testverbindungen zur Inhibierung der Freisetzung von löslichem CD23 wurde durch Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht.
RPMI 8866-Zellmembran-CD23-Spaltungsaktivitätstest:
Plasmamembranen aus RPMI 8866-Zellen, einer humanen, mit Epstein-Barr-Virus transformierten B-Zellinie (Sarfati et al., Immunology 60 [1987] 539–547), die hohe Mengen von CD23 exprimiert, werden unter Verwendung eines wäßrigen Extraktionsverfahrens gereinigt. Die in Homogenisierungspuffer (20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT) resuspendierten Zellen werden durch N₂-Kavitation in einer Parr-Bombe aufgebrochen, und die mit anderen Membranen vermischte Plasmamembranfraktion wird durch Zentrifugieren mit 10000 × g gewonnen. Das leichte Pellet wird in 0,2 M Kaliumphosphat, pH 7,2 unter Verwendung von 2 ml auf 1–3 g nasse Zellen resuspendiert, und das Kernpellet wird verworfen. Die Membranen werden weiter durch Auftrennen zwischen Dextran 500 (6,4% G/G) und Polyethylenglykol (PEG) 5000 (6,4% G/G) (Ref.) bei 0,25 M Saccharose in insgesamt 16 g auf 10–15 mg Membranproteine fraktioniert [Morre and Morre, BioTechniques 7, 946–967 (1989)]. Die Phasen werden durch kurzes Zentrifugieren mit 1000 × g getrennt, und die (obere) PEG-Phase wird aufgefangen, 3- bis 5-fach mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 verdünnt und mit 100000 × g zentrifugiert, um Membranen in dieser Phase zu gewinnen. Das Pellet wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und besteht aus 3- bis 4-fach angereicherten Plasmamembranen sowie einigen anderen Zellmembranen (z.B. Lysosomen, Golgi). Die Membranen werden in Teilmengen aufgeteilt und bei –80°C gelagert. Fraktionierung mit 6,6% Dextran/PEG liefert 10-fach angereicherte Plasmamembranen.
Die fraktionierten Membranen werden bei 37°C für bis zu 4 h inkubiert, um Fragmente von CD23 zu erzeugen, die aus der Membran durch Filtration in 0,2 μm Durapore-Filterplatten (Millipore) abgetrennt werden, nach Abschrecken des Assays mit einem nicht-selektiven MMP-Inhibitor, z.B. 5 μM Zubereitung 1 aus WO 95/31457 ([4-(N-Hydroxyamino)-2-(R)-isobutyl-3-(S)-(2-thiophenthiomethyl)succinyl]-(S)-phenylalanin-N-methylamidnatriumsalz, hergestellt gemäß dem in Beispiel 11 aus WO 90/05719 beschriebenen Verfahren). Aus der Membran freigesetztes sCD23 wird unter Verwendung des EIA-Kits von The Binding Site (Birmingham, UK) oder eines ähnlichen unter Verwendung von MHM6 anti-CD23-mAb [Rowe et al., Int. J. Cancer, 29, 373–382 (1982)] oder eines anderen anti-CD23-mAb als Einfangantikörper in einem Sandwich-EIA bestimmt. Die Menge von löslichem CD23, die durch 0,5 μg Membranprotein in einem Gesamtvolumen von 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt wird, wird durch EIA gemessen und mit der Menge verglichen, die in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Inhibitoren erzeugt wird. Inhibitoren werden in Lösungen von Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt, und die DMSO-Endkonzentration beträgt nicht mehr als 2%. IC₅₀-Werte wurden durch Kurvenanpassung als diejenige Konzentration bestimmt, bei der eine 50%ige Inhibierung der Erzeugung von sCD23 relativ zur Differenz von sCD23 zwischen Kontrollen beobachtet wird, die ohne Inhibitor inkubiert wurden.
Ergebnisse
Die Verbindung von Beispiel 1 zeigte einen IC₅₀-Wert von 0,02 μM.
Die Verbindung von Beispiel 2 zeigte einen IC₅₀-Wert von 0,04 μM.
Verfahren 2: Die Fähigkeit von Testverbindungen zur Inhibierung von Matrixmetalloproteasen wurde unter Verwendung der folgenden Verfahren untersucht.
Collagenase-Inhibierungstest:
Die Wirksamkeit von Verbindungen, als Inhibitoren von Collagenase zu wirken, wurde durch das Verfahren von Cawston and Barrett bestimmt (Anal. Biochem. 99, 340–345, 1979), das hier durch Verweis eingeführt wird, wobei eine 1 mM Lösung des untersuchten Inhibitors oder Verdünnungen davon bei 37°C für 18 h mit Collagen und humaner rekombinanter Collagenase aus synovialen Fibroblasten, exprimiert und gereinigt aus E. coli (gepuffert mit 150 mM Tris, pH 7,6, enthaltend 15 mM Calciumchlorid, 0,05% Brij 35, 200 mM Natriumchlorid und 0,02% Natriumazid), inkubiert wurde. Das Collagen war acetyliertes ³H-Rindercollagen vom Typ 1, hergestellt durch das Verfahren von Cawston und Murphy (Methods in Enzymology, 80, 711, 1981). Die Proben wurden zentrifugiert, um unverdautes Collagen zu sedimentieren, und eine Teilmenge des radioaktiven Überstands zum Test an einem Szintillationszähler als Maß für die Hydrolyse entfernt. Die Collagenaseaktivität in Gegenwart von 1 mM Inhibitor oder einer Verdünnung davon wurde mit der Aktivität in einer Kontrolle verglichen, der Inhibitor fehlte, und die Ergebnisse als diejenige Konzentration angegeben, die 50% der Collagenase bewirkt (IC₅₀).
Ergebnisse
Die Verbindung von Beispiel 1 zeigte einen IC₅₀-Wert von > 10 μM in Verfahren 2.
Allgemeine MMP-Inhibierungstests:
Die Inhibierung der Matrixmetalloproteaseaktivität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzlöschungstests mit geeignetem Substrat bestimmt. Zum Beispiel wurde MMP-Aktivität unter Verwendung von MMP bestimmt, das unter Verwendung von Trypsin aktiviert wurde, gemäß Lark et al., Connective Tissue Res. 25, 52 (1990). Das MMP wird bei Raumtemperatur in einer Mikrotiterplatte in einem Gesamtvolumen von 100 μl inkubiert, enthaltend 0,15 M Tris Cl, 15 mM CaCl₂, 0,2 M NaCl, pH 7,6 (Testpuffer); Inhibitor mit Konzentrationen von bis zu 100 μM mit nicht mehr als 2% DMSO-Endkonzentration, 10 μM Substrat (wie z.B. SDP-3815-PI für MMP-1, Peptides International). Die MMP-Konzentration beträgt < 10 nM und wird empirisch mit dem geeigneten Substrat bestimmt, um eine wenigstens 20-fache Zunahme der Fluoreszenzemission in 30 min zu ergeben. Die fluoreszente Anregungswellenlänge war 355 nm, die Emissionswellenlänge 400–460 nm, und Datenpunkte werden zur Erzeugung einer Steigung gesammelt (zeitliche Veränderung der Fluoreszenz). Die prozentuale Inhibierung für jede Konzentration wird aus der Steigung zum Zeitpunkt Null und IC₅₀-Werte aus der Konzentrationsabhängigkeit berechnet. MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13 und -14 können alle in der gleichen Weise unter Verwendung kommerziell erhältlicher Substrate getestet werden, von denen angegeben wurde, daß sie wirksam für jedes Enzym sind. Enzyme wurden von Calbiochem erhalten und unter Verwendung des gleichen Trypsinverfahrens aktiviert.
Ergebnisse
Die Verbindung von Beispiel 1 zeigte einen IC₅₀-Wert von > 10 μM gegenüber MMP-3 und einen IC₅₀-Wert von 2,6 μM gegenüber MMP-13.
Die Verbindung von Beispiel 2 zeigte einen IC₅₀-Wert von 3 μM gegenüber MMP-13.
Abkürzungen
Bn – Benzyl; EtOAc – Ethylacetat; h – Stunde; min – Minuten; MCPBA – m-Chlorperoxybenzoesäure; MDC – Dichlormethan; RT – Raumtemperatur; THF – Tetrahydrofuran.

Claims

Verbindung der Formel (I):
Verbindung der Formel (IA):
Verbindung der Formel (IB):
Verwendung einer Verbindung gemäß jedem vorhergehenden Anspruch zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen, an denen die Überproduktion von s-CD23 beteiligt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen, an denen die Überproduktion von s-CD23 beteiligt ist, die eine Verbindung gemäß Ansprüchen 1 bis 3 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei das Verfahren umfasst: (a) Entschützen einer Verbindung der Formel (II):
worin P eine Schutzgruppe ist, oder (b) Formylieren einer Verbindung der Formel (III):
oder (c) Oxidieren einer Verbindung der Formel (X):
Verbindung der Formel (II):
worin P eine Schutzgruppe ist, die aus Benzyl, Tetrahydropyranyl oder p-Methoxybenzyl ausgewählt ist.
Verbindung der Formel (III):
Verbindung der Formel (X):