DE60124418T2 - Assoziation von Calpain-Inhibitoren und von reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanzen - Google Patents

Assoziation von Calpain-Inhibitoren und von reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanzen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs hemmende Substanz (ROS für "reactive oxygen species") und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Die Erfindung betrifft ferner ein Produkt, das mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs selektiv oder nicht selektiv einfangende Substanz umfasst, als Kombinationsprodukt dieser Wirkstoffe in getrennter Form.
  • Angesichts der potentiellen Rolle der Calpaine und der ROS in der Physiopathologie kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung vorteilhafte oder günstige Wirkungen bei der Behandlung von Krankheiten erzeugen, an denen diese Enzyme und/oder diese Radikalspezies beteiligt sind, und zwar insbesondere:
    • – entzündliche und immunologische Krankheiten, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Pankreatiten, Plaque-Sklerose, Entzündungen des Magen-Darm-Systems (ulzerative oder nicht ulzerative Kolitis, Crohn-Krankheit),
    • – kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Krankheiten, beispielsweise umfassend arterielle Hypertonie, septischer Schock, Herz- oder Hirninfarkte ischämischen oder hämorrhagischen Ursprungs, Ischämien sowie Störungen, die mit der Plättchenaggregation verbunden sind,
    • – Störungen des zentralen oder peripheren Nervensystems, wie z.B. neurodegenerative Krankheiten, von denen man insbesondere die Hirn- oder Rückenmarkstraumata, subarachnoidale Hämorrhagie, Epilepsie, Altern, Altersdemenzen einschließlich Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington, Parkinson-Krankheit, periphere Neuropathien nennen kann,
    • – Osteoporose,
    • – Muskeldystrophien, Kachexie,
    • – proliferative Krankheiten, wie z.B. Atherosklerose oder Restenose,
    • – Hörverlust,
    • – Katarakt,
    • – Organtransplantationen,
    • – Autoimmun- und Viruserkrankungen, wie z.B. Lupus, Aids, parasitäre und virale Infektionen, Diabetes und seine Komplikationen, Plaque-Sklerose,
    • – Krebs,
    • – alle Krankheiten, die durch eine Überproduktion der ROS und/oder eine Aktivierung der Calpaine gekennzeichnet sind.
  • Bei all diesen Krankheiten gibt es experimentelle Erkenntnisse, die die Beteiligung der ROS belegen (Free Radic. Bi ol. Med. (1996) 20, 675-705; Antioxid. Health. Dis. (1997) 4 (Handbook of Synthetic Antioxidans), 1-52) sowie die Beteiligung der Calpaine (Trends Pharmacol. Sci. (1994) 15, 412419; Drug News Perspect (1999) 12, 73-82). Beispielsweise werden Hirnverletzungen, die mit dem experimentellen Hirninfarkt oder Schädeltrauma verbunden sind, durch antioxidierende Mittel reduziert (Acta. Physiol. Scand. (1994) 152, 349-350; J. Cereb. Blood Flow Metabol. (1995) 15, 948-952; J. Pharmacol Exp Ther (1997) 2, 895-904), sowie durch Calpainhemmer (Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93, 3428-33; Stroke, (1998) 29, 152-158; Stroke (1994) 25, 2265-2270). Das Patent US 5760048 beschreibt die 3-(4-Iodphenyl)-2-mercapto-2-propansäure als Calpainhemmer. Die Anmeldung JP 2000191616 beschreibt Verbindungen mit einer doppelten, Calpaine hemmenden und freie Radikale hemmenden, Wirkung. In der Literatur wurde jedoch keine Kombination dieser beiden Wirkstoffe zu therapeutischen Zwecken, und zwar einer Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, beschrieben. Außerdem wirken diese beiden Wirkstoffe synergetisch.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die freien Radikale einfangende Substanz" die Kombination von mindestens zwei verschiedenen Einheiten, und zwar eine die Calpaine hemmende Einheit und eine die freien Radikale einfangende Einheit.
  • Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine die Calpaine hemmende Substanz und eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  • Unter dem Begriff "reaktive Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz" ist jede chemische oder enzymatische Substanz zu verstehen, die in der Lage ist, die oder eine der reaktiven Formen des Sauerstoffs, wie O2 .–, OH., RO2 ., RO., ONO2 –, NO., NO2 . oder H2O2, zu widersetzen oder diese einzufangen (Halliwell B., Gutteridge JMC., Free radicals in biology and medicine, 2nd ed., Oxford. Clarendon Press, 1989). Diese Substanzen können natürlich oder synthetisch sein und antioxidierende Eigenschaften besitzen (Santrucek and Krepelka, Antioxidans – Potential chemotherapeutic agents Drugs Future 13, 975-996, 1988; Jackson et al, Antioxidants: a biological defense mechanism for the prevention of atherosclerosis, Med. Res. Reviews 13, 161-182 (1993); Aruoma, Characterization of drugs as antioxidant prophylactics, Free Rad. Biol. Med. 20, 675-705 (1996)). Die antioxidierende Aktivität einer chemischen Substanz kann durch herkömmliche pharmazeutische Tests bestimmt werden, wie sie im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung veranschaulicht werden. Eine solche antioxidierende Substanz kann auf diese Weise bei der Lipidperoxidation (vgl. Test im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung) ein CI50 aufweisen, das kleiner als 100 μM und vorzugsweise kleiner als 10 μM ist.
  • Die Calpaine sind zytosolische proteolytische Enzyme, die zu der Familie der Cysteinproteasen gehören. Die Aktivierung der Calpaine ist eng abhängig vom Calcium (Suzuki et al. Calpain: Novel family members, activation, and physio logical fonction (1995) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 376, 523-529). Unter normalen physiologischen Bedingungen sind diese Enzyme nicht oder wenig aktiviert. Dagegen bewirkt das übermäßige Ansteigen von intrazellulärem Calcium, das bei manchen physiopathologischen Erscheinungen beobachtet wird, eine starke Aktivierung der Calpaine. Diese Aktivierung bringt die selektive Spaltung und damit den Verlust der Funktion von Proteinen des Zytoskeletts, eines Membranrezeptors oder von Transkriptionsfaktoren mit sich, der zum Zellentod und zum Abbau der Gewebe führt. Die Aktivierung der Calpaine scheint eine große und gefährliche Rolle bei mehreren Krankheiten zu spielen, wie z.B. bei neurodegenerativen Krankheiten, zerebraler Ischämie oder Muskeldystrophien, die gegebenenfalls Hemmer dieser Enzyme korrigieren könnten (Wank K et al., Calpain inhibition: an overview of its therapeutical potential (1994) Trends in Pharmacological Sciences 15, 412-419). Die hemmende Wirkung einer chemischen Substanz gegenüber den Calpainen kann durch herkömmliche pharmazeutische Tests bestimmt werden, wie sie im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden. Eine solche Calpaine hemmende Substanz kann auf diese Weise bei der Hemmung des Calpains (vgl. Test im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung) ein CI50 kleiner als 10 μM aufweisen.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Produkt, umfassend mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz als Kombinationsprodukt in getrennter Form für eine gleichzeitige oder sequentielle Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten, an denen die Calpaine und die reaktiven Formen des Sauerstoffs beteiligt sind, und zwar Krankheiten wie entzündliche und immunologische Krankheiten, kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Krankheiten, Stö rungen des zentralen Nervensystems, Osteoporose, Muskeldystrophien, Kachexie, Hörverlust, proliferative Krankheiten, Katarakt, Organtransplantationen, Autoimmun- und Viruserkrankungen, Krebs und alle Krankheiten, die durch eine Überproduktion der ROS und/oder eine Aktivierung der Calpaine gekennzeichnet sind, und vorzugsweise Störungen des zentralen oder peripheren Nervensystems, Muskeldystrophien, Kachexie, Hörverlust und Katarakt.
  • Bei einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einem Produkt gemäß der Erfindung können der Calpainhemmer und die reaktive Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz in Dosen vorliegen, die gleich oder verschieden sein können. Die Dosierungen werden in Abhängigkeit von den mit geeigneten Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen kombinierten Verbindungen gewählt.
  • Der Calpainhemmer und die reaktive Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz können gleichzeitig oder sequentiell auf demselben Verabreichungsweg oder auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungswege sind vorzugsweise oral, parenteral oder topisch.
  • Die phenolischen reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Verbindungen können auch aus den Verbindungen der allgemeinen Formel IA ausgewählt sein,
    Figure 00060001
    in der R'1 einen oder mehrere Substituenten darstellt, die aus einem Wasserstoffatom und den Resten Hydroxy, Halogen, Carboxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkenyl oder Alkoxycarbonyl ausgewählt sind, wobei die Reste Alkyl, Alkoxy und Alkenyl gegebenenfalls mit einem Hydroxy-, Halogen-, Carboxy- oder Aminorest substituiert sind; und R'2 einen oder mehrere Substituenten darstellt, die aus einem Wasserstoffatom und den Resten gegebenenfalls substituiertes Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxy, Halogen, Amino oder Carboxy ausgewählt sind. Die Verbindungen der allgemeinen Formel IA sind vorzugsweise 3-5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure, 2,3,6-Trimethyl-2-hexyloxyphenol, 2,6-di-tert-Butyl-4-methoxyphenol, 2,6-di-tert-Butyl-4-methylphenol.
  • Als Hemmer der reaktiven Formen des Sauerstoffs kann man auch die Verbindungen der Formel IVA oder VA nennen.
    Figure 00070001
    in denen R'5, R'6, R'7, R'8 und R'9 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen der Reste Alkyl, Alkoxy, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro oder -NR'11R'12 darstellen,
    R'11 und R'12 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder eine Gruppe -COR'13 darstellen oder R'11 und R'12 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten Heterocyclus bilden,
    R'13 ein Wasserstoffatom oder einen der Reste Alkyl, Alkoxy oder -NR'14R'15 darstellt,
    R'14 und R'15 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest darstellen oder R'14 und R'15 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten Heterocyclus bilden,
    R'10 ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder eine Gruppe -COR'16 darstellt,
    R'16 ein Wasserstoffatom oder einen der Reste Alkyl, Alkoxy oder -NR'17R'18 darstellt,
    R'17 und R'18 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest darstellen oder R'17 und R'18 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten Heterocyclus bilden,
    W eine Bindung, O oder S darstellt oder einen Rest -N(R'19)-, in dem R'19 ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest darstellt.
  • Als Verbindungen der Formel IVA kann man auch die Phenothiazine und insbesondere 2-Methoxyphenothiazin, die Phenoxazine und die Phenazine nennen. Als Beispiele von Verbindungen der Formel VA kann man die Diphenylamine nennen, wie z.B. 4-Hydroxydiphenylamin, 4-Aminodiphenylamin oder 4-Methoxy-N-(4-methoxyphenyl)anilin.
  • Bei den oben angeführten Definitionen stellt der Ausdruck Halogen einen der Reste Fluor, Chlor, Brom oder Iod, vorzugsweise Chlor, Fluor oder Brom dar. Unter Alkyl, wenn es nicht genauer angegeben ist, oder Niederalkyl versteht man einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. die Reste Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl, Pen tyl, Neopentyl, Isopentyl, Hexyl, Isohexyl. Die Reste Alkoxy, wenn es nicht genauer angegeben ist, oder Niederalkoxy können den oben genannten Alkylresten entsprechen, wie z.B. den Resten Methoxy, Ethoxy, Propyloxy oder Isopropyloxy, aber auch sekundärem oder tertiärem linearen Butoxy. Der Begriff Niederalkylthio bezeichnet vorzugsweise die Reste, bei denen der Alkylrest so beschaffen ist wie oben definiert wurde, wie z.B. Methylthio, Ethylthio.
  • Unter Alkenyl, wenn es nicht genauer angegeben ist, oder Niederalkenyl versteht man einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, der mindestens eine Unsättigung (eine oder mehrere Doppelbindungen) aufweist. Beispielsweise kann man die Gruppen Vinyl, Allyl, Propenyl, Isopropenyl, Pentenyl, Butenyl, Hexanyl, Propenyl und Butadienyl nennen. Der Begriff Cycloalkyl bezeichnet vorzugsweise die Ringe Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl.
  • Der Ausdruck Aryl stellt einen aromatischen Rest dar, der aus einem oder mehreren kondensierten Ringen besteht, wie z.B. einen Phenyl- oder Naphtylrest. Der Begriff Aryloxy bezeichnet vorzugsweise die Reste, bei denen der Arylrest so beschaffen ist, wie oben definiert wurde, wie z.B. den Phenoxyrest. Der Ausdruck Heteroaryl bezeichnet einen aromatischen Rest, der aus einem oder mehreren kondensierten Ringen besteht, mit mindestens einem Ring, der ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Heteroatome enthält, die aus Schwefel, Stickstoff oder Sauerstoff ausgewählt sind. Als Beispiel eines Heteroarylrests kann man die Reste Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isothiazolyl, Thiazolyl, Isoxazolyl, Oxazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidyl, Chinolinyl, Benzothienyl, Benzofuryl und Indolyl nennen.
  • Der Begriff Heterocycloalkyl stellt vorzugsweise einen mono- oder bicyclischen gesättigten Heterocyclus mit 1 bis 5 aus O, S, N ausgewählten Heteroatomen dar. Als Beispiel kann man nennen: Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Oxetan, Tetrahydrothiophen, Tetrahydrothiopyran, Thietan, Pyrrolidin, Piperidin, Azetidin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dioxolan, 1,3-Dithiolan, 1,3-Dithian, 1,3-Oxathiolan, 1,3-Oxazolidin, 1,3-Imidazolidin oder 1,3-Thiazolidin.
  • Der Begriff Arylalkyl (oder Aralkyl) bezeichnet einen Rest, bei dem die Reste Aryl bzw. Alkyl so beschaffen sind, wie oben definiert wurde, wie z.B. Benzyl, Phenethyl oder Naphtylmethyl. Die Reste Alkoxycarbonyl, (Alkyl)aminocarbonyl und (Dialkyl)aminocarbonyl bezeichnen die Reste, bei denen die Reste Alkyl bzw. Alkoxy die oben angegebene Bedeutung haben. Die Begriffe Alkylcarbonylaminoalkyl, Aryloxyalkyl, Arylalkoxy, Heteroarylalkyl, Cycloalkylalkyl bezeichnen die Reste, bei denen die Reste Alkyl, Aryloxy, Aryl, Heteroaryl und Cycloalkyl so sind, wie oben definiert wurde.
  • Im Fall von Resten der Formel -NRiRj, in denen Ri und Rj zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten Heterocyclus bilden, ist der Heterocyclus vorzugsweise gesättigt und umfasst 4 bis 7 Kettenglieder und 1 bis 3 Heteroatome, die das bereits vorhandene Stickstoffatom einschließen, wobei die zusätzlichen Heteroatome unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den Atomen O, N und S besteht. Dieser Heterocyclus kann beispielsweise der Ring Acetidin, Pyrrolidin, Piperidin, Piperadin, Morpholin oder Thiomorpholin sein. Dieser Heterocyclus kann mit einem oder mehreren gleichen oder verschiedenen Substituenten substi tuiert sein, die aus einem der Reste Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aralkyl, Hydroxy oder Halogen ausgewählt sind.
  • Je nach der Definition der variablen Gruppen kann eine Verbindung der Formel IB, wie sie oben definiert wurde, einen oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffe aufweisen. Die Erfindung betrifft die Verbindungen der Formel IB, wie sie oben definiert wurde, die in racemischer Form oder in Form von Enantiomeren oder Diastereoisomeren vorliegen können.
  • Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie es oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass der Calpainhemmer der Formel (IB) T-NH-CH(R1)-C(O)-NH-CH(R2)-C(O)-[NH-CH(R3)-C(O)]n-Y (IB)entspricht, wie sie oben definiert wurde und in der
    R1, R2 und R3 unabhängig voneinander einen Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind aus: Hydroxy, Mercapto, Niederalkylthio, Carboxy, Aminocarbonyl, Amino, Guanidino oder Phenyl, Indol oder gegebenenfalls substituiertes Imidazol,
    wobei der oder die Substituenten der Reste Phenyl, Indol und Imidazol ausgewählt sind aus: Halogen, Hydroxy, Niederalkyl oder Niederalkoxy;
    Y ein Wasserstoffatom oder einen Rest -C(O)-Ry oder -C(O)-O-R'y darstellt, in dem
    Ry einen Rest Niederalkyl oder -N(Ry1)(Ry2) darstellt; R'y einen Niederalkylrest oder Benzyl darstellt;
    Ry1 ein Wasserstoffatom darstellt und Ry2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen der Reste Niederalkyl, Niederalkoxy, Arylniederalkyl, Heteroarylniederalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl darstellt, wobei diese Reste mit einem oder mehreren gleichen oder verschiedenen Substituenten substituiert sein können, die ausgewählt sind aus: Halogen, Hydroxy, Trifluormethyl, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, (Niederalkyl)amino, di(Niederalkyl)amino, Aryloxy, Arylalkoxy;
    n 0 oder 1 darstellt;
    T einen Rest der Formal -C(O)-O-Rt1 oder -C(O)-Rt2 darstellt, in der
    Rt1 einen Rest Niederalkyl, Benzyl, Phenethyl darstellt;
    Rt2 einen Rest Niederalkyl, Niederarylalkyl, Aryloxyniederalkyl oder Heteroaryl darstellt.
  • In sehr bevorzugter Weise ist Gegenstand der Erfindung eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie es oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass der Calpainhemmer der Formel (IB) entspricht T-NH-CH(R1)-C(O)-NH-CH(R2)-C(O)-[NH-CH(R3)-C(O)]n-Y (IB)wie sie oben definiert wurde und in der
    R1 und R2 unabhängig voneinander einen Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit einem Phenylrest substituiert ist, der seinerseits gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy substituiert ist;
    Y ein Wasserstoffatom darstellt;
    T einen Rest der Formel -C(O)-O-Rt1 darstellt, in dem Rt1 einen Niederalkyl- oder Benzylrest darstellt und n = 0.
  • Gegenstand der Erfindung ist vorzugsweise eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie es oben definiert wurde, in dem die reaktive Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure, 2,3,6-Trimethyl-2-hexyloxyphenol, 2,6-di-tert-Butyl-4-methoxyphenol, 2,6-di-tert-Butyl-4-methylphenol, 2-Methoxy-10H-phenothiazin, 4-Hydroxydiphenylamin, 4-Aminodiphenylamin, 4-Methoxy-N-(4-methoxyphenyl)anilin.
  • Gegenstand der Erfindung ist insbesondere auch eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie es oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist. Die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ist vorzugsweise aus den Phenolverbindungen der Formel IA, wie sie oben definiert wurde, den Phenothiazinen der Formel IVA, wie sie oben definiert wurde, und den Diphenylaminen der Formel VA, wie sie oben definiert wurde, ausgewählt.
  • Gegenstand der Erfindung ist insbesondere auch eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie es oben definiert wurde, in dem
    die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus: 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure (BHT), 2-Methoxy-10H-phenothiazin und 4-Hydroxydiphenylamin; und
    die Calpaine hemmende Zusammensetzung ausgewählt ist aus: (1S)-1-1({[(1S)-1-Formyl-3-methylbutyl]amino} carbonyl)-3-methylbutylbenzylcarbamat (oder Z-Leu-Leu-H), (1S)-1-{[(1-Benzyl-2-oxoethyl)amino]carbonyl}-3-methylbutylbenzylcarbamat (oder Z-Leu-Phe-H), dem Benzylester der [1-[[(1-Formylpentyl)amino]carbonyl]-3-methylbutyl]carbaminsäure (Calpeptin).
  • Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung der Störungen des zentralen oder peripheren Nervensystems, der Muskeldystrophien, der Kachexie, des Hörverlusts und des Katarakts bestimmt ist. Die die Calpaine hemmende Substanz entspricht der Formel IB, wie sie oben definiert wurde. Die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ist vorzugsweise aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt, und insbesondere ist die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz aus den Phenolverbindungen der Formel IA, wie sie oben definiert wurde, den Phenothiazinen der Formel IVA, wie sie oben definiert wurde, und den Diphenylaminen der Formel VA, wie sie oben definiert wurde, ausgewählt.
  • Die die Calpaine hemmenden und die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Verbindungen sind im Handel erhältlich oder können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden (oder analog zu diesen) (J. Med. Chem., Vol. 37, 2918-2929 (1994); TIPS, Vol. 11, 139-142 (1990); TIBS, Vol. 16, 150-153 (1991); Br. J. Pharmacol., Vol. 110, 369-377 (1993)).
  • Alle in dem vorliegenden Text verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe haben die dem Fachmann bekannte Bedeutung.
  • Experimenteller Teil
  • Die folgenden Beispiele werden vorgelegt, um die vorstehenden Verfahren zu illustrieren, und dürfen in keinem Fall als eine Begrenzung der Reichweite der Erfindung betrachtet werden.
  • A sei die die reaktiven Formen des Sauerstoffs hemmende Substanz und B der Calpainhemmer.
  • Beispiel 1
  • Verbindung AB, Kombination der Verbindung A: 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure (BHT), freie Sauerstoffradikale einfangendes Antioxidans, und der Verbindung B: Z-Leu-Leu-H, Calpainhemmer.
  • Beispiel 2
  • Verbindung AB, Kombination der Verbindung A: 2-Methoxy-10H-phenothiazin, freie Sauerstoffradikale einfangendes Antioxidans, und der Verbindung B: Z-Leu-Phe-H, Calpainhemmer.
  • Beispiel 3
  • Verbindung AB, Kombination der Verbindung A: 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure (BHT), freie Sauerstoffradikale einfangendes Antioxidans, und der Verbindung B: Calpeptin, ein Calpainhemmer.
  • Beispiel 4
  • Verbindung AB, Kombination der Verbindung A: 4-Hydroxydiphenylamin, freie Sauerstoffradikale einfangendes Antioxidans, und der Verbindung B: Z-Leu-Leu-H, ein Calpainhemmer.
  • Beispiel 5
  • Verbindung AB, Kombination der Verbindung A: 2-Methoxy-10H-phenothiazin, freie Sauerstoffradikale einfangendes Antioxidans, und der Verbindung B: Calpeptin, ein Calpainhemmer.
  • Pharmakologische Untersuchung
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden einigen biologischen Tests in vitro unterzogen, um ihre Aktivität, das Calpain zu blockieren und die freien Radikale einzufangen, zu belegen. Ihre Aktivität wurde an enzymatischen Tests und an einem Modell des Schutzes gegen den Zelltod ermittelt. Bei diesem Modell wird der Zelltod durch Nekrose durch Maitotoxin induziert (J Neurochem. 1999, 72 (5): 1853-1863, Mc Ginnis et al). Maitotoxin ist ein marines Toxin, das die Calciumkanäle aktiviert (Biochem. Pharmacol 1990, 39: 1663-1639, Gusovsky et al). Daraus ergibt sich eine Erhöhung des intrazellulären Calciums in den C6-Gliazellen der Ratte um das 10 bis 20-fache (Chem Res Toxicol 1999:12:993-1001, Konoki et al). Die Behandlung von menschlichen Neuroblastomen SHSY5Y mit Maitotoxin induziert eine Aktivierung der Aktivität des Calpains über die Erhöhung des intrazellulären Calciums (Archiven of Biochemistry and Biophysics, 331 (2): 208-214, Wang et al). Calpaine sind zytosolische Cysteinproteasen, die Calcium unbedingt benötigen, um aktiviert zu sein. Zwei Isoformen von Calpainen sind in den Geweben ubiquitär verteilt. Das Calpain I oder "μ" und das Calpain II oder "m", die eine Calciumkonzentration μM oder mM erfordern, um aktiviert zu sein.
  • Bei dem in-situ-Modell der durch Maitotoxin induzierten Nekrose findet eine Stimulierung des Calpains und eine Erzeugung von reaktiven Formen des Sauerstoffs statt. Die partiell schützende Wirkung des Calpainhemmers oder der reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz gegenüber der Nekrose ist belegt. Die Wirkungen der Kombination wurden mit denjenigen verglichen, die durch eine Behandlung mit dem Calpainhemmer oder der reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz allein erzeugt werden. Die Kombination eines Calpainhemmers und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz zeigt eine signifikante Schutzwirkung gegenüber der durch Maitotoxin induzierten Nekrose im Vergleich zu der Wirkung des Calpainhemmers oder der die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, getrennt eingenommen, und bei den verwendeten Dosen. Dies belegt die Synergie zwischen dem Calpainhemmer und der die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz.
  • 1) Untersuchung der Wirkungen auf das menschlichen Calpain I
  • Der Test besteht darin, dass die Aktivität des Enzyms (gereinigtes Enzym aus menschlichen Erythrozyten) gemessen wird, das in einem Puffer in Gegenwart eines an ein Fluorochrom (Aminomethylcourmarin, AMC) gekoppelten Peptidsubstrats und von Calcium inkubiert wird. Das durch das Calcium aktivierte Enzym proteolysiert das Substrat und setzt das Fragment AMC frei. Das freigesetzte AMC fluoresziert bei 460 nm unter einer Erregung mit 380 nm. Die Aktivität des Enzyms ist also proportional zu der Menge an Fluoreszenz, d.h. an freiem Fragment AMC. Die Fluoreszenz (380/460 nm) wird mit Hilfe eines Fluorimeters mit mehreren Vertiefungen gemessen (Victor 2, Wallac).
  • Die Dosierung findet in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit transparentem Boden und schwarzen Wänden statt, in die 10 μl pro Vertiefung Testsubstanz in DMSO 10 %, 45 μl Reaktionsmischung, die menschliches Calpain I zu 2,2 U/ml (Calbiochem, ref: 208713), das Substrat Suc Leu Tyr-AMC (Bachem, ref: I-1355), zu 1,1 mM in Puffer (Tris-HCl 110 mM, NaCl 110 mM; EDTA 2,2 mM; EGTA 2,2 mM, Mercaptoethanol 1,1 mM) enthält, verteilt werden. Die Reaktion wird initiiert, indem 45 μl CaCl2 22 mM zugesetzt werden. Zur Bestimmung des Hintergrundrauschens werden auf der Platte Vergleichsvertiefungen ohne Calcium hinzugefügt (10 μl DMSO 10 + 45 μl Puffer mit dem Enzym und dem Substrat + 45 μl H2O). Zur Bestimmung der Gesamtaktivität des Enzyms werden auf der Platte Vergleichsvertiefungen ohne Produkt hinzugefügt (10 μl DMSO 10 % + 45 μl Puffer mit dem Enzym und dem Substrat + 45 μl CaCl2 22 mM). Jede Konzentration der Produkte (0,1 nM bis 10 μM) wird in Duplikaten getestet. Die Platten werden bewegt und die Inkubation findet während ei ner Stunde bei 25°C unter Dunkelheit statt. Die Fluoreszenz wird bei 380/460 nm mit Hilfe des Victors abgelesen.
  • Die Ergebnisse sind ausgedrückt in CI50-Werten und sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst.
  • 2) Wirkung in situ auf die Calpainaktivität in menschlichen Neuroblastomen (SHSY5Y) und in Rattengliazellen (C6)
  • Die menschlichen Neuroblastome SHSY5Y und die C6-Gliazellen von Ratten werden jeweils zu 50 000 bzw. 25 000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in DMEM 10 % FBS eingeimpft. Am darauf folgenden Tag werden die Zellen, bei denen es zu einer Haftung kam, 3 mal in DMEM-Medium ohne Serum um 40 mM Hepes gewaschen. Hundert Mikroliter des Produkts B werden in die Vertiefungen eingebracht. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C unter einer 5%-igen CO2-Atmosphäre werden 10 μl zugesetzt, die das fluoreszierende Substrat des Calpains (Suc-Leu-Tyr-RMC) und Maitotoxin (Sigma, ref: M-9159) enthalten, um eine Endkonzentration in der Vertiefung von 100 μM bzw. 1 nM zu erhalten.
  • Zur Bestimmung der Gesamtaktivität des zellulären Enzyms werden auf der Platte Vertiefungen ohne Produkt hinzugefügt (100 μl DMSO 100stel plus 10 μl MTX und Substrat). Das Hintergrundrauschen wird bestimmt, indem Kontrollvertiefungen ohne MTX hinzugefügt werden. Jede Konzentration der Produkte (0,3 μM bis 200 μM bei den SHSY5Y und 0,01 μM bis 100 μM bei den C6) wird dreifach getestet. Die Platten werden bewegt, die Fluoreszenz wird bei 380/460 nm mit Hilfe des Victors bei T null gemessen. Die Inkubation findet bei SHSY5Y während vier Stunden und bei den C6-Zellen eine Stunde dreißig Minuten bei 30°C unter Dunkelheit statt.
  • Die Ergebnisse sind in CI50-Wert ausgedrückt und in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Aktivität der enzymatischen Hemmung der Verbindungen A und B
    Figure 00200001
    • (Das Leupeptin sowie die Beispiele 3 bis 5 wurden nur hinsichtlich der Hemmung des azellulären menschlichen Calpains I getestet.)
  • 3) Wirkung in vitro auf die Lipid-Lipoperoxidation
  • Der Test besteht darin, dass die Lipidperoxidation durch die Fenton-Reaktionen in Gegenwart von Eisen und Ascorbat induziert wird. Der Grad der Lipidperoxidation wird durch die Konzentration an Malonaldehyd (MDA) bestimmt. Der durch die Lipidperoxidation der ungesättigten Fettsäuren erzeugten MDA ist ein guter Indikator für die Lipidperoxidation (Esterbauer et al., 1990; Meth. Enzymol. 186: 407-421). Bei diesem kolorimetrischen Test erzeugt die Kondensation eines MDA-Moleküls mit zwei Molekülen eines chromogenen Reagens R (N-Methyl-2-phenylindol) einen stabilen Chromophor, dessen Wellenlänge maximaler Absorbanz gleich 586 nM ist.
  • Die Membranen werden aus Hirnrinde von männlichen Ratten Sprague Dawley von 200 bis 250 g hergestellt. Die Tiere werden durch Köpfen getötet und die Gehirne werden sofort entnommen und in kaltem Tris HCl 20 mM, pH 7,4, gespült. Die Hirnrinde, seziert und von der weißen Substanz befreit, werden dann im Thomas-Potter in Puffer Tris HCl 20 mM, pH 7,4, bei 4°C zerkleinert. Das erhaltene Mahlgut wird mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um die großen Bruchstücke zu entfernen (515 g während 15 Minuten bei 4°C). Der Überstand wird dann in Zentrifugationsgläser aus Polycarbonat verteilt und während 25 min bei 4°C mit 51 500 g zentrifugiert. Die Membranrückstände werden bei –80°C gelagert.
  • Am Tag des Tests werden die tiefgefrorenen Membranen mit der Konzentration von 0,5 Grammäquivalent Hirnrinde pro 5 ml Puffer Tris HCl 20 mM, pH 7,4, wieder in Suspension gebracht und mit Hilfe eines Combitips homogenisiert. In Platten mit 96 Vertiefungen "deep-well", 1 ml Polypropylen mit konischem Boden, werden 5 μl Testprodukt oder Lösungsmittel pro Vertiefung mit 40 μl Rattenhirnrindenhomogenat durch Zentrifugation (800 U/min) gemischt. Die Platten werden mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie bedeckt und bei 37°C während 15 min unter Rühren inkubiert. Die Lipidperoxidationsreaktion wird mit Hilfe der Fentonreaktion durch Zusatz von 5 μl der Peroxidationsmischung pro Vertiefung initiiert, die EDTA zu 1 mM, Ascorbinsäure zu 4 mM und FeCl2 zu 1 mM enthält, um MDA zu bilden. Die Platten werden kurz zentrifugiert (800 U/min) und mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie bedeckt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C unter Rühren werden 160 μl einer Entwicklermischung, die 3 Volumen des homogenen Reagens R und ein Volumen Methanol enthält, pro Vertiefung zugesetzt. Nach 10 Sekunden Rühren werden 40 μl HCl 37% pro Vertiefung zugesetzt. Die Entwicklung des gebildeten MDA wird nach einer Inkubation der Membranen während 3/4 h bei 45°C erhalten.
  • Die Abtrennung der Membranen und des Überstands geschieht durch Filtration unter Vakuum auf einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Filterboden Multiscreen NA (Millipore, ref: MANANLY 50).
  • Die Absorbanz des gewonnenen Überstands in den Platten mit 95 Vertiefungen wird mit Hilfe eines Fotometers abgelesen.
  • Die Ergebnisse sind in CI50-Wert ausgedrückt und sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst.
  • 4) Wirkung in situ auf den Gehalt an Isoprostanen (8-isoPG1F2α)
  • 8-isoPG1F2α ist Teil einer Familie von Verbindungen, deren erster Syntheseschritt (Peroxidation der Arachidonsäure) nicht enzymatisch in Gegenwart von freien Radikalen stattfindet (Morrow u. Mitarb., 1990). Die Messung der Gehalte an 8-iso PGF2α wird als ein zuverlässiger Indikator des oxidativen Stresses betrachtet.
  • Die C6-Rattengliazellen wurden zu 25 000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in DMEM 10 % FBS eingeimpft. Am folgenden Tag werden 100 μl des Produkts A in die Vertiefungen eingebracht. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C unter einer 5 %-igen CO2-Atmosphäre werden Maitotoxin enthaltende 10 μl zugesetzt, um eine Endkonzentration in der Vertiefung von 1 nM zu erhalten. Nach 3 Stunden Inkubation werden die Überstände entnommen und auf –20°C tiefgefroren. Die Gehalte an 8-isoPG1F2α werden mit Hilfe eines spezifischen EIA-Dosierkits gemessen (Cayman chemical, ref: 516351).
  • Die Ergebnisse sind im CI50-Wert (μM) ausgedrückt und sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Aktivität der enzymatischen Hemmung der Verbindungen A und B
    Figure 00240001
    • (Das Leupeptin sowie die Beispiele 3 bis 5 wurden nur hinsichtlich der Hemmung der Lipidperoxidation getestet.)
  • 5) Wirkung in vitro auf die durch Maitotoxin induzierte Nekrose
  • Die menschlichen Neuroblastome SHSY5Y und die C6-Rattengliazellen werden zu 25 000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in DMEM 10 % FBS während 24 h eingeimpft. Die Rattenmyoblasten L6 werden zu 1000 Zellen pro Vertiefung in DMEM 10 % FBS auf Mikroplatten mit 96 Vertiefungen, die zuvor mit Gelatine 0,5 % PBS beschichtet wurden, eingeimpft. Nach 3 Tagen Kultur wird das Medium entfernt und durch ein Differenzierungsmedium (DMEM + 10 μg/ml Insulin + 100 μg/ml Transferrin) ersetzt. Es werden 50 μl des Produkts A plus 50 μl Lösungsmittel oder 50 μl des Produkts B in die Vertiefungen eingebracht. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C unter einer 5 %-igen CO2-Atmosphäre werden 10 μl Maitotoxin zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,1 bis 1 nM (je nach Zellentyp) zu erhalten. Nach 3 h Inkubation bei 37°C unter einer 5 %-igen CO2-Atmosphäre wird die Zellenviabilität durch Zusatz von 10 μl Tetrazoliumsalzen (wst-1, Roche, ref: 1644807) bestimmt. Die Tetrazoliumsalze werden durch mitochondriale Deshydrogenasen in Formazanmoleküle aufgespalten. Die Menge des gebildeten Formazans wird direkt mit den Anzahlen von metabolisch aktiven Zellen in der Kultur korreliert. Die Messung der Absorbanz des Formazans wird mit Hilfe eines Fotometers mit mehreren Vertiefungen bei einer Wellenlänge von 420 nm gegen eine Bezugswellenlänge von 620 nm durchgeführt. Die Ergebnise sind in Prozent des Schutzes vor durch Maitotoxin 0,1 nM induzierter Nekrose ausgedrückt und sind in den nachstehenden Tabellen 4 und 5 zusammengefasst.
  • Die theoretische Wirkung wurde erhalten, indem der Prozentsatz toter Zellen in Gegenwart des Produkts A mit dem Prozentsatz toter Zellen in Gegenwart des Produkts B multipliziert wurde (Tabelle 3). Der Prozentsatz des Schutzes vor durch MTX induziertem Zelltod ist der Prozentsatz am Leben gebliebener Zellen in Gegenwart des oder der Produkte. Tabelle 3: Bestimmung der Interaktion der Verbindungen A und B
    Figure 00260001
  • In einer ersten Reihe von Tests ist die Konzentration des Produkts A in Beispiel 1 fest (100 μM), das Produkt B wird in Konzentrationen von null bis 100 μM variierend zugesetzt (Tabelle 4A). In einer zweiten Reihe von Tests ist das Produkt B des Beispiels 1 auf 100 μM festgelegt, das Produkt A wird in Konzentrationen von null bis 100 μM variierend zugesetzt (Tabelle 4B). Die stärkste Synergie zwischen dem Produkt A und dem Produkt B bei dem Schutz der Zellen SHSY5Y vor der durch MTX induzierten Nekrose zeigt die Kombination mit 100 μM jedes der Produkte. Tabelle 4: Schutz vor durch Maitotoxin 0,1 nM induzierter Nekrose bei menschlichen Neuroblastomen SHSY5Y (n=2) Tabelle 4A: Interaktion der Verbindung A (BHT) (feste Konzentration von 100 μM) in Gegenwart von veränderlichen Konzentrationen der Verbindung B (Z-Leu-Leu-H).
    Figure 00270001
    Tabelle 4B: Interaktion der Verbindung B (Z-Leu-Leu-H) fest (100 μM) in Gegenwart von variablen Konzentrationen der Verbindung A (BHT).
    Figure 00280001
  • In Anbetracht der vorhergehenden Ergebnisse wird die Kombination des Beispiels 1 mit dem Produkt A und dem Produkt B zu 100 μM von jedem der Produkte an den menschlichen Neuroblastomen (SHSY5Y; Tabelle 5A) und an den Gliazellen mit 25 μM Produkt A und 50 μM Produkt B (C6; Tabelle 5B) in einer größeren Anzahl von Fällen durchgeführt. Tabelle 5: Synergetische Interaktion der Verbindungen A und B bei dem Schutz vor Nekrose. Tabelle 5A:
    Figure 00290001
  • Die Ergebnisse der Tabelle 5A, Beispiel 1, zeigen, dass der in der Konzentration von 100 μM verwendete Calpainhemmer Z-Leu-Leu-H hinsichtlich des Schutzes der menschlichen Neuroblastome (SHSY5Y) vor durch Maitotoxin induzierter Nekrose inaktiv ist. Desgleichen ist die 3-5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure, die als die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz verwendet wird, bei einer Dosis von 100 μM schwach aktiv (weniger als 20 %). Dagegen schützt die Kombination der beiden Verbindungen signifikant im Verhältnis zu den beiden getrennt getesteten Verbindungen. Diese Wirkung ist synergetisch, da der Prozentsatz an Schutz, der durch Kombinieren der beiden Verbindungen erhalten wird, höher als die errechnete theoretische Wirkung ist (Tabelle 3 und 5A, Beispiel 1). Tabelle 5B:
    Figure 00300001
    • (( a ) n = 1 bei den Beispielen 1 und 3 bis 5 und n = 3 bei Beispiel 2)
  • Ebenso wie bei der Tabelle 5A zeigen die Ergebnisse der Tabelle 5B Beispiel 1, dass der in der Konzentration von 50 μM verwendete Calpainhemmer Z-Leu-Leu-H hinsichtlich eines wirksamen Schutzes der Rattengliazellen (C6) vor durch Maitotoxin induzierter Nekrose inaktiv ist. Ebenso ist die als die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz verwendete 3-5-di-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure in der Dosis von 25 μM schwach aktiv (etwa 20 %). Dagegen schützt die Kombination der beiden Verbindungen im Verhältnis zu den beiden getrennt getesteten Verbindungen (43 %). Diese Wirkung ist synergetisch, da der durch Kombinieren der beiden Verbindungen erhaltene Schutzprozentsatz höher als die errechnete theoretische Wirkung ist (Tabelle 3 und 5B, Beispiel 1).
  • Die synergetische Wirkung eines Anti-ROS und eines Anticalpains hinsichtlich des Schutzes vor durch MTX induzierter Nekrose wurde bei Gliazellen mit einem anderen Antioxidans und einem anderen Calpainhemmer überprüft (Beispiel 2, Tabelle 5B).
  • Auf dieselbe Weise sind das freie Sauerstoffradikale einfangende Oxidans 2-Methoxy-10H-phenothiazin und der Calpainhemmer Z-Leu-Phe-H in einer Dosis von 50 μM hinsichtlich des Schutzes der Rattengliazellen (C6) vor durch Maitotoxin induzierter Nekrose inaktiv. Dagegen zeigt die Kombination von 2-Methoxy-10H-phenothiazin mit Z-Leu-Phe-H (Tabelle 5B, Beispiel 2) einen hochsignifikanten Schutz im Vergleich zu den beiden getrennt getesteten Verbindungen sowie zu der theoretischen Kombination. Diese Wirkung ist signifikant synergetisch, da der durch Kombinieren der beiden Verbindungen erhaltene Schutzprozentsatz signifikant höher als die errechnete theoretische Wirkung ist (Tabelle 3 und 5B).
  • Die synergetische Wirkung von anderen Antioxidantien und anderen Calpainhemmern wurde ebenfalls an Gliazellen getestet (Beispiele 3 bis 5, Tabelle 5B). Beispiel 5 wurde an einer anderen Zelllinie, insbesondere Skelettmuskelzellen von Ratten wiederholt (zu Myotuben differenzierte Myoblasten; Tabelle 5C). In diesen Beispielen schützen die Produkte A und B für sich wenig vor durch Maitotoxin induzierter Zellennekrose, wohingegen die Kombination der beiden Verbindungen im Verhältnis zu den beiden getrennt getesteten Verbindungen schützt. Diese Wirkungen sind synergetisch, da der durch Kombinieren der beiden Verbindungen erhaltene Schutzprozentsatz höher als die errechnete theoretische Wirkung ist (Tabelle 3, 5B, Beispiele 3 bis 5 und 5C, Beispiel 5). Tabelle 5C:
    Figure 00320001

Claims (11)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz und ggf. einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, dadurch gekennzeichnet, dass – die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus: den Phenolverbindungen der Formel IA
    Figure 00330001
    in der R'1 einen oder mehrere Substituenten darstellt, die aus den Resten Carboxy und Niederalkyl ausgewählt sind; den Phenothiazinen und den Diphenylaminen der Formel IVA oder VA
    Figure 00330002
    in der R'5, R'6, R'7, R'8, R'9 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen der Reste Alkyl, Alkoxy, Hydroxy darstellen; und – der Calpainhemmer der Formel (IB) entspricht T-NH-CH(R1)-C(O)-NH-CH(R2)-C(O)-[NH-CH(R3)-C(O)]n-Y (IB)in der R1 und R2 unabhängig voneinander einen Alkylrest darstellen, der ggf. mit einem Phenylrest substituiert ist, der seinerseits ggf. mit Halogen, Hydroxy substituiert ist; Y das Wasserstoffatom darstellt; T einen Rest der Formel -C(O)-O-Rt1 darstellt, in der Rt1 einen Niederalkyl- oder Benzylrest darstellt und n = 0, wobei gilt, dass die Begriffe "Alkyl", "Niederalkyl" und "Alkoxy" 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff eine die Calpaine hemmende Substanz und eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz und ggf. einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus: 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxybenzoesäure (BHT), 2-Methoxy-10H-phenothiazin und 4-Hydroxydiphenylamin; und die Calpaine hemmende Substanz ausgewählt ist aus: (1S)-1-({[(1S)-1-Formyl-3-methylbutyl]amino}carbonyl)-3-methylbutylbenzylcarbamat, (1S)-1-{[(1-Benzyl-2-oxoethyl)amino]carbonyl}-3-methylbutylbenzylcarbamat und der Benzylester der [1-[[(1-Formylpentyl)amino]carbonyl]-3-methylbutyl]carbaminsäure (Calpeptin).
  4. Produkt, umfassend mindestens eine die Calpaine hemmende Substanz und mindestens eine die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz als Kombinationsprodukt in getrennter Form für eine gleichzeitige oder sequenzielle Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten, die aus den entzündlichen und immunologischen Krankheiten, den kardiovaskulären und zerebrovaskulären Krankheiten, den Störungen des Zentralnervensystems, Osteoporose, Muskeldystrophien, Kachexie, Hörverlust, den proliverativen Krankheiten, Katarakt, Organtransplantationen, Autoimmun- und Viruserkrankungen und Krebs ausgewählt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus: den Phenolverbindungen der Formel IA
    Figure 00350001
    in der R'1 einen oder mehrere Substituenten darstellt, die aus den Resten Carboxy und Niederalkyl ausgewählt sind; den Phenothiazinen und den Diphenylaminen der Formel IVA oder VA
    Figure 00360001
    in der R'5, R'6, R'7, R'8, R'9 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen der Reste Alkyl, Alkoxy, Hydroxy darstellen; und – der Calpainhemmer der Formel (IB) entspricht T-NH-CH(R1)-C(O)-NH-CH(R2)-C(O)-[NH-CH(R3)-C(O)]n-Y (IB)in der R1 und R2 unabhängig voneinander einen Alkylrest darstellen, der ggf. mit einem Phenylrest substituiert ist, der seinerseits ggf. mit Halogen, Hydroxy substituiert ist; Y das Wasserstoffatom darstellt; T einen Rest der Formel -C(O)-O-Rt1 darstellt, in der Rt1 einen Niederalkyl- oder Benzylrest darstellt und n = 0, wobei gilt, dass die Begriffe "Alkyl", "Niederalkyl" und "Alkoxy" 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten.
  5. Produkt nach Anspruch 4 für die Behandlung der Störungen des zentralen oder peripheren Nervensystems, der Muskeldystrophien, der Kachexie, des Hörverlusts, des Katarakts.
  6. Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz ausgewählt ist aus: 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxybenzoesäure (BHT), 2-Methoxy-10H-phenothiazin und 4-Hydroxydiphenylamin; und die Calpaine hemmende Substanz ausgewählt ist aus: (1S)-1-({[(1S)-1-Formyl-3-methylbutyl]amino}carbonyl)-3-methylbutylbenzylcarbamat, (1S)-1-{[(1-Benzyl-2-oxoethyl)amino]carbonyl}-3-methylbutylbenzylcarbamat und der Benzylester der [1-[[(1-Formylpentyi)amino]carbonyl]-3-methylbutyl]carbaminsäure (Calpeptin).
  7. Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, die aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung der Muskeldystrophien bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die die Calpaine hemmende Substanz der Formel IB entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz den Formeln IA, IVA oder VA entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
  8. Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Sub stanz, die aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung der Kachexie bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die die Calpaine hemmende Substanz der Formel IB entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz den Formeln IA, IVA oder VA entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
  9. Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, die aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung des Hörverlusts bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die die Calpaine hemmende Substanz der Formel IB entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz den Formeln IA, IVA oder VA entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
  10. Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, die aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung des Katarakts bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die die Calpaine hemmende Substanz der Formel IB entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz den Formeln IA, IVA oder VA entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
  11. Verwendung einer die Calpaine hemmenden Substanz und einer die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanz, die aus den Phenolverbindungen, den Phenothiazinen und den Diphenylaminen ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung der Störungen des zentralen oder peripheren Nervensystems bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die die Calpaine hemmende Substanz der Formel IB entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert, ist, und die die reaktiven Formen des Sauerstoffs einfangende Substanz den Formeln IA, IVA oder VA entspricht, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
DE60124418T 2000-11-15 2001-11-14 Assoziation von Calpain-Inhibitoren und von reaktive Formen des Sauerstoffs einfangenden Substanzen Expired - Lifetime DE60124418T2 (de)

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