DE60026826T2

DE60026826T2 - Alterungsschutztetrapeptid, dieses enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen und seine verwendung

Info

Publication number: DE60026826T2
Application number: DE60026826T
Authority: DE
Inventors: Vladimir Khatskelevich St.Petersburg KHAVINSON
Original assignee: OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTIJU "KLINIKA INSTITUT A BIOREGULYATSII I GERONTOLOGII"
Current assignee: OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTIJU "KLINIKA INSTITUT A BIOREGULYATSII I GERONTOLOGII"
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: JP3902406B2; WO2000068255A3; RU2157233C1; AU769847C; DE60026826D1; ATE321068T1; EP1179008B1; US6727227B1; IL146432A; EP1179008A2; AU769847B2; WO2000068255A2; IL146432A0; AU2703400A; ES2259998T3; CA2373128C; CA2373128A1; JP2003526622A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Arzneimittel und kann als geroprotektive Substanz zur Vorbeugung einer verfrühten Alterung des Organismus verwendet werden. Es ist bekannt, dass einige der Hauptmechanismen für die Alterung des Organismus sind: eine Zunahme der molekularen Läsionen, die durch freie Radikale verursacht werden, funktionelle Störungen des Anti-Oxidations-Abwehrsystems und Veränderungen der physiologischen Funktionen der Epiphyse (1, 2, 3).
Hintergrund der Erfindung
Da das erfindungsgemäß beanspruchte Tetrapeptid eine biologische Aktivität, nämlich eine geroprotektive Aktivität aufzeigt, muss auf eine Gruppe von Verbindungen, die Antioxidationseigenschaften besitzen als in ihrer Anwendung analoge Verbindungen Bezug genommen werden. Das Nahrungsergänzungsmittel Ionol (2,6-Di-tert-butyl-4-Methylphenol) ist ein allgemein bekannter Inhibitor der Prozesse von Radikalen, es fördert eine Verlängerung der Lebensdauer von Mäusen des LAF₁-Stamms, die durch beschleunigte Alterung gekennzeichnet sind (4). Das auf 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol basierende Pharmazeutikum (Dibunol) wird allerdings in Form eines Einreibemittels hergestellt und wird im Wesentlichen im urologischen Bereich zur Behandlung von Krebspatienten verwendet (5). Die Zugabe des Antioxidans Ethoxhin (Santohin) zur Nahrung verlängerte die Lebensdauer von C3H-Mäusen (6). Eine Zunahme der Lebensdauer von Experimentaltieren wird weiter durch 2-Ehtyl-6-Methyl-3-Oxypyridin-Chlorhydrat, einem gering toxischen, wasserlöslichen Antioxidans, gefördert, hierbei handelt es sich um ein Strukturanalog des Vitamins B₆ (7, 8). Eine unbedeutende Verlängerung der Lebensdauer von Experimentaltieren wurde durch 2-Mercaptoethanolamin, Butylhydroxytoluol, Cystein, 3-Hydroxypyridin, Centrophenoxyn, Milch- und Glykonsäuren und Glutathion ermöglicht (9, 10). Bei diesen Verbindungen handelt es sich nicht um pharmazeutische Präparate und sie haben bisher noch keine Anwendung in der Medizin als geroprotektive Substanzen gefunden. Die Verabreichung der Vitamine A, C, E führte bei Experimentaltieren ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensdauer (11, 12, 13). Eine Übersättigung des Organismus mit diesen Vitaminen kann allerdings einen unvorteilhaften Einfluss auf die Funktionen der Organe und Systeme haben und eine ausgeprägte Entwicklung einer Hypervitaminosis verursachen. Für β-Catechol, ein Präparat, dessen Zusammensetzung aus Vitaminen und pflanzlichen Substanzen gebildet wird, ist bekannt, dass es antioxidative Wirkung aufzeigt (14). Die Verabreichung dieses Präparats an Mäusen des Stamms SAM-P8, die eine beschleunigte Alterung aufzeigen, steigerte die Überlebensrate dieser Tiere. Die Mechanismen dieser geroprotektiven Wirkung werden allerdings bisher noch nicht untersucht, dieses limitiert dessen Integration in die klinische Praxis. Wenn Mäuse des Stammes SAM, die für eine beschleunigte Alterung prädisponiert sind, auf eine Diät mit einer erhöhten Menge an Carnosin (β-Ala-His) für 7 Monate gehalten werden, nimmt ihre Todesrate ab (15).
Carnosin ist kein pharmazeutisches Präparat; dessen geroprotektive Eigenschaften wurden bisher nicht untersucht. Eine geringe Erhöhung der durchschnittlichen Lebensdauer von Mäusen wurde durch Verabreichung von Melatonin, einem Epiphysenhormon, erzielt (16). Der Einfluss des Melatonins ist assoziiert mit dessen Anti-Oxidationseigenschaft (17). Allerdings zeigte ein Aussetzen von Drosophila Melanogaster, die aufgrund ihrer hohen embryonalen Sterberate ausgesucht wurden (HEM-Stamm) gegenüber Melatonin keine geroprotektive Wirkung auf, obwohl dieses von einer antioxidativen Wirkung begleitet wurde. Melatonin ist kein pharmazeutisches Präparat und wird in Form von biologisch aktiven Nahrungsergänzungsmitteln hergestellt.
Gerovital, ein Novocain enthaltendes Arzneimittel, wird als geroprotektive Substanz verwendet. Die Nachteile dieses Präparats bestehen in dessen möglichen negativen Einfluss auf die Funktionen des kardiovaskulären Systems, seinen allergischen Einfluss, manchmal Schlafstörungen, ein Gefühl von Ängstlichkeit, muskuläre und artikuläre Schmerzen.
Offenbarung der Erfindung
Die beanspruchte Erfindung zielt auf den Erhalt einer neuen, biologischen aktiven Verbindung aus einem Peptid, die eine geroprotektive Wirkung aufzeigt.
Die beanspruchte Peptidverbindung, das Tetrapeptid, hat keine Strukturanaloga.
Gemäß der Erfindung wird ein Tetrapeptid, L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin der allgemeinen Formel L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly beansprucht.
Erfindungsgemäß zeigte das Tetrapeptid L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin mit der folgenden Aminosäuresequenz: L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly eine biologische Wirkung, nämlich eine geroprotektive Wirkung aufgrund der Stimulation der Indizes für das Anti-Oxidationsabwehrsystem und aufgrund der Prozesse der Melatoninsynthese in den Strukturen des diffusen neuroendokrinen Systems.
Das Tetrapeptid wird durch ein klassisches Verfahren der Peptidsynthese in einer Lösung erhalten (19).
Die geroprotektive Wirkung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde in Versuchstests bestätigt. Die Studie für die geroprotektive Wirkung wurde in Drosophila melanogaster durch Analyse der Indizes der Anti-Oxidationsabwehr, der Lebensdauer und der Länge des Vermehrungszeitraums bestimmt, genauso wie in Ratten durch Untersuchungen der Synthese von Melatonin außerhalb der Epiphyse.
Erfindungsgemäß schließt die pharmakologische Substanz, die eine geroprotektive Wirkung aufzeigt als wirksamen Inhaltsstoff eine wirksame Menge des Tetrapeptids der Formel L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) oder dessen Salze ein.
Erfindungsgemäß kann die pharmakologische Substanz, die eine geroprotektive Wirkung aufzeigen kann, kann Salze der Aminogruppen (Acetat, Hydrochlorid und Oxalat) oder der Carboxylgruppen (Metallsalze mit Natrium, Kalium, Calcium, Lithium, Zink, Magnesium und anderen organischen und anorganischen Kationen, Ammonium, Triethylammonium) enthalten.
Erfindungsgemäß ist die pharmakologische Substanz zur parenteralen, intranasalen, oralen Verabreichung oder zur lokalen Applikation vorgesehen.
Die geroprotektive Wirkung aufzeigende, beanspruchte pharmakologische Substanz ist in der Lage, die Indizes des Anti-Oxidationsabwehrsystems und des Prozesses der Melatonin-Synthese in Strukturen des diffusen neuroendokrinen Systems zu stimulieren, die dann Alterungsprozesse inhibieren und die Erhöhung der Lebensdauer fördern.
Der Ausdruck „geroprotektive Substanz", wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf die Substanz, die ein Altern verhindert und das Leben verlängert durch das Verhindern einer verfrühten Alterung, dieses benötigt die Stimulierung des Anti-Oxidationsabwehrsystems und einen regulierenden Einfluss auf Stoffwechselprozesse in Strukturen des diffusen neuroendokrinen Systems.
Der Ausdruck „pharmakologische Substanz" wie er vorliegend verwendet wird, impliziert die Verwendung irgendeiner Form von Arzneimittel, die das Tetrapeptid oder dessen Salze enthält, für prophylaktische oder therapeutische Zwecke in der Medizin als geroprotektive Substanz bei verfrühter Alterung.
Der Ausdruck „wirksame Menge" wie er vorliegend verwendet wird, impliziert die Verwendung einer solchen Menge an wirksamen Inhaltsstoff, der unter Einhaltung der quantitativen Indizes der Wirksamkeit und der Toxizität und aufgrund des vorhandenen Wissens in dieser Form des Arzneimittels wirksam sein muss.
Der Ausdruck „pharmakologische Zusammensetzung" wie er vorliegend verwendet wird, impliziert verschiedene Arzneiformen des Präparats.
Um erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen zu erhalten, wird das vorgesehene Tetrapeptid oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Derivate als wirksamer Inhaltsstoff mit einem pharmazeutischen Träger gemäß den pharmazeutisch akzeptierten Verfahren des Zusammenmischens vermischt.
Der Träger kann in Abhängigkeit von der Arzneimittelform des Präparats, wie sie zur Verabreichung gewünscht ist verschiedene Formen annehmen, z.B. parenteral, intranasal oder oral.
Alle bekannten pharmakologischen Komponenten können zur Herstellung der Zusammensetzungen in Dosierungen, die zur oralen Verabreichung bevorzugt sind, verwendet werden.
Für die parenterale (intranasale) Verabreichung schließt der Träger üblicherweise steriles Wasser ein, es können aber auch andere Inhaltsstoffe, die zur Stabilisierung oder zur Aufrechterhaltung der Stabilität beitragen, verwendet werden.
Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren ein prophylaktisches oder therapeutisches Aussetzen der Patienten gegenüber der beanspruchten pharmakologischen Substanz in Dosierungen von 0,01 bis 100 μg/kg Körpergewicht mindestens einmal am Tag über einen Zeitraum notwendig zum Erzielen einer therapeutischen Wirkung: 10 bis 40 Tage in Abhängigkeit von der Art und Schwere des pathologischen Prozesses.
Erfindungsgemäß ist das Tetrapeptid wirksam, wenn es in Dosen von 0,01 bis 100 μg/kg Körpergewicht verabreicht wird, geringere (höhere) Dosierungen können ebenfalls verwendet werden, in Abhängigkeit von der Art und Schwere des pathologischen Prozesses.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Erfindung wird mit Hilfe eines Beispiels zur Synthese des Tetrapeptids, dessen Formel L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) ist (Beispiel 1), durch Beispiele für Toxizitätstests und Tests für die biologische Wirksamkeit des Tetrapeptids (Beispiele 2 bis 8) und weiterhin durch Beispiele, die die Ergebnisse der klinischen Anwendung dieses Tetrapeptids darstellen und somit auch dessen pharmakologischen Eigenschaften aufzeigen und bestätigen, dass es die Möglichkeit gibt, eine prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung zu erzielen (Beispiel 0, 10), weiter dargestellt.
Beispiel 1 Synthese des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids

1. Produktname: L-Alanyl-L-Gutamyl-L-Aspartyl-Glycin
2. Strukturformel: H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH
3. Molekularformel ohne Ionenpaar: C₁₄H₂₂N₄O₉
4. Molekulargewicht ohne Ionenpaar: 390.35.
5. Ionenpaar: Acetat.
6. Aussehen: weißes amorphes geruchloses Pulver.
7. Syntheseverfahren: Das Peptid wird durch ein klassisches Verfahren der Synthese in Lösung durch das folgende Schema erhalten:

Z

= Benzyloxycarbonylgruppe

BOC

= tert.Butyloxycarbonylgruppe

OSu

= N-Oxysuccinimidester

OBzl

= Benzylester

DCC-N,

N'-Dicyclohexylcarbodiimid

HOBT

= N-Oxybenzotriazol

N,N'-Dimethylformamid wurde als Lösungsmittel verwendet. Bei Zugabe der Asparaginsäure wurde die α-COOH-Gruppe durch Versalzung mit Hilfe von Triethylamin geschützt. Das Entfernen der BOC-Schutzgruppe wurde mit einer Lösung von Trifluoroessigsäure (TFA) durchgeführt; das Entfernen der Z-Schutzgruppe wurde durch katalytische Hydrierung durchgeführt. Die Extraktion und Aufreinigung des Produkts wurde mit dem Verfahren der präparativen Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf Umkehrphasensäulen durchgeführt.
Eigenschaften des Endprodukts

– Aminosäureanalyse: Glu Asp Ala Gluy 1,02 1,00 1,01 1,00
– Peptidgehalt: 98,4% (mittels HPLC, 220 nm)
– Dünnschichtchromatographie (TLC): Einzelbande, R_f = 0,73 (Acetonitril/Essigsäure/Wasser, 5:1:3)
– Feuchtigkeitsgehalt: 5
– pH der 0,0001% Lösung: 4,37
– spezifische optische Aktivität: [α]_D ²²: –32° (c = 1, H₂O)

Synthesebeispiel:
1. BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), N-tert.-Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)aspartat
4,3 g (0,0100 Mol) N-Oxysuccinimidester der N-tert.-Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)Glutaminsäure (BOC-Glu(OBzl)-OSu) wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und zu 1,72 ml (0,0125 Mol) Triethylamin und 2,80 g (0,0125 Mol) β-Benzylasparatat hinzugefügt. Die Mischung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Produkt mit 0,5 N (150 ml) Schwefelsäure präzipitiert, mit Ethylacetat extrahiert (3 × 33 ml), mit 0,5 N Schwefelsäure (2 × 20 ml) Wasser, 5%-Lösung von Natriumbicarbonat (1 × 20 ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäure (2 × 20 ml), Wasser gewaschen, die Lösung wurde wurde über wasserfreien Na₂SO₄ getrocknet. Ethylacetat wurde abfiltriert und im Vakuum bei 40°C entfernt. Der Rest wurde in vacuo über P₂O₅ getrocknet. Als Ergebnis wurden 5,68 g (≈ 100%) Öl erhalten. R_f = 0,42 (Benzol/Aceton 2:1, Sorbfilplatten, 8 bis 12 μm Silicagel, UV und Chlor/Benzidin-Entwicklung).
2. TFA-H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), (γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)aspartat Trifluoroacetat
5,68 g (≈ 0,01 Mol) N-tert.Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat (I) wurden in 20 ml Dichlormethan-Trifluoressigsäuremischung (3:1) gelöst. Zwei Stunden später wurde das Lösungsmittel bei 40°C entfernt. Dieses Entfernen wurde durch Zugabe eines weiteren Teils Dichlormethan (2 × 10 ml) wiederholt, der Rest wurde im Vakuum über NaOH getrocknet. 5,80 g (≈ 100%) Öl wurden erhalten. R_f = 0,63 (N-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser, 15:10:3:12).
3. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat
5,65 g (0,01 Mol) (γ-Benzyl)Glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat Trifluoracetat (II) wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, es wurden 2,80 ml (0,02 Mol) Triethylamin und 4,14 g (0,013 Mol) N-Oxysuccinimidester von N-carbobenzoxyalanyl hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Das Produkt wurde mit 0,5 N Schwefelsäure (150 ml) präzipitiert, mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert, mit 0,5 N Schwefelsäure (2 × 20 ml), Wasser, 5% Lösung von Natriumbiocarbonat (1 × 20 ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäure (2 × 20 ml) und Wasser gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, das Ethylacetat wurde abgetrennt und im Vakuum bei 40°C entfernt. Der Rest wurde in Ethylacetat/Hexansystem rekristallisiert. Das Produkt wurde filtriert und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Die Ausbeute betrug 4,10 g (66%). Der Schmelzpunkt (T_ml) ist 154°C. R_f = 0,48 (Benzol-Aceton, 1:1), R_f = 0,72 (N-Butanol/Pyridin/Essigsäure, Wasser, 15:10:3:12).
4. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (IV), N-carbobenzooxyalanyl (γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartylglycinbenzylester
1,01 g (3 mMol) Benzylester von Glycintosylat TosOH-H-Gly-OBzl wird in 15 ml Tetrahydrofuran suspendiert und mit 0,4 ml (3 mMol) Triethylamin unter Rühren vermischt, anschließend wird innerhalb von 5 Minuten 1,28 g (2 mMol) N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)Glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat (III) und 0,27 g (2 mMol) N-oxybenzotriazol hinzugefügt. Die Mischung wird auf 0°C abgekühlt. Anschließend werden 0,42 g (2 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung in 5 ml Tetrahydrofuran, gekühlt auf 0°C, hinzugefügt. Die Mischung wird bei dieser Temperatur für 2 Stunden gerührt und konnte über Nacht bei Raumtemperatur stehen bleiben. Das restliche Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rest wird in 30 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde gewaschen mit 1 N Schwefelsäure, Wasser, 5%-Lösung Natriumbicarbonat, Wasser, 1 N Schwefelsäure, Wasser und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Produkt in Ethylacetat/Hexansystem rekristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,30 g (82%). T_ml = 146–148°C. R_f = 0,75 (Benzol/Aceton, 2:1).
5. H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH (V), Alanyl-Glutamyl-Aspartyl-Glycin
1,25 g N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)glutamyl(β-Benzyl)aspartylglycinbenzylester (III) wurden in Methanol-Wasser-Essigsäuresystem (3:1:1) über Pd/C hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mittels TLC mit Benzol-Aceton (2:1) und Acetonitril-Essigsäure-Wasser(5:1:3)-Systemen überwacht. Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat wurde im Vakuum entfernt, und der Rest wurde in einem Wasser-Methanol-System rekristallisiert. Das Produkt wurde im Vakuum über KOH getrocknet. Die Ausbeute betrug 520 mg (95%). Rf = 0,73 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser, 5:1:3). Zur Aufreinigung wurden 390 mg des Produkts in 4 ml 0,01% Trifluoressigsäure gelöst und eine HPLC auf Umkehrphasensäulen 50 × 250 mm Diasorb-130-C16T, 7 μm unterworfen. Als Chromatograph wurde ein Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module verwendet. Die Bedingungen der Chromatographie waren A: 0,1% TFA, B: 50% MeCN/0,1% TFA, Gradient B 0 → 5% über 80 Minuten. Das Probenvolumen betrug 5 ml, der Nachweis wurde bei 215 nm durchgeführt, Scannen von 190–600 nm mit einer Flussrate von 10 ml/min. Die Fraktion wurde zwischen 54,0 bis 66,0 Minuten gesammelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei einer Temperatur, die nicht 40°C überschritt, entfernt, dieses wurde mehrfach (5-fach) mit 10 ml 10% Lösung Essigsäure wiederholt. Schließlich wurde der Rest in 20 ml deionisiertem Wasser gelöst und lyophilisiert. Als Ergebnis wurden 290 mg aufgereinigtes Produkt in Form eines amorphen, geruchslosen, weißen Pulver erhalten. Das erhaltene Peptid in Form seines Acetats wurde in die freie Form durch Aufarbeitung mit IRA-Anionit oder mit einer analogen Substanz in der (OH^–)-Form. Danach wurden die Salze der Aminogruppen durch anschließenden Zusatz eines entsprechenden Säureäquivalenz (Hydrochlorid oder Oxalat) erhalten. Die erhaltene Wasserlösung wurde lyophilisiert und als Endprodukt analysiert.
Um entsprechende Salze der Carboxylgruppen zu erhalten, wurden zu dem freien Tetrapeptid eine berechnete Menge einer wässrigen Lösung eines Hydroxid eines entsprechenden Metalls (NaOH, KOH, Zn(OH)₂, LiOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, NH₄OH) hinzugefügt.
Um das Triethylammoniumsalz zu erhalten, wurde das Verfahren in ähnlicher Weise unter Verwendung von Triethylamin als Base durchgeführt.
6. Analyse des Endprodukts
Der Peptidgehalt wurde mittels HPLC auf einer Surelco LC-18-DB-Säule, 4,6 × 250 mm, Grad. LC-18-DB bestimmt. A: 0,1% TFA, B: 50% MeCN/0,1% TFA; grad. B 0 → 20% in 30 Minuten. Die Flussgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Der Nachweis wurde bei 220 nm durchgeführt, das Scannen von 190 bis 600 nm, das Probenvolumen betrug 20 μl. Peptidgehalt: 98,45%.
Die Aminosäureanalyse wurde mittels AAA"T-339" Prag durchgeführt. Die Hydrolyse wurde in 6 N HCl bei 125°C für 24 Stunden durchgeführt.
Glu Asp Ala Gly
1,02 1,00 1,01 1,00
TLC: Einzelbande, Rf = 0,73 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser, 5:1:3). Sorbfilplatten, 8 bis 12 μm Silicagel, Entwicklung in Chlor/Benzidin. Feuchtigkeitsgehalt 5% (gravimetrisch gemäß dem Wasserverlust durch Trocknung: 20 mg bei 100°C). pH einer 0,001%-Lösung: 4,37 (potentiometrisch). Spezifische optische Aktivität: [α]_D ²²: –32° (c = 1, H₂O), „Polamat A", Carl-Zeiß Jena
Beispiel 2 Untersuchung des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly auf Toxizität
Die Studie einer allgemeinen Toxizität des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-Asp-Gly wurde gemäß den „Regeln zur präklinischen Beurteilung der Sicherheit von pharmakologischen Substanzen" (GLP) durchgeführt.
Der Zweck der Studie ist die tolerierbare toxische Dosis des Präparats zu bestimmen, den Grad und den Charakter pathologischer Veränderungen in verschiedenen Organen und Systemen des Organismus zu beurteilen und den Zusammenhang von toxischen Effekten, die aufgrund der Dosis auftreten, und der Dauer der Aufnahme des Arzneimittels aufzudecken. Die Bestimmung der akuten Toxizität des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids wurde gemäß Kerber durchgeführt. Die Untersuchung wurde an 66 weißen männlichen Mischlingsmäusen mit einem Gewicht von 20 bis 23 g durchgeführt, diese wurden im Käfig unter Standardbedingungen gehalten und mit Standardrationen gefüttert. Die Tiere wurden zufällig in sechs gleiche Gruppen geteilt, jede mit 11 Mäusen. Die Tiere wurden intramuskulär mit dem Tetrapeptid in Dosen von 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg und 5 mg/kg in 0,25 ml injiziert (einige tausendfach oberhalb der therapeutischen Dosis, wie sie für klinische Versuche empfohlen wird). Die Kontrolltiere erhielten die gleiche Menge an Natriumchlorid.
Über 22 Stunden und bis zu 14 Tage verstarb keines der Tiere irgendeiner Gruppe. Es wurden keine Veränderungen im Allgemeinzustand, dem Verhalten, der motorischen Aktivität, dem Haar- und Hautaussehen, oder den physiologischen Ausscheidungen der Tiere beobachtet.
Somit löst das Tetrapeptid L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly in Dosen, die einige tausendfach über der empfohlenen therapeutischen Dosis für klinische Studien lag, keine akute toxische Reaktion aus, dies zeigt eine breite therapeutische Anwendbarkeit dieses Präparats.
Die Studie für die subakute Toxizität des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids wurde mit 60 Mischlingsratten mit einem Körpergewicht von 150 bis 250 g durchgeführt. Die Versuchstiere wurden täglich einer einzelnen intramuskulären Verabreichung des Arzneimittels über 90 Tagen in Dosen von 1 μg/kg, 0,3 mg/kg, 3 mg/kg in 0,5 ml Natriumchloridlösung unterworfen. Den Tieren der Kontrollen wurde die gleiche Menge Natriumchlorid verabreicht.
Über den gesamten Untersuchungszeitraum wurden die Tiere täglich beobachtet. Das Verhalten der Tiere, der Nahrungs- und der Wasserverbrauch, der Zustand des Haaraufbaus und der mukosalen Membran wurden registriert. Die Tiere wurden wöchentlich gewogen. Vor Verabreichung nach dem 30., 60. und 90. Tag der Verabreichung des Tetrapeptids wurde die morphologische Zusammensetzung und die Eigenschaften des peripheren Bluts untersucht. Die biochemischen und coaguloratorischen Eigenschaften des Bluts wurden nach Beendigung des Experiments untersucht.
Die chronische Toxizität des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, wurde durch Langzeitverabreichung davon an Ratten mit einem Körpergewicht von 150 bis 250 g untersucht. Die Tiere wurden täglich einer einzelnen intramuskulären Verabreichung des Mittels in Dosen von 1 μg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg in 0,5 ml Natriumchloridlösung über 6 Monate ausgesetzt. Das Verhalten der Tiere, der Nahrungsmittel- und Wasserverbrauch, der Zustand des Haaraufbaus und der mukosalen Membranen wurde untersucht. Die Tiere wurden täglich innerhalb der ersten drei Monate des Experiments und anschließend einmal im Monat gewogen. Drei Monate nach Verabreichung und zum Ende des Experiments wurden hämatologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Funktion des kardiovaskulären Systems, der Leber, Pankreas, Nieren und Nebennieren wurde untersucht. Nach Ende der Verabreichung wurden einige Tiere pathomorphologischen Untersuchungen unterworfen, um den Zustand verschiedener Bereiche des Gehirns, des Knochenmarks, des Herzen, der Aorta, der Lunge, der Leber, der Nieren und der endokrinalen Organe und des Immunsystems festzustellen.
Die Beurteilung des allgemeinen Zustands der Tiere, morphologische und biochemische Indizes des peripheren Bluts, der morphologische Zustand der intrinsischen Organe, der Status des kardiovaskulären und des Atemsystems, der Leber- und Nierenfunktionen zeigte keine pathologischen Veränderungen.
Die Untersuchungen des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly auf subakute und chronische Toxizität bestätigte das Nichtvorhandensein von Nebenwirkungen bei Langzeitverabreichung des Arzneimittels in Dosen, die therapeutische Dosen um das 100- bis 1000-fache überschreiten.
Beispiel 3. Einfluss des L-Ala-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die Prozesse der freien Radikale in Drosophila melanogaster des HEM-Stamms ausgewählt aufgrund seiner hohen embryonalen Sterberate
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde Drosophila melanogaster-Larven im 2. Stadium des Stamms HEM, ausgewählt wegen einer hohen Alterungsrate, verabreicht (20). Der HEM-Stamm ist gekennzeichnet durch eine einzigartige Dynamik der embryonalen Sterblichkeit, die in einer erhöhten Frequenz des frühen embryonalen Sterbens von 65% am ersten Tag der Eiablage bis auf 95% am vierten Tag, in einer verringerten durchschnittlichen Lebensdauer (29 Tage) und in einer erhöhten Stärke der Lipidperoxidoxidation besteht.
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde in Mengen von 0,00001% des Gewichts des Kulturmediums hinzugefügt, dies ist eine extrem niedrige Dosis. Die in der Literatur zur Beeinflussung von verschiedenen Substanzen auf Drosophila melanogaster beschriebene Dosis liegt üblicherweise im Bereich von 0,001 bis 0,01%. Geringere Dosen weisen normalerweise keine Effekte auf.
Die biochemischen Parameter wurden an 14 Tage alten Fliegen untersucht. In diesen wurde die Katalaseaktivität und die Intensität der Gewebechemolumineszenz analysiert (21, 22, 23). Die Katalase ist das Grundenzym der antioxidativen Abwehr. Der Grad seiner Aktivität weist auf die Fähigkeit des Organismus hin, oxidativen Stress zu widerstehen. Luminol abhängige Chemolumineszenz, die durch Wasserstoffperoxid induziert wurde, reflektiert das Stadium von aktivem Sauerstoff im Gewebe. Somit weist eine Abnahme der Chemolumineszenzintensität auf eine Zunahme der Fähigkeit des Organismus oxidativen Stress zu widerstehen auf.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Da signifikante intersexuelle Unterschiede auf die untersuchten Indizes aufgefunden wurden, sind die Daten für Männchen und Weibchen getrennt wiedergegeben.
Die dargestellten Daten zeigen, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid einen signifikanten Anstieg der in der Katalaseaktivität bei den männlichen und weiblichen Versuchsfliegen im Vergleich zu den Kontrollen fördern.
Im Allgemeinen nahm die Antioxidationsaktivität in Geweben, gekennzeichnet durch den Grad an Chemolumineszenz unter dem Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid, nur bei Weibchen zu.
Tabelle 1 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Katalasaktivität und die Gewebechemolumineszenz in Drosophila melanogaster vom HEM-Stamm
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Lebensdauer in den verschiedenen Experimentalgruppen.
Tabelle 2 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter der Lebensdauer in Drosophila melanogaster vom HEM-Stamm
Wie in Tabelle 2 gezeigt, führt das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid zu deutlich geroprotektiven Wirkungen. Bei Weibchen verlängert es signifikant die durchschnittliche Lebensdauer (p < 0,001) und verringert die Alterungsrate (R) (P < 0,001). Bei Männchen erniedrigt es leicht die Alterungsrate (P < 0,05).
Somit erhöht das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid die durchschnittliche Lebensdauer um 26% und reduziert die tatsächliche Alterungsrate in der Population, bestimmt durch den Wert des Gomperz-Parameters um 40%.
Beispiel 4. Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Fortpflanzungsfunktionen von Drosophila melanogaster des HEM-Stamms; ausgewählt für seine hohe embryonale Sterblichkeitsrate
Der Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf Drosophila melanogaster wurde im zweiten bis dritten Stadium der Larven durch Zugabe des Präparats zum Kulturmedium in einer Dosis von 0,00001% des Mediumgewichts, welches ca. 0,015 mg/100 ml entspricht, getestet. Die am ersten Tag ausgeschlüpften Fliegen wurden jeweils 5 Paare in Teströhrchen verbracht und alle drei bis sechs Tage auf frisches Medium transferiert.
Die folgenden Faktoren wurden berücksichtigt:
Der Anteil an Teströhrchen (von ihrem anfänglichen Wert), die lebende Weibchen enthielten (in Tabelle 3 – der Anteil an lebenden Kulturen).
Der Anteil an Teströhrchen (Zahl der Lebendkulturen), in denen Nachkommen erhalten wurden (in Tabelle 3 – Anteil an fruchtbaren (fertilen) Kulturen).
In jeder Variante des Experiments wurden 75 Elternpaare analysiert. Die Unterschied zwischen den Fertilitätsindizes wurden mit Hilfe der Fischer-Genauigkeitskriterien für 2 × 2 Anpassungstabellen definiert (24).
Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 3 dargestellt. Für jede experimentelle Variante sind die Anteile an lebenden und fertilen Kulturen dargestellt. Wie in der Tabelle gezeigt, übersteigt der Anteil an im Tetrapeptid behandelten fertilen Kulturen den analogen Anteil in der Kontrolle. Es wird gezeigt, dass der Anteil an fertilen Kulturen in der L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid Variante wesentlich höher ist (p < 0,05) als in den Kontrollen im Alter von 32 Tagen.
Die Koeffizienten der linearen Regression sind in Tabelle 4 dargestellt. Wie in der Tabelle gezeigt, unterscheiden sich die Koeffizienten der Kontrollregressionsgeraden signifikant von denen des Versuchs. Der „a"-Koeffizient (gibt den Anstieg der geraden Linie wieder) in der Kontrolle ist 1,8-fach größer als der Regressionskoeffizient der Versuchstiere.
Damit wird aufgezeigt, dass der Anteil an fertilen Kulturen in der Kontrollvariante im Vergleich zu der L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid Variante zweifach schneller abnimmt. Die Dauer der Fortpflanzungsperiode war 30 Tage für Kulturen, die nicht dem Tetrapeptid ausgesetzt waren und 47 Tage bei Kulturen, die dem Tetrapeptid ausgesetzt waren. Es wird gezeigt, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid den Fortpflanzungszeitraum 1,5-fach verlängert.
Die für die Lebensdauer erhaltenen Daten wurden entsprechend analysiert. Die Daten der Regressionsanalyse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Wie man aus der Tabelle entnehmen kann, nimmt der Anteil an Lebendkulturen (d.h. Kulturen, in denen lebende Weibchen vorhanden sind) durchschnittlich 1,5-fach schneller ab in den Kontrollen). Der berechnete Median für die Lebensdauer (d.h. das Alter, bei dem 50% der Individuen gestorben sind) die tatsächlich erreichte Lebensdauer (d.h. die maximale Lebensdauer in verschiedenen Experimentalvarianten) ist in Tabelle 6 dargestellt.
Wie in der Tabelle gezeigt, ist bei den Varianten, denen L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid verabreicht wurde, neben der Zunahme der Median-Lebensdauer ein maximaler rekordbrechender Anstieg in der Lebensdauer erzielt worden (in den Stämmen von Drosophila melanogaster mit hoher Alterungsrate): 100 Tage.
Tabelle 3 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Lebensdauer und die Fertilität der Kulturen und deren Anteil in den Kulturen des HES-Stamms von Drosophila melanogaster
Tabelle 4 Koeffizienten der linearen Regression für die Abhängigkeit der Anteile an Fertilität in den Kulturen vom Alter (y = B + A_x)
Tabelle 5 Koeffizienten der linearen Regression für die Abhängigkeit der Anteile an Lebenden in den Kulturen vom Alter (y = B + A_x)
Tabelle 6 Parameter der Lebensdauer in verschiedenen Tests (Tage)
Beispiel 5 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die Prozesse der freien Radikale in Drosophila melanogaster mit geringer Aktivität (LA) ausgewählt für eine geringe sexuelle Aktivität der Männchen
Die Wirkung des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Katalaseaktivität, den Gehalt an Produkten der Lipidperoxidaseoxidation (LPO), die Lebensdauer und die Alterungsrate wurden in Drosophila melanogaster des LA-Stamms untersucht.
Einen Tag alte Fliegen wurden in Teströhrchen gegeben, 10 Individuen des gleichen Geschlechts jeweils. Alle zwei Tage wurden sie auf frisches Medium transferiert, wobei die Zahl an der verstorbenen Individuen berücksichtigt wurde. Die durchschnittliche und maximale Lebensdauer wurden bestimmt. Die Alterungsrate wurde mit Hilfe der Parameter der Gomperz-Gleichung berechnet.
Das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurden den Larven des dritten Stadiums mit einer Dosis von 0,00001% des Gewichts des Kulturmediums, was ca. 0,015 mg/100 ml war, verabreicht. Die Katalaseaktivität wurde mit Hilfe allgemein anerkannter Verfahren in den Homogenaten der erwachsenen 14 Tage alten Fliegen bestimmt. Das Experiment wurde mit einer anschließenden Wiederholung durchgeführt.
Die Regression und die Verteilungsanalysen dienten als Grundtechniken der statistischen Bearbeitung. Die Richtigkeit der Unterschiede wurde mit Hilfe des Verfahrens der minimal relevanten Diversität bestätigt.
Es wurde gefunden, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bei Weibchen keine Veränderung in der durchschnittlichen Lebensdauer induziert, aber eine Zunahme der maximalen Lebensdauer (LS_max). Zur gleichen Zeit verlängerte die Substanz wesentlich die ALS in Männchen. Die Analyse der Kurven der Überlebensraten und der Gomperz-Darstellung zeigte, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid in Weibchen als Geroprotektor der ersten Art diente (ALS und LS_max waren erhöht, die Alterungsrate veränderte sich aber im Vergleich zu der Kontrolle nicht). In Männchen wirkte es aber als Geroprotektor der dritten Art (ALS war erhöht, LS_max veränderte sich nicht, weiterhin wurde eine Tendenz der Erhöhung der Alterungsrate beobachtet).
Zur gleichen Zeit zeigt die Analyse der Überlebensrate in Fliegen ohne Berücksichtigung ihrer geschlechtlichen Unterscheidung, dass der LS_max unter Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids wesentlich verlängert war.
Die Anwendung des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids bei Männchen erhöhte signifikant die Katalaseaktivität, während der Gehalt an LPO-Produkten bei Weibchen wesentlich herunterging. Die Unterdrückung zwischengeschlechtlicher Unterscheidungen bestätigte eine hohe Antioxidationsaktivität des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids.
Tabelle 7 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter der Lebensdauer bei weiblichen Drosophila melanogaster vom LA-Stamm
Tabelle 8 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter der Lebensdauer in männlichen Drosophila melanogaster vom LA-Stamm
Somit zeigte die Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid eine alterungshemmende Wirkung bei Fliegen.
Tabelle 9 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die biochemischen Indizes der Verfahren mit freien Radikalen in Drosophila melanogaster vom LA-Stamm
Beispiel 6 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die Prozesse mit freien Radikalen in Drosophila melanogaster in umweltangepassten (environmental adaptation EA)-Stamm ausgewählt für deren geringe Anpassungsfähigkeit an die Umwelt
Drosophila melanogaster vom EA-Stamm dienen als Modell, um den Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Katalaseaktivität, die Gewebechemoluminesnzenz und die Lebensdauer zu untersuchen.
Einen Tag alte Fliegen wurden in Teströhrchen verbracht, 10 Individuen des gleichen Geschlechts jeweils. Alle fünf bis sieben Tage wurde diese auf frisches Medium verbracht, wobei die Zahl an verstorbenen Individuen berücksichtigt wurde. Die durchschnittliche und maximale Lebensdauer wurde bestimmt. Die Alterungsrate wurde mit Hilfe der Parameter der Gomperz-Gleichung berechnet.
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde in Larven des dritten Stadiums in einer Dosis von 0,00001% des Kulturmediums, dies entsprach ca. 0,015 mg/100 ml angewendet. Die Katalaseaktivität und die Stärke der Chemolumineszenz wurden in den Homogenaten der erwachsenen sieben Tage alten Fliegen durch allgemein anerkannte Verfahren bestimmt. Die Experimente wurden wiederholt.
Die Regression und die Verteilungsanalysen dienten als Grundtechnik der statistischen Bearbeitung. Die Richtigkeit der Unterschiede wurde mit dem Verfahren der minimalen relevanten Verteilung bestätigt.
Die Ergebnisse des Experiments sind in den Tabellen 10 bis 13 dargestellt.
Tabelle 10 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter der Lebensdauer in weiblichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 1)
Es wurde gefunden, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid eine Wirkung auf die Luminol-abhängige Chemilumineszenz hervorruft (Tabelle 14). Die Abnahme dieses Index zeigt die Aktivierung des Anti-Oxidations-Abwehrsystems in den Fliegen an. Die Zunahme der Intensität in dem Anti-Oxidations-Abwehrsystems des Gewebes ist in diesem Fall wahrscheinlich mit der Aktivierung von niedermolekularen, endogenen Anit-Oxidantien verbunden, wie Glutathion, Tocopherol und dergleichen.
Eine Ausweitung in der durchschnittlichen und der maximalen Lebensdauer wurde nur in Fällen beobachtet, bei denen ein verringerte Viabilität und ein beschleunigtes Altern in den Kontrollen auftraten. Wie die dargestellten Daten aufzeigen, ist dieses der Fall, wenn das untersuchte Tetrapeptid eine klare geroprotektive Wirkung aufzeigt.
Tabelle 11 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter der Lebensdauer bei männlichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 1)
Tabelle 12 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter der Lebensdauer bei weiblichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 2)
Tabelle 13 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter der Lebensdauer in männlichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 2)
Tabelle 14 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die biochemischen Indizes der Prozesse der freien Radikale in Drosophila melanogaster vom EA-Stamm
Beispiel 7 Einfluss von L Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Lebensdauer von Drosophila melanogaster vom Wildtypstamm Canton-S
In diesem Experiment wurden Drosophila melanogaster vom Wildtyp-Stamm Canton-S verwendet. L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid in löslicher Form wurde zu dem Kulturmedium für das Wachstum der Insekten gegeben, dieses wurde dann auf 50 bis 60°C heruntergekühlt und anschließend vorsichtig gerührt und in die Teströhrchen verbracht.
Um die Bedingungen von sowohl der Kontroll- als auch der Testpopulation identisch zu machen, wurde eine Menge von Natriumchlorid, die gleich der verwendeten L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid-Lösung ist, in das Kulturmedium für die Kontrolle zugeführt. Die Konzentration an allen verwendeten Substanzen wurde gerechnet im Verhältnis zu der Masse des Kulturmediums, das zur Vermehrung bereitgestellt wurde.
Vier Tage alte weibliche Fliegen wurden einer zufällig ausgewählten Paarung mit Männern über 20 Stunden unterworfen, wobei jeweils ein Paar in jedem Teströhrchen war, anschließend wurden die Elternpaare aus dem Teströhrchen entfernt. Um jeweils eine neue Generation zu bilden, wurden die Nachkommen von 50 bis 80 Paaren verwendet.
Die Lebensdauer (life span, LS) wurde an Laborpopulationen untersucht, jede davon bestand aus 90 Individuen eines jeden Geschlechts. Sofort nach dem Schlüpfen der Fliegen wurden diese zufällig ausgewählt in Teströhrchen verbracht, jeweils 10 Individuen. Ein Austausch des Kulturmediums wurde 3× die Woche durchgeführt.
Die Durchschnittswerte (ALS) und die Standardabweichungen wurden mit bekannten Verfahren auf die Parameter für die Verteilung der Lebensdauer angewendet. Die Durchschnittswerte wurden miteinander unter Anwendung des Student-T-Tests verglichen.
Die Tabelle 15 zeigt die Ergebnisse der Merkmale zur Verteilung der Lebensdauer (Durchschnittswerte und Standardabweichungen dieser Durchschnittswerte) für alle Test- und Kontrollgruppen.
Für die Teststudie wurden sechs Konzentrationen an L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid ausgewählt: 0,01 ×, 0,1 ×, 1 ×, 5 ×, 7,5 × und 12,5 × 10^–6% des Gewichts des Kulturmediums.
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid, das den Männern in den vier geringsten Konzentrationen (0,01 × bis 5 × 10^–6%) verabreicht wurde, zeigte eine signifikante geroprotektive Wirkung: Die ALS in den Testgruppen zeigte einen statistisch relevanten Anstieg. Die relative Verlängerung des ALS bei Männern betrug 3,3 bis 10,8%.
In den mit den weiblichen Fliegen durchgeführten Experimenten zeigte L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid eine geroprotektive Wirkung nur bei Konzentrationen von 0,01 × und 0,1 × 10^–6% mit einer signifikanten Erhöhung im ALS entsprechend 13,4% (P < 0,004) und 11,8% (P < 0,03).
Die Wirksamkeit des in geringeren Konzentrationen verabreichten L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids, wie mit den erhaltenen Daten gezeigt, ist beispiellos. Es wird darauf hingewiesen, dass die Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bei Drosophila melanogaster nicht die Dauer ihrer Entwicklung in den Stadien verändert, das im Allgemeinen das Fehlen von gerotoxischen Wirkungen durch diese untersuchte Substanz reflektiert.
Tabelle 15 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter für die Lebensdauer bei Drosophila melanogaster vom Wildstamm Canton-S
Beispiel 8 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die extra-pineale Synthese von Melatonin in Ratten nach Epiphysectomie
Die Untersuchungen wurden mit männlichen Wistar Ratten mit einem Gewicht von 130 bis 140 g durchgeführt. Die Gesamtzahl an Tieren (23) wurde in fünf Gruppen geteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) schloss nicht operierte Tiere ein. Die Tiere der Gruppen zwei bis fünf wurden einer Epiphysectomie (EE) unterworfen. Drei Wochen nach der chirurgischen Behandlung (am 21. Tag) wurden die Tiere der zweiten und dritten Gruppe subkutan mit Natriumchlorid mit einer Dosis von 0,05 ml für die nächsten 10 Tage injiziert. Den Tieren der Gruppen vier und fünf wurden mit dem gleichen Schema L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid mit einer Dosis von 0,5 μg verabreicht.
Das Töten der Tiere und das Entnehmen ihrer Organe wurde von 10 Uhr morgens bis 12 Uhr mittags bei Tageslicht mit Hilfe des Narkotikums Nembutal durchgeführt (50 mg/kg). Die Tiere der Gruppen 1, 2 und 4 wurden drei Tage nach der letztmaligen Verabreichung des Arzneimittels (am 33. Tag nach der Operation und dem Fortsetzen des Experiments) getötet, während der Tiere der Gruppen 3 und 5 12 Tage (am 42. Tage nach Epiphysectomie) getötet wurden. Die Hauptorgane des diffusen neuroendokrinen Systems (DNES), Magen, Schilddrüse und Pankreas, wurden untersucht.
Der chirurgische Eingriff, Epiphysectomie, wurde unter Ethernarkose gemäß der folgenden Technik durchgeführt. Ein 1 bis 1,5 cm langer Einschnitt wurde entlang der Zentrallinie des Kopfes gemacht. Nach Aufklappen der Kopfhaut wurde ein Loch oberhalb des Sinuskonfluenzpunktes mit Hilfe eines Lochstangenbohrers mit 0,5 cm Durchmesser gebohrt, dieser wurde extra aus einer für dieses Experiment hergestellten Metallröhre hergestellt. Die Epiphyse wurde mit Hilfe einer ophtalmischen Pinzette durch die Öffnung im Granium entnommen. Die Trepanationsöffnung wurde mit einem Knochenfragment bedeckt. Der Hauteinschnitt wurde mit einem Seidenfaden genäht.
Fragmente der extrahierten Organe wurden 24 Stunden in sauerer Bouin's Flüssigkeit für die mikroskopische Untersuchung und gemäß Kamovsky für die elektronenmikroskopische Untersuchung fixiert. Die Entwässerung und das Einbetten in Paraffin für die Lichtmikroskopie sowie die Eponmischung für die ultrastrukturelle Untersuchung der Proben wurden gemäß allgemein anerkannter Verfahren durchgeführt. Die Paraffinschnitte (7 μm) wurden auf einen Objektträger, der mit einer Poly-L-Lysinschicht (Sigma) beschichtet war, verbracht. Ultra-Dünnschnitte (100 nm) wurden mit einem LKB-7A-Mikrotom (LKB) hergestellt und mit Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt.
Die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden mit Hilfe eines Jenamed-2-Mikroskops (Zeiss) durchgeführt. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden mit Hilfe eines JEM-100S-Elektronenmikroskops (JEOL) durchgeführt.
Für das Färben wurde Hematoxylin-Eosin verwendet. Die gesamte Population an APUD-Zyten im Magenausgang und in Schnitten des Magenfundus wurden gemäß des Grimelius' histochemischen Versilberungsverfahrens (25) gezeichnet.
Immunhistochemischer Nachweis von enterochromophinen Zellen (EC-Zellen) wurde durch Verwendung von Mausmonoklonalen Antikörper gegen Serotonin durchgeführt (Dako, 1:15 Titer). Die monoklonalen Antikörper wurden mit Hilfe des Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren (ABP) (Vectastain Kit) nachgewiesen, um Immunserumglobuline der Mäuse nachzuweisen.
Die quantitativen Studien wurden mit Hilfe eines Computeranalysesystem für die Mikroskopie (Imstar) unter Verwendung von Morphostar und Colquant (Imstar) unter Anwendung von lizenzierten Computerprogrammen durchgeführt gemäß den Grundsätzen der Stereologie und Morphometrie (26). Die quantitative Dichte an Enteroendokrin-(END) (N_End) (N_END/1 mm²) und Serotonin-positiven Zellen (N_Ser/1 mm²) wurde in 10 sichtbaren Feldern bestimmt. Die Testfläche (S) bestand aus 5 mm².
Für die statistische Bearbeitung der erhaltenen Daten wurde das nicht parametrische Mann/Whitney U-Kriterium angewendet.
Die Ergebnisse der funktionalen DNES Morphologie-Untersuchungen, die an epiphysectomierten Ratten mit Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid durchgeführt worden, zeigten, dass das Tetrapeptid den Gewebe- und den zellulären Stoffwechsel stimuliert.
Es wurde gefunden, dass die L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid-Verabreichung eine kompensierende Wirkung auf die strukturelle und funktionale Organisation der DNES-Zellen bei Tieren, die eine Epiphysectomie ausgesetzt waren, hervorrufen. Diese Wirkung wurde innerhalb drei Tage nach dem Ende der Tetrapeptidverabreichung durch komplette Suppression des Einflusses des Epiphysectomie manifestiert und für 12 Tage aufrecht erhalten, d.h. bis zur Beendigung des Experiments mit Bezug auf alle untersuchten Organe.
Die Daten bestätigen, dass der Hauptzielort des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids die Magen EC-Zellen sind, bei denen das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid die extra-pineale Synthese von Serotonin und Melatonin fördert (Tabelle 16) und somit im Endeffekt eine wollständige Kompensation der entfernten Hypophyse erlaubt.
Diese Ergebnisse der Experimente beweisen, dass L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid keine Toxizität aufzeigt, Anti-Oxidations-Abwehrindizes normalisiert und Stoffwechelsprozesse in den melaninproduzierenden Strukturen verschiedener Gewebe reguliert.
Tabelle 16 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die quantitativen Merkmale der untersuchten Parameter in verschiedenen Magenabschnitten von epiphysectomierten Ratten
Die Eigenschaften des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids zeigen in präklinischen Experimenten die manifestierte und prophylaktische und/oder therapeutische Anwendung als geroprotektive Substanz.
Beispiele von Ergebnissen, die in klinischen Studien mit den vorgeschlagenen Tetrapeptids erhalten wurden, zeigen dessen pharmakologischen Eigenschaften und bestätigen, dass die Erfindung in die medizinische Praxis umgesetzt werden kann.
Beispiel 9 Wirksamkeit der Verabreichung einer pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bei Patienten mit Störungen des Anti-Oxidations-Abwehrsystems zur Verhinderung verfrühter Alterung
Die untersuchte pharmakologische Substanz wurde in 14 Patienten (34 bis 69 Jahre alt) mit altersbedingter Pathologie (Hochdruckerkrankung, Herzanfallerkrankung, chronischer Gastritis, nicht Insulinabhängigen Diabetes Mellitus) und Reduktion der Anti-Oxidations-Abwehrindizes in Blut verabreicht.
Die Substanzen enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde intramuskulär in Form einer Injektionslösung mit einer einzelnen täglichen Dosis von 10 μm pro Injektion für 10 Tage verabreicht.
Bei Fällen mit Verabreichung des Arzneimittels wurde ein signifikanter Anstieg der Superoxiddismutaseaktivität und eine Abnahme an Gehalt von Lipidperoxidoxidationsprodukten beobachtet (Tabelle 17).
Tabelle 17 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Anti-Oxidations-Abwehrindizes im Blut bei altersbedingten Erkrankungen
Die Ergebnisse der Therapie beweisen die wiederherstellende Wirkung der pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf das Anti-Oxidations-Abwehrsystem des Organismus.
Beispiel 10 Wirksamkeit der pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid verabreicht zur Vorbeugung von verfrühter Alterung bei Patienten mit Störungen in der Melatonin-Synthese
Die pharmakologische Substanz wurde 11 Patienten im Alter von 39 bis 63 Jahren, die an Aspirin-Bronchialasthma leiden, verabreicht. Die Haupteigenschaft dieser Erkrankung besteht in der Assoziierung von Asphyxii-Anfällen mit Intertoleranz gegenüber Acetylsalicylsäure und anderen nicht steroiden anti-inflammatorischen Substanzen. N-Acetyl-5-Methoxykynurenamin (N-AMK) ein Analog in ihrer chemischen Struktur der Acetylsalicylsäure ist bekannt im Organismus durch Verstoffwechselung von Melatonin, einem Epiphysenhormon, gebildet zu werden. Die Melatonin-Synthese und entsprechend das Niveau an endogenen N-AMK ist in Patienten mit Aspirin-Bronchialasthma signifikant erniedrigt, dies wird durch ein niedriges Ausscheiden von 6-Sulfatoxymelatonin, dem wesentlichen Melatoninstoffwechselprodukt, im Urin bestätigt.
Dieses stellt einen neuen pathogenen Ansatz zur Behandlung der Aspirin-Bronchialasthma durch Korrektur des Melatonin-Niveaus im Organismus durch die pharmakologische Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bereit.
Die Substanz wurde intramuskulär in Form einer Injektionslösung täglich am Morgen mit einer Dosis von 10 μg über 10 Tage verabreicht.
Die Patienten wurden in einer Phase einer abklingenden Exazerbation oder einer vorübergehenden Besserung der Erkrankung begleitend von einer permanenten Antiasthmatherapie, die das Inhalieren und die orale Aufnahme von Glucocorticoiden beinhaltet, behandelt.
Vor, während und nach der Behandlung haben die Patienten monatlich ihren Gesundheitszustand aufgrund der Symptome, Husten, Auswurf, Schwierigkeiten beim Atmen, Brustkorbcongestion, Rasselgeräuschen, Asphyxieanfällen und Intoleranz gegenüber körperlicher Aktivität, Erkältung und Gerüchen. Die klinische Wirkung die durch das Präparat hervorgerufen wurden, wurden unmittelbar nach der Behandlung und innerhalb der nächsten 7 Monate auf Basis der von dem Patienten berichteten Analysen, die Daten auf ihren Gesundheitszustand, Leistungsfähigkeit, psychologischen Zustand, Schlafstörungen und täglichen Dosierungen von genommenen antiasthmatischen Arzneimitteln beinhalten, bestimmt.
Vor Beginn der Behandlung und unmittelbar nach Verabreichung der letzten Dosis des Arzneimittels wurden die externen Atmungsfunktionen bei allen Patienten mit Bezug auf die folgenden Parameter bestimmt: Vitalkapazität der Lunge (VBC), Atmenvolumen (TV), Gesamtlungenvolumen (TLC), erzwungende Vitalkapazität der Atmung (FVBC), maximale volumetrische Ausatmungsrate (MV_exhR), maximale volumetrische Ausatmungsrate bei 50% und 75% forcierte VBC (VBC₅₀ und VBC₇₅) forcierte Atmung (FEV₁). Diese Parameter wurden als Prozent des anfänglichen Wertes gemessen. Weiterhin wurde die spezifische Durchleitung des Bronchialstamms in cm-Säule bestimmt. Der gesamte Komplex wurde mit Tests innerhalb von 15 Minuten nach Inhalieren mit Berotek wiederholt. Die Veränderungen von MVR, VBC₅₀ und VBC₇₅ nach Inhalation von Berotek wurde als Prozente der anfänglichen Werte bestimmt. Der FEV-Index in allen Patienten vor Behandlung war weniger als 80% des Sollwerts.
Der Gehalt an 6-Sulfatoxymelatonin, dem grundsätzlichen Melatoninmetaboliten wurde vor, unmittelbar nach und innerhalb 10 Tagen nach der Behandlung im Urin, der zur Tageszeit (von 9 Uhr bis 21 Uhr) und nachts (von 21 Uhr bis 9 Uhr) genommen wurde, gemäß den immunofermentalen Verfahren mit Hilfe eines „DRG Instrument GmbH"-Kits (Marburg, Deutschland) gemessen. Die Ergebnisse der Untersuchungen bestätigen, dass eine Verbesserung des klinischen Zustands am Ende der Behandlung bei der wesentlichen Mehrheit der Patienten, die mit der untersuchten pharmakologischen Substanz behandelt wurden, vorliegt. Eine reduzierte Häufigkeit von Asthmasymptomen am Tage, eine reduzierte Intoleranz gegenüber körperlicher Arbeit, starken Gerüchen und kalter Luft genauso wie eine Verbesserung beim Schlaf wurde registriert. Objektive Beobachtungen der Patienten zeigten eine Abnahme oder ein absolutes Verschwinden der Rasselgeräusche in den Lungen, Symptome einer bronchialen Verstopfung. Eine Untersuchung der externen Atmungsfunktion nach Beendigung der Behandlung zeigte keine wesentlichen Veränderungen in VBC, MV_exhR, FEV₁, TV/TLC. Die Patienten, die einer Tetrapeptidhaltigen pharmakologischen Substanz ausgesetzt waren, zeigten aber eine Verbesserung in der Reaktion gegenüber Berotek auf dem Niveaus der distalen Bronchien. Das Ausscheiden von 6-Sulfatoxymelatonin im Urin nahm zu, dies zeigt eine Erhöhung der Melatoninproduktion nicht nur nachts, sondern auch am Tage.
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Claims

Tetrapeptid L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin der allgemeinen Formel L-Ala-L-Glu-Asp-Gly.
Tetrapeptid L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin der allgemeinen Formel L-Ala-L-Glu-Asp-Gly zur Verwendung als Substanz, die eine geroprotektive Wirkung erzeugt.
Zusammensetzung umfassend einen wirksamen Grundstoff und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, bei dem der wirksame Grundstoff eine wirksame Menge des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly Tetrapeptids oder eines Salzes davon umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, bei der das Salz ein Salz der Aminogruppe ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, bei der das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetat, Hydrochlorid und Oxalat.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, bei der das Salz ein Salz der Carboxylgruppe ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, bei der das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Kalzium, Lithium, Zink, Magnesium, Ammonium und Triethylammonium.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, präsentiert in einer für die parenterale Verabreichung geeigneten Form.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, präsentiert in einer für die intranasale Verabreichung geeigneten Form.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, präsentiert in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form.
Verwendung eines Tetrapeptids gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments.
Verwendung eines Tetrapeptids gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10 in der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung verfrühter Alterung.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Vorbeugung die Erhöhung der Superoxidismutaseaktivität, die Erniedrigung der Lipidperoxid-Oxidationsprodukte und die Zunahme der Melatoninproduktion umfasst.
Verwendung eines Tetrapeptids gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Aspirin-Bronchialasthma.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, bei der die Zusammensetzung ein Salz des Tetrapeptids umfasst und das Salz ein Salz der Aminogruppe ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, bei der das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetat, Hydrochlorid und Oxalat.
Verwendung gemäß Anspruch 15, bei der das Salz ein Salz der Carboxylgruppe ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, bei der das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Calcium, Lithium, Zink, Magnesium, Ammonium und Triethylammonium.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 präsentiert in einer für die lokale Verabreichung geeigneten Form.