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Bereich der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Arzneimittel und kann
als geroprotektive Substanz zur Vorbeugung einer verfrühten Alterung
des Organismus verwendet werden. Es ist bekannt, dass einige der Hauptmechanismen
für die
Alterung des Organismus sind: eine Zunahme der molekularen Läsionen,
die durch freie Radikale verursacht werden, funktionelle Störungen des
Anti-Oxidations-Abwehrsystems
und Veränderungen
der physiologischen Funktionen der Epiphyse (1, 2, 3).
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Hintergrund
der Erfindung
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Da
das erfindungsgemäß beanspruchte
Tetrapeptid eine biologische Aktivität, nämlich eine geroprotektive Aktivität aufzeigt,
muss auf eine Gruppe von Verbindungen, die Antioxidationseigenschaften
besitzen als in ihrer Anwendung analoge Verbindungen Bezug genommen
werden. Das Nahrungsergänzungsmittel
Ionol (2,6-Di-tert-butyl-4-Methylphenol) ist ein allgemein bekannter
Inhibitor der Prozesse von Radikalen, es fördert eine Verlängerung
der Lebensdauer von Mäusen
des LAF1-Stamms, die durch beschleunigte
Alterung gekennzeichnet sind (4). Das auf 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol
basierende Pharmazeutikum (Dibunol) wird allerdings in Form eines
Einreibemittels hergestellt und wird im Wesentlichen im urologischen
Bereich zur Behandlung von Krebspatienten verwendet (5). Die Zugabe
des Antioxidans Ethoxhin (Santohin) zur Nahrung verlängerte die
Lebensdauer von C3H-Mäusen
(6). Eine Zunahme der Lebensdauer von Experimentaltieren wird weiter
durch 2-Ehtyl-6-Methyl-3-Oxypyridin-Chlorhydrat, einem gering toxischen,
wasserlöslichen
Antioxidans, gefördert,
hierbei handelt es sich um ein Strukturanalog des Vitamins B6 (7, 8). Eine unbedeutende Verlängerung
der Lebensdauer von Experimentaltieren wurde durch 2-Mercaptoethanolamin,
Butylhydroxytoluol, Cystein, 3-Hydroxypyridin, Centrophenoxyn, Milch-
und Glykonsäuren
und Glutathion ermöglicht
(9, 10). Bei diesen Verbindungen handelt es sich nicht um pharmazeutische
Präparate
und sie haben bisher noch keine Anwendung in der Medizin als geroprotektive
Substanzen gefunden. Die Verabreichung der Vitamine A, C, E führte bei
Experimentaltieren ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensdauer (11,
12, 13). Eine Übersättigung
des Organismus mit diesen Vitaminen kann allerdings einen unvorteilhaften
Einfluss auf die Funktionen der Organe und Systeme haben und eine
ausgeprägte
Entwicklung einer Hypervitaminosis verursachen. Für β-Catechol, ein Präparat, dessen
Zusammensetzung aus Vitaminen und pflanzlichen Substanzen gebildet wird,
ist bekannt, dass es antioxidative Wirkung aufzeigt (14). Die Verabreichung
dieses Präparats
an Mäusen des
Stamms SAM-P8, die eine beschleunigte Alterung aufzeigen, steigerte
die Überlebensrate
dieser Tiere. Die Mechanismen dieser geroprotektiven Wirkung werden
allerdings bisher noch nicht untersucht, dieses limitiert dessen
Integration in die klinische Praxis. Wenn Mäuse des Stammes SAM, die für eine beschleunigte Alterung
prädisponiert
sind, auf eine Diät
mit einer erhöhten
Menge an Carnosin (β-Ala-His)
für 7 Monate
gehalten werden, nimmt ihre Todesrate ab (15).
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Carnosin
ist kein pharmazeutisches Präparat;
dessen geroprotektive Eigenschaften wurden bisher nicht untersucht.
Eine geringe Erhöhung
der durchschnittlichen Lebensdauer von Mäusen wurde durch Verabreichung
von Melatonin, einem Epiphysenhormon, erzielt (16). Der Einfluss
des Melatonins ist assoziiert mit dessen Anti-Oxidationseigenschaft
(17). Allerdings zeigte ein Aussetzen von Drosophila Melanogaster,
die aufgrund ihrer hohen embryonalen Sterberate ausgesucht wurden
(HEM-Stamm) gegenüber
Melatonin keine geroprotektive Wirkung auf, obwohl dieses von einer
antioxidativen Wirkung begleitet wurde. Melatonin ist kein pharmazeutisches
Präparat
und wird in Form von biologisch aktiven Nahrungsergänzungsmitteln
hergestellt.
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Gerovital,
ein Novocain enthaltendes Arzneimittel, wird als geroprotektive
Substanz verwendet. Die Nachteile dieses Präparats bestehen in dessen möglichen
negativen Einfluss auf die Funktionen des kardiovaskulären Systems,
seinen allergischen Einfluss, manchmal Schlafstörungen, ein Gefühl von Ängstlichkeit, muskuläre und artikuläre Schmerzen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
beanspruchte Erfindung zielt auf den Erhalt einer neuen, biologischen
aktiven Verbindung aus einem Peptid, die eine geroprotektive Wirkung
aufzeigt.
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Die
beanspruchte Peptidverbindung, das Tetrapeptid, hat keine Strukturanaloga.
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Gemäß der Erfindung
wird ein Tetrapeptid, L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin der
allgemeinen Formel L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly beansprucht.
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Erfindungsgemäß zeigte
das Tetrapeptid L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin mit der folgenden Aminosäuresequenz:
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly eine biologische Wirkung, nämlich eine
geroprotektive Wirkung aufgrund der Stimulation der Indizes für das Anti-Oxidationsabwehrsystem
und aufgrund der Prozesse der Melatoninsynthese in den Strukturen
des diffusen neuroendokrinen Systems.
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Das
Tetrapeptid wird durch ein klassisches Verfahren der Peptidsynthese
in einer Lösung
erhalten (19).
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Die
geroprotektive Wirkung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde
in Versuchstests bestätigt. Die
Studie für
die geroprotektive Wirkung wurde in Drosophila melanogaster durch
Analyse der Indizes der Anti-Oxidationsabwehr, der Lebensdauer und
der Länge
des Vermehrungszeitraums bestimmt, genauso wie in Ratten durch Untersuchungen
der Synthese von Melatonin außerhalb
der Epiphyse.
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Erfindungsgemäß schließt die pharmakologische
Substanz, die eine geroprotektive Wirkung aufzeigt als wirksamen
Inhaltsstoff eine wirksame Menge des Tetrapeptids der Formel L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin
(L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) oder dessen Salze ein.
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Erfindungsgemäß kann die
pharmakologische Substanz, die eine geroprotektive Wirkung aufzeigen kann,
kann Salze der Aminogruppen (Acetat, Hydrochlorid und Oxalat) oder
der Carboxylgruppen (Metallsalze mit Natrium, Kalium, Calcium, Lithium,
Zink, Magnesium und anderen organischen und anorganischen Kationen,
Ammonium, Triethylammonium) enthalten.
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Erfindungsgemäß ist die
pharmakologische Substanz zur parenteralen, intranasalen, oralen
Verabreichung oder zur lokalen Applikation vorgesehen.
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Die
geroprotektive Wirkung aufzeigende, beanspruchte pharmakologische
Substanz ist in der Lage, die Indizes des Anti-Oxidationsabwehrsystems
und des Prozesses der Melatonin-Synthese in Strukturen des diffusen
neuroendokrinen Systems zu stimulieren, die dann Alterungsprozesse
inhibieren und die Erhöhung der
Lebensdauer fördern.
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Der
Ausdruck „geroprotektive
Substanz", wie er
vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf die Substanz, die ein
Altern verhindert und das Leben verlängert durch das Verhindern
einer verfrühten
Alterung, dieses benötigt
die Stimulierung des Anti-Oxidationsabwehrsystems
und einen regulierenden Einfluss auf Stoffwechselprozesse in Strukturen
des diffusen neuroendokrinen Systems.
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Der
Ausdruck „pharmakologische
Substanz" wie er
vorliegend verwendet wird, impliziert die Verwendung irgendeiner
Form von Arzneimittel, die das Tetrapeptid oder dessen Salze enthält, für prophylaktische oder
therapeutische Zwecke in der Medizin als geroprotektive Substanz
bei verfrühter
Alterung.
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Der
Ausdruck „wirksame
Menge" wie er vorliegend
verwendet wird, impliziert die Verwendung einer solchen Menge an
wirksamen Inhaltsstoff, der unter Einhaltung der quantitativen Indizes
der Wirksamkeit und der Toxizität
und aufgrund des vorhandenen Wissens in dieser Form des Arzneimittels
wirksam sein muss.
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Der
Ausdruck „pharmakologische
Zusammensetzung" wie
er vorliegend verwendet wird, impliziert verschiedene Arzneiformen
des Präparats.
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Um
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen zu erhalten, wird das vorgesehene Tetrapeptid
oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Derivate als wirksamer Inhaltsstoff
mit einem pharmazeutischen Träger
gemäß den pharmazeutisch
akzeptierten Verfahren des Zusammenmischens vermischt.
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Der
Träger
kann in Abhängigkeit
von der Arzneimittelform des Präparats,
wie sie zur Verabreichung gewünscht
ist verschiedene Formen annehmen, z.B. parenteral, intranasal oder
oral.
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Alle
bekannten pharmakologischen Komponenten können zur Herstellung der Zusammensetzungen in
Dosierungen, die zur oralen Verabreichung bevorzugt sind, verwendet
werden.
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Für die parenterale
(intranasale) Verabreichung schließt der Träger üblicherweise steriles Wasser
ein, es können
aber auch andere Inhaltsstoffe, die zur Stabilisierung oder zur
Aufrechterhaltung der Stabilität
beitragen, verwendet werden.
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Erfindungsgemäß umfasst
das Verfahren ein prophylaktisches oder therapeutisches Aussetzen
der Patienten gegenüber
der beanspruchten pharmakologischen Substanz in Dosierungen von
0,01 bis 100 μg/kg Körpergewicht
mindestens einmal am Tag über
einen Zeitraum notwendig zum Erzielen einer therapeutischen Wirkung:
10 bis 40 Tage in Abhängigkeit
von der Art und Schwere des pathologischen Prozesses.
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Erfindungsgemäß ist das
Tetrapeptid wirksam, wenn es in Dosen von 0,01 bis 100 μg/kg Körpergewicht
verabreicht wird, geringere (höhere)
Dosierungen können
ebenfalls verwendet werden, in Abhängigkeit von der Art und Schwere
des pathologischen Prozesses.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die
Erfindung wird mit Hilfe eines Beispiels zur Synthese des Tetrapeptids,
dessen Formel L-Alanyl-L-Glutamyl-L-Aspartyl-Glycin (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly)
ist (Beispiel 1), durch Beispiele für Toxizitätstests und Tests für die biologische
Wirksamkeit des Tetrapeptids (Beispiele 2 bis 8) und weiterhin durch
Beispiele, die die Ergebnisse der klinischen Anwendung dieses Tetrapeptids
darstellen und somit auch dessen pharmakologischen Eigenschaften
aufzeigen und bestätigen,
dass es die Möglichkeit
gibt, eine prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung zu erzielen
(Beispiel 0, 10), weiter dargestellt.
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Beispiel 1 Synthese des
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids
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- 1. Produktname: L-Alanyl-L-Gutamyl-L-Aspartyl-Glycin
- 2. Strukturformel: H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH
- 3. Molekularformel ohne Ionenpaar: C14H22N4O9
- 4. Molekulargewicht ohne Ionenpaar: 390.35.
- 5. Ionenpaar: Acetat.
- 6. Aussehen: weißes
amorphes geruchloses Pulver.
- 7. Syntheseverfahren: Das Peptid wird durch ein klassisches
Verfahren der Synthese in Lösung
durch das folgende Schema erhalten:
- Z
- = Benzyloxycarbonylgruppe
- BOC
- = tert.Butyloxycarbonylgruppe
- OSu
- = N-Oxysuccinimidester
- OBzl
- = Benzylester
- DCC-N,
- N'-Dicyclohexylcarbodiimid
- HOBT
- = N-Oxybenzotriazol
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N,N'-Dimethylformamid
wurde als Lösungsmittel
verwendet. Bei Zugabe der Asparaginsäure wurde die α-COOH-Gruppe
durch Versalzung mit Hilfe von Triethylamin geschützt. Das
Entfernen der BOC-Schutzgruppe wurde mit einer Lösung von Trifluoroessigsäure (TFA)
durchgeführt;
das Entfernen der Z-Schutzgruppe wurde
durch katalytische Hydrierung durchgeführt. Die Extraktion und Aufreinigung
des Produkts wurde mit dem Verfahren der präparativen Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) auf Umkehrphasensäulen durchgeführt.
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Eigenschaften des Endprodukts
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- – Aminosäureanalyse:
Glu
Asp Ala Gluy
1,02 1,00 1,01 1,00
- – Peptidgehalt:
98,4% (mittels HPLC, 220 nm)
- – Dünnschichtchromatographie
(TLC): Einzelbande, Rf = 0,73 (Acetonitril/Essigsäure/Wasser,
5:1:3)
- – Feuchtigkeitsgehalt:
5
- – pH
der 0,0001% Lösung:
4,37
- – spezifische
optische Aktivität:
[α]D 22: –32° (c = 1,
H2O)
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Synthesebeispiel:
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1. BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH
(I), N-tert.-Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)aspartat
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4,3
g (0,0100 Mol) N-Oxysuccinimidester der N-tert.-Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)Glutaminsäure (BOC-Glu(OBzl)-OSu)
wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und zu 1,72 ml (0,0125 Mol)
Triethylamin und 2,80 g (0,0125 Mol) β-Benzylasparatat hinzugefügt. Die
Mischung wurde für
24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde
das Produkt mit 0,5 N (150 ml) Schwefelsäure präzipitiert, mit Ethylacetat
extrahiert (3 × 33
ml), mit 0,5 N Schwefelsäure
(2 × 20
ml) Wasser, 5%-Lösung
von Natriumbicarbonat (1 × 20
ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäure
(2 × 20
ml), Wasser gewaschen, die Lösung
wurde wurde über
wasserfreien Na2SO4 getrocknet.
Ethylacetat wurde abfiltriert und im Vakuum bei 40°C entfernt.
Der Rest wurde in vacuo über
P2O5 getrocknet.
Als Ergebnis wurden 5,68 g (≈ 100%) Öl erhalten.
Rf = 0,42 (Benzol/Aceton 2:1, Sorbfilplatten,
8 bis 12 μm
Silicagel, UV und Chlor/Benzidin-Entwicklung).
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2. TFA-H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH
(II), (γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)aspartat Trifluoroacetat
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5,68
g (≈ 0,01
Mol) N-tert.Butyloxycarbonyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat
(I) wurden in 20 ml Dichlormethan-Trifluoressigsäuremischung (3:1) gelöst. Zwei
Stunden später
wurde das Lösungsmittel
bei 40°C
entfernt. Dieses Entfernen wurde durch Zugabe eines weiteren Teils
Dichlormethan (2 × 10
ml) wiederholt, der Rest wurde im Vakuum über NaOH getrocknet. 5,80 g
(≈ 100%) Öl wurden
erhalten. Rf = 0,63 (N-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser,
15:10:3:12).
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3. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH
(III), N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat
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5,65
g (0,01 Mol) (γ-Benzyl)Glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat
Trifluoracetat (II) wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, es wurden
2,80 ml (0,02 Mol) Triethylamin und 4,14 g (0,013 Mol) N-Oxysuccinimidester
von N-carbobenzoxyalanyl hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde
bei Raumtemperatur für
24 Stunden gerührt.
Das Produkt wurde mit 0,5 N Schwefelsäure (150 ml) präzipitiert,
mit Ethylacetat (3 × 30
ml) extrahiert, mit 0,5 N Schwefelsäure (2 × 20 ml), Wasser, 5% Lösung von
Natriumbiocarbonat (1 × 20
ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäure
(2 × 20
ml) und Wasser gewaschen. Die Lösung
wurde über
wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, das
Ethylacetat wurde abgetrennt und im Vakuum bei 40°C entfernt.
Der Rest wurde in Ethylacetat/Hexansystem rekristallisiert. Das
Produkt wurde filtriert und im Vakuum über P2O5 getrocknet. Die Ausbeute betrug 4,10 g
(66%). Der Schmelzpunkt (Tml) ist 154°C. Rf = 0,48 (Benzol-Aceton, 1:1), Rf =
0,72 (N-Butanol/Pyridin/Essigsäure,
Wasser, 15:10:3:12).
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4. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl
(IV), N-carbobenzooxyalanyl (γ-Benzyl)glutamyl-(β-Benzyl)Aspartylglycinbenzylester
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1,01
g (3 mMol) Benzylester von Glycintosylat TosOH-H-Gly-OBzl wird in
15 ml Tetrahydrofuran suspendiert und mit 0,4 ml (3 mMol) Triethylamin
unter Rühren
vermischt, anschließend
wird innerhalb von 5 Minuten 1,28 g (2 mMol) N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)Glutamyl-(β-Benzyl)Aspartat
(III) und 0,27 g (2 mMol) N-oxybenzotriazol hinzugefügt. Die
Mischung wird auf 0°C
abgekühlt.
Anschließend
werden 0,42 g (2 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung in
5 ml Tetrahydrofuran, gekühlt
auf 0°C,
hinzugefügt.
Die Mischung wird bei dieser Temperatur für 2 Stunden gerührt und
konnte über
Nacht bei Raumtemperatur stehen bleiben. Das restliche Dicyclohexylharnstoff
wurde abfiltriert und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt und der Rest wird in 30 ml Ethylacetat gelöst. Die
Lösung
wurde gewaschen mit 1 N Schwefelsäure, Wasser, 5%-Lösung Natriumbicarbonat,
Wasser, 1 N Schwefelsäure,
Wasser und über
wasserfreiem Na2SO4 getrocknet.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt und das Produkt in Ethylacetat/Hexansystem
rekristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,30 g (82%). Tml =
146–148°C. Rf = 0,75 (Benzol/Aceton, 2:1).
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5. H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH
(V), Alanyl-Glutamyl-Aspartyl-Glycin
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1,25
g N-carbobenzoxyalanyl-(γ-Benzyl)glutamyl(β-Benzyl)aspartylglycinbenzylester
(III) wurden in Methanol-Wasser-Essigsäuresystem (3:1:1) über Pd/C
hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mittels TLC mit Benzol-Aceton
(2:1) und Acetonitril-Essigsäure-Wasser(5:1:3)-Systemen überwacht.
Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat
wurde im Vakuum entfernt, und der Rest wurde in einem Wasser-Methanol-System
rekristallisiert. Das Produkt wurde im Vakuum über KOH getrocknet. Die Ausbeute betrug
520 mg (95%). Rf = 0,73 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser, 5:1:3). Zur Aufreinigung
wurden 390 mg des Produkts in 4 ml 0,01% Trifluoressigsäure gelöst und eine
HPLC auf Umkehrphasensäulen
50 × 250
mm Diasorb-130-C16T, 7 μm
unterworfen. Als Chromatograph wurde ein Beckman System Gold, 126
Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module verwendet. Die Bedingungen
der Chromatographie waren A: 0,1% TFA, B: 50% MeCN/0,1% TFA, Gradient
B 0 → 5% über 80 Minuten.
Das Probenvolumen betrug 5 ml, der Nachweis wurde bei 215 nm durchgeführt, Scannen
von 190–600
nm mit einer Flussrate von 10 ml/min. Die Fraktion wurde zwischen
54,0 bis 66,0 Minuten gesammelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum
bei einer Temperatur, die nicht 40°C überschritt, entfernt, dieses
wurde mehrfach (5-fach) mit 10 ml 10% Lösung Essigsäure wiederholt. Schließlich wurde
der Rest in 20 ml deionisiertem Wasser gelöst und lyophilisiert. Als Ergebnis
wurden 290 mg aufgereinigtes Produkt in Form eines amorphen, geruchslosen,
weißen
Pulver erhalten. Das erhaltene Peptid in Form seines Acetats wurde
in die freie Form durch Aufarbeitung mit IRA-Anionit oder mit einer
analogen Substanz in der (OH–)-Form. Danach wurden
die Salze der Aminogruppen durch anschließenden Zusatz eines entsprechenden
Säureäquivalenz
(Hydrochlorid oder Oxalat) erhalten. Die erhaltene Wasserlösung wurde
lyophilisiert und als Endprodukt analysiert.
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Um
entsprechende Salze der Carboxylgruppen zu erhalten, wurden zu dem
freien Tetrapeptid eine berechnete Menge einer wässrigen Lösung eines Hydroxid eines entsprechenden
Metalls (NaOH, KOH, Zn(OH)2, LiOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, NH4OH) hinzugefügt.
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Um
das Triethylammoniumsalz zu erhalten, wurde das Verfahren in ähnlicher
Weise unter Verwendung von Triethylamin als Base durchgeführt.
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6. Analyse
des Endprodukts
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Der
Peptidgehalt wurde mittels HPLC auf einer Surelco LC-18-DB-Säule, 4,6 × 250 mm,
Grad. LC-18-DB bestimmt. A: 0,1% TFA, B: 50% MeCN/0,1% TFA; grad.
B 0 → 20%
in 30 Minuten. Die Flussgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Der Nachweis
wurde bei 220 nm durchgeführt,
das Scannen von 190 bis 600 nm, das Probenvolumen betrug 20 μl. Peptidgehalt:
98,45%.
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Die
Aminosäureanalyse
wurde mittels AAA"T-339" Prag durchgeführt. Die
Hydrolyse wurde in 6 N HCl bei 125°C für 24 Stunden durchgeführt.
Glu
Asp Ala Gly
1,02 1,00 1,01 1,00
TLC: Einzelbande, Rf =
0,73 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser,
5:1:3). Sorbfilplatten, 8 bis 12 μm
Silicagel, Entwicklung in Chlor/Benzidin. Feuchtigkeitsgehalt 5%
(gravimetrisch gemäß dem Wasserverlust
durch Trocknung: 20 mg bei 100°C).
pH einer 0,001%-Lösung:
4,37 (potentiometrisch). Spezifische optische Aktivität: [α]D 22: –32° (c = 1,
H2O), „Polamat
A", Carl-Zeiß Jena
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Beispiel 2 Untersuchung
des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly auf Toxizität
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Die
Studie einer allgemeinen Toxizität
des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-Asp-Gly wurde gemäß den „Regeln zur präklinischen
Beurteilung der Sicherheit von pharmakologischen Substanzen" (GLP) durchgeführt.
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Der
Zweck der Studie ist die tolerierbare toxische Dosis des Präparats zu
bestimmen, den Grad und den Charakter pathologischer Veränderungen
in verschiedenen Organen und Systemen des Organismus zu beurteilen
und den Zusammenhang von toxischen Effekten, die aufgrund der Dosis
auftreten, und der Dauer der Aufnahme des Arzneimittels aufzudecken.
Die Bestimmung der akuten Toxizität des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids
wurde gemäß Kerber
durchgeführt.
Die Untersuchung wurde an 66 weißen männlichen Mischlingsmäusen mit
einem Gewicht von 20 bis 23 g durchgeführt, diese wurden im Käfig unter
Standardbedingungen gehalten und mit Standardrationen gefüttert. Die
Tiere wurden zufällig
in sechs gleiche Gruppen geteilt, jede mit 11 Mäusen. Die Tiere wurden intramuskulär mit dem
Tetrapeptid in Dosen von 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg und
5 mg/kg in 0,25 ml injiziert (einige tausendfach oberhalb der therapeutischen
Dosis, wie sie für
klinische Versuche empfohlen wird). Die Kontrolltiere erhielten
die gleiche Menge an Natriumchlorid.
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Über 22 Stunden
und bis zu 14 Tage verstarb keines der Tiere irgendeiner Gruppe.
Es wurden keine Veränderungen
im Allgemeinzustand, dem Verhalten, der motorischen Aktivität, dem Haar-
und Hautaussehen, oder den physiologischen Ausscheidungen der Tiere
beobachtet.
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Somit
löst das
Tetrapeptid L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly in Dosen, die einige tausendfach über der
empfohlenen therapeutischen Dosis für klinische Studien lag, keine
akute toxische Reaktion aus, dies zeigt eine breite therapeutische
Anwendbarkeit dieses Präparats.
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Die
Studie für
die subakute Toxizität
des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids wurde mit 60 Mischlingsratten
mit einem Körpergewicht
von 150 bis 250 g durchgeführt.
Die Versuchstiere wurden täglich
einer einzelnen intramuskulären
Verabreichung des Arzneimittels über
90 Tagen in Dosen von 1 μg/kg,
0,3 mg/kg, 3 mg/kg in 0,5 ml Natriumchloridlösung unterworfen. Den Tieren
der Kontrollen wurde die gleiche Menge Natriumchlorid verabreicht.
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Über den
gesamten Untersuchungszeitraum wurden die Tiere täglich beobachtet.
Das Verhalten der Tiere, der Nahrungs- und der Wasserverbrauch,
der Zustand des Haaraufbaus und der mukosalen Membran wurden registriert.
Die Tiere wurden wöchentlich
gewogen. Vor Verabreichung nach dem 30., 60. und 90. Tag der Verabreichung
des Tetrapeptids wurde die morphologische Zusammensetzung und die
Eigenschaften des peripheren Bluts untersucht. Die biochemischen
und coaguloratorischen Eigenschaften des Bluts wurden nach Beendigung
des Experiments untersucht.
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Die
chronische Toxizität
des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten wurde, wurde durch Langzeitverabreichung davon an Ratten
mit einem Körpergewicht
von 150 bis 250 g untersucht. Die Tiere wurden täglich einer einzelnen intramuskulären Verabreichung
des Mittels in Dosen von 1 μg/kg,
0,1 mg/kg, 1 mg/kg in 0,5 ml Natriumchloridlösung über 6 Monate ausgesetzt. Das
Verhalten der Tiere, der Nahrungsmittel- und Wasserverbrauch, der
Zustand des Haaraufbaus und der mukosalen Membranen wurde untersucht.
Die Tiere wurden täglich
innerhalb der ersten drei Monate des Experiments und anschließend einmal
im Monat gewogen. Drei Monate nach Verabreichung und zum Ende des
Experiments wurden hämatologische
und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Funktion des kardiovaskulären Systems,
der Leber, Pankreas, Nieren und Nebennieren wurde untersucht. Nach
Ende der Verabreichung wurden einige Tiere pathomorphologischen
Untersuchungen unterworfen, um den Zustand verschiedener Bereiche
des Gehirns, des Knochenmarks, des Herzen, der Aorta, der Lunge,
der Leber, der Nieren und der endokrinalen Organe und des Immunsystems
festzustellen.
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Die
Beurteilung des allgemeinen Zustands der Tiere, morphologische und
biochemische Indizes des peripheren Bluts, der morphologische Zustand
der intrinsischen Organe, der Status des kardiovaskulären und des
Atemsystems, der Leber- und Nierenfunktionen zeigte keine pathologischen
Veränderungen.
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Die
Untersuchungen des Tetrapeptids L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly auf subakute
und chronische Toxizität bestätigte das
Nichtvorhandensein von Nebenwirkungen bei Langzeitverabreichung
des Arzneimittels in Dosen, die therapeutische Dosen um das 100-
bis 1000-fache überschreiten.
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Beispiel 3. Einfluss des
L-Ala-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die Prozesse
der freien Radikale in Drosophila melanogaster des HEM-Stamms ausgewählt aufgrund
seiner hohen embryonalen Sterberate
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L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
wurde Drosophila melanogaster-Larven im 2. Stadium des Stamms HEM,
ausgewählt
wegen einer hohen Alterungsrate, verabreicht (20). Der HEM-Stamm
ist gekennzeichnet durch eine einzigartige Dynamik der embryonalen
Sterblichkeit, die in einer erhöhten
Frequenz des frühen
embryonalen Sterbens von 65% am ersten Tag der Eiablage bis auf
95% am vierten Tag, in einer verringerten durchschnittlichen Lebensdauer
(29 Tage) und in einer erhöhten
Stärke
der Lipidperoxidoxidation besteht.
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L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
wurde in Mengen von 0,00001% des Gewichts des Kulturmediums hinzugefügt, dies
ist eine extrem niedrige Dosis. Die in der Literatur zur Beeinflussung
von verschiedenen Substanzen auf Drosophila melanogaster beschriebene
Dosis liegt üblicherweise
im Bereich von 0,001 bis 0,01%. Geringere Dosen weisen normalerweise
keine Effekte auf.
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Die
biochemischen Parameter wurden an 14 Tage alten Fliegen untersucht.
In diesen wurde die Katalaseaktivität und die Intensität der Gewebechemolumineszenz analysiert
(21, 22, 23). Die Katalase ist das Grundenzym der antioxidativen
Abwehr. Der Grad seiner Aktivität
weist auf die Fähigkeit
des Organismus hin, oxidativen Stress zu widerstehen. Luminol abhängige Chemolumineszenz,
die durch Wasserstoffperoxid induziert wurde, reflektiert das Stadium
von aktivem Sauerstoff im Gewebe. Somit weist eine Abnahme der Chemolumineszenzintensität auf eine
Zunahme der Fähigkeit
des Organismus oxidativen Stress zu widerstehen auf.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Da signifikante
intersexuelle Unterschiede auf die untersuchten Indizes aufgefunden
wurden, sind die Daten für
Männchen
und Weibchen getrennt wiedergegeben.
-
Die
dargestellten Daten zeigen, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
einen signifikanten Anstieg der in der Katalaseaktivität bei den
männlichen
und weiblichen Versuchsfliegen im Vergleich zu den Kontrollen fördern.
-
Im
Allgemeinen nahm die Antioxidationsaktivität in Geweben, gekennzeichnet
durch den Grad an Chemolumineszenz unter dem Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid, nur
bei Weibchen zu.
-
Tabelle
1 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Katalasaktivität und die
Gewebechemolumineszenz in Drosophila melanogaster vom HEM-Stamm
-
Tabelle
2 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Lebensdauer in den verschiedenen
Experimentalgruppen.
-
Tabelle
2 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter
der Lebensdauer in Drosophila melanogaster vom HEM-Stamm
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, führt
das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid zu deutlich geroprotektiven
Wirkungen. Bei Weibchen verlängert
es signifikant die durchschnittliche Lebensdauer (p < 0,001) und verringert die
Alterungsrate (R) (P < 0,001).
Bei Männchen
erniedrigt es leicht die Alterungsrate (P < 0,05).
-
Somit
erhöht
das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid die durchschnittliche Lebensdauer
um 26% und reduziert die tatsächliche
Alterungsrate in der Population, bestimmt durch den Wert des Gomperz-Parameters um
40%.
-
Beispiel 4. Einfluss des
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Fortpflanzungsfunktionen
von Drosophila melanogaster des HEM-Stamms; ausgewählt für seine
hohe embryonale Sterblichkeitsrate
-
Der
Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf Drosophila melanogaster
wurde im zweiten bis dritten Stadium der Larven durch Zugabe des
Präparats
zum Kulturmedium in einer Dosis von 0,00001% des Mediumgewichts,
welches ca. 0,015 mg/100 ml entspricht, getestet. Die am ersten
Tag ausgeschlüpften Fliegen
wurden jeweils 5 Paare in Teströhrchen
verbracht und alle drei bis sechs Tage auf frisches Medium transferiert.
-
Die
folgenden Faktoren wurden berücksichtigt:
Der
Anteil an Teströhrchen
(von ihrem anfänglichen
Wert), die lebende Weibchen enthielten (in Tabelle 3 – der Anteil
an lebenden Kulturen).
Der Anteil an Teströhrchen (Zahl der Lebendkulturen),
in denen Nachkommen erhalten wurden (in Tabelle 3 – Anteil
an fruchtbaren (fertilen) Kulturen).
-
In
jeder Variante des Experiments wurden 75 Elternpaare analysiert.
Die Unterschied zwischen den Fertilitätsindizes wurden mit Hilfe
der Fischer-Genauigkeitskriterien für 2 × 2 Anpassungstabellen definiert
(24).
-
Die
Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 3 dargestellt. Für jede experimentelle
Variante sind die Anteile an lebenden und fertilen Kulturen dargestellt.
Wie in der Tabelle gezeigt, übersteigt
der Anteil an im Tetrapeptid behandelten fertilen Kulturen den analogen
Anteil in der Kontrolle. Es wird gezeigt, dass der Anteil an fertilen
Kulturen in der L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid Variante wesentlich
höher ist
(p < 0,05) als
in den Kontrollen im Alter von 32 Tagen.
-
Die
Koeffizienten der linearen Regression sind in Tabelle 4 dargestellt.
Wie in der Tabelle gezeigt, unterscheiden sich die Koeffizienten
der Kontrollregressionsgeraden signifikant von denen des Versuchs.
Der „a"-Koeffizient (gibt
den Anstieg der geraden Linie wieder) in der Kontrolle ist 1,8-fach
größer als
der Regressionskoeffizient der Versuchstiere.
-
Damit
wird aufgezeigt, dass der Anteil an fertilen Kulturen in der Kontrollvariante
im Vergleich zu der L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid Variante zweifach
schneller abnimmt. Die Dauer der Fortpflanzungsperiode war 30 Tage
für Kulturen,
die nicht dem Tetrapeptid ausgesetzt waren und 47 Tage bei Kulturen,
die dem Tetrapeptid ausgesetzt waren. Es wird gezeigt, dass das
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid den Fortpflanzungszeitraum 1,5-fach
verlängert.
-
Die
für die
Lebensdauer erhaltenen Daten wurden entsprechend analysiert. Die
Daten der Regressionsanalyse sind in Tabelle 5 dargestellt.
-
Wie
man aus der Tabelle entnehmen kann, nimmt der Anteil an Lebendkulturen
(d.h. Kulturen, in denen lebende Weibchen vorhanden sind) durchschnittlich
1,5-fach schneller ab in den Kontrollen). Der berechnete Median
für die
Lebensdauer (d.h. das Alter, bei dem 50% der Individuen gestorben
sind) die tatsächlich erreichte
Lebensdauer (d.h. die maximale Lebensdauer in verschiedenen Experimentalvarianten)
ist in Tabelle 6 dargestellt.
-
Wie
in der Tabelle gezeigt, ist bei den Varianten, denen L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid verabreicht wurde,
neben der Zunahme der Median-Lebensdauer ein maximaler rekordbrechender
Anstieg in der Lebensdauer erzielt worden (in den Stämmen von
Drosophila melanogaster mit hoher Alterungsrate): 100 Tage.
-
Tabelle
3 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Lebensdauer
und die Fertilität
der Kulturen und deren Anteil in den Kulturen des HES-Stamms von
Drosophila melanogaster
-
-
Tabelle
4 Koeffizienten der linearen Regression für die Abhängigkeit der Anteile an Fertilität in den
Kulturen vom Alter (y = B + A
x)
-
Tabelle
5 Koeffizienten der linearen Regression für die Abhängigkeit der Anteile an Lebenden
in den Kulturen vom Alter (y = B + A
x)
-
Tabelle
6 Parameter der Lebensdauer in verschiedenen Tests (Tage)
-
Beispiel 5 Einfluss des
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die
Prozesse der freien Radikale in Drosophila melanogaster mit geringer
Aktivität
(LA) ausgewählt
für eine
geringe sexuelle Aktivität der
Männchen
-
Die
Wirkung des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Katalaseaktivität, den Gehalt
an Produkten der Lipidperoxidaseoxidation (LPO), die Lebensdauer
und die Alterungsrate wurden in Drosophila melanogaster des LA-Stamms
untersucht.
-
Einen
Tag alte Fliegen wurden in Teströhrchen
gegeben, 10 Individuen des gleichen Geschlechts jeweils. Alle zwei
Tage wurden sie auf frisches Medium transferiert, wobei die Zahl
an der verstorbenen Individuen berücksichtigt wurde. Die durchschnittliche
und maximale Lebensdauer wurden bestimmt. Die Alterungsrate wurde
mit Hilfe der Parameter der Gomperz-Gleichung berechnet.
-
Das
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurden den Larven des dritten
Stadiums mit einer Dosis von 0,00001% des Gewichts des Kulturmediums,
was ca. 0,015 mg/100 ml war, verabreicht. Die Katalaseaktivität wurde
mit Hilfe allgemein anerkannter Verfahren in den Homogenaten der
erwachsenen 14 Tage alten Fliegen bestimmt. Das Experiment wurde
mit einer anschließenden
Wiederholung durchgeführt.
-
Die
Regression und die Verteilungsanalysen dienten als Grundtechniken
der statistischen Bearbeitung. Die Richtigkeit der Unterschiede
wurde mit Hilfe des Verfahrens der minimal relevanten Diversität bestätigt.
-
Es
wurde gefunden, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bei Weibchen
keine Veränderung
in der durchschnittlichen Lebensdauer induziert, aber eine Zunahme
der maximalen Lebensdauer (LSmax). Zur gleichen
Zeit verlängerte
die Substanz wesentlich die ALS in Männchen. Die Analyse der Kurven
der Überlebensraten
und der Gomperz-Darstellung zeigte, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
in Weibchen als Geroprotektor der ersten Art diente (ALS und LSmax waren erhöht, die Alterungsrate veränderte sich
aber im Vergleich zu der Kontrolle nicht). In Männchen wirkte es aber als Geroprotektor
der dritten Art (ALS war erhöht, LSmax veränderte
sich nicht, weiterhin wurde eine Tendenz der Erhöhung der Alterungsrate beobachtet).
-
Zur
gleichen Zeit zeigt die Analyse der Überlebensrate in Fliegen ohne
Berücksichtigung
ihrer geschlechtlichen Unterscheidung, dass der LSmax unter
Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids wesentlich verlängert war.
-
Die
Anwendung des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids bei Männchen erhöhte signifikant
die Katalaseaktivität,
während
der Gehalt an LPO-Produkten bei Weibchen wesentlich herunterging.
Die Unterdrückung zwischengeschlechtlicher
Unterscheidungen bestätigte
eine hohe Antioxidationsaktivität
des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids.
-
Tabelle
7 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter
der Lebensdauer bei weiblichen Drosophila melanogaster vom LA-Stamm
-
Tabelle
8 Einfluss des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Parameter
der Lebensdauer in männlichen Drosophila
melanogaster vom LA-Stamm
-
Somit
zeigte die Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid eine
alterungshemmende Wirkung bei Fliegen.
-
Tabelle
9 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die biochemischen
Indizes der Verfahren mit freien Radikalen in Drosophila melanogaster
vom LA-Stamm
-
-
Beispiel 6 Einfluss des
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids auf die Alterungsrate und die
Prozesse mit freien Radikalen in Drosophila melanogaster in umweltangepassten
(environmental adaptation EA)-Stamm ausgewählt für deren geringe Anpassungsfähigkeit
an die Umwelt
-
Drosophila
melanogaster vom EA-Stamm dienen als Modell, um den Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
auf die Katalaseaktivität,
die Gewebechemoluminesnzenz und die Lebensdauer zu untersuchen.
-
Einen
Tag alte Fliegen wurden in Teströhrchen
verbracht, 10 Individuen des gleichen Geschlechts jeweils. Alle
fünf bis
sieben Tage wurde diese auf frisches Medium verbracht, wobei die
Zahl an verstorbenen Individuen berücksichtigt wurde. Die durchschnittliche
und maximale Lebensdauer wurde bestimmt. Die Alterungsrate wurde
mit Hilfe der Parameter der Gomperz-Gleichung berechnet.
-
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
wurde in Larven des dritten Stadiums in einer Dosis von 0,00001% des
Kulturmediums, dies entsprach ca. 0,015 mg/100 ml angewendet. Die
Katalaseaktivität
und die Stärke
der Chemolumineszenz wurden in den Homogenaten der erwachsenen sieben
Tage alten Fliegen durch allgemein anerkannte Verfahren bestimmt.
Die Experimente wurden wiederholt.
-
Die
Regression und die Verteilungsanalysen dienten als Grundtechnik
der statistischen Bearbeitung. Die Richtigkeit der Unterschiede
wurde mit dem Verfahren der minimalen relevanten Verteilung bestätigt.
-
Die
Ergebnisse des Experiments sind in den Tabellen 10 bis 13 dargestellt.
-
Tabelle
10 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter
der Lebensdauer in weiblichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm
(Experiment 1)
-
Es
wurde gefunden, dass das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid eine
Wirkung auf die Luminol-abhängige
Chemilumineszenz hervorruft (Tabelle 14). Die Abnahme dieses Index
zeigt die Aktivierung des Anti-Oxidations-Abwehrsystems in den Fliegen
an. Die Zunahme der Intensität
in dem Anti-Oxidations-Abwehrsystems des Gewebes ist in diesem Fall
wahrscheinlich mit der Aktivierung von niedermolekularen, endogenen Anit-Oxidantien
verbunden, wie Glutathion, Tocopherol und dergleichen.
-
Eine
Ausweitung in der durchschnittlichen und der maximalen Lebensdauer
wurde nur in Fällen
beobachtet, bei denen ein verringerte Viabilität und ein beschleunigtes Altern
in den Kontrollen auftraten. Wie die dargestellten Daten aufzeigen,
ist dieses der Fall, wenn das untersuchte Tetrapeptid eine klare
geroprotektive Wirkung aufzeigt.
-
Tabelle
11 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter
der Lebensdauer bei männlichen Drosophila
melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 1)
-
-
Tabelle
12 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter
der Lebensdauer bei weiblichen Drosophila melanogaster vom EA-Stamm
(Experiment 2)
-
Tabelle
13 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter
der Lebensdauer in männlichen Drosophila
melanogaster vom EA-Stamm (Experiment 2)
-
Tabelle
14 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die biochemischen
Indizes der Prozesse der freien Radikale in Drosophila melanogaster
vom EA-Stamm
-
-
Beispiel 7 Einfluss von
L Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Lebensdauer von Drosophila
melanogaster vom Wildtypstamm Canton-S
-
In
diesem Experiment wurden Drosophila melanogaster vom Wildtyp-Stamm
Canton-S verwendet. L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
in löslicher
Form wurde zu dem Kulturmedium für
das Wachstum der Insekten gegeben, dieses wurde dann auf 50 bis
60°C heruntergekühlt und
anschließend
vorsichtig gerührt
und in die Teströhrchen
verbracht.
-
Um
die Bedingungen von sowohl der Kontroll- als auch der Testpopulation
identisch zu machen, wurde eine Menge von Natriumchlorid, die gleich
der verwendeten L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid-Lösung ist,
in das Kulturmedium für
die Kontrolle zugeführt.
Die Konzentration an allen verwendeten Substanzen wurde gerechnet
im Verhältnis
zu der Masse des Kulturmediums, das zur Vermehrung bereitgestellt
wurde.
-
Vier
Tage alte weibliche Fliegen wurden einer zufällig ausgewählten Paarung mit Männern über 20 Stunden
unterworfen, wobei jeweils ein Paar in jedem Teströhrchen war,
anschließend
wurden die Elternpaare aus dem Teströhrchen entfernt. Um jeweils
eine neue Generation zu bilden, wurden die Nachkommen von 50 bis
80 Paaren verwendet.
-
Die
Lebensdauer (life span, LS) wurde an Laborpopulationen untersucht,
jede davon bestand aus 90 Individuen eines jeden Geschlechts. Sofort
nach dem Schlüpfen
der Fliegen wurden diese zufällig
ausgewählt in
Teströhrchen
verbracht, jeweils 10 Individuen. Ein Austausch des Kulturmediums
wurde 3× die
Woche durchgeführt.
-
Die
Durchschnittswerte (ALS) und die Standardabweichungen wurden mit
bekannten Verfahren auf die Parameter für die Verteilung der Lebensdauer
angewendet. Die Durchschnittswerte wurden miteinander unter Anwendung
des Student-T-Tests verglichen.
-
Die
Tabelle 15 zeigt die Ergebnisse der Merkmale zur Verteilung der
Lebensdauer (Durchschnittswerte und Standardabweichungen dieser
Durchschnittswerte) für
alle Test- und Kontrollgruppen.
-
Für die Teststudie
wurden sechs Konzentrationen an L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid ausgewählt: 0,01 ×, 0,1 ×, 1 ×, 5 ×, 7,5 × und 12,5 × 10–6%
des Gewichts des Kulturmediums.
-
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid,
das den Männern
in den vier geringsten Konzentrationen (0,01 × bis 5 × 10–6%)
verabreicht wurde, zeigte eine signifikante geroprotektive Wirkung:
Die ALS in den Testgruppen zeigte einen statistisch relevanten Anstieg.
Die relative Verlängerung
des ALS bei Männern
betrug 3,3 bis 10,8%.
-
In
den mit den weiblichen Fliegen durchgeführten Experimenten zeigte L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
eine geroprotektive Wirkung nur bei Konzentrationen von 0,01 × und 0,1 × 10–6%
mit einer signifikanten Erhöhung
im ALS entsprechend 13,4% (P < 0,004)
und 11,8% (P < 0,03).
-
Die
Wirksamkeit des in geringeren Konzentrationen verabreichten L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids,
wie mit den erhaltenen Daten gezeigt, ist beispiellos. Es wird darauf
hingewiesen, dass die Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
bei Drosophila melanogaster nicht die Dauer ihrer Entwicklung in
den Stadien verändert,
das im Allgemeinen das Fehlen von gerotoxischen Wirkungen durch
diese untersuchte Substanz reflektiert.
-
Tabelle
15 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Parameter
für die
Lebensdauer bei Drosophila melanogaster vom Wildstamm Canton-S
-
-
-
Beispiel 8 Einfluss von
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die extra-pineale Synthese
von Melatonin in Ratten nach Epiphysectomie
-
Die
Untersuchungen wurden mit männlichen
Wistar Ratten mit einem Gewicht von 130 bis 140 g durchgeführt. Die
Gesamtzahl an Tieren (23) wurde in fünf Gruppen geteilt. Die erste
Gruppe (Kontrolle) schloss nicht operierte Tiere ein. Die Tiere
der Gruppen zwei bis fünf
wurden einer Epiphysectomie (EE) unterworfen. Drei Wochen nach der
chirurgischen Behandlung (am 21. Tag) wurden die Tiere der zweiten
und dritten Gruppe subkutan mit Natriumchlorid mit einer Dosis von
0,05 ml für
die nächsten
10 Tage injiziert. Den Tieren der Gruppen vier und fünf wurden
mit dem gleichen Schema L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid mit einer
Dosis von 0,5 μg
verabreicht.
-
Das
Töten der
Tiere und das Entnehmen ihrer Organe wurde von 10 Uhr morgens bis
12 Uhr mittags bei Tageslicht mit Hilfe des Narkotikums Nembutal
durchgeführt
(50 mg/kg). Die Tiere der Gruppen 1, 2 und 4 wurden drei Tage nach
der letztmaligen Verabreichung des Arzneimittels (am 33. Tag nach
der Operation und dem Fortsetzen des Experiments) getötet, während der
Tiere der Gruppen 3 und 5 12 Tage (am 42. Tage nach Epiphysectomie)
getötet
wurden. Die Hauptorgane des diffusen neuroendokrinen Systems (DNES),
Magen, Schilddrüse
und Pankreas, wurden untersucht.
-
Der
chirurgische Eingriff, Epiphysectomie, wurde unter Ethernarkose
gemäß der folgenden
Technik durchgeführt.
Ein 1 bis 1,5 cm langer Einschnitt wurde entlang der Zentrallinie
des Kopfes gemacht. Nach Aufklappen der Kopfhaut wurde ein Loch oberhalb
des Sinuskonfluenzpunktes mit Hilfe eines Lochstangenbohrers mit
0,5 cm Durchmesser gebohrt, dieser wurde extra aus einer für dieses
Experiment hergestellten Metallröhre
hergestellt. Die Epiphyse wurde mit Hilfe einer ophtalmischen Pinzette
durch die Öffnung
im Granium entnommen. Die Trepanationsöffnung wurde mit einem Knochenfragment
bedeckt. Der Hauteinschnitt wurde mit einem Seidenfaden genäht.
-
Fragmente
der extrahierten Organe wurden 24 Stunden in sauerer Bouin's Flüssigkeit
für die
mikroskopische Untersuchung und gemäß Kamovsky für die elektronenmikroskopische
Untersuchung fixiert. Die Entwässerung
und das Einbetten in Paraffin für
die Lichtmikroskopie sowie die Eponmischung für die ultrastrukturelle Untersuchung
der Proben wurden gemäß allgemein
anerkannter Verfahren durchgeführt.
Die Paraffinschnitte (7 μm)
wurden auf einen Objektträger,
der mit einer Poly-L-Lysinschicht (Sigma) beschichtet war, verbracht.
Ultra-Dünnschnitte
(100 nm) wurden mit einem LKB-7A-Mikrotom (LKB) hergestellt und
mit Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt.
-
Die
histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden mit
Hilfe eines Jenamed-2-Mikroskops (Zeiss) durchgeführt. Die
elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden mit Hilfe eines
JEM-100S-Elektronenmikroskops (JEOL) durchgeführt.
-
Für das Färben wurde
Hematoxylin-Eosin verwendet. Die gesamte Population an APUD-Zyten
im Magenausgang und in Schnitten des Magenfundus wurden gemäß des Grimelius' histochemischen
Versilberungsverfahrens (25) gezeichnet.
-
Immunhistochemischer
Nachweis von enterochromophinen Zellen (EC-Zellen) wurde durch Verwendung
von Mausmonoklonalen Antikörper
gegen Serotonin durchgeführt
(Dako, 1:15 Titer). Die monoklonalen Antikörper wurden mit Hilfe des Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren
(ABP) (Vectastain Kit) nachgewiesen, um Immunserumglobuline der
Mäuse nachzuweisen.
-
Die
quantitativen Studien wurden mit Hilfe eines Computeranalysesystem
für die
Mikroskopie (Imstar) unter Verwendung von Morphostar und Colquant
(Imstar) unter Anwendung von lizenzierten Computerprogrammen durchgeführt gemäß den Grundsätzen der
Stereologie und Morphometrie (26). Die quantitative Dichte an Enteroendokrin-(END)
(NEnd) (NEND/1 mm2) und Serotonin-positiven Zellen (NSer/1 mm2) wurde
in 10 sichtbaren Feldern bestimmt. Die Testfläche (S) bestand aus 5 mm2.
-
Für die statistische
Bearbeitung der erhaltenen Daten wurde das nicht parametrische Mann/Whitney U-Kriterium
angewendet.
-
Die
Ergebnisse der funktionalen DNES Morphologie-Untersuchungen, die
an epiphysectomierten Ratten mit Verabreichung von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
durchgeführt
worden, zeigten, dass das Tetrapeptid den Gewebe- und den zellulären Stoffwechsel
stimuliert.
-
Es
wurde gefunden, dass die L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid-Verabreichung
eine kompensierende Wirkung auf die strukturelle und funktionale
Organisation der DNES-Zellen bei Tieren, die eine Epiphysectomie ausgesetzt
waren, hervorrufen. Diese Wirkung wurde innerhalb drei Tage nach
dem Ende der Tetrapeptidverabreichung durch komplette Suppression
des Einflusses des Epiphysectomie manifestiert und für 12 Tage
aufrecht erhalten, d.h. bis zur Beendigung des Experiments mit Bezug
auf alle untersuchten Organe.
-
Die
Daten bestätigen,
dass der Hauptzielort des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids die
Magen EC-Zellen sind, bei denen das L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
die extra-pineale Synthese von Serotonin und Melatonin fördert (Tabelle
16) und somit im Endeffekt eine wollständige Kompensation der entfernten
Hypophyse erlaubt.
-
Diese
Ergebnisse der Experimente beweisen, dass L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid keine
Toxizität aufzeigt,
Anti-Oxidations-Abwehrindizes normalisiert und Stoffwechelsprozesse
in den melaninproduzierenden Strukturen verschiedener Gewebe reguliert.
-
Tabelle
16 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die quantitativen
Merkmale der untersuchten Parameter in verschiedenen Magenabschnitten
von epiphysectomierten Ratten
-
Die
Eigenschaften des L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptids zeigen in präklinischen
Experimenten die manifestierte und prophylaktische und/oder therapeutische
Anwendung als geroprotektive Substanz.
-
Beispiele
von Ergebnissen, die in klinischen Studien mit den vorgeschlagenen
Tetrapeptids erhalten wurden, zeigen dessen pharmakologischen Eigenschaften
und bestätigen,
dass die Erfindung in die medizinische Praxis umgesetzt werden kann.
-
Beispiel 9 Wirksamkeit
der Verabreichung einer pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
bei Patienten mit Störungen
des Anti-Oxidations-Abwehrsystems zur Verhinderung verfrühter Alterung
-
Die
untersuchte pharmakologische Substanz wurde in 14 Patienten (34
bis 69 Jahre alt) mit altersbedingter Pathologie (Hochdruckerkrankung,
Herzanfallerkrankung, chronischer Gastritis, nicht Insulinabhängigen Diabetes
Mellitus) und Reduktion der Anti-Oxidations-Abwehrindizes in Blut
verabreicht.
-
Die
Substanzen enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid wurde intramuskulär in Form
einer Injektionslösung
mit einer einzelnen täglichen
Dosis von 10 μm
pro Injektion für
10 Tage verabreicht.
-
Bei
Fällen
mit Verabreichung des Arzneimittels wurde ein signifikanter Anstieg
der Superoxiddismutaseaktivität
und eine Abnahme an Gehalt von Lipidperoxidoxidationsprodukten beobachtet
(Tabelle 17).
-
Tabelle
17 Einfluss von L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid auf die Anti-Oxidations-Abwehrindizes im
Blut bei altersbedingten Erkrankungen
-
Die
Ergebnisse der Therapie beweisen die wiederherstellende Wirkung
der pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
auf das Anti-Oxidations-Abwehrsystem des Organismus.
-
Beispiel 10 Wirksamkeit
der pharmakologischen Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid
verabreicht zur Vorbeugung von verfrühter Alterung bei Patienten
mit Störungen
in der Melatonin-Synthese
-
Die
pharmakologische Substanz wurde 11 Patienten im Alter von 39 bis
63 Jahren, die an Aspirin-Bronchialasthma leiden, verabreicht. Die
Haupteigenschaft dieser Erkrankung besteht in der Assoziierung von
Asphyxii-Anfällen
mit Intertoleranz gegenüber
Acetylsalicylsäure
und anderen nicht steroiden anti-inflammatorischen Substanzen. N-Acetyl-5-Methoxykynurenamin
(N-AMK) ein Analog in ihrer chemischen Struktur der Acetylsalicylsäure ist
bekannt im Organismus durch Verstoffwechselung von Melatonin, einem Epiphysenhormon,
gebildet zu werden. Die Melatonin-Synthese und entsprechend das
Niveau an endogenen N-AMK ist in Patienten mit Aspirin-Bronchialasthma
signifikant erniedrigt, dies wird durch ein niedriges Ausscheiden
von 6-Sulfatoxymelatonin, dem wesentlichen Melatoninstoffwechselprodukt,
im Urin bestätigt.
-
Dieses
stellt einen neuen pathogenen Ansatz zur Behandlung der Aspirin-Bronchialasthma durch
Korrektur des Melatonin-Niveaus im Organismus durch die pharmakologische
Substanz enthaltend L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly-Tetrapeptid bereit.
-
Die
Substanz wurde intramuskulär
in Form einer Injektionslösung
täglich
am Morgen mit einer Dosis von 10 μg über 10 Tage
verabreicht.
-
Die
Patienten wurden in einer Phase einer abklingenden Exazerbation
oder einer vorübergehenden Besserung
der Erkrankung begleitend von einer permanenten Antiasthmatherapie,
die das Inhalieren und die orale Aufnahme von Glucocorticoiden beinhaltet,
behandelt.
-
Vor,
während
und nach der Behandlung haben die Patienten monatlich ihren Gesundheitszustand
aufgrund der Symptome, Husten, Auswurf, Schwierigkeiten beim Atmen,
Brustkorbcongestion, Rasselgeräuschen,
Asphyxieanfällen
und Intoleranz gegenüber
körperlicher
Aktivität,
Erkältung
und Gerüchen.
Die klinische Wirkung die durch das Präparat hervorgerufen wurden,
wurden unmittelbar nach der Behandlung und innerhalb der nächsten 7
Monate auf Basis der von dem Patienten berichteten Analysen, die
Daten auf ihren Gesundheitszustand, Leistungsfähigkeit, psychologischen Zustand,
Schlafstörungen
und täglichen
Dosierungen von genommenen antiasthmatischen Arzneimitteln beinhalten,
bestimmt.
-
Vor
Beginn der Behandlung und unmittelbar nach Verabreichung der letzten
Dosis des Arzneimittels wurden die externen Atmungsfunktionen bei
allen Patienten mit Bezug auf die folgenden Parameter bestimmt: Vitalkapazität der Lunge
(VBC), Atmenvolumen (TV), Gesamtlungenvolumen (TLC), erzwungende
Vitalkapazität
der Atmung (FVBC), maximale volumetrische Ausatmungsrate (MVexhR), maximale volumetrische Ausatmungsrate
bei 50% und 75% forcierte VBC (VBC50 und
VBC75) forcierte Atmung (FEV1).
Diese Parameter wurden als Prozent des anfänglichen Wertes gemessen. Weiterhin
wurde die spezifische Durchleitung des Bronchialstamms in cm-Säule bestimmt.
Der gesamte Komplex wurde mit Tests innerhalb von 15 Minuten nach
Inhalieren mit Berotek wiederholt. Die Veränderungen von MVR, VBC50 und VBC75 nach
Inhalation von Berotek wurde als Prozente der anfänglichen
Werte bestimmt. Der FEV-Index in allen Patienten vor Behandlung
war weniger als 80% des Sollwerts.
-
Der
Gehalt an 6-Sulfatoxymelatonin, dem grundsätzlichen Melatoninmetaboliten
wurde vor, unmittelbar nach und innerhalb 10 Tagen nach der Behandlung
im Urin, der zur Tageszeit (von 9 Uhr bis 21 Uhr) und nachts (von
21 Uhr bis 9 Uhr) genommen wurde, gemäß den immunofermentalen Verfahren
mit Hilfe eines „DRG
Instrument GmbH"-Kits
(Marburg, Deutschland) gemessen. Die Ergebnisse der Untersuchungen
bestätigen,
dass eine Verbesserung des klinischen Zustands am Ende der Behandlung
bei der wesentlichen Mehrheit der Patienten, die mit der untersuchten
pharmakologischen Substanz behandelt wurden, vorliegt. Eine reduzierte
Häufigkeit
von Asthmasymptomen am Tage, eine reduzierte Intoleranz gegenüber körperlicher
Arbeit, starken Gerüchen
und kalter Luft genauso wie eine Verbesserung beim Schlaf wurde
registriert. Objektive Beobachtungen der Patienten zeigten eine
Abnahme oder ein absolutes Verschwinden der Rasselgeräusche in den Lungen,
Symptome einer bronchialen Verstopfung. Eine Untersuchung der externen
Atmungsfunktion nach Beendigung der Behandlung zeigte keine wesentlichen
Veränderungen
in VBC, MVexhR, FEV1,
TV/TLC. Die Patienten, die einer Tetrapeptidhaltigen pharmakologischen
Substanz ausgesetzt waren, zeigten aber eine Verbesserung in der
Reaktion gegenüber
Berotek auf dem Niveaus der distalen Bronchien. Das Ausscheiden von
6-Sulfatoxymelatonin im Urin nahm zu, dies zeigt eine Erhöhung der
Melatoninproduktion nicht nur nachts, sondern auch am Tage.
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