JPH0851980A

JPH0851980A - 合成遺伝子およびこれを用いた癌転移阻害活性を有するペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH0851980A
Application number: JP6189414A
Authority: JP
Inventors: Hideki Higashida; 英毅東田; Kimiko Murakami; 喜美子村上; Yuko Hama; 祐子浜; Yoko Tsukamoto; 洋子塚本; Atsushi Isoai; 敦礒合; Hiromichi Kumagai; 博道熊谷
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 1996-02-27

Abstract

(57)【要約】【目的】これまで化学的合成方法および結合方法を組み
合わせてのみ作製可能であった癌転移阻害ペプチドを、
遺伝子組換え手法により直接的にしかも高効率で生産し
得るために、合成遺伝子およびそれを用いた癌転移阻害
ペプチドの製造方法を提供する。【構成】特に分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Sc
hizosaccharomyces pombe) 菌体内で多頻度で使用され
るコドンを用いて設計、合成された、癌転移阻害活性を
有するペプチドをコードする遺伝子、並びに、該遺伝子
を用いた遺伝子組換え手法による癌転移阻害活性を有す
るペプチドの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌転移阻害活性を有す
るペプチド（以下、単に「癌転移阻害ペプチド」と略
記）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベ
クター、該組換えベクターによって形質転換された宿主
細胞の形質転換体並びに該形質転換体を用いる癌転移阻
害ペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌の治療には主として外科的療法、放射
線療法および化学療法が行われているが、癌の再発や転
移の防止という点ではいまだ満足すべき治療効果が挙げ
られていない。

【０００３】現在用いられている多くの制癌剤は、核酸
あるいはタンパク質の生合成系を阻害し、癌細胞を死に
至らしめるものである。しかしながらこれらの制癌剤で
は、癌細胞と正常細胞との区別が困難なため、その効果
には、特に副作用の面で大きな問題が内在している。ま
たこれらの制癌剤は原発巣を縮小させることによって治
療するものであるが、癌の治療で常に問題になるのは癌
細胞が原発巣から離れ、他の臓器に転移し、そこで増殖
し致命的な結果を招くことである。したがって癌の根本
的治療のためには、癌細胞の増殖抑制とともに、転移に
対して有効な抑制効果を示す制癌剤の開発が望まれてい
る。

【０００４】癌転移の機構の解明には多くの研究がなさ
れ、転移の抑制に関する物質の検索も広く行なわれてき
た。癌細胞は原発巣から遊離した後、血管中に侵入す
る。そして血管壁に接着後、血管内皮細胞層の下に潜り
込み細胞外基質を破壊し、標的臓器の実質中に浸潤侵入
する。このような各ステップを経て癌細胞は他の臓器に
転移すると考えられている（L.A. Liotta et al.: Lab.
Invest., 49, 636-649(1983)）。よって癌転移阻害剤
開発のためには、上記の各ステップのいずれかを抑制す
るものが開発されればよいと考えられる。例えば、癌細
胞が細胞外基質と接着するのを阻害するもの（例えば、
N.J. Humphries et al.: Science, 223, 467-470 (198
6) ）、中皮細胞層や血管内皮細胞層などの下層への浸
潤を阻害する物質（例えば、A. Isoai et al.: Jpn. J.
Cancer Res., 81, 909-914 (1990)）、細胞外基質の分
解を阻害する物質（例えば、R.M. Schultz et al.: Can
cer Res., 48, 5539-5545 (1988)）等が挙げられる。

【０００５】本発明者らは、配列表の配列番号５のアミ
ノ酸配列で表されるペプチドが癌転移阻害活性を有する
ということをすでに確認している（特開平３−３４９９
３号公報、A. Isoai et al.: Jpn. J. Cancer Res., 8
1, 909-914 (1990) および A. Isoai et al.: Cancer
Res., 52, 1422-1426 (1992) ）。さらに本発明者ら
は、この配列番号５のアミノ酸配列で表されるペプチド
（癌転移阻害ペプチド）をタンパク質など生体高分子と
化学的に結合させて複合体をつくり、この複合体がペプ
チド単独に比べてより強い癌細胞浸潤阻害活性並びに癌
転移抑制活性をもつということも確認している（特開平
４−２５４０００号、同４−３００８９９号、同４−３
００９００号公報および A. Isoai et al.: Biochem. B
iophys. Res.Commun., 192, 7ー14 (1993)）。すなわ
ち、癌転移阻害ペプチドと血清アルブミンなどの生体高
分子を水溶性カルボジイミドで結合させることによって
創製した新規タンパク質は、癌転移阻害ペプチド単独で
用いる場合に比べ、１／５０〜１／６０の低濃度で、ヒ
トおよびマウス由来高転移性癌細胞の細胞外基底膜への
浸潤を強く抑制した。さらに、癌細胞をマウスの尾静脈
より注入し肺や肝臓などの主要臓器に転移させるいわゆ
る「実験的転移モデル」系において、該新規タンパク質
は、ペプチド単独で用いる場合に比べ、１／１０以下の
低用量で同等以上の癌転移阻害活性を示した。

【０００６】このように有用な癌転移阻害ペプチドは、
通常化学的ペプチド合成法によって作製される。しかし
ながらその方法はステップ数が多く、また不純物である
不完全合成産物の分離を行なわなければならない。通常
これらの方法は煩雑であり、また効率よく大量生産する
ことが難しく、特に２１アミノ酸残基を有する該ペプチ
ドでは、化学的合成法によることは、コスト的にも設備
的にも必ずしも満足できるものではなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる事情に
鑑みてなされたもので、配列番号５のアミノ酸配列で表
されるペプチド（癌転移阻害ペプチド）を、従来の化学
的ペプチド合成法に代えて、遺伝子組換え技術を用い
て、より効率的な遺伝子発現並びに癌転移阻害ペプチド
の生産をなし得るための技術を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ね、遺伝子組換え技術を用
いて癌転移阻害ペプチドを生産する新規な系を創出し、
該ペプチドを生産することに成功した。具体的には、癌
転移阻害ペプチドをコードする遺伝子を作製し、すでに
確立されている異種タンパク質生産用のベクターに該遺
伝子を組み込み、得られた組換えベクターを宿主細胞に
導入し、形質転換体を作製することにより、癌転移阻害
ペプチドの生産を達成し得るというものである。

【０００９】すなわち本発明によれば、配列番号５のア
ミノ酸配列で表される癌転移阻害活性を有するペプチド
をコードする、配列番号１の塩基配列で表される遺伝子
が提供される。

【００１０】また本発明によれば、配列番号５のアミノ
酸配列で表される癌転移阻害活性を有するペプチドをコ
ードする、配列番号２の塩基配列で表される遺伝子が提
供される。

【００１１】また本発明によれば、上記配列番号１また
は２の塩基配列で表される遺伝子を含有する組換えベク
ターが提供される。

【００１２】また本発明によれば、上記組換えベクター
で宿主細胞を形質転換してなる、癌転移阻害ペプチドを
産生し得る形質転換体が提供される。

【００１３】さらに本発明によれば、上記形質転換体を
培養し、培養物中に産生された癌転移阻害ペプチドを単
離し、所望により精製することからなる癌転移阻害ペプ
チドの製造方法が提供される。

【００１４】以下、本発明について詳述する。

【００１５】上述したように、配列番号５のアミノ酸配
列で表されるペプチド（癌転移阻害ペプチド）が癌転移
阻害活性をもつということは本発明者らによりすでに確
認されている。本発明による合成遺伝子は、この配列番
号５のアミノ酸配列で表されるペプチドをコードする合
成遺伝子であり、理論的には配列表の配列番号１の塩基
配列で表されるものが可能であり、２、１４７、４８
３、６４８通りの配列が考えられ得る。しかし、望まし
くは遺伝子組換えに用いる宿主細胞のコドン使用頻度に
合わせたものがよく、最も多頻度で使用されるコドンを
用いて設計するのがよい。

【００１６】ここで、用いる宿主細胞としては特に限定
されるものではないが、望ましくは培養方法が容易で、
低コストで培養できる微生物がよく、例えば大腸菌（Es
cherichia coli）、各種酵母類、枯草菌、糸状菌等、当
業分野で常用されている宿主細胞等が挙げられる。原核
生物を宿主細胞として用いる方法では必ずしも全てのポ
リペプチドに対して有効ではなく、真核生物由来のタン
パク質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ立体構
造を再現することは必ずしも容易ではない。また特有の
エンドトキシンが存在する場合は、最終製品の夾雑物に
なる可能性があり、好ましくない。このため好ましく
は、エンドトキシンを含まず、培養方法も確立してお
り、従来より発酵並びに食品工業で用いられており、人
体に関する安全性も確立されている各種酵母類がよい。
このなかでも特に、遺伝学的並びに分子生物学的に動物
細胞に近い性質をもつとされ、より天然体に近い遺伝子
産物が得られることが期待される分裂酵母シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe) が最も
好ましい。このシゾサッカロミセス・ポンベの菌株とし
ては、例えば寄託番号ＡＴＣＣ３８３９９(leu-32h^-)や
ＡＴＣＣ３８４３６(ura4-294h^-)等としてアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されているものが挙げられ、入手可能である。

【００１７】したがって本発明においては、配列番号５
のアミノ酸配列で表される癌転移阻害ペプチドをコード
する遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベでの高発現
に至適なコドンを用いて設計し、合成したものであるの
が最も好ましい。シゾサッカロミセス・ポンベの最適コ
ドン使用頻度は、例えば A. Nasim et al: Molecular
Biology of the Fission Yeast p263, Academic Press
(1989) 等から知ることができる。本発明者らは種々研
究を重ねた結果、配列番号２の塩基配列で表される遺伝
子が最も好適であるとの結論を得、設計、合成した（た
だし、配列番号２の塩基配列は、翻訳開始シグナル（Ａ
ＴＧ）および翻訳終了シグナル（ＴＡＡ）を付加してい
る）。なお遺伝子の作製（合成）は、トリエステル法
（Nuc. Acid. Res. 10, p.6553,(1982))やホスホアミダ
イト法（Tetrahedron Letters 22,p.1859, (1981)) な
どの種々の方法がすでに開発されており、いずれの方法
を用いてもよい。またＤＮＡ合成機器（ＤＮＡシンセサ
イザー）等が市販されているので、それらを用いてもよ
い。

【００１８】次に、このようにして合成した遺伝子をベ
クターに組み込んで組換えベクターを作製する。用いる
ベクターは特に限定されるものではないが、宿主細胞内
で自律的に複製可能であって、合成遺伝子（外来遺伝
子）を組み込み得る挿入部位をもち、さらにこの組み込
んだ合成遺伝子を宿主細胞内で発現せしめることを可能
とする領域を有する必要がある。このようなベクターと
して、例えば本発明者らがすでに創出に成功しているシ
ゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする外来遺伝子発現
ベクターｐＴＬ２Ｍ（特願平５−２４９３１０号明細
書）等を有利に用いることができ、これらのベクターに
上記合成遺伝子を容易に組み込み得る。

【００１９】次いで上記組換えベクターを宿主細胞内に
導入し、形質転換体を得る。組換えベクターの宿主細胞
内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法によ
り行うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラス
ト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーショ
ン法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合
法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙げられる
が、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得
る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場合は、
例えば酢酸リチウム法（K. Okazaki et al., Nucleic A
cids Res.,18, 6485-6489(1990) ）等によって効率よく
形質転換体を得ることができる。

【００２０】このようにして得られた形質転換体を培養
することにより、培養物中に癌転移阻害ペプチドが産生
される。これを公知の方法で単離し、場合により精製す
ることにより、目的とする癌転移阻害ペプチドが得られ
る。

【００２１】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地などの栄養培地（M. D. Rose et al.,
"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor L
abolatory Press(1990) ）や、ＭＢ培地などの最小培地
（K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res.,18, 6485-6
489(1990) ）等を用いることができる。形質転換体の培
養は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、
８〜１６８時間、好ましくは２４〜７２時間行う。振盪
培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて
攪拌や通気を加えてもよい。

【００２２】培養物中に産生したペプチドの単離・精製
法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶解度の
差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動
法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用
する方法等が挙げられる。

【００２３】単離・精製したペプチドの確認方法として
は、公知のウエスタンブロッティング法や活性測定法等
が挙げられる。また、精製されたペプチドは、アミノ酸
分析、アミノ末端（Ｎ末端）分析、一次構造解析などに
よりその構造を明らかにすることができる。

【００２４】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技
術範囲が限定されるものではない。また実施例中の各操
作については、特に記載したもの以外は、当業分野で常
用されている方法（例えばJ. Sambrook et al.: Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York, USA, 1989.）に従った。

【００２５】［実施例１］癌転移阻害ペプチドをコード
する配列番号２の塩基配列で表される遺伝子の作製配列番号５のアミノ酸配列をもとに、シゾサッカロミセ
ス・ポンベのコドン使用頻度（Nasim, A. et al: Molec
ular Biology of the Fission Yeast, Academic Press,
1989, p263.）に合せて、配列番号３および４の塩基配
列で表される２本の一本鎖オリゴＤＮＡを、ＤＮＡ自動
合成装置（Applied Biosystems）を用いて合成した。な
お、配列番号３の塩基配列は、５’末端に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩへの挿入部位と開始コドンＡＴＧを、３’末端に
終始コドンＴＡＡと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩへの挿入部
位を導入した遺伝子のセンス鎖であり、配列番号４の塩
基配列はそのアンチセンス鎖である。脱保護、精製後、
これら２本を７０℃でアニーリングした。

【００２６】一方、これとは別にプラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造（株）製）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）で
二重消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱による精
製の後、アガロースゲル電気泳動し、約２６００塩基対
に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰ（旭硝子
（株）製）を用いたガラスビーズ法で精製した。

【００２７】これら両者の断片を、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションし
た。これを大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）に導
入して形質転換した後、アンピシリン耐性を持ち、かつ
X-gal プレート上で白コロニーを提示するポジティブ
クローンをスクリーニングし、目的のプラスミドすなわ
ち制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化時
に約７０塩基対の切断断片を示すｐＩ２Ａを得た。アル
カリ−ＳＤＳ法に従ってｐＩ２Ａを大量調製し、制限酵
素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番号２
の塩基配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００２８】［実施例２］癌転移阻害ペプチド遺伝子を
含有する発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの作製実施例１で作製したプラスミドｐＩ２Ａを制限酵素Ｎｃ
ｏＩ（宝酒造（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩで二重消
化して末端を調節し、アクリルアミドゲル電気泳動によ
り約７０塩基対に相当するバンドを切出し、ゲルから溶
出して、癌転移阻害ペプチドをコードする遺伝子挿入断
片とした。

【００２９】一方、これとは別に、遺伝子導入用のリン
カー断片を作製した。すなわち、ヒト肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリーよりプラスミドｐＵＣ１９上にクローニングし
たヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型として、配列番号
６の塩基配列で表されるＤＮＡを５’末端側プライマー
とし、配列番号７の塩基配列で表されるＤＮＡを３’末
端側プライマーとしてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限
酵素ＮｃｏＩおよびＡｆｌＩＩＩ（New England Biolab
s ）によって末端調節（部分消化）を行なった。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱による精製の後、アガロース
ゲル電気泳動し、約１８００塩基対に相当するバンドを
切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精
製し、リンカー断片とした。

【００３０】さらにこれとは別に、シゾサッカロミセス
・ポンベ発現ベクターｐＴＬ２Ｍを用意した。このベク
ターｐＴＬ２Ｍは、本願発明者らがすでに構築したもの
である（特願平５−２４９３１０号明細書）。以下にそ
の作製方法を述べる。

【００３１】［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］まず、公知
の方法で調製されたｐｃＤ４ＣＡＴをＢａｍＨＩで切断
し、ＣＡＴ遺伝子を除去後ライゲーションし、ｐｃＤ４
を作製した。ｐｃＤ４をＢａｍＨＩで部分切断し、平滑
末端化した後ライゲーションしてｐｃＤ４Ｂを作製した
（特開平５−１５３８０号公報）。

【００３２】このプラスミドｐｃＤ４Ｂを制限酵素Ｓａ
ｃＩで消化後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さらに
アガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によって約
４５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３３】一方、これとは別に、ヒト線維芽細胞由来
の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリー（ｐｃＤベクタ
ー）を公知の方法により調製した。さらに、既に知られ
ているヒトリポコルチンＩの遺伝子配列（Nature, 320,
77,(1986)）のうち、タンパク質のＮ末端側アミノ酸配
列をコードする５０塩基の遺伝子配列をＤＮＡプローブ
として上述のライブラリーからリポコルチンＩの遺伝子
をコロニーハイブリダイゼーション法により取得し、塩
基配列を決定することにより、リポコルチンＩタンパク
質全長をコードするものであることを確認した。取得し
たクローンをｐｃＤｌｉｐｏＩと名づけた。（特開平５
−１５３８０号公報）。そしてこのヒトリポコルチンＩ
遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃＤｌｉｐｏＩを
制限酵素ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さ
らにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によっ
て約１３００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３４】両ＤＮＡをライゲーションした後、これを
大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入して形質転換
した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的
とするベクターｐＲＬ２Ｌ（図５）を持った形質転換体
をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限
酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認し
た。

【００３５】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後、アガロース
ゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバンド
を切り出し、ガラスビーズ法で精製した。これとは別
に、公知のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り約６０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから
抽出精製した。

【００３６】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＲ
Ｌ２Ｍ（図６）をスクリーニングした。部分塩基配列の
確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであ
ることを確認した。

【００３７】［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］上記ｐＲＬ
２Ｍを鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-
TTGACTAGTTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌ
クレオチド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-
3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用
いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐ
ｅＩおよびＥｃｏＲＩで末端調節し、フェノール抽出、
エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約
６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。

【００３８】一方、これとは別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵
素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約４５００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベ
クターｐＴＬ２Ｍ（図７）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。

【００３９】このようにして作製したｐＴＬ２Ｍを制限
酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、
約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４０】そして、上記遺伝子挿入断片、リンカー断
片およびベクターｐＴＬ２Ｍの二重消化物の計３本を、
ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーションし
た。これを大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入し
て形質転換した後、図１に示すような、目的のプラスミ
ドｐＴＬ２ＢｍＩを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従って
ｐＴＬ２ＢｍＩを大量調製し、制限酵素地図の作製およ
び塩基配列決定によって、配列番号２の塩基配列を持っ
たプラスミドであることを確認した。

【００４１】［実施例３］発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ
を用いたシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換シゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求性株、ｈ^-
ｌｅｕ１−３２（ＡＴＣＣ３８３９９）をロイシン含有
最少培地ＭＢ−ｌｅｕで１０⁷ 細胞数／ｍｌになるまで
生育させた。遠心集菌、水による洗菌後、１０⁹ 細胞数
／ｍｌになるように１００ｍＭ酢酸リチウム（ｐＨ５．
０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。
その後、上記懸濁液１００μｌに、制限酵素ＰｓｔＩで
消化したｐＡＬ７（K. Okazaki et al.: Nucl. Acids R
es. 18, 6485-6489 (1990)）１μｇおよび２μｇの発現
ベクターｐＴＬ２ＢｍＩを１０μｌのＴＥバッファーに
溶かした溶液を加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０μ
ｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
次いで遠心分離によりＰＥＧ４０００を除去した後、１
ｍｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕに懸濁した。

【００４２】この懸濁液から１００μｌを分取し、さら
に９００μｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕで希釈し
て、３２℃３０分間インキュベートした後、３００μｌ
を最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日
間インキュベートし、得られた形質転換体をＧ４１８を
２５μｇ／ｍｌ含むＹＥＡ培地に移し、さらに３２℃で
５日間培養し、得られたクローンを目的とする各形質転
換体とした。

【００４３】一方、これとは別に、癌転移阻害ペプチド
遺伝子を持たないプラスミドｐＴＬ２Ｍ（既述）および
ｐＴＬ２Ｂｍ（特願平５−２４９３１０号明細書）につ
いても、同じ方法で形質転換体を作製し、ネガティブコ
ントロールとした。なお、プラスミドｐＴＬ２Ｂｍは以
下のようにして作製した。

【００４４】［プラスミドｐＴＬ２Ｂｍの作製］国立予
防衛生研究所遺伝子バンクより供与を受けた、ヒト血清
アルブミンｃＤＮＡを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５を
鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCA
TGGATGCACACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プ
ライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素ＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで末端調節し、フェノール抽出、エタノー
ル沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。

【００４５】これとは別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆ
ｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約５０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。

【００４６】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＴ
Ｌ２Ｂｍ（図８）をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。

【００４７】［実施例４］形質転換体の培養および無細
胞抽出液の調製抗生物質Ｇ４１８（GIBCO BRL ）を２００μｇ／ｍｌの
濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ培地［（２％グルコース
（和光純薬（株）製）、１％バクトイーストエキス（Di
fco ）、２％バクトペプトン（Difco ）］に、実施例３
で作製した形質転換体を植菌し、３２℃で５日間培養し
た。その培養液から１０⁸ 個の菌体を集菌し、洗菌後、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５) で懸濁し、超
音波破砕を行った。終濃度が１％になるように１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、８０℃で１５分間加熱した。遠心分離
によって無細胞抽出液（上清）を得た。

【００４８】これとは別に、癌転移阻害ペプチド遺伝子
を持たない上記ｐＴＬ２ＭおよびｐＴＬ２Ｂｍを導入し
た形質転換体についても、同様の方法で無細胞抽出液を
作製し、ネガティブコントロールとした。

【００４９】［実施例５］ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による癌転移阻害ペプチドの発現解析ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、実施例４で作製した各形質
転換体由来の無細胞抽出液について発現解析を行なっ
た。結果を図２に示す。同図から明らかなように、ｐＴ
Ｌ２ＢｍＩによる形質転換体では、コントロールである
ｐＴＬ２Ｂｍによる形質転換体に比較して、分子量６
９，０００のバンド（同図中、＊で示す）が、癌転移阻
害ペプチドを産生していることによって分子量７１，０
００の位置（同図中、＊＊で示す）に移動していること
が検出できた。デンシトメータによって測定したとこ
ろ、癌転移阻害ペプチドの産生量は、全菌体タンパク質
の３０％程度であった。

【００５０】［実施例６］ウエスタンブロッティングに
よる癌転移阻害ペプチドの確認実施例４で作製した各形質転換体由来の無細胞抽出液に
ついて実施例５と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっ
た。得られたゲルをＰＶＤＦ膜（Bio-Rad ）に転写し、
癌転移阻害ペプチドに特異的な抗体（A. Isoai et al.:
Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 7-14 (1993)）
を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ（ア
マシャム（株）製）によって検出した。結果を図３に示
す。同図から明らかなように、癌転移阻害ペプチドを含
む配列に相当する分子量７１, ０００附近の位置に唯一
の明瞭なバンドが得られたことから、該ペプチドに特異
的なアミノ酸配列が含まれているペプチドが産生してい
ることが確認された。

【００５１】［実施例７］癌転移阻害ペプチドの精製ｐＴＬ２ＢｍＩにより形質転換された形質転換体を、Ｇ
４１８を２５μｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ
培地で３２℃、１日間前培養した後、Ｇ４１８を２００
μｇ／ｍｌ含む１リットルのＹＰＤ培地に１×１０⁸ ／
ｍｌの割合で植菌してさらに４日間培養した。集菌後の
菌体の４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）［１２μＭのＡＰＭＳＦ（和光純薬（株）製）、２
５μＭロイペプチン（和光純薬（株）製）、２ｍＭのＥ
ＤＴＡを含む］に懸濁し等量のガラスビーズ（ビードビ
ーター）を用いて０℃で破砕した。１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した沈澱を同じ緩衝液で洗浄した
後、６Ｍグアニジン塩酸と１０ｍＭのジチオスレイトー
ルを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て５０℃１時間で可溶化した後、１２，０００rpm 、２
０分間遠心分離した上清を０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型
グルタチオンを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で１００倍（ｖ／ｖ）に４℃で徐々に希釈し
た。１晩４℃で放置後、限外濾過膜（アミコン）にて濃
縮しスーパーロース１２カラムにてゲル濾過し、各画分
についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析し分子量７１，００
０の位置に唯一のバンドが見られた画分を集め精製癌転
移阻害ペプチドとした。

【００５２】［実施例８］精製癌転移阻害ペプチドの癌
細胞浸潤阻害活性の測定実施例７で精製した癌転移阻害ペプチドについて、癌細
胞の浸潤抑制効果を調べた。評価方法は Albini らの方
法（Albini et al.: Cancer Res. 47, 3239-3245 (198
7) ）に従って行った。８μｍのポアサイズを持つポリ
カーボネートフィルターを用い、上層と下層に分けられ
たケモタキセル（クラボウ（株）製）のフィルター上面
に１０μｇのマトリゲル（コラボレーティブ（株）製）
を塗布し、室温で一晩乾燥させた。使用直前に培養液で
膨潤させ、２４穴のカルチャープレートにセットした。
癌細胞はＢ１６メラノーマ由来の高転移性クローンＢ１
６ＦＥ７を使用した。

【００５３】細胞を１．８５ｋＢｑ／ｍｌの［¹²⁵ Ｉ］
ＩＵｄＲ（アマシャム（株）製）存在下で２日間培養し
た。使用直前にトリプシン溶液で細胞を回収した後、
０．１％の牛血清アルブミンを含む培養液に懸濁し、細
胞数と、取り込まれた［¹²⁵ Ｉ］ＩＵｄＲの放射能を計
測した。ケモタキセルの下層には２０μｇ／ｍｌのヒト
フィブロネクチンを入れ、上層には５×１０⁴ 個の細胞
を種々の濃度の癌転移阻害ペプチドと共に入れ、炭酸ガ
スインキュベータ中で２０時間培養した。

【００５４】培養終了後、フィルターの上面に残ってい
る細胞を綿棒でかきとり、フィルターをティッシュソル
ビライザー（アマシャム（株）製）で下面に移動した細
胞と共に溶解した後、放射能を計測した。結果を図４に
示す。同図から明らかなように、本癌転移阻害ペプチド
により、癌細胞の浸潤が有意に阻害されることが示され
た。

【００５５】

【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、こ
れまで化学的合成方法および結合方法を組合わせてのみ
作製可能であった癌転移阻害ペプチドを組換えＤＮＡ技
術を用いることによって初めて直接的に、しかも高効率
に生産することができるという効果が奏される。

【００５６】したがって本発明における形質転換体を用
いた大量培養により、目的とする癌転移阻害ペプチドの
高い生産性が得られ、工業スケールでの生産に使用する
ことが十分可能である。すなわち医薬品としての癌転移
阻害ペプチドを安定的に供給することが可能になったと
いえる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．６３配列 GCN GAR GAY GGN GAY GCN AAR ACN GAY CAR GCN GAR AAR GCN GAR GGN 48 GCN GGN GAY GCN AAR 63 （式中のN はA,T,G またはC を；Y はT またはC を；R
はA またはG を表す）配列番号：２配列の長さ：６９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．６９特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG 48 GGT GCC GGT GAC GCC AAG TAA 69 配列番号：３配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATCC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT 50 GAG GGT GCC GGT GAC GCC AAG TA 73 配列番号：４配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列 AGCTTA CTT GGC GTC ACC GGC ACC CTC AGC CTT CTC AGC TTG GTC GGT CTT 51 GGC GTC ACC GTC CTC GGC CAT G 73 配列番号：５配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Glu Asp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Gly Asp Ala Lys 20 21 配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGACCATGGA TGCACACAAG AGTGAGGT 28 配列番号：７配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列： TTCACATGTA TAAGCCTAAG GCAGCTTG 28

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの構成図である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図である。

【図３】ウエスタンブロット観察図である。

【図４】癌細胞浸潤阻害活性測定結果を示すグラフであ
る。

【図５】発現ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図である。

【図６】発現ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図である。

【図７】発現ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図である。

【図８】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＣ０７Ｋ 14/435 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:645） (72)発明者塚本洋子神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者礒合敦神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者熊谷博道神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号５のアミノ酸配列で表される癌転
移阻害活性を有するペプチドをコードする、配列番号１
の塩基配列で表される遺伝子。
【請求項２】配列番号５のアミノ酸配列で表される癌転
移阻害活性を有するペプチドをコードする、配列番号２
の塩基配列で表される遺伝子。
【請求項３】請求項１または２に記載の遺伝子を含有す
る組換えベクター。
【請求項４】前記組換えベクターがプラスミドｐＴＬ２
ＢｍＩである、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】請求項３または４に記載の組換えベクター
で宿主細胞を形質転換してなる、癌転移阻害活性を有す
るペプチドを産生し得る形質転換体。
【請求項６】宿主細胞が分裂酵母シゾサッカロミセス・
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe)である、請求項５
に記載の形質転換体。
【請求項７】請求項５または６に記載の形質転換体を培
養し、培養物中に産生された癌転移阻害活性を有するペ
プチドを単離し、所望により精製することからなる、配
列番号５のアミノ酸配列で表される癌転移阻害活性を有
するペプチドの製造方法。