JPH05501651A - Ｐ．クリソゲナムから得られるオキシドリダクターゼ酵素系、それをコードする遺伝子のセットと、抗生物質を増産するためのオキシドリダクターゼ酵素系あるいはそれをコードする遺伝子の使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

それをコードする遺伝子のセントと、抗生物質を増産するためのオキシドリダク ターゼ酵素系あるいはそれをコードする遺伝子の使用 本発明はβ−ラクタム化合物の生産に関係する酵素系と、抗生物質を増産するた めの酵素系の使用に関する。 ペニシリンとセファロスポリンか抗菌剤として最も広く使用される。ベニシリ（ １９８９）３：６８９−６９５）。 セファロスポリンとペニシリンへ導く生合成の経路における主な段階は過去３０ 年の間に解明されてきた。その経路は２つの酵素的段階を共有している。最初の 段階では、トリペプチドがα−アミノアジピン酸、システィン及びバリンから生 成される。この段階をになう酵素はδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−シス テイニル−〇−バリン（ＡＣＶ）合成酵素である。二番目の段階ではそのＡＣＶ がイソペニシリンＮ合成酵素（以下、ＩＰＮＳと表わされる）あるいはサイクラ ーゼで環化される。その反応生成物はイソペニシリンＮで、典型的なβ−ラクタ ム環状構造を含み、抗菌活性を育する化合物である。ペニシリンの生合成は独特 の３番目の、そして最後の段階を件い、その段階ではイソペニシリンＮのα−ア ミノアジピン酸側鎖が疎水性の側鎖に変換される。工業生産で通常使われる疎水 性側鎖はフェニル酢酸（ＰＡＡ）とフェノキシ酢酸（ＰＯＡ）で、それぞれペニ シリンＧとペニシリンＶを産する。その側鎖の変換はアシルトランスフェラーゼ （ＡＴ）と呼ばれる単一酵素による触媒反応であると提証されてきた。セファロ スポリンは、イソペニシリンＮのペニシリンＮへの異性ｆ法理の拡張、そして水 酸化を含む幾つかの段階でイソペニシリンＮから形成される。 ペニシリンとセファロスポリンへの生合成経路はほとんど完全に説明されてきて おり、ペニシリンとセファロスポリンへの生合成に関係する大部分の酵素が精製 され、特徴づけられてきた（Ｉｎｇｏｌｉａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｄ、　Ｒｅｓ 、　Ｒｅｖ、、（＋９８９）９・２４５−２５６）。 これらの酵素をコードする遺伝子がクローニングされてきており、これらの酵素 をコードしているＤＮＡを含む発現ベクターを産生株に導入するとβ−ラクタム 化合物の収率があがるであろうと一般に理解されている。最近では、遺伝子のエ クストラコピー（ｅｘｔｒａ　ｃｏｐｉｅｓ）の発現の成功応用例が述べられて いる（Ｓｋａｔｒｕｄ　ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　（１９ ８９）　７　：　４７７−４８５）。 β−ラクタム化合物を生産するために、還元条件を持続することが重要であると 認められている。たとえば非還元条件下では、ＡＣＶはＡＣＶジスルフィド（ｂ ｉｓ−ＡＣＶ）に、あるいは、おそらく他のチオールを含む化合物か混ざったジ スルフィドに三量化する。これらのジスルフィドはＴＰＮＳによる基質としては 使わジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元化合物がインヴイトロでの還元 条件を持続するのに使われる。この方法で、分離された酵素を使って、非天然型 のペニシリン及びセファ０スポリン誘導体と同じように、トリペプチド前駆体か らセファロスポリンを生産する過程が発展している（ＵＳ特許４，５１０，２４ ６及び４．５３６．４７６）。さらに酵素ＡＣＶＳを使ってトリペプチドを生産 する過程がＥＰ−Ａ−２８００５１，で述べられている。現在、β−ラクタム化 合物の生産に関与する酵素とジスルフィド化合物、たとえばＡＣＶが、Ｐ　クリ ソゲナムや他のβ−ラクタム生産微生物内で還元状態でどのように持続されるの かは知られていない。 驚ろくべきことには、他のジスルフィド化合物の中でｂｉｓ−ＡＣＶを還元する ことができる還元特性をもつ未報告の酵素系が分離された。その酵素系は、還元 された形では、２つのポリペプチド成分、すなわち高及び低分子量のポリペプチ ドと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰＨ）のような電子伝達 体を含む。そのポリペプチド成分はチオレドキシン還元酵素とチオレドキシンに それぞれ類似している。チオレドキシン系がβ−ラクタムの生産に関係するかも しれないということは前に述べられていない。 そこで、本発明は、オキシドリダクターゼ系を提供するものであり、すなわちＰ 、クリソゲナムから得ることができ、他の成分の中でＡＣＶジスルフィドを還元 することができるチオレドキシン還元酵素系を提供するものである。 このオキシドリダクターゼ系はソディウムドデシルスルフエイトポリアクリルア ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で決められた約３６ｔＧ）ａの分子量を もつ高分子量（ＨＭＷ）のポリペプチド、５ＤＳ−ＰＡＧＥで決められた約１２ 　ＫＤａの分子量をもつ低分子量のポリペプチド及び還元された電子伝達体から 成る。高及び低分子量のポリペプチドは、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換 クロマトグラフィーそしてアフィニティクロマトグラフィーの組み合わせで分離 された。 ＨＭＷ成分はエシェリヒア　三ユから得られたチオレドキシン還元酵素に類似し ている。ＬＭＷ成分は既知のチオレドキシンに類似しており、蛋白ジスルフィド 変換を含む類似の活性を有する。またＰ、クリソゲナムから得られる新しいオキ シドリダクターゼ系のポリペプチド成分をコードする遺伝子も提供される。 さらに、Ｐ、クリソゲナムのオキシドリダクターゼ系が、例えば還元状態でβ− ラクタム生合成に関係する、酵素と例えばＡＣＶのようなジスルフィド化合物の 維持に関係することが発見された。また他のチオレドキシン系がこの目的に適チ オレドキシン系のポリペプチド成分の両方をコードしている遺伝子を、代謝産物 、たとえばβ−ラクタム化合物の生産を増進する方法として使うことができ、そ の方法はチオレドキシン系の１番目及び２番目の成分あるいはそれらの機能性部 分をコードしているＤＮＡ配列であって、細胞内で機能する転写及び翻訳制御シ グナルの制御コントロール下にある各ＤＮＡ配列を含む微生物宿主の形質転換体 からなる微生物培地を育て、それにより該酵素系の上記成分で発現され、該β− ラクタム化合物が生産され、そして前述のβ−ラクタム化合物を分離することに よってできる。本発明はさらに、新規オキシドリダクターゼ系のポリペプチド化 合物をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むＤＮＡ構造と、該ＤＮＡの構造 を含む宿主を提供する。 最後にジスルフィド化合物と、インヴイトロでのβ−ラクタム化合物の生産に関 係する化合物を還元する方法が提供さね〜核力法では還元皇の電子伝達体の存在 下で還元ずべき化合物をＨＭＷポリペプチドとＬＭＷポリペプチドから成るオキ シドリダクターゼを含み、ジスルフィド化合物を還元することができる組成物に 還元型の電子伝達体の存在下で接触させるが、あるいは、例えばＤＴＴのような 還元剤の存在下でＬＭＷポリペプチドに接触させる好ましくは、ＡＣＶはこの図 １・ｐＰＣＨ−１に含まれるＰ、クリソゲナム由来ＤＮＡの部分的制限地図の図 式的説明。遺伝子の５′−末端の位置とＨＭＷ遺伝子の転写の方向を示すノ酸配 列をコードするオーブンリーディングフレームを示す。（下線部）。イントロン の位置もまた示す（下に記す部分）。 る。アミノ酸配列の一部を示す。 配列リストＮα４はＨＭＷポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列に基づいた２９ −マーのオリゴヌクレオチドプローブを示す。 配列リスト魔５はチオレドキシンに典型的な酸化還元（ｒｅｄｏｘ）配列を示す 。 本発明に従い、β−ラクタム抗生物質を得るための、あるいは生産を高めるため に使うことができるオキシドリダクターゼ系が提供される。本酵素系は天然に存 在する酵素系であり、分離された形では２つの成分、高分子量ポリペプチドと低 分子量ポリペプチド、及びＮＡＤＰＨのような還元状態の電子伝達体を含む。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、Ｐ、クリソゲナム由来のオキシドリダクター ゼ系の高分子量（ＨＭＷ）成分は、約３６ＫＤａのみかけの分子量を有しており 、そして低分子量（ＬＭＷ）成分は、約１２ｔａ）ａのみかけの分子量をもつ。 本酵素系は、ＮＡＤＰＨのような電子供与体の存在下でジスルフィド結合を含む 化合物中にフリーのチオールを形成することができる。 ド成分から成る。活性は５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ ＮＢ）の還元を、４１２Ｉ＆２５°Ｃでの吸光度の増加を追うことで具体的に示 された。その代わりの方法として、他の基質を用いて３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ の吸光度の減少を追うことで還元速度を測定した。この場合、活性はＮＡＤＰＨ のマイクロモル７分９ｍｇタンパクとして表わされる。 本酵素系はＰ、クリソゲナムから得られ、あるいは本発明の遺伝子を導入発現し た後のＰ、クリソゲナムのＨＭＷあるいはＬＭＷ成分をコードする遺伝子を含む 他の酵母、かび、あるいは細菌から得られる。リダクターゼ活性に関与するポ培 地で増殖した。至適酵素、活性は使用した微生物株及び培地と、菌糸体の集薗時 間に依存する。 本酵素系のポリペプチド成分は、分子ふるい、イオン交換クロマトグラフィー、 アフィニティクロマトグラフィーを含むさまざまな技術を組み合わせて、無細胞 抽出物から分離された。その酵素系は、まず細胞を破砕し、続いておよそｐＨ８ ，０の低イオン強度（１〜５０ｄｌ）緩衝液（例えばトリスバッファー）でホモ ジネートすることによって、Ｐ　クリソゲナムより抽出された、細胞の溶菌は数 種の方法で行うことかでき、例えばブラウン細胞膜破砕機を使ったりフレンチプ レスを使ったり、あるいは凍結乾燥した菌糸体を乳鉢ですりつぶしてから緩衝液 （好ましくは１〜５０ｍＭトリスのような低イオン強度のもの）°で抽出するこ とにより行うことができる。固型物から液体を分離した後、例えば硫酸ストレプ トマイシン、ボリミンＢ、あるいは硫酸プロタミンのような化合物によって、核 酸を除去した。 例えばｐＨ８，０で硫酸アンモニウムを使うことによって、液相中の蛋白質か沈 殿した。５０％−８０％飽和の間で形成する沈殿を集め、その後、溶解して酵素 系を含む活性画分を集めた。分子ふるい技術（例えば、低圧樹脂、ＡｃＡ３４あ るいはセファデックスＧ７５、これらは約３から８０にダルトンの輻の間で画分 する）によりこれらの活性画分を分画した後、その活性が消去した。これらのカ ラムから初期に溶出する画分を遅れて溶出する画分と混合した後に、ＨＭＷ及び ＬＭＷ成分を含む両分をＤＴＮＢアッセイを使って同定した。 本酵素系のＨＭＷとＬＭＷの成分は別々に精製された。ＨＭＷ成分を含む画分は さらに、低イオン強度緩衝液（例えば５０−トリス−塩酸ｐ）１８．０．１ｄＥ ＤＴＡ）で平衡化した低、中あるいは高圧でのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ ）あるいはモノＱのような陰イオン交換樹脂、例えばＴＳＫ−ＤＥＡＥ−８５０ を用いて分画された。ＨＭＷ成分は、例えば０から０．５　Ｍ　ＮａＣｊ？の幅 での塩勾配で溶出した。ＤＴＮＢアッセイで活性を示す両分は０．２と０．４　 Ｍ　ＮａＣ１の間の勾配で溶出した。この段階の後ＨＭＷ成分は、より低塩濃度 で溶出する酵素、グルタチオンリダクターゼから分離される。集められた画分は 更にブルーセファ０−スＣＬ−６Ｂのような、ＮＡＤ”あるいはＮＡＤＰ”に親 和性をもつアフィニティクロマトグラフィー樹脂によって精製した。その樹脂を 、例えば２０ｄｉｌ）リス、１ｄｌＥＤＴＡのようなｐＨ７，３以下の低イオン 強度緩衝液で洗浄した。ＨＭＷ成分は同緩衝液に５ｍＭＮＡＤＰＨを加えること によってその樹脂から溶出される。 ＬＭＷ成分を含む分子ふるいカラムの画分は、例えばＴＳＫ−ＤＥＡＥ−６５０ Ｓのように、低イオン強度緩衝液、好ましくはｌＯ蘭トリス−塩酸ｐＨｓ、ｏ、 Ｉｄｌ　ＥＤＴＡあるいはそれ以下で平衡化した低、中あるいは高圧でのＤＥＡ ＥあるいはモノＱのような陰イオン交換樹脂を使って、さらに精製された。ＬＭ Ｗ成分は例えば０−０．３Ｍ　ＮａＣｆの幅での塩勾配で溶出した。ＬＭＷ成分 の活性を安定化するために、この成分を含む画分に例えばＤＴＴやβ−メルカプ トエタノールのような還元剤を入れた。活性をテストする前に、例えばＤＥＡＥ 樹脂に結合したＬＭＷ成分を充分に洗浄することによって、ゲル濾過によって、 あるいは１〜４０ｍＭ酢酸ナトリウムのような低イオン強度緩衝液に対して溶出 した画分を透析することによって、その還元剤を常に除去する。ＬＭＷ成分は、 ｐＨ５，５以下（例えば１＋ｎ１ＪＥＤＴＡを含む２０雇（酢酸ナトリウムｐＨ ４，９）の低イオン強度緩衝液で平衡化したカルボキシメチル（ＣＭ−）セファ ロースのような陽イオン交換樹脂を使ってさらに精製された。ＬＭＷ成分は０− ６００ｍＭ酢酸ナトリウムのような勾配で溶出した。ＬＭＷポリペプチドを含む 画分は２５０と４５０ｍ１の間の酢酸で溶出した。 ＨＭＷとＬＭＷ成分の純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。これらのバンドのア ミノ酸シークエンシングを行い、５ＤＳ−ＰＡＧＥに続くアミノ酸シークエンシ ングにより判定すると、これらのポリペプチドが、実質上細胞残渣や他の微生物 蛋白を含まないことが示された。 ブルーセファロースＣＬ−６Ｂアフィニティクロマトグラフィーの後、基質とし てＤＴＮＢと、ＤＥＡＥで精製されたＬＭＷ成分の一定量を用いて決めると、Ｈ ＭＷ成分は１．０−２．０　μｍｏｌｅｓ　ＮＡＤＰＨ／ｍｉｎ、　ｍｇ　ｐｒ ｏｔ、の範囲の比活性をもつ。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーの後、Ｌ ＭＷ成分は、基質としてＤＴＮＢを用いて決めると、０．３−０．４　μｍｏｌ ｅｓ　ＮＡＤＰＨ／ｗｉｎ、　ｍｇ　ｐｒｏｔ、の比活性をもつ。しかしながら 、比活性の測定は、ＨＭＷとＬＭＷの成分の純度、精製後の測定時期、そして反 応混合物に加えられるＨＭＷとＬＭＷの成分の相対量にかなり依存する。高度に 精製されたポリペプチド成分は、部分的に精製されたポリペプチド成分より不安 定である。 その酵素系は、ビス−ＡＣＶ、ＤＴＮＢ、ビス−（Ｃｙｓ−ｇｌｙ）そしてビス −（補酵素Ａ）のような低分子量のジスルフィドを還元することかできた。ミカ エリスメンテン定数（Ｋ、）は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの後得られるＨＭ ＷとＬＭＷの成分を用いて、これらの基質で測定された（各々１８と２．５μｇ ）。 Ｋ、値は、ビス−ＡＣｖで１２５μＮ］、ＤＴＮＢｔ’１．４　μＭ、ビス−（ 補酵素Ａ）で８３μＭ、そしてビス−（Ｃｙｓ−ｇｌｙ）で８００　μＭのオー ダーにあった。 本酵素系で、インシュリンにあるような蛋白ジスルフィドを還元することもてき た。インシュリンのに、値は、３つのジスルフィドを含む未変性の分子の分子量 に基づくと、２．３晶（である。 Ｐ　クリソゲナム由来のＨＭＷとＬＭＷの成分のアミノ酸配列を当業界において 知られている方法によって決めた。ＨＭＷ遺伝子生産物は次のアミノ酸配列から 成る。 Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ｖａｌ−Ｖａｌ−［１ｅ−１１ｅ− Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ− Ａｌａ−［１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ− 。 残基２−２９は、精製された蛋白質のアミノ酸配列分析によって、決められた。 クローン化されたＨＭＷ遺伝子の塩基配列データによりこの配列中の仮定的構造 が確定され、残基ｌと残基３０−３６でその配列を延長した。 ＬＭＷ遺伝子生産物は次のアミノ酸配列からなる。 （Ｇｌｙ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ａｓｐ− Ａ　１ａ−（Ｔｈｒ）−（Ｇ　１ｙ）−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−（Ｖａ　１）−（Ｖ ａｌ）−ＡＳＩ）−Ｐｈｅ−Ｈ１ｓ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ−（Ｔｒｐ）−（Ｇｌｕ ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−αａａ）−（Ｌｙｓ）−（Ａｌａ）−（Ｉｌｅ）−（Ａｌ ａ）−（Ｐｒｏ）−（Ｇｌｕ）−。 いくつかのアミノ酸は明らかに合理的には決定することはできなかった。これら の仮定的構造は、かっこの中で示される。 本発明はまた、Ｐ、クリソゲナムのＨＭＷとＬＭＷポリペプチドあるいはそれら の一部と相同性があり、比活性を示す、異なったアミノ酸配列をもつポリペプチ ドも含む。本明細書において相同性はＨＭＷあるいはＬＭＷ蛋白質のアミノ酸配 列と比べて、少くとも８０％の類似成績があるものと定義され、それはギヤノブ ウェイト３．　ＯＯＯとレングスウェイト０．１００のパラメーターセツティン グを用いてライスコンシン　シーケンス　アナライシス　ソフトウェア　パッケ ージ（バージョン６．０、ｒｅｌｅａｓｅ　１９８９、ＧＣＧ、ライスコンシン 大学、Ｕ、　Ｓ。 Ａ）のベストフィツトプログラムによって決められる。８５％より低いか６０％ より高い類似成績をもつアミノ酸配列を本明細書で類似物と呼ぶ。相同性のある 蛋白質は天然から分離されるかもしれず、あるいは遺伝子をコードするＨＭＷと ＬＭＷの変異によって生産されるかもしれない。 アミノ酸配列を既知のアミノ酸配列と比較すると、ＨＭＷポリペプチドのＮ−末 端アミノ酸配列は　Ｅ、　ｃｏｌｉ　（ＥＣ１，６，４，５）のチオレドキシン リダクターゼのＮ−末端アミノ酸配列に類似している（３３個のアミノ酸の重な りにおいて８４％の類似性をもつ）ことか明らかになった。ＬＭＷ配列はチオレ ドキシンに典型的な、高度に保存されたレドックス配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ −Ｃｙｓを含んでもよいし、数種の生物から得られるチオレドキシンに類似して いてもよい（Ｅ、　ｃｏｌｉのチオレドキシンへの３８個のアミノ酸の重なりに おいて６０％の類似性をもつ）。 ＨＭＷ及びＬＭＷ成分とＮＡＤＰＨ（７）結合作用によってＤＴＮＢかビス−Ａ Ｃｖのどちらかが還元される測定で、ＬＭＷ成分をスビラリナ　プラテンシスか ら得られるチオレドキシンでおきかえることができるという発見は、ＬＭＷ成分 のチオレドキシンとの相同性をさらに示唆する。 びチオレドキシンと呼ぶことができよう。 ポリペプチドあるいはそれらの一部分は、抗原、受容体、ラベル等の他の化合物 に結合されていてもよい。 またＰ、クリソゲナムのオキシドリダクターゼ系のポリペプチド成分をコードす る遺伝子も、本発明で提供される。２つのポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列 が決められた。このことは、ここで以下に定義されるリバース遺伝子工学的手法 を使って、これらのポリペプチドをコードする遺伝子を分離し、ひき続きこれら の遺伝子の塩基配列を決める（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　［ｎｇｏｌｉａ、　５ｕ ｐｒａ　）ことを可能にする。リバース遺伝子工学的手法によれば、精製された 酵素のＮ−末端あるいは内部のペプチド断片に基いてオリゴヌクレオチドプロー ブがデザインされる（参照ｅ、　ｇ、、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（２ｎｃｌ　ｅｅｌ、）　１９８９）。 これらのオリゴヌクレオチドプローブは、目的の遺伝子をめて、ゲノムあるいは ＣＤＮＡライブラリーを検索するために、直接使用してもよい。ラムダファージ ベクターＥＭＢＬ−３にＰ、クリソゲナムのＤＮＡ断片を含むそのようなライブ ラリーの例はＥ　ＰＯ３５４６２４で述べられている。 あるいは、より大きなプローブ断片を産生ずるために目的の微生物由来のゲノミ ックＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを使ったポリメラーゼチェーン反応（ＰｃＲ ）で用いる合成オリゴヌクレオチドプローブのセットを、デザインしてもよい。 別の手法では、精製された酵素に対する抗体、あるいはそれらの一部を、目的の 遺伝子をめて発現ライブラリーを検索するのに使用してもよい。ＨＭＷ及びＬＭ Ｗポリペプチドをコードする遺伝子、あるいは遺伝子の一部が、一度クローン化 されるとこれらの遺伝子は異種交雑によって他の生物から対応する遺伝子をば遺 伝子の中で最も保存された配列の領域を含む合成オリゴヌクレオチドプローブを 作ることができる。これらのオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムあるいはＣＤＮ Ａライブラリーの検索に使うことができる。他方、ＰｃＲ技術を使って選ばれた 微生物のゲノムＤＮＡ５ｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡから、目的の遺伝子又はその 一部を分離するために使うことができるオリゴヌクレオチドを作成してもよい。 まだもう一つの手法では、ＨＭＷ及びＬＭＷポリペプチドをコードする遺伝子の クローン化された配列を、真正のＨＭＷ及びＬＭＷポリペプチドをコードしてい る遺伝子の遺伝子破壊によるオキシドリダクターゼ変異株をこれらの遺伝子のク ローン化された変異誘導体による形質転換で創るために用いてもよい。その結果 として生ずるチオレドキシンあるいはチオレドキシンリダクターゼ変異株は、オ キシドリダクターゼ活性を保存できる同種あるいは別種の生物からＤＮＡ断片を 選択し、分離するための宿主として、引き続き使うことができる。 プローブは、プローブとその相補的な標的との間での二重鎖形成を検出できるさ まざまな標識に結合することによって改変されていてもよい。標識には、放射性 間位体、リガンド、ｅ、　ｇ、ビオチン、酵素、蛍光物質及びこれに類似するも のが含まれる。プローブを標識化し、プローブとそれらの標的交雑配列との間で 形成される二重鎖を検出するための種々の方法が文献で述べられている。例えば Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｋｉｍｍｅｌ、　！ｉｉ集者、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ、　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ刀@（１９８７） Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡを参照 のこと。プローブ配列はまたさまざまな他の核酸配列に結合していてもよい。こ れらの他の核酸配列の中には、プラスミド、コスミド、ファージ、及びそれに類 するもの、のようなベクターが存在する。プローブ配列をベクター配列に結合さ せることによって、プローブは都合よく創られ、延長され、保存され、改変する ことができる。 都合良い制限部位が本酵素系をコードするＤＮＡ配列の中にデザインされていて もよい。可能な場合には、制限部分は発現生産物のアミノ酸配列を不変のままに する。ある場合には、新しい制限部位の取込みが、変化したアミノ酸配列を生み 出すかもしれない。しかしながら、ＨＭＷ及びＬＭＷポリペプチドの３次元構造 が残されていること、特に酵素活性を担う酵素系の構造のその（それらの）部分 が残されているということが極めて望ましいことである。 本発明はまた、例えば、その配列は同じアミノ酸をコードするか、３０％まで異 なる塩基を、より通常的には１０％以下の異なる塩基を有する保存性（ｃｏｎｓ ｅｖａｔｉｖｅ）突然変異を件い、あるいは約１０％より少なく、より通常的に は約５％よりも少なく、好ましくは１％以下のアミノ酸がとり代えられ、あるい は削除されており、そう人されるアミノ酸は５％より少ない非保存性（ｎｏｎ− ｃｏｎｓｅｖａｔｊｖｅ）変異を件う異なる塩基配列を含む遺伝子も含む（１０ ０分率は天然に存在するアミノ酸の数に基く）。前述の遺伝子も、ハイブリダイ ゼーションによって分離されるかもしれない。 その酵素系をコードするＤＮＡ配列が一度分離されると、ＤＮＡ配列は都合よい 宿主、すなわち原核生物か真核生物のどちらか一方での発現のために、その後使 用されてもよい。配列の発現のために、必要な場合には、開始メチオニンコドン が提供される。 その酵素系をコードするＤＮＡ配列か未変性の酵素系をコードする遺伝子の真正 の転写及び翻訳制御領域を有効に認める宿主において発現されるような場合には 、真正な５′及び３′−制御領域をもつ完全な遺伝子をさらに手を加えることな く宿主に導入してもよい。 本酵素系をコードするＤＮＡ配列が、真正な発現シグナルを認めない宿主細胞内 で発現されるような場合には、あるいは本酵素系をコードする未変性の遺伝子が 使われない場合には、さらに処理が必要となる。オーブンリーディングフレーム （ＯＲＦ）の上流の非コード５′−領域を、エクソヌクレアーゼ消化、例えばＢ ａ１３１消化等により除去してもよい。あるいは、都合良い制限部位がＯＲＦの ５′−末端の近くにある場合には、ＤＮＡを制限処理し、宿主細胞内のＯＲＦの 発現を提供するＤＮＡ配列に、ＯＲＦをつなぐためにアダプターが使われるか、 その場合アダプターはＯＲＦの失われた塩基を提供する。同じように真正の３′ −転写制御領域を宿主内で機能する３′−転写制御領域によっておきかえること かできる。加えて、他の宿主、特に原核生物の宿主内での発現には遺伝子内のイ ントロンの除去と、遺伝子のｃＤＮＡコピーの使用を必要とするかもしれない。 本酵素系の成分ポリペプチドをコードする遺伝子のために、オリジナルの発現か ら得られる発現シグナルによって置きかえることができる。これらのプロモータ ーは、好ましくはβ−ラクタム合成の間に発現される。発現シグナルは、本明細 書において転写の有効な開始と終結及び翻訳の有効な開始と終結に必要で十分な シグナルとして定義される。 その遺伝子は、形質転換、ウィルスと遺伝子を接触させることによるトランスフ ェクション、細胞等への遺伝子のマイクロインジェクションのような既知の技術 に従って、宿主細胞へ導入されてもよい。それらの遺伝子は、１つの構造物の中 に一緒に、あるいは別の構造物の中にそれぞれ別々に組み入れることができる。 それらの遺伝子をＰ、クリソゲナムあるいは他のβ−ラクタム生産生物の株、好 ましくは生産株に、適切な選択マーカーと共に（相互）形質転換によって、導入 することができる。 形質転換の選択が、異なった選択マーカー、即ち宿主に相同又は異種のマーカー 、ベクター配列が存在又は欠損しているマーカー、非選択的ＤＮＡに物理的に結 合又は結合していないかマーカーを使うことによって、達成されるということは 、当業者に自明なことである。特に微生物宿主は、カビのグループ、好ましくれ る。 物から得られるチオレドキシンとチオレドキシン還元酵素も使用することができ る。これはＨＭＷ及びＬＭＷ成分とＮＡＤＰＨの結合作用によってＤＴＮＢかビ ンシスから得られるチオレドキシンによってＬＭＷ成分を置換することができる という知見により例証される。チオレドキシンはアミノ酸配列：　−Ｃｙｓ−Ｇ ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有し、露出された活性中心内に２つのレドックス活性 ハーフシスティン残基をもつ蛋白質として定義され、ジスルフィド結合を含む他 の化合物のほかに、蛋白質中のジスルフィド結合を還元することかできる（Ａ、 　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８５）５４　：２３７−２７１）、そのポリペプチド成 分は、十分に精製されなくてもよく、たいてい適用する場合は、部分的に精製さ れたポリペプチド成分が使われる。 その酵素系はＤＴＴをおきかえることができる。ＤＴＴは、例えば分離された酵 素がβ−ラクタム化合物を生産するために使われる過程で、還元状態を提供する ために使われる。たいていのβ−ラクタム生合成酵素の活性は、ＤＴＴの存在に よって促進される。ＩＰＮＳの基質であるトリペプチドＡＣＶは、還元状態でな ければならない。 しかしながら、鉄の存在下では、ＤＴＴは多くの酵素を失活させるだろう（Ｋｉ ｍｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８５）　２６０　：１ ５３９４−１５３９７）。 鉄は、環の閉鎖、環の拡張及び水酸化を触媒するようなβ−ラクタム合成に関係 する酵素の必須補因子である。 チオレドキシン基が、β−ラクタム生合成のための還元条件を提供するためにＤ ＴＴをおきかえることができるということが例証されている。Ｐ、クリソゲナム から得られるオキシドリダクターゼ系及び既に知られているチオレドキシン系の 存在下で、イソペニソリンＮが非還元条件で、ＡＣＶジスルフィドから生産され た。 すへてのこれらの酵素系のＬＭＷ成分をＤＴＴの促進効果に依存するβ−ラクタ ム生合成酵素の活性を促進するために使うことができる。これはＡＣＶＳとして 例示されている。 その酵素にチオレドキシンとＤＴＴを加えると、ＤＴＴのみを加えるより活性が 高くなる結果となる。チオレドキシンリダクターゼは、適切な電子供与体の存在 下でチオレドキシンを還元することかできる蛋白質として定義づけられる。 このように、ジスルフィド化合物と、インヴイトロでのβ−ラクタム誘導体の生 産に関係する化合物を還元する方法は、電子供与体の存在下でオキシドリダクタ ーゼ系あるいはその成分を含む組成物を還元される化合物と接触させることによ り提供され、その場合前述の酵素系はＰ、クリソゲナムから得ることができ、約 ３６ＫＤａの分子量をもつ高分子量（ＨＭＷ）ポリペプチドと、約１２ＫＤａの 分子量をもつ低分子量（ＬＭＷ）ポリペプチドを成分として有し、ジスルフィド 化合物を還元することができるか、あるいは、例えばＤＴＴのような還元剤の存 在下に低分子量のポリペプチドを有するものであり、又はその場合、前述の酵素 系あるいは成分は、チオレドキシン系、あるいは任意の生物から得られるチオレ ドキシン及びチオレドキシンリダクターゼである。 使用において、Ｐ、クリソゲナムのオキシドリダクターゼ系のポリペプチド成分 をコードする遺伝子は、いくつかの適用例がある。天然から酵素系を分離するよ りもむしろ、ＨＭＷ及び／又はＬＭＷ成分を組換え技術によって改変された微生 物から供給してもよい。これはオキシドリダクターゼ系のＨＭＷ及び／又はＬＭ Ｗポリペプチド成分をコードする１以上の遺伝子を含むＤＮＡ構造物を供給しこ の場合、任意に一つあるいは両方の発現シグナルが、上述のように、同じあるい は別の生物から得られる発現シグナルによって置きかえられていてもよい：及び これらのＤＮＡ構造物により宿主生物を形質転換することによって成し遂げるこ とができる。それらの酵素系あるいはその構成成分は、基本的に上記の方法に従 って形質転換された宿主から分離してもよい。 クローン化されたＨＭＷ及びＬＭＷ遺伝子、あるいはチオレドキシン及びチオレ ドキシンリダクターゼをコードするクローン化された遺伝子を使うことによって 、改変された酵素をデザインないし合成してもよい。本発明のＤＮＡはまた、特 異的な突然変異、欠失、及びそう人が導入されているＤＮＡを生産するために部 位特異変異という既知の技術によって改変されてもよい。これらの改変は至適ｐ Ｈあるいは温度における変（ＩＺ、安定性における変（Ｅ、基質特異性における 変化のような酵素の改変された特質に帰着する。後者によれば１例えば、オキシ ドリダクターゼ系の他の成分、β−ラクタム生合成酵素、あるいは、たとえばＡ ＣＶのようなβ−ラクタム化合物の生産に関係するジスルフィド化合物、あるい はそれらの混合物により高い親和性をもつ酵素に帰着することができよう。これ らの改変された酵素をコードする遺伝子で形質転換された宿主株は、形質転換さ れない株に比べてより高い水準でβ−ラクタム抗生物質を生産することができる かもしのポリペプチド成分をコードする遺伝子を微生物宿主内のβ−ラクタム化 合物の生産を促進するために使用してもよい。この発明で述べたように供給され るＤＮＡ構造物が、前述の化合物を生産する微生物を形質転換するために使われ る。形質転換に好ましい微生物はＰ、クリソゲナム、Ａ、クリソゲナムあるいは 工各す前記発明を明確カリ、理解のために例証と実施例でやや詳細に述べてきた か、本発明の教示によれば、当業者には添付の請求の範囲の目的及び範囲を逸脱 することなく本発明に改変や修飾がなしうることが明らかである。 以下の非制限的な実施例によりさらに本発明が具体的に示される。 引用されるすべての文書を参照として本開示に含める。 ペニシリウム・クリソゲナムの抽出液の高及び低分子量画分を組み合わせるＰ　 クリソゲナムＮＲＲＬ１９５１株の胞子を含有する米（ｒｉｃｅ）をＬｅｉｎら （Ｖａｎｅｋ及びＨｏ５ｔａｌｅｋ　（ｍ）　Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、ホス トン、＋０５−１３９頁におけるＬｅｉｇ’　（１９８６）　、微生物代謝産物 の過剰生産・菌株改良及びプロセス制御法〕に記述されたようにして調製した。 炭素源として１％のデンプンを含存するトリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ）に １０５個／ｍｌの無性胞子を接種した。 ３０°Ｃで２４−４８時間増殖後、この培養液５＋＋＋ｆをＴＳＢ−デンプン培 地５００ｍ１に植菌した。２４時間後、濾過によって菌糸を回収し、得られる濾 過ケーキを０．９％ＮａＣｉて２回洗浄した。ぎっしり詰まった菌糸を使用まで 一２０°Ｃて冷凍した。 ＤＴＮＢ還元酵素活性アッセイ ＤＴＮＢ還元酵素活性を以下のようにして測定した４反応混合物は（最終濃度と して）５０ｄｌトリス−ＨＣｌ！ｐＨ８，０，１ｎｉｌ　ＥＤＴＡ、　０．０２ 　ｍＭ　ＤＴＮＢ及び０、２　ｒｒＡＩ　ＮＡＤＰＨを含有していた。酵素調製 物を加えて最終容量１ｍｌにした。 反応は４１２ｎｍ、２５°Ｃての吸光度の増加を測定することによって最初の３ 分間または必要に応しより長く追跡した。酵素調製物またはＮＡＤＰＨを除いた コントロール実験も行なった。 菌体画分の調製 菌糸１０ｇ（湿重量）を０．０５ＭｈリスーＨＣ４緩衝液ｐＨ８，０、ｌ　１Ｔ １１１１　ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に懸濁して全容量５０ｍ１とし、Ｂｒａｕｎ 　ディスメンブレーター（ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）　（Ｂｒａｕｎ　ｌＩＩ ｅｌｓｕｎｇｅｎ、　ＦＲＧ）及びＢａ１ｌｏｔｉｎｉガラスピーズ（Ｓｉｇｍ ａタイプＶ、直径４５０−５００　μｍ　）を用い、冷却しながら（ｗｉｔｈ　 ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｉｏｎ）１５秒の間隔て３０秒間破砕した。均質化懸濁液 をグラスウールを通して明澄化した。この工程及びその後の工程は４°Ｃで行っ た。菌体フリー抽出液にＴＥ緩衝液中１０％（Ｗ／Ｖ）の硫酸ストレプトマイシ ンを徐々に加えて最終濃度１％にした。 冷却下で４５分攪拌後、１０．０００　ｘｇで１０分の遠心分離によって核酸沈 殿物を除去した。上澄液を硫酸アンモニウム添加による沈殿によって分画したが 、この添加中溶液のｐＨを８０に維持した。５０−８０％飽和の１回に沈殿する 画分を少容量のＴＥ緩衝液に溶解した。溶解した画分を、ＴＥ緩衝液で平衡化し たＡ　ｃ　Ａ５４ゲル濾過カラム（２，５ｘ３５ｃｍ）に適用した。カラムをＴ Ｅ緩衝液を０．５ｍｆ／ｍｉｎの流速で流すことにより溶出し、３ｍｌずつの画 分を回収した。 ＤＴＮＢ還元酵素活性は５０−８０％飽和で沈殿する硫酸アンモニウムベレット 中に存在したか、ＡｃＡ３４ゲル濾過カラム以外の画分には存在しなかった。 ＤＴＮＢ還元酵素活性はＨＩ’ｖｌＷ物質（＞１５ｋＤａ）を含有する特定画分 にＬＭＷ物質（＜１５ｋＤａ）を含有する特定画分を加えることにより復活した 。ＤＴＮＢ還元酵素活性はＮＡＤＰＨの存在に依存することが見い出された。こ れらの実験からＰ、クリソゲナムの菌体フリー抽出液によるＤＴＮＢの還元は少 なくとも２つのポリペプチド成分（ＨＭＷ及びＬＮ［Ｗ成分）及び電子供与体に よって達せられると結論される。 実施例２ ＤＴＮＢの還元に関与する酸化還元酵素系のＨＭＷ及びＬＭＷ成分の精製ＤＴＮ Ｂ還元酵素活性アッセイ ＨＭＷ成分の精製のためのアッセイ条件は実施例１に記述したと同様である。 反応混合物を以下のようにして調製した。ＨＭＷ成分の精製のために、ＬＭＷ物 質（く１５ｋＤａ）を含有するＡｃＡ３４ゲル濾過画分５０−１００μｆを加え た（ｗｅｒｅ　１ｎｃｌｕｄｅｄ）。ＬＭＷ成分の精製のためにＨＭＷ物質（＞ ＋５ｋＤａ）を含有するゲル濾過画分２ｓ−ｓｏμｌを混合物に加えた（ｗｅｒ ｅ　１ｎｃｌｕｄｅｄ）。 ＨＭＷ成分の精製 ＨＭＷ物質を含有し、ＤＴＮＢアッセイに活性なゲル濾過画分をプールし、予め ＴＥ緩衝液で平衡化したＴＳＫ−ＤＥＡＥ　−６５０（Ｎｌｅｒｃｋ）カラム（ 床容量１０ｍＡ）に適用した。カラムを０−０．５ＭＮａＣｆの直線濃度勾配で 溶出した。０．２５−０．３２Ｍ　ＮａＣｊ！で溶出する画分かＤＴＮＢ還元酵 素アッセイで活性であった。 これらの画分をついでブルーセファロース（Ｂｌｕｅ　５ｅｐｈａｌｏｓｅ）　 ＣＬ　−６Ｂカラム上に加えた。ＨＭＷを含有する画谷はＩ　ｄｌ　ＥＤＴＡを 含有する２　Ｏｎ（Ｉ　トリス−ＨＣ１緩衝液ｐＨ７，２５中の５　ｍ１ＮＡＤ ＰＨで溶出した。この操作によって、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎ ａｔｕｃｅ（１９７０）　２２７　：　６８０−６８５）によってめた場合に３ ６ｋＤａの見掛けの分子質量（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓ ｓ）を育する１つのポリペプチドバンドを含有する画分が得られた。 ＬＭＷ物質を含存し、ＤＴＮＢ還元酵素アッセイに活性なゲル濾過画分をプール し、２　ｎｉｌ　ＤＴＴを用いてインキュベートし、１０ｍｆの床容量を有し、 予め１０　ｍｆＴＥ緩衝液で平衡化したＴＳＫ−ＤＥＡＥ−６５０Ｓ　（λＩｅ ｒｃｋ’）カラムに適用した。カラムを０−０．３〜ＩＮａＣｊ７の直線ａ度勾 配でｔ容量した。０．１−０．１５ＭＮａＣｊｌ’で溶出する画分かＤＴＮＢ還 元酵素アッセイで活性であった。これらの画分を２　ｄｌ　ＤＴＴを用いて３０ 分インキュベートした。１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する２０鴎１酢酸ナトリウム 緩衝液ｐＨ４，９に対して透析後、合した画分を、床容量１０ｍｆで同し緩衝液 で平衡化した（Ｊ、Ｉ−セファロース上に負荷した。カラムを同し緩衝液中酢酸 ナトリウム４Ｏ−６００ｄｌの直線濃度勾配で溶出した。酢酸塩緩衝液３００− ４００蘭て溶出する画分かＤＴＮＢ還元酵素アッセイて活性であった。この操作 により、５ＤＳ−ＰＡＧＥでめた場合に１２ｋＤａの見掛けの分子質量を有する ポリペプチドバントを含有する画分を得た。 精製したＬＭＷ成分を１７．５％５ＤＳ−ＰＡＡゲルに付し、精製したＨＭＷ成 分を１２％５ＤＳ＝ＰＡＡゲルに付した。ゲル操作後、ポリペプチドを電気泳動 的にポリニブ化ビニリデン膜に移動させた。水中５０％メタノール、１０％酢酸 中の０．１％クマシーブリリャントプルーＲ２５０で染色し、ついで脱染色した 。 ＨＭＷ及びＬＭＷ成分に相当するポリペプチドバントのＮ−末端アミノ酸配列を ガス相シークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｔｏｒ）　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｃｍｓ　社モデル４７０　ａ）を用いて決定した。 ＨＭＷポリペプチドについて以下のアミノ酸配列か決定された。 （Ｖａ　ｌ）−（Ｈｉ　５）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−［１ｅ− １１ｅ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ− Ａｌａ−Ａｌａ−１１ｅ−ＴｙｒＬｅｕ−Ｓｅｒ−（Ａｒｇ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−仮の帰属を括弧内に与えた。 ＬＭＷポリペプチドについて以下のアミノ酸配列か決定された。 （Ｇｌｙ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ａｓ 　ｐ−Ａ　ｌａ−（Ｔｈｒ）−（Ｇ　１ｙ）−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ−（Ｖａ　ｌ　 ）−（Ｖａ　１）−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−ｆｌ　ｉｓ　−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ−（Ｔ ｒｐ）−（Ｇ　１ｕ）−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−（Ｘａａ）−（Ｌｙｓ）−（Ａ　１ ａ）−（［！　ｅ）−（Ａ　１ａ）−（Ｐｒｏ）−（Ｇｌｕ）− 仮の帰属を括弧内に与えた。 これらのアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列との比較を、 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔ ｉｏｎ　（国立生物医学研究財団’）　（１９９０年３月まで）、５ｗ１ｓｓＰ ｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　（スイス蛋白質図書館＞　（１９９０年４月ま で）及びεｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　（ヨーロッパ分子生物学研究所＞　（１９９０年３月まで）の蛋白 質データベースに関するライブラリーサーチによって、それぞれＬｉｐｍａｎ及 びＰｅａｒｓｏｎ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２７！４３５−１４４ １）及びＰｅａｒｓｏｎ　及びＬｉｐｍａｎ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）（１９８５）８５　：２４４４−２４４８）に記載されたＦａｓｔＰ 　及びＴＦａｓｔＡプログラムを用いて行うことができる。２つの配列の間の類 似性についてのより詳しい比較はＳｍ１ｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｕａｎ ｃｅ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ。 １９８１．２：４８２−４８９）によって記述された問題解決法を用いるＢｅ５ ｔｆｉｔプログラムを用いて行うことかできる。用いられるＦａｓｔＰ、　ＴＦ ａｓｔＡ及びＢｅ５ｔＦｉｔプログラムはＧＣＧ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　（ＧＣＧ配列分析ソフトウェア −パッケージ）（脚色（ｖｅｒｓｉｏｎ）　６．　Ｏ、公開１９８９．　ＧＣＧ 、ライスコンシン大学、米国）の一部である。研究及び比較によりＨＭＷはＥ　 コリのチオレドキシン還元酵素（ＥＣ１，６，４，５）のＮ末端アミノ酸配列に 類似する（配列において８４％の類似性を示し、２７アミノ酸が重なる）ことか 判明した。 ＬＭＷ配列２−１６については上述のライブラリー中には意味のある類似性は見 い出されない。従って、上述の配列及び特性を有する酸化還元酵素系は新規な系 である。 延長されたＬＭＷ配列１６−３８はいくつかの点で仮定的である。それにも拘ら ず、残基３１−３４がレドックス反応に代表的に関与する推定的な共通配列Ｃｙ ｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを形成することが認められた。この見解は、ＬＭＷ 配列２−３８に関して行ったライブラリーサーチ及び比較を通してこの配列と異 なる種のチオレドキシンとの類似性（例えばＥ、コリのチオレドキシンと３８ア ミノ酸の重なりで６０％の類似性）を明らかにすることによって確認された。 反応混合物は５０１Ｔ１１１１トリス−ＨＣｊｌ’ｐＨ８，０、Ｉ　艷Ｉ　ＥＤ ＴＡ、０．５ｍｇビス−ＡＣＶ　（Ｂａｃｈｅｍ　Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉ ｅｎ　ＡＧ、　Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、　スイス）　、０．ｌ　ｍＭ　ＮＡＤＰＨ 及び精製ＨＭＷ及びＬＭＷ成分を含有していた。アッセイ容量はｌ　ｍｌでイン キュベーションは３０°Ｃで行った。反応は３４０ｎｍて追跡した。 ＨＭＷもしくはＬＭＷ成分のいずれか、またはビス−ＡＣＶを除いたコントロー ル実験も行った。コントロール実験のいずれにも活性か見い出されなかったのに 対し、上述の成分のすべてを含有する反応混合物中には、ＮＡＤＰＨの消費によ る、３４０ｎｍでの吸光度の減少か観察された。 用いたＨＭＷ及びＬｌｖｌＷ成分共ＤＥＡＥクロマトグラフィー後まで精製した 点を除き、実施例２に記述したＤＴＮＢ還元酵素アッセイを行った。反応混合物 中に存在する蛋白質の量はＨＭＷ成分０．２６４ｍｇとＬＭＷ成分２０μｇもし くはスピルリナ・プラテンシスから得られたチオレドキシン（ＳｉｇｌＴｌａ、 セントルイス、米国）１０μｇであった。この実験において吸光度の増加は４１ ２１ｍで測定した。 １５分のインキュベーンコン後、吸光度の増加はＨＭＷとＬＭＷの組合せについ ては０．２２５、ＨＭＷとチオレドキシンの組合せについては０．０８０であっ た。 ＨＭＷまたはＬＭＷ成分のいずれかを除いたコントロール実験、またはＨＭＷま たはチオレドキシンのいずれかを除いたコントロール実験は吸光度の増加を示さ なかった。 Ｐ　クリソゲナムのＨＭＷ化合物とスピルリナ・プラテンシスのチオレドキシン の協同作用によるビス−ＡＣＶの還元は以下のようにして測定した。反応混合物 は８０閘トリス−ＨｆＪ’　ｐＨ８，０，１，５ｉｔ　ＥＤＴＡ、０．０３　ｍ ｇ／ｍｌビス−ＡＣＶ及びＯ，ｌ　閘ＮＡＤＰＨを含有していた。加えた蛋白質 の量を表１に示す。 ＨＭ　Ｗ及びＬＭＷ成分はＤＥＡＥクロマトグラフィー後まで精製した。アッセ イ容量は０．５ｍ！！であり、インキュベーションは室温で行った。反応は３４ ０ｎｍで追跡し、活性は１分間に酸化されたＮＡＤＰＨのμｍｏｌｅｓとして表 した。 〔表１〕 ＨＲＩＩＶ（μｇ）　ＬλＩＩＶ（μｇ）　チオレドキシン（μｇ）　μｍｏｌ 　ＮＡＤＰＨ／ｍ１ｎ２５０　１０　０　２．２５ ２５０　５　−　０　１．１’３ ６０　０　４　１．９３ ２５０　０　２　０、６４ ２５０　０　１　０．３２ １２５　０　０　０、３２ ０　１０　０　０、＋６ ０　０　４　０．１６ 結果はスピルリナ・プラテンシスのチオレドキシンか基質ビスＡＣＶに対し親和 性を有することを示している。活性は、明らかに、用いたチオレドキシンの濃度 に依存する。さらに、結果はＰ　クリソゲナムのＨＭＷ成分かスピルリナ・プラ テンシスから得られたチオレドキシンに対し親和性を有することを示している。 イソペニシリンＮの酵素合成はＡＣＶのチオール形感の存在に依存する。この実 験ではＩＰＮＳによるイソペニシリンＮの合成を基質としてビスＡＣＶを用いて 行った。イソペニシリンＮの生産のためのアッセイ条件は以下の通りであった。 反応混合物ハ５０　ｍｌ　ｈｌＪス−ＨＣｌ！ｐＨ７，５，１，４２ｄｌ　ヒス ＡｃＶ、３．８４ｍＡｌアスコルベート、０．８１ＴＩＮＩ　Ｆｅ”、０．７　 ｎｉｌ　ＥＤＴＡ、ｌ　４．２　ｓ　ｎｉｌ　ＮＡｉ：＋ＰＨ１１６，８μｇの ＩＰＮＳ及び必要とされるＨＭＷ及びＬＭＷ成分を含有していた。 酵素調製物を加えて最終容量７０μｌにした。ＴＰＮＳ調製物はフラボバクテリ ウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｓｐ、１２．１５４からのＩＰＮＳ遺 伝子を発現するＥ、コリ株から製造した調製物である。ＩＰＮＳ遺伝子はＰＩＮ 　ＯＭＰＡ発現ベクター　（Ｆ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌら（纏）、Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　＆Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ 分子生物学における現在のプロトコル）（１’９８７−１９．ｓ８）、Ｊｏｈｎ 　Ｗｉｌｌｅｙａｎｄ　Ｓｏｎ、ニューヨーク）中にクローン化されている。Ｅ 　コリ　ＭＣＩ　０２２は得られたベクターｐＤｓ５１０て形質転換されている 。 ｐＤｓ５１０を含有するＥ、　ＤすＭＣＩ　０２２をＬＢ培地＋５−Ｏｔｔ　ｇ ／ｍｌカナマイシン中で一夜増殖させた。菌体をＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイ シン十〇、Ｉ晶１イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）中に１００倍希釈 し、２Ｌフラスコ中で増殖した。６時間後に菌体を回収したか、ＯＤ、。。は約 ２であった。菌体は遠心分離によって回収し、５０ｄｌ　トリス−ＨＣ，ｆ’　 ｐＨ７，５で洗浄した。菌体を１ｍＭＤＴＴを含有する同じトリス緩衝液中で音 波処理した。粗抽出液を１％硫酸ストレプトマイシンで処理して核酸を沈殿させ た。４０−８０％飽和で沈殿する硫酸アンモニウム画分を集めた。試料をＡＣＡ ４４カラム（５５ｃｍＸ２．６ｃｍ）に０、３３　ｍＪ／ｍｉｎで１２分付した 。画分中の抗生物質活性を試験微生物としてミクロコツカス・ルテウスＱｌｉｃ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）を用いる標準的バイオアッセイによりアッセ イした。異なるセファロスポリンＣＢ度の標準曲線を形成したが、かくしてその 数はセファロスポリンＣの活性に相対させた活性を表す。活性画分をプールし、 ＤＥＡＥセファロースカラム１．６ｃｍＸＩｏｃｍ上に負荷した。〇−４００ｍ ｌ　ＮａＣ４のｉ５０ｍｊ！勾配で蛋白質を溶出した。流量は０．３３　ｍｊ！ ／ｍｉｎであった。画分は７．５分毎に集めた。画分をアッセイし、高活性を示 す画分をプールした。このＴＰＮＳ調製物をさらなる実験のために用いた。 ）ＴＭＷ及びＬＭＷ成分を実施例２に記述したＤＥＡＥクロマトグラフィーを含 む精製手順により部分的に精製した。 Ｐ−クリソゲナムからの酸化還元酵素系の存在下でのビスＡＣＶからイソペニシ リンＮの生成を測定した。抗生物質活性を上述のようにして測定した。ＨＭＷも しくはＬＭＷ成分のいずれかまたはＮＡＤＰＨを除いたコントロール実験を行っ た。代表的実験の結果は以下の通りであった。 非還元条件下でのビスＡＣＶからイソペニシリンＮの生成ＨＭＷ　ＬＭＷ　ＮＡ ＤＰＨ阻害ゾーン　抗生物質μｇ／反応　關　μｇ／ｍ１ ６．６８−　ＮＤ　ＮＤ ３９．６８−　ＮＤ　ＮＤ １４５．２　１１　−　ＮＤ　ＮＤ Ｂ　＋　ＮＤ　ＮＤ −１１＋　ＮＤ　ＮＤ ６．６　−　＋　ＮＤ　ＮＤ ３９．８　−　十　ＮＤ　ＮＤ １０５．６　−　＋　ＮＤ　ＮＤ １４５．２　−　十　ＮＤ　ＮＤ １０５．６　８　＋　ＮＤ　ＮＤ １４５．２　１１　＋　ＮＤ　ＮＤ コントロール実験のいずれにおいても抗生物質の生産は検出されなかった。ＨＭ Ｗ及びＬＭＷ両成分成分ＡＤＰＨが存在した場合には抗生物質活性か検出された 。イソペニシリンＮの合成は）ＩＭＷ成分の高濃度によって阻害されるようであ るか、これは調製物中の不純物による可能性がある。 この実施例はＰ、クリソゲナムの酸化還元酵素系かＩＰＮＳによるビスＡＣＶか らイソペニシリンＮの生産に必要な還元環境を提供することを実証している。 実施例７ 硫酸アンモニウム沈殿を溶解し、ゲル濾過カラム（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　 ３４）上に注いだ（ａｐｐｌ　１ｅｄ）。ＡＣＶＳ活性アッセイはＶａｎ　Ｌｉ ｃｍｐｔら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８８）２６４　：　３６８ ０−３６８４）によって記述されたようにして行った。ＡＣＶＳの高活性を示す 画分を集めた（７５−８５μｇ蛋白／ｍｉ）、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシープ リリガンドブルーＲ２５０による染色後の判断によると調製物はＡＣＶＳについ て８０％の純度を示す。この酵素をさらなる実験での使用直前にＰＤＩＯカラム に通塔してＤＴＥを除去した。 ＬＭＷ成分の精製 Ｐ、クリソゲナムＷｉｓｃｏｎｓｉｎ　５４−１２５５株（ＡＴＣＣ２８０８９ ）からＬＭＷ成分を得た。実施例２に記述したようにしてＬＭＷ成分を精製した 。ＤＥＡＥクロマトグラフィー後に得られた、ＤＴＮＢアッセイに活性の画分を さらなる実験に用いた。 ＤＴＴ及びＬＭＷ成分の存在下でのＡＣＶＳ活性の測定ＡＣＶＳ及び新鮮なりＴ Ｔを含有する反応混合物のＡＣＶＳ活性をＡＣＶＳ、活性についてのコントロー ルとしてはＡＴＰを反応混合物から除いた。反応混合物中のより低い蛋白質濃度 を補填するためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた。 反応混合物はＡＣＶＳ調製物１５０μｌを含有していた。ＤＴＴを加えて最終濃 度１．７ｍＭにした。ＡＴＰを任意的に加えて最終濃度５ｍＭにした。０．５’ ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ溶液２５μＡもしくは同じ溶液１２．５　μ４７を１．５　 ｍｇ／ｍｌ　Ｌ　ＭＷ成分調製物１２．５μｌと共に加えた。反応混合物を室温 で１０分静置した。Ｌ−α−アミノアジピン酸（最終濃度１．３ｎ＊ｌ）、Ｌ− システィン（１，３ｍＭ）、ＭｇＣｊ’ｚ（２５ｍＭ）、トリス−ＨＣ４（３５ ０ｍＭ）　ｐＨ７，５、ＥＤＴＡ　（０，１ｍｋｌ　）、グリセロール（９％Ｗ ／Ｗ）及び０．２５μＣＬ−（Ｕ−”Ｃ）バリン（３μＭ）を含有する混合物５ ０μｌを添加して反応を開始させた。反応を３０°Ｃで３０分進行させた。停止 混合物（８０μＭ　ＡＣＶＳＯ，３ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５　ｍ１ｉｌ　Ｌ−バ リン及びＩＯ％トリクロロｒｎ酸（ＴＣＡ）＞２５０μｌを添加して反応を停止 させた。 Ｐｏｒａ　ｐａｋ　Ｑ　（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ社、ミルフォー ド、ＭＡ）に通塔してＷ識バリンを分離した後、下記に与えられたｄｐｍｌ直は インキュベーション中に生産されたＡＣＶに対応する。 結果を表２に示す。 〔表２〕 ＡＴＰ　ＤＴＴ　ＬＭＷ　ｄｐｍ 塩を含有しないＵｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ　ｃ　Ａ　５４を通すゲル濾過から得られ たＬＭＷ成分を用いて同様に行った実験はＡＣＶＳ活性に対する一層強い効果（ ２３倍の刺ｆｌりを示した。このようにＬＭＷ成分はＡＣＶＳ活性を刺激する。 実施例８ ＨＭＷポリペプチドをコード化する遺伝子の単離ＨＭＷポリペプチドのＮ末端ア ミノ酸配列に基いて、以下のヌクレオチド配列を有する２９マーオリゴヌクレオ チドプローブを合成した。 ここでＡはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデオキシシチジル、 Ｔはデオキシチミジル及びＩはデオキシイノジチルである。 デオキシイノジチル含有プローブをデザインするための原理は２部分よりなる。 すなわち、プローブにおける配列の数を広げてすべての可能なコドンの使用をカ バーすること、及び混合物における異なる配列の数を制限し合理的な数にするこ とである。デオキシイノジチルそれ自体はＤＮＡハイブリッドを形成する作用に おいて本質的に中性であると考えられている。 以下のＨＭＷ遺伝子単離プロセスで用いた技術及び手順は当分野で周知であり、 Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら（前出）によって十分に記載されている。 ＨＭＷオリゴヌクレオチドプローブをγ−（”Ｐ〕−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼを用いて潔識した。標識したプローブを用いて、λ（ラムダ）フ ァージベクターＥＭＢＬ−３中で作成した、Ｐ、クリソゲナムのゲノムライブラ リーをスクリーニングした。ニトロセルロースフィルター上の約１０’のプラー クについてプラークハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション は１５％ホルムアミドを含有する標準ハイブリダイゼーション溶液中４２°Ｃで 行った。フィルターを５０−６０°Ｃで１−２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣは０．１５ Ｍ塩化ナトリウム／１５關クエン酸ナトリウムである）を用いて洗浄した。これ らの実験で８つの陽性に応答するプラークが見い出された。これらのうち５つを 同じＨＭＷプローブを用いる第２回目のスクリーニングのために選んだ。５つの ファージ単離物はいずれも明瞭な陽性応答を与えた。十分に分離された強い応答 を示すプラークをさらなる性格づけのためにピックアップした。各単離物に対し 、組換えファージの小規模ＤＮＡ調製物を作成した。 精製したＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に続いて、当分野 で周知の手順（！＋ｔａｎｉａｔｉｓ　ら、１９８９、既出）に従ってサザンプ ロットを調製した。ＨＭＷプローブによるサザンプロットのハイブリダイゼーシ ョンは、５つのλファージのすべてについて、該プローブの唯一の（ｕｎｉｑｕ ｅ）制限断片に対する陽性のハイブリダイゼーションを明らかにした。それぞれ λファージｌ、４及び５に由来する４、７キロベース（ｋｂ）　、８．　Ｏｋｂ 及び６．２ｋｂの大きさのＳａｔ　Ｉ制限断片を単離し、Ｅ、コリベクターｐＵ Ｃ１９（Ｐｏｕｗｅｌｓら、　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ。 ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　（クローニングベクター、実験室 マニュアル）、ε１ｓｅｖｉｅｒ。 アムステルダム、１９８７）中にサブクローン化した。 得られたｐＰＣＨ−Ｌ　ｐＰＣＨ−４及びｐＰＣＨ−５とそれぞれ名づけられた プラスミドを制限酵素分析及びサザンブロットハイプリダイゼーションによって さらに分析した。３つのプラスミドはすべてＨＭＷプローブに応答する１、２ｋ ｂら単離し、Ｍ１３配列ベクターＭ　ｌ　３　ｍｐ　ｌ　８／　＋　９　（Ｐｏ ｕｗｅｌｓら、既出）中にサブクローン化した。引き続き、Ｓａｎｇｅｒの手法 （Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、１９８９、既出）に従ってＨｉｎｄ　ＤＩ−ＢａｍＨ Ｉ制限断片のヌクレオチド配列を決定した。このヌクレオチド配列はＨＭＷ遺伝 子のＮ末端アミノ酸配列をコード化した読取り枠を明らかにした（図２）。ＨＭ Ｗ遺伝子の５′末端の位置及び遺伝子の転写の方向を示す（図１）。 本明細書に述べたすべての刊行物及び特許出願は本発明か関与する分野における 熟練者の熟練のレベルを示す。すへての刊行物及び特許出願は個々の刊行物また は特許出願か具体的にかつ個々的に参考に加入するよう示されているのと同程度 に参考にここに加入する。 本発明は今や十分に記述されているので、当業者にとって、多くの変化の修飾を 特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなすことかできることは 明らかであろう。 配列リスト （２＋　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎαｌのための情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ　２５０塩基対 （Ｂ）　タイプ　（亥酸 （Ｃ）　鎮状！Ｑ　（ｓｔｒａｎｄｅｄｈｅｓｓ）　１本鎖（Ｄ）トポロジー　 線状 （ｕ）分子タイプ　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定性（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉ ｃａｌ）　なしくｉｖ）アンチセンス　なし くｖｉ）起源　ベニツリウム・クリソゲナム（ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　Ｐ、クリソゲナム酸化還元酵素系のＨＭＷ遺伝子の読取り枠 （Ｂ）位置　５９＝−８０及び１６４・−２５０（Ｘｌ）配列記述　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎα１＋２＋ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα２のための情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ　３６アミノ酸 ＣＢ）　タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｉ）分子タイプ　蛋白質 （ｖｌ）起源　Ｐ　クリソゲナム （ＩＸ）特徴 （Ａ）名前／キー　Ｐ　クリソゲナム酸化還元酵素系のＨＭＷ成分（Ｂ）位置　 １・・３６ （ｘｉ）配列記述　ＳＥＱ　Ｉ　Ｎα２Ｍｅｔ　Ｖａｔ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙ ｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　［ｌｅ　［ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　Ｈｉｓｌ　５　’　１０　１５ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ（２）ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎα３のための情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ　４０アミノ酸 （Ｂ）　タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （助分子タイプ　蛋白質 （ｖｌ）起源　Ｐ、クリソゲナム （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　Ｐ、クリソゲナム酸化還元酵素系のＬＭＷ成分（Ｂ）位置　 ｌ・・４０ （Ｃ）他の情報／標識　二者択一の　ａａｓＣａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅａａｓ　 ／注　ａａｌ恐ら＜Ｇｌｙ、ａａ１９恐ら＜　Ｔｈｒ。 ａａ２０恐ら＜ＧＩＹ、ａａ２３恐ら＜ＶａＬａａ２４恐ら（Ｖａｌ、ａａ３ｏ 恐ら＜Ｔｒｐ、ａａ３１恐ら＜Ｇｌｕ、ａａ３４不明、ａａ３５恐ら＜Ｃｙｓ、 ａａ３６恐ら＜Ａｌａ、ａａ３７恐ら＜Ｔｉｅ、ａａ３８恐ら＜Ａｌａ、ａａ３ ９恐ら＜Ｐｒｏ、ａａ４０恐ら＜Ｇｌｕ（Ｘｌ）配列記述　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα ３Ａｓｐ　Ａｌａ　ｈａ　Ｘｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｓｐ　Ｐ ｈｅ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｙ＋２１ＳＥＱ　ＩＤ　 魚４のための情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ　２９塩基対 （Ｂ）　タイプ　核酸 （Ｃ）　鎖状態　１本鎖 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ＤＮＡ　（合成）（ＩＸ）特徴 （Ｃ）他の情報／標識　二者択一の　ａａｓ／注　塩基対３＝ＡまたはＣまたは Ｔ、塩基対９＝ＡまたはＣまたはＴ、塩基対１５＝ＣまタハＧ、塩基対２１＝Ｃ またはＴ（Ｘｌ）配列記述　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα４ＧＧＨＣＣ［ＧＧＨＧ　ＣＩ ＣＡＳＡＣＩＧＣＩＧｃ［ＡＴＹＧｃ　２９ｆ２１　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα５のた めの情報（ｉ）配列特性 （Ａ）　長さ　４アミノ酸 （Ｂ）　タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｉ）分子タイプ　蛋白質 （ｉｘ）特徴 （Ａ）名前／キー　チオレトキンン類について典型的なレドックス配列ＣＢ）位 ｉ１・・４ （ｘｉ）配列記述　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα５Ｆｉｇｕｒｅ　１ ＧＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＣＧ 　ＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＴｃｌｙＭｅｔＬａｕ Ｆｉｇｕｒｅ　２ 浄書′内容に変更なし） 要　約　書

【要約】

【構成］　Ｐ、クリソゲナムから得られ、β−ラクタムの生産に関与する新規な 酸化還元酵素、その酵素活性をコード化するひと組の遺伝子、及び上記の酸化還 元酵素系及び他の酸化還元酵素系またはそれをコード化する遺伝子を用いて該β −ラクタムの生産を高める方法が開示される。 平成　年　月　日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．単離された形態で第一及び第二の成分である２種のポリペプチド、約３６Ｋ Ｄａの分子量を有する高分子量（ＨＭＷ）ポリペプチドと約１２ＫＤａの分子量 をもつ低分子量（ＬＭＷ）ポリペプチドを含み、還元された電子伝達体の存在下 でジスルフィド化合物を還元することができるＰ．クリソゲナムから得ることが できるオキシドリダクターゼ系。
2. ２．例えばビス−ＡＣＶである酸化型のＡＣＶを還元することができる請求の範 囲第１項に記載のオキシドリダクターゼ系。
3. ３．請求の範囲第１項に記載のオキシドリダクターゼ系であって、該第一成分を 示すＮ末端アミノ酸配列が以下の配列：【配列があります】 に等しいか又は相同性があり、該第二成分を示すＮ末端アミノ酸配列が以下の配 列： 【配列があります】 に等しいか又は相同性があるオキシドリダクターゼ系。
4. ４．請求の範囲１ないし３項に記載の酵素系を製造する方法であって、それぞれ の配列が細胞内で機能性の発現シグナルの調節コントロール下にある該第一及び 第一成分をコードするＤＮＡ配列を含む細胞を含有する微生物培地を培養し、そ れにより該酵素の上記成分が発現される工程；及び該酵素系を単離する工程とを 含む方法。
5. ５．実質的に細胞残渣と他の微生物タンパク質を含まない請求の範囲１ないし３ 項のいずれか１項に記載のオキシドリダクターゼ系。
6. ６．請求の範囲１ないし３項、または第５項のいずれか１項に記載のオキシドリ ダクターゼ系を単離する方法であって、以下の工程：該系を含む微生物の無細胞 抽出物を得る工程；クロマトグラフィー工程により該無細胞抽出物を画分に分離 し、上記第一成分または第二成分のいずれかの各クロマトグラフィー工程の後に 活性画分を単離する工程であって、該クロマトグラフィー工程が（ａ）分子ふる いクロマトグラフィー；（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー；（ｃ）陽イオ ン交換クロマトグラフィー；（ｄ）アフィニティクロマトグラフィーの少なくと も１種を含み、該工程はいかなる配列で行ってもよいが前工程からの同定された 活性画分に対して行われる工程；及び 該（ａ）−（ｄ）の工程に続き、任意に（ａ）−（ｄ）の工程からの活性画分を ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する工程 を含む方法。
7. ７．Ｐ．クリソゲナムから得ることができ還元された電子供与体の存在下にジス ルフィド化合物を還元することができるオキシドリダクターゼ系のポリペプチド 成分の少なくとも機能的部分をコードするＤＮＡ配列。
8. ８．コードされたＨＭＷポリペプチド成分が下記のアミノ酸配列：【配列があり ます】 を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ配列。
9. ９．コードされたＬＭＷポリペプチド成分が下記のアミノ酸配列：【配列があり ます】 を含む請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ配列。
10. １０．ベニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｑｅ ｎｕｍ）から単離された請求の範囲７ないし９項のいずれか１項に記載のＤＮＡ 配列。
11. １１．請求の範囲第１０項に示されたＤＮＡ配列の発現シグナル。
12. １２．同種もしくは異種生物から得られた発現シグナルのコントロール下にある 請求の範囲７ないし１０項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
13. １３．請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列の少なくとも１種を含むＤＮＡ構 造物。
14. １４．請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ構造物を含む形質転換された宿主細胞 。
15. １５．該細胞が原核生物、好ましくは大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）もしくはストレプ トマイセート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）である請求の範囲第１４項に記載 の形質転換された宿主細胞。
16. １６．該細胞が真核生物、好ましくはペニシリウムクリソゲナム、アスペルギル スニドランス、またはアクレモニウムクリソゲナムである請求の範囲第１４項に 記載の形質転換された宿主細胞。
17. １７．β−ラクタム化合物の取得又は生産の促進における請求の範囲１４ないし １６項のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞の使用。
18. １８．微生物宿主内でβ−ラクタム化合物を取得又は生産促進する方法であって 、以下の工程： 請求の範囲１４ないし１６項のいずれか１項に記載された形質転換された宿主細 胞、またはチオレドキシン系の第一および第二成分またはその機能性部分をコー ドするＤＮＡ配列であって各ＤＮＡ配列が細胞内で機能性の転写及び翻訳制御シ グナルの制御コントロール下にある配列を含む形質転換された宿主細胞を成育さ せる工程； β−ラクタム化合物を該微生物宿主よりも高い水準で産生する該形質転換体のク ローンを同定する工程；及び 該β−ラクタム化合物を単離する工程 を含む方法。
19. １９．該微生物宿主が真菌、好ましくはペニシリウムクリソゲナム、アスペルギ ルスニドランス、アクレモニウムクリソゲナム、又はストレプトミセスである請 求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．ジスルフィド化合物及びインビトロでのβ−ラクタム化合物の製造に関与 する化合物を還元する方法であって、還元された電子伝達体の存在下で、還元す べき物質をＨＭＷポリペプチド及びＬＭＷポリペプチドからなりジスルフィド化 合物を還元することができるオキシドリダクターゼ系、あるいは例えばＤＴＴの ような還元剤の存在下にあるＬＭＷポリペプチドと接触させる工程を含む方法。
21. ２１．ＡＣＶがインビトロで還元される請求の範囲第２０項に記載の方法。
22. ２２．Ｐ．クリソゲナムから得ることができるオキシドリダクターゼ系のインビ トロでの還元系としての使用。