PT98020B

PT98020B - Processo para a preparacao de um sistema de enzima de oxido redutase e de antibioticos a partir do mesmo

Info

Publication number: PT98020B
Application number: PT98020A
Authority: PT
Inventors: Harriet Palissa; Lucia Helena Maria Van D Voort; Roelof Ary Lans Bovenberg; Yair Aharonowitz; Gerald Cohen; Rachel Schreiber; Anat Argaman; Yossef Av-Gay; Helena Maria Nan; Alfred Kattevilder
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1998-11-30
Also published as: IL98544A; PT98020A; JPH05501651A; US5328839A; US5652132A; IL98544A0; EP0462674A1; IE912083A1; KR920702419A; WO1991019788A1

Description

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ANTIBIÓTICOS

enzimas envolvido na produção de compostos de β-lactama e à utilização de sistemas de enzimas para aumentar a produção de antibióticos.

As penicilinas e as cefalosporinas são os agentes bacterianos mais utilizados. As penicilinas e as cefalosporinas são metabólitos secundários que são industrialmente produzidos por fungos filamentosos tais como Penicillium chrvsogenum e Acremonium chrvsogenum. respectivamente, em várias fases enzimáticas (J.R. Miller e

T.D. Ingolia, Mol. Microbiol. (1989) 3:689-695).

As fases principais nas vias biossintéticas que conduzem às cefalosporinas e à penicilinas foram estabelecidas nos últimos 30 anos. Às vias partilham duas fases enzimáticas. Na primeira fase é formado um tripéptido a partir do ácido a-aminoadípico, cisteína e valina. A enzima que é responsável por esta fase é a s-(L-aaminoadipil)-L-cisteinil-D-valina (ACV) sintetase. Na segunda fase o ACV é ciclizado por acção da isopenicilina N sintetase (de agora em diante referida como IPNS) ou ciclase. 0 produto da reacção é a isopenicilina N, que é um composto que contem o anel de β-lactama típico e que possui actividade anti-bacteriana. A biossíntese da penicilina envolve uma terceira fase e última em que a cadeia lateral do ácido a-aminoadípico da isopenicilina N é permutada por uma cadeia lateral hidrofóbica. As cadeias laterais hidrofóbicas vulgarmente utilizadas na produção industrial são o ácido fenilacético (AFOA) que produzem a penicilina G

e a penicilina V, respectivamente. Foi proposto que a permuta de cadeia lateral era uma reacção catalisada por uma única enzima referida como aciltransferase (AT). As cefalosporinas são obtidas a patir da isopenicilina N em várias fases que incluem a epimerização da isopenicilina N para penicilina N, expansão do anel e hidroxilação.

As vias biossintéticas para as penicilinas e cefalosporinas foram quase completamente esclarecidas e a maior parte das enzimas envolvidas na biossíntese das penicilinas e cefalosporinas foram purificadas i caracterizadas (Ingolia e col., Med. Res. Rev.. (1989) 9:245-256). Os genes que codificam estas enzimas foram clonados e é vulgarmente aceite que a introdução dos vectores de expressão que contêm o ADN que codifica estas enzimas em estirpes de produção pode aumentar o rendimento dos compostos de β-lactama. Recentemente, foi descrito um exemplo da aplicação com sucesso da expresão de cópias extra de genes (Skatrud e col.» Biotechnologv. (1989)

7:477-485).

Foi reconhecido que a manutenção das condições de redução era importante para a produção de compostos de β-lactama. Por exemplo, em condições não redutoras o tripéptido ACV dimeriza para o dissulfureto de ACV (bisACV) ou possivelmente para dissulfuretos mistos com outros compostos contendo tiol. Estes dissulfuretos não são utilizados como substratos pelo IPNS. Além disso, a enzima IPNS é menos activa em condições não redutoras (Perry e

col., Biochem. J. (1988) 255:345-351). Os compostos redutores como por exemplo o ditiotreitol (DTT) são utilizados para manter condições redotaras in vitro. Desta forma foi desenvolvido um processo para produzir cefalosporinas a partir de precursores de tripéptido bem como derivados não naturais de penicilina e de cefalosporina utilizando enzimas isoladas (Patentes Norteamericanas 4.510.246 e 4.536.476). Além disso, foi descrito no documento EP-A-280051 um processo para produzir tripéptidos utilizando a enzima ACVS. Nesta altura não é conhecida a forma como as enzimas e os compostos de dissulfureto, por exemplo o ACV envolvidos na produção de compostos de β-lactama são mantidos num estado reduzido em P. chrvsogenum ou outros microorganismos produtores de βlactama. Foi isolado com surpresa um outro sistema de enzima não referido na literatura com propriedades redutoras que é susceptível de reduzir o bis-ACV entre outros compostos de dissulfureto. O sistema de enzima compreende dois componentes de polipéptido, um polipéptido de alto peso molecular e outro de baixo peso molecular, e um veículo de electrões, como por 'exemplo o fosfato de nicotinamida ademina dinucleótido (NADPH), na sua forma reduzida. Os componentes de polipéptido partilham a semelhança com a tiorredoxina redutase e a tiorredoxina. respectivamente. Não foi ainda anteriormente mencionado que o sistema de tiorredoxina pode estar envolvido na produção de B-lactama.

Assim, a presente invenção proporciona um sistema de óxido redutase, por exemplo um sistema de tiorredoxina redutase que é possível de obter a partir de P. chrvsogenum, que é susceptível de reduzir o dissulfureto de ACV entre outros compostos. Este sistema de óxido redutase consiste num polipéptido de elevado peso molecular (APM) com um peso molecular de cerca de 36 kDa determinado pelo método da electroforese em gel de poliacrilamida e dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), e um polipéptido de baixo peso molecular (BPM) com um peso molecular de cerca de 12 kDa determinado por SDS-PAGE, e um veículo de electrões reduzido. Os polipéptidos de alto e de baixo peso molecular foram isolados por uma combinação de cromatografia em gel, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de afinidade. 0 componente de APM é semelhante á tiorredoxina redutase obtida de Escherichia coli. O componente de BPM é semelhante á tiorredoxina conhecida, e possui actividades semelhantes incluindo a permuta de dissulfureto de proteína. São também proporcionados genes que codificam os compostos de polipéptido para o novo sistema de óxido redutase obtidos de P. chrvsogenum.

Além disso, o sistema de óxido redutase de P, chrvsogenum revelou estar envolvido na manutenção de enzimas e de compostos de dissulfureto, por exemplo o ACV, envolvidos na biossíntese de β-lactama num estado reduzido.

Também se verificou que outros sistemas de tiorredoxina

eram aplicáveis para este fim. Desta forma estes sistema são aplicáveis na produção in vitro de agentes, por exemplo na produção de antibióticos de β-lactama. Além disso, podem ser utilizados os genes que codificam os componentes de polipéptido do novo sistema de óxido redutase que se pode obter de P. chrvsogenum e os que pertencem aos (outros) sistemas de tiorredoxina num processo para aumentar a produção de metabólitos, por exemplo compostos de βlactama, por crescimento de uma cultura de microorganismo consistindo em transformantes do referido hospedeiro microbiano compreendendo sequências de ADN que codificam os primeiro e segundo componentes ou as suas partes funcionais e um sistema de tiorredoxina, em que cada sequência de ADN têm o controlo de regulação de sinais de regulação transcripcional e translaccional nas referidas células, em que os referidos componentes do referido sistema de enzima são expressos e é produzido o referido composto de βlactama; e isolar-se o referido composto de β-lactama. A presente invenção proporciona ainda contruções de ADN compreendendo pelo menos um gene que codifica um composto de polipéptido do novo sistema de óxido redutase e um hospedeiro compreendendo a referida construção. Finalmente, foi proporcionado um processo para reduzir compostos de dissulfureto e compostos envolvidos na produção in vitro de compostos de β-lactama fazendo contactar, na presença de um veículo de electrões reduzido, os compostos que se pretendem reduzir com uma composição compreendendo um

sistema de óxido redutase, consistindo num polipéptido de APM e de um polipéptido de BPM, e sendo susceptível de reduzir os compostos de dissulfureto, ou com um polipéptido de BPM na presença de um agente redutor como por exemplo DTT. De preferência, o ACV é reduzido in vitro desta forma. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática de um mapa de restrição parcial do ÃDN derivado de P. chrvsogenum contido em pPCH-1. A posição da extremidade 5' do gene e a direcção de transcrição do gene de APM é indicada (seta).

Figura 2: Sequência parcial de nucleótidos do gene de APM de P.chrvsogenum. 0 quadro de leitura aberto codificando a sequência N terminal do aminoácido de APM é indicada (sublinhado). E também indicada a posição de um intrão (sublinhado)

BREVE DESCRIÇÃO DAS LISTAGENS DE SEQUÊNCIA

A listagem de sequências No. 1 mostra parte da sequência de nucleótidos e de sequência deduzida de aminoácidos do polipéptido de APM de P. chrysogenum.

A listagem de sequências No. 2 mostra parte da sequência de aminoácidos do polipéptido de APM de P. chrvsogenum

A listagem de sequências No. 3 mostra parte da sequência de aminoácidos do polipéptido de BPM de P. chrvsogenum

A listagem de sequências No. 4 mostra uma sonda de oligonucleótidos com 29 meros, com base na sequência N

terminal de aminoácidos do polipéptido de APM.

A listagem de sequências No. 5 mostra a sequência de redox típica para tiorredoxinas.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um sistema de enzima de óxido redutase que pode ser utilizado para obter ou para aumentar a produção de antibióticos de β-lactama. Este sistema de enzima é um sistema de enzima de ocorrência natural, que compreende dois componentes, um componente de polpéptido de alto peso molecular e um componente de polipéptido de baixo peso molecular, numa forma isolada e um veículo electrónico por exemplo NÀDPH num estado reduzido. Tal como medido por SDSPAGE, o componente de alto peso molecular (APM) do sistema de óxido redutase de P.chrysogenum tem um peso molecular aparente de cerca de 36 kDa, e o componente de baixo peso molecular (BPM) tem um peso molecular aparente de cerca de 12 kDa. 0 sistema de enzima é susceptível de formar tióis livres em compostos que contêm ligações de dissulfureto, na presença de um dador de electrões tal como o NADPH.

sistema de enzima compreenderá dois componentes de polipéptido que, quando combinados na presença de um veículo de electrões adequado em forma reduzida, são susceptíveis de manter enzimas e intermediários num estado reduzido in vitro. Foi demonstrada a actividade pela redução do ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) por seguimento do aumento da absorvãncia a 412 nm a 25C.

Alternativamente foram utilizados outros substratos e foi

medida a taxa de redução por seguimento da diminuição da absorvãncia de NADPH a 340 nm. Neste caso a actividade é expressa em umoles de NADP/min.mg de proteína.

O presente sistema de enzima foi obtido a partir de P. chrysogenum. ou de outras leveduras, fungos ou bactérias compreendendo os genes gue codificam os componentes de APM e de BPM de P. chrysogenum. após transferência e expressão dos genes da invenção no referido microorganismo.

Os componentes de polipéptido envolvidos na actividade de redutase foram purificados a partir de extractos isentos de células de P. chrysogenum. Foi cultivado o P. chrysogenum. por exemplo, num meio complexo como por exemplo amido como fonte de carbono, ou num meio definido. A actividade óptima de enzima é dependente da estirpe e do meio utilizado, e do tempo de cultura do micélio.

Os composto de polipéptidos do presente sistema de enzima foram isolados a partir de extractos isentos de células por combinação de várias técnicas, incluindo peneiros moleculares, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de afinidade. 0 sistema de enzima foi extraído de P. chrysogenum rompendo inicialmente as células, seguido de homogeneização num tampão de baixa força iónica (1 a 50 mM) (por exemplo um tampão Tris) a aproximadamente pH 8,0. A lise das células pode ser efectuadada de vãrias formas por exemplo por utilização de

um desmembrador de Braun por uma prensa de French, ou por moagem de micélio lofilizado seguido de extracçâo em tampão (de preferência com baixa força iónica como por exemplo Tris 1-50 mM). Após separar o líquido da matéria sólida, foi removido o ácido nucleico, por exemplo por meio de compostos tais como o sulfato de estreptomicina, Polimina B ou sulfato de protamina. A proteína na fase líquida foi precipitada utilizando, por exemplo, sulfato de amónio. pH 8,0. 0 precipitado que se formou entre 50% a 80% de saturação foi recolhido e em seguida dissolvido e as fracções activas contendo o sistema de enzima foram recolhidas. Após fraccionação destas fracções activas por técnicas de peneiros moleculares (por exemplo, resinas de baixa pressão, AcA54 ou Sephadex G75, que fraccionam aproximadamente na gama de 3 a 80 kDalton) a actividade desapareceu. Apenas após se combinarem as fracções que eluiam mais cedo destas colunas com as fracções gue eluiam mais tarde, foram identificadas as fracções contendo os componentes de APM e BPM utilizando o ensaio de DTNB.

Os componentes de APM e BPM do sistema de enzima foram purificados individualmente. As fracções contendo o componente de APM foram ainda fraccionadas utilizando resinas de permuta iónica como por exemplo a dietilamino etilo (DEAE) ou mono O a uma pressão baixa, média ou alta, por exemplo a TSK-DEÀE-650, equilibrada com um tampão de baixa força iónica (por exemplo 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA). 0 componente de APM foi eluído com um

gradiente salino, variando por exemplo de 0-0,5 M de NaCl. As fracções que revelavam actividade no ensaio de DTNB eluiam de 0,2 a 0,4 M de NaCl com este gradiente. Após esta fase o componente de ÀPM da enzima glutationa redutase que elui a concentrações salinas inferiores. As fracções combinadas foram ainda purificadas por utilização de resinas de cromatografia de afinidade para NAD⁺ ou NADP⁺, como por exemplo Blue Sepharose CL-6B. A resina foi lavada com um tampão de baixa força iónica com um valor de pH inferior a 7,3, por exemplo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA. O componente de APM é eluído da resina por adição de 5 de mM NADPH ao mesmo tampão.

As fracções da coluna de peneiros moleculares que continham o componente de BPM foram ainda purificadas utilizando resinas de permuta aniónica tais como DEAE ou mono Q a pressão baixa, média ou alta, por exemplo TSK-DEAE-650S, equlibrada com um tampão de baixa força iónica, de preferência 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA ou inferior. O componente de BPM foi eluido com um gradiente salino, por exemplo variando de 0-0,3 M de NaCl. Para estabilizar a actividade do componente de BPM, as fracções contendo este componente receberam um agente redutor, por exemplo DTT ou β-mercaptoetanol. Antes do ensaio da actividade o agente redutor é sempre removido, por exemplo por boa lavagem do componente de BPM ligado a uma resina de DEAE, por filtração em gel, ou por diálise das fracções eluidas contra um tampão de baixa força iónica

como por exemplo acetato de sódio 1-40 mM. O componente de BPM foi ainda purificado utilizando resinas de permuta iónica como por exemplo carboximetil (CM-)-Sepharose equilibrada com um tampão de baixa força iónica com um valor de pH inferior a 5,5 (por exemplo acetato de sódio 20 mM a pH 4,9 contendo 1 mM de EDTA). 0 componente de BPM foi eluido com um gradiente por exemplo acetato de sódio 0-600 mM. As fracções contendo o polipéptido de BPM eluiam entre

250 e 450 mM de acetato.

A pureza do componente de APM e BPM foi examinada por SDS-PAGE. À sequenciação de aminoácidos destas bandas revelou que estes polipéptidos eram essencialmente isentos de resíduos celulares e de outras proteínas de microorganismos, tal como avaliado por SDS-PAGE seguido de sequencição de aminoácidos.

Após o ensaio de cromatografia de afinidade em Blue Sepharose CL-6B o componente de APM tem uma actividade específica na gama de 1-2 umoles de NADPH/min.mg de proteína determinada por DTNB como substrato e uma quantidade fixa de componente de BPM purificado com DEAE. Após cromatografia de CM-Sepharose componentes de BPM tem uma actividade específica de 0,3-0,4 umoles de NADP/min.mg de proteína tal como determinado com DTNB como substrato. Contudo, a medida da actividade específica é muito dependente do grau de pureza dos componentes de APM e de BPM, da altura do ensaio após a purificação, e das quantidades relativas dos componentes de APM e de BPM

adicionados à mistura reaccional. Os componentes de polipéptido muito purificados são menos estáveis do que os componentes de polipéptido parcialmente purificados.

sistema de enzima era susceptível de reduzir os dissulfuretos de baixo peso molecular como por exemplo bis-ACV, DTNB, bis-(cis-gly) e bis-(Coenzima A). Foram medidas as constantes de Michaelis Menten (K_M) para estes substratos, utilizando os componentes de APM e de BPM após cromatografia de DEAE (18 e 2.5 ug, respectivamente). Os valores de K_M eram da ordem de 125 uM para bis-ACV, 1.4 uM para DTNB, 83 uM para bis-(Coenzima A) e 800 uM para bis(cis-gly).

sistema de enzima era também susceptível de reduzir dissulfuretos de proteína como por exemplo a insulina. O valor de K_M para a insulina, com base no peso molecular da molécula nativa que contêm três dissulfuretos, é de 2,3 mM.

As sequências de aminoácidos dos componentes de APM e de BPM isolados de P. chrvsogenum foram determinadas por processos conhecidos. 0 produto de gene de APM compreende a sequência de aminoácidos:

Met-Val-His-Ser-Lys-Val-Ile-Ile-GlySer-Gly-Pro-Gly-Ala-His-Thr-Ala-Ala-IleTyr-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Gln-Pro-ValLeu-Tyr-Glu-Gly-Met-LeuOs resíduos 2-29 foram determinados por análise da sequência de aminoácidos da proteína purificada. Os dados de sequência de nucleótidos do gene de APM clonado

confirmaram as atribuições provisórias nesta sequência e aumentaram a sequência com o resíduo 1 e os resíduos 3036.

O produto de gene de BPM compreende a sequência de aminoácidos seguinte:

(Gly)-Val-Thr-Pro-Ile-Lvs-Ser-Val-Ala-GluTyr-Lys-Glu-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-(Thr)-(Gly)Pro-Val-(Vai)-(Vai)-Asp-Phe-His-Ala-Thr-(Trp)(Glu)-Gly-Pro-(Xaa)-(Lys)-(Ala)-(Ile)-(Ala)-(Pro)(Glu)—.

Alguns dos aminoácidos não podiam ser atribuídos para além de uma certa dúvida; estas atribuições provisórias são apresentadas em parênteses.

A invenção também inclui polipéptidos com diferentes sequências de aminoácidos que são homólogas aos polipéptidos de APM e de BPM de P. chrysogenum ou partes suas que revelam uma actividade comparável. A homologia é aqui definida como um resultado semelhante de pelo menos 80% quando comparado com a sequência de aminoácidos da proteína de APM ou de BPM, como determinada pelo programa BestFit do Wisconsin Sequence Analysis Software Package (versão 6,0, edição de 1989, GCG, Universidade de Wisconsin, Estados Unidos da América) utilizando o conjunto dos parâmetros de peso 3 000 e peso de comprimento de 0,100. As sequências de aminoácidos com resultados semelhantes inferiores a 85% mas superiores a 60% são designadas aqui também por semelhantes. As proteínas homólogas podem ser isoladas a partir de fontes naturais, ou podem ser obtidas por mutagénese dos genes de codificação de APM e de BPM.

A comparação da sequência de aminoácidos com sequências de aminoácidos conhecidas revelou que a sequência N-terminal de aminoácidos do polipéptido de APM é semelhante à sequência N-terminal de aminoácidos da tiorredoxina redutase de E. coli (EC 1.6.4,5) (84% de semelhança numa sobreposição de 33 aminoácidos). A sequência de APM pode conter a sequência de redoxaltamente conservada Cys-Gly-Pro-Cvs típica para tiorredoxinas e pode ser semelhante às tiorredoxinas obtidas de vários organismos (semelhança de 60% numa sobreposição de 38 aminoácidos para a tiorredoxina de E. coli. A descoberta que o componente de BPM podia ser substituído pela tiorredoxina obtida de Spirulina platensis. num ensaio em que o DTNB ou o bis-ACV eram reduzidos pela acção combinada dos componentes de APM e de BPM e NADPH, indica ainda a homologia do componente de APM com a tiorredoxina.

Assim é muito provável que o componente de alto peso molecular e o polipéptido de baixo peso molecular isolados de P. chrvsogenum possam referidos como a tiorredoxina redutase e a tiorredoxina de P. chrvsogenum. respectivamente.

Os polipéptidos ou partes deles podem ser ligados a outros compostos, como por exemplo antigénios, receptores, marcadores ou compostos semelhantes.

São também proporcionados nesta invenção os

genes que codificam os componentes de polipéptido do sistema de óxido redutase de P. chrysogenum. As sequências de aminoácidos N-terminais dos dois polipéptidos foram determinadas. Isto permite, utilizando a técnica da genética inversa a seguir definida, o isolamento de genes que codificam estes polipéptidos, e depois a determinação das sequências de nucleótidos desses genes (Miller e Ingolia, supra). Na técnica da genética inversa, são criadas sondas de oligonucleótidos com base numa sequência parcial de aminoácidos do terminal N ou dos seus fragmentos de péptido interno da enzima purificada (ver por exemplo, Maniatis e col., Molecular Cloning (2a edição) 1989). Estas sondas de oligonucleótidos podem ser usadas directamente para escrutinar bibliotecas genómicas ou de cADN para o gene de interesse. Foi descrito um exemplo dessa biblioteca, contendo fragmentos de ÀDN de P. chrysogenum no vector fago lambda EMBL-3 no documento EP 0354624.

Alternativamente, pode ser criado um conjunto de sondas de oligonucleótidos sintéticos para serem utilizadas numa reacção em cadeia de polimerase (PCR) utilizando ADN, cADN ou mARN genómicos dos microorganismos de interesse para criar um maior fragmento de sonda.

Em outra técnica podem ser utilizados anticorpos criados para a enzima purificada, ou partes dela, para escrutinar as bibliotecas de expressão para o gene do interesse. Logo que os genes, ou partes do genes que codificam os polipéptidos de APM e de BPM sejam clonados,

estes genes podem ser utilizados como sondas para isolar os genes correspondentes de outros organismos por hibridização heteróloga. Estas sondas podem ser fragmentos de restrição

derivados de ADN isolados de, por exemplo, P.	cftrvsocrenum.
Alternativamente,	podem	ser obtidas	sondas	de
oligonucleótidos	sintéticos	compreendendo	por	exemplo	uma
região das sequências mais	conservadas	no	gene.	Estas

sequências de oligonucleótidos podem ser utilizadas para o escrutínio de bibliotecas genómicas ou de cADN. Por outro lado, podem ser obtidos oligonucleótidos que podem ser utilizados para isolar o gene de interesse, ou parte dele, do ADN, cADN ou mARN genómicos do microorganismo de escolha utilizando a técnica de PCR.

Numa outra técnica ainda, podem ser utilizadas sequências clonadas dos genes que codificam os polipéptidos de APM e de BPM para criar mutantes de óxido redutase por rompimento dos genes que codificam os polipéptidos autênticos de APM e de BPM por transformação com derivados de mutantes clonados destes genes. O mutante de tiorredoxina ou tiorredoxina redutase resultante pode posteriormente ser utilizado como hospedeiro para a selecçâo e o isolamento dos fragmentos de ADN do mesmo ou de outro orgnismo que são suspceptíveis de restaurar a actividade da óxido redutase.

Podem ser modificadas sondas por conjugação com uma variedade de marcadores que permitem a detecção da formação de duplex entre a sonda e o seu alvo complementar.

Os marcadores incluem os isótopos radioactivos. ligantes, por exemplo, biotina, enzimas, substâncias fluorescentes e produtos semelhantes. Foi descrita na literatura uma grande variedade de procedimentos para a marcação de sondas e detecção de duplexes formados entre as sondas e as suas sequências de hibridização alvo. Ver por exemplo Berger e Kimel, editores Guide to Molecular Cloning Techniaues (1987), Academic Press Inc., San Diego, CA. Podem também ser ligadas sequências a várias outras sequências de ácidos nucleicos. Entre estas outras sequências de ácidos nucleicos encontram-se vectores como por exemplo plasmídios, cosmídios, fagos, e semelhantes. Por ligação da sequência de sonda a uma sequência de vector, podem ser convenientemente ligadas, expandidas, armazenadas e modificadas as sondas.

Podem ser criados pontos de restrição convenientes nas secruências de ADN crue codificam o sistema | de enzima; quando possível os pontos de restrição deixam a sequência de aminoácidos do produto de expressão inalterada. Em alguns casos, a incorporação de novos pontos de restrição pode conduzir a uma sequência alterada de aminoácidos. Contudo, é muito desejável que a estrutura tri-dimensional dos polipéptidos de APM e de BPM seja retida, em particular as partes da estrutura do sistema de enzima que podem ser responsáveis pela actividade da enzima.

A invenção também inclui genes que compreendem

com sequências diferentes de nucleótidos por exemplo mutações conservativas, em que a sequência codifica a mesma sequência de aminoácidos, mas pode ter até 30% de bases diferente, mais habitualmente não mais de que 10% de bases diferentes, ou mutações que não são conservativas, onde apenas cerca de de 10%, mais preferivelmente apenas cerca de 5%, e de preferência não mais do que 1% dos aminoácidos são substituídos ou eliminados, e existem menos do que 5% de aminoácidos inseridos, em que a percentagem é baseada no número de aminoácidos de ocorrência natural. Os referidos genes podem também ser isolados por hibridização.

Logo que tenha sido isolada uma sequência de ADN que codifica o sistema de enzima, a sequência de ADN pode ser em seguida utilizada para expressão num hospedeiro conveniente, quer procariótico quer eucariótico. Para a expressão da sequência, é proporcionado quando necessário um codão inicial de metionina. Ouando a sequência de ADN que codifica o sistema de enzima tem de ser expressa num hospedeiro que reconhece com eficiência as regiões autênticas de regulação de transcrição e de translacção dos genes que codificam o sistema de enzima nativo, podem ser introduzidos todos os genes com as suas regiões autênticas 5' e 3'-regulatórias no hospedeiro sem outra manipulação.

Ouando a sequência de ADN que codifica um sistema de enzima tem de ser expressa numa célula hospedeiro que não reconhece os sinais autênticos de expressão ou em que o gene nativo que codifica o sistema de

enzima não está a ser utilizado, pode ser necessária uma manipulação adicional. À região 5' de não codificação a montante do quadro de leitura aberto (ORF) pode ser removida por digestão de exonuclease, por exemplo digestão com Bal31. ou produtos semelhantes. Alternativamente, quando está presente um ponto conveniente de restrição perto do terminal 5' do ORF, o ADN pode ser restringido e utilizado um adaptador para o ORF a uma sequência de ADN que proporciona a expressão do ORF na célula hospedeiro, em que o adaptador proporciona os nucleótidos perdidos do ORF. De forma semelhante, as regiões autênticas de regulação 3'transcricionais podem ser substituídas pelas regiões de regulação 3'-trascricionais no hospedeiro. Além disso, a expressão em outros hospedeiros, especialmente procarióticos, pode necessitar a redução de intrões no gene, ou a utilização de cópias de cADN do gene.

Para os genes que codificam os polipéptidos componentes do sistema de enzima, os sinais originais de expressão podem ser substituídos por sinais de expressão obtidos do mesmo ou de outro organismo, que são funcionais na célula hospedeiro, por exemplo em E. coli ou em Streptomvces. ou em fungos filamentosos tais como P. chrvsogenum. Estes promotores são de preferência expressos durante a síntese da β-lactama. Os sinais de expressão são aqui definidos como os sinais necessários e suficientes para a eficaz iniciação e terminação da transcrição e a eficaz iniciação e terminação da translacção.

Os genes podem ser introduzidos na célula hospedeira de acordo com técnicas conhecidas, como por exemplo transformação, trasfecção por contacto das células com um vírus, microinjecção dos genes nas células e técnicas semelhantes. Os genes podem ser incorporados em construções, quer juntos numa construção, quer cada um numa construção separada. Os genes podem ser introduzidos em estirpes de P. chrvsogenum ou outros organismos produtores de β-lactama, de preferência estirpes de produção, por (co)transformação com um marcador de selecção adequado. E óbvio para os especialistas que a selecção dos transformantes pode ser conseguida utilizando diferentes marcadores de selecção, homólogos ou heterólogos para o hospedeiro, na presença ou na ausência de sequências de vector, fisicamente ligados ou não ao ADN não seleccionável. Em particular, os hospedeiros mocrobianos são escolhidos no grupo consistindo em fungos, de preferência Penicillium chrvsogenum. Acremonium chrvsogenum ou Aspergillus nidulans. ou no grupo de Streptomyces.

Na utilização para a produção de β-lactama o sistema isolado de enzima de P. chrvsogenum encontra várias aplicações. A seguir aos componentes de polipéptido do sistema de P. chrysogenum. também pode ser utilizada a tiorredoxina e a tiorredoxina redutase obtidas de outros organismos. Isto é exemplificado pela descoberta que o componente de BPM pode ser substituído pela tiorredoxina obtida de Spirulina plastensis. num ensaio em que é

reduzido o DTNB ou o bis-ÀCV pela acção combinada do componente de APM e de BPM e NADPH. A tiorredoxina é definida como uma proteína que possui dois resíduos activos de redox e de meia cistina num centro activo exposto, possuindo a sequência de aminoácidos seguinte:

-Cys-Glv-Pro-Cys-, e que é susceptível de reduzir, para além de outros compostos contendo ligações de dissulfureto, ligações de dissulfureto em proteínas (A. Holmgren, Ann. Rev. Biochem. (1985) 54:237-271). Os componentes de polipéptido não têm de ser urifiçados completamente, porque para a maior parte das aplicações podem ser utilizados componentes de polipéptido parcialmente purificados.

sistema de enzima pode substituir DTT. 0 DTT é utilizado para proporcionar condições redutoras, por exemplo em processos em que são utilizadas enzimas isoladas para produzir compostos de B-lactama. A actividade da maior parte das enzimas de B-lactama biossintética é estimulada pela presença de DTT. O tripéptido ACV, que é o substrato de IPNS, tem de estar também num estado reduzido. Contudo, na presença de DTT de ferro ele desactivará muitas enzimas (Kim e col., L. Biol. Chem (1985) 260:15394-15397). O ferro é um co-factor essencial para as enzimas envolvidas na síntese de β-lactama, como por exemplo a catálise do fecho do anel, expansão de anel e hidroxilação. Foi exemplificado que o sistema de tiorredoxina pode substituir o DTT para proporcionar condições redutoras para a biossíntese da Blactama. Na presença do sistema de óxido redutase que se

pode obter de P. chrysogenum e do sistema de tiorredoxina já conhecido, foi produzida a isopenicilina N de dissulfureto de ACV em condições não redutoras.

o componente de BPM de todos esses sistemas de enzimas pode ser utilizado para aumentar a actividade das enzimas biossintéticas de B-lactama que são dependentes do efeito estimulante de DTT. Isto foi exemplificado para os ÃCVS. A adição de tiorredoxina e de DTT á enzima resultava numa actividade superior do que a adição de apenas DTT. A tiorredoxina redutase é definida como uma proteína que é susceptível de reduzir a tiorredoxina na presença de um dador de electrões adequado.

Assim um processo para reduzir compostos de dissulfureto e compostos envolvidos na produção de derivados de B-lactama in vitro foi proporcionado por contacto, na presença de um dador de eletrões, dos compostos que se pretendem reduzir com uma composição que compreende o sistema ou componentes de óxido redutase, em que o referido sistema de enzima é obtido de P. chrysogenum e tem como componentes um polipéptido de alto peso molecular (APM) com peso molecular de cerca de 36 kDa e um polipéptido de baixo peso molecular (BPM) com um peso molecular de cerca de 12 kDa, e que é susceptível de reduzir compostos de dissulfureto, ou com polipéptido de BPM com a presença de um agente redutor tal como por exemplo DTT, ou em que o referido sistema ou componentes de enzima são um sistema de tiorredoxina, ou tiorredoxina e

tiorredoxina redutase, que se pode obter de qualquer organismo.

Durante a utilização, os genes que codificam os componentes de polipéptido do sistema de óxido redutase de P. chrvsogenum encontram várias aplicações. Em vez de isolar o sistema de enzima de fontes naturais, os componentes de APM e/ou de BPM podem ser preparados a partir de microroganismos modificados por técnicas recombinantes. Isto pode ser conseguido preparando uma construção de ADN compreendendo um ou mais genes gue codificam o componente de polipéptido de APM e/ou de BPM do sistema de óxido redutase em que opcionalmente um ou ambos os sinais de expressão foram substituídos por sinais de expressão obtidos do mesmo ou de outro organismo, tal como acima descrito; e transformando um organismo hopedeiro com estas construções de ADN. 0 sistema de enzima ou os seus componentes podem ser isolados de hospedeiros transformados essencialmente de acordo com os processo acima proporcionados.

Utilizando genes clonados de APM e de BPM ou genes clonados que codificam a tiorredoxina e a tiorredoxina redutase, podem ser criados e sintetizados enzimas modificados. 0 ADN da invenção pode também ser modificado por técnicas conhecidas de mutagénese dirigida a sítios para se obter o ADN em que foram introduzidas mutações. eliminações e inserções específicas. Estas modificações resultarão em características modificadas das

enzimas como por exemplo alteração no pH ou temperatura óptimos, uma alteração na estabilidade ou uma alteração na especificidade de substrato. Esta última pode por exemplo resultar numa enzima com uma maior afinidade para outros componentes do sistema de óxido redutase, para enzimas biossiténticas de β-lactama ou para compostos de dissulfureto, por exemplo ACV envolvido na produção de compostos de β-lactama, ou uma combinação deles. As estirpes de hospedeiro, transformadas com genes gue codificam estas enzimas modificadas podem ser capazes de produzir antibióticos de β-lactama a níveis superiores quando comparados com estirpes não transformadas.

Os genes que codificam os polipéptidos componentes de todos os sistemas de tiorredoxina que incluem o sistema de óxido redutase de P. chrysogenum podem ser utilizados para aumentar a produção de compostos de βlactama num hospedeiro microbiano. As construções de ADN preparadas da forma descrita nesta invenção são utilizadas para transformar microorganismos que produzem os referidos compostos. Os microorganismos preferidos para a transformação são os produtores de β-lactama eucarióticos, como por exemplo as espécies de P. chrysogenum. A. chrysogenum ou Aspergillu, e os produtores procarióticos de β-lactama como por exemplo as espécies de Flavobacterium ou Streptomyc.es.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum pormenor como ilustração e exemplo para objectivos

de clareza e compreensão, será aparente para o especialista, tendo em consideração os ensinamentos desta invenção, que podem ser feitas algumas alterações e modificações sem o desvio do espírito e do âmbito das reividicações anexas.

Os seguintes exemplos não limitativos ilustrarão melhor a invenção.

Todos os documentos citados são aqui incorporados como referência.

PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Demonstração da actividade redutora de DTNB por combinação de fracções de alto e de baixo peso molecular de extractos de Penícillium chrvsogenum

Cultura:

Foi preparado arroz contendo esporos de P. chrvsogenum estirpe NRRL 1951 da forma descrita por Lein e col. (Lein (1986) em Vanek e Hostalek (ed.) Buttersworth, Boston, pp. 105-139, Overproduction of microbial metabolites: strain improvement and process control strategies). Foi inoculado caldo de soja tríptico (TSB) com 1% de amido como fonte de carbono com 10⁵ conidíos por ml. Após cultura durante 24 a 48 h a 30'C foram utilizados 5 ml desta cultura para inocular 500 ml de meio TSB-amido. Passadas 24 h, foram recolhidos os micélios por filtração e o bolo de filtro resultante foi lavado 2 vezes com solução a 0,9% de NaCl. Foram mantidos congelados a -20C até

utilização os micélios embalados.

Ensaio da actividade da redutase de DTNB

Foi medida a actividade da redutase de DTNB da forma seguinte: A mistura reacional continha (concentração final) 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA, 0,02 mM de DTNB, 0,2 mM de NADPH. Foram adicionadas preparações de enzima até um volume final de 1 ml. A reacção foi seguida por medida da absorvância a 412 nm a 25 ”C durante os três primeiros minutos ou mais se necessário. Foram incluídas experiências de controlo em que as preparações de enzima ou

NADPH foram omitidas.

Preparação das fraccões de células:

Foram suspensos 10 g (peso líquido) de micélios em tampão de 0,05 M de Tris-HCl a pH 8,0, 1 mM de EDTA (tampão-TE) para um volume total de 50 ml e eles foram rompidos num desmembrador de Braun (Braun, Melsungen, RFÀ) utilizando pérolas de vidro de Ballotini (Sigma tipo V, diâmetro 450-500 um) durante períodos de 30 s em intervalos de 15 s com refrigeração. A suspensão homogeneizada foi em seguida tornada transparente fazendo-a passar sobre um filtro de lã de vidro.

Esta fase e as seguintes foram efectuadas a 4“C. Ao extracto isento de células, foi adicionado lentamente sulfato de estreptomicina a 10% (p/v) em tampão TE lentamente até uma concentração final de 1%. Após agitação durante 45 min a frio, o ácido nucleico precipitado foi removido por centrifugação a 10 000 x g durante 10 min. O

sobrenadante foi fraccionado por precipitação de sulfato de amónio mantendo o pH da solução a 8,0 durante as adições de sulfato de amónio. A fracção precipitante entre 50 e 80% de saturação foi dissolvida num pequeno volume de tampão TE. A fracção dissolvida foi aplicada a uma coluna de filtração de gel AcA54 (2,6 x 35 cm) equilibrada com tampão TE. A coluna foi eluida com tampão TE a um caudal de 0,5 ml/min e foram recolhidas fracções de 3 ml.

A actividade de DTNB redutase estava presente na pastilha de sulfato de amónio que precipitava entre 50 e 80% da saturação, mas estava ausente na fracção separada da coluna de filtração de gel AcA54. A actividade de DTNB redutase foi recuperada por adição de fracções particulares contendo o material de BPM (<15 kDa) para fracções particulares contendo o material de APM (>15 kDa). Verificou-se que a actividade da DTNB redutase era dependente da presença de NADPH. Pode concluir-se a partir destas experiências que a redução de DTNB por extractos isentos de células de P. chrysoqenum é consequida por pelo menos dois componentes de polipéptido (componentes de APM e de BPM) e um dador de electrões.

Exemplo 2

Purificação dos componentes de APM e BPM do sistema de óxido redutase envolvidos na redução de DTNB

Ensaio da actividade de DTNB redutase;

As condições de ensaio para a purificação do componente de APM foram as descritas no Exemplo 1. A mis

tura reaccional foi preparada da forma seguinte: para a purificação do componente de APM, foram incluídas fracções de 50-100 ul de filtração de gel AcA54 contendo o material de BPM (<15 kDa). Para a purificação do componente de BPM, foram incluídas na mistura fracções de 25-50 ul filtradas em gel contendo o material de APM (>15 kDa).

Purificação do componente de APM:

As fracções de filtracção de gel que continham o material de APM e que eram activas no ensaio de DTNB foram combinadas e aplicadas a uma coluna de TSK-DEAE-650 (Merck) (10 ml de volume de leito) que tinha sido previamente equilibrada com o tampão TE. A coluna foi eluida com um gradiente linear de 0 a 0,5 M de NaCl. As fracções que eluiram entre 0,25 e 0,32 M de NaCl eram activas no ensaio de DTNB redutase. Estas fracções foram posteriormente carregadas numa coluna de Blue Sepharose CL-6B. As fracções contendo APM foram eluidas com NADPH 5 mM num tampão de Tris-HCl 20 mM a um valor de pH a 7,25 contendo EDTA 1 mM . Este procedimento resultou numa fracção contendo uma banda de polipéptido com uma massa molecular aparente de 36 kDa determinada por SDS-PAGE (Laemmli, Nature (1970) 227:680685).

Purificação do componente de BPM:

As fracções filtradas em gel que continham o material de BPM e que eram activas no ensaio de DTNB redutase foram combinadas, e incubadas com DTT 2 mM e aplicadas a uma coluna de TSK-DEAE-650S) (Merck) com 10 ml

de volume de leito, que tinha sido previamente equilibrada com um tampão de TE 10 mM . A coluna foi eluida com um qradiente linear de 0-0,3 M de NaCl. As fracções eluindo entre 0,1 e 0,15 M de NaCl eram activas no ensaio de DTNB redutase. Estas fracções foram incubadas com DTT 2 mM durante 30 min. Após a diálise contra um tampão de acetato de sódio 20 mM pH 4,3 contendo 1 mM de EDTA, as fracções combinadas foram carregadas em CM-Sepharose, 10 ml de volume de leito, equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi eluida com um gradiente linear de acetato de sódio 40-600 mM no mesmo tampão. As fracções eluindo entre 300-400 mM de tampão de acetato eram activas no ensaio de DTNB redutase. Este procedimento resultou numa fracção contendo uma banda de polipéptido com uma massa molecular aparente de 12 kDa determinada por SDS-PAGE.

Exemplo 3.

Determinação das sequências de aminoácidos dos componentes purificados de APM e de BPM

O componente de BPM purificado foi aplicado a um gel de SDS-PAGE a 17%, o componente de APM purificado a um qel de SDS-PAA a 12%. Após processamento os géis, os polipéptidos foram electroforeticamente transferidos para uma membrana de polidifluoreto de vinilideno. A membrana foi revelada com Azul Brilhante de Coomassie R250 a 0,1% em 50% de metanol, 10% de ácido acético em água e posteriormente limpa. As bandas de polipéptido correspondentes ao componente de APM e de BPM foram

analisadas para uma sequenciação de aminoácidos N-terminais utilizando um separador de fase gasosa (Applied Biosystems modelo 470 a).

Foi determinada a seguinte sequência de aminoá eidos para o polipéptido de APM:

(Vai)-(His)-Ser-Lys-Val-Val-Ile-Ile-Gly-SerGly-Pro-Gly-Ala-His-Thr-Ala-Àla-Ile-TyrLeu-Ser-(Arg)-Ala-Glu-Leu-Gln-Pro.

As atribuições propostas são dadas entre parenteses.

Foi determinada a seguinte sequência de aminoá eidos para o polipéptido de BPM:

(Gly)-Val-Thr-Pro-Ile-Lys-Ser-Val-Ala-GluTyr-Lys-Glu-Lvs-Val-Thr-Asp-Ala-(Thr)-(Gly)Pro-Val-(Vai)-(Vai)-Asp-Phe-His-Ala-Thr-(Trp)(Glu)-Gly-Pro-(Xaa)-(Lys)-(Ala)-file)-(Ala)-(Pro)(Glu)-.

As atribuições propostas são dadas entre parenteses.

A comparação destas sequências de aminoácidos com sequências de aminoácidos e sequências de nucleótidos conhecidas pode ser efectuada por uma pesquisa de bibliotecas nas bases de dados de proteínas da National Biomedical Research Foundation (actualizadas a Março de 1990) e Swiss Protein Library (actualizada a Abril 1990). e bases de dados de sequências de nucleótidos da European Molecular Biology Laboratory (actualizada a Maio de 1990), utilizando, respectivamente, os programas FastP e TFastA descritos por Lipman e Pearson (Science (1985) 227: 14351441) e Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1988) 85: 2444-2448). Pode ser feita uma comparação mais

detalhada da semelhança entre duas sequências pelo programa Bestfit que utiliza um algoritmo descrito por Smith e Waterman fAdvances in Applied Mathematics. 1981, 2:482489). Os programas FastP, TFastÀ e Bestfit utilizados são parte de GCG Sequence Analvsis Software Package (versão 6,0, edição de 1989, GCG, Universidade de Wisconsin, Estados Unidos da América). A pesquisa e a comparação revelaram que a sequência de APM é semelhante à sequência de aminoácidos N-terminais da tiorredoxina redutase de E.

coli (EC 1.6.4.5) (84% de semelhança numa sequência de 27 sob reposições de aminoácidos).

Não é encontrada semelhança significativa para a sequência 2-16 de BPM nas bibliotecas acima indicadas. Assim, o sistema de óxido redutase que possui as sequências e características acima mencionadas é um sistema novo.

A sequência estendida de BPM 16-38 é uma tentativa em várias posições. Contudo, foi reconhecido que os resíduos 31-34 formam uma sequência de consenso putativa Cys-Gly-Pro-Cys, tipicamente envolvida em reacções redox. Uma pesquisa de biblioteca e comparação efectuada com a sequência de BPM 2-38 confirmou esta noção revelando a semelhança desta sequência com a tiorredoxina de diferentes espécies (por exemplo 60% de semelhança numa sobreposição de 38 aminoácidos com a tiorredoxina de E. coli).

Exemplo 4

Demonstração da redução de bis-ACV por accão combinada do componente de APM e de BPM

Ensaio de bis-ACV redutase:

A mistura reaccional continha 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA, 0,5 mg de bis-ACV (Bachem

Feinchemikalien AG, Bubendorf, Suíça), 0,1 mM de NADPH e componentes purificados de APM e de BPM. O volume de ensaio era de 1 ml e a incubação foi efectuada a 30C. A reacção foi seguida a 340 nm.

Foram incluídas experiências de controlo em gue o componente de APM ou de BPM, ou o bis-ACV era omitido. Embora não se tivesse encontrado actividade em qualquer das experiências de controlo, foi observada uma redução da absorvância a 340 nm, devida a um consumo de NADPH, em misturas reaccionais que continham todos os compostos acima referidos.

Exemplo 5

Demonstração da redução de bis-ACV e DTNB pela acção combinada do componente de APM obtido de P. chrvsogenum e tior redoxina obtida de Spirulina platensis

Foi efectuado o ensaio de DTNB redutase da forma descrita no Exemplo 2, com a excepção de ambos os componentes de APM e de BPM utilizados serem purificados por cromatografia de DEÀE. A quantidade de proteína presente na mistura reaccional era de 0,264 mg do componente de APM e 20 ug do componente de BPM ou 10 ug de tiorredoxina obtida de Spirulina platensis (sigma, St. Louis, Estados Unidos da América). Nesta experiência foi medido o aumento da absorvância a 412 nm. Passados 15

minutos de incubação o aumento da absorvância era de 0,225 para a combinação de APM e de BPM e 0,080 para a combinação de APM e tiorredoxina. As experiências de controlo em que o componente de APM ou de BPM foram omitidos, ou em que foi omitido o componente de APM ou a tiorredoxina, não revelaram um aumento da absorvância.

A redução de bis-ACV pela acção combinada do composto de APM de P. chrysogenum e tiorredoxina de Spirulina platensis foi determinada da forma seguinte. A mistura reaccional continha 80 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,5 de mM de EDTA, 0,03 mg/ml de bis-ACV e 0,1 mM de NADPH. As quantidades de proteínas adicionadas são apresentadas na Tabela 1. Os componentes de APM e de BPM foram purificados por cromatografia de DEAE. O volume de ensaio era de 0,5 ml e a incubação foi feita à temperatura ambiente. A reacção foi seguida a 340 nm e a actividade foi expressa em umoles de NADPH oxidada por minuto.

Tabela 1

/-	APM (ug)	j BPM (ug) r	j tiorredoxina (ug) j ! I	umol de NADP/minuto	-\ ! 1
I	250	! ío	t ~ ~ τι 0 1	2,25	1 1
	250	1 5	\| o i	1,13	1
	60	1 o	! 4 I	1,93	i
	250	! o	1 2 1	0,64	!
	250	1 o	Í 1 !	0,32	1
1	125	1 o	! 0 1	0,32	i
1	0	1 10	• 0 I	0,16	i
1	0	ί 0	! 4 I	0,16	i
\-					-/

Os resultados mostram que a tiorredoxina de

Spirulina platensis tinha uma afinidade para o substrato de bis-ACV. A actividade era claramente dependente da concentração da tiorredoxina utilizada. Além disso, os resultados revelam que o componente de APM de P. chrysogenum tem afinidade para a tiorredoxina obtida de Spirulina platensis.

Exemplo 6

Demonstração da produção de isopenicilina N a partir de bis-ACV em condições não redutoras

A síntese enzimática de isopenicilina N é dependente da forma de tiol de ACV. Neste exemplo a síntese da isopenicilina N por IPNS foi efectuada com bis-ACV como substrato. As condições de ensaio para a produção da isopenicilina N foram as seguintes. A mistura reaccional continha 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1,42 mM de bis-ACV, 3,84 mM de Ascorbato, 0,8 mM de Fe²⁺, 0,7 mM de EDTA, 14,28 mM de NADPH, 16,8 ug de IPNS e os componentes de APM e de BPM como necessário. As preparações de enzima foram adicionadas até um volume final de 70 ul. 0 IPNS era uma preparação obtida de uma estirpe E. coli expressando o gene de IPNS de Flavobacterium sp. 12.154. O gene de IPNS foi clonado num vector de expressão (F.M. Ausubel e col., (ed) Current Protocols in Molecular Biology (1987-1988), John Wiley and Son, Nova Iorque). A E. coli MC1022 foi transformada com o vector resultante pDS510.

Foi cultivada a E. coli MC1022 contendo pDS510 em meio LB + 50 ug/ml de canamicina durante a noite. As

células foram diluídas 100 vezes em LB + 50 ug/ml de canamicina + 0,1 mM de isopropiltio galactósido (IPTG), e cultivadas em frascos de 2 litros. As células foram recolhidas passadas 6 horas ; 0 valor de OD₆₀₀ era aproximadamente 2. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5. As células foram tratadas por sonificação no mesmo tampão Tris contendo 1 mM de DTT. O extracto bruto foi tratado com 1% de sulfato de estreptomicína em ácido nucleico precipitado. Foi recolhida uma fracção de sulfato de amónio que precipitava entre 40-80% da saturação. A amostra foi processada numa coluna AcA44 (55 cm x 2,6 cm), a 0,33 ml/min, 12 min. A actividade antibiótica nas fracções foi avaliada utilizando o bioensaio convencional utilizando o Micrococcus luteus como oerganismo de ensaio. Foi construída uma curva convencional de diferentes concentrações de cefalosporina C, e assim os números exprimem a actividade em relação á da cefalosporina C. As fracções activas foram combinadas e carregadas numa coluna de DEAE-Sepharose 1,6 cm x 10 cm. As proteínas foram eluidas com 150 ml de gradiente de 0 a 400 mM de NaCl. 0 caudal era de 0,33 ml/min. As fracções foram recolhidas em cada 7,5 min. Foram ensaiadas as fracções e aquelas que revelavam uma elevada actividade foram combinadas. Esta preparação de IPNS foi utilizada para outras experiências.

Os componentes de APM e de BPM foram parcialmente purificados por processos incluindo a

cromatografia de DEAE da forma descrita no Exemplo 2.

Foi determinada a formação da isopenicilina N de bis-ACV na presença do sistema de óxido redutase de P. chrysogenum . Foi determinada a actividade anti-biótica da forma acima descrita. Foram incluídas experiências de controlo em gue o componente de APM ou de BPM ou o NADPH foram omitidos. Os resultados obtidos numa experiência típica foram os seguintes:

Produção de isopenicilina N de bis-ACV em condições não redutoras

APM BPM	NADPH	Zona de inib.	Antibiótico
ug/reacção		mm	ug/ml

6,6	8	-	ND	ND
39,6	8	-	ND	ND
145.2	11	—	ND	ND
—	8	+	ND	ND
—	11	+	ND	ND
6,6	—	+	ND	ND
39,8	-	+	ND	ND
105,6	-	+	ND	ND
145,2	—	+	ND	ND
6,6	8	+	7	38
19,8	8	+	12	72
39,6	8	+	12	72
105,6	8	+	ND	ND
145,2	11	+	ND	ND

ND = não detectado

Não foi detectada a produção do antibiótico em qualquer das experiências de controlo. Quando ambos os componentes de APM e de BPM e NADPH estavam presentes foi detectada actividade antibiótica. A síntese da

isopenicilina N parece ser inibida por elevadas concentrações do componente de ÀPM que podem ser devidas a impurezas na preparação.

Este exemplo demonstra que o sistema de óxido redutase de P. chrvsogenum proporciona o ambiente redutor necessário para a produção da isopenicilina N de bis-ACV por IPNS.

Exemplo 7

Demonstração da actividade potenciada de ACVS por contacto com o componente de BPM Purificação de ACVS:

Foi purificado o ACVS de Acremonium chrvsogenum CIO (ATCC 48272) essencialmente da forma descrita por Baldwin e col. (J. Antibiotic (1991) 44:241-248).

precipitado de sulfato de amónio foi dissolvi do e aplicado a uma coluna de filtração em gel (Ultroqel AcA34). 0 ensaio da actividade de ACVS foi efectuado da forma descrita por Van Liempt e col. (J. Biol. Chem. (1989) 264:3680-3684). As fracções que revelavam uma alta actividade para ACVS foram colhidas (75-85 ug de proteína/ml). A composição revela uma pureza de 80% para ACVS determinada por SDS-PAGE e revelação com o Azul

Brilhante de Comassie R250. Foi removido o DTE fazendo passar a enzima através de uma coluna PD10 imediatamente antes da utilização em outras experiências.

Purificação do componente de BPM:

componente de BPM foi obtido de P. chrvsogenum

estirpe Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089). O componente de BPM foi purificado da forma descrita no Exemplo 2. As fracções obtidas após cromatografia de DEAE gue eram activas no ensaio de DTNB, foram utilizadas para outras experiências. Determinação da actividade de ACVS na presença do componente DTT e de BPM:

A actividade de ACVS de uma mistura reaccional contendo ACVS e DTT recente foi comparada com a actividade de uma mistura reaccional contendo ACVS, DTT recente e o componente de BPM. Como controlo para a actividade de ACVS foi omitido o ATP da mistura reaccional. Para compensar as menores concentrações de proteínas da mistura reaccional foi adicionado albumina de soro de bovino (BSA).

A mistura reaccional continha 150 ul da preparação de ACVS. Foi adicionado DTT até uma concentração final de 1,7 mM. Foi adicionado opcionalmente ATP até uma concentração final de 5 mM. Foram adicionados 25 ul de uma solução 0,5 mg/ml de BSA ou 12,5 ul da mesma solução em conjunto com 12,5 ul de uma preparação do componente de BPM a 1,5 mg/ml. A mistura reaccional foi deixada em repouso durante 10 min à temperatura ambiente. Foi iniciada a reacção por adição de 50 ul de uma mistura contendo ácido L-a-aminoadipico (concentração final 1,3 mM), L-cisteína (1,3 mM), MgCl₂ (25 mM), Tris-HCl (350 mM) pH 7,5, EDTA (0,1 mM), glicerol (9% p/p) e 0,25 uC L-[U-¹⁴C]valina (3 uM). Deixou-se prosseguir a reacção durante 30 min a 30~C. Parou-se a reacção pela adição de 250 ul de uma mistura de

paragem (80 uM de ACV, 0,3 mM de DTT, 0,5 de L-valina e 10% de ácido tricloroacético (TECA)). Após separação da valina marcada por passagem através de Por a pak Q (Waters Associated Inc. Milford, MA), os valores de dpm abaixo indicados correspondem ao ACV produzido durante a incubação.

Os resultados obtidos são apresentados na Tabela

Tabela 2

ATP	DTT	BPM I	dpm
—	-	T - 1	180
+	-	1	198
+	+	- !	278
+	+	+ !	509

Experiências semelhantes com o componente de BPM derivado de uma filtração de gel através de Ultrogel AcA54 não contendo sal revelaram um efeito ainda mais forte na actividade de ACVS (2,3 vezes de estimulação). Assim o componente de BPM estimula a actividade de ACVS.

Exemplo 8

Isolamento do gene que codifica o polipéptido de APM

Com base na sequência de aminoácidos N terminal do polipéptido de APM foi sintetizada uma sonda de oligonucleótidos de 29-meros com a seguinte sequência mista de nucleotidos:

5'-GGA CGI GGA GCI CAC ACI GCI GCI ATC GC-3'

C C G T

T T

na qual A é desoxiadenilo, G é desoxiguanilo, C é desoxicitidilo, T é desoxitimidilo e I desoxiinositilo.

A razão para a concepção de sondas contendo desoxiinositilo é dupla: para expandir o número de sequências na sonda para englobar todas as utilizações de codão possíveis, e para restringir o número de sequências diferentes na mistura para um número razoável. 0 próprio desoxiinositilo é considerado como sendo essencialmente neutro nos seus efeitos da formação de híbridos de ADN.

As técnicas e procedimentos utilizados no processo seguinte de isolamento do gene de APM são bem conhe cidas e foram adequadamente descritas por Maniatis e col. f supra).

A sonda de oligonucleótido de APM foi marcada com gama-[²²P]-ATP e T4 polinucleótido quinase. A sonda marcada foi utilizada para escrutinar uma biblioteca genómica de P. chrvsogenum. formada num vector lambda fago EMBL-3. Foi efectuada a hibridização de placas em aproximadamente 10⁴ placas em filtros de nitrocelulose. A hibridização foi efectuada a 42”C numa solução convencional de hibridização contendo 15% de formamida. Os filtros foram lavados com 1-2 x SSC (1 x SSC é: 0,15 M de cloreto de sódio/ 15 mM de citrato de sódio) a 50-60“C. Nestas experiências foram encontradas oito placas com resposta positiva. Cinco delas foram escolhidas para um segundo escrutínio com a mesma sonda de HPM. Todos os cinco isolados de fago davam uma resposta claramente positiva.

Foram tomadas placas de resposta bem separadas para outra caracterização. As preparações de ADN a pequena escala e de fagos recombinantes foram preparadas para cada isolado.

Os ADN purificados foram digeridos com enzimas de restrição e, após electroforese em gel de agarose, foram preparadas revelações de Southern de acordo com procedimentos bem conhecidos (Maniatis e col., 1989, supra). A hibridização das revelações de Southern com a sonda de APM revelou, para todos os cinco fagos lambda, uma hibridização positiva da sonda para um único fragmento de restrição. Foram isolados fragmentos de restrição Sall com o tamanho de 4,7 quilobases (kb), 8,0 kb e 6,2 kb derivados de fagos lambda 1, 4 e 5, respectivamente, e foram subclonados em E. coli vector pUC19 (Pouwels e col.,

Cloning Vectors. a laboratorv manual, Elsevier, Amsterdão, 1987). Os plasmídios resultantes, designados por pPCH-1, pPCH-4 e pPCH-5, respectivamente, foram ainda analizados por análise de enzima de restrição e por hibridização de revelação de Southern. Todos os três plasmídios continham um fragmento de restrição EcoRV de 1,2 kb respondendo á sonda de APM. Apresenta-se na Figura 1 em mapa parcial de restrição do fragmento Sall de 4,7 kb contido em pPCH-1. Foi identificado um fragmento de restrição de HindIII-BamHI com 0,5 kb em pPCH-1, respondendo à sonda de APM. Este fragmento foi isolado de pPHC-1 e subclonado na sequência M13 do vector M13 mp 18/19 (Pouwels e col., supra). A determinação da sequência de nucleótidos do fragmento de

restrição de HindIII-BamHI foi posteriormente efectuada de acordo com o procedimento de Sanger (Maniatis e col., 1989, supra). A sequência de nucleótidos revelou um quadro de leitura aberto que codifica a sequência de aminoácidos Nterminal do gene de APM (Figura 2). A posição de terminal 5' do gene de APM, bem como a direcção da transcrição do gene é também indicada (Figura 1).

Todas as aplicações e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são indicadores do nível dos especialistas a que esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patentes são consideradas referências na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada como incorporada como referência.

Tendo sido a invenção agora totalmente descrita, será aparente para os especialistas a forma como muitas alterações e modificações podem ser efectuadas sem se afastar do espírito e do âmbito das reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO, ID, NO:.l:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 250 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE BANDAS: única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL: Penicillium chrysogenum (ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: quadro de leitura do gene de APM do sistema de óxido redutase de P. chrysogenum (B) LOCALIZAÇÃO: 59..80 e 164..250 (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ, ID, N0:l:

GCCTCGGTCT TCTCCAAGTC ATTTCCGAGC GTCGCGCGTC AATTCCAATA CCGCCAGA 58

ATG GTG CAC TCT AAA GTA GTC A | GT AAGTGGTTTT TCGAGGAGAT CGAATGATCC 112

Het Vai Hís Ser Lys Vai Vai Ij

5

GGATCACCTA GATTTCTTCG ATATCAGACT TCTAACCGTT TTCCCCCACA G | TT ATT 168 |le He

GGC TCC GGC CCT GGT GCC CAC ACT GCC GCT ATC TAT CTA TCG CGC GCA 216

Gly Ser Gly Pro Gly Ala His Thr Ala Ala lie Tyr Leu Ser Arg Ala

15 20 25

GAG CTC CAG CCA GTC CTT TAC GAG GGC ATG CTC G 250

Glu Leu Gin Pro Vai Leu Tyr Glu Gly Met Leu

35 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ, ID, NO:2:

(i) CARACTERISTICAS DA SEOUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 36 ácidos amino (B) TIPO: ácido amino (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: protaína

(vi) FONTE ORIGINAL: P. chrysogenum (ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: componente APM do sistema de óxido redutase de P. chrvsogenum (B) LOCALIZAÇÃO: 1..36 (xi) DESCRIÇÃO DA SEOUENCIA: SEO, ID, NO:2:

Met

Vai

His

Ser

Lys Vai

Ile

Gly

Ser

Gly

Pro

Gly Ala

His

1

5

10

15

Thr

Ala

Ile

Tyr Leu

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Pro Vai

Leu

20

25

30

Tyr

Glu

Met

Leu

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ, ID, NO:3:

(i) CARACTERISTICAS DA SEOUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 40 ácidos amino (B) TIPO: ácido amino (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: protaína (vi) FONTE ORIGINAL: P. chrysogenum (ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: componente BPM do sistema de óxido redutase de P. chrysogenum (B) LOCALIZAÇAO: 1..40 (C) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label= alternativas ,/nota= aal=provalvelmente Gly, aal9=provavelmente Thr, aa20=provavelmente Gly, aa23=provavelmente Vai, aa24=provavelmente Vai, aa30=provavelmente Trp, aa31=provavelmente Glu, aa34=desconhecido, aa35=provavelmente cys, aa36=provavelmente Ala, aa37=provavelmente Ile, aa38=provavelmente Ala, aa39=provavelmente Pro, aa40=provavelmente Glu (xi) DESCRIÇÃO DA SEOUENCIA: SEQ, ID, NO:3:

Xaa Vai Thr Pro Ile Lys Ser Vai Ala Glu Tyr Lys Glu Lys Vai 1 5 10 15

Thr Asp Ala Xaa Xaa Pro Vai Xaa Xaa Asp Phe His Ala Thr Xaa 20 25 30

Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO, ID, NO:4:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(À) COMPRIMENTO: 29 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético) (IX) CARACTERISTICAS:

(C) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label= alternativas /nota= par de base 3= A ou C ou T? par de base 9 A ou C ou T? par de base 15= C ou G; par de base

21=C ou T (xi) DESCRIÇÃO DA SEOUENCIA: SEO, ID, NO:4:

GGHCCIGGHG CICASACIGC IGCIATYGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ, ID, NO:5:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 4 ácidos amino (B) TIPO: ácido amino (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: protaína (ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: sequência redox típica para tioredoxinos (B) LOCALIZAÇÃO: 1..4 (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEO, ID, NO:5:

Cys Gly Pro Cys

Claims

REIVINDICAÇÕES

- l^s -

Processo para a preparação de um sistema de óxido redutase que se i pode obter a partir de P^ chrvsoaenum comnreendendo na forma isolada como primeiro e segundo componentes dois polipéptidos, um polipéptido de

alto peso molecular (APM) com um peso molecular de cerca de 36 kDa e um polipéptido de baixo peso molecular (BPM) com um peso molecular de cerca de 12 kDa e susceptível de reduzir compostos do tipo dissulfureto na presença de um veículo electrónico reduzido, caracterizado por :

cultivar-se uma cultura de microorganismos contendo células compreendendo sequências de ADN que codificam os referidos primeiro e segundo componentes cada sequência sob o controlo regulador de sinais de expressão funcionais nas referidas células, em que os referidos componentes do referido sistema de enzima são expressos, e isolar-se o referido sistema de enzima.

- 2³ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um sistema de óxido redutase susceptível de reduzir ACV na forma oxidada, por exemplo bis-ACV.

- 3^â Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um sistema de óxido redutase em que a sequência de aminoácidos N-terminal para o referido primeiro componente é igual a ou homóloga a:

Met-Val-His-Ser-Lys-Val-Val-Ile-Ile-GlvSer-Gly-Pro-Gly-Ala-His-Thr-Ala-Ala-IleTyr-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Gin-Pro-ValLeu-Tyr-Glu-Gly-Met-Leue a sequência de aminoácidos N-terminal para o referido segundo componente é igual a ou homóloga a:

(Gly)-Val-Thr-Pro-Ile-Lys-Ser-Val-Ala-GluTyr-Lys-Glu-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-(Thr)-(Gly)Pro-Val-(Vai)-(Vai)-Asp-Phe-His-AlaThr-(Trp)(Glu)-Gly-Pro-(Xaa)-(Lys)-(Ala)-(Ile)-(Ala)-(Pro)(Glu)-.

- 4^S Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por se obter um sistema de óxido redutase essencialmente isenta de resíduos celulares e de outras proteínas de microorganismos.

- 5^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por compreender:

obter-se um extracto isento de células de um microorganismo compreendendo o referido sistema, separar-se o referido extracto isento de células em fracções por passos de cromatografia e isolar-se uma fracção activa após cada um dos referidos passos de cromatografia quer do referido primeiro componente quer do referido segundo componente, incluindo os referidos passos pelo menos um passo de entre (a) cromatografia em peneiros moleculares, (b) cromatografia de permuta aniónica, (c) cromatografia de permuta catiónica, (d) cromatografia de afinidade, em que os referidos passos podem ser efectuados numa sequência qualquer e são efectuados numa fracção activa identificada de um passo anterior, e após os referidos passos (a)-(d), separar-se opcionalmente uma fracção activa dos referidos passos (a)-(d) por SDS-PAGE.

- 6^a Processo para a preparação ou aumento da produção de compostos de β-lactama num hospedeiro microbiano caracterizado por compreender:

cultivar-se uma célula hospedeiro transformada constituída por uma construção de ADN que compreende pelo menos uma sequência de ADN que codifica pelo menos uma parte funcional de um componente de polipéptido de um sistema de óxido redutase que se pode obter de P. chrysogenum e que é susceptível de reduzir compostos de dissulfureto na presença de um dador de electrões reduzido, sob o controlo de sinais de expressão obtidos do mesmo ou de outro organismo, ou uma célula hospedeiro transformada constituída por sequências de ADN que codificam o primeiro e segundo componentes ou as suas partes funcionais de um sistema de tioredoxina, cada sequência de ADN sob o controlo regulador do sinal de regulação transcricional e translaccional funcional em cada célula, identificarem-se os clones dos referidos transformantes que produzem os referidos compostos de βlactama a um nível maior do que o referido hospedeiro microbiano, e isolarem-se os referidos compostos de β-lactama.

- 7^a Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por na sequência de ADN o componente de polipéptido APM codificado compreender a sequência de aminoácidos:

Met-Val-His-Ser-Lys-Val-Val-Ile-Ile-GlySer-Gly-Pro-Gly-Ala-His-Thr-Ala-Ala-IleTyr-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Gin-Pro-ValLeu-Tyr-Glu-Gly-Met-Leu-.

- 8^a Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por na sequência de ADN o componente de polipéptido BPM codificado compreender a sequência de aminoácidos:

(Gly)-Val-Thr-Pro-Ile-Lys-Ser-Val-Ala-GluTyr-Lys-Glu-Lvs-Val-Thr-Àsp-Àla-(Thr)-(Gly)Pro-Val-(Vai)-(Vai)-Asp-Phe-His-AlaThr-(Trp)(Glu)-Gly-Pro-(Xaa)-(Lys)-(Ala)-(Ile)-(Ala)-(Pro)(Glu)-.

- 9^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 8 caracterizado por a sequência de ADN ser isolada de Penicillium chrysogenum.

- 10^a Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por na célula hospedeira transformada a referida célula ser um procariota, de preferência E. coli ou um Estreptomiceta.

- 11^a Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por na célula hospedeira transformada a referida célula ser um eucariota, de preferência Penicillium chrysogenum. Aspergillus nídulans ou Acremonium chrysogenum.

- 12^a Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por o referido hospedeiro microbiano ser um fungo, de preferência Penicillium chrysogenum. Aspergillus nídulans ou Acremonium chrysogenum. ou um Streptomvces.

- 13^a Processo para a redução de compostos de dissulfureto e de compostos envolvidos na produção in vitro de compostos de β-lactama caracterizado por compreender:

fazer-se reagir, na presença de um veículo electrónico reduzido, os compostos a reduzir com uma composição constituída por um sistema de óxido redutase, consistindo num polipéptido APM e num polipéptido BPM, e que é susceptível de reduzir compostos de dissulfureto, ou com um polipéptido BPM na presença de um agente redutor como por exemplo DTT.

- 14^a Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o ACV ser reduzido in vitro.

A requerente reivindica a prioridade do pedido europeu apresentado em 18 de Junho de 1990. sob o N².

90201598.1.

Lisboa, 18 de Junho de 1991

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE ENZIMA DE ÓXIDO REDUTASE E DE ANTIBIÓTICOS A PARTIR DO MESMO

A invenção refere-se a um processo para a preparação de um sistema de óxido redutase que se pode obter a partir de P. chrvsogenum compreendendo na forma isolada como primeiro e segundo componentes dois polipéptidos, um polipéptido de alto peso molecular (APM) com um peso molecular de cerca de 36 kDa e um polipéptido de baixo peso molecular (BPM) com um peso molecular de cerca de 12 kDa e susceptível de reduzir compostos do tipo dissulfureto na presença de um veículo electrónico reduzido, que compreende :

cultivar-se uma cultura de microorganismos contendo células compreendendo sequências de ADN que codificam os referidos primeiro e segundo componentes cada sequência sob o controlo regulador de sinais de expressão funcionais nas referidas células, em que os referidos componentes do referido sistema de enzima são expressos, e isolar-se o referido sistema de enzima.

Sal I I BamHI

ΣΖ

I

I1000 I2000 I3000 4000 t—4 ·—( ►—1 σ c >

CL

Ο ο

Ld ~ T _c Q_ ω

Figuro 1

1 ίο 20 30 40 50 60

GCCTCGGTCTTCTCCAAGTCATTTCCGAGCGTCGCGCGTCAATTCCAATACCGCCAGAAT