ES2296350T3 - Vector de alta expresion en escherichia coli. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de tratamiento térmico para la formación de una capa superficial austenítica con = 0, 30% en peso de nitrógeno disuelto en piezas próximas a su forma definitiva de X5 CrNiMo 17 12 2 o de X2 CrNiMoN 22 5 3 como acero inoxidable mediante nitruración a una temperatura entre 1.000ºC y 1.200ºC en una atmósfera gaseosa que contiene nitrógeno y enfriamiento posterior con tal velocidad que se evita una segregación de nitruros.
Description
Vector de alta expresión en Escherichia
coli.
La presente invención se refiere a vectores de
alta expresión para la expresión de genes heterólogos en bacterias
tales como Escherichia coli.
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La capacidad para expresar grandes cantidades de
proteínas recombinantes es deseable en muchas aplicaciones y es de
necesidad económica para muchas industrias. Esto es especialmente
cierto para productos que son de poco valor, productos con un
pequeño margen de beneficios, enzimas técnicas (por ejemplo,
proteasa y lipasas para detergentes) y proteínas para diagnósticos
in vivo (colesterol oxidasa, penicilina-G
acilasa). Existen varios sistemas de expresión disponibles para la
expresión de genes heterólogos. Sin embargo, el más valioso,
versátil y quizás el mejor sistema para la expresión de proteínas
heterólogas es Escherichia coli. Existen muchas
publicaciones sobre los elementos esenciales necesarios para
expresar proteínas heterólogas en altos niveles. Uno de los
elementos más esenciales es el promotor usado para expresar los
genes heterólogos. El promotor usado debe ser fuerte. Algunos de
los promotores fuertes usados más frecuentemente para la expresión
de genes heterólogos son los promotores de P_{L}, tac,
trp, trc y el promotor T7 descrito por Studier et
al. Los promotores usados son generalmente regulables. Esta
característica es esencial si la proteína diana que va a expresarse
es tóxica para el huésped. En general, cuanto más fuerte es el
promotor, más ARN se transcribirá a partir del ADN conduciendo a la
acumulación de ARN mensajero. Aparte de los promotores regulables
fuertes, también participan otros elementos en la expresión de los
genes heterólogos. La eficacia de la traducción participa en
maximizar la expresión de los genes heterólogos. La eficacia de la
traducción puede verse afectada por las secuencias en el extremo
5'-terminal del ARNm así como por la estructura de
horquilla en el extremo 5' del ARNm. Generalmente, un sitio de
unión a ribosoma funcional que contiene una secuencia
Shine-Dalgarno (SD) situada apropiadamente en un
codón de iniciación AUG es esencial para la traducción eficaz. Se
sabe que la variación de la distancia entre la secuencia SD el codón
AUG afectan a la traducción del ARNm. Los estudios también han
demostrado que, cuando la secuencia SD o el codón de iniciación AUG
están secuestrados en una región bicatenaria del ARNm, la
traducción es menos eficaz debido al bloqueo de la accesibilidad de
estas secuencias al ribosoma. Algunos otros factores que se ha
informado que afectan a la expresión eficaz de genes heterólogos
son la estabilidad de los ARN mensajeros, las sensibilidades de los
productos proteicos a la proteolisis y el efecto del contexto
genético del huésped. Aunque existe una abundancia de información
sobre los elementos que afectan la eficacia global de un sistema de
expresión basado en plásmidos, existen otros elementos que no se
han estudiado que pueden participar en la expresión de genes
heterólogos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un vector de
expresión que comprende operativamente unidos entre sí:
(a) el promotor tac, seguido por
(b) la región intergénica groESL de ADN, que, en
el genoma de E. coli, es la región entre el codón de
terminación del gen groES y el codón de iniciación del gen groEL,
seguida por
(c) un codón de iniciación, seguido por
(d) un sito de restricción
en el que dicho vector de expresión no contiene
más de los primeros siete codones del gen groEL.
En una realización preferida, el vector de
expresión de la invención comprende además:
(e) ADN de groES.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped procariota que contiene un vector de
expresión tal como se definió anteriormente.
En otro aspecto la presente invención se refiere
también a un procedimiento para producir una proteína heteróloga
que comprende cultivar una célula huésped de la invención en el que
dicho vector de expresión contiene un ADN que codifica dicha
proteína heteróloga operativamente unido a secuencias de ADN
reguladoras, en un medio adecuado en condiciones adecuadas para la
expresión de la proteína.
Figura 1. Construcción de pBMS1000.
Figura 2. Construcción de pBMS1000GroESL.
Figura 3. Construcción de pBMS2000H.
Figura 4. Construcción de pBMS2000, pBMS2001,
pBMS2002.
Figura 5. Construcción de pBMS2000.103 y
pBMS2000.75.
Figura 6. Construcción de pBMS1999GCA y
pBMS2000GCA.
Figura 7. Construcción de pBMS2000.103GCA,
pBMS2000.75GCA y pBMS2000HGCA.
Figura 8. Construcción de pBMS1000PGA, pET9dPGA,
y pBMS2000PGA.
Las GroES y GroEL de Escherichia coli son
proteínas chaperonas que median en el correcto plegamiento de una
amplia variedad de polipéptidos y facilitan el montaje de proteínas
oligoméricas evitando interacciones intramoleculares interiores
prematuras que pueden conducir a una estructura de agregación o
plegamiento incorrecto. Las proteínas GroES y GroEL se transcriben
a partir del mismo ARNm. Los vectores de expresión de la invención
se basan en el operón de GroESL.
Los vectores de expresión de utilidad en la
presente invención están con frecuencia en forma de
"plásmidos", lo que se refiere a bucles de ADN bicatenario
circulares que, en su forma de vector, no están unidos al
cromosoma.
Los vectores de la invención pueden expresar
genes heterólogos en grandes cantidades en Escherichia coli.
Además de otras características, los vectores de la invención tienen
un origen de replicación y preferiblemente una secuencia de ácido
nucleico que codifica un marcador seleccionable. El marcador
seleccionable particular usado no es crítico siempre que el
marcador permita la selección fenotípica en células huésped
transformadas. Los marcadores seleccionables preferidos son
resistencia a antibióticos. Los ejemplos de marcadores de
resistencia a antibióticos incluyen ampicilina, tetraciclina,
cloranfenicol, kanamicina, gentamicina, ácido nalidíxico,
rifampicina, espectinomicina, estreptomicina, neomicina
fosfotransferasa y similares.
En los vectores de la invención, el promotor
tac está seguido por (es decir, en sentido 5' de) la
secuencia génica completa del gen groES, que está seguida por la
región intergénica entre el codón de terminación del gen groES que
está seguido por el codón de iniciación del gen groEL (denominada en
el presente documento "región intergénica groESL"), que está
seguido por un sitio de clonación por restricción. El sitio de
clonación por restricción puede introducirse inmediatamente en el
codón de iniciación del gen groEL o en el sitio RsaI en la región
codificante del gen groEL. El gen heterólogo clonado en los primeros
vectores de expresión se expresará como la proteína nativa mientras
que el gen heterólogo clonado en los últimos vectores de expresión
se expresará como una proteína de fusión con los primeros 7
aminoácidos del gen groEL. Los sitios de
restricción-clonación proporcionan el codón ATG, el
codón necesario para la iniciación de la traducción.
Los vectores de la invención pueden clasificarse
en dos clases, aquéllos que contienen el gen groES y aquéllos sin
el gen groES. La primera clase de vectores contiene el promotor
regulable fuerte, tac, seguido por los codones que codifican
el gen de GroES. En los vectores de la invención, se introduce un
sitio de clonación en el sitio RsaI del gen que codifica GroEL o se
introduce un sitio de clonación inmediatamente antes del codón de
iniciación del gen de GroEL. Tal como se indicó anteriormente, en el
primer caso, el producto génico será una proteína de fusión que
contiene aproximadamente 7 aminoácidos del gen de GroEL en el
extremo amino terminal; en el último caso, el producto génico será
la proteína nativa que contiene el aminoácido metionina en el
extremo amino terminal. En ambos tipos de constructos, se eliminan
todas las secuencias de GroEL tras el sitio de restricción
introducido. En el segundo tipo de vectores, los vectores contienen
el promotor tac seguido por las secuencias intergénicas
entre el gen groES y el groEL y un sitio de restricción que
proporciona el codón de iniciación para la clonación de genes
heterólogos. El gen groES se ha eliminado.
La deleción de las secuencias del gen groES
puede ser ventajosa en algunos casos. La expresión conjunta de la
proteína de groES en grandes cantidades pueden interferir con el
procesamiento posterior, tal como la inmovilización de las enzimas
en soportes sólidos. Sin embargo, en otros casos puede ser ventajoso
usar un vector de expresión que contiene las secuencias génicas
para el gen groES (por ejemplo, pBMS2000) porque puede estabilizar
los tránscritos y la presencia de groES puede estabilizar la
proteína heteróloga expresada.
Los vectores de la invención también contienen
opcionalmente secuencias que codifican el represor lac para
regular la transcripción del promotor lac; esto permite que
la expresión del gen heterólogo clonado esté controlada por
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) o lactosa.
En una variación de los vectores de expresión
mencionados anteriormente, los vectores contemplados en el presente
documento expresan opcionalmente genes heterólogos de manera
constitutiva. Esto se logra eliminando las secuencias de operador
de la región promotora. Un ejemplo de un vector de este tipo es el
plásmido pBMS2000H. Las ventajas de usar un vector de expresión
constitutiva incluyen la eliminación de la necesidad de añadir un
inductor para inducir al sistema a expresar los productos génicos
heterólogos. Esto puede disminuir el coste de los artículos y
simplificar el proceso de fermentación eliminando un parámetro de
fermentación que necesita examinarse tal como la concentración
óptima de IPTG y el momento óptimo en el que añadir el inductor para
proporcionar una expresión óptima del producto génico. Es posible,
en algunos casos, que la clonación de genes heterólogos en vectores
de expresión constitutiva produzca más productos génicos heterólogos
ya que los productos génicos se acumulan desde el comienzo del
crecimiento celular.
Las secuencias de ADN reguladoras de los
vectores de la invención, tales como el promotor y el represor,
están operativamente unidas a la secuencia de ADN que codifica toda
o parte de la secuencia de gen heterólogo que desea expresarse. Tal
como se usa en este contexto, la expresión "operativamente
unida" significa que las secuencias de ADN reguladoras pueden
dirigir la replicación y/o la expresión de la secuencia de ADN que
codifica toda o parte de la proteína que desea expresarse.
Los vectores de la invención pueden usarse para
expresar una amplia variedad de genes heterólogos. Los ejemplos de
genes heterólogos que pueden expresarse usando los vectores de la
invención incluyen el gen de la D-aminoácido
oxidasa de Trignopsis variabilis; genes que codifican
inmunotoxinas tales como G28.5sFv-PE40 y
BR110sFv-PE40; el gen que codifica la penicilina G
amidasa, el gen que codifica la glutarilcefalosporina amidasa (GCA)
y similares. Tal como se muestra en la sección de ejemplos, los
vectores de la invención proporcionan títulos superiores de enzimas
expresadas (por ejemplo, GCA), en relación con otros vectores
conocidos en la técnica, tales como vectores pET basados en ARN
polimerasa de T7.
Los vectores de expresión de la invención
también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la
técnica, por ejemplo, secuencias líder de estabilidad que proveen
estabilidad al producto de expresión, secuencias líder secretoras
que proveen la secreción del producto de expresión, elementos de
estabilidad que proporcionan estabilidad mitótica al plásmido, y
otras secuencias que proporcionan sitios adicionales para la rotura
mediante endonucleasas de restricción. Las características del
vector de expresión real usado deben ser compatibles con la célula
huésped que va a emplearse.
La secuencia para el promotor tac se
describe, por ejemplo, en Weiss et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 81, p. 6019-6023, 1984.
Pueden construirse vectores de expresión
adecuados que contienen las secuencias codificantes y de control
deseadas usando técnicas de ADN recombinante convencionales, tal
como se enseña en el presente documento o tal como se conoce en la
técnica, muchas de las cuales se describen en T. Maniatis et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.
La presente invención se refiere adicionalmente
a células huésped que contienen un vector de expresión de la
invención. Las células huésped adecuadas son células procariotas que
de manera preferible son biológicamente puras. Las células huésped
procariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de
Escherichia coli, Bacillus subtilus y Salmonella
typhimurum. La célula huésped más preferida de la invención es
E. coli DH5\alpha mcr que también se denomina ATCC 98563.
E. coli ATCC 98563 se depositó en la Colección Americana de
Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE.UU
20852 el 28 de octubre de 1997, según las disposiciones del tratado
de Budapest. E. coli ATCC 98563 contiene el plásmido
pBMS2000.
Pueden introducirse vectores de expresión en
células huésped mediante diversos procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la transfección de
células huésped con vectores de expresión mediante el procedimiento
de precipitación con fosfato de calcio. Sin embargo, también pueden
emplearse otros procedimientos para introducir vectores de
expresión en células huésped, por ejemplo, electroporación, fusión
biolística, fusión liposomal, inyección nuclear, infección viral o
por fagos o fusión de protoplastos.
Una vez que se ha introducido un vector de
expresión en una célula huésped apropiada, la célula huésped puede
cultivarse en condiciones que permitan la expresión de la proteína o
polipéptido deseado.
Las células huésped que contienen un vector de
expresión de la invención pueden identificarse mediante uno o más
de los siguientes seis enfoques generales: (a) hibridación de
ADN-ADN; (b) presencia o ausencia de funciones de
gen marcador; (c) evaluación del nivel de transcripción tal como se
mide mediante la producción de tránscritos de ARNm de hTOPI en las
células huésped; (d) detección inmunológica del producto génico; (e)
análisis de complementación; y (f) ensayo enzimático, siendo el
ensayo enzimático del procedimiento de identificación preferido.
En el primer enfoque, puede detectarse la
presencia de una secuencia de ADN que codifica la proteína
heteróloga deseada mediante hibridación de ADN-ADN
o de ARN-ADN usando sondas complementarias a la
secuencia de
ADN.
ADN.
\newpage
En el segundo enfoque, puede identificarse el
sistema huésped de vector de expresión recombinante y seleccionarse
basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de gen
marcador (por ejemplo, actividad de timidina quinasa, resistencia a
antibióticos, prototrofía de uracilo, etc.). Puede colocarse un gen
marcador en el mismo plásmido que la secuencia de ADN que codifica
el gen heterólogo bajo la regulación del mismo promotor o un
promotor diferente usado para regular la producción de proteína
heteróloga. La expresión del gen marcador en respuesta a la
inducción o selección indica la expresión de la secuencia de ADN que
codifica la proteína heteróloga.
En el tercer enfoque, puede evaluarse la
producción de tránscritos de ARNm del gen heterólogo mediante
ensayos de hibridación. Por ejemplo, puede aislarse ARN y
analizarse mediante transferencia de tipo Nothern o ensayo de
protección de la nucleasa usando una sonda complementaria a la
secuencia de ARN. Como alternativa, pueden extraerse los ácidos
nucleicos totales de la célula huésped y someterse a ensayo o
hibridación con tales sondas.
En el cuarto enfoque, puede evaluarse
inmunológicamente la expresión del gen heterólogo, por ejemplo,
mediante inmunotransferencia de tipo Western.
En el quinto enfoque, puede evaluarse la
expresión del gen heterólogo mediante análisis de complementación.
Por ejemplo, en células que se sabe que son deficientes en una
enzima de interés, puede deducirse la expresión de actividad
enzimática mediante el crecimiento mejorado de las células en
condiciones limitantes del crecimiento.
En el sexto enfoque, puede medirse la expresión
de ADN heterólogo sometiendo a ensayo para detectar una actividad
enzimática usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, puede
emplearse el ensayo descrito en Y. Pommier, J. Biol. Chem., 265,
páginas 9418-9422, 1990.
Las secuencias de ADN de los vectores de
expresión, plásmidos o moléculas de ADN de la presente invención
pueden determinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, puede emplearse el procedimiento de
terminación de cadena de didesoxi tal como se describe en Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, páginas
5463-5467, 1977, o el procedimiento de
Maxam-Gilbert tal como se describe en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 74, páginas 560-564, 1977.
Por supuesto, debe entenderse que no todos los
vectores de expresión y secuencias de ADN reguladoras funcionarán
igual de bien para expresar las secuencias de ADN de la presente
invención. Tampoco todas las células huésped funcionarán igual de
bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en
la técnica puede hacer una selección entre los vectores de
expresión, secuencias de ADN reguladoras y células huésped usando la
orientación proporcionada en el presente documento sin
experimentación excesiva y sin apartarse del alcance de la presente
invención.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para producir una proteína heteróloga que comprende
cultivar una célula huésped de la invención en condiciones adecuadas
para la expresión de la proteína.
Un experto en la técnica puede lograr el
crecimiento de las células huésped mediante el uso de un medio
apropiado. Los medios apropiados para hacer crecer las células
huésped incluyen aquéllos que proporcionan nutrientes necesarios
para el crecimiento de las células. Un medio típico de crecimiento
incluye oligoelementos, fuentes de nitrógeno y fuentes de carbono y
necesarias. También pueden añadirse inductores. El término
"inductor", tal como se usa en el presente documento, incluye
cualquier compuesto que potencie la formación de la proteína o
péptido deseado. Las fuentes de carbono pueden incluir azúcares
tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, rafinosa y
similares; las fuentes de nitrógeno incluyen extracto de levadura,
casaminoácidos, N-Z amina, Bactotriptona y
similares. Un medio preferido comprende extracto de levadura al
2,4%, Bactotriptona al 1,2%, glicerol al 0,4%, hidrogenofosfato de
dipotasio 0,72 M y dihidrogenofosfato de potasio 0,17 M. El pH del
medio se ajusta preferiblemente hasta aproximadamente 6,8 a 7,5, de
manera más preferible aproximadamente 7,0.
El procedimiento de la presente invención se
realiza en condiciones adecuadas para la expresión del péptido
deseado. El pH del medio se mantiene preferiblemente entre
aproximadamente 7,0 y 7,5, lo más preferiblemente entre
aproximadamente 7,0 y 7,2, durante el crecimiento de las células
huésped. Un intervalo de temperatura adecuado para el procedimiento
de la invención es desde aproximadamente 25ºC hasta aproximadamente
37ºC. No se sabe que la presión sea crítica para poner en práctica
la invención y por conveniencia normalmente se emplea
aproximadamente la presión atmosférica. El procedimiento de la
invención se lleva a cabo preferiblemente en condiciones
aerobias.
El siguiente ejemplo es para ilustrar la
invención pero no debe interpretarse como una limitación de la
misma.
\newpage
Los plásmidos y cepas de Escherichia coli
se enumeran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Caldo Lauria: Bactotriptona de Difco al 1%,
extracto de levadura Bacto de Difco al 0,5%, cloruro de sodio l
0,5%.
Agar Lauria: caldo Lauria complementado con
Bacto-agar de Difco al 1,5%.
Caldo T: Bactotriptona de Difco al 1,2%,
extracto de levadura Bacto de Difco al 2,4%, hidrogenofosfato de
dipotasio 0,72 M, dihidrogenofosfato de potasio 0,17 M, glicerol al
0,4%.
Se sintetizaron los cebadores de PCR directo e
inverso con el sintetizador de ADN ABI 391. Se diseñó el cebador
directo (5'CTCAAAGGAGAGTTATCCATGGATATTCGTCC3') (SEC. ID. NO.:
1) para introducir un sitio de restricción NcoI en el codón de
iniciación del gen groES. Se diseño el cebador inverso
(5'CAGACATTTCTGCCCGGGGG
TTTGTTTATTTC3') (SEC. ID. NO.: 2) para que tuviese aproximadamente 23 bases desde el codón de terminación de la traducción de groEL que incluía un sitio SmaI natural. Se amplificó el ADN de Escherichia coli XG44 en una reacción de 50 \mul que contenían tampón de PCR convencional. Se realizaron las reacciones en el termociclador de ADN GeneAmp^{R} PCR System 2400 DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer) usando microtubos de 0,25 ml. Las condiciones de PCR consistían en la etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 4 minutos, seguido por 32 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 45 segundos, reasociación del cebador a 58ºC durante 1 minutos y extensión del cebador a 72ºC durante 3 minutos. Tras la extensión final de las etapas de ciclación, se realizó una extensión final a 72ºC durante 20 minutos antes de que la reacción se almacenara a 4ºC. Se digirieron los productos de PCR resultantes con enzimas de restricción NcoI y SmaI y se separaron en un gel de agarosa al 0,7%. Se escindió el fragmento de ADN de 2,0 kb deseado del gel, se sometió a electroelución y se precipitó con etanol. Se usó el ADN purificado para la clonación posterior.
TTTGTTTATTTC3') (SEC. ID. NO.: 2) para que tuviese aproximadamente 23 bases desde el codón de terminación de la traducción de groEL que incluía un sitio SmaI natural. Se amplificó el ADN de Escherichia coli XG44 en una reacción de 50 \mul que contenían tampón de PCR convencional. Se realizaron las reacciones en el termociclador de ADN GeneAmp^{R} PCR System 2400 DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer) usando microtubos de 0,25 ml. Las condiciones de PCR consistían en la etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 4 minutos, seguido por 32 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 45 segundos, reasociación del cebador a 58ºC durante 1 minutos y extensión del cebador a 72ºC durante 3 minutos. Tras la extensión final de las etapas de ciclación, se realizó una extensión final a 72ºC durante 20 minutos antes de que la reacción se almacenara a 4ºC. Se digirieron los productos de PCR resultantes con enzimas de restricción NcoI y SmaI y se separaron en un gel de agarosa al 0,7%. Se escindió el fragmento de ADN de 2,0 kb deseado del gel, se sometió a electroelución y se precipitó con etanol. Se usó el ADN purificado para la clonación posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó el gen de penicilina G amidasa a
partir de ADN genómico de E. coli XG44 mediante PCR usando
el cebador directo específico (CAGAGGATATCATGAAAAAT) (SEC.
ID. NO.: 3) que introduce un sitio de restricción BspHI y el
cebador inverso (ACCAGGATCCAACATCACAATACCTG) (SEC. ID. NO.:
4) que introduce un sitio de restricción BamHI. Las condiciones de
PCR consistían en la etapa de desnaturalización inicial a 95ºC
durante 2 minutos seguido por 33 ciclos de desnaturalización a 94ºC
durante 1 minuto, reasociación del cebador a 55ºC durante 1 minutos
y extensión del cebador a 72ºC durante 2 minutos. Tras la extensión
final de las etapas de ciclación, se realizó una extensión final a
72ºC durante 5 minutos antes de que la reacción se almacenara a
4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer durante la noche las células
que albergaban los genes recombinantes en caldo T en presencia de
30 \mug/ml de sulfato de neomicina. Al día siguiente, se diluyeron
los cultivos 1:10 con caldo T complementado con un antibiótico
apropiado. Se hicieron crecer las células a 30ºC en un incubador
giratorio durante 4 horas y/o hasta la densidad óptica de 2,0 a 600
nm, momento en el que se añadió una concentración apropiada de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) al cultivo. Se continuó la incubación de los cultivos en
presencia de IPTG a 30ºC durante cuatro horas adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de glutarilcefalosporina amidasa
(GCA) se basó en la conversión del ácido
glutaril-7-aminoadipilcefalosporánico
(glutaril-7-ADCA) en ácido
7-aminoadipilcefalosporánico
(7-ADCA). Se recogieron las células que expresaban
la glutarilcefalosporina amidasa mediante centrifugación. Se
resuspendieron los sedimentos celulares en agua y se rompieron las
células mediante sonicación. Se eliminaron los residuos celulares
mediante centrifugación y se usó el sobrenadante clarificado
obtenido para los ensayos. Se añadió el sobrenadante clarificado
diluido hasta la concentración apropiada en un volumen de 250
\mul a un volumen igual de
glutaril-7-ADCA 20 mg/ml calentado
previamente en tampón Tris 0,3 M, pH 8,0. Se incubaron las mezclas
de reacción en un incubador giratorio a 37ºC a 330 rpm durante 30
minutos. Se paró la reacción mediante la adición de 4 ml de
H_{2}SO_{4} 25 mM. Se clarificaron las mezclas de reacción
mediante centrifugación y se inyectaron los 5 \mul de la muestra
en una columna Phenosphere C18 de 5 micrómetros y se eluyeron los
productos con un 95% de acetato de amonio 60 mM y un 5% de
acetonitrilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron las células que expresaban
penicilina G amidasa mediante centrifugación y se resuspendieron
los sedimentos celulares en agua. Se rompieron las células mediante
sonicación y se sometieron a ensayo los lisados celulares para
determinar la actividad penicilina G amidasa. Se añadió un ml del
sobrenadante diluido apropiadamente a un ml de penicilina G
potásica al 4,5% calentada previamente preparada en tampón fosfato
de potasio 200 mM, pH 7,5. Se incubaron las mezclas de reacción en
un incubador giratorio a 37ºC durante 15 minutos. Se pararon las
reacciones mediante la adición de un ml de un 99,0% de CH_{3}CN y
1,0% de HOAC, se mezclaron y se clarificaron mediante
centrifugación. Se mezcló un ml de la mezcla de reacción con 0,33
ml de reactivo de p-dimetilaminobenzaldehído (PDAB):
una parte de PDAB al 1% en metanol más 6 partes de tampón acetato
de sodio (1000 ml de ácido acético glacial, 475 ml de agua
desionizada y 25 ml de hidróxido de sodio 1 N). Tras incubar
durante 4 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a
415 nm, a partir de la cual se calculó la conversión molar.
\newpage
Se digirió el plásmido pBM11M5 con PvuI y ClaI.
Se eliminaron las bases de proyección en 3' y de proyección en 5'
mediante tratamiento con polimerasa de T4 y fragmento Klenow,
respectivamente. Se sometió a electroelución el fragmento de 4,4 kb
y se acopló. El plásmido resultante, denominado
pBM11M5(Cla/Pvu), se sometió a digestión parcial con
HindIII. Se sometió a electroelución el fragmento linealizado, se
rellenó la proyección en 5' con el fragmento Klenow y se acopló. Se
realizaron análisis de restricción para seleccionar el plásmido con
el sitio HindIII eliminado en la posición correcta. El plásmido
resultante, denominado pBM11M5 (Cla/Pvu/H3) se digirió con HindIII
y BamHI. Se eluyó el fragmento de 3,35 kb y se acopló con el
promotor tac de 90 pb obtenido mediante la digestión del
plásmido pDR540 con HindIII y BamHI. El plásmido resultante,
denominado pBM11tac, se digirió con EcoRI y HindIII, produciendo un
fragmento de 2,9 kb que se acopló con el fragmento
lac^{iQ} de 1,3 kb obtenido mediante la digestión de
pUC19lac^{iQ} con EcoRI y HindIII. Para facilitar la clonación de
genes heterólogos, se introdujo un sitio de clonación NcoI
inmediatamente después del BamHI del promotor tac insertando
el adaptador 5'-GATCTCCATGGG-3'
(SEC. ID. NO.: 5) 3'-AGGTACCCCTAG-5'
(SEC. ID. NO.: 6) en el sitio BamHI del plásmido pBM11taclac. El
plásmido de 4,2 kb resultante se denominó pBMS1000.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el plásmido pBMS1000 con enzimas de
restricción, NcoI y SmaI. Se acopló el fragmento de 4,2 kb
resultante con el gen groELS obtenido mediante amplificaciones por
PCR y se digirió con NcoI y SmaI tal como se describió
anteriormente. El plásmido de 6,2 kb resultante se denominó
pBMS1000GroESL.
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El plásmido pBM11taclac\lambdaN203GCA es un
plásmido de expresión de fusión derivado de pBMS1000 que contiene
ADN que codifica los primeros 33 aminoácidos de la proteína
\lambdaN de fago fusionada con el extremo
amino-terminal del gen glutarilcefalosporina
amidasa 203 (203GCA). La parte de fusión de la proteína \lambdaN
puede eliminarse mediante digestión con NcoI (extremo 5') y BspH1
(extremo 3'). Se digirió el plásmido pBM11taclac\lambdaN203GCA
con BspHI y se rellenó la proyección en 5' con el fragmento Klenow
seguido por digestión con NcoI. Se sometió a electroelución el
fragmento de 6,1 kb y se acopló con el fragmento de 403 pares de
bases que contenía la secuencia génica completa para el gen groES y
los primeros 7 aminoácidos del gen groEL. Por tanto, la proteína
GCA es un producto de fusión del gen groEL. Se generó este fragmento
mediante la digestión del plásmido pBM11taclacGroESL con enzimas de
restricción, Nco I y Rsa I seguido por electroelución. El plásmido
de 6,5 resultante kb se denominó pBMS1999GCA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el plásmido pBMS1999 con MfeI y
BspHI. Se purificó el fragmento de 6,43 kb a partir del gel mediante
electroelución y se acopló con el siguiente adaptador
sintético:
El plásmido resultante se denominó pBMS2000GCA.
Este plásmido tiene el gen groES intacto, la región intergénica
entre los genes groES y groEL seguida por la secuencia que codifica
el gen glutarilcefalosporina amidasa 203.
Se digirió el plásmido pET9d (adquirido de
Novogen) con enzimas de restricción, NcoI y BamHI. Se purificó el
ADN de plásmido de 4,3 kb linealizado a partir del gel de agarosa
mediante electroelución y se acopló con el gen de
glutarilcefalosporina amidasa de 2 kb obtenido mediante la digestión
de un plásmido que contenía el gen de GCA203 con BspHI y BamHI. El
plásmido resultante se denominó pET9dGCA.
Se derivó el plásmido pBMS2000 a partir del
plásmido pBMS2000GCA. Se digirió el plásmido pBMS2000GCA con enzimas
de restricción, MfeI y BamHI para eliminar el gen de GCA. Se acopló
el fragmento de 4,53 kb resultante con el siguiente oligómero
El plásmido resultante se denominó pBMS2000.
Este plásmido contiene el gen groES intacto, la región intergénica
entre groES y groEL, y los sitios de restricción BspHI y BamHI para
la clonación génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se derivó el plásmido pBMS2001 del plásmido
pBMS2000. Se digirió el plásmido pBMS2000 con enzimas de
restricción, MfeI y BamHI. Se acopló el fragmento de 4,53 kb
resultante con el siguiente oligómero
El plásmido resultante se denominó pBMS2001.
Este plásmido contiene el gen groES intacto, la región intergénica
entre groES y GroEL seguida por los sitios de restricción NcoI y
BamHI para la clonación génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se derivó el plásmido pBMS2002 del plásmido
pBMS2000. Se digirió el plásmido pBMS2000 con enzimas de
restricción, MfeI y BamHI. Se acopló el fragmento de 4,53 Kb
resultante con el siguiente oligómero
El plásmido de 4,6 kb resultante se denominó
pBMS2002. Este plásmido contiene el gen groES intacto, la región
intergénica entre groES y groEL seguida por los sitios de
restricción NdeI y BamHI para la clonación génica.
Se deriva el plásmido pBMS2000.103 del plásmido
pBMS2000. Carece de la secuencia codificante para el gen groES pero
conserva las secuencias intergénicas entre los genes groES/groEL. Se
digirió el plásmido pBMS2000 con enzimas de restricción, HindIII y
BspHI. Este procedimiento elimina el promotor tac, el
operador las, el gen groES y la región intergénica
groES/groEL. Se acopló el fragmento de 4,12 kb resultante con un
oligómero químicamente sintetizado que contenía las secuencias del
promotor tac, el operador lac y la región intergénica
groES/groEL.
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El plásmido de 4,2 kb resultante se denomina
pBMS2000.103.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pBMS2000.75 es similar al plásmido
pBMS2000.103. Contiene sólo las secuencias intergénicas parciales
groEs/groEL en lugar de las secuencias intergénicas completas como
en el plásmido pBMS2000.103. Se digirió el plásmido pBMS2000 con
enzimas de restricción, HindIII y BspHI. Este procedimiento elimina
el promotor tac, el gen groES y la región intergénica
groES/groEL. Se acopló el fragmento de 4,1 kb resultante con un
oligómero químicamente sintetizado que contenía las secuencias del
promotor tac, el operador lac y la región intergénica
parcial groES/groEL.
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\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido de 4,2 kb resultante se denomina
pBMS2000.75.
\newpage
Se digirió el plásmido pBMS1000 con enzimas de
restricción, HindIII y NcoI. Se aisló el fragmento de 4,1 Kb, se
sometió a electroelución y se acopló con el siguiente oligómero
El plásmido de 4,2 kb resultante denominado
pBMS2000H contiene el promotor tac seguido por secuencias
espaciales intergénicas entre el gen groES y el groEL. No contiene
las secuencias del operador, haciendo por tanto que cualquier gen
heterólogo clonado en este vector se exprese constitutivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el producto de PCR resultante de la
amplificación del gen de PGA con enzimas de restricción, BspHI y
BamHI y se clonó entre los sitios NcoI y BamHI de pBMS1000, los
sitios NcoI y BamHI de pET9d (adquirido de Novogen) y los sitios
BspHI y BamHI de pBMS2000 dando como resultado pBMS1000PGA, pET9dPGA
y pBMS2000PGA respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el plásmido pBMS2000H con enzimas de
restricción, NcoI y BamHI. Se aisló el fragmento de 4,2 kb mediante
electroelución y se acopló con el gen de glutarilcefalosporina
amidasa de 2 kb obtenido mediante digestión de un plásmido que
contenía el gen de GCA203 con BspHI y BamHI. El plásmido de 6,2 kb
resultante se denominó pBMS2000GCA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirieron los plásmidos pBMS2000.103 y
PBMS2000.75 con enzimas de restricción, BspHi y BamHI. Se sometió a
electroelución el fragmento de 4,2 kb y se acopló con el gen de
glutarilcefalosporina amidasa de 2 kb obtenido mediante digestión
de un plásmido que contenía el gen de GCA203 con BspHI y BamHI. El
plásmido de 6,2 kb resultante se denominó pBMS2000.103GCA y
pBMS2000.75GCA.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos de una noche de E. coli que
albergaban GCA203 se diluyeron 1:10 en caldo T complementado con 30
\mug/ml de sulfato de neomicina. Se hicieron crecer los cultivos a
30ºC a 300 rpm durante 4 horas o hasta que la DO_{550} = 2,0. En
ese punto de tiempo, se añadieron 60 \muM de IPTG a los cultivos
para inducir la expresión de GCA.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos de una noche de E. coli que
albergaban penicilina G amidasa se diluyeron 1:10 en caldo T
complementado con 30 \mug/ml de sulfato de neomicina. Se hicieron
crecer los cultivos a 30ºC a 300 rpm durante 4 horas o hasta que la
DO_{550} = 2,0. En ese punto de tiempo, se añadieron 60 \muM de
IPTG a los cultivos para inducir la expresión de penicilina G
amidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos de una noche de E. coli que
albergaban GCA203 se diluyeron 1:10 en caldo T complementado con 30
\mug/ml de sulfato de neomicina. Se hicieron crecer los cultivos a
30ºC a 300 rpm durante 4 horas o hasta que la DO_{550} = 2,0. En
ese punto de tiempo, se añadieron 60\muM de IPTG a los cultivos
para inducir la expresión de GCA.
<110> Bristol-Myers Squibb
Company
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTOR DE ALTA EXPRESIÓN EN
ESCHERICHIA COLI DE ALTA EXPRESIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> E 1722 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US98/26343
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
11-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/069.751
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-12-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcaaaggag agttatccat ggatattcgt cc
\hfill32
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcagacatttc tgcccggggg tttgtttatt tc
\hfill32
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskipaccaggatcc aacatcacaa tacctg
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hfill12
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskipgatccccatg ga
\hfill12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hfill52
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskipattccttaaa ttcgtatgtt cagtgtcgtg cgcggattac gcttcaac
\hfill48
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskipaaagat
\hfill6
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskipcatgatcttt
\hfill10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial
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\hfill35
Claims (15)
1. Un vector de expresión que comprende
operativamente unidos entre si:
(a) el promotor tac, seguido por
(b) la región intergénica groESL, que, en el
genoma de E. coli, es la región entre el codón de terminación
del gen groES y el codón de iniciación del gen groEL, seguida
por
(c) un codón de iniciación, seguido por
(d) un sito de restricción
en el que dicho vector de expresión no contiene
más de los primeros siete codones del gen groEL.
2. El vector de expresión según la
reivindicación 1, que comprende además ADN de groES.
3. El vector de expresión según la
reivindicación 1 ó 2, que comprende, en lugar del codón de
iniciación, los primeros siete codones de groEL y en el que el
sitio de restricción se introduce en el sitio RsaI del gen que
codifica groEL.
4. El vector de expresión según la
reivindicación 1 ó 2, en el que el sitio de restricción se introduce
inmediatamente antes del codón de iniciación.
5. El vector de expresión según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una secuencia
de ADN que codifica un marcador seleccionable.
6. El vector de expresión según la
reivindicación 5, en el que el marcador seleccionable es resistencia
a antibióticos.
7. El vector de expresión según la
reivindicación 6, en el que el marcador seleccionable es resistencia
a neomicina.
8. El vector de expresión según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además secuencias que
codifican el represor lac.
9. Una célula huésped procariota que contiene el
vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8.
10. La célula huésped procariótica según la
reivindicación 9 que es E. coli.
11. La célula huésped procariótica según la
reivindicación 10 que es la cepa ATCC 98563 de E. coli.
12. Un procedimiento para expresar una proteína
heteróloga en una célula huésped procariota que comprende cultivar
la célula huésped procariota según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho vector de expresión
contiene un ADN que codifica dicha proteína heteróloga
operativamente unido a secuencias de ADN reguladoras, en un medio
adecuado en condiciones adecuadas para la expresión de dicha
proteína heteróloga.
13. El procedimiento según la reivindicación 12,
en el que la proteína heteróloga es glutarilcefalosporina amidasa o
penicilina G amidasa.
14. El procedimiento según la reivindicación 12
ó 13 realizado a una temperatura de 25ºC a 37ºC y un pH de 7,0 a
7,2.
15. Uso del vector de expresión según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la célula huésped
procariota según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para
expresar una proteína heteróloga.
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