JPH02503750A - β‐ラクタム化合物の製造を目的とする遺伝子および遺伝子産物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、構造および多価機能性の点で新規であり、ペニシリンＧおよびペニ シリン■の生合成の最終段階を触媒する、精製された単離形態の鍵酵素の遺伝子 および遺伝子産物に関するものである。

既に１９５３年に、加藤（「ジャーナル・オブ・アンティバイ、オテイックス・ シリーズ」、東京６．１３０−１３６頁、１９５３年）により、前駆物質を欠く ペニシリン発酵物においてペニシリン核の蓄積が観察されている。後にこのβ− ラクタムは、バチエラー等（１ネイチヤー」、］８３．２５７−２５８頁、１９ ５９年）により単離され、６−アミツベニシラン酸（６−ＡＰＡ）として同定さ れ几。６−ＡＰＡは、特に前駆体を欠くペニシリン発酵物において蓄積される。

エリクソンおよびベネット（「アプライド・マイクロバイオロジー」、１３．７ ３８−７４２頁、１９６５年）は、６−ＡＰＡを、前駆物質としてのフェニル− ま几；ヨフェノキシ酢酸の非存在下におけるイソペニシリンＮの酵素的７−説ア シル化により得られるか、または天然疎水性ペニシリン類の酵素的開裂により形 成さオーる第二中間代謝物としてみなした。後にペニシリン生合成の最終段階は 、フェニル−またはフェノキシ酢酸をイソペニシリンＮのＬ−α−アミノアジピ ン酸側鎖と交換することによって、側鎖酸がアンルー補酵素Ａ−化合物として反 応を開始することにより構成されることが発見された。このアシル基転移を触媒 する酵素は、ローグー（Ｐｏｓｔｅｐｙ　Ｈｉｇ。

Ｍｅｄ、　Ｄｏｓｅ、、２６．４９３−５００頁、１９７２年）によりペニシリ ウム・クリソゲヌムの粗抽出物において同定され、ペニシリン・アシルトランス フェラーゼ（ＦＡＴ）と命名され乙。この酵素は全てのペニシリン形成菌におい て見出され、細胞内で局在している。フォーセット等の研究（「バイオケミカル ・ジャーナルＪ、　　ｌ　５Ｌ７４．１−７４．６頁、１９７５年）は、フェニ ルアセチル−補酵素への存在下でのペニシリウム・クリソゲヌムの酵素粗抽出物 によるイソペニシリンＮからペニシリンＧへのアシル基転移を確認している。

ペニシリンＧまたはＶの生合成におけるＦＡＴの重要性は、プルジオロギシェ・ ヘミ−」３４９．９５−１０３頁、１９６８年）、スペンサー（「バイオケミカ ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」３１．１７ ０−１７５頁、１９６８年）、ガーテンパックおよびプランズバーグ（「アクタ ・ケミ力・スカンディナビカ」２２．１０５９−１０６１頁、１９６８年）、ス ペンサーおよびマウング（「バイオケミカル・ジャーナルＪｌ　１８．２９−３ ０頁、１９７０年）、メーシェルト等（「ジャーナル・オブ・アンティバイオテ ィックス」３３，７２２−７３０頁、１９８０年）、コゲカー等（「インディア ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス」２ ０．２０８−２１２頁、１９８３年）、フレデリクゼン等（「バイオテクニカル ・レターズＪ６．５４９−５５４頁、１９８４年）、アブラハム（「レギュレー ション・オブ・セカンダリ−・メタポライド・フォーメーシジン」中、クライン カウフ等編、プロシーディンゲス・才ブ・ザ・シックスティーンズ・ワ−クンジ ップ・コンファレンンーズ・ヘキスト、グラハト・カストレ、１２．−１６．５ ．８５、第１６巻、パインハイム、１１５−１３２頁、１９８６年）、ルエンゴ 等（「ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス」３９．１５６５−１５７ ３頁および１７５４−１７５９４　１９８６年）並びにアルパレス等（「アンテ ィマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー」３］、１６７５− １６８２頁、１９８７年）により為された観察により確認されている。またチオ ール依存性酵素は、様々なペニシリン内でのアシル基交換を触媒し得、高い合成 能を有するペニシリン株における場合の方が低生産株における場合より見出され る度合が大きい（ブルースおよびジョンソン、「ジャーナル・オブ・バクテリオ ロジー」９４．１５０２−１５０８頁、１９６７年）。

この発明；よ、この重要な生合成酵素の遺伝子配列および遺伝子産物の単離、特 性検定および説明に関するものであり、力価の増加およびハイブリッドまには突 然変異合成の両方に関する遺伝子工学技術の必須先行条件まｆ二は新規ｔβ−ラ クタム形質転換方法の開示を提供する。

蛋白質配列決定は、ローゼン、「メソッズ・エンザイモロジーー：２５．３４４ −３５９頁（１９７２年）により知られている。同様に、当技術分野の現段階で は、蛋白質をコードする遺伝子の位置決め（Ｃズスタイン等、コールド・スプリ ング・ハーバ−・ンンポジア、オン・クオンティテイティブ・バイオロジー、Ｘ ＬＶ巻、９９−１０５頁、１９８１年）およびそれらの配列決定（マクサムおよ びギルバート、「メソッズ・エンザイモロジーヨ６５．４９９−５６０１ｉ、１ ９８０年）が知られている。強力で所望により誘導性てめり得るプロモーターへ の遺伝子のカップリング達成は、プリブノー、「バイオロジカル・レギュレーシ ョン・アンド・デベロップメント」、第１Ｌ２３１−２７７頁、ブレナム・プレ ス・ナンバー４（ゴールドバーガー等、１９７９年）により知られている。

β−ラクタム生合成の幾つかの酵素は、既に純粋形態で単離され、構造に従い特 性検定されている。同様に、こシーらの酵素の幾つかのに適した対応する発現ベ クターに組み込まれ、クローン化されている（例、セファロスポリウム・アクレ モニウムからイソペニシリンＮシンテターゼ：サムソン等、「ネイチャー」３１ ８．１９１−１９４頁、１９８５年、ボールドウィン等、「ジャーナル・オブ・ アンティバイオティックスｊ４０（５）、６５２−６５９頁、１９８７年、ＥＰ ２００４２５、イーライ・リリー、１９８５年、ペニシリウム・クリソゲヌムか らイソペニシリンＮシンテターゼ二カ一等、「ジーン」４８．２５７−２６６頁 、１９８６年、ＥＰ２２：１１２８、イーライ・リリー、１９８５年、セファロ スポリウム・アクレモニウムからエクスパンダーゼ：サムソン等、「バイオテク ノロジー」５．１２０７−１２１４頁、１９８７年、並びにβ−ラクタム生合成 を触媒するストレプトマイセス・クラブリゲルスから幾つかの酵素：ＥＰ２３３ ７１５、ビーチャム、１９８６年）。同様に、そｔ、らの発現ベクターにより行 なわれたβ−ラクタム生産性微生物の最初の形質転換について：よ、既に記載さ れている（スカトルド等、璽カレント・ジェネティクスＪｌ　２（５）、３３７ −３４８頁、１９８７年）。

第９図に示されている反応式に従い、ペニシリン生合成の最終段階、すなわちイ ソペニシリンＮのアシル基転移または６−ＡＰＡへのその開裂およびペニシリン へのそのアシル化を触媒するＦＡＴは、既に以前に（上記参照）ペニシリン生産 菌株において同定されており、その多価触媒的機能性も記載されているが、それ は非常に不安定である１こめ、現時点ではまだ、注目に値するほど純粋には単離 され得す、構造による特性検定も不可能である。非常に不安定で微酸性であり、 ４０〜１００時間の発酵中にペニシリウム・クリソゲヌムのペニシリン形成味に おいて多量に形成されるチオール依存性ＦＡＴは、一方では補酵素Ａ活性化発酵 性側鎖（例、疎水性前駆物質フェノキシ酢酸、フェニル酢酸、ヘキサン酸、オク タン酸などのアンルー補酵素八−化合物）の天然ペニシリン類（例、イソペニシ リンＮ、ペニシリン■、ペニシリンＧ、６−ＡＰＡ等）へのアシル基転移を触媒 し、他方では天然ペニシリンどうしのアシル基転移を触媒する、すなわちアシル 基転移の間、アシル酵素複合体によって、アシル供与体およびアシル受容体とし ての両方の天然ペニシリン機能を発揮するが、補酵素Ａ活性化疎水性前駆化合物 の方はただアシル供与体として酵素反応に入り得る。アシル転移は水性媒質中で 行ｔわれるため、求核剤としての水はまたアシル酵素複合体と競合し、それによ りエネルギーに富むアシル供与体は単に加水分解的に開裂され得る。すｔわち、 ６−ＡＰＡ、天然ペニシリンのβ−ラクタム核は、常にペニシリン発酵物の培養 ブロスにおいて見出される。

ＦＡＴの検出は、慣用的分析方法、例えば放射能、微生物またはクロマトグラフ ィーによる試験方法を用いて行なわれ得る。例えば酵素反応 ６−ＡＰＡ＋フェノキシアセチル−補酵素Ａ−ペニシリン■十補酵素Ａ： を触媒する、ＦＡＴの６−ＡＰＡ−フェノキシアセチル補酵素Ａ−アシル・トラ ンスフェラーゼ活性を測定するために、次の３種の異なる試験方法を準備した。

ａ）特異的生成物−感受性試験株を用いた微生物寒天拡散試験によるペニシリン ■の検出。例えば、マイクロコツカス・ルテウスＡＴＣＣ９３４１は、６−　Ａ 　Ｐ　Ａに対する場合よりも小数点以下３位より大きい倍率でのペニシリンに対 する抗＠感受性を有する。

ｂ）Ｓ３５−標識６−ＡＰＡを用いる場合、β−カウンターにおいて抽出可能な ５３５−ペニシリン■の検出（Ｓ３５−ペニシリンＧから酵素的）。

Ｃ）抽出されたペニシリンＶのＨＰＬＣによる検出。

酵素的アシル基転移反応は、下記混合物を用いてマイクロタイター・プレートで 行なわれる。

６−ＡＰＡ（反応緩衝液中２．５ｘ９／ｘ１２）　　　　　　　　２０　μＱＰ ａＣｏＡ（再蒸留水中的１５−２０ｍ９／＝Ｑ＞　　　　　　３０　ｕＱ酵素ま たは反応緩衝液（０，１モル燐酸緩衝液ｐＨ７，８，１ミリモルＤＴＴ含有）　 　　　　　　　　　　　　　　　１５０μＱ直後に、または１時間の一定したイ ンキニベーンヨン期間内の様々を時点で、２０μρのアリコートを各々採取し、 次に同じマイクロタイター・プレート中で５０％水性エタノール（＝酵素反応の 停止）によりｌ、５まｆ：　！ｉ　０　Ｌｊ　／　ｉ１２のベニシリナーゼ（＝ β−ラクタム対照）によｌ）１：５に希釈し、マイクロコツカス・ルテウスＡ、 　Ｔ　ＣＣ９３４１まにはラクタム−超感受性株シトモナス・エルギノサＢＣ２ ４８を播種（播種率０．５％、ディフコの抗生物質培地１．１ウエル当たり５０ μｇ１３７℃でインキニベーンヨン１５時間）シた試験プレートにおける寒天拡 散試験でペニシリン■について試験し乙。

様々な時点で、アリコートを酵素的アシル基転移調製物（総体積２順を有する上 記と同じ混合物）から採取し、次に、ｐＨ２（ＨＣｌ）でジイソプロピルエーテ ルにより抽出しく１：１）、呈素により有機相を濃縮し、残留物を同体積の反応 緩衝液に再懸濁し、ＨＰＬＣによりペニシリンＶについて試験しに（ＰａＣｏ、 Ａ含有量測定に関する条件、ただし溶離剤として０．０２５モル燐酸緩衝液ｐＨ ７，０中４０％メタノールおよび６０％０，０１モルＴＢＡＳを使用）。

保持時間（分）フェノキシ酢酸　　　　　　　　　　　　ｌ、１０ベニシロン酸 Ｇ　　　　　　　　　　　　　１．６２ペニンロン酸Ｖ　　　　　　　　　　　 　　１．９２ペニシリンＧ　　　　　　　　　　　　’　　　３．００３−デス アセトキシセファロスポリンＶ　　２．４６セフアロスボリンＶ　　　　　　　 　　　　　３．２４同様の方法で、身持異性ＦＡＴ酵素の他の活性はＨＰＬＣに より測定され得る。この場合、極性基質または生成物の溶離剤として、０．０２ ５モル燐酸緩衝液ｐＨ７、０中０．００１モルＴ　Ｂ　Ａ　Ｓを単独使用する。

保持時間（分）イソペニシリンＮ　　　　　　　　　　　　１，６７６−ＡＰＡ 　　　　　　　　　　　　　　　４．００ＤＴＴ（還元）　　　　　　　　　　 　　　　　２．４１ＤＴＴ（酸化）　　　　　　　　　　　　　　　４．６０イ ソペニシリンＮは、吸着樹脂ＣＤｌＡｌ０Ｎ　　ＨＰ２０）および逆相クロマト グラフイベヌクレオシル０１８、ｌＯμｆ、）を用（１ろことにより、前駆体を 欠くペニシリン発酵物から回収され得る。

酵素調製物によっては、多特異性生合成酵素の実際の活性が検出される指示反応 の選択に特に注意を払わなければならない。例えば、粗酵素調製物に存在する妨 害活性：よ、急速にフェノキンアセチル−補酵素Ａ（−ＰａＣｏＡ）およびペニ シリンＶを加水分解し、またエネルギーに冨む側鎖誘導体ＰａＣｏＡを有する６ −ＡＰＡをペニシリン■にアシル化する（これは、例えば既知蛋白質分解酵素、 例えばキモトリプシンが触媒する）ため、この粗抽出物におけるＦＡＴの指示反 応として６−ＡＰＡ−フェノキンアセチル−補酵素へ八アシルトランスフェラー ゼ活性を用いること：立あまり宵益ではない。しかしながら、これらの干渉活性 は、実際Ｏチオール依存性Ｐ　、Ａ　Ｔとは明確に区別される。それらは、例え ば異なるクロマトグラフィー溶離作用、安定性プロフィールおよび阻害パターン を有する。これらの干渉妨害活性は、一方では粗調製物で先に見出されに非常に 低い特異的ＦＡＴ活性（約１−１０μＩＪ／１９蛋白質）、並びにま１；、酵素 希釈率が増加すると、粗抽出物におけろ６−ＡＰＡ−ＰａＣｏ、Ａ−アシルトラ ンスフェラーゼ活性も最大活性まで大きく増加するという、逆説と思われろ発見 を説明する。ＰへＴ検出における本質的因子は、高酸化感受性ＳＨ−酵素を活性 化または安定化させる還元性化合物、例えばジチオトレイトールまたはβ−メル カプトエタノールの存在である。

また、ＦＡＴは温度ン二対する不安定性が高いため、酵素精製はかなり困難であ る。例えば、新たに製造した酵素調製物でも、様々な安定剤（例、５ミリモルの ジチオトレイトール＋５％ソルビトール”−０，１ミリモルのフェニルメタンス ルホニルフルオリド）の存在にも拘わらず、３７℃での１時間の一定したインキ ュベーション後には全チオール依存性６−ＡＰＡ−ＰａＣｏＡアンルトアシスフ ェラーゼ活性を失う。従って、酸化を防ぎながら４℃の冷却実験室で全精製作業 を行うのが適切である。粗製の精製前酵素溶液は、あまり活性を失わずに安定剤 の存在下で数週間冷凍され得る（−］　９６℃、−２０℃）。しかしながら、そ の場合、幾つかの冷凍交換段階により、すぐにＦＡＴ活性は不活化される。また 、硫酸アンモニウム沈澱物は、前記安定剤混合物の存在下では４℃で数日または 数週間多かメ−少なかれ安定している。

若いペニシリン陽性ペニシリン菌糸体からは、この発明で使用されるＦＡＴの精 製方法により、菌糸体の分解、核酸沈澱、蛋白質沈澱、疎水性相互作用およびア フィニティー・クロマトグラフィー後に、酵素反応速度または蛋白質化学特性検 定に必要とされる、比較的安定した少なくとも５０％活性の酵素調製物が得られ る。比較的貯蔵可能な蛋白質沈澱に対する後処理は、慣用的精製方法、例えば高 圧ホモジナイザーもしくはガラス製ボール−ミルによる細胞分解またはセチルト リメチルアンモニウムプロミド、ストレプトマイシン・スルフェートもしくはプ ロタミン・スルフェートによる核酸沈澱により行なわれ得る。蛋白質沈澱の場合 、中でも硫酸アンモニウムが適しており、検出可能なＦＡＴ活性を全て沈澱させ るには５０％飽和度で充分である。硫酸アンモニウム沈澱から出発すると、チオ ール依存性ＦＡＴは、疎水性相互作用によりフェニルセファロースＣｌ４Ｂに結 合する。９０％を越えるバラスト蛋白質の除去後、生成物を、低イオン強度の安 定剤水溶液で溶離し、１ＯｋＤカツト・オフ限外ろ過膜により濃縮し、さらに好 ましくはアフィニティー・クロマトグラフィーま几は別法としてアニオン交換ク ロマトグラフィー（Ｄ　ＥＡ　Ｅ〜セファロースＰＦ）によるゲルろ過工程（ウ ルトロゲル・アカ５４）または吸着クロマトグラフィー（ヒドロキシルアパタイ ト）により精製すると、少なくとも５０％の活性酵素調製物が形成される。これ は、硫酸アンモニウム沈澱に基づくと約１０００の濃度係数に相当する。

常用のマクロ多孔性担体材料、例えばセファロース、セルロース、ポリマー性材 料、安定化シリカゲル、酸化アルミニウム等は、親和性マトリックスとして使用 され得る。Ｃ１〜Ｃ３゜スペイサ−により担体に結合、またはスペイサ−の非存 在下で担体と共有結合、または疎水性もしくはイオノゲン相互作用により担体に 結合する適当な親和性リガンドは、好ましくはアシルまたはアミノ−β−ラクタ ム化合物である。これらのリガンドのスペイサ−またはマトリックスへの結合は 、リガ：／ドの結合部位が精製すべき酵素に接近し得る状態のままであるように 行なわれなければならない。この発明によると、特に強い精製効果は、特に、Ｎ −エトキシカルホニル−２−エトキンー１．２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ） に上り結合する、末端アミノスペイサ−を有する親和性マトリックス、例えばＡ Ｈ−セルロース４ＢまたはＨＭＤ−ウルトロゲル・アカ３４、リガンド、例えば 天然ペニシリン類、好ましくは６−Ａ、ＰＡ、ペニシリンＶもしくはペニシリン Ｇまたは類似した安定性３−デスアセトキシセファ０スポリン化合物、例えば７ −アミノ−３−デスアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）または７− フェニルアセトアミドーもしくは７−フェニルアセトアミド−３−デスアセトキ シセファロスポラン酸（３−デスアセトキシセファ０スポリンＶおよびＧ）によ り示される。すなわち、アミノ−β−ラクタム親和性マトリックスは、エシェリ ヒア・コリの可溶性ペニシリンＧ−アシラーゼによる高価な保護基工業技術を用 いなくても対応するフェニルアセトアミド−β−ラクタムマトリックスから生成 され得る。

酵素製造に必要とされる微生物は、常用のペニシリン形成用栄養培地において培 養される。栄養培地の適当な成分は、真菌培養に一般に使用されている全ての基 質である。これらの栄養素に加えて、微生物の成長を促進し、ＦＡＴ活性を高め る添加剤を適当に組み合わせて使用することができる。添加剤は、例えば硫酸マ グネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸塩および同様の無機塩類並 びに成長促進物質、ビタミン類および微量元素である。様々な誘導物質、好まし くはフェノキシ−もしくはフェニル酢酸およびそれらの誘導体もしくは類縁体を 加えることにより、達成される酵素力価はかなり増強され得る。

培養は、主として好気性条件下１５〜３５℃の温度範囲および４ないし８のｐ） （値で行なわれる。培養ブロスが最大酵素活性に到達するのに要する時間は、使 用される微生物のタイプにより異なるため、最適培養時間は好ましくは個々の株 ごとに別々に評価する。一般に、培養の持続時間は、好ましくは２〜５日の範囲 である。アシル基転移の場合、培養ブロスまたはそこから製造される活性二次調 製物が使用され得る。それらの活性二次調製物の例としては、培養ブロスから回 収および洗浄された非修飾ま几は透過化細胞、菌糸体の物理的、化学的および酵 素的処理により得られる細胞不含有抽出物（例えば、菌糸体の分解または超音波 処理により得られる細胞ホモジネート、および表面活性物質または酵素による処 理により形成される細胞リゼイト）、慣用の酵素精製方法、例えば塩析、分別沈 澱、透析、ゲルろ過、イオン交喚−１吸着−およびアフィニティー−りロマトグ ラフィーを用いて細胞不含有抽出物を精製することにより得られる所望の酵素の 部分または全体精製調製物、酵素または非修飾または透過化細胞を、吸着、共有 結合形成、架橋、収納または封入手段により水不溶性高分子量担体物質を用いて 物理的ま乙：ヨ化学的に固定させる方法で得られる安定化ＦＡＴ！Ｆ］製物があ る。

生成した上記酵素濃縮物の酵素的または物理化学的特性検定は、古典的方法、例 えばクロマトグラフィー、電気泳動、基質特異性に関する研究、Ｎ−末端配列決 定、活性および安定性に関するｐ）（および温度プロフィール、活性化、阻害お よび安定化の試験等を用いて行なわれ得る。

多くの遺伝子単離方法が存在する。一般的概説は、ワトソン等（レコンビニエル テＤＮＡ−アイン・アインフユールング、ハイデルベルグ、１９８３年）および ウィナツカ−（ゲーネ・ラント・クローンーアイン・アインフ二−ルング、ケン テクノロジー中、パインハイム、１９８４年）の著書に記載されている。ｐａｔ −遺伝子（酵素ＦＡＴの遺伝子）の場合、必要なアミノ酸配列が存在するため、 合成りＮＡ−プローブの使用が最も有意義であると思われる。遺伝子コードに基 づ＜ＤＮＡ配列は、ＦＡＴのポリペプチドｌのアミノ酸配列から誘導され得、対 応するオリゴヌクレオチドは、化学的に合成ざれ得る。第５図は、ＦＡＴのポリ ペプチド】のアミノ酸基２〜２２の配列を示す。２．３．４または６個のコドン が数個のアミノ酸に割り当てられるため、結果的にアミノ酸配列下に与えられた ヌクレオチド配列が形成される。この場合１６のみの相異なる遺伝子配列が可能 であるため、例えばアミノ酸残基１６〜２１に対応する部分が特に適している。

ＲＮＡに相補的であるこれらの１６オリゴヌクレオチドは、各々４個のオリゴヌ クレオチドを有する４種の混合物（第５図におけるオリゴヌクレオチド混合物１ ．２．３および４）として合成され得る。これらのＤＮＡ配列と非常に類似した さらに別のＤＮＡ配列が、ペニシリウム・クリソゲヌムのゲノムに形成されてい るため、遺伝子のさらに確かな同定は、恐らくこれらのオリゴヌクレオチドによ っても為され得ないと思われる。これらの様々なり　Ｎ　Ａ配列間の区別は非常 に複雑であり得る。従って、トレーサー配列として利用可能なさらに別のオリゴ ヌクレオチドが要望されている。

ＤＮＡプローブを用い７二遺伝子単離戦略：耘レイズ（「ジャーナル・才ブ・モ レキュラー・バイオロジー」１８３、］−１２，１９８５年）により検討されて いる。例えば、ある種のコドンまたはめる種のジヌクレオチド系列の頻度に関す る情報が知られている場合、さらに長いＤＮＡ配列が合成され得る。ペニシリウ ム・クリソゲヌムの場合、そのような情報は利用できない。これにも拘わらず、 プローブとしてさらに長いオリゴヌクレオチドを得るために、利用可能なオリゴ ヌクレオチドが配列決定プライマーとして使用され得る。

酵素「逆転写酵素」は、所定のＲＮＡに相補的なりＮＡ鎖を合成し得るが、ただ し過当なスターター分子（＝ブライマー）が存在する場合のみである。上記の場 合、オリゴヌクレオチド混合物１〜４；よプライマーとして使用され得る。すな わち、調製物には多くの他の釦ＲＮＡが存在するが、ｐａｔ−ｔｎＲＮＡのみの 配列決定が可能である。配列決定反応は、塩基−特異性端一破壊試薬（ジデオキ シヌクレオチド・トリホスフェート）の存在下で行なわれる。すなわち、多くの 延長さし１ニオリゴヌクレオチドが製造され、そのゲル電気泳動分析により、ｐ ａｔ−＋ｕＲＮＡに相補的なりＮＡの塩基系列の測定が行なわれる。この方法の 利点は、得られた配列情報により新しいオリゴヌクレオチドが直接合成され得る ことである。さらに、非常に重要なのは、この配列が、アミノ酸配列から誘導さ れる配列と同じでな：すればならないことであり、確実にｐａｔ−特異的配列が 実際に存在することである。

次に、遺伝子の現実の単離は、遺伝子バンクから行なわれ得る。

遺伝子バンクは、各々ペニシリウム・クリソゲヌムのＤＮＡの小部分を含む組換 えＤＮＡベクターのコレクションである（λ−Ｅ　Ｍ　ＢＬ３遺伝子バンクの場 合、これは、１組換え分子につき約０．０５％である）、プラーク・ハイブリダ イゼーションにより、λ−クローンは単離され得、これらは放射能標識ＤＮＡプ ローブとハイブリダイゼーションする。物理的地図は、これらのクローンのＤＮ Ａから製造され得る。その制限地図は、配向決定℃補助として機能し得る制限エ ンドヌクレアーゼ交差部位の配置を示す。ＤＮＡハイブリダイゼーション技術を 用いろと、ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションするＤ　Ｎ　、Ａの部分領 域を測定することができる。対応する部分フラグメントは、プラスミド−ま１こ はバクテリオファージ−ベクター分子に組み込まれ、さらに分子遺伝子方法によ り特性検定される。次に、ＤＮＡ断片をベクターＭ１３ｍｐ１９へクローン化す ることにより、ＤＮＡ配列の決定が可能となり、それによってｐａｔ−特異的Ｄ 　Ｎ　Ａプローブがプライマーとして使用され得る。さらにＤＮＡの配列決定に 上り、遺伝子の暗号化部分およびそこから誘導されたＦＡＴのアミノ酸配列を確 認することができる。既に決定されたアミノ酸部分配列は、必要な情報を提供し 得る。

ＤＮＡ配列情報に基づき、ペニシリウム・クリソゲヌムのｐａｔ　−遺伝子は発 現ベクターに組み込まれ得、よく知られた発現生物体へのＦＡＴの良好な発現が 可能となる（レツニコフおよびゴールド、「マクシマイジング・ジーン・エクス プレッション」、ボストン、１９８６年）。ＡＴＧが正確にエシェリヒア・コリ 出発コドンの位置に来る形である正確な構築を可能にするため、Ｎｃｏｌ交差部 位を部位突然変異により導入することができる。しかしながら、この前に、完全 なｃＤＮＡクローンが対応する遺伝子バンクから単離されなければならない。実 施例１９（第７図も参照）は、プラスミドｐＢＣ２００１の構築の詳細を記載し ている。これを実施するＬめ、まず第一にｐａｔ−ｃＤＮＡ−クローンからのＤ ＮＡフラグメントをＭ１３ｍｐ１９にクローン化する。すなわち、部位突然変異 においてＮｃｏｌ交差部位、さらにクローニングに必要なＨｉｎｄｎ［交差部位 の導入に使用される一本１１ＤＮＡが利用可能である。Ｎｃｏｌ　−Ｈｉｎｄ　 −ｍ−フラグメントがベクターｐＫＫ２３３−２に組み込まれた場合、プラスミ ドｐＢＣ２００１が製造される。それは、エシェリヒア・コリ選択指標として、 エシェリヒア・クリにおける発現に有効なシグナル（ｐｔｒｃ、、ｒｒｎＢ　Ｔ 　Ｉ　Ｔ　２　）およびアンピンリン耐性遺伝子（ｂｌａ）を含む。

ｐａｔ−遺伝子のＤＮＡは、ペニシリウム・クリソゲヌムまたは他のβ−ラクタ ム生産微生物の形質転換を可能にするベクターに組み込まれ得る。形質転換体は 導入されたＤＮＡの幾つかのコピーを含むことが灸いため（例、コラ−等）、遺 伝子のさらに強力な発現が可能であり、ベニンリン形成が増強され得る。実施例 ２０は、プラスミドｐＢｃ２００２の構築を記載しており、それ：よペニシリウ ム・クリソゲヌムの形質転換に使用され得る。ｐＢｃ２００２（第８図も参照） は、修飾ベクターｐＨ５Ｉ０３に組み込まれた、４．８ｋｂの５ａ１１制限フラ グメント上に完全なペニシリウム・クリソゲヌムｐａｔ　−遺伝子を含む。フレ オマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）は、ペニシリウム・クリソゲヌムにおける選択 を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子（ｂｉａ）は、エシェリヒア・クリにお ける選択を可能にする。

さらに、ＤＮＡの操作は可能である。同様に、プロモーター・セグメントを交換 すると、ペニシリウム・クリソゲヌムにおける転写が改善され得る。ＡＴＧの部 位突然変異は、ペニシリウム・クリ′７ゲヌムにおける翻訳を増加させ得る。部 位指向的ま几はフラグメント特異的−非指向的であるが遺伝子特異的−突然変異 により特定のアミノ酸基を交換すると、酵素の安定性またはその活性もしくは特 異性を変化さける特定の突然変異体を単離することができる。

無作為または作為的に選択された微生物のスクリーニング（放射性ｐａｔ−ＤＮ Ａとの特異的ハイブリダイゼーションについてそれらの微生物のＤＮＡを調べる ）はまた、単離されにＤＮ　、Ａセグメントの明らかな用途である。そのスクリ ーニングの結果は、以前に未知のβ−ラクタムを生産した株、また！ｔ−Ｆ　Ａ 　Ｔ類似酵素を含むが他の特性を有する株であり得る。

この発明のＤ　Ｎ　Ａは、ペニシリウム・クリソゲヌムから単離された。その方 法は実施例ＩＯ〜１３に記載されており、第４．５および６図に示されている。

ＦＡＴのポリペプチドＩのアミノ酸配列から出発して（第５図）、４つのオリゴ ヌクレオチドを合成しく第５図：オリゴヌクレオチド混合物１〜４、第６Ｃ図） 、これらを配列決定プライマーとして使用する（実施例１１）。こうして決定さ れた配列の最初の２９塩基（第６Ｄ図）は、仮定され？＝ｐａｔ−＋ｎＲＮ、Ａ 配列と同じである（第６Ｂ図）。この形質転換の結果として、３Ｃ量体が合成さ れ（第６Ｅ図）、これをペニシリウム・クリソゲヌム遺伝子バンクからのλクロ ーンの単離における放射性プローブとして使用した（実施例１２および１３）。

ＭＩ　３ベクターへのサブクローニング後、ＤＮＡの配列決定を行った（第６Ｆ 図入この配列の最初の７７塩基は、ｃ　ＲＮ　Ａに相補的な配列の塩基３５〜１ １１と同じである（第６Ｄ図）。これらの個々の配列間の関係は、ｐａｔ−遺伝 子が実際に単離されたことを立証している。

ＦＡＴは約３８０００ダルトンの分子量を有する。１１０ダルトンの平均アミノ 酸分子量からは、遺伝子の暗号化部分について１１００ｂｐのサイズが予測され 得る。フィラメント状菌の遺伝子は普通数個のみ、次いで小さなイントロンを含 むため（バランセ、「イースト」２．２２９．１９８６年）、完全な遺伝子は記 載されたＤＮＡ分子上に存在すること、および同様に制御領域が完全形態で存在 することが推測され得る。

以下、実施例によりこの発明の説明を行うが、限定的なものではない。実施例に おいて、省略形ｘＱＳＬ　ｒｔｙ、９、ｒｐｍ、ＤＳ、ＷＶ％およびＵは、ミリ リットル、リットル、ミリグラム、グラム、１９当たりの回転数、乾燥物質、重 量／体積パーセントおよび国際酵素単位（１国際酵素単位＝１マイクロモル基質 ／分）を表す。重量部は；ｇに対する９として体積部に関するものであり、温度 ；よ摂氏で与えられている。生成物の特性検定は、次の技術、すなわち高性能薄 層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ ）、紫外線分光測光法（ＵＶ）、赤外線分光測定法（ＩＲ）および核磁気共鳴（ ＮＭＲ）を用いで実施されに。実施例において列挙された株名称に付は加えられ た番号は、株自体が寄託されているそれらの培養コレクシタン、例えばＡＴＣＣ （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシタン、ロックビル、メリーランド 、アメリカ合衆国）の登録された株記号に対応する。

フェノキシアセチル−補酵素Ａ（ＰａＣｏＡ）の製造および分析：原理：　補酵 素Ａ＋フェノキシ酢酢酸塩化物−ＰａＣｏ水氷冷やしながら、９０１！＋９のＣ ｏＡを１５ｘ１２の再蒸留水に溶かし、水酸化ナトリウム（２，５６ｄのｌＮ− ＮａＯＨおよび１．６（ＩＪ！の０．５Ｎ−ＮａＯＨ）によりｐＨ７，０にセッ トする。続いて、合計２３５ｕのフェノキシ酢酸塩化物を激しく撹：よんしなが ら分けて加え、ｐ）（値を７．０に保つ（１，８ｉＱのＩＮ　ｈａＯＨ）ｃ水で 冷やしながら１時間撹は人後、溶液を３回抽出しく毎回４０ｒ、Ｑのジエチルエ ーテルにより、ｐＨ２，０（６またはＩＮ−ＨＣＩ）で）、次いで水相をＮａＯ Ｈにより中和し、残留エーテルを回転蒸発器において室温で除去し、混合物を短 時間墾素によりガス処理し、次いで再蒸留水によりｌ：５０に希釈し、５００μ Ｑの分量でアンプルに詰め、液体窒素中で冷凍する。ＨＰＬＣを用いて分析を行 い、フェニルアセチル−補酵素Ａ（ＰｅＣｏＡ）を標準として使用する。

ＨＰＬＣシステム：ＨＰ１０９０液体クロマトグラム（ヒユーレット・パラカー ド） カラム：　ハイパージル０ＤＳ５μＩ、Ｃ１Ｂ、＋５０ｘ２００ｍｍ積分器：モ デル３３９２（ヒユーレット・パラカード）／ＡＴＴ３流速：　　　０　、５　 ＲＱ１分 検出：　　　　２３０ｎｍ 溶離剤：　３５％メタノール ６５％０．０１モルの硫酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＳ）、０．０２５ モル燐酸緩衝′ａｐＨ７，０中評価： 試料　　　　　　保持時間（分）　　面積　　　　高さ４００ｕ　９／ｘＱ　　 ＰｅＣ０Ａ　　　　　９．４１　　　８４６６９００　　　２１０６９２２００ −〃−９，６８４１０５４００１０７６８９１００−〃−９Ｊ８　　　２０９２ １００　　　５４９９０ＰａＣｏＡストツク溶液１：２００　１０．５３　　　 　１９６６６００．　　　４７７３７ＰａＣｏＡス）　ツク溶液ｌ：　５０　１ ０．６８　　　　７８５０７００　　　１７２９８３ＰａＣｏ＾ストツク溶液１ ：　４０　１０．４７　　　１０３８９０００　　　２２２４７５面積総和　− ＋１９．２ｘｙ　　ＰｓＣｏＡ／ｘ０高さ評価　→１　Ｂ、８ｚ９　　ＰａＣｏ Ａ／ｘ（１平均値　　−＋１８．０ｘ９　　ＰａＣｏＡ／ｉｆｆ実施例１ 酵素活性バイオマスの製造。

ペニシリウム・クリソゲヌムＰ２／ＡＴＣＣ４８２７＋の凍結乾燥胞子を含むア ンプルの内容物を、８ｘＱの媒質Ａ（１リットル当ｆ：りの組成：ラクトース１ ５９、フーンスティーブ・リカー（とうもろこし浸漬液）からの窒素０．１１９ ．５ｇのピッチ・ペプトン、４ｇのＮａ　Ｃ１ｓ　　Ｏ−Ｄ　ｇのＭｇ５Ｏａ− ７ＨｔＯ，０，６ｔのＫＨ，ＰＯ４，５π９のＦ　ｅＣＩｓ　・６　Ｈｔｏ、２ ＨのＣＬＩＳ０４　・５ＨｔＯ１蒸留Ｈ，Ｏを適量加えて全部で２０００ｚｆｆ 、ｐＨ４，８５、殺菌：１２０°で２０分間）に懸濁する。２２５１ρの大麦を 含む２ｇのエルレンマイヤー・フラスコに、この胞子懸濁液２１１Ｏを播種する 。満たす前に、透明になるまで大麦を水で洗浄し、２０〜３０分間媒質Ａ中で膨 張させ、ふるいによりろ過し、約１時間ろ紙上で乾燥し、続いて２Ｑのエルレン マイヤー・フラスコ中２２５ｉ（！に満たし、次いで１日間隔で約１時間１００ °で３回滅菌し、播種前に４０〜４５°で２日間で乾燥する。胞子を播種後、エ ルレンマイヤー・フラスコを短時間振り混ぜ、次に約８日間２４＝１”および相 対湿度６０±１０％でインキュベーションする。

この一定したインキュベーション期間後、菌胞子を、垂直アジテータ−において ３〜５分間＋　４０　ｒｐ＋ｍで２５０１の０．９％ＮａＣｌ＋０．１％トウィ ーン８０に再懸濁する。さらに２５０ｗＣの０．９％ＮａＣ１溶液（トウィーン は含まず）を加えた後、胞子懸濁液をＩＣの播種キャニスタ−に無菌状きて静か に注ぐ。各々２００１の媒質Ｂ（１リツトル当たりの組成　９９のフェノキシ酢 酸カリウム、ＩＤ０９のラクトース水和物、医薬媒質としての窓素２．２５９． １０．５９の（ＮＨ４）ｔｓｏ−，４９のＮａ　２　Ｓ　Ｏａ、０　、５　ｇノ Ｋ　Ｈｔ　Ｐ　Ｏ４、ｌ０ｚＣの動物油（ラード油）、２５９のＣａ　ＣＯｓ、 蒸留Ｈｚ　Ｏを適量加えて全部で１０００戻１２．ｐＨ６，５、殺菌：　１２０ °で２０分間）を含む５０本の２Ｑエルレンマイヤー・フラスコに、４°で約１ 箇月間貯蔵され得るこの播種材料８ｘＱを各々播種し、次いで２５±１で３日間 ２６０　ｒｐｍで震とうする。この震とうインキュベーション後、１８２０９の 酵素活性バイオマスが採取される。ペニンリンカ価は、パルプ（軟塊）１リツト ル当たりペニシリンＶ１．９ｇである。

実施例２ 酵素活性粗酵素調製物の製造。

実施例１で得られ？１７８６９の湿った菌糸体（＝２２０９ＤＳ）を、５ミリモ ルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％トリトンＸｌ００および０．１ミ リモルのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む３．５ρの０ ，１モル燐酸緩衝液（ｐＨ，７、５）；：再＝ｓし、ガラス製ボール・ミル中（ ５１０ｄ７の５００−７５０μ＝ガラス粒（バール）を有する６００吋の鋼製粉 砕容器、回転速度２００Ｏｒｐｍ、摩擦ギャップの幅０．１■、流速３０Ｑ／時 、前進移動２〜３°、回帰移動５°、前進移動−２０／８°および回帰移動−５ ／−１°で食塩水冷却）２／３°に冷却しながら連続的にホモジネートする。続 いて、このホモジネートを１５００Ｏｒｐｍおよび４゛で３０分間遠心分離し、 上滑を００でｏ、ｓｗｖ％のセチルトリメチルアンモニウムプロミドＣＣＴＡＢ ）と混合し、３０分間撹はんするよ沈澱した核酸を遠心分離（１０分間、１５０ ００ｒｐ斃、４゛）により分離し、固体硫酸アンモニウムを加えることにより上 清を５０Ｗ〜′％の飽和度にし、４°で一夜保つことにより、蛋白質沈澱を完了 させる。次いで、沈澱を遠心分離し、冷飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、５ Ｗ　ｖ％のソルビトール、５ミリモルのＤＴＴ、２ミリモルのＥＤＴＡおよび０ ．１ミリモルのＰ　Ｍ　Ｓ　Ｆを加えた後、次のクロマトグラフィ一工程まで４ °で貯蔵する。蛋白質測定（ブラッドフォード）または活性測定（ラクタム−超 感受性株シュードモナス・エルギノサＢＣ２４Ｂによる６−ＡＰＡ、−ＰａＣｏ Ａ−アシルトランスフェラーゼ活性の微生物学的検出）を用いて、分解または２ つの沈澱工程が行なわれる。実測値を第１表に列挙する。

実施例３ 阻害剤の追加を伴う場合または伴わない場合における酵素調製物ＡＳ−沈澱での アシル基転移活性またはペニシリン■開裂活性の微生物学的検出。

阻害剤を追加する場合または追加しない場合における、ＰａＣｏ、Ａによる６− ＡＰＡまにはイソベニンリンＮのアシル基転移およびカリウム・ペニシリンＶの 開裂に関する微生物学的寒天拡散試験において次の要領により、実施例２の記載 に従い製造された粗酵素調製物を試験する。

試験生物体二マイクロコツカス・ルテウスＡＴＣＣ／ＢＣ８：）、０゜５％播種 試験培地：　抗生物質培地１（ディフコ）、１１０ｉＱ試験プレート：　タンク ２４３Ｘ２４３Ｘ１８ｉｘ試料＝　　　ｌウェル当たり５０μｇ（直径６１ｘ） インキュベーション：　３７°、１５時間酵素：　　ＡＳ−沈澱（実施例２の記 載に従い製造された）：Ｉ酎を遠心分離（２０００Ｏｒｐｍ／　１０分）、上清 を廃棄、沈澱物を２０ｄのＲＰ＋Ｚに再懸濁。

ＲＰ＋Ｚ：　０．１モル燐酸緩衝液ｐＨ７、５÷１ミリモルＤＴＴ＋１０ミリモ ルＭｇＣＩｔ。

Ａ、アシル基転移／アシル化 マイクロタイター・プレートにおける製造：基質６−ＡＰＡまたはイソペニシリ ンＮＣ２，５ｒｔｒ９／ｚＱ）　　　１０ｐＱＰａＣｏＡ（約］　５　ｍ９／　 Ｒｆ））　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５μＱ阻害剤の使用下または 不使用下での酵素またはＲＰ□Ｚ　　７５Ｊｇ阻害剤、ａ）阻害剤不使用（＝対 照） ｂ）２ミリモルのヨードアセトアミド ｃ）２ミリモルのＰＭＳ　Ｆ インキュベーション時間の直後および／または７．３ｏおよび６０分後、２０Ｊ ｇアリコートを沈澱物から採取し、５０％エタノールによりｌ：５に希釈しく酵 素反応停止）、寒天拡散試験においてペニシリン含有量について試験する。

ＰａＣｏＡ（ＨＨφ■）によるイソペニシリンＮ（＃２８および３６）のアシル 基転移 イソベニ　　　　　　ａ）　　　　　　　　　　　　　ｂ）シリンＮ　　　ｓ　 　　７’　　３０’　　　６０′ｓ　　　７’　　　３０’　　　６０’＝２８ 　　　２２．５　２５，５　２６．０　２３．０　　　２１．１　２０．８　１ ε、３　１４．７：３６　　　２７．０　２８４　　Ｂｏ、８　２８，７　　　 ２５，２　２５．０　２３．６　２２．１イソペニシリンＮｈμ９ノ１ｇ　イソ ペニシリンｖｈμ９／πＱ５０　　２５　１２．５　　　２．０　１．５　１． ０　０．５　０．２５＃２Ｂ　　　　２０　　　１６．５　　１２．４　　　　 　２５゜３　　２４，０　　２１．７　　１７．８　　９．フ；！：３６　　２ ４．５　２２，１　１８．４＃２Ｂ　　　２２，７　２４．７　２５．７　２０ ．７４３Ｂ　　　２６，３　２７．２　２７，７　２６．７酵素希釈率により異 なるＰａＣｏＡによる６　−Ａ　Ｐ　、Ａのアシル化１１！、３　２４，４　２ ４，３　１５．７　　１Ｌ６　２５．４　２８．５　２５．４ｓ　　　７′３０ ′６０’　　　　　ｓ　　　　７’　　　　３０’　　　６０’１６．０　２４ ．２　３０，７　３０，７　　１４．５　２１．３　２６．７　２７．０１４Ｊ 　　１７Ｊ　　２０．６　２２．８　　　０　　　９．６　１０．５　１１．１ ２５Ｊ　　　２４．０　　２１．７　　１７．８　　　９．７Ｂ、ペニシリンＶ 開裂 マイクロタイター・プレートにおける製造：カリウム・ペニシリン■　　　１０ ０μ９／１１ｇ　　　　ｌＯμＱＯ，１−１−ル燐酸緩衝液ｐＨ７，５１５μ＋ ２酵素またはＲＰ−！−Ｚ（−阻害剤）　　　　　　　　　　７５μＱａ）阻害 剤不使用（＝対照） ｂ）＋２ミリモルのヨードアセトアミドｃ）＝２ミリモルのエチルマレインイミ ドｄ）−２ミリモルのＰＭＳＦ ｅ）ＲＰ＋Ｚ 様々な阻害剤の存在下におけるカリウム・ペニシリンＶ（ＨＨφ製仄）の開裂。

２５．７　２１．８　０　　０　　　２５．７　２３．１　０　　　０２５．０ 　２３．０　０　　０　　　２５．３　０　　０　　　０ｅ）　　　　　　　カ リウム・ペニシリンＶ　ｈ　ｕ９／ＭＱｓ　　　７’　　３０′６（１’　　　 ２．０　　１．５　　１．０　　０．５　　０．２５２Ｂ、８　２５Ｊ　　２６ ．２　２６．４　２７，４　２４，７　２３．４　１８．４　１１．９比較とし てのアシル基転移 ６−ＡＰＡ−＋−ＰａＣｏＡ　−ｓ　　　７’　　３０’　　６０’ペニンリン Ｖ　　　　　　１７．０　２３．２　２６，９　２５．９実施例４ ＦＡＴの活性化、阻害、安定化およびｐ）（プロフィール。

実施例２の記載に従い製造されたＰＡＴ−硫酸アンモニウム沈澱を、様々な活性 剤または阻害剤または安定剤の存在下、０．１モル反応緩衝液により１：１０に 希釈し、微生物学試験モデルにおいて直後または４°または一２０°で１日イン キコベーンヨン後に、６−ＡＰＡ、−ＰａＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性 について試験する。結果を第２表に要約する。

実施例５ ＰＡ、Ｔの温度安定性。

実施例２の記載に従い製造されｒ二ｐ　Ａ　Ｔ−硫酸アンモニウム沈澱を、１ま たはｌＯミリモルのＤＴＴを含む０．１モル燐酸緩衝液ｐ）１７．５により１： ２０に希釈し、次に厳密に遠心分離し、上清を、−１９６°、−２０’　、−１ −４°、＋２０°および＋３７°での一定したインキュベーションに付し、微生 物学試験モデルにおいて直後まｆ二はｌ、４．２６および１２０時間後に６−Ａ 、ＰＡ−ＰａＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性について試験する。結果を第 ７表に列挙する。

実施例６ フエニルセフ７０−スＣｌ−４Ｂにおける疎水性相互作用クロマトグラフィー（ ＨＩ　Ｃフロー）および６−ＡＰＡ−ＡＨ−セファロース４Ｂにおけるアフィニ ティー・クロマトグラフィー（アフィニティー・フロー）によるＦＡＴの精製。

実施例２の記載に従い製造されたＦＡＴ−硫酸アンモニラ÷沈澱２４０９を、１ モル（ＮＨ，）ｔｓｏ、および１ミリモルＤＴＴを含む５０ミリモル燐酸緩衝液 （ｐＨ７，５）２０００ｘ（ｌに溶かし、−４°での冥験用冷却チャンバ中、２ ００ｘＩ２の平衡状態のフェニルセファロースＣｌ−４Ｂを仕込んだＢＰ１１３ −カラムに加える。続いて、カラムを、流速５０ｉｊ／分で１モル（Ｎ　Ｈ，） ｔｓＯ□および１ミリモルＤＴＴを含む３基礎容量の５０ミリモル燐酸緩衝液ｐ Ｈ７，５により洗浄し、次いで、１ミリモルのＤＴＴを含むさらに２基礎容量の ５０ミリモル燐酸緩衝液ｐｌ（７，５によりバラスト蛋白質を除去し、次いて、 １ミリモルＤＴＴを含む３基礎容量の脱イオン水（Ｅ　　ＨｔＯ）によりＰＡＴ −酵素を溶離し、活性フラクションを、１０ｋＤのカット−オフを有するポリス ルホン限外ろ過膜を用いてベリコン・カセット・システム中で１０分の１の容量 に濃縮し、ｌＷＶ％ソルビトール、５ミリモルのＤＴＴ、２ミリモルのＥＤＴＡ および０．１ミリモルのＦＭＳＦにより安定化させ、次のクロマトグラフィ一工 程まで一２０°で冷凍する。微生物学的に確立された６−ＡＰＡ−ＰａＣｏＡ− アシルトランスフェラーゼ活性および１基礎容量を含む個々のフラクシヨンの総 蛋白質含有量を下表に要約する。

ＰＬ１５０／ｌ　　　１７　１８　　　　　０　　　　　　　　２３０ＰＬ１５ ０／２　１６　１５　　　　　０　　　　　　　　１０２ＰＬ１５０／４　　　 ０　　　０　　　　　　　０　　　　　　　　　　２７５０ＰＬ１５０１５　　 　０　　　０　　　　　　　０　　　　　　　　　　　３９０ＰＬ１５０／６　 　痕跡　１５　　　　　０　　　　　　　　　５２ＰＬ１５０／７　　１８　　 ３１　　　　　　　０　　　　　　　　　　　３８９ＰＬ１５０／８　　　０　 　　０　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　１４翌日、注意深い条件下で ＨＴＧフラクションの活性保持物質（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を解凍し、５０ｉ１ ２のアフィニティー・マトリックス６−ＡＰＡ−ＡＨ−セファロース４Ｂを含む に２６／４０フアーマシア・カラムに加える。これは、ＬＫＢ−記録「プラクテ ィカル・ガイド・フォー・ユース・イン・アフィニティー・クロマトグラフィー ・アンド・リレイテッド・テクニクス」、ルアクタフ・ＩＢＦ−ソンエテ・キミ ク・ポワンツージラール、フランス１９３３、＋３３頁に従い、Ｅ、ＥＤＱによ りペニシリンＧをＡＨ−セファロース４Ｂ（ファーマシア）にカップリングし、 続いてエシェリヒア・コリの可溶性ペニシリンＧ−アミダーゼによりフェニル酢 酸を開裂することにより製造されたものであった。次いで、カラムを、下記媒質 により４°および流速３ｚＱ／分で溶離する。

ＡＬ２７Ｂ／ｌ：　　１２基礎容量の５０ミリモル燐酸緩衝液ｐＨ７。

５＋１ミリモルＤＴＴ＋０．１モルＮ　ａ　Ｃ＋ＡＬ２７Ｂ／２：　　３基礎容 量の同緩衝液÷１ミリモルＤＴＴ＋０゜１モルＮａＣ１＋　１ミリモル６−ＡＰ ＡＡＬ２７８／３：　　６基礎容量の同緩衝液中１ミリモルＤＴＴ＋　１モルＮ ａＣ１＋１ミリモル６−ＡＰＡ 特異的溶離剤６−ＡＰＡによりフラクシヨン２７　ｇ／２において溶離されたＦ ＡＴ活性を、１０ｋＤのカット・オフを有するポリスルホン−ＵＦ−膜を用いて ミニタン・カセット・システム中で１０分の１の容量に濃縮し、再び安定性混合 物ｌＷ■％ソルビトール、５ミリモルＤＴＴ、２ミリモルＥＤＴＡおよび０．１ ミリモルＰＭＳＦと混合し、分割して急速冷凍する。ＨＰＬＣ測定により少なく とも５０％純度であるこの酵素調製物の基質特異性を、第４表に記録する。

実施例７ モノＰ／ファーマシアにおけるアフィニティー・クロマトクラフィーにより製造 され？＝　Ｆ　Ａ　Ｔ酵素調製物のクロマトフオーカシング（クロマトフオーカ シングＡＬ３１０）。

アフィニティー・クロマトグラフィーにより実施例６の記載に従い精製され、濃 縮されγ：ＦＡＴ酵素調製物のｌｆｆ１２分量を、注意深く解凍し、次いで平衡 状態のＰＤＩＯセファデックスＧ２５充填カラムにおいて２５ミリモルのビスト リス／ＨＣ１１衝液（ｐＨ６，３）と緩衝液交換を行い、次いで同緩衝液により 平衡状性にさメ−た４＊ＱＦＰＬＣモノＰ充填カラムに加え、すぐ後に流速６０ ｘＱ／時で１＝１０希釈ボリバファ−７４（ｐＨ４，０に設定）１００ｘ１２に より溶離し、次いてピークごとに分画化する。これらのフラクションについては 、最初の形態またはセントリコンｌＯにより１０倍濃縮して、ＲＰＣ。

５ＤＳ−勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動、インモビリンに基づく等電点電 気泳動およびゲルろ過により分析を行う。

第１図は、モノＰにおけるＰＡＴ−酵素の溶離プロフィールを示す。多機能酵素 は、少なくとも３種の等電形＠（ＰＡＴ３１Ｏ／３、ＰＡＴ３１０／４およびＰ Ａ′Ｔ３１０１５）に分解される。異なる電荷を有するこれらの酵素変異型は、 真のアイソザイムま几は同じ酵素の異なる酸化還元形態を表し得る。

第２図から明らかな通り、ペニシリウム・クリソゲヌムのチオール依存性ＦＡＴ は、ＲＰＣの変性条件下で（カラム−バイオラド・ハイ・ポアＲＰ３０４．２５ ０Ｘ４．６ｕ＋、ＨＰＬＣ−パラメーター　：　０　、５　ＭＱ１分、４５バー ル、２８０ｎｍ、４０°、２５μＱ注射容量、溶離剤Ａ：０．０１％トリフルオ ロ酢酸を含む３５％水性アセトニトリルおよび溶離剤Ｂ：０．０１％トリフルオ ロ酢酸を含む８０％水性アセトニトリル間での一次勾配、３０分）、１つのポリ ペプチドｌ、並びにイソ−または酸化還元−変異型によって、１種または２種の 可変性疎水性ポリペプチド変異型２ａおよび２ｂに分解される。

５ＤＳ−勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第３ａ図参照、レムリ、「ネイ チャー」２２７．６８０−６８５頁、１９７０年による条件、Ｌだし、８−２０ ％Ｔによる勾配ゲル）では、Ｐ　ＡＴ−酵素は、約３０および８ｋＤの分子量を 有する、様々なサイズの２種のポリペプチドに分解される。ＲＰＣおよび後続の ５ＤＳ−勾配−ＰＡＧＥを用いると、ＲＰＣにおいて最初に溶離されるポリペプ チド１は、約３０ｋＤ級分と同一であり、２種のさらに強力な保持された疎水性 ポリペプチド２ａおよび２ｂは、８ｋＤと同一であることが立証され得る。さら に、その多次元分析により、５ＤＳ−勾配−ＰＡＧＥにおける小ポリペプチド２ ａおよび２ｂは同じ移動性を宵し、塩基性イソ−まｆ二は酸化還元−変異型の大 きい方の約３０ｋＤポリペプチドｌは、酸性の強い形態の対応するポリペプチド １よりも迅速に移動することが示され得る。

アンホリンに基づく等電点電気泳動（ＩＥＦ）の間（第３ｂ図参照、ＬＫＢアプ リケージタン・ノート１８０４による方法論的手法）、活性親和性ブールｉヨ、 ５．１に等電点を有する互いに近接した３つの帯を示す。

インモビリンに基づく高度溶媒ＩＥＦの狭いＰＨ範囲においては（第３ｅ図参照 、ＬＫＢアブリケーンヨン・ノート１８１９による方法論的手法）、クロマトフ オーカシングにより分離されるＦＡＴ−変異型は５，１５．５．０６および５． ３２のｐｉ−値を有する。

ファーマンアノスーパロース１２におけるゲルろ過により分子量を測定すると（ 溶離剤：１ミリモルＤＴＴを含む０．１モル燐酸緩衝液ｐＨ７，５，０，４πＣ ／分）、３６．５ｋＤの分子量が測定され、またＬ　Ｋ、　ＢのＴＫＳ−Ｇ２０ ００ＳＷでは（同じ溶離剤、ｏ　、　５　ａ（１／分）、３８ｋＤの分子量が測 定される。これは２種の変性ポリペプチド１および２の合計と正しく相関してい る。

実施例８ ポリペプチドｌ並びに２ａおよび２ｂのＮ−末端配列決定。

実施例６の記載に従いアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製されたＰ ＡＴ醇素酵素物の別の分量（２ｕ蛋白質）を、注意深く解凍後（実施例７の場合 と同じカラムおよび条件、ｆ二だし、フラッタ−増加勾配：分／％Ｂ＝０１０． ８１０．２０／１２．２５／１２．３０／＋００．３３／１００．３６１０．４ ０１０）、ＲＰＣにより２回分離し、ポリペプチド】並びに２８および２ｂを含 むフラクションを凍結乾燥し、蛋白質シーケンサ−においてＮ−末端配列決定を 行う。

Ｎ−末端アミノ酸配列： ３０ｋＤ単位／ポリペプチド１：部分配列１８ｋＤ単位■／ポリペプチド２ａ： 部分配列６１５　　　　　　　　　　　１ｏ　　　　　　　　　　　　１５　　 　　　　　　　　２０Ａｌｅ−Ｌｙｓ−ＡｌトＶａｌ−Ｗｅ−Ａｌａ−ｋｇ−５ ・ｒ−１１ｅ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ａｌｓ−Ｖａ←Ａｓｐ−８ｋＤ単位ｎ／ポリペ プチド２ｂ二部分配列６＋　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　１ ０　　　　　　　　　　　　　Ｉｓ　　　　　　　　　　　　２０Ａｌａ−Ｌｙ ｓ−−ＶｍＨｌｅ−Ａｌａ−＃０−−−１１ｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａ ドＡｓｐ−Ｌｅｕ−−−Ｇｙ−−Ｔｈｒ−ＳＤＳ−勾配−ＰＡＧＥの場合と同様 、ＲＰＣにおいて異なる保持性を有する小ポリペプチド２ａおよび２ｂは、配列 決定された分子部分において区別されない。

実施例９ ポリペプチド１および２の蛋白質分解性ペプチド・フラグメントの配列決定。

実施例８の記載に従い製造されるポリペプチドｌまた（よ２の凍結乾燥フラクシ ョンを、Ｊ、Ｍ、ウィルキンソン（「プラクティカル・プロティン・ケミストリ ー−ア・〕１ンドブツク」、Ａ、ダーブル編、１９８６年）に従いトリプシンま たはリシル−エンドペプチダーゼ１こより酵素的に開裂し、個々のペプチド・フ ラグメントをＲＰ　Ｃ１こより単離し、蛋白質シーケンサ−において配列決定す る。中でも下２己のアミノ酸部分配列が得られる。

ＡＳ一部分配列２（ポリペプチド１のトリブチツク・ペプチド・Ｇ　１ｙ−Ａ　 ｌ　ａ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｎ−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｙ　ｒ−Ａ ｓｐ−Ｈｉ　ｓ−Ａ　１ａ−Ａ　ｒｇ−ＡＳ一部分配列３（ポリペプチドｌのト リブチツク・ペプチド・フラグメント）： Ｐｒｏ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｍｅ　ｔ−Ｐ ｈｅ−Ｖａ　ｌ　−Ｍｅｔ　−Ａ　ｒｇＡＳ一部分配列４（ポリペプチドｌのト リブチツク・ペプチド・Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−＾ ｓｐ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−ＡｒｇＡＳ一部分配列５（ポリペプチドｌのト リブチツク・ペプチド・Ｍｅｔ−Ｃｉｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−−Ａｓｐ−Ｃｉｌ ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＬｙｓＡＳ一部分配列７（ポリペプチド ｌのトリブチツク・ペプチド・１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ− Ｔｈ　ｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇ　１　ｎ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｔｙ　ｒ−Ａ ｓ　ｐ−Ａ@ｒｇ ＡＳ一部分配列８（ポリペプチドｌのトリブチツク・ペプチド・フラグメント） ： Ｖａ　１−Ｇ　ｌｙ−ＰＭｅ−Ａｓ　ｎ−５ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ　 Ｉ　−Ａ　Ｉａ−Ｖａ　１−Ａｓ　ｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａ@］　］ａ−Ｌｅｕ Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇ 　１ｙ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｈｉｓ　−１１ｅ−Ａ@ｌａ− Ｌｅｕ−Ａｒｇ ＡＳ一部分配列９（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・Ｔｈｒ−Ｇｌｕ −Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＬｙｓＡＳ一部分配列１０（ポリ ペプチド２のトリブチツク・ペプチドＴｙｒ−Ｔｙｒ−−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒ ｇＡＳ一部分配列１１（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメン ト）： Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ＡＳ一部分配列１２（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチドＳｅｔ−１１ｅ −Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＡｒｇＡＳ一部 分配列１３（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチドＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ −Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ｖａ　１−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｎ−Ｔｈ　ｒ−Ａ　ｒ ｇＡＳ一部分配列１４（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチドＧｉｎ−Ｖａ ｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｒ＋−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇＡＳ一部分配列１５（ リシル−エンドペプチダーゼによるポリペプチド２のペプチド・フラグメント） ： Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＧｉｕＡＳ一部分配列１６ （リシル−エンドペプチダーゼによるポリペプチド２のペプチド・フラグメント ）： Ｔｙｒ−τｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＋１ｅ−Ａｌａ− ＬｙｓＡＳ一部分配列１７（リンルーエンドペプチダーゼによるポリペプチド２ のペプチド・フラグメント）： ０Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ− １１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ＡＳ一部分配列１８（リシル−エンドペプチダーゼによるポリペプチド２のペプ チド・フラグメント）： Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−人５ｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ− Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−＾ｓｎ−Ｔｈｒ−ＡｒｇＡＳ一部分配列＋９（ポリペ プチド２のトリブチツク・ペプチドＡｌａ−ｖａｌ−１１ｅ−Ａｌａ−ＡｒｇＬ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＬｙｓＡＳ一部分配列２１（ ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチドＧｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ ＡＳ一部分配列２２（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチドＶａｌ−１１ｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＡｒｇＡＳ一部分配列２３（リシル−エンドペプチダーゼに よるポリペプチド２のペプチド・フラグメント）： Ａｓｎ−Ｔｈｒ−−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −ＬｙｓＡＳ一部分配列２４（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラ グメント）： Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ 実施例１０ ペニシリウム・クリソゲヌムの菌糸体からのポリ（、Ａ）Ｒ，ＮＡの単離。

ペニシリウム・クリソゲヌムＰ　２／ＡＴＣＣ４Ｂ　２７　］の胞子懸濁液を、 ２５　Ｏｒｐｍでのアジテータ−において、約７０時間２５゛で各々］、００ｉ ＱのＣＤ５−培地（ＩｃのＣＤ５−培地の場合、オートクレーブ処理により、９ ００ｙｆ２の溶液Ａ：３９のＮ　ａ　Ｎ　Ｏｓ、０．５９のＭｇ５Ｏ−，７Ｈｔ Ｏ１０，５９のＫＣＩ、０．１９のＦｅＳＯ４・２Ｈｔ０゜５９の酵母抽出物、 ＩＯ２のカゼイン・ペプトン、２０９のサッカロース、ｐＨ５、８および１００ ｉＱの溶液Ｂ：２５０ミリモルのＫ　ｔ　ＨＰＯ，／ＫＨ，ＰＯ，、Ｐ）（５、 ８を混合する）を含む５本のエルレンマイヤー・フラスコ（各々１０００ｚ（ｉ ）中でインキュベーションする。各々３００藁ｇのＣＤＬＰ−培地（ＣＤＳ−培 地と同じ組成、１こだし、２０９のサッカロースの代わりに、１５０ｇのラクト ース／Ｑおよび５０ｘＱの１０％フェノキシ酢酸［水に溶解、ＫＯＨによりｐＨ ７，５に設定］）を含む１２本のエルレンマイヤー・フラスコ（各々１０００π Ｑ）に、各々３０岬の前培養物を播種し、２５０　ｒｐｍのアジテータ−中２５ ゛で４０時間インキュベーションする。ビュフナー漏斗を用いて菌糸体をろ過し 、ＴＥ（１０ミリモルのトリス／ＨＣＩ、ｐ）（８，１，１ミリモルＥＤＴＡ、 ）により簡単に洗浄し、液体窒素中で微細粉末に粉砕する。この粉末を溶解緩衝 液（５モルのグアニジン・モノチオンアナート、１０ミリモルＥＤＴＡ、５０　 ミリモルのトリス／）（Ｃ１、ｐＨ７，５，８％β−メルカプトエタノール）（ 湿った菌糸体の塊１ｇ当たり３ｖＱ溶解緩衝液）に懸濁し、室温で１時間撹はん する。全ＲＮＡの単離：よ、記載された方法（カサラ等、ＤＮＡ２．３２９−３ ３５頁、１９８３年）に従い行なわれる。６０ｇの湿った菌糸体の塊からは、約 １８９の粗ＲＮＡが単離され得る。これを二の濃縮は、マニアチス等の記載Ｃモ レキュラー・クローニングｊ１コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２年） に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロース−アフィニティー・クロマトグラフィーによ り行なわれる。この目的の場合、粗ＲＮ　Ａを遠心分離し、乾燥し、水に溶かす 。りｊマドグラフィー後、ポリ（Ａ）ＲＮＡを含Ｃフラクションを再びエタノー ルにより沈澱させ、−７０°で貯蔵する。ポリ（Ａ）”ＲＮＡの正常性をグリオ キサルの存在下でゲル電気泳動により試験しくマニアチス等）、Ｕ■−吸収によ り濃度を試験する。

実施例１】 酵素ＦＡＴをコードするＲＮＡの部分配列決定。

遺伝子コードを基礎として、ＤＮＡ配列は、ＦＡＴのポリペプチドｌのアミノ酸 配列から誘導される（実施例８）（第５図）、最少数の異なる配列を可能にする １７ｂｐの範囲を、オリゴヌクレオチド混合物の合成用に選択する。目的とする 鎖、すなわちまγ：ＲＮＡに相補的である４種の異なるオリゴヌクレオチドの４ 種の混合物を合成する（第５図におけるオリゴヌクレオチド混合物ｌ、２．３お よび４）。

これらのオリゴヌクレオチドを酵素的に燐酸化し、すなわち放射性標識する（マ ニアチス等）、１５１１９のオリゴヌクレオチドを、３０分間３７°で２５０μ ＣｉのＡＴＰを含む１２ｇｇの反応調製物（５０ミリモルのトリス／ＨＣＬ　ｐ Ｈ９，５，１０ミリモルＭｇＣｌ、、５ミリモルＤ　Ｔ　Ｅ　％　５％グリセリ ン）中、１６単位のポリヌクレオチドキナーゼとインキユベーションする（アマ −ジャムＰＢ１０２１８）。

２５０ミリモルのＫＣＩ、１０５９モルのトリス／ＨＣＩ％ｐＨ８，３中１０μ ９のポリ（Ａ）’　ＲＮＡ（実施例１０）を、０　、５　ｘ（ｌの反応容器中で ２μｇの３２−Ｐ−標識オリゴヌクレオチド混合物と混合する。

混合物を２分間７５°に加熱し、次いで４５分間５０°で温める。

４つのエッペンドルフ容器の各々に、３３μＱの反応緩衝液（２４ミリモルのト リス／ＨＣＬ　ｐＨ８，３，１６ミリモルＭｇＣｌり、８ミリモルＤＴＥ、０． ４ミリモルｄＡＴＰ、０．８ミリモルｄＧＴＰ。

０．４ミリモルｄｃＴＰ、０．４ミリモルｄＴＴＰ、６単位の逆転写酵素を加え る。さらに各々は、ｌμＱの１ミリモルｄＡＴＰまたはｌμｇの１ミリモルｄＧ ＴＰまたは１μＣの１ミリモルｄｃＴＰまｔは１μ＋　。

Ｃの１ミリモルｄＴＴＰを有する。２μｇのポリ（Ａ）　　ＲＳＡ−オリゴヌク レオチド混合物を加えた後、エッペンドルフ容器の内容物を短時間遠心分離にか け、５０゛で４５分間加熱する。２μＣの停止緩衝液（９９％ホルムアミド、０ ．３％ブロモフェノール・ブルー、０．３％キシレンーンアノール）を加え、３ 分間沸騰させることにより、反応を終結させる。４μＱの各試料を、８％ポリア クリルアミド／尿素ゲルに適用し、４０Ｗ（セキ・ゲン、バイオラド）で２．５ 時間暴露する。その後、ゲルを２０分間５％メタノール、５％酢酸中に置き、８ ０°で１時間乾燥する。冷却したゲルを家庭用ホイルに包む。Ｘ線フィルム（コ ダックｘＯマットＡＲ）を２０時間適用する。このＸ線フィルムから読取られる 配列を再生する。

１〜２９位は、ＦＡＴのポリペプチド１のアミノ酸配列（第５、ＣＤ図）から誘 導されるＤＮＡ配列に相捕的である。この配列の最初の３０ヌクレオチドを含む オリゴヌクレオチドを合成する。

実施例１２ ペニシリウム・クリソゲヌムのゲノム遺伝子バンクの構築。

ＣＤ５−培地で洗浄し１ニペニンリウム・クリソゲヌム培養の菌糸体（実施例１ ０）からＤＮＡを単離する。菌糸体を液体窓素中で粉砕し、次いで１％サルコシ ル、０．１モルＥＤＴＡ％ｐＨ８，１００μ９プロテイナーゼに／ＲＱ（１９菌 糸体／　２５１Ｉ２）に加え、３７°で４８時間撹はんする。混合物をフェノー ルで３回抽出し、０１体積部の３モル酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）を加えた後 、エタノールにより沈澱させる。続いて、ＣｓＣ１−ＥｔＢｒ遠心分離を行い（ マニアチス等）、イソアミルアルコールにより抽出し、ＴＥで透析しに後、Ｕ■ 吸収により濃度を測定する。さらに、アガロース−ゲル電気泳動に上りＤＮＡを 試験する。３００μこのペニシリウム・クリソゲヌムＤＮＡを、ＵＳａｕ３Ａ（ ＢＲＬ）において３７゛で６０分間ｌＯミリモルのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ７，５ ，１０ミリモルＭｇＣ１ｔＳ　１ミリモルＤＴＥ、５０ミリモルＮａＣ＋中で開 裂する。開裂の種変をアガロース−ゲルで試験する。Ｄ　Ｎ　Ａの大部分はＩＯ ないし２Ｏｋｂ間のサイズを有するのが望ましい。次いで、ＤＮＡを２つ９　Ｎ 　ａ　ＣＩ勾配（ＴＥ［ＩＯミリモルのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１ミリモ ルＥＤＴＡ］中２０％ＮａＣ１を含む２本のベックマン−Ｓ　Ｗ２８　、１超遠 心分離管を冷凍、次いで解凍することにより製造）に適用し、ローター５Ｗ２８ ．１中に置い几超遠心機において＋４０００ｒｐｒｒｌで１６時間遠心分離を行 う。管の内容物を分画する。１ｏｋｂよりも大きいＤＮＡを含むフラクションを 合わせ、ＴＥで透析する。ＤＮＡを濃縮（５００、ｌ／ｒ＝Ｑ）後、それを、Ｂ ａｍＨｌおよびＥｃｏＲＩにより開裂しておいたλ−ＥＭＢＬ３−ＤＮＡ（フリ シャラフ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」１７０．８２ ７−８３２頁、１９８３年）により精製する。０．５ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガー ゼを加えに後、それを、３０ミリモルのトリス／ＭＣ１，ｐＨ７，５、ｌＯミリ モルＭｇＣＩｔ、ＩＯミリモルＤＴＥ、２，５ミリモルＡＴＰ中１６°で一夜ラ イゲーションする（ＤＴＥ濃度２００　ｕ９／ｒｎＱ、ベクタ一対ベニンリウム ・クリソゲヌムＤＮＡのモル比１　：ｌ）。このライゲーンヨン混合物を、蛋白 質抽出物（ｒパッケージング・ミリシーズー、マニアチス等）で補助しながらイ ンビトロ包装する。生成しｒ；λ〜リゼイトを指示株＼Ｍ５３９（フリシャラフ 等）で滴定する。

ｔｏ＠ｐｒυが得られる。

実施例１３ ＰＡＴ−特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションするλ−クローン の単離。

株ＮＭ５３８（フリシャラフ等）による、λ−ＥＭＢＬ３におけるペニシリウム 、クリソゲヌム遺伝子バンク（実施例１２）の４００００の組換えファージを、 ０．７％アガロース中９０ｉｘ（’＞ＴＢ−プレート（ＴＢ培地は、１リツトル 当たり１．０ｇのバクトートリプトンおよび５９のＮａＣ１を含み、ＮａＯＨに よりｐ）（を７．５に設定する）に放す。これらのプレートの２つの型（印象） をナイロン・フィルター（アマ−ジャム・ハイボンドＮ−フィルター）上で作成 する。ＤＮＡをＵ■固定した後、これらのフィルターをハイブリダイゼーション に用いる。ＦＡＴのポリペプチドｌのアミノ酸配列から誘導されるＤＮＡ配列に 相捕的な配列を有する、実施例１１に記載されｙ＝３０量体に、放射性陣識を行 う（実施例１１記戦のＴ４−ポリヌクレオチド−キナーゼ反応）、６ＸＳＳＰＥ （Ｉ　Ｘ５ＳＰＥは、０．１５％ル、ＮａＣ］、１０ミリモルＮａＨｔＰ０４． １ミリモルＥＤＴ、へ、ｐ）１７゜４である）、３０％ホルムアミド、５Ｘデン ハード、Ｏ１％ＳＤＳ。

１００　ｕ９／ｌＯニーシン精子ＤＮＡ、０．１ミリモルＡＴＰ、３ｎｇ／ｚ（ ｉ３２−Ｐ−標識オリゴヌクレオチド中３７゛で約２０時間ハイブリダイゼーシ ョンを行う。次いで、フィルターを、２ｘＳＣＣ（Ｉ　ｘＳＣＣは、０．３モル ＮａＣＬ　０．０３モルくえん酸ナトリウム、ｐＨ７，０である）、０．１％Ｓ ＤＳにより室温で１０分間３回洗浄し、次にｌＸ５ＣＣ，０，１％ＳＤＳにより ５６°で２θ分間３回洗浄し、乾燥後、オートラジオグラフィーを行う。ｘａフ ィルムにおけル陽性ハイブリダイゼーション・シグナルに対応する、オリジナル ・プレートのアガロース層における領域を、滅菌し１ニバスツール・ピペットに より採取し、ＳＭ−緩衝液（５，８９のＮａＣ１，２ｇのＭｇ５Ｏ，・７Ｈ１０ および５０πＱのＩＭ）リス／ＨＣＩ、ｐＨ７，５）に再懸濁する。また、指示 株としてのＮＭ５３８による適当な希釈物をＴＢ−プレートに放す。これらのプ レート上のファージをナイロン・フィルターに移し、上記と同様にハイブリダイ ゼーションする。

対応する組換え入−ファージを、２番目に陽性シグナルを与えるプラークから単 離する。これらのファージの精製ＤＮＡは、制限分析およびサザーン・ハイブリ ダイゼーションに使用される。さらに、プラスミド（ｐＵｃ１２、メッシング、 「メソッズ・イン・エンザイモロジー」１０１．２０．１９８３年）およびＭ１ ３−ベクター（Ｍ１３ｍｐ１Ｂ、Ｍ１３ｍｐ１９、ノランダー等、「ジーン」２ ６．１０１．１９８３年）においてサブクローニングを行う。オリゴヌクレオチ ドを有するＭ１３ｍｐ１９−サブクローンの配列決定により、下記配列が与えら れる。

ＲＮＡを用いて確かめられた（実施例１１）ＤＮＡ配列のヌクレオチド３５〜１ １１は、このＤ　Ｎ　Ａ配列のヌクレオチド１〜７７と適合する（第６Ｆ図）。

実施例１４ Ｐ　、Ａ　Ｔ遺伝子のＤＮＡ配列。

第４図において、このＤＮＡ配列の位置を２本の水平線１こより表す。１は最初 のヌクレオチドに対応し、１９７２は最後のヌクレオチドに対応する。

０丁Ｔｃ＾ＴＣＴＣＣＣＡＴＣＡＩ：ＴＣＴ’ＣＡＴＯＣＴＡＴＧＣ；ＴＣＣＣ ＡｃＡτ丁ＣＣτｍＡｃ０ＯｃＡＡＴＡ丁ＡＡＡＴＣＴＣＡbＣＡＴＧＣＡ σ口’ＣＣαでπｔ＾−ＴＣ＾πＣＣＣＡαスα）ＣＣσ口Ｔσに講式１℃　　 　　　　　　　　　　　　　　ＡＣＣＣ１５０１６０１フ０　　　　　　　１８ ０　　　　　　　１９０　　　　　　　２００　　　　　　　２１０ＡＴＣＴｒ ＣＣＣＡＣＣＣｃｃＡＯＣＡＣＡＡＡ−×π−シｒｃＡＴｃｃ’ｒｃｒｃ；−シ Ａ０χＡ　　　　　　　　　　＾Ａσ■℃１ズ詰■ 丁ＣＭ丁ＡＣＣＡＧＡＴｒＴ丁ＴｒＣＣ’！ＴＣＴＣＡＡＴＣ丁τＣＣｃＡｃＴ ｒｃＴｃＡＣＣτＣａτＣＣＡＣＡＴＣＯＯＣτＡＣＣＭＣ`ＴＣＩＯＣＴ ２９０　　　　　３００　　　　　３１０　　　　　３２Ｇ　　　　　　３３０ 　　　　　３４０　　　　　３５０Ｗχ！：ＡＡＡＯＣＣ（ＴＣＡＴＡＱＣＣ） Ｊ：ａＡＡＣＡシＬＴ！’ＣＡＣＴＩ℃αχで式χｖ’ＴＣＴＣＡ？ＣＣＧＡα χ論人ん暖℃Ａ`ＣＡＡ ＣＡＣＣｉＣＡＣｃＡＡｃＡＯＣＴｒＡＡＡＣＡＯＣＴＡ（ＴＣＴＣＯＣＡＡ　 　　　　　　　　　　　　　ＴＣｃ＾ＧＧＡ＾＾Ｇ＾τ０ｃbＣＣＡ八Ａ丁ＡＣ ＯＣＱＣＣＣ；ＡＣｒＡＡへロ工℃τ買刀１℃　　　　　　　　　　　　ＣＣＡ ＡＡＱＡｃＡＡｃＣＴｃＡＴＣＣＯＣＴＴＡＡαンｒＴｃｃf？ ７１０　　　７９０　　　　Ｂｏｏ　　　−’８１０　　　８２０　　　８３０ 　　　８４０ＣＡＣＣ；Ｃα：ＣＡＣＴｒＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴ ＡＡＣＣＣＡαｍｎシ＋ＴＣＣＡズーＡα＝−χｖｉτんＩｃＡｃＴＧ８５０　 　　　　１１６０　　　　　８７０　　　　　１１８０　　　　　８９０　　　 　　９００　　　　　　Ｑ１０Ｃ００ＯＣ−ＣＴＣＯＣＣＣＴＣＡＡＴｒＡＣＡ ＡＣＯＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　ｃbＡ丁Ａ丁 ＴＯＣＣＣＴＣＣＯ：ＡＴＡＱＣＯＣＴ℃ＣＡＡＡＱＣＡσ口℃−χゴｉズ℃Ａ ＤＣＣＣＴＡ　７シＣαχｖ式ｘτα論０シ請α℃α論９９０　　　　１０００ 　　　　　！０１０　　　　１０２０　　　　１０３０　　　　１０４０　　　 　１０５０＾τα℃α℃Ｃ＾αχＣτ＝τＡτＣＡ−χπαχＣんりαχ℃＾α 話αχ涛Ｔ口℃ＣＴ口℃αＡＡＴＴσｒｃｃｃｃｃＡｃｃ＾ＣＡＣＡ（ｊス刀工 ＋ＣＡＣ 実施例１５ ＦＡＴ遺伝子のＤＮＡ配夕し このＤ　Ｎ　Ａ配列では、このＤＮＡ配列の暗号化能力を存する実験的に決定さ れたアミノ酸部分配列との比較により暗号化領域を確立した。すなわち、この遺 伝子には３つのイントロンの存在することが示されている。さらに、それらは、 イントロンー二クストロンー散配列（ランポセックおよびリーチ、「クリティカ ル・レビコーズ・イン・バイオテクノロジー」６．３５７−３９３頁、１９８７ 年）により同定された。

１１０　　　　　９０　　　　　１００　　　　　１１０　　　　　１２０　　 　　　１３０　　　　　１４゜ＣＴＴＣＣＧＣＣＴＯＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣ ＣＡＯＣ，Ａα℃Ｃσ−ＴＣＴＣＡτｅｒａαπＣＡＯＣＣＡαπＣＴＣＡＣＴ ＴＣＴＴＴ`ＣＣＣ １５０１６０１７０１ｇ０　　　　　　　１９０　　　　　　　２００　　　　 　　　２１０ＡＴＣＴｒＣＣＣａＡＣＣＣＱＣＡＱＣＡ　ＣＡＡＡ丁ＧＣＴｒＣ ＡＣＡＴＣＣＴ　ｅＴｃ′ｒＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＡＣ丁■奄` ｃ’ｒＯＣＴＱＣＡＣ Ｍ６ｔＬｅｕ）ｌｉｇＺユｅＬｅｕｃｉｓＣ１ｎｃｌｙ丁ｈｒＰｒｏＰｈｅｃｌ ｕ丁ｙｒＧｌｕＣ１ｕ工１ａＡｒｇＣｉ Ｃ１ｕＡｓｐｃｌｕＡｙｇＳｅｒＡｌ吐ｅｍｓｎＡ１ｙｒｇＬｅ−１実施例１６ ＤＮＡ配列から誘導されに、Ｐ、八Ｔのアミノ酸配列。

このポリペプチドは、４００００Ｄの分子量を有する。モジ−力くアミノ酸基＋ ０２および１０３間で開裂された場合、２種のポリペプチドが得られる。すなわ ち１つは、分子量！、＋５００Ｄでポリペプチド２のＮ−末端アミノ酸配列を有 するポリペプチドである。ペプチド・フラグメントは全て再びこのアミノ酸配列 に見出され得る（ＡＳ部部分列９〜２４）。すなわち、これはｒＰＡＴの８ｋＤ 成分」である。もう１つは、分子量２８５００ＤでポリペプチドｌのＮ−末端ア ミノ酸配列を有するポリペプチドである。ペプチド・フラグメントは全て再びこ のアミノ酸配列に見出され得る（ＡＳ部部分列２．３．４．５．７．８）。すな わち、これは「ＦＡＴの３０ｋＤ成分ｊである。

ＭｅｔＬｅｕＨｉｓＸｌｅＬａｕｃｙｓｌｌｌ；１ｎｃｌｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅ ｃｌｕＸｌｅＧ１ｙＴｙｒＣ１ｕＨ１ｓｃｌｙＳｅｒ＾１龜人１ａＬｙｓＡｌａ ＶａｌＸｌｅ＾ユ＆ＡｒｇｓｅｒｌｌｅＡｇｐｐｈｅ＾ＩＬＶ＆１ｋｓｐＬｅｕ Ｘ１．ｅｋＨＧ１ｙＬｙｓτｈｒＬｙｓ　Ｌｙ　５ＴｈｒＡｓｐｃ＋　ｌ　ｕｃ ｌｕＬｅｕＬｙｓｃｌｎＶａ　１Ｌｅｕｓｅｒｃｉ　ｌ　ｎＬｅｕｏ　１ｇｒｇ Ｖａ　ｌ　Ｚ@１ｅｃｌ　ｕＣｌｕ ＾ｒＩｒＴｒｐＰｒｏＬｙｓ丁ｙｒＴｙｒＣ１ｕＧ１ｕｌｌｅＡｒｌｒｃｌｙＩ ｌｅＡｌａＬｙｓＣ１ｙ＾ｌａｃｌｕＡｒｇ八ｓｐｖａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＶ ａ１ＭｅｔＬｅｕＡｓｎＴｈｒＡｒｇＴｈｒＯ１ｕＰｈａ＾１ａＴｙに１ｙＬｅ ｘ止７３　Ａ　１　ａＡ　ｌ　ａ）−秩@ｇ ＰｒｏＴｈｒＸｌａＬｙｓＰｈｅｌｌａＴｈにｌ＋ａＡｌａｃｌｙＺ　ｌｅ工１ ｅＧ１ｙＬｙｓＶａＩＣ１ｙＰｈυｔｓｎｓｅｒＡｌａ（：１．ｙＶａｌ＾１ａ ＶａｌＡｓｎＴｙｒ人ｓｎ＾１ａＬａｕＨｔｓＬｅｕＣ１ｎＣ１ｙＬｅｕ＾ｒｇ ＰｒＯ丁ｈｒｃｌｙＶａｌＰｒ。

Ｓ＠２ＨｉｓＸ１ｅ＾ｌａＬｅｕＡｒｇＩｌｅＡｌａＬａｕＣ１ｕＳｅｒＴｈｒ ＳｅｒＰｒｏＳａに１ｎＡｌａＴｙｒ＾ｓｐｙｇ＾１ａＰｈａＧ１ｙＬｅｕＧｌ ｕＰｈｅＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＩｌａ＾ｒｇＬｙｓＣ；１ｎＶｓＩＬｅｕ＾ ５ｐＡｌａ＾５ｎＧＩｒ＾ｒｇＭｅｔＶａｌＨｉｓτｈｒＡｓ　ｎＨｉ　５ｃｙ ｉＬａｕＬａｕに１ｒ＋ＨＬ　ｓＧ　ｌｙＬｙｓＡｇｎＣｌ　ｕＬｙｓＣ；ｌｕ Ｌｅ高唐■ Ｃ１ｙＴｈｒＬｙｓＣ１ｎ＾１ａｓｈｓ＾１ａｃｌｎＬｅｕＴｒｐ＾１ａＭＰｃ ｌｕＡ！ｓｐ＾５ｎＴｙｒＰｒｏＰｈｅｓｅｒＩｌｅ３１０　　”’　　　　　 　　　　　　　　　　　　３２０ＣｙｓＡｒｇ＾１＆τｙｒＣ１ｕＣ１ｕＣ１ｙ ＬｙｓＳｅｒＡｒｒＧｌｙ＾１ｍＴｈｒＬｅｕＰｈｅＡｓｎＩｌｅＩｌｅＴｙｒ ＾ｓｐＨ：ｓ人１ａＡｒｇｈｒｒｏユｕＡｌａＴｈｒＶａｌ＾ｒ７Ｌｅｕｃｌｙ 人ｒｇＰｒｏＴｈｒｈｓｎＰｒｏ人３ｐ（ｌｕＭｅｔＰｈｅ実施例１７ 実験的に決定されγニアミノ酸配列とＤ　Ｎ　Ａ力Ｘら誘導されｙ：ＦＡＴのア ミノ酸配列との比較。

３０ｋＤ／ポリペプチド１（Ｎ−末端アミノ酸配り１］）２　　　ＴｈｒＴｈｒ ＡｌａＴｙｒＣｙｓＧｌｎＬｅｕＰｒｏＡｓｎＧｌｙ八１ａＬｅｕＧｌｎＧ１ｙ Ｇｌｎ入ｎ５ＴｒｐＡｓｐＰｈｅＰｈ■ １０４　　Ｔｈｒ？ｈｒＡｌａＴｙｒＣｙｓＧｌｎＬｅｕＰｒｏＡｓｎＧｌｙＡ ｌａＬｅｕＧｌｎＧ１ｙＧｌｎＡｓｎＴ’ｒｐＡｓｐＰｈｅoｈｅ ２２　　ＳｅｒＡｌａＴｈｒｌ、ｙｓＧｌｕＡｓｎＬｅｕ工１ｅＡｒｇ　　　３ ０Ｌ２４　　　Ｓｅｒ入１ａＴｈｒＬｙｓＧｌｕＡｓｎＬｅｕ工１ｅＡｒｇ　　 　１．３２ＡＳ部分配列２（ポリペプチド１０ト１ノブチツク・ペプチド・フラ グメント）： ｌ　　ＧＩｙＡｌａＴｈｒＬｅｕＰｈｅＡｓｎｌｌｅｌｌｅＴｙｒＡｓｐＨｉｓ ＡｌａＡｒｇ　１３３１１　ＧＩｙＡｌａＴｈｒＬｅｕＰｈｅＡｓｎｌｌｅｌｌ ｅＴｙｒＡｓｐＨｉｓＡｌａＡｒｇ　３２３ＡＳ部分配列３（ポリペプチドｌの トリブチツク・ペプチド・フラグメント）： Ｉ　　ＰｒｏＴｈｒＡｓｎＰｒｏＡｓｐＧＩＪｅＬＰｈｅＶａｌ！ＩＩｅｔＡｒ ｇ　　１１３３３　Ｉ’ｒｏＴｈｒＡｓｎＦ’ｒｏＡｓｐＧｌｕＭｅｔＰｈｅＶ ａ１ＭｅＬＡｒｇ　　３４３ＡＳ部分配列４（ポリペプチド１のトリブチツク・ ペプチド・フラグメント） １　　Ｇ］ｕＬｅｕＡｓｐＰｒｏＬｅｕＰｒｏＡｓｐＳｅｒＴｒｐＡｓｎＡｒｇ 　　１１２５８　　ＧｉｕＬｅｕＡｓｐＰｒｏＬｅｕＰｒｏＡｓｐＳｅｒＴｒｐ ＡｓｎＡｒｇ　　２６ｇＡＳ部分配列５（ポリペプチドｌのトリブチツク・ペプ チド・）２７２　　ＭｅｔＧｌｕＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｓｐＧｌｙＰｈｅＡｓｐ ＧｌｙＴｈｒＬｙｓ　　２８３ＡＳ部分配列７（ポリペプチドｌのトリブチツク ・ペプチド・フラグメント）。

＋　　１１ｅＡｌａＬｅｕＧｌｕＳｅｒＴｈｒＳｅｒＰｒｏＳｅｒＧ］ｎ＾Ｉａ ＴｙｒＡｓｐＡｒｇ　　１４１８７　１１ｅＡｌａＬｅｕＧｌｕＳｅｒＴｈｒＳ ｅｒＰｒｏＳｅｒＧ］ｎ＾ＩａＴｙｒＡｓｐＡｒｇ　　２００ＡＳｓ分配列８（ ポリペプチドｌのトリブチツク・ペプチド・フラグメント）・ ｌ　　ＶａｌＧｌｙＰｈｅＡｓｎＳｅｒＡｌａＧｌｙＶａｌＡｌａＶａｌλ５ｎ ＴｙｒＡｓｎＡｌａＬｅｕＨｉｓＬｅｕＧｌｎＧｌｙＬｅｕ１５５　　　Ｖａｌ ＧｌｙｐｈｅＡｓｎ５＊ｒＡｌａＧｌｙＶａｌＡｌａＶａｌａｓｎＴｙｒＡｓａ ＡユａＬｅｕＨｉｓＬｅｕＧｌｎＧｌｙkｅｕ ２１　　ＡｒｇＰｒｏＴｈｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＳｅｒＨｉｓＩｌｅＡｌａＬｅ ｕＡｒｇ　　　　　３２１７５　　ＡｒｇＰｒｏＴｈｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＳｅ ｒＨｉｓｌｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇ　　　　　１８６８ｋＤ単位１／ポリペプチ ド２ａ ｌ　ＭｅｔＬｅｕｌ（ｉｓｌｌｅＬｅｕＣｙｓＧｌｎＧｌｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅ ＧｌｕｌｌｅＧｌｙＴｙｒＧｌｕ）ｌｉｓＧｌｙＩ　ＭｅｔＬｅｕ）ｌｉｓｌｌ ｅＬｅｕＣｙｓＧ１ｎＧ１ｙＴｈｒＴ’ｒｏＰｈｅＧｌｕｌｌｅＧｌｙＴｙｒＧ １ｕ）ｌｉｓＧｌｙＳｅｒＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａＶａｌｌｌｅＡｌａＡｒｇ ＳｅｒｌｌｅＡｓｐＰｈｅＡｌａＶａｌＡｓｐ　３４ＳｅｒＡ１ａＡ１ａＬｙｓ ＡｌａＶａ１１１ｅＡ１ａＡｒｇＳｅｒｌｌｅＡｓｐＰｈｅＡ１ａ〜’ａｌＡｓ ｐ　３４８ｋＤ単位■／ポリペプチド２ｂ １１１ｅｔＬｅｕＨ４ｓｌｌｅＬｅｙＣｙｓＧ１ｎＧ１ｙＴｈｒＰｒｏＦ’ｈｅ ＧｌｕｌｌｅＧｌｙＴｙｒＧｌｕＨｉｓＧ１ｙｌ　ＭｅｔＬｅｕｌ（ｉｓｌｌｅ ＬｅｕＣｙｓＣ１ｎＣ＋１ｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅＧｌｕｌｌｅＣ１ｙＴｙｒＧｌ ｕ）ｉｉｓＧｌｙＳｅｒＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａｖａｌ　１１ｅＡｌａＡｒｇ ｓｅｒｌ　１ｅＡｓｐＰｈｅＡｌａＶａｌＡｓｐＬｅｕｌ　］ｅＳｅｒＡｌａＡ １ａＬｙｓ　　　　ＶａｌｌｌｅＡｌａＡｒｇ　　　　ｌ１ｅＡｓｐＰｈｅＡｌ ａＶａｌＡｓｐＬｌｌ！ｕ−ＡｒｇＧｌｙＬｙｓＴｈｒ　　４（１ ＡＳ部分配列９（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）： Ｉ　　ＴｈｒＧｌｕＰｈｅＡｌｉＴｙｒＧｌｙＬｅｕＬｙｓ　　８９０　　Ｔｈ ｒＧｌｕＰｈｅＡｌｉＴｙｒＧｌｙＬｅｕＬｙｓ　　９７ＡＳＳ分配列】０（ポ リペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）： ］　　ＴｙｒＴｙｒＡｎｙＧ］ｕｌｌｅＡｒｇ　　６６５　　ＴｙｒＴｙｒＧＬ ｕＧｌｕｌｌｅＡｒｇ　　７０ＡＳ部分配列１１（ポリペプチド２のトリブチツ ク・ペプチド・フラグメント）： ｌ　　ＴｒｐＰｒｏＬｙｓ　　３ ６２　　ＴｒｐＰｒｏＬｙｓ　　６４ ＡＳ部分配列１２（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメント） ： Ｉ　　５ｅｒｌｌｅＡｓｐＰｈｅＡ］ａＶａｌＡｓｐＬｅｕｌｌｅＡｒｇ　　１ ０２８　　５ｅｒｌｌｅへｓｐＰｈｅＡｌａＶａｌＡｓｐＬｅｕｌｌｅＡｒｇ　 　　：（７ＡＳ部分配列］３（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラ グメント）： ｌ　　ＡｓｐＶａｌＳｅｒＧｌｕｌｌｅＶａｌＭｅｔＬｅｕＡｓｎＴｈｒＡｒｇ 　　１１７９　　ＡｓｐＶａｌＳｅｒＧｌｕｌｌｅＶａｌＭｅｔＬｅｕＡｓｎＴ ｈｒＡｒｇ　　８９ＡＳ部分配列１４（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチ ド・フラグメント）： １　　（ｉｌｎＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＬｅｕＧｌｙＡｒｇ　　８４９　　Ｇ ｌｎＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＬｅｕＧＩｙＡｒｇ　　５６ＡＳ部分配列１５（ リシル−エンドペプチダーゼを含むポリペプチド２のペプチド・フラグメント） ： ６　　ＣｙｓＧｌｎＧｌｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅＧｌｕ　　１２１　　Ｃｙｓ（ｉ ｌｎＧｌｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅＧｌｕ　　７ＡＳ部分配列１６（リシル−エンド ペプチダーゼを含むポリペプチド２のペプチド・フラグメント）： ６５　　ＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧＩｕｌｌｅＡｒｇＧｌｙｌｌｅＡｌａＬｙｓ　　 ７４Ｉ　　　ＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧｌｕｌｌｅへｒｇＧｌｙｌｌｅＡｌａＬｙｓ 　　　１０ＡＳ部分配列１７（リシル−エンドペプチダーゼを含むポリペプチド ２のペプチド・フラグメント）・ ４９　　Ｇ１ｎＶａｌＬｅｕＳｅｒＧ！ｎＬｅｕＧｌｙＡｒｇＶａｌｌｌｅＧｌ ｕＧｌｕＡｒｇＴｒｐＰｒｏＬｙｓ　　６４１　　ＧｌｎＶａｌＬｅｕＳｅｒＧ ＩｎＬｅｕＧｌｙＡｒｇＶａｌｌｌｅＧｌｕＧｌｕＡｒｇ　　ＰｒｏＬｙｓ　　 ｌ５ＡＳ部分配列１Ｂ（リシル−エンドペプチダーゼを含むポリペプチド２のペ プチド・フラグメント）ニ ア５　　ＧｌｙＡｌａＧｌｕＡｒｇＡｓｐＶａｌＳｅｒＧｌｕｌｌｅＶａｌＭｅ ｔＬｅｕＡｓｎＴｈｒＡｒｇ　　８９１　　ＧｌｙＡｌａＧｌｕＡｒｇＡｓｐＶ ａｌＳｅｒＧｌｕｌｌｅＶａｌＭｅｔＬｅｕＡｓｎＴｈｒＡｒｇ　　１５ＡＳ部 分配列１９（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）： ２３　　ＡｌａＶａｌｌｌｅＡｌａＡｒｇ　　２７１　　ＡｌａＶａｌｌｌｅＡ ｌａＡｒｇ　　５ＡＳ部分配列２０（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド ・フラグメント）： ４２　　ＬｙｓＴｈｒＡｓｐＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬｙｓ　　４ＢＡ、　Ｓ　ｉｌ Ｅ分配列２１（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）ニ ア１　　ＧＩｙｌｌｅＡｌａＬｙｓ　　７４１　　ＧｌｙｌｌｅＡｌａＬｙｓ　 　４ＡＳ部分配列２２（ポリペプチド２のトリブチツク・ペプチド・フラグメン ト）： ５７　　ＶａｌｌｌｅＧｌｕＧｌｕＡｒｇ　　６１１　　ＶａｌｌｌｅＧｌｕＧ ｌｕＡｒｇ　　５ＡＳ部分配列２３（リシル−エンドペプチダーゼを含むポリペ プチド２のペプチド・フラグメント）： ８７　　ＡｓｎＴｈｒＡｒｇＴｈｒＧ４ｕＰｈｅＡｌａＴｙｒＧｌｙＬｅｕＬｙ ｓ　　９７１　　　ＡｓｎＴｈｒ−丁ｈｒＧＩｕＰｈｅＡＩａＴｙｒＧＩｙＬｅ ｕＬｙｓ　　　ＩＩ要約： ＡＳ部分配列　　　　　　　　　　　　　　　ＤＮＡから誘導されたＡＳ配列に おけるＡＳの位置 Ｎ−末端人Ｓ配列３０ｋＤ単位／ポリペブチダーゼｌ　　　　　　　１０４−１ ．１３Ｎ−末端ＡＳ配列８ｋＤ単位／ポリペブチダーゼ２ａ　　　　　　　　１ −３４λ−末端ＡＳ配列８ｋＤ単位／ポリペブチダーゼ２ｂ　　　　　　　　１ −４０ＡＳ部分配列２（ポリペプチド１のトリブチツク・ペプチド・フラグメン ト）：　　　　　　　　　　　　　　３１１−３２３ＡＳ部分配列３（ポリペプ チド１のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）　：　　　　　　　　　　　 　　　３３３−３４３ＡＳ部分配列４（ポリペプチド１のトリブチツク・ペプチ ド・フラグメント）　：　　　　　　　　　　　　　　　２５Ｂ−２６８Ａｓ部 分配列５（ポリペプチド１のトリブチツク・ペプチド・フラグメント）　：　　 　　　　　　　　　　　　２７２−２８３ＡＳ部分配列７（ポリペプチド１のト リブチツク・ペプチド・フラグメント）　：　　　　　　　　　　　　　　　１ ８７−２００Ａｓ部分配列８（ポリペプチド１のトリブチツク・ペプチド・フラ グメント）：　　　　　　　　　　　　　　１５５−１８６ＡＳ部分配列９（ポ リペプチド２のトリブチツク・フラグメント）：　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　９０−９７ＡＳ部分配列１０（ポリペプチド２のトリブチツク・ フラグメント］　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６５−７０ＡＳＩ分 配列１１（ポリペプチド２のトリブチツク・フラグメント）：　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　６２−６４ＡＳＩ分配列１２（ポリペプチド２のトリ ブチツク・フラグメント）：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｂ− ３７ＡＳ部分配列１３（ポリペプチド２のトリブチツク・フラグメント）：　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７９−８９ＡＳ部分配列１４（ポリペ プチド２のトリブチツク・フラグメント）：４９〜５６ Ａｓ部分配列１５（ポリペプチド２のリシル−エンドペプチダーゼ）＋　　　　 　　　　　　　　　　　　　　６−１２ＡＳ部分配列１６（ポリペプチド２のリ シル−エンドペプチダーゼ）二６５〜７４ ＡＳ［Ｅ分配列１７（ポリペプチド２のリシル−エンドペプチダーゼ）：　　　 　　　　　　　　　　　　　　４９−６４Ａｓ部分配列】８（ポリペプチド２の リンルーエンドペプチダーゼ）・　　　　　　　　　　　　　　　　７５−８９ ＡＳ部分配列１９（ポリペプチド２のトリブチツク・フラグメント）：　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　２３−２７ＡＳ部分配列２０（ポリペプチ ド２のトリブチツク・フラグメント）：　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　４２−４８Ａｓ部分配列２１（ポリペプチド２のトリブチツク・フラグメ ント）：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７１−７４ＡＳ部分配列 ２２（ポリペプチド２のトリブチツク・フラグメント）：　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　５７−６１＾Ｓ部分配列２３（ポリペプチド２のリシル −エンドペプチダーゼ）：　　　　　　　　　　　　　　　　　８７−９７実施 例＋８ イソペニシリンＮシンテターゼ（ｉｐｓ）の遺伝子およびＰ　Ａ、　Ｔの遺伝子 間に存在するＤＮＡフラグメントの部分配列。

この配列；ま、ｉｐｓ遺伝子に存在するｒｃＧＡＴｃｃＪ、すなわち制限＃素Ｂ ａＩｈＨ１の認識配列から始まる。この遺伝子の最後の３４（ｃ−末端）コドン を示す。それらは、公開されたＤＮＡ配列との比較により同定された（カー等、 「ジーン」４８．２５７−２６６頁、１９８６年）、中間頌域の後に、ｐａｔ− ＤＮＡ配列の１位が１４４２から続匂このＤＮＡ部分配列を第４図において示す （Ｂ　）ｃｉｐｓ−およびｐａｔ−遺伝子間の狭いカップリングを証明し、また ｐａｔ−遺伝子の転写および翻訳に不可欠な制御要素全てがこのフラグメントに 存在するため、このＤ　Ｎ　Ａ部分配列は重要である。

実施例１９ プラスミドｐＢｃ２００１の構築およびエシェリヒア・クリにおけるｐａｔ−遺 伝子の発現。

ａ）ペニシリウム・クリソゲヌムのｃＤ＼Ａ遺伝子バンクの構築。

５μ９のポリ（Ａ）”−ＲＮＡ（これの単離および精製については実施例＋０７ こ記載されている）を、４種のデオキシヌクレオシド・トリホスフェートの存在 下で逆転写酵素を用いてオリゴｄＴ−プライマーと反応させることにより、相補 的１本鎖ＤＮＡを形成させる。

そこから酵素リボヌクレアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼにより２本鎖分子を 形成させる（グプラーおよびホフマン、「ジーン」２５．２６３．１９８３年） 。適当なＥｃｏＲＩアダプターを加えた後（このために酵素ポリヌクレオチドキ ナーゼおよびＴ４−ＤＮＡリガーゼが用いられる）、線状２本鎖ｃＤＮＡが得ら れ、これはクローニング・ベクター中に組み込まｈ得る。これらの反応の場合、 市販されているＣＤＮＡ合成キット（ファーマシア社製）を使用するのが好まし い。それは、Ｈし重要な酵素およびアダプター・オリゴヌクレオチドを含む。こ の反応は、製造会社の使用説明書に従い行なわれる。

こうして合成された、ＥｃｏＲＩ末端を有する２本鎖ＤＮＡを、ベクターｇｔｌ ｏにクローン化する（ユイン等、ｒＤＮＡクローニング」、デセーバー、Ｄ、Ｍ 、１１ｉ、オフスフオード、１．４９．１９８５年）。

８０μρのｃＤＮＡ調製物を、予めＥｃｏＲＩにより開裂し、ホスファターゼに より処理しておいた（マニアチス等）１６μＱのｇｔｌＯ−ＤＮＡ（８μ９）と 混合する。３μｇの３モル酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）および２５０μｇのエ タノールを加えた後、混合物を一２０°で２θ時間沈澱させ、続いて６０μｇの １０ミリモル・トリス−ＨＣＩ（ＰＨ７，５）、１ミリモルＥＤＴＡに溶かす。

６６ミリモルのトリス−ＨＣ１（ｐＨ７、５）、１ミリモルのスペルミジン、１ ０ミリモルＭ　ｇ　Ｃ１２，１５ミリモルのジチオトレイトール、０．２１／Ｉ ＣＢＳＡ、０゜５ミリモルＡＴＰ中６ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えることに より１２°で２０時間ライゲーションを行う。ライゲージロン混合物を蛋白質抽 出物Ｃパッケージング・ミックス」）によりインビトロ包装し、エシェリヒア・ コリ株ｃ　６００ｈｒｌと培養する（ユイン等）。

必要な方法は記載されている（マニアチス等）。その試験で：よ、５゜１ＯＬを 越えるプラークを得ることができる。

ｂ）ｐａｔ−特異的ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの単離およびＭ１３１１１１）１９ におけるサブクローニング。

実施例１３の記載に従い、ペニシリウム・クリソゲヌムｃＤＮＡ遺伝子バンクの 約４００００のプラークを用いてプラーク・ハイブリダイゼーションを行う。エ シェリヒア・コリ株Ｃ６００ｈｆｌ（ユイン等）を指示株として使用する。Ｅｃ ｏＲＩにより部分開裂後、組換えｇｔｌｏ−ファージのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ− 開裂Ｍ１３ｍＰ１９−ＲＦ−ＤＮＡとライゲージロンし、トランスフイクシタン する。組換えＭ１３ＩＩｌｐｌ　９−ＲＦ−ＤＮＡの個々のクローンを同定し、 制限地図法により確認する。

Ｃ）ＮＣＯ＋交差部位を挿入するための組換えＭＩ３ａｐ１９クローンのＤＮＡ の部位突然変異。

下記配列を有する４１量体オリゴヌクレオチドが合成される。

５’　−ＴＣＣＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣへＣＡＴＣＣＴＣ ＴＧＴＣ＾ＡＧＧＣ−３゜ｐａｔ−ｃＤＮＡのＤＮＡ配列と比べると、このＤ　 Ｎ　、Ａ配列：よ、Ｎ−末端メチオニン基に対応するＡＴＧを囲ｅＮｃｏｌ交差 部位か得られる点が変わっている。右方へ２０、左方へ１５のヌクレオチドは、 ｐａｔ−ｃＤＮＡ配列と同一である。５ピコモルの燐酸化オリゴヌクレオチドお よび０．５ピコモルの１本鎖Ｍ　１３ｍｐｌ　９　　ＤＮ、Ａを混合し、１０μ Ｑの２０ミリモルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ミリモルＭｇＣ１ｙ、 ５０ミリモルＮａ　Ｃｌ中、５分間６５°および２０分間４２°で加熱する。エ フチダルザブ−およびヘニコフに従い（「ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ」 １４．５１１５．１９８６年）、フレノウ・ポリメラーゼ、Ｔ４−ＤＮＡリガー ゼおよびＳｌ−ヌクレアーゼによる処理を行う（２０ミリモルのトリス−Ｃ１（ ｐＨ７，５）、ｌＯミリモルＭｇＣｌ、、、Ｉ　Ｏミリモルのジチオトレイトー ル、４種のｄＴＮＡ各々０．８ミリモル、１ミリモルＡＴＰに２単位のフレノウ ・ポリメラーゼおよび３単位のＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを含む１０μＱの溶液、 ４２°で１時間）。ＥＤＴＡを加えることにより（Ｒ終濃度２５ミリモル）反応 を止め、１０分間７０°に加軌する。エタノールにより沈澱後、沈澱物をｌＯμ ｇのトリス−ＨＣＩ（ＰＨ８）、ｌミリモルＥＤＴＡに溶かす。１５μＱの３０ ミリモル酢酸カリウム（ＰＨ４，，６）、０．２５モルＮａＣ１，１ミリモルＺ ｎＣＬ、５％グリセリン、７単位のＳｌヌクレアーゼを加えた後、室温で２０分 間インキュベーションを行う。反応調製物により適当なエシェリヒア・クリ株（ 例、ＪＭＩ　ＯＩ、ヤニシューベロン等、Ｅノーン」３３．１０３．１９８５年 ）をトランスフェクションし、ＲＦ　　ＤＮＡを単離しに後、変化したＤＮＡが Ｎｃｏｌ開裂により同定され得る。

ｄ）ｐａｔ　−ｃＤ　Ｎ　Ａを有するＮ　ｃｏｌ　−Ｈ１ｎｄＩＩ［フラグメン トのプラスミドＰＫＫ２３３−２へのクローニング。

挿入されたＮｃｏｌ交差部位を有するｐａｔ−ｃＤＮＡを含む組換えＭ１３クロ ーンのＲＦ−ＤＮＡを、Ｎ　ｃｏｌおよびＨｉｎｄＩ［ｌにより開裂する。同様 に、プラスミドｐＫＫ２３３−２（アマンおよびブロシウス、「ジーン」４０， １８３．１９８５年）をＮｃｏｌおよびＨｉｎｄｎｌにより開裂する。６６ミリ モルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ミリモルのスペルミジン、］、０ミリ モルＭｇＣＩ！、１５ミリモルのジチオトレイトール、０．２ｘ９／ｘＯＢｓｐ 、、０．５ミリモルＡＴＰ中１４’　で２０時間、２ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガー ゼを加えることにより、２つの上記ＤＮＡのライゲーションを行う。適当なエシ ェリヒア、コリ株の形質転換後（例、ＪＭ８３、ヤニシューベロン等、：ジーン 」３３．１０３．１９８５年）、個々のプラスミド−ＤＮＡを単離し、制限地図 法により特性検定する。プラスミドｐＫＫ２３３−２においてｐａｔ−ｃＤＮＡ を有するＮ　ｅｏｌ　−Ｈｉｎｄｍ制限フラグメントを含むプラスミドをｐＢｃ ２００１と称する。

Ｃ）エシェリヒア・コリにおけるｐａｔ−遺伝子の発現。

エシェリヒア・コリＲＢ７９１（アマンおよびブロシウス、「ジーン」４０，１ ８３．１９８５年）をＰＢＣ２００］により形質転換する。５０　ｘＱ’ｌ）　 Ｌ　Ｂ培地（１リツトル当たり、１０９のバクトートリブトン、８ｇのＮａＣ１ ，５ｇの酵母抽出物。ＮａＯＨによりｐＨ７，５に設定する）に、株ＲＢ７９＋ の個々のコロニーを播種しくｐＢ　０２００１）、０．５の光学密度が得られる まで（６００ｎｍで測定）、２００ｒｐｍ、３７′″で振り混ぜる。５ＨＱのｏ 、ｉモルＩ　ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を加える。続 いて、２０　Ｏｒｐｍで３時間３７°で振り混ぜる。次いで、細胞を遠心分離（ １０分間、５０００ｒｐｍ、　２０°ベツクマンＪＡ２０）にかけ、後処理する ことにより、エシェリヒア・クリにおいて発現した蛋白質の同定を行う。

この同定は、エシェリヒア・コリ総蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気 泳動、ＰＡＴ−特異抗体を用いたウェスタン−プロットまたは酵素検出法により 行なわれ得る。

実施例２０ ベニンリウム・クリソゲヌムのｐａｔ−遺伝子の形質転換。

ａ）プラスミドｐＢｃ２００２の構築。

プラスミドｐＨ５１０３（コラ−等、「ジーン」６２．１２７．１９８８年）を ＥｅｏＲｌにより全体的に開裂し、ＥｅｏＲｌ　−９ａｉ１開裂Ｍ　１３ｍｐｌ 　９−ＲＦ−ＤＮＡの存在下で再びライゲージタンする（６６ミリモルのトリス −ＨＣ１（ｐ）１７　、５　）、１ミリモルのスペルミジン、ｌＯミリモルＭｇ Ｃｌ、、１５ミリモルのジチオトレイトール、０　、２　ｏ／友ＱＢＳｐ、、０ ．５ミリモルＡＴＰ、２０時間１４°で２ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを加える ）。形質転換後、５ａｌｌフラグメントのクローニングに適したプラスミドが利 用可能である。完全なｐａｔ−遺伝子を含む４　、８　ｋｇの５ａｉｌフラグメ ントを有する組換えプラスミドの場合と同様に（実施例］３参照）、このプラス ミドを５ａｌｌにより開裂する。ライゲーションおよび形質転換後、修飾ＰＨ５ １０３およびｐａｔ−遺伝子を含む４　、８　ｋｂの５ａｌｌフラグメントから 成るプラスミドが同定され得る。このプラスミドを１）ＢＣ２００２と称する。

ｂ）ペニシリウム・クリソゲヌム・プロトプラストの単離および形質転換。

ペニシリウム・クリソゲヌムＰ２／ＡＴＣＣの濃厚胞子５ｓ液２ｘＱを、ｌＱの エルレンマイヤー・フラスコ中、ペニシリウム・クリソゲヌム用の無菌最小培地 （１リツトル当たり、３ｇのＮａ　Ｎ　Ｏｓ、０゜５９のＭｇＳＯ４・７ＨｔＯ １０，５９０ＫＣＩ、＋０２９のＦｅ５０．．７８ｙ０．２０９＋７）サッカロ ース、ｌ　３９のＫＨ，ＰＯ，およびＩｘＱの微量元素混合物（１００ｄ当たり 、０．１９のＦｅ５Ｏ−・７ＨｔＯ１０゜９９のＺｎ５Ｏ−・７Ｈｔ０，０．０ ４９のＣｕ５Ｏ−・５ＨｔＯ１０，０１９のＭｎＳＯ４・ＨｔＯｌｏ、０１９の Ｈ３ＢＯ！、０．０１９＋７）ＮａｔＨＰＯ−・２　Ｈ＊０））２００ｘＱに加 え、２５０　ｒｐＩｌｌで２０時間２５°で振り混ぜる。プロトプラストの単離 および精製は、イニルトン等の方法（「プロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイＪ、８ ］、１４７０．１９８４年）により行なわれる。菌糸体を遠心分離にかけ、０゜ ９モルＮａＣｌ中で２回洗浄し、５ｘ９／ｘＱのノボザイム２３４を含Ｌ′０． ９モルＮａＣＱ２０＊Ｑに再懸濁する。３０°で１５時間インキュベージぢンを 行う。反応調製物を遠心分離にかける（ベックマン冷却遠心分離機ＪＳ７．５． １５００ｒｐｍ、２０°、５分間）。プロトプラスト沈澱物を０．９モルＮａＣ １により２回、次いで１．０モルのソルビトール、５０ミリモルのＣａＣ１ｔに より１回洗浄する。プロトプラストを、０．２ｘＣ（７）１．０Ｍソルビトール 、５０ミリモルＣａＣ１ｘ（約０．５〜５．１０＠プロトプラスト／Ｉｇ）に再 懸濁する。ｌＯミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１ミリモルＥＤＴＡ 中５μこのｐＢｃ２００２を、形質転換に使用し、プロトプラスト懸濁液に加え る。１２．５μｇの２５％ポリエチレングリコール（ＢＤＨ）、ｌＯミリモルの トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、５０ミリモルのＣａＣ］ｔ（滅菌ろ過済み）を 加える。水中で２０分間インキニベーシタンを行う。

０　、５　ｘ（ｌの１２．５μｇ２５％ポリエチレングリコール（Ｂ　Ｄ　Ｈ） 、ｌＯミリモルのトリス−ＨＣ１（ｐＨ７、５）、５０ミリモルＣａＣ］ｔ（滅 菌ろ過済）を加える。混合物を２０°で５分間インキュベージジン徹底的に混合 し、混合物を、０．５％寒天および２０μ９のフレオマイシン／ＩＩＱを含む最 小培地３１１ｇに加える（４８°）。形質転換調製物を最小培地プレートに移し て培養する（上記の最小培地、１．６％寒天および２０μタフレオマイシン／Ｉ Ｃ）。

様々なコロニーから単離されるＤＮＡは、放射性標識ｐａｔ−ＤＮＡとのサザー ン・ハイブリダイゼーションにより特性検定され得る。

形質転換体の中から、多重組み込みの発生によってｐａｔ−遺伝子の幾つかのコ ピーを含むものが発見される。続いて、ペニシリン形成増加に関する試験発酵に よりそれらの株を試験する。

以下、図面の説明を行う。

第１図：　ペニシリウム・クリソゲヌムＰ２／ＡＴＣＣ４８２７１からのチオー ル依存性ＦＡＴの精製。

モノＰにおけるアフィニティー−タロマドグラフィーにより製造されたＰＡＴ醇 素酵素物Ａ１　２７８／２のクロマトフオーカシング（耽ＡＬ３１０）。

カラム：　　　　ファーマシア・モノＰ基礎体積：　　　　４友ｇ 溶離緩衝液：　　　Ａ：２５ミリモルのビス・トリス緩衝１ｆｆｌｐＨ６。

３、ＨＣＩ Ｂ：１０１ｆｆのポリバフｙ−７４／　］　ＯＯｘ（！、　ｐ）（４，０、ＨＣ Ｉ 試料：　　　　　アフィニティー試料ＡＬ　２７　Ｂ／２試料体積：ｔａ衝液ａ とｌλＱの緩衝液交換、その２１ｇは荷電状態 紙送り速度：　　３０ｃ災／時 流速：　　　　　　　６０ｔＱ１時 光学密度：　　　Ｏ０］、２８０ｎｍ、　ＨＲ−１０−細胞フラクション：　標 識参照 第２図：　ペニシリウム・クリソゲヌムＰ　２／ＡＴＣＣ４８２７１のチオール 依存性ＦＡＴの精製。

ＡＬ３１０からのフラクション３−５のＲＰＣ（Ｍ！’、’ヌクレオジル３００ −５／Ｃ，）／モノＰにおける活性プールＡＬ２７８／２（アフィニティー・ク ロマトグラフィー後）のクロマトフオーカシング。

第３図：　ペニシリウム・クリソゲヌムＰ　２／ＡＴＣＣ４８２７】のチオール 依存性ＦＡＴの電気泳動特性検定。

ＡＬ３１０の勾配５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアンホリン（ ｐＨ３，５−９，５）またはインモビリン（ｐＨ４，５−６゜５）にお；する等 電点電気泳動／モノＰにおけるアフィニティー・クロマトグラフィーにより製造 されｊ：　Ｆ　Ａ　Ｔ酵素調製物ＡＬ　２７８／２のクロマトフオーカシング。

第４図：　　ｐａｔ−遺伝子を含乙゛ペニシリウム・クリソゲヌムの制限地図。

制限地図は、ＤＮＡ分子における制限交差部位の大体の再現である。制限交差部 位の示されＬ距離は現実の距離に比例するが、現実に観察される距離はこれらと は相異し得る。全ての制限交差部位が与えられている訳ではなく、さらに別の交 差部位も全体を通じて存在し得る。

Ａ＝実施例１４および１５の配列 Ｂ＝実施例１８の配列 第５図：２１！択されたオリゴヌクレオチド混合物の配置お工び配列。

第６図：　配列決定された領域（Ｄ、Ｆ、Ｇ）、オリゴヌクレオチド（Ｃ，Ｅ） 、ＦＡＴのポリペプチド！およびそこから誘導された暗号化ＤＮＡ鎖（Ｂ）の配 列間の関係の図示。

Ｄ＝実施例１１の配列 Ｆ；実施例】３の配列 Ｇ−実施例１４および１５０配列の一部分第７図：　プラスミドｐＢｃ２００１ ）構５゜完全なｐａｔ　−ｃＤ　Ｎ　ＡクローンのＤＮＡから出発して（最上線 ）、２つのＥｃｏＲ１フラグメントをベクターＭ１３ｍｐ１９にクローン化する 。オリゴヌクレオチドを用いてＮｃｏｌ交差部位を挿入する。次いで、Ｎｃｏｌ −Ｈｉｎｄｍ−フラグメントを発現ベクターｐＫＫ２’３３−２に組み込む。Ｅ ｃｏＲｌ、Ｉ（ｉｎｄＤＩ、Ｎ　ｃｏｌは、対応する酵素の交差部位、ＭＩ３ｍ ｐ１９のａｃｓ多重クローニング部位、ｐＫ　Ｋ　２３３−２のｐ　ｔｒｃ　Ｌ ｒｐ−１ａｃ融合プロモーター、ｐＫＫ２３３’−２のｒｒｎＢＴＩＴ２転写タ ーミネータ−１ｐＫＫ２３３−２のｂｌａアンピシリン耐性遺伝子を示す。

第８図：　プラスミドｐＢｃ２００２゜フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｅｅ）と アスペルギルス・ニデユランス・プロモーターｐ　ｇｄｐ（グリセリン・アルデ ヒド燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター）との融合を含むこのプラスミ ドの構築は、ｐＨ５Ｉｃ１３（コラ−等）から出発する。アンピシリン耐性遺伝 子（ｂｌａ）は、エシェリヒア・フリにおける選択マークとしての役割を果にす 。ｐＨｓ＋０３１こおいて、４．８ｋｇの５ａｉ１フラグメントは、ペニシリウ ム・クリソゲヌムｐａｔ−遺伝子と共に組み込まれる。５ａ１１、ＥｃｏＲｌは 、対応する制限酵素の交差部位でるる。

第９図；　ベニンリン・アシル・トランスフェラーゼ（ＦＡＴ）が、イソペニノ リンＮのアシル基転移またはその６−ＡＰＡへの開裂およびペニシリンへのその アシル化を触媒する場合に従う反応式。

Ｆｉｇ−２＝ Ｆ工ｇ＋　　７： Ｆｉｇ、　　　Ｅｌ： 巳豆ニーユニ Ｅヨ＝コ 国際調査報告 −１−−１＾紳−ｍｋ　　セＣＴ／ＥＰ　　８９１００３７４

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素ぺニシリン・アシル・トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする、 精製および単離形態のＤＸＡ。
2. （２）第４図において図式的に再現された制限地図を有する、請求項１記載のベ ニシリウム・クリソゲヌムのＤＮＡ。
3. （３）下記配列（解読鎖）を有する、請求項１および２記載のＤＮＡ。 【配列があります】
4. （４）ベニシリウム・クリソゲヌムｐａｔ−遺伝子の転写および翻訳に必要な配 列を有する、請求項１〜３記載のＤＮＡ。
5. （５）下記配列を有する、請求項４記載のＤＮＡ。 【配列があります】
6. （６）下記部分配列を有する、請求項４記載のＤＮＡ。 【配列があります】
7. （７）形質転換に使用され得るベク外ＤＮＡに組み込まれた、請求項１〜６記載 のＤＮＡまたはこのＤＮＡの一部分。
8. （８）請求項１〜５記載のＤＮＡによりコードされる、精製および単離形態の蛋 白質。
9. （９）下記アミノ酸部分配列を含むことを特徴とする、請求項８記載の蛋白質； ＡＳ−部分配列（ポリペプチド１のＮ−末端ＡＳ−配列）：【配列があります】 ＡＳ−部分配列２（ポリペプチド１のトリブチック・ペプチド・フラグメント） ： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列３（ポリペプチド１のトリブチック・ベブチド・フラグメント） ： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列４（ポリペプチド１のトリブチック・ペプチド・フラグメント） ： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列５（ポリペプチド１のトリブチック・ベブチド・フラグメント） ： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列６（ポリペプチド２のＮ−末端配列）：【配列があります】 ＡＳ−部分配列７（ポリペプチド１のトリブチックペプチドフラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列８（ポリペプチド１のトリブチック・ペプチド・フラグメント） ： 【配列があります】 Ｌｅｕ−Ａｒｇ ＡＳ−分配列９（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１０（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１１（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： ＴｒＰ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ＡＳ−部分配列１２（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１３（ポリペプチド２のトリブチック・ベブチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−配列１４（ポリペプチド２のトリブチック・ベブチド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１５（リシルーエンドベブチダーゼを含むポリペプチド２のべブ チド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１６（リシルーエンドベブチダーゼを含むポリペプチド２のべブ チド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１７（リシルーエンドペプチダーゼを含むポリペプチド２のペプ チドフラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１８（リシルーエンドペプチダーゼを含むポリペプチド２のべブ チド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列１９（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列２０（ポリペプチド２のトリブチック・ベブチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列２１（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列２２（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチド・フラグメント ）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列２３（リシルーエンドベブチダーゼを含むポリペプチド２のベブ チド・フラグメント）： 【配列があります】 ＡＳ−部分配列２４（ポリペプチド２のトリブチック・ペプチドフラグメント） ： 【配列があります】
10. （１０）下記アミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項８記載の蛋白質。 【配列があります】
11. （１１）蛋白質が、変性条件下ポリアクリルアミドゲル電気泳動における非修飾 酵素として約３０ｋＤの分子量でＮ−末端アミノ酸部分配列１を有するポリペプ チド１、並びに分子量約８ｋＤでＮ−末端アミノ酸部分配列６を有するポリペプ チド２に分解することを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
12. （１２）非修飾酵素が、約５．１の等電点を有する幾つかのイソ変異体により構 成されることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
13. （１３）塩基性イソ変異体のポリペプチド１が、変性条件下ポリアクリルアミド ゲル電気泳動において酸性イソ変異体のポリペプチド１よりも迅速に移動するこ とを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
14. （１４）酵素として還元性化合物、例えばジチオトレイトール、β−メルカプト エタノール、グルタチオンおよびシステインにより活性化されるか、またはソル ビトール、サッカロースもしくはグリセリンにより安定化され、ヨードアセトア ミドにより不活化されることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
15. （１５）ベニシリウム属のペニシリンＧおよびペニシリンＶ生産株により形成さ れることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
16. （１６）酵素イソペニシリンＮの活性形態が、フェニルアセチルーまたはフェノ キシアセチルー補酵素Ａの存在下でペニシリンＧまたはペニシリンＶにアシル基 転移されることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
17. （１７）酵素ペニシリンＶの活性形態が、フェニルアセタールー補酵素Ａの存在 下でペニシリンＧにアシル基転移されるか、またはこれがフェノキシアセチルー 補酵素Ａの存在下でペニシリンＶにアシル基転移されることを特徴とする、請求 項８〜１０記載の蛋白質。
18. （１８）酵素６−アミノペニシラン酸の活性形態が、フェニルアセチルー補酵素 Ａまたはフェノキシアセチルー補酵素Ａの存在下でペニシリンＧまたはペニシリ ンＶにアシル化されることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
19. （１９）酵素７−アミノ−３−デスアセトキシセファロスポラン酸の活性形態が 、フェニルアセチルー補酵素Ａまたはフェノキシアセタールー補酵素Ａの存在下 で対応する７−アシル−３−デスアセトキシセファロスポリン化合物にアシル化 されることを特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
20. （２０）酵素イソペニシリンＮ、ペニシリンＶまたはペニシリンＧの活性形態が 、活性化アシル基供与体の非存在下で６−アミノベニシラン酸に開裂されること を特徴とする、請求項８〜１０記載の蛋白質。
21. （２１）請求項７記載のＤＮＡを含むベクター。
22. （２２）請求項２１記載のベクターを含む細胞。
23. （２３）遺伝子発現を可能にする調節要素の制御下でｐａｔ−遺伝子を含むＤＮ Ａ配列を供給する、請求項２１記載のベクター。
24. （２４）プラスミドｐＢＣ２００１に関するものである、請求項２２記載のベク ター。
25. （２５）β−ラクタム−生産微生物におけるプラスミドの選択を可能にするさら に別の遺伝子を含む、請求項２１記載のベクター。
26. （２６）プラスミドｐＢＣ２００２に関するものである、請求項２５記載のベク ター。
27. （２７）請求項２１〜２６のいずれか１項記載のベクターの助けによる宿主の形 質転換および発理されたＰＡＴの単離から成る、酵素ぺニシリンアシラーゼート ランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の製造方法。
28. （２８）組換えＰＡＴ。