HU208845B - Process for producing penicillin acyle-transferase its coding dna sequence vector containing it and host cell transformated thereby - Google Patents
Process for producing penicillin acyle-transferase its coding dna sequence vector containing it and host cell transformated thereby Download PDFInfo
- Publication number
- HU208845B HU208845B HU892092A HU209289A HU208845B HU 208845 B HU208845 B HU 208845B HU 892092 A HU892092 A HU 892092A HU 209289 A HU209289 A HU 209289A HU 208845 B HU208845 B HU 208845B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- penicillin
- dna
- pat
- sequence
- dna sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Mold Materials And Core Materials (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
Description
A találmány tárgya egy kulcsenzim génje és a gén terméke, amely szerkezetében és többszörös funkcionalitásában új, valamint tisztított és izolált formában a penicillin G és V bioszintézisének utolsó lépését katalizálja. Ez az enzim a penicillin acil-transzferáz.
Már 1953-ban Kató megfigyelte [J. Antibiot. Ser. Tokyo 6, 130-136 (1953)] prekurzor nélküli penicillin fermentációknál a penicillin mag felhalmozódását. Ezt a β-laktám vegyületet később Batchelor és munkatársai izolálták [Natúré, 183, 257-258 (1959)] és 6-aminopenicillánsavként (6-APA) azonosították. A 6-APA főleg a prekurzor nélküli penicillin fermentációkban halmozódik fel. Erickson és Bennett [Appl. Microbiol. 13, 738-742 (1965)] a 6-APA-t szekunder metabolitnak tekintették, amelyet a fenil- vagy fenoxi-ecetsav prekurzorok távollétében az izopenicillin N enzimatikus 7-dezacetilezésével kapunk, illetve a természetes hidrofób penicillinek enzimes hasításával keletkezik. Később felfedezték, hogy a penicillin bioszintézis utolsó lépése abból áll, hogy az izopenicillin N L-a-aminoadipinsav oldallánca fenil- vagy fenoxi-ecetsav oldalláncra cserélődik, míg az oldallánc savak acil-koenzim-A vegyületek formájában lépnek reakcióba. Egy ilyen acil-transzfert katalizáló enzimet Loder azonosított [Prostepy. Hig. Med. Dosw. 26, 493-500 (1972)] P. chrysogenum nyers kivonatában, és a penicillin aciltranszferáz nevet (PAT) adta neki. Ez az enzim az összes penicillin-termelő gombában megtalálható, a sejten belül helyezkedik el. Fawcett és munkatársai [Biochem. J. 151, 741-746 (1975)] kutatásai megerősítik az izopenicillin N penicillin G-vé való transzacilezését P. chrysogenum nyers enzimkivonatával fenilacetil-koenzim-A jelenlétében.
A PAT fontosságát a penicillin G vagy V bioszintézisében a következő megfigyelések is megerősítették: Brunner et al., [Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 349, 95-103 (1968)], Spencer [Biochem. Biophys, Rés. Commun., 31, 170-175 (1968)], Gatenback és Brunsberg [Acta Chem. Scand. 22, 1059-1061 (1968)], Spencer és Maung [Biochem. J. 118,29-30 (1970)], Meesschaert et al. [J. of Antibiotics, 33,722-730 (1980)], Kogekar et al., [Indián J. of Biochem. and Biophys., 20, 208-212 (1983)], Frederiksen et al. [Biotechn. Letters, 6,549-554 (1984)], Abraham [Regulation of Secondar Metabolite Formation, Kleinkauf et al., eds., Proceedings of the 16th Workshop Conferences Hoechst, Gracht Castle, 1216.5.85., Vol. 16, Weinheim, 115-132 (1986)], valamint Alvarez et al. [Antimicrob. Agents and Chemotherapy 31,1675-1682 (1987)]. A tiol-függő enzim képes az acilcserét is katalizálni különböző penicillinekben, és nagyobb a jelentősége a magasabban termelő törzsekben, mint a gyengén termelő törzsekben [Pruess and Johnson, J.Bact.,94,1502-1508(1967)].
A jelen találmány tárgya ezen fontos bioszintézis enzim génjének izolálása, jellemzése és a gén szekvenciájának, valamint a gén-terméknek a magyarázata, amely lényeges előfeltétele a géntechnológiai munkának amely a termelési szint növelésére, a hibrid-, illetve muta-szintézisre, valamint új enzimatikus β-laktám transzformálási módok leírására irányul.
A fehérje szekvenálása Laursen [Methods in Enzymology, 25, 344-359 (1972)] szerint ismert. Ez hasonló a tudomány mai állásához a fehérjéket kódoló gének lokalizálásában [Rothstein et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, XLV, 99-105 (1981)], valamint szekvenálásában [Maxam and Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499-560 (1980)]. A génnek egy erős, adott esetben indukálható promoterhez való kapcsolását Pribnow írta le [Biolog. Regulation and Development, Vol, 1., 231-277, Plentum Press No. 4 (Goldberger et al., 1979)].
A β-laktám bioszintézis számos enzimét izolálták már tiszta formában és jellemezték szerkezetét. Hasonlóan, időközben számos fent említett enzim kódoló régióját izolálták, szekvenálták, transzformációra alkalmas expressziós vektorba építették be és klónozták [például az izopenicillin N szintetáz Cephalosporium acremoniumból: Sámson et al., Natúré 318, 191-194 (1985); Baldwin et al., J. Antibiotics 49 (5), 652-659 (1987); EP 200 425 Eli Lilly (1985); az izopenicillin N szintetáz Penicillium chrysogenumból: Carr et al., Géné 48 257-266 (1986): EP 225 128 Eli Lilly (1985); az expandáz Cephalosporium acremoniumból: Sámson et al., Biotechn. 5, 1207-1214 (1987): valamint számos más enzimet Streptomyces clavuligerusból, amelyek katalizálják a β-laktám bioszintézist: EP 233715, Beecham (1986)]. Egy β-latkám termelő mikroorganizmus első transzformációját ilyen expressziós vektorral Skatrud és munkatársai írták le [Curr. Génét. 12/5,337-348 (1987)].
A PAT-ot, amely a penicillin bioszintézis utolsó lépését, azaz az izopenicillin N transzacilezését, 6APA-ra való hasítását és penicillinné való acilezését katalizálja a 9. ábrán látható reakcióséma szerint, már korábban azonosították (lásd fent) penicillin-termelő gombatörzsekben, és leírták többszörös katalitikus funkcióit, de rendkívüli instabilitása miatt nem tudták megfelelő tisztaságban előállítani és szerkezetét leírni. A tiol-dependens PAT, amely erősen instabil, enyhén savas és növekvő mennyiségben keletkezik a penicillin-termelő PenicilVum chrysogenum 40-100 órás fermentálása során, egyrészt katalizálja a koenzim A aktivált fermentatív oldalláncok (pl. a hidrofób prekurzor vegyületek, a fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav, hexánsav, oktánsav stb. acil-koenzim-A vegyületek) acil transzferét a természetes penicillinekre (pl. izopenicillin N, penicillin V, penicillin G, 6-APAP stb.), másrészt katalizálja a természetes penicillinek egymás közötti aciltranszferét, azaz az acil-enzim komplex útján működő acil-transzfer során a természetes penicillinek mind acil donorként, mind acil akceptorként működnek, míg a koenzim A aktivált hidrofób prekurzor vegyületek csak acil donorként léphetnek be az enzimatikus reakcióba. Mivel az acil transzfer vizes közegben játszódik le, a víz mint nukleofil ágens is verseng az acil-enzim komplexszel, míg az acil donorok, amelyek energiában gazdagok, egyszerűen hidrolitikusan elhasíthatók. így a 6-APA, a természetes penicillinek β-laktám magja mindig megtalálható a penicillin fermentációk fermentlevében.
HU 208 845 Β
A PAT kimutatását végezhetjük szokványos analitikai módszerekkel, úgymint radioaktív, mikrobiológiai vagy kromatográfiás tesztmódszerekkel. A következő három különböző tesztmódszert állítottuk be például a PAT 6-APA-fenoxiacetilkoenzim A acil-transzferáz aktivitásának meghatározására, amely a következő enzimatikus reakciót katalizálja:
6-APA + fenoxi-acetil-koenzim A = penicillin V + koenzim A
a) A penicillin V kimutatása mikrobiológiai agardiffúziós módszerrel, specifikus termék-érzékenységgel rendelkező teszt törzset használva, például a Micrococcus luteus ATCC 9341 törzset, amelynek a penicillin iránti érzékenysége több mint három nagyságrenddel nagyobb, mint a 6-APA iránti érzékenysége.
b) s35-jelzett 6-APA használata esetén (enzimatikusan állítható elő s35-penicillin G-ből) az extrahálható s35-penicillin V detektálása β-számlálóval.
c) Az extrahált penicillin V detektálása HPLC-vel.
Az enzimatikus transzacilezési reakciókat mikrotiter lemezeken végezzük, a következő reakcióeleggyel:
6-APA (2,5 mg/ml a reakció-elegyben) 20 μΐ
PaCoA (kb. 15-20 mg/ml bidesztillált vízben) 30 μΐ enzim, illetve reakció puffer (0,1 M foszfát puffer, pH = 7,8, + 1 mM DTT) 150 μΐ
Az egy órás stacioner inkubálási periódusnak a legelején, vagy az egy órán belül különböző időpontokban 20 μΐ-es alikvot részeket veszünk, majd ugyanazon a mikrotiter lemezen 1 : 5 arányban hígítjuk 50%os etanollal (ezzel leállítjuk az enzim reakciót), illetve 1: 1 arányban hígítjuk 5 U/ml penicillinázzal (β-laktám kontroll), majd a penicillin V tartalmat vizsgáljuk agardiffúziós módszerrel olyan lemezeken, amelyeket Micrococcus luteus ATCC 9341 törzzsel oltottunk be, illetve a laktám-szuperszenzitív Pseudomonas aeruginosa BC 248 törzzsel (oltási arány 0,5%, a táptalaj DIFCO 1-es antibiotikum-táptalaj, 50 μΐ per luk, inkubálás 15 óra 37 ’C-on).
Különböző időpontokban alikvot részeket veszünk ki az enzimes transzacilezési preparátumból (ugyanaz az elegy, mint fent, 2 ml össztérfogat), majd 1 : 1 arányban extraháljuk di-izopropil-éterrel (pH = 2,0, HCI), a szerves fázist nitrogénnel kiűzzük, a maradékot azonos térfogatú reakció-pufferben szuszpendáljuk, majd HPLC-vel vizsgáljuk penicillin V tartalmát (a körülmények ugyanazok, mint a PaCoA tartalom meghatározásnál, csak az eluens 40% metanol és 60% 0,01 M TBAS 0,028 M foszfát pufferben, pH = 7,0).
Retenciós idők (perc)
| fenoxi-ecetsav | 1,10 |
| penicillánsav G | 1,62 |
| penicillánsav V | 1,92 |
| penicillin G | 3,00 |
| penicillin V | 4,92 |
| 3-dezacetoxi-cefalosporin V | 2,46 |
| cefalosporin | 3,24 |
A multispecifikus PAT enzim többi aktivitását hasonlóképpen meg lehet határozni HPLC-vel, mikor is a poláris szubsztrátok, illetve termékek eluálásához főleg
0,001 M TBAS 0,025 M foszfát pufferben (pH = 7,0) készült oldatát használjuk.
Retenciós idők (perc)
| izopenicillin N | 1,67 |
| 6-APA | 4,00 |
| DTT red. | 2,41 |
| DTT oxid. | 4,60 |
A prekurzor nélküli penicillin fermentációkból az izopenicillin N kinyerhető adszorber gyantát (DIAION
HP 20) és fordított fázisú kromatográfiát alkalmazva (Nucleosil C 18, 10 pm).
Az enzim-preparátumtól függően különös figyelmet kell fordítani az indikátor reakció megválasztására, amellyel a multispecifikus bioszintézis enzim aktuális aktivitását ki akarjuk mutatni. Például nem különösebben célszerű a 6-APA-fenoxiacetil-koeznzim-A acetiltranszferáz aktivitást használni a PAT indikátor reakciójának a nyers kivonatban, mivel a nyers enzimkészítményben jelen levő zavaró aktivitások egyrészt gyorsan hidrolizálják a fenoxi-acetil-koenzim = A-t (=PaCoA) és a penicillin V-t, másrészt acilezik a 6APA-t a PaCoA energiában gazdag oldallánc származékával penicillin V-vé, amit például ismert proteolitikus enzimek, úgymint a kimotripszin, katalizálnak.
Azonban ezek az interferáló aktivitások könnyen megkülönböztethetők az aktuális tiol-dependens PAT-tól. Például eltérő kromatográfiás elúciós tulajdonságokkal, stabilitási profillal és inhibiciós mintázattal rendelkeznek. Ezek a zavaró aktivitások magyarázzák egy30 részt a nyers preparátumokban korábban talált nagyon alacsony PAT specifikus aktivitást (körülbelül ΙΙΟ μϋ/mg fehérje), másrészt hasonlóan az a felfedezés is paradoxonnak tűnik, hogy a nyers extraktumban talált 6-APA-PaCoA-aciltranszferáz aktivitás nagymér35 tékben megnő, ahogy az enzim hígítása nő, egész egy maximum aktivitásig. A PAT detektálásában egy lényeges faktor a redukáló anyagok jelenléte, úgymint a ditiotreitol vagy β-merkapto-etanol, amely aktiválja, illetve stabilizálja az oxidációra erősen érzékeny SH40 enzimet.
A PAT erős hőmérséklet-érzékenysége hasonlóképpen nagyon nehézzé teszi az enzim tisztítását. Például egy frissen izolált enzim-preparátum a teljes tiol-dependens 6-APA-PaCoA aciltranszferáz aktivitását el45 veszti, ha egy órán át 37 ’C-on tartjuk, annak ellenére, hogy különböző stabilizátorok vannak jelen (pl. 5 mM ditiotreitol + 5% szorbit + 0,1 mM fenil-metán-szulfonil fluorid). Tehát célszerű az összes tisztítási munkát hűtőszobában 4 ’C-on végezni, oxidáció elleni véde50 lem mellett. A nyers, előtisztított emzim-oldatokat lefagyaszthatjuk (-196 ’C, -20 ’C), néhány hétig lefagyasztva tárolhatjuk stabilizáló anyagok jelenlétében anélkül, hogy észlelhetően veszítene az aktivitásából, azonban néhány felolvasztás-lefagyasztási ciklus azon55 nal eltünteti a PAT aktivitást. Az ammónium-szulfát csapadékok hasonlóképpen többé-kevésbé stabilak néhány napig vagy hétig 4 °C-on az említett stabilizáló keverék jelenlétében.
Fiatal, penicillin-pozitív micéliumból a találmány szerinti PAT tisztítási eljárás a micélium feltárása, a
HU 208 845 Β nukleinsavak kicsapása, a fehérjék kicsapása, hidrofób interakció- és affinitás-kromatográfia után egy viszonylag stabil, legalább 50%-os aktivitású enzim-preparátumot eredményez, ami szükséges az enzim-kinetikai, illetve protein-kémiai jellemzéshez. Egy viszonylag tárolható fehérje előállításához a kicsapást szokásos tisztítási eljárással végezhetjük, például a sejteket nagy nyomású homogenizálóval vagy üveggolyós malomban tárjuk fel, a nukleinsavakat cetil-trimetilammónium-bromiddal, streptomicin-szulfáttal vagy protamin-szulfáttal kicsapva. A fehérje kicsapására a más anyagok mellett az ammónium-szulfát is megfelel, 50%-os telítés már elegendő az összes PAT aktivitás kicsapásához. Az ammónium-szulfát csapadékból kiindulva a tiol-függő PAT-t hidrofób kölcsönhatással fenilszefaróz Cl 4 B-hez kötjük, majd a ballaszt-fehérje több mint 90%-ának eltávolítása után a terméket alacsony ionerősségű vizes stabilizáló oldattal leoldjuk, 10 kD vágási értékű ultraszűrő membránnal töményítjük, majd előnyösen tovább tisztítjuk affinitás-kromatográfiával, illetve egy más eljárás szerint gélszűréssel (Ultrogel Aca 54), anioncserélő kromatográfiával (DEA szefaróz FF), illetve adszorpciós kromatográfiával (hidroxilapatit), így egy legalább 50%-os aktivitású enzimpreparátumot kapunk, ami megfelel egy legalább 1000-szeres koncentrációs faktornak, az ammónium-szulfát csapadékra számolva.
Affinitás-mátrixnak a szokásos makroporózus hordozóanyagok használhatók, mint például a szefaróz, polimer anyagok, stabilizált szilikagél, alumínium-oxid stb. A megfelelő affinitás-ligandumok, amelyek a hordozóhoz C2—C10 karon keresztül, vagy anélkül kovalensen vagy hidrofób kötéssel, illetve ionos reciprok kötéssel kapcsolódnak, előnyösen acil-, illetve aminoβ-laktám vegyületek. Ezeket a ligandumokat úgy kell a karokhoz, illetve a mátrixhoz kapcsolni, hogy a ligandum kötőhelye a tisztítandó enzim számára hozzáférhető maradjon. A jelen találmány szerint különösen jó tisztítási hatás főleg affinitás mátrixokkal érhető el, terminális amino-karokkal, úgymint AH-szefaróz 4B, illetve HMD-Ultrogel Aca 34, amelyekhez N-etoxikarbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolinnal (EEDQ) kapcsolhatjuk a ligandumokat, úgymint a természetes penicillineket, előnyösen a 6-APA-t, penicillin-V-t vagy penicillin-G-t, illetve az analóg stabil 3-dezacetoxi-cefalosporin vegyületeket, úgymint a 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsavat (7-ADCA), illetve a 7-fenoxiacetamido- vagy 7-fenil-acetamido-3-dezacetoxi-cefalosporánsavat (3-dezacetoxi-cefalosporin V és G). Tehát az amino-P-laktám affinitás-mátrixok a megfelelő fenil-acetamido-P-laktám mátrixokból állíthatók elő drága védőcsoport technológia nélkül oldható. E. coli penicillin G acilázzal.
Az enzim-termeléshez szükséges mikroorganizmusokat a penicillin-termelésnél megszokott táptalajon tenyésztjük. A táptalaj öszetevői mind olyan szubsztrátumok, amelyeket a gombák tenyésztésében általában használnak. Ezen tápanyagok melletti olyan adalékanyagokat, amelyek a mikroorganizmusok növekedését serkentik, illetve növelik a PAT aktivitást is adagolhatunk megfelelő kombinációban. Adalékanyagok például a magnézium-szulfát, nátrium-klorid, kalciumkarbonát, foszfátok és hasonló szervetlen sók, valamint a növekedést serkentő anyagok, vitaminok és nyomelemek. Különböző induktorok, előnyösen fenoxi-, illetve fenil-ecetsav és származékaik vagy analógjaik hozzáadásával az elért enzim-titer lényegesen megnövelhető.
A tenyésztést általában süllyesztett levegőztetett körülmények között végezzük 15-30 °C közötti hőmérsékleten 4 és 8 közötti pH-értéken. A maximális enzim-aktivitás eléréséhez szükséges idő függ az alkalmazott mikroorganizmus típusától, tehát a tenyésztés optimális idejét előnyösen minden egyes törzsre különkülön ki kell dolgozni. A tenyésztés ideje általában 2-5 nap között változik. Transzacilezéshez a fermentlevet, illetve az ebből készített szekunder készítményt használhatjuk. Az ilyen aktív szekunder készítményre példa lehet a tenyészetből kinyert és mosott módosítatlan, illetve permeabilizált sejtek: a micélium fizikai, kémiai és enzimatikus kezelésével kapott sejtmentes extraktumok (például a micélium feltárásával vagy ultrahangos kezelésével előállított sejthomogenizátumok és a felületaktív-anyagokkal vagy enzimekkel való kezelés után keletkező sejt-lizátumok); a kívánt enzim részlegesen vagy teljesen tisztított készítménye, amelyet a sejtmentes extraktumok szokványos enzim-tisztítási módszerekkel való tisztításával állíthatunk elő, például kisózással, frakcionált kicsapással, gélszűréssel, ioncserélő, adszorpciós- és affinítás-kromatográfiával; stabilizált PAT preparátumok, amelyeket úgy kapunk, hogy az enzimet, illetve a módosítatlan, illetve a permeabilizált sejteket akár fizikailag, akár kémiailag immobilizáljuk nagy molekulasúlyú, vízben oldhatatlan hordozókkal, adszorpcióval, kovalens kötéssel, keresztkötések kialakításával, bezárással vagy kapszulázással.
A fentiek szerint előállított enzim-koncentrátumok enzimatikus, illetve fiziokémiai jellemzését klasszikus módszerekkel, például kromatográfiával, elektroforézissel, kutatásszempontú szubsztrát-specifitással, Nterminális szekvenálással, az aktivitás és stabilitás pH és hőmérséklet profiljával, az aktivitás, inhibició és stabilizáció tanulmányozásával végezhetjük.
Számos módszer létezik gének izolálására. Egy általános összefoglalót adnak Watson és munkatársai (Rekombinierte DNA - Eme Einführung, Heidelberg, (1983), valamint Winnacker (Gene und Klone - Eine Einführung in die Gentechnologie, Weinheim, 1984). A pat gén esetében (a PAT enzim génje) legcélszerűbbnek tűnik a szintetikus DNS próbák alkalmazása, mivel a szükséges aminosav-szekvenciákat meghatározták. A genetikai kód alapján a PAT 1 polipeptidjének aminosav-sorrendje felhasználásával megtervezhető a DNSszekvencia, és a megfelelő oligonukleotidokat kémiailag megszintetizálhatjuk. Az 5. ábrán láthatjuk a PAT 1 polipeptid 2-22 aminosavjának sorrendjét. Mivel néhány aminosavhoz 2, 3, 4 vagy 6 kodon is tartozik, ezért az aminosav-szekvencia alatt látható nukleotidszekvencia az eredmény. A 16. és 21. aminosav közötti szakasz különösen alkalmas, mivel itt csak 16 különbö4
HU 208 845 Β ző génszekvencia lehetséges. Ezt a 16 oligonukleotidot, amely az RNS-sel komplementer, négy, egyenként négy oligonukleotidot tartalmazó keverék (az 5. ábrán
1,2, 3 és 4 jelű oligonukleotid keverék) formájában lehet megszintetizálni. A gén még biztosabb azonosítása valószínűleg nem lehetséges ezekkel az oligonukleotidokkal, mivel a Penicillium chrysogenum genomjában további, nagyon hasonló DNS szekvenciák találhatók. Ezek között a DNS szekvenciák között nagyon bonyolult dolog lehet különbséget tenni. Ennélfogva tanácsos, ha további oligonukleotid is van tracer szekvenciaként.
A stratégiát gének izolálására DNS próbák felhasználásával Lathe írja le [J. Mól. Bioi., 183, 1-12 (1985)]. Ha például van információnk bizonyos kodonok vagy bizonyos dinukleotid sorozatok előfordulásának gyakoriságáról, akkor hosszabb DNS szekvencia is megszintetizálható. A Penicillium chrysogenumre ilyen információval nem rendelkezünk. Ennek ellenére, hogy próbaként hosszabb oligonukleotidok állnak rendelkezésünkre, az elérhető oligonukleotidokat szekvenáló printerként használhatjuk: a reverz transzkriptáz enzim képes az adott RNS-sel komplementer DNS szál szintézisére, de csak akkor, ha megfelelő starter molekula (primer) van jelen. A leírt esetben az 1-4 oligonukleoitod keveréket lehet printerként használni. Tehát így lehetséges csak a pat mRNS szekvenálása, jóllehet számos más mRNS is jelen van a készítményben. A szekvenálási reakciót bázis-specifikus lánctörő reagensek (didezoxi-nukleotid-trifoszfátok) jelenlétében végezzük. így számos meghosszabbodott oligonukleotidot állítunk elő, amelyeknek gélelekroforetikus analízise lehetővé teszi a pat mRNS-sel komplementer DNS bázis-sorrendjének meghatározását. Ennek a módszernek az az előnye, hogy a kapott szekvencia-információ lehetővé teszi új oligonukleotidok direkt szintézisét. Emellett nagyon fontos, hogy ez a szekvencia konform legyen az aminosav-szekvenciából származtatott szekvenciával, és ezáltal igazolja, hogy egy pat-specifikus szekvencia valóban létezik.
A gén izolálását ezután egy gén-bankból végezhetjük. A gén-bank (klóntár) olyan rekombináns DNS vektorok gyűjteménye, amelyek mindegyike tartalmaz a Penicillium chrysogenum DNS-éből egy kis részt (a lambda-EMBL3 gén-bank esetében ez körülbelül 0,05% per rekombináns molekula). A tarfolt hibridizáció módszerével a lambda-klónok izolálhatok, és ezek hibridizálnak a radioaktívan jelzett DNS próbával. Ezeknek a kiónoknak a DNS-éből fizikai térkép készíthető. Az ilyen restrikciós térkép a restrikciós endonukleáz hasítási helyeket mutatja, amelyek az orientáció meghatározását szolgálhatják. DNS hibridizálási technikák felhasználásával megállapítható, hogy a DNS próba a DNS melyik részével hibridizál. A megfelelő fragmentet plazmid- vagy bakteriofág-vektorba építjük be, és tovább jellemezzük molekuláris-genetikai módszerekkel. Egy DNS szegmensnek M13mpl9 vektorba klónozása ezután lehetővé teszi a DNS szekvencia meghatározását, primerként a pat-specifikus DNS-próba használható. A DNS további szekvenálása lehetővé teszi a gén kódoló részének, valamint az ebből származtatható aminosav-szekvenciának a bizonyítását. A már meghatározott részleges aminosav-szekvencia szolgáltatja a szükséges információt.
A DNS-szekvencia információ alapján a Penicillium chrysogenum pat-génje beépíthető egy expressziós vektorba, amely a PAT jó expresszióját teszi lehetővé jól ismert expressziós organizmusokban [Reznikoff and Gold, Maximizing Gene Expression, Boston (1986)]. Hogy a pontos konstrukciót lehetővé tegyük, amelyben az ATG pontosan az E. coli start-kodonjának helyére kerül, egy Ncol hasítási helyet építhetünk be helyspecifikus mutagenezissel. Azonban ezelőtt egy komplett cDNS kiónt kell izolálni egy megfelelő klóntárból. A 19. példa (lásd még a 7. ábrát) leírja a pBC2001 plazmid készítésének részleteit. Ennek végrehajtásához először a pat-cDnS kiónból a DNS fragmentet Ml 3mp 19 vektorba klónozzuk. Ezzel van olyan egyszálú DNS-ünk, amely helyspecifikus mutagenezisre használható az Ncol hasítási hely bevitele céljából; emellett egy HindlII helyet is beépítünk, amely a klónozáshoz szükséges. A pBC2001 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy az NcoI-HindlII fragmentet beépítjük a pKK233-2 vektorba. Ez megfelelő jeleket tartalmaz az
E. coliban való expresszióhoz (ptrc, σηΒΤ1Τ2) és az
E. coliban való szelekcióhoz egy empicillin rezisztencia (bla) gént.
A pat-gén DNS-ét olyan vektorokba is beépíthetjük, amelyek lehetővé teszik Penicillium chrysogenum vagy más β-laktám antibiotikumot termelő mikroorganizmusok transzformációját. Mivel a transzformánsok gyakran több példányban tartalmazzák a bevitt DNS-t (pl. Kolar et al.,), a gén erősebb expressziója is lehetséges, ami megnövekedett penicillin-termeléshez vezethet. A 20. példában a pBC2002 plazmid készítését írjuk le, amely a Penicillin chrysogenum transzformálására használható. A pBC2002 (lásd még a 8. ábrát) a teljes Penicillium chrysogenum pat gént tartalmazza egy
4,8 kb méretű Sáli restrikciós fragmenten, amelyet a módosított pHS103 vektorba építünk be. A phleomicin rezisztencia gén (ble) lehetővé teszi a Penicillium chrysogenumban való szelekciót, az ampicillin rezisztencia gén (bla) lehetővé teszi az E. coliban való szelekciót.
Továbbá, a DNS manipulálása is lehetséges. A promoter rész kicserélése hasonlóan megjavíthatja a transzkripciót Penicillium chrysogenumban. Az ATG-k helyspecifikus mutagenezise javíthatja a transzlációt Penicillium chrysogenumban. Az egyes kiválasztott aminosavak kicserélése helyspecifikus vagy fragmentspecifikus - nem irányított, de gén-specifikus - mutagenezissel lehetővé teszi speciális mutánsok izolálását, amelyeknél megváltozik az enzim stabilitása, aktivitása vagy specifitása.
Véletlenszerűen vagy nem véletlenszerűen szelektált mikroorganizmusok átvizsgálása - amikor az ilyen organizmusok DNS-ét radioaktív pat DNS-sel specifikusan hibridizálva vizsgáljuk - szintén kézenfekvő alkalmazása az izolált DNS darabnak. Az ilyen átvizsgálás (screening) olyan törzseket eredményezhet, ame5
HU 208 845 Β lyek addig ismeretlen β-laktámokat termelnek, vagy olyan törzseket, amelyek tartalmazzák a PAT-szerő enzimeket, de más tulajdonságokkal rendelkeznek.
A jelen találmány szerinti DNS-t Penicillium chrysogenumból izoláltuk. Az eljárást a 10-13. példákban írjuk le, és a 4., 5., 6. ábrákkal illusztráljuk. A PAT 1 polipeptid aminosav-szekvenciájából (5. ábra), kiindulva, négy oligonukleotidot szintetizáltunk (5. ábra, 1-4 oligonukleotid keverékek, 6C ábra), amelyeket szekvenáló printerként használtunk (11. példa). Az így meghatározott szekvencia első 29 bázisa konform a posztulált pat mRNS szekvenciával (6B ábra). Ennek az információnak az eredményeképpen egy 30 tagú oligonukleotidot szintetizáltunk (6E ábra), amelyet radioaktív próbaként használtunk egy lambda-klón izolálására, a Penicillium crhysogenum klóntárból (12. és 13. példák). M13 vektorokba való szubklónozás után a DNS-t szekvenáljuk (6F ábra). Ennek a szekvenciának az első 77 bázisa megegyezik az mRNS-sel komplementer szekvencia 35-111-es bázisaival (6D ábra). Az ezen szekvenciák közötti kapcsolat igazolja, hogy valóban a pat gént izoláltuk.
A Pat molekulasúlya körülbelül 38000 D. Az aminosavak átlagos molekulasúlyából (110 D) a gén kódoló részére körülbelül 1100 bp becsülhető. Mivel a fonalasgombák génjei általában kevés és kis intront tartalmaznak [Ballance, Yeast, 2, 229 (1986)], ezért feltételezhető, hogy a teljes gén a leírt DNS molekulán található és a kontroll régiók hasonlóképpen teljes egészükben megtalálhatók.
A következő példák illusztrálják a találmányt, anélkül, hogy korlátoznák. A rövidítésekben a ml, 1, mg, g, rpm, DS, WV% és U jelentése milliliter, liter, milligramm, gramm, fordulat per perc, szárazanyag, vegyes százalék és nemzetközi enzim-egység (1 nemzetközi enzim egység = 1 μιτιόΐ szubsztrát/perc). A vegyesszázalék súly per térfogatra vonatkozik, azaz g/ml-re, a hőmérsékletet Celsius fokokban adjuk meg. A termékek jellemzését a következő technikákkal végeztük: nagy nyomású vékonyréteg kromatográfia (HPTLC), nagy nyomású folyadékkromatográfia (HPLC), ultraibolya spektrofotometria (UV), infravörös spektrofotometria (IR) és magmágneses rezonancia (NMR). A példákban felsorolt törzsnevekhez hozzáírt számok megfelelnek azoknak a törzsgyűjteményeknek a sorszámainak, ahol a törzset letétbe helyezték, azaz például az ATCC-nek (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA).
A fenoxiacetil-koenzim A (PaCoA) előállítása és elemzése:
Elmélet: koenzim A + fenoxiecetsav klorid = PaCoA
901 mg CoA-t oldunk hűtés közben 15 ml bidesztillált vízben, a pH-t nátrium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk (2,56 ml 1 N NaOH és 1,60 ml 0,5 N NaOH). Ezt követően összesen 235 mg fenoxiecetsav kloridot adunk az oldathoz részletekben, állandó kevertetés közben, és a pH-értékét 7,0-n tartjuk (1,8 ml 1 N NaOH). Miután egy órán át kevertettük jeges hűtés közben, az oldatot háromszor extraháljuk 40-40 ml dietil-éterrel pH = 2,0 mellett (6, illetve 1 N HC1), majd a vizes fázist NaOH-val semlegesítjük, az étermaradékot szobahőmérsékleten eltávolítjuk rotációs bepárló berendezésben, az elegyet rövid ideig nitrogénnel átöblítjük, majd 1: 50 arányban hígítjuk bidesztillált vízzel, ampullákba helyezzük 500 ples mennyiségben, majd folyékony nitrogénben tároljuk. Az elemzést HPLC-vei végezzük, standardként fenilacetil-koenzim A-t (PeCoA) használunk.
HPLC rendszer: HP 1090 Liquid Chromatogram (Hewlett
Packard)
Oszlop: Hypersil ODS 5 μιη, C18,150x200 mm Integrátor: Model 3392 (Hewlett Packard)/ATT 3 Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc
Detektálás: 230 nm
Eluálószer: 35% metanol
65% 0,01 M tetrabutilammónium-szulfát (TBAS) 0,025 M foszfátpufferben pH = 7,0
| Kiértékelés: minta | Retenciós idő (perc) | Terület | Magasság |
| 400 pg/ml PeCoA | 9,41 | 8466900 | 210692 |
| 200 pg/ml PeCoA | 9,68 | 4105 400 | 107 689 |
| 100 pg/ml PeCoA | 9,88 | 2092100 | 54990 |
| PaCoA törzsoldat 1 : 200 | 10,53 | 1966600 | 47 737 |
| PaCoA törzsoldat 1 : 50 | 10,68 | 7850700 | 172983 |
| PaCoA törzsoldat 1 : 40 | 10,47 | 10389000 | 222475 |
terület integrálás, 19,2 mg PaCoA/ml,, magassági értékelés, 16,8 mg PaCoA/ml,, átlagérték, 18,0 mg PaCoA/ml,,
1. példa
Egy Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271 liofilizált spórákat tartalmazó ampulla tartalmát 8 ml A táptalajban szuszpendáljuk (összetétele 1 literre számítva: 15 g laktóz, 0,11 g nitrogén kukoricalekvárból, 5 g Witte pepton, 4 g NaCl, 0,5 g MgSO4x7 H2O, 0,6 g KH2PO4, 5 mg FeCl3x6 H2O, 2 mg CuSO4x5 H2O, az egész desztillált vízzel 1000 ml-re feltöltve, pH = 4,85, sterilezés 20 perc 120 ’C-on). Ezzel a spóraszuszpenzióval egy 2 literes Erlenmeyer lombikban lévő 225 ml árpát oltunk be. A betöltés előtt az árpát addig mossuk vízzel, míg tiszta nem lesz, hagyjuk az A táptalajban 30-30 percig duzzadni, szitán átszűrjük, körülbelül egy óra hosszat szűrőpapíron szárítjuk, ezután 225 ml térfogatban 2 literes Erlenmeyer lombikba töltjük, 100 ’C-on háromszor egymás után sterilezzük egy órán át, közben egy-egy napot pihentetjük, majd beoltás előtt 2 napon át 40-45 ’Con szárítjuk. A spórákkal való beoltás után az Erlenmeyer lombikot rövid ideig rázatjuk, majd körülbelül 8 napig 24+1 ’C-on inkubáljuk 60+10%-os relatív nedvességtartalom mellett.
Ezután a stacioner inkubálási periódus után a gom6
HU 208 845 Β baspórákat 3-5 percig 140 rpm-mel szuszpendáljuk 250 ml 0,9% NaCl+0,1% Tween 80 összetételű oldatban vertikális rázóban. Miután újabb 250 ml 0,9%-os NaCl oldatot adtunk hozzá (Tween 80 nélkül), a spóraszuszpenziót sterilen dekantáljuk egy 1 literes oltókannába, 5 50 db 2 literes Erlenmeyer lombikot, amelyekben 200 ml B táptalaj van (összetétel 1 literre számítva: 9 g káliumfenoxi-acetát, 150 g laktóz monohidrát, 250 g nitrogén mint pharmamedia, 10,5 g (NH4)2SO4,4 g Na2SO4,0,5 g KH2PO4, 10 ml állati olaj (disznózsír), 25 g CaCO3, az 10 egészet 1000 ml-re feltöltve desztillált vízzel; pH = 6,5, sterilezés 20 perc 120 °C-on) 8-8 ml fenti oltóanyaggal oltunk be, amelyet 4 °C-on körülbelül egy hónapig lehet tárolni, majd három napig rázatjuk 25±1 °C-on 260 rpmmel. Ezután a rázatásos inkubálás után 1820 g enzimati- 15 kusan aktív biomasszát nyerhetünk ki. A penicillin titer
1,9 g penicillin V per liter biomassza.
2. példa
Enzimatikusan aktív nyers enzimpreparátum előál- 20 lítása
1786 g, az 1. példa szerint előállított nedves micélíumot ( = 220 g DS) 3,5 liter 0,1 M foszfát-pufferben szuszpendálunk [pH = 7,5, összetétele 5 mM ditiotreitol (DTT), 0,1% TritonxlOO és 0,1 mM fenil-metán-szulfo- 25 nil-fluorid (PMSF)], majd folyamatosan homogenizáljuk 2/3°-ra való hűtés közben üveggolyós malomban (600 ml-es acéltartály, 510 ml 500-850 μηι-es iivegygyöngyök, forgatási sebesség 2000 rpm, 0,1 mm súrlódási hézag távolság, áramlási sebesség 30 1/óra, előremoz- 30 gás 2-3°, visszafelé mozgás 5°, sóié hűtés -20/8° előremozgással és -5/-1° hátrafelé mozgással). A homogenizátumot ezután 30 percig 15000 rpm-mel centrifugáljuk 4 °C-on, a felülúszót 0 °C-on 0,5 v% (cetil-trimetil-ammónium)-bromiddal (CTAB) keverjük el, majd 30 percig 35 kevertetjük. A kicsapott nukleinsavat centrifugálással eltávolítjuk (10 perc, 15000 rpm, 4 °C), a felülúszót 50%os telítésre állítjuk be szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával, majd 4 °C-on tartjuk éjszakán át, hogy a fehérje kicsapása teljes legyen. A csapadékot ezután centrifugál- 40 juk, hideg, telített ammónium-szulfát oldattal mossuk, majd 5 v% szorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA és 0,1 mM PMSF hozzáadása után 4 °C-on tároljuk a következő kromatográfiás lépésig. A feltárás, illetve a két kicsapási lépés során fehérje-meghatározást végzünk (Bradford), il- 45 letve aktivitás meghatározást a (6-APA-PaCoA-acetiltranszferáz aktivitás mikrobiológiai kimutatása a laktám szuperérzékeny Pseudomonas aeruginosa BC 248 törzszsel). A talált értékeket az 1. táblázatban soroljuk fel.
3. példa
A transzacilezési aktivitás, illetve a penicillin V hasítási aktivitás mikrobiológiai detektálása az AScsapadék enzimpreparátumban inhibitor hozzáadásával, illetve anélkül
A 2. példa szerint előállított nyers enzimpreparátumot a következők szerint vizsgáljuk mikrobiológiai agar-diffúziós teszttel a 6-APA, illetve az izopenicillin N-PaCoA-val való transzacilezésére, illetve penicillium-kálium V hasítására (inhibitor hozzáadásával vagy anélkül) vonatkozóan:
teszt organizmus: Micrococcus luteus ATCC 9341/BC 85, 0,5%-os oltás teszt táptalaj: DIFCO 1-es antibiotikus-táptalaj, 110 ml teszt lemez: Nunc 243x243x18 mm minta: 50 pm per luk (átmérő 6 mm) inkubálás: 37 °C, 15 óra enzim: AS-csapadék (a 2. példa szerint előállítva):
ml centrifugált (20000 rpm/10 perc) felülúszót elöntünk, a csapadékot 20 ml RP + Z-ben szuszpendáljuk.
RP + Z: 0,1 M foszfát puffer, pH = 7,5 + 1 mM DTT + 10 mM MgCl2
A) Transzacilezés/acilezés
| Preparálás mikrotiter lemezeken: a | |
| szubsztrátum 6-APA, illetve izopenicillin | |
| N (2,5 mg/ml) | 10 μΐ |
| PaCoA (kb. 16 mg/ml) | 15 μΐ |
| enzim ill., RP + Z inhibitorral vagy anélkül Inhibitor: a) inhibitor nélkül (kontroll) b) 2 mM jódacetamid c) 2 mM PMSF | 75 μΐ |
A preparátumokból 0, 7, 30 és 60 perces inkubálás után 20 μΐ-es alikvotokat veszünk, 1: 5 arányban hígítjuk 50%-os etanollal diffúziós eljárással vizsgáljuk.
Az izopenicillin N transzacilezés (28 & 36) (HH 0 mm)
| Isopenícíllin N | a) | b) | c) | |||||||||
| s | 7' | 30‘ | 60' | s | 7' | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ | |
| No.28 | 22,5 | 25,5 | 26,0 | 23,0 | 21,1 | 20,8 | 18,3 | 14,7 | 22,7 | 24,7 | 25,7 | 20,7 |
| No.36 | 27,0 | 28,3 | 30,8 | 28,7 | 25,2 | 25,0 | 23,6 | 22,1 | 26,3 | 27,2 | 27,7 | 26,7 |
| Isopenicillin N h pg/ml | Penicillin V h pg/ml | |||||||||||
| 50 | 25 | 12,5 | 2,0 | 1,5 | 1,0 | 0,5 | 0,25 | |||||
| No.28 | 20 | 16,5 | 12,4 | 25,3 | 24,0 | 21,7 | 17,8 | 9,7 | ||||
| No.36 | 24,5 | 22,1 | 18,4 |
HU 208 845 Β
6-APA acilezése PaCoA-val az enzim-hígítás függvényében
| 1 : 5 | I : 10 | 1 : 50 | 1 ; 100 | ||||||||||||
| s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30' | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ |
| 18,3 | 24,4 | 24,3 | 15,7 | 18,6 | 25,4 | 28,5 | 25,4 | 16,0 | 24,2 | 30,7 | 30,7 | 14,5 | 21,3 | 26,7 | 27,0 |
| 1 :500 | 1 : 1000 | Penicillin V ug/ml | |||||||||||||
| s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ | 2,0 | 1,5 | 1,0 | 0,5 | 0,25 | |||
| 14,8 | 17,6 | 20,6 | 22,8 | 0 | 9,6 | 10,5 | 11,1 | 25,3 | 24,0 | 21,7 | 17,8 | 9,7 |
| B) Penicillin V hasítás | a) inhibitor nélkül (= kontroll) | |
| Preparálás mikrotiter lemezeken: | b) + 2 mM jódacetam id | |
| Penicillin V káliumsó 100 pg/ml | 10 pl | 15 c) + 2 mM etilmaleinamid |
| 0,1 M foszfát puffer pH = 7,5 | 15 pl | d) + 2 mM PMSF |
| enzim ill., RP + Z (+ inhibitor) | 75 pl | e) + RP + Z |
Penicillin V káliumsójának (HH 0 mm) hasítása különböző' inhibitorok jelenlétében
| a) | b) | c) | d) | ||||||||||||
| s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ | s | 7’ | 30’ | 60’ |
| 25,7 | 21,8 | 0 | 0 | 25,7 | 23,1 | 0 | 0 | 25,0 | 23,0 | 0 | 0 | 25,3 | 0 | 0 | 0 |
| Penicillin V káliumsó ag/ml | Transzáéi lezés összehasonlítás céljából | ||||||||||||||
| s | 7’ | 30’ | 60’ | 2,0 | 1,5 | 1,0 | 0,5 | 0,25 | 6-APA + PaCoA—>PeniCiliin V | s | 7’ | 30’ | 60’ | ||
| 27,4 | 24,7 | 23,4 | 18,4 | 11,9 | 17,0 | 23,2 | 26,9 | 25,9 | 17,0 | 23,2 | 26,9 | 25,9 |
4. példa
A PAT aktiválás, gátlása, stabilizálása és pH profilja A 2. példa szerint előállított PAT-ammóniumszulfát csapadékot 1:10 arányban hígítjuk 0,1 M reakció-pufferrel különböző aktivátorok, illetve inhibitorok vagy stabilizátorok jelenlétében, és a 6-APA-PaCoA acetiltranszferáz aktivitást mérjük azonnal, egynapos 4 ’Cos, illetve 20 ’C-os inkubálás után a mikrobiológiai tesztmodellben. Az eredményeket a 2. táblázatban fog- 40 laljuk össze.
5. példa
A PAT hőmérséklet-érzékenysége A 2, példa szerint előállított PAT ammónium-szul- 45 fát csapadékot 1 : 20 arányban hígítjuk 0,1 M foszfátpufferrel (pH = 7,5), amely 1, illetve 10 mM DTT-tartalmú, majd erősen lecentrifugáljuk, a felülúszót -196°, -20°, +4°, +20’ és +37 ’C hőmérsékleten tároljuk, és a
6-APA-PaCoA acetil-transzferáz aktivitást 0, 1,4, 26 50 és 120 óra elteltével vizsgáljuk a mikrobiológiai tesztmodellben. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük.
juk, amelynek pH-ja 7,5 és 1 M (NH4)2SO4-et és 1 mM DTT-t tartalmaz, és egy laboratóriumi hűtőkamrában +4 ’C-on egy olyan BP 113 oszlopra visszük, amely 35 200 ml ekvilibrált fenil-szefaróz Cl-4B-t tartalmaz. Az oszlopot ezt követően mossuk 50 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával 3 bázis-térfogatnyi 50 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5, tartalmaz még 1 M (NH4)2SO4-et és 1 mM DTT-t), majd a ballasztfehérjét eltávolítjuk további 2 bázistérfogatnyi 50 mM foszfátpufferrel (pH = 7,5, 1 mM DTT-t tartalmaz) majd a PAT enzimet 3 bázistérfogatnyi, 1 mM DTT-t tartalmazó ionmentes vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat egytized térfogatra koncentráljuk Pellicon kazetta rendszerben, poliszulfon ultraszűrő membránt használva, amelynek vágási értéke 10 kD, majd 1 v% szorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA és 0,1 mM PMSF oldatban stabilizáljuk, és a következő kromatográfiás lépésig -20 ’C-on tároljuk. A mikrobiológiailag meghatározott 6-APA-PaCoA-acil-transzferáz aktivitás és az egy bázistérfogatban található egyes frakciók összfehérje tartalma látható összefoglalva a következő táblázatban.
6. példa
A PAT tisztítása hidrofób interakciós kromatográfiával fenilszefaróz Cl-4B-n (HlCflow) és affinitás-kromatográfiával 6-APA-AH-szefaróz 4 B-n (ajfinity flow)
A 2. példa szerint előállított 240 g ammónium-szulfát csapadékot 2000 ml 50 mM foszfát pufferben old-
| Minta | Mikrobiológiai akt. (mm HH 0 Pseudomonas aeruginosa BC 248) | Összfehérje (mg) | ||
| 30 min | 30 min + Perese | |||
| sarzs | 19 | 24 | 0 | 5483 |
| PL 150/1 | 17 | 18 | 0 | 230 |
HU 208 845 Β
| Minta | Mikrobiológiai aki. (mm HH 0 Pseudomonas aeruginosa BC 248) | Összfehcrje (mg) | ||
| 30 min | 30 min + Perase | |||
| PL 150/2 | 16 | 15 | 0 | 102 |
| PL 150/3 | 14 | 15 | 0 | 98 |
| PL 150/4 | 0 | 0 | 0 | 2750 |
| PL 150/5 | 0 | 0 | 0 | 390 |
| PL 150/6 | trace | 15 | 0 | 52 |
| PL 150/7 | 18 | 31 | 0 | 389 |
| PL 150/8 | 0 | 0 | 0 | 14 |
A következő napon a HIC frakció aktív frakciót óvatosan megolvasztjuk és K 26/40 Pharmacia oszlopra visszük, amely 50 ml 6-APA-AH-szefaróz 4B affinitás mátrixot tartalmaz. Ezt a mátrixot úgy állítjuk elő, hogy a penicillin G-t AH-szefaróz 4B-hez kötjük (Pharmacia) EEDQ-val a „Practical guide fór use in affinity chromatography and related techniques”, Reactifs IBF-Societe Chimique Pointet-Girard, Francé, 1983, 133. oldalon szereplő leírás alapján (LKB), majd ezt követően a fenilecetsavat oldható E. coli penici 11 inG amidázzal lehasítjuk. Az oszlopot ezután 4 °C-on ml/perc sebességgel eluáljuk a következő oldatokkal:
AL 278/1: 12 alaptérfogat 50 mM-os foszfát puffer (pH = 7,5) + 1 mM DTT + 0,1 mM NaCl
AL 278/2: 3 alaptérfogat ugyanilyen puffer + 1 mM DTT + 0,1 mM NaCl + 1 mM 6-APA.
AL 278/3: 6 alaptérfogat ugyanilyen puffer + 1 mM DTT + 1 M NaCl + 1 mM 6-APA
A PAT aktivitás a 278/2 frakcióval eluálódik, a specifikus eluenssel a 6-APA egytized térfogatnyira koncentrálódik a Minitan kazetta rendszerben, poliszulfon-UF membránt használva, amelynek vágási értéke 10 kD, majd ismét összekeverjük az 1 v% szorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA és 0,1 mM PMSF összetételű stabilizáló keverékkel, majd részletekben lefagyasztjuk. Ennek a legalább 50%-os tisztaságú enzimpreparátumnak (HPLC szerint) a szubsztrát specifitását a 4. táblázatban közöljük.
7. példa
Az affinitás-kromatográfiával előállított PAT enzimkészítmény kromatofóku szólása Mono P/Pharmacia-val (Chromatofocussing AL31Q)
A 6. példában affinitás-kromatográfiával tisztított majd koncentrált PAT enzimpreparátum 1 ml-es részét óvatosan megolvasztjuk, majd puffer-cserét hajtunk végre rajta egy ekvil ibrált PD 10 Sephadex G 25 oszlopon, a puffért 25 mM bisz TRISZ/HC1 pufferre cserélve (pH = 6,3), majd ugyanilyen pufferrel ekvilibrált ml térfogatú FPLC Mono P oszlopra visszük, ezt követően azonnal eluáljuk 60 ml/óra áramlási sebességgel 100 ml 1 : 10 arányban hígított, pH 4-re állított polibuffer 74-gyel, majd csúcsonként frakcionáljuk, a csúcsokat analizáljuk, (akár eredeti fonnájukban vagy Centricon 10-zel tízszeresre töményítve) RPC-vel, SDS-gradiens poliakrilamid gélelektroforézissel, immobilin alapú izoelektromos fókuszálással és gélszűréssel.
Az 1. ábrán láthatjuk a PAT enzim elúciós profilját a Mono P-n. A multifunkcionális enzim legalább három izoelektromos formából áll (PAT 310/3, PAT 310/4 és PAT 310/5). Ezek a különböző töltésű enzim-variánsok jelenthetnek akár igazi izoenzimeket, akár ugyanannak az enzimek különböző redox formáit.
Amint az a 2. ábrán látható, a Penicillium chrysogenum tioldependens PAT-ja lebomlik az RPC denaturáló körülményei között (oszlop: Biorad Hi Poré RP 304, 250x4,6 mm; HPLC paraméterek: 0,5 ml/perc, 45 bar, 280 nm, 40°, 25 μΐ injektálási térfogat: lineáris gradiens az A eluens: 35% vizes acetonitril 0,01% trifluorecetsav és a B eluens: 80%-os vizes acetonitril 0,01% trifluor-ecetsav között, 30 perc), egy 1-es jelű polipeptiddé és az izo-, illetve a redox-variánstól függően, egy, illetve két eltérően hidrofób polipeptiddé (2a, illetve 2b variáns).
Az SDS-gradiens poliakrilamid gélelektroforézis során [lásd a 3a ábrát, a körülmények Laemmli szerint, Natúré, 227, 680-685, (1970), azonban 8-20% T gradiens-géllel a PAT enzim két különböző méretű polipeptiddé bomlik le, molekulasúlyuk körülbelül 30 és 8 kD. RPC és ezt követő SDS-gradiens-PAGE alkalmazásával kimutatható, hogy az RPC-nél először eluálódó
1- es polipeptid azonos a körülbelül 30 kD méretű komponenssel, és a két erősebben visszatartott, hidrofób komponens, a 2a és 2b azonosak a 8 kD méretű komponenssel. Az ilyen többdimenziós analízissel kimutatható továbbá, hogy a 2a és 2b kisméretű polipeptidek az SDS-gradiens-PAGE-nél azonosan vándorolnak, míg a bázikus izo-, illetve redox-variáns nagyobb, körülbelül 30 kD méretű 1-es polipeptidje gyorsabban vándorol, mint a savasabb forma megfelelő 1-es polipeptidje.
Az amfolin alapú izoelektromos fókuszálásnál (IEF) (lásd a 3b ábrát, a módszert az LKB Application Note 1804 szerint végezve) az aktív affinitási pool három, egymáshoz közeli csíkot mutat, 5,1-es izoelektromos ponttal.
Az immobilin alapú IEF keskeny pH tartományában (lásd a 3c ábrát, a módszert az LKB Application Note 1819 szerint végezve) a kromatofókuszálással elválasztott PAT-variánsok pi érétke 5,15,5,06 és 5,32.
A molekulasúly gélszűréssel való meghatározása során (Pharmacia Superose 12) (eluálószer: O.M. foszfát-puffer, pH = 7,5, amely 1 mM DTT-t tartalmaz, 0,4 ml/perc) 36,5 kD-os molekulasúlyt határoztunk meg, míg az LKB TKS-G2000 SW-vel (az eluens ugyanaz, 0,5 ml/perc) 38 kD molekulasúlyt határoztunk meg, ami jól korrelál a két denaturálódó, 1-es és
2- es polipeptid molekulasúlyának összegével.
8. példa
Az / -es és a 2a polipeptid, valamint a 2b polipeptid N-terminális szekvenálása A 6. példában leírt módon affinitás-kromatográfiával tisztított PAT-enzim preparátum további részét (2 mg fehérje) óvatos felolvasztás után kétszer elvá9
HU 208 845 Β lasztjuk RPC-vel (ugyanaz az oszlop és körülmények, mint amit a 7. példában megadtunk, csak a gradiens nő lassabban: min% B=0/0, 8/0, 20/12, 25/12, 30/100,
33/100, 36/0, 40/0), a frakciókat az 1-es, valamint a 2a és 2b polipeptidekkel liofilezzük, és az N-terminális szekvenciát fehérje-szekvenátorban meghatározzuk.
N-terminális aminosav-szekvencia:
kD-os egys.polipeptidl : rész-szekvencia 1
5 _-Thr-Thr-Ála-Tyr-Cys-Gin-Leu-Pro-Asn-Gly-Alá-Leu-Gin-Gly-Gin-Asn-Trp-Asp-Phe25 30
Phe- Ser-Alá -Thr-Lys-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg i KD-os egys/polipeptid 2a: rész-szekvencia 6
10
-Gln37
-Gly15
Met-Leu-His-Ile-Leu-Cys-Gin-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Glu-His-Gly-Ser-Alá25 30 34
Alá-Lys-Alá-Val-Ile-Alá -Arg-Ser-Ile-Asp-Phe-Alá-Val-Asp8 kD-os egység II/polipeptid 2b: rész-szekvencia 6
5 10 15 20
Met-Leu-His-Ile-Leu-Cys-Gin-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Glu-His-Gly-Ser-Alá25 30 35 40
Alá-LysVal-Ile-Alá-Arg-_Ile-Asp-Phe-Alá-Val-Asp-LeuGlyThrAz SDS-gradiens-PAGE-hez hasonlóan a 2a és 2b kis polipeptidek, amelyeknek eltér a retenciájuk az RPC-nél, nem különböznek a szekvenált molekularészben.
9. példa
Az 1-es és 2-es polipeptid proteolitikus peptid-fragmenseinek szekvenálása
A 8. példában leírtak szerint előállított 1-es, illetve 30
2-es polipeptidek liofilizált frakcióját enzimatikusan hasítjuk J. M. Wilkinson szerint [Practical Protein Chemistry-A Handbook, szerk. A. Darbre, (1986)] trip25 színnel, illetve lizil-endopeptidázzal, az egyes peptidframenteket RPC-vel izoláljuk, majd fehérje-szekvenátorral szekvenáljuk. Többek között a következő aminosav rész-szekvenciákat kapjuk:
As-rész-szekvencia 2 (az 1-es polipeptid triptikus peptid fragmentje~):
5 10 13
Gly-Alá-Thr-Leu-Phe-Asn-Ile-Ile-Tyr-Asp-His-Alá-ArgAS-rész-szekvencia 2 (az 1-es peptid triptikus peptid fragmenjte):
10
Pro-Thr-Asn-Pro-Asp-Glu-Met-Phe-Val-Met-Arg
AS-rész-szekvencia 4 (az 1-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
10
Glu-Leu-Asp-Pro-Leu-Pro-Asp-Ser-Trp-Asn-Arg AS-rész-szekvencia 5 (az 1-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
10 12
Met-Glu-Phe-LeuAsp-Gly-Phe-Asp-Gly-Thr-Lys
AS-rész-szekvencia 7 (az 1-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
10 14
Ile-Alá-Leu-Glu-Ser-Thr-Ser-Pro-Ser-Gin-Alá-Tyr-Asp-Arg AS-rész-szekvencia 8 (az 1-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
10 15
Val-Gly-Phe-Asn-Ser-Alá-Gly-Val-Alá-Val-Asn-Tyr-Asn-Alá-Leu-His
25 30 32
Leu-Gin-Gly-Leu-Arg-Pro-Thr-Gly-Val-Pro-Ser-His-Ile-Alá-Leu-Arg
AS-rész-szekvencia 9 (a 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
8
Thr-Glu-Phe-Alá-Tyr-Gly-Leu-Lys AS-rész-szekvencia 10 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
5
Tyr-TyrGlu-Ile-Arg
AS-rész-szekvencia 11 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
Trp-Pro-Lys
HU 208 845 Β
AS-rész-szekvencia 12 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
10
Ser-Ile-Asp-Phe-Alá-Val-Asp-Leu-Ile-Arg AS-rész-szekvencia 13 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
10
Asp-Val-Ser-Glu-1le -Val-Met-Leu-Asn-Thr-Arg
AS-rész-szekvencia 14 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
5 8
Gin-Val-Leu-Ser-Gin-Leu-Gly-Arg AS-rész-szekvencia 15 (a 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid fragmenjte):
1 5
Cys-Gin-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu
AS-rész-szekvencia 16 (a 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid fragmentje):
10
Tyr-Tyr-Glu-Glu-Ile-Arg-Gly-Ile-Alá-Lys AS-rész-szekvencia 17 (a 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid fragmentje):
10 15
Gln-Val-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Val-Ile-Glu-Glu-Arg-_-Pro-Lys
AS-rész-szekvencia 18 (a 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid fragmentje):
10 15
Gly-Alá-Glu-Arg-Asp-Val-Ser-Glu-Ile-Val-Met-Leu-Asn-Thr-Arg AS-rész-szekvencia 19 (a 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
5
Alá-Val-Ile-Alá-Arg
AS-rész-szekvencia 20 (a 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
5
Lys-Thr-Asp-Glu-Glu-Leu-Lys AS-rész-szekvencia 21 (a 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
4
Gly-Ile-Alá-Lys
AS-rész-szekvencia 22 (a 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
5
Val-Ile-Glu-Glu-Arg
AS-rész-szekvencia 23 (a 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid fragmentje):
10
Asn-ThrThr-Glu-Phe-Alá-Tyr-Gly-Leu-Lys AS-rész szekvencia 24 (a 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
3
Ala-Ala-Arg
10. példa
Poll(A)+ RNS izolálása Penicillium chrysogenum micéliumból:
A Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271 törzs 45 spóraszuszpenzióját rázó inkubátorban inkubáljuk 250 rpm-mel 70 órán át 25 °C-on 5 db Erlenmeyer lombikban (mindegyik 1000 ml-es), mindegyik 100 ml CDS táptalajt tartalmaz (1 liter CDS táptalaj összetétele az autokláv kezeléssel összhangban: 900 ml A oldat: 3 g Na- 50 NO3, 0,5 g MgSO4x7 H2O, 0,5 g KC1, 0,1 g FeSO4x2 H20,5 g élesztőkivonat, 10 g kazein-pepton, 20 g szacharóz, pH = 5,8 és 100 ml B oldat: 250 mM K2HPO4/KH2PO4, pH = 6,8). 12 db egyliteres Erlenmeyer lombikot, mindegyik 300 ml CDLP táptalajt tártál- 55 máz [összetétele ugyanaz, mint a CDS táptalajé, de 20 g szacharóz helyett 150 g laktózt tartalmaz literenként, valamint 50 ml 10%-os fenoxi-ecetsavat (vízben oldva, pH =
7,5, KOH-val állítva)], oltunk be 30 ml oltóanyaggal, majd 250 rpm rázás mellett 40 órán át 25 °C-on inkubál- 60 juk. A micéliumot Büchner-tölcséren szűrjük, röviden mossuk TE-vel (10 mM TRIS/HC1, pH = 8,1,1 mM EDTA), majd cseppfolyós nitrogénben finom porrá törjük. Az így kapott port lizis-pufferben szuszpendáljuk (5 M guanidin-monotiocianát, 10 mM EDTA, 50 M TRIS/HC1, pH =
7,5, 8% β-merkapto-etanol), (3 ml lízis-puffer/gramm nedves micélium-tömeg): majd egy óránt át szobahőmérsékleten kevertetjük. Az össz-RNS-t ismert módszerrel izoláljuk [Cathala et al., DNS, 2, 329-335 (1985)]. 60 g nedves micéliumból 18 g nyers RNS-t lehet izolálni. Ezt etanollal kicsapjuk, majd -70 “C-on tároljuk. A poli(A)+ RNS töményítését oligo (dT) cellulóz affinitás-kromatográfiával végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)]. Ebből a célból a nyers RNS-t centrifugáljuk, szárítjuk, majd vízben oldjuk. Kromatografálás után a poli(A)+RNS-t ismét kicsapjuk etanolall, majd -70 °C-on tároljuk. A poli(A)+-RNS-t glíoxál jelenlétében gél-elektroforézissel vizsgáljuk, a koncentrációját UV abszorpció alapján határozzuk meg.
HU 208 845 Β
11. példa
A PATenzimet kódoló RNS részleges szekvenálása A genetikai kód alapján DNS-szekvencia származtatható a PAT 1-es polipeptidje aminosav-szekvenciájából (8. példa, 5. ábra). Egy 17 bp méretű tartományt, 5 amely a különböző szekvenciák minimális számát teszi lehetővé, választunk ki az oligonukleotid keverékek szintéziséhez. 4 különböző oligonukleotid 4 keverékét, amelyek a kiválasztott szállal, és így az RNS-sel is komplementerek, megszintetizáljuk (az 5. ábra 1, 2, 3 10 és 4 oligonukleotid keverékei). Ezeket az oligonukleotidokat enzimatikusan foszforilezzük és ezáltal radioaktívan jelezzük (Maniatis et al.). 150 ng oligonukleotidot inkubálunk 16 egység polinukleotid-kinázzal 30 percig 37 °C-on 12 μΐ-es reakciókeverékben 15 (50 mM TRIS/HCI, pH = 9,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTE, 5% glicerin) 250 μ(3ί ATP-vel (Amersham PB 10218). A poli(A)+ RNS (10. példa) 10 μg-jának 250 mM KC1, 10 mM TRIS/HC1 pH = 8,3 összetételű pufferrel készített oldatát elegyítjük 2 μΐ 2lP-vel össze- 20 tételű pufferrel készített oldatát elegyítjük 2 μΐ 32P-vel jelzett oligonukleotid keverékkel 0,5 ml reakciótérfogatban. A keveréket 2 percre 75 °C-ig melegítjük, majd percig 50 °C-on tartjuk. Mind a 4 Eppendorf-csőhöz
3.3 μΐ reakciópuffert adunk (24 mM TRIS/HC1 pH =
8.3 16 mM MgCl2), 8 mM DTE, 0,4 mM dATP, 0,8 mM dGTP, 0,4 mM dCTP, 0,4 mM dTTP, 6 egység reverz transzkriptáz, emellett mindegyik tartalmaz még 1 μΐ 1 mM dATP-t vagy 1 μΐ 1 mM dGTP-t vagy 1 μΐ 1 mM dCTP-t vagy 1 μΐ 1 mM dATP-t vagy 1 μΐ 1 mM dGTP-t vagy 1 μΐ 1 mM dCTP-t vagy 1 μΐ 1 mM dTTP-t. 2 μΐ poli(A)+, RNS-oligonukleotid keverék hozzáadása után az Eppendorf-csövek tartalmát rövid ideig centrifugáljuk, majd 45 percig 50 °C-on tartjuk. A reakciót leállítjuk 2 μΙ stop-keverék (99% formamid, 0,3% brómfenol-kék, 0,3% xilol-ciano) hozzáadásával, majd három percig forraljuk. Mindegyik mintából 4 μΐt viszünk 8%-os poliakrilamid/karbamid gélre, majd
2,5 óráig 40 wattal futtatjuk (Sequi Gén, Biorad). Ezután a gélt 20 percre 5%-os metanol, 5%-os ecetsav összetételű oldatba helyezzük, majd egy órán át 80 °Con tartjuk. A lehűtött gélt háztartási fóliába csomagoljuk. Röntgen-filmet (Kodak XOmat AR) helyezünk rá 20 óráig. Az erről a Röntgen-filmről leolvasható szekvencia a következő:
20 30 40 50 60
5'-CCATTTGGAAGTTGACAATAGGCAGTGGTGCAGCCATCACGGGCTGCCTTGAGCCCGTAT
80 90 100 110
GCAAATTCCGTGCCGGTATTAAGCATGACAATCTCGGAGACATCGCGTTCA-3'
Az 1-29-es pozíciók komplementerek a DNS-szek- 30 venciával, amely a PAT 1-es polipeptidjének aminosavszekvenciájából határozható meg (5., 6D. ábra). Szintetizálunk egy oligonukleotidot, amely megfelel a fenti szekvencia első 30 nukleotidjének.
12. példa
Penicillium chrysogenum genomiális génbankjának előállítása
Egy Penicillium chrysogenum tenyészet (10. példa) CDS táptalajban mosott micéliumából DNS-t 40 izolálunk. A micéliumot folyékony nitrogénben elporítjuk, majd adunk hozzá 1% szarkozilt, 0,1 M EDTA-t (pH = 8), 100 qg/ml proteináz K-t (1 g micélium/25 ml), majd 48 órán át 37 °C-on kevertetjük. Az elegyet háromszor extraháljuk fenollal, majd 0,1 tér- 45 fogatnyi 3 M nátrium-acetát (pH = 5,2) hozzáadása után etanollal kicsapjuk. Ezután CsCl-EtBr centrifugálást végzünk vele (Maniatis et al.), majd izoamilalkoholos extrakció és TE-vel szembeni dialízis után a koncentrációt UV abszorpció alapján meghatároz- 50 zuk. A DNS-t emellett agaróz-gélelektroforézissel vizsgáljuk. 300 μg Penicillium chrysogenum DNS-t 5 egység Sau3A (BRL) enzimmel emésztünk 60 percig 38 °C-on 10 mM TRIS/HCI (pH = 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTE, 50 mM NaCl összetételű oldat- 55 bán. A hasítás mértékét agaróz gélen ellenőrizzük. Előnyös, ha a DNS nagy része 10 és 20 kb között van. A DNS-t ezuitán két NaCl gradiensre visszük [ezeket úgy állítjuk elő, hogy két Beckman-SW28.1 ultracentrifuga csőben 20%-os NaCl TE-s oldatát 60 (10 mM TRIS/HCI pH = 8,0, 1 mM EDTA)], kétszer lefagyasztjuk és felolvasztjuk, majd 16 órán át 14000 rpm-mel centrifugáljuk az SW 28.1 ultracentrifuga rotorban. A csövek tartalmát frakcionáljuk. A 10 kb-nál nagyobb DNS-fragmenteket tartalmazó 35 frakciókat egyesítjük és TE-vel szemben dializáljuk. A DNS-t betöményítése után (500 pg/ml) BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel hasított lambdaEMBL3 FNS-sel [Frischauf et. al., J. Mól. Bioi., 170, 827-832 (1983)] együtt tisztítjuk. 5 egység T4 DNS ligáz hozzáadása után a ligálást éjszakán át végezzük 16 °C-on 30 mM TRIS/HCI pH = 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTE, 2,5 mM ATP összetételű oldatban (a DNS-koncentráció 200 μg/ml, a vektor/penicillium chrysogenum DNS mólaránya 1: 1). A ligáló elegyet in vitro pakoljuk fehérje extraktumokkal („pakoló keverékek”, Maniatis et al.,). A kapott lambda lizátumokat az NM539 indikátor törzsön (Frischauf et al.) titrálva 106 tarfolt-képző egységet kapunk.
13. példa
A PAT-specifikus oligonukleotiddal hibridizáló lambda-klónok izolálása
A Penicillium chrysogenum NM538 törzsben (Frischauf et al.) lévő lambda-EMBL3 gén-bankjának (12. példa) 40000 rekombináns fágját 90 mm-es Petri-csészében lévő TB agarra szélesztjük (a TB agar-táptalaj összetétele 10 g bacto-trypton, 5 g NaCl per liter, 0,7% agaróz, a pH-t 7,5-re állítjuk NaOH-val). Ezekről a lemezekről két lenyomatot
HU 208 845 Β készítünk nejlon szú'rőlapokra (Amerisham Hybond N-szűrőlap). A DNS UV-vel történő rögzítése után ezeket a szűrőlapokat használjuk hibridizálásra. A
11. példában leírt 30 tagú oligonukleotidot, amelynek szekvenciája komplementer a PAT 1-es polipep- 5 tidjének aminosav-szekvenciájából következő DNS szekvenciának, radioaktívan jelöljük (T4 polinukleotid kináz reakció all. példa szerint). A hibridizálást körülbelül 20 órán át végezzük 37 ’C-on 6xSSPE (az lxSSPE összetétele 0,15 mM MaCl, 10 mM 10 NaH2PO4, 1 mM EDTA pH = 7,4), 30% formamid, 5xDenhard, 0,1% SDS, 100 pg/ml hering-sperma DNS, 0,1 mM ATP, 3 ng/ml 32P-vel jelzett oligonukleotid összetételű oldatban. A szűrőket ezután háromszor mossuk 10 percig szobahőmérsékleten 15 2XSSC (az lxSSC összetétele 0,3 M NaCl, P.P3 M NaCl, 0,03 M nátrium-citrát pH = 7,0), 0,1% SDS összetételű oldatban, majd háromszor mossuk 20 percig 56 ’C-on lxSSC, 0,1% SDS összetételű oldatban, majd szárítás után autoradiografáljuk. Az 20 agaróz rétegnek azokat a régióit, amelyek megfelelnek a Röntgen-filmben található pozitív hibridizációs jeleknek, a steril Pasteur-pipettával kivesszük, majd SM pufferben (5,8 g NaCl, 2 g MgSO4x7 H2O és 50 ml 1 M TRIS/HC1 pH = 7,5) szuszpendáljuk. Az NM 538-as indikátor törzs megfelelő hígítását ismét TB-lemezekre szélesztjiik. Az ezeken a lemezeken található fágokat nejlon szűrőre visszük, majd a fentiek szerint hibridizáljuk. A megfelelő rekombináns lambda-fágokat a másodszor pozitív jelet adó tarfoltokból izoláljuk. Ezeknek a fágoknak a tisztított DNS-ét használjuk restrikciós elemzéshez és Southern hibridizáláshoz. Emellett plazmidokban szubklónozzuk a DNS-t [pUC12, Messing, Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)] és M13 vektorokban [M13mpl8, M13mpl9, Norrander et al., Gene, 26 101 (1983)]. Az M13mpl9 szubklónnak az oligonukleotiddal végzett szekvenálása a következő szekvenciát eredményezi:
20 30 40 50
5'-CATCACGGGCTGCCTTGAGCCCGTATGCAAATTCCGTGCGGGTATTAAGC
70 80 90 100
ATGACAATCTCGGAGACATCGCGTTCAGCGCCCTTTGCAATACCTGGTTT 110 120 130 140 150
TTCGGGGGTCATCGGTCAGCATTGGTGCAGAAAATGTAGGAAAGACCGAA 160 170 180 190 200
GTGGCACTCACCGCGAATCTCCTCGTAGTATTTGGGCCATCTTTCCTCGATC- 3'
A DNS-szekvencia 35-111 nukleotidjai, amelyeket RNS alkalmazásával bizonyítunk (11. példa), konformak ennek a DNS szekvenciának 1-77-es nukleotidjaival (6F ábra).
14. példa
A PAT gén DNS-szekvenciája A 4. ábrán ennek a DNS-szekvenciának a pozíciója két függőleges vonallal van jelölve (A), 1 felel meg az 35 első nukleotidnak, 1972 az utolsónak.
20 30 40 50 60 70
GTTGATGTCCCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCAGATTGGTGGCTACGGCAATATAAATCTCAGCATGCA
90 100 110 120 130 140
GTTCCGCCTGCATGATCATCCCCAGGACGCCGTTTGTCATCTCCGTCAGCCAGGTCTCAGTTGTTTACCC 150 160 170 180 190 .·, 200 210
ATCTTCCGACCCGCAGCAGAAATGCTTCACATCCTCTGTCAAGGCACTCCCTTTGAAGTAAGTGCTGCAC 220 230 240 250 260 270 280
TGAATACCAGATTTTTTCCTTCTGAATCTTCCGAGTTCTGACCTGATCCAGATCGGCTACGAACATGGCT 290 300 310 320 330 340 350
CTGCTGCCAAAGCCGTGATAGCCAGAAGCATTGACTTCGCCGTCGATCTCATCCGAGGGAAAACGAAGAA 360 370 380 390 400 410 420
GACGGACGAAGAGCTTAAACAGGTACTCTCGCAACTGGGGCGCGTGATCGAGGAAAGATGGCCCAAATAC 430 440 450 460 470 480 490
TACGAGGAGATTCGCGGTGAGTGCCACTTCGGTCTTTCCTACATTTTCTGCACCAATGCTGACCGATGAC 500 510 520 530 540 550 560
CCCCGAAAAACCAGGTATTGCAAAGGGCGCTGAACGCGATGTCTCCGAGATTGTCATGCTTAATACCCGC 570 580 590 600 610 620 630
ACGGAATTTGCATACGGGCTCAAGGCAGCCCGTGATGGCTGCACCACTGCCTATTGTCAACTTCCAAATG 640 650 660 670 680 690 700
GAGCCCTCCAGGGCCAAAACTGGGATCTACGTTAAGAGATTTTACCTCCTCATTTTATTCCATCGAATTT 710 720 730 740 750 760 770
GCGCCGACTAATTTGGTTGTTCAAGTTCTTTTCTGCCACCAAAGAGAACCTGATCCGGTTAACGATCCGT 780 790 800 810 820 830 840
CAGGCCGGACTTCCCACCATCAAATTCATAACCGAGGCTGGAATCATCGGGAAGGTTGGATTTAACAGTG
HU 208 845 Β
850 860 870 880 890 900 910
CGGGGGTCGCCGTCAATTACAACGCCCTTCACCTTCAAGGTCTTCGACCCACCGGAGTTCCTTCGCATAT
920 930 940 950 960 970 980
TGCCCTCCGCATAGCGCTCGAAAGCACTTCTCCTTCCCAGGCCTATGACCGGATCGTGGAGCAAGGCGGA
990 1000 1010 1020 1030 1040 1050
ATGGCCGCCAGCGCTTTTATCATGGTGGGCAATGGGCACGAGGCATTTGGTTTGGAATTCTCCCCCACCA 1060 1070 1080 1090 1100 1110 .1120
GCATCCGAAAGCAGGTGCTCGACGCGAATGGTAGGATGGTGCACACCAACCACTGCTTGCTTCAGCACGG 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190
CAAAAATGAGAAAGAGCTCGATCCCTTACCGGACTCATGGAATCGCCACCAGCGTATGGAGTTCCTCCTC 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
GACGGGTTCGACGGCACCAAACAGGCATTTGCCCAGCTCTGGGCCGACGAAGACAATTATCCCTTTAGCA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330
TCTGCCGCGCTTACGAGGAGGGCAAGAGCAGAGGCGCGACTCTGTTCAATATCATCTACGACCATGCCCG 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400
TAGAGAGGCAACGGTGCGGCTTGGCCGGCCGACCAACCCTGATGAGATGTTTGTCATGCGGTTTGACGAG 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470
GAGGACGAGAGGTCTGCGCTCAACGCCAGGCTTTGAAGGCTCTTCATGACGAGCCAATGCATCTTTTGTA 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540
TGTAGCTTCAACCGACTCCGTCTTCACTTCTTCGCCCGCACTGCCTACCGTTTGTACCATCTGACTCATA 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610
TAAATGTCTAGCCCCTACCTACACTATACCTAAGGGAGAGAAGCGTAGAGTGATTAACGTACGGGCCTAT 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680
AGTACCCCGATCTCTAGATAGAACATTTAGTAGAGATTAGGATGCCTAACTAATTTAACTTGAGCATTGT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750
CCCGTTCATATTGATTTTCATCCATTATACACTCTTAATCGTTTCCCGGTAGAAGCCGNATATATACGAC 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820
CATAGGGTGTGGAGAACAGGGCTTCCCGTCTGCTTGGCCGTACTTAAGCTATATATTCTACACGGCCAAT 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890
ACTCAATGTGCCCTTAGCACCTAAGCGGCACTCTAGGGTAAGTGCGGGTGATATAGGTGAGAAGTCTTAA 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960
GACTGAAGACAGGATATCACGCGTTACCCTGCACCGTACCTACTACCTTCAATATCACTCTTTCAGGATG
1970
GACAGGGTCGAC
75. példa
A PAT gén DNS szekvenciája
Ezen a DNS szekvencián a kódoló tartományt úgy határoztuk meg, hogy a kísérletesen meghatározott aminosav rész-szekvenciákat hasonlítjuk ennek a DNS szekvenciának a kódoló kapacitásához. Ebből látszik, hogy ezen a génen három intron van jelen. Ezeket a fentieken kívül intron-exon konszenzus szekvenciákkal azonosítjuk [Lambosek and Leach, Critical Reviews in Biotechnology, 6, 357-393 (1987)].
20 30 40 50 60 70
GTTGATGTCCCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCAGATTGGTGGCTACGGCAATATAAATCTCAGCATGCA
90 100 110 120 130 140
GTTCCGCCTGCATGATCATCCCCAGGACGCCGTTTGTCATCTCCGTCAGCCAGGTCTCAGTTGTTTACCC 150 160 170 180 190 200 210
ATCTTCCGACCCGCAGCAGAAATGCTTCACATCCTCTGTCAAGGCACTCCCTTTGAAGTAAGTGCTGCAC
MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGlu
220 230 240 250 260 270 280
TGAATACCAGATTTTTTCCTTCTGAATCTTCCGAGTTCTGACCTGATCCAGATCGGCTACGAACATGGCT IleGlyTyrGluHisGlyS
290 300 310 320 330 340 350
CTGCTGCCAAAGCCGTGATAGCCAGAAGCATTGACTTCGCCGTCGATCTCATCCGAGGGAAAACGAAGAA erAlaAlaLysAlaValIleAlaArgSerlleAspPheAlaValAspLeuIleArgGlyLysThrLysLy
360 370 380 390 · 400 410 420
GACGGACGAAGAGCTTAAACAGGTACTCTCGCAACTGGGGCGCGTGATCGAGGAAAGATGGCCCAAATAC ThrAspGluGluLeuLysGlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGluArgTrpProLysTyr
430 440 450 460 470 480 490
TACGAGGAGATTCGCGGTGAGTGCCACTTCGGTCTTTCCTACATTTTCTGCACCAATGCTGACCGATGAC TyrGluGluIleArgG
HU 208 845 Β
500 510 520 530 540 550 560
CCCCGAAAAACCAGGTATTGCAAAGGGCGCTGAACGCGATGTCTCCGAGATTGTCATGCTTAATACCCGC lylleAlaLysGlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg
570 580 590 600 610 620 630
ACGGAATTTGCATACGGGCTCAAGGCAGCCCGTGATGGCTGCACCACTGCCTATTGTCAACTTCCAAATG ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLysAlaAlaArgAspGlyCysThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnG
640 650 660 670 680 690 700
GAGCCCTCCAGGGCCAAAACTGGGATGTACGTTAAGAGATTTTACCTCCTCATTTTATTCCATCGAATTT lyAlaLeuGlnGlyGlnAsnTrpAsp
710 720 730 740 750 760 770
GCGCCGACTAATTTGGTTGTTCAAGTTCTTTTCTGCCACCAAAGAGAACCTGATCCGGTTAACGATCCGT PhePheSerAlaThrLysGluAsnLeuIleArgLeuThrlleArg
780 790 800 810 820 830 840
CAGGCCGGACTTCCCACCATCAAATTCATAACCGAGGCTGGAATCATCGGGAAGGTTGGATTTAACAGTG GlnAlaGlyLeuProThrlleLzyPhelleThrGluAlaGlyllelleGlyLzyValGlyPheAsnSerA
850 860 870 880 890 900 910
CGGGGGTCGCCGTCAATTACAACGCCCTTCACCTTCAAGGTCTTCGACCCACCGGAGTTCCTTCGCATAT laGlyValAlaValAsnTzrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeuArgProThrGlyValProSerHisIl
920 930 940 950 960 970 980
TGCCCTCCGCATAGCGCTCGAAAGCACTTCTCCTTCCCAGGCCTATGACCGGATCGTGGAGCAAGGCGGA eAlaLeuArglleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArglleValGluGlnGlyGly
990 1000 1010 1020 1030 1040 1050
ATGGCCGCCAGCGCTTTTATCATGGTGGGCAATGGGCACGAGGCATTTGGTTTGGAATTCTCCCCCACCA MetAl·aAl·aSerAl·aPheIleMetValGlyAsnGlyHisGluAlaPheGlyLeuGl·uPheSerProThrS 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120
GCATCCGAAAGCAGGTGCTCGACGCGAATGGTAGGATGGTGCACACCAACCACTGCTTGCTTCAGCACGG erlleArgLysGlnValLeuAspAlaAsnGlyArgMetValHysThrAsnHysCysLeuLeuGlnHysGl
1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190
CAAAAATGAGAAAGAGCTCGATCCCTTACCGGACTCATGGAATCGCCACCAGCGTATGGAGTTCCTCCTC yLysAsnGluLysGluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnArgHisGlnArgMetGluPheLeuLeu
1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
GACGGGTTCGACGGCACCAAACAGGCATTTGCCCAGCTCTGGGCCGACGAAGACAATTATCCCTTTAGCA AspGlyPheAspGlyThrLysGlnAlaPheAlaGlnLeuTrpAlaAspGluAspAsnTyrProPheSerl
1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330
TCTGCCGCGCTTACGAGGAGGGCAAGAGCAGACCCCCCACTCTGTTCAATATCATCTACGACCATGCCCG leCysArgAlaTyrGluGluGlyLysSerArgGlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAspHisAlaAr
1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400
TAGAGAGGCAACGGTGCGGCTTGGCCGGCCCACCAACCCTGATGAGATGTTTGTCATGCGGTTTGACGAG gArgGluAlaThrValArgLeuGlyArgProThrAsnProAspGluMetPheValMetArgPheAspGlu
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470
GAGGACGAGAGGTCTGCGCTCAACGCCAGGCTTTGAAGGCTCTTCATGACGAGCCAATGCATCTTTTGTA GluAspGluArgSerAlaLeuAsnAlaArgLeu***
1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540
TGTAGCTTCAACCGACTCCGTCTTCACTTCTTCGCCCGCACTGCCTACCGTTTGTACCATCTGACTCATA
1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610
TAAATGTCTAGCCCCTACCTACACTATACCTAAGGGAGAGAAGCGTAGAGTGATTAACGTACGGGCCTAT
1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680
AGTACCCCGATCTCTAGATAGAACATTTAGTAGAGATTAGGATGCCTAACTAATTTAACTTGAGCATTGT
1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750
CCCGTTCATATTGATTTTCATCCATTATACACTCTTAATCGTTTCCCGGTAGAAGCCGNATATATACGAC
1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820
CATAGGGTGTGGAGAACAGGGCTTCCCGTCTGCTTGGCCGTACTTAAGCTATATATTCTACACGGCCAAT
1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890
ACTCAATGTGCCCTTAGCACCTAAGCGGCACTCTAGGGTAAGTGCGGGTGATATAGGTGAGAAGTCTTAA
1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960
GACTGAAGACAGGATATCACGCGTTACCCTGCACCGTACCTACTACCTTCAATATCACTCTTTCAGGATG
1970
GACAGGGTCGAC
HU 208 845 Β
16. példa
A PAT aminosav-szekvenciája, a DNS szekvencia alapján
Ennek a polipeptidnek a molekulatömege 40000 D. Ha a 102-es és 103-as aminosavak között hasítjuk, akkor két polipeptidet kapunk. Az egyik polipeptid molekulatömege 11500 D, és tartalmazza a 2-es polipeptid N-terminális aminosav-szekvenciáját; az összes peptidfragment megtalálható ismét ezen az aminosav-szekvencián (AS rész-szekvenciák 9-től 24-ig). Tehát ez a „PAT 8 kD komponense.”
Az egyik polipeptid molekulasúlya 28500 D, és 5 tartalmazza az 1-es polipeptid N-terminális aminosavszekvenciáját (a 2., 3., 4., 5., 7. és 8. AS rész-szekvenciák). Tehát ez a PAT 30 kD komponense.”
20 ΜθόΙιεαΗϊβΙΙθΕε^ΙγΒΟίηΟίγΤΐίΓΡΓοΡίιβΟίαΙΙθΟΙγΤγΓΟίιιΗϊεΟΙγδβΓΑΐα
40
AlaLysAlaValIleAlaArgSerlleAspPheAlaValAspLeuIleArgGlyLysThr
60
LysLysThrAspGluGluLeuLysGlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGlu
80
ArgTrpProLysTyrTyrGluGluIleArgGlylleAlaLysGlyAlaGluArgAspVal
100
SerGluIleValMetLeuAsnThrArgThrGluPheAlaTyrGlyLeuLysAlaAlaArg 110 230
AspGlyCysThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAspTrp 130 140
AspPhePheSerAlaThrLysGluAsnLeuIleArgLeuThrlleArgGlnAlaGlyLeu 150 160
ProThrlleLysPhelleThrGluAlaGlyllelleGlyLysValGlyPheAsnSerAla 170 180
GlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeuArgProThrGlyValPro 190 200
SerHisIleAlaLeuÁrglleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 210 220
IleValGluGlnGlyGlyMetAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAsriGlyHisGlu 230 240
AlaPheGlyLeuGluPheSerProThrSerlleArgLysGlnValLeuAspAlaAsnGly 250 260
ArgMetValHisThrAsnHisCysLeuLeuGlnHisGlyLysAsnGluLysGluLeuAsp 270 280
ProLeuProAspSerTrpAsnArgHisGlnArgMetGluPheLeuLeuAspGlyPheAsp 290 300
GlyThrLysGlnAlaPheAlaGlnLeuTrpAlaAspGluAspAsnTyrProPheSerlle 310 320
CysArgAlaTyrGluGluGlyLysSerArgGlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAsp 330 340
HisAlaArgArgGluAlaThrValArgLeuGlyArgProThrAsnProAspGluMetPhe
350
ValMetArgPheAspGluGluAspGluArgSerAlaLeuAsnAlaArgLeu
17. példa
A PAT kísérletesen meghatározott aminosav-szekvenclájának összehasonlítása a DNS-ből kikövetkeztetett aminosav-szekvenciával kD egység/polipeptid 1 (N-terminális aminosav szekvencia)
ThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAnsTrpAspPhePhe
104 ThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAsnTrpAspPhePhe 22 SerAlaThrLysGluAsnLeuIleArg 30
124 SerAlaThrLysGluAsnLeuIlleArg 132
AS 2-es rész-szekvencia (Az 1-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje)
GlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAspHisAlaArg 13
311 GlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAspHisAlaArg 323
HU 208 845 Β
AS 3-as szekvencia (Az 1-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje)
ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 11
333 ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 343
AS 4-es rész-szekvencia (Az 1-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje)
GluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnArg 11
258 GluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnArg 268
AS 5-ös rész-szekvencia (Az 1-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje)
MetGluPheLeuAspGlyPheAspGlyThrLys 12
272 MetGluPheLeuLeuAspGlyPheAspGlyThrLys 283
AS 7-es rész-szekvencia (Az l-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
IleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 14
187 IleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 200
AS 8-as rész-szekvencia (1-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje)
ValGlyPheAsnSerAlaGlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeu
155 ValGlyPheAsnSerAlaGlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeu 21 ArgProThrGlyValProSerHisIleAlaLeuArg 32
175 ArgProThrGlyValProSerHisIleAlaLeuArg 186 kD egység I/2a polipeptid
MetLeuH-isIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla
AlaLysAlaValIleAlaArgSerlleAspPheAlaValAsp 34
AlaLysAlaValIleAlaArgSerlleAspPheAlaValAsp 34 kD Il/polipeptid
MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla
AlaLysAl·aValIleAlaArgSerIl·eAspPheAlaVal·AspLeuIleArgGl·yLyΞThr 40 AlaLys_ValIleAlaArg_IleAspPheAlaValAspLeu_Gly__Thr 40
AS 9 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid fragmentje):
ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 8
ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97
AS 10 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
TyrTyrAnyGluIleArg 6
TyrTyrGluGluIleArg 70
AS 11 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
TrpProLys 3
TrpProLys 64
AS 12 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
SerlleAspPheAlaValAspLeuIleArg 10
SerlleAspPheAlaValAspLeuIleArg 37
AS 13 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
AspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg 11
AspValSerGluIleVaMmetLeuAsnThrArg 89
AS 14 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid-triptikus peptid-fragmentje):
GlnValLeuSerGlnLeuGlyArg 8
GlnValLeuSerGlnLeuGlyArg 56
AS 15 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid-fragmentje):
CysGlnGlyThrProPheGlu 12
CysGlnGlyThrProPheGlu 7
AS 16 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid-fragmentje):
TyrTyrGluGluIleArgGlylleAlaLys 74
TyrTyrGluGluIleArgGlylleAlaLys 10
AS 17 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid-fragmentje):
GlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGluArgTrpProLys 64
GlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGluArg_ProLys 16
AS 18 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos peptid-fragmenjte):
GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg 89
GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg 15
AS 19 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
AlaValIleAlaArg 27
HU 208 845 Β
AlaValIleAlaArg 5
AS 20 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
LysThrAspGluGluLeuLys 48
Lys_AspGluGluLeuLys 7
AS 21 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
GlylleAlaLys 74
GlylleAlaLys 4
AS 22 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
'57 VallleGluGluArg 61
VallleGluGluArg 5
AS 23 rész-szekvencia (A 2-es polipeptid triptikus peptid-fragmentje):
AsnThrArgThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97
AsnThr_ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 11
AS rész-szekvencia AZ AS pozíciója a DNS-szekvenciából származtatott aminosav-szekvencián
AS 16-os rész-szekvenciája (A 2-es poliN-terminális AS szekvencia 30kD egység/1-es polipeptid 104-113
N-terminális AS szekvencia 8kD egység/2a polipeptid 1- 34
N-terminális AS szekvencia 8kD egység/2b polipeptid 1- 40
AS 2-es rész-szekvencia (Az 1-es polipeptid peptid fragmentje) 311-323
AS 3-as rész-szekvenciája (Az 1-es polipeptid szekvenciája) 333-323
AS 4-es rész-szekvenciája (Az 1-es polipeptid peptid fragmentje) 258-268
AS 5-ös rész-szekvenciája (Az 1-es polipeptid peptid fragmentje) 272-283
AS 7-es rész-szekvenciája (Az 1-es polipeptid peptid fragmentje) 187-200
AS 8-as rész-szekvenciája (Az 1-es polipeptid peptid fragmentje) 155-186
AS 9-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 90- 97
AS 10-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 65- 70
AS 11-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 62- 64
AS 12-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 28- 37
AS 13-as rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 79- 89
AS 14-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 49- 56
AS 15-ös rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos fragment) 6- 12 peptid lizil-endopeptidázos fragment) 65- 74
AS 17-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos fragment) 49- 64
AS 18-as rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos fragment) 75- 89
AS 19-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 23- 27
AS 20-as rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 42- 48
AS 21-es rész-szekvenciája (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 71-74
AS 22-es rész-szekvencia (A 2-es polipeptid peptid fragmentje) 57- 61
AS rész-szekvencia (A 2-es polipeptid lizil-endopeptidázos fragment) 87- 97
18. példa
A PAT gén és az izopenicillin N szintetáz (ips) gén közötti DNS fragment rész-szekvenciája A szekvencia a „GGATCC” szekvenciával kezdődik, ez a BamHI restrikciós enzim felismerő szekvenciája, amely az ips génben található. Ennek a génnek az utolsó 34 (C-terminális) kodonját mutatjuk: ezeket a publikált DNS szekvenciával (Carr et al., Gene, 48, 257-266 (1986)] való összehasonlításával azonosítottuk. Egy átmeneti régió után a pat DNS-szekvencia 1-es sorszámú nukleotidja következik az 1442-es helyen. Ezt a DNS szekvencia-részt a 4. (B) ábrán bejelöltük.
Ez a DNS szekvencia fontos, mivel igazolja az ips és a pat gének szoros kapcsolódását, valamint azért, mivel a pat gén transzlációjához és transzkripciójához szükséges kontroli-elemet tartalmazza.
20 30 40 50
GGATCCTAGCAAGGAAGACGGCAAGACCGATCAGCGGCCAATCTCGTACG AspProSerLysGluAspGlyLysThrAspGlnArgProIleSerTyrG
70 80 90 100
GGGACTATCTGCAGAACGGATTAGTTAGTCTAATCAACAAGAACGGCCAG lyAspTyrLeuGlnAsnGlyLeuValSerLeuIleAsnLysAsnGlyGln 110 120 130 140 150
ACATGAAAGGGCCCATGGATGGGACCGGGATGGAAATCCCGGACTCTGAG
ThrEnd
850
NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 1250 bp NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
HU 208 845 Β
1410 1420 1430 1440 1450
CAAGACTAGGCGGATGCAGCAGGGATACTCGAGGTGCCCCAGTTGATGTC
1460 1470 1480 1490 1500
CCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCAGATTGGTGGCTACGGCCAATATAAA
1510 1520 1530 1540 1550
TCTCAGCATGCAGTTCCGCCTGCATGATCATCCCCAGGACGCCCGCAGCA
1560 1570 1580 1590
GAAATGCTTCACATCCTCTGTCAAGGCACTCCCTTTGAAGTA
MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGlu
19. példa
A pBC2001 plazmid előállítása és a pat gén expressziója E. coliban
a) A Penicillium chrysogenum cDNS génbankjának előállítása:
A 10. példa szerint előállított és tisztított 5 pg poli(A)+RNS-t reagáltatunk reverz transzkriptázzal oligo dT-primerrel a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében, a komplementer egyszálú DNS előállítására. Ebből kétszálú DNS-molekulát állítunk elő az RN-áz H és a DNS-polimeráz enzimekkel [Gubler and Hoffman, Gene, 25,263 (1983)]. Megfelelő EcoRI adapter-molekulák hozzáadása után, amely célra a polinukleotid-kináz és a T4 DNS-ligáz enzimeket használjuk, lineáris, kétszálú cDNS molekulát kapunk, amelyet klónozó vektorba építhetünk. Ezekhez a reakciókhoz egy, a kereskedelmi forgalomban kapható cDNS kit-et használunk (Fa. Pharamcia). Ez tartalmazza a legfontosabb enzimeket és az adapter oligonukleotidot. A reakciót a gyártó előírásai szerint hajtjuk végre. Az így szintetizált, EcoRI végekkel rendelkező kétszálú cDNS-t a gtlO vektorba klónozzuk [Huynh et al., DNA cloning, Glover, D. M. szerk. Oxford, 7, 49 (1985)]. A cDNS preparátum 80 μΐ-ét 16 μΐ (8 pg) gtlO DNS-sel elegyítjük, amelyet előzőleg EcoRI enzimmel hasítottunk és alkalikus foszfatázzal kezeltünk (Maniatis et al.,). 3 pl 3 M nátrium-acetát (pH = 5,2) és 250 pl etanol hozzáadása után a keveréket 20 órán át -20 °C-on tartva kicsapjuk, majd ezt követően 60 pl 10 mM TRIS/HC1 (pH = 7,5), 1 mM EDTA összetételű pufferben oldjuk. A ligálást 20 órán át 12 °C-on végezzük 66 mM TRIS/HC1 (pH = 7,5), 1 mM spermidin, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitol, 0,2 mg/ml BSA, 0,5 mM ATP összetételű oldatban 6 egység T4 DNS-ligáz hozzáadásával. A ligáló elegyet in vitro pakoljuk fehérjekivonatokkal („pakoló elegy”), majd az E. coli C600hfl törzsre szélesztjük (Huynh et al.). A használt módszereket leírták (Maniatis et al.). Egy ilyen kísérletben több mint 5xl05 tarfoltot lehet kapni.
b) A pat-specifikus cDNS kiónok izolálása és szubklónozása M13mpl9-ben
A tarfolt hibridizációt a 13. példában leírt módon hajtjuk végre, a Penicillin chrysogenum cDNS bankból körülbelül 40000 tarfoltot használva. Indikátor törzsként az
E. coli C600hfl törzset használjuk (Huynh et al.). EcoRI restrikciós enzimmel való részleges hasítás után a rekombináns gtlO fágok DNS-ét restrikciós enzimmel hasított M13mpl9-RF DNS-be ligáljuk, majd transzfixáljuk. Az egyes rekombináns M13mpl9-RF DNS kiónokat restrikciós térképezés alapján azonosítjuk.
c) A rekombináns M13mpl9 klón DNS-ének helyspecifikus mutagenezise Ncol hasítási hely bevitele céljából
A következő bázissorendű 41 tagú oligonukleotidot szintetizáljuk:
’TCCGACCCGCAGCAGCCATGGTTCACAT CCTCTGTCAAGGC-3’
A pat cDNS-hez viszonyítva a DNS szekvencia annyiban változik, hogy egy Ncol hasítási helyet kapunk, amely tartalmazza az N-terminális metionin csoportot kódoló ATG kodont. A bal oldalon 20, a jobb oldalon 15, a pat cDNS szekvenciával azonos nukleotid van. A foszforilezett oligonukleotidból 5 pmól-t és az egyszálú M13mpl9 DNS-ből 0,5 pmól-t összekeverünk, majd 10 pl 20 mM TRIS/HC1 (pH 7,5) 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl össztételű oldatban 5 percig °C-on tartjuk, majd 20 percig 42 °C-on. Aklenow polimeráz, T4 DNS ligáz és SÍ nukleáz kezelést Eghterdarzadeh és Henikoff szerint végezzük [Nucl. Acids Rés., 14, 5115 (1986): 10 μΐ oldat 2 egység Klenow polimerázzal és 3 egység T4 DNS ligázzal, 20 mM TRIS/HC1 (pH 7,5) 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,8 mM mind a négy dNTP-ből, 1 mM ATP összetételű puffer, 1 óra 42 °C]. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le (végkoncentráció 25 mM), majd 10 percre 70 °C-ra melegítjük. Az etanolos kicsapás után a csapadékot 10 μΐ TRIS/HC1 (pH 8), 1 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. 15 μΐ 30 mM nátriumacetát (pH 4,6), 0,25 M NaCl, 1 mM ZnCl2, 5% glicerin, 7 egység SÍ nukleáz hozzáadása után az inkubálást szobahőmérsékleten végezzük [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103 (1985)] a reakcióeleggyel való transzfektálása, valamint az RF-DNS izolálása után a megváltoztatott DNS-t Ncol-es emésztés alapján lehet azonosítani.
d) A pat cDNS-t tartalmazó NcoI-HindlII fragment klónozása a pKK.233-3 plazmidba
A beépített Ncol hasítási hellyel rendelkező pat cDNS-t tartalmazó rekombináns M13 klón RF-DNS-ét Ncol és HindlII enzimmel hasítjuk. A pKK233-2 plazmidot [Amann and Brosius, Gene 40, 183 (1985)] hasonlóképpen Ncol és HindlII enzimekkel hasítjuk. A két DNS ősszel igái ását 20 órán át végezzük 14 °C-on mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 mM spermidin, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitol, 0,2 mg/ml BSA, 0,5 mM ATP összetételű oldatban 2 egység T4 DNS ligáz hozzáadásával. Egy megfelelő E. coli törzs [például JM83; Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103 (1985)] transzformálása után az egyes plazmid DNS-eket izoláljuk és restrikciós térképezéssel jellemezzük. Azt a plazmidot,
HU 208 845 Β amely a pat cDNS-t hordozó NcoI-HindlII restrikciós fragmentet tartalmazza a pKK233-2 plazmidba építve, pBC2001 plazmidnak nevezzük.
e) A pat gén expressziója E. coliban E. coli RB791 törzset [Amann and Brosius, Gene, 5
40, 183 (1985)] transzformálunk a pBC2001 plazmiddal. 50 ml LB táptalajt (tartalma literenként: 10 g Bacto Tryptone, 8 g NaCI, 5 g élesztőkivonat; pH 7,5-re állítva NaOH-val) oltunk az RB791 (pBC2001) törzs izolált telepével és 200 rpm-mel 37 °C-on rázatjuk, 1 amíg a 0,5-ös optikai sűrűséget elérjük (600 nm-en mérve). 5 ml 0,1 M IPTG-t (izopropil-P-D-tiogalaktozid) adunk hozzá. Ezután 3 óra hosszat tovább rázatjuk 200 rpm-mel 37 ’C-on. A sejteket ezután lecentrifugáljuk (10 perc, 5000 rpm, 20 ’C, Beckmann JA20), és az 1 E.coliban expresszálódott fehérje azonosítása céljából feldolgozzuk. Ezt az azonosítást végezhetjük az E. coli összfehérje SDS poliakrilamid gél-elektroforézisével, Westrer-Blot-tal PAT-specifikus antitestek felhasználásával, vagy enzimes detektálással. 2
20. példa
A pat gén transzformálása Penicillium chrysogenumba
a) A PBC2002 plazmid előállítása: 2
A pHS103 plazmidot [Kolar et al., Gene, 62, 127 (1988)] teljesen megemésztjük EcoRI enzimmel, majd EcoRl-Sall enzimekkel emésztett Ml3mpl9-RF DNS jelenlétében összeligáljuk (66 mM TRIS/HC1 pH 7,5, mM spermidin, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitol, 3 0,2 mg/ml BSA, 0,5 mM ATP, 2 egység T4 DNS ligáz, ’C, 20 óra). Transzformálás után olyan plazmidunk van, amely alkalmas Sáli fragmentek klónozására. Ezt a plazmidot Sáli enzimmel hasítjuk, csakúgy, mint a komplett pat gént hordozó 4,8 kb méretű Sáli fragmen- 3 tét tartalmazó rekombináns plazmidot (lásd 13. példa). Ligálás és transzformálás után olyan plazmidot azonosíthatunk, amely a módosított pHS103 plazmidból és a pat gént tartalmazó 4,8 kb méretű Sáli fragmentből áll; ennek a plazmidnak a jele pBC2002. 4
b) Penicillium chrysogenum protoplasztok izolálása és transzformálása:
A Penicillium chrysogenum P2/ATCC törzs 2 ml tömény spóraszuszpenzióját 2 literes Erlenmeyer-Iombikban lévő 200 ml Penicillium chrysogenum steril minimál táptalajhoz adjuk (összetétele 1 üteme számítva: 3 g NaNO3, 0,5 g MgSO4x7 H2O, 0,5 g KC1, 10 mg FeSO4x7 H2O, 20 g szacharóz, 13 g KH2PO4, és 2 ml nyomelemkeverék [100 ml-re 0,1 g FeSO4x7 H20,0,9 g ZnSO4x7 H2O, 0,0 CuSO4x5 H2O, 0,01 g MnSO4xH2O, 0,01 g H3BO3,0,01 g Na2HPO4x2 H2O), majd 20 órán át 25 ’Con rázatjuk. A protoplasztok izolálását és tisztítását Yelton és munkatársai leírása szerint végezzük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470 (1984)].
A micéliumot lecentrifugáljuk és kétszer mossuk 0,9 M NaCl-dal, majd 20 ml, 5 mg/ml novozyme 234-et tartalmazó 0,9 M-os NaCl-ben szuszpendáljuk. Másfél órán át inkubáljuk 30 ’C-on. A reakcióelegyet lecentrifugáljuk (Beckman hűtőcentrifuga JS 7,5, 1500 rpm, 20’, 5 perc). A protonplaszt üledéket kétszer mossuk 0,9 M NaCl-dal, majd egyszer 1,0 M szorbit, 50 mM CaCl2 összetételű oldattal. A protoplasztokat 0,2 ml 1,0 m szorbit, 50 mM CaCl2 összetételű oldatban szuszpendáljuk (körülbelül 0,5-5xl08 protoplazt/ml).
pg PBC2002 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA pufferes oldatát használjuk transzformáláshoz és adjuk hozzá a protoplaszt szuszpenzióhoz. 12,5 μΐ 25%-os polietilén-glikol (BDH), 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 50 mM CaCl2 összetételű oldatot (sterilre szűrve) adunk a szuszpenzióhoz. 20 percig jégen inkubáljuk. 0,5 ml 12,5μ1 25%-os polietilén-glikol (BDH), 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 50 mM CaCl2 összetételű, streilre szűrt oldatot adunk hozzá; a keveréket 5 percig 20 ’C-on inkubáljuk. I ml 0,9 M NaCI, 50 mM CaCl2 összetételű oldat hozzáadása után alapos keverés következik, majd a keveréket 3 ml minimál-táptalajhoz adjuk, amely 0,5% agart és 20 pg/ml phleomycint tartalmaz (48°). A transzformációs elegyet minimál táptalajra szélesztjük (a minimál táptalaj össztétele megegyezik az előzőkben leírtakkal, 1,6% agart és 20 pg/ml phleomycint tartalmaz).
A különböző telepekből izolált DNS-t Southern hibridizálással lehet jellemezni, radioaktívan jelzett pat DNS-t használva. A transzformánsok között olyanokat fedeztünk fel, amelyek a többszörös integráció következtében a pat gén számos példányát tartalmazzák. Ezeket a törzseket teszt-fermentációkban fogjuk vizsgálni, hogy megnőtt-e a penicillin termelésük.
/. táblázat
A Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271-ből származó tiol-dependens PAT feltárása és kicsapása
| Tisztítás | Feltárás ideje | Ossz. térf.(ml) | Fehérje | Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA aciltranszferáz aktivitás (mm HH 0 BC 248 | |||||||||
| mg (tót.) | (mg/ml) | SNT hígíloltan | SVT 1 : 10 | SNT 1 : 50 | |||||||||
| azonnal | 30' | 30’ + Penase | azonnal | 30’ | 30’ + Penase | azonnal | 30’ | 30’ + Penase | |||||
| Sejt-feltárás Dynomill-el KDL típusú (1786 g Bim=220 g DSh 3,5 1) | 4900 | 676 | 0,138 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
HU 208 845 Β
| Tisztítás | Feltárás ideje | Ossz. térf.(ml) | Fehérje | Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA acillranszferáz aktivitás (mm HH 0 BC 248 | |||||||||
| mg (tót.) | (mg/ml) | SNT hígítottál! | SVT 1: 10 | SNT 1 :50 | |||||||||
| azonnal | 30’ | 30' + Penase | azonnal | .30’ | 30’ + Penase | azonnal | 30’ | 30’ + Penase | |||||
| 0,1 M Foszfátpuffer pH 7,5 + 5 mM DTT + 0,l%Tritonxl00 + 0,1 mM PMSF | 30 | 20776 | 4,24 | nyom | 18,0 | 0 | 0 | 24,4 | 0 | 0 | nyom | 0 | |
| 600 ml acéltartály 510 ml 500-750 pm üveggyöngy | 60 | 25 431 | 5,19 | nyom | 17,9 | 0 | nyom | 27,0 | 0 | 0 | 15,7 | 0 | |
| folyamatos műk. sebesség: 2000 rpm=6,7 m/sec súrl.has.táv. 0,1 mm | 90 | 29204 | 5,96 | 15,2 | 22,0 | 0 | 13,8 | 29,9 | 0 | 0 | 16,5 | 0 | |
| áramlási seb, anyag = 301/6 Hőm, 2-3 ’C előre 5 ’C vissza Hőm. hűtés -20-8 ’C előre -5-1 hátra | 120 | 29302 | 5,98 | nyom | 17,1 | 0 | 0 | 24,8 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| SNT a nukleinsavak kicsapása után 0,5% CTAB-bal | 4650 | 12927 | 2,78 | 14,4 | 26,0 | 0 | 0 | 25,8 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Fehérje kicsapás 50 v% ammónium szulfáttal | 480 (=544 g) | 10965 | 22,8 | 27,4 2· | 28,8 | 0 | 18,4 | 28,2 | 0 | 16,1 | 27,1 | 0 |
1. Az aktivitás vizsgálata előtt a hígítatlan feltárási minták puffcrcscrcn esnek át P010 oszlopon (a maradék penicillin V eltávolítása 2,5 ml SNT minta 3,5 ml 0,1 M foszfát pufferrel, pH 7,5 + I mM DTT)
2. (NH4)2SO4 csapadék aktivitás-vizsgálata előtt 0,1 M foszfát puffer pH 7,5 + I mM DTT: I : 5 hígításban, Penase = penicillináz
2. táblázat
A Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271-ből származó tiol-dependens PAT stabilitása, illetve aktivitása a hőmérsékleti idő, pH és stabilizálószerek függvényében
| Teszt | Azonnal | 24h, +4 °C-on | 24h, -20 °C-on | ||||||
| Stabilizálási körülmények | Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA acilezési aktivitás (mm HH 0 Micrococctis luteus ATCC 9341/BC 85) | ||||||||
| azonnal | 30’ | 30* + Penase | azonnal | 30’ | 30’ + Penase | azonnal | 30’ | 30* + Penase | |
| Aktiválás | |||||||||
| hozzáadás nélkül | 11 | 15,5 | 0 | - | nyom | 0 | - | - | 0 |
| + 1 mM DTT | 23,5 | 37,1 | 0 | 0 | nyom | 0 | 15 | 38 | 0 |
| + 10 mM DTT | 22,7 | 39,0 | 0 | 16,6 | 36 | 0 | 16 | 33 | 0 |
HU 208 845 Β
| Teszt | Azonnal | 24h, +4 “C-on | 24h, -20 ’C-on | ||||||
| Stabilizálási körülmények | Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA acilezési aktivitás (mm HH 0 Micrococcus luteus ATCC 9341/BC 85) | ||||||||
| azonnal | 30' | 30' + Pe- nasc | azonnal | 30' | 30‘ + Pe- nase | azonnal | 30’ | 30’ + Pe- nase | |
| + 10 mM β-ΜΕ | 15,4 | 27,8 | 0 | 0 | nyom | 0 | nyom | 28,3 | 0 |
| + 10 mM MgCl2 | 9,8 | 17,1 | 0 | 0 | nyom | 0 | 18,5 | 15 | 0 |
| + 2 mM EDTA | 0 | 16,0 | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| + I mM DTT + 10 mM MgCI2 | 26,9 | 36,7 | 0 | 0 | nyom | 0 | 12,2 | 37 | 0 |
| + 2mM EDTA+ lOmM MgCl2 | 16,3 | 25,4 | 0 | 0 | 14,8 | 0 | nyom | 23 | 0 |
| + 5% Sorbit + 1 mM DTT + 2 mM EDTA + 1 mM PMSF | 26,0 | 38,6 | 0 | 0 | nyom | 0 | 11,3 | 33 | 0 |
| + 5% Sorbit + 1 mM DTT + 1 mM PMSF | 25,5 | 36,6 | 0 | 0 | nyom | 0 | 16,8 | 36 | 0 |
| pH-profil | |||||||||
| 0,1 MHEPES pH 7,5+ 1 mM DTT | 26,6 | 37,3 | 0 | 0 | nyom | 0 | 12,5 | 33,5 | 0 |
| 0,1 M NaH2PO4/Na2HPO4 pH 6,0 + 1 mM DTT | 0 | 17,3 | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| 0,1 M NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 + 1 mM DTT | 22,1 | 32,7 | 0 | 0 | 11,2 | 0 | 0 | 29,3 | 0 |
| 0,1 M NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8,0 + 1 mM DTT | 33,8 | 35,0 | 0 | 0 | 13 | 0 | 17 | 36,5 | 0 |
| 0,1 M TRIS/HC1 pH 8,0 + 1 mM DTT | 14,3 | 19,6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 16 | 0 |
| 0,1 MTRIS/HCI pH 9,0+1 mM DTT | 0 | nyom | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| Gátlás | |||||||||
| hozzáadás nélkül | 22,6 | 33,6 | 0 | nyom | nyom | 0 | 11,6 | 34 | 0 |
| + 2 mM PMSF | 22,1 | 32,2 | 0 | 0 | nyom | 0 | 13,8 | 27 | 0 |
| + 2 mM D1PFP | 22,6 | 34,5 | 0 | 0 | nyom | 0 | 10 | 35 | 0 |
| + 2 mM 2,2’-Blovrldyl | 0 | 0 | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| + 2 mM Hidroxi-kinolin | n. | 34,5 | 0 | 0 | 12 | 0 | 13,5 | 38 | 0 |
| + 2 mM o-Phenanthroline | 18,9 | 29,9 | 0 | nyom | nyom | 0 | 11 | 33 | 0 |
| + 2 mM N-Ethylmaleinimide | 0 | 0 | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| + 2 mM lodacetamide | 0 | 0 | 0 | - | - | 0 | - | - | 0 |
| + 2 mM 4-HydroxymercuriNa-benzoate | 19,4 | 32,3 | 0 | 0 | 11,6 | 0 | 12,2 | 39 | 0 |
| Stabilizálás | |||||||||
| hozzáadás nélkül | 21,5 | 33,4 | 0 | 0 | nyom | 0 | 15,2 | 38 | 0 |
| + 5% Sorbit | 23,3 | 34,1 | 0 | 0 | 12,2 | 0 | 16,3 | 38 | 0 |
HU 208 845 Β
| Teszt | Azonnal | 24h, +4 °C-on | 24h, -20 ’C-on | ||||||
| Stabilizálási körülmények | Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA acilezési aktivitás (mm HH 0 Micrococcus luteus ATCC 9341/BC 85) | ||||||||
| azonnal | 30' | 30' + Pc- nasc | azonnal | 30' | 30' + Penase | azonnal | 30’ | 30’ + Pe- nase | |
| + 20% Sorbit | 21,9 | 34,2 | 0 | 0 | 12 | 0 | 15,2 | 37 | 0 |
| + 1 mM PMSF | 22,0 | 33,7 | 0 | 0 | nyom | 0 | 15 | 40 | 0 |
| + 1%BSA | trace | 20,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18 | 0 |
| + 10% glicerin | 22,0 | 33,1 | 0 | 0 | 11,5 | 0 | 15,2 | 38 | 0 |
| + 5% Mannit | 24,0 | 36,2 | 0 | 0 | nyom | 0 | 16,8 | 38 | 0 |
| + 100 pg 6-APA/ml | 26,8 | 35,4 | 0 | 15 | 24 | 0 | 17,2 | 38 | 0 |
| mg/ml Penicillin V Standard, | mm HH 0 BC 85-04 | ||||||||
| 2 | 27,4 | ||||||||
| 1,5 | 27,4 | ||||||||
| 1,0 | 23,4 | ||||||||
| 0,5 | 18,4 | ||||||||
| 0,25 | 11,9 |
Enzim: PAT4 ammónium-szulfát csapadék
Tárolás és tesztelés 1+10 0,1 M HEPES rcakció-puffencl (pH 7,5) különböző stabilizálási körülmények között
3. táblázat
A Penicillium chrysogenum P„CoA-G-APA-acetiltranszferáz hasítása
| DTT (mM) | Inkubál ás időtar- tama | -196 ’C | -20’C | +4 ’C | RT | 37’C | ||||||||||
| Mikrobiológiai 6-APA-PaCoA transzbioi. aktivitás (mm HH 0 Micrococcus luteus ATCC 9341/BC 85) | ||||||||||||||||
| azon- nal | 30’ | 30’ + Penase | azon- nal | 30' | 30’ + Penase | azon- nal | 30' | 30’ + Penase | azon- nal | 30’ | 30’ + Penase | azon- nal | 30’ | 30’ + Penase | ||
| azon- nal | 14 | 40 | 0 | 14 | 40 | 0 | 14 | 40 | 0 | 14 | 40 | 0 | 14 | 40 | 0 | |
| lh | 14 | 36 | 0 | azon- nal | 38 | 0 | azon- nal | 38 | 0 | 10 | 37 | 0 | 0 | azon- nal | 0 | |
| 1 | 4h | 12 | 37 | 0 | 17 | 36 | 0 | 12 | 36 | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 26h | 17 | 33 | 0 | 17 | 35 | 0 | 10 | 32 | 0 | azon- nal | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 120h | 26 | 32 | 0 | 23 | 34 | 0 | 0 | azon- nal | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| azon- nal | 24 | 40 | 0 | 24 | 40 | 0 | 24 | 40 | 0 | 24 | 40 | 0 | 24 | 40 | 0 | |
| lh | 15 | 35 | 0 | 11 | 35 | 0 | 14 | 34 | 0 | 13 | 34 | 0 | 0 | 17 | 0 | |
| 10 | 4h | - | - | - | 12 | 34 | 0 | 11 | 32 | 0 | 11 | 28 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 26h | 18 | 32 | 0 | 17 | 34 | 0 | 11 | 27 | 0 | 0 | azon- nal | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 120h | - | - | - | 28 | 32 | 0 | 0 | azon- nal | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Enzim: AS-csapadék (1 : 20 hígítás RP-vel centrifugálva, SNT-+ teszt-tárolás, 0,1 MPP pH 7,5 10 mM DTT-vel
HU 208 845 Β
4. táblázat
Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271 törzsből származó tisztított tiol-dependens PAT szubsztrát-specifitása (affinitás-kormatográfia után AL27812 aktív frakció)
| Szubsztrát | Termék | HPLC-vel meghat, specifik. enzim. akt. (mU/mG fehérje) | |
| Acil-akceptor | Acil-donor | ||
| Izopenicillin N | PaCoA | Penicillin V | 146 |
| Izopenicillin N | PaCoA | Penicillin G | 80 |
| 6-APA | PaCoA | Penicillin V | 393 |
| 6-APA | PaCoA | Penicillin G | 329 |
| 7-ADCA | PaCoA | 3-Desacetox-cephalosporin V | 49 |
| 7-ACA | PaCoA | Cephalosporin V | 0 |
| Cephalosporin C | PaCoA | Cephalosporin V | 0 |
| Penicillin G | PaCoA | Penicillin V | 25 |
| Penicillin V | PaCoA | Penicillin G | 99 |
| H2o | Izopenicillin N | 6-APA | 150 |
| h2o | Penicillin V | 6-APA | 75 |
| h2o | Penicillin G | 6-APA | 17 |
| h2o | 7-Glutaryl-APA | 6-APA | 106 |
Az ábrák a következőket tartalmazzák: 25
/. ábra
A tiol-dependens PAT tisztítása Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271-ből
Az affinitás-kromatográfiával előállított Al 278/2 30 kromatofókuszálása Mono P = AL 310 oszlop: Pharmacia Mono P alap-térfogat: 4 ml eluáló puffer: A: 25 mM bisz-TRIS puffer pH 6,3;
HCl 35
B: 10 ml polipuffer 74/100 ml pH 4,00;
HCl minta: AL 278/2 affinitás minta minta-térfogat: 1 ml puffercsere az A pufferre, ml töltve 40 papírsebesség: 30 cm/óra sebesség: 60 ml/óra
O.D.: 0,1; 280 nm;HR-10 cella frakciók: lásd jelölés.
2. ábra
A Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271 tioldependens PAT-jának tisztítása
Az AL 278/2 aktív pool AL310/kromatofókuszálás
3-5 frakciójának RPC-je (MN Nucleosil 300-5/C4) 50 Mono P-n.
3. ábra
A Penicillium-crysogenum P2IATCC 48271 tioldependens PAT-jának elektroforetikus jellemzése 55 Az affinitás-kromatográfiásan előállított AL 278/2
PAT enzimkészítmény Mono P AL 310/kromatofókuszálás gradiens SDS-poliakrilamid gél-elektroforézis és izoelektromos fókuszálása ampholinon (pH 3,5—
9,5), illetve immobilinen (pH 4,5-6,5). 60
4. ábra
A Penicillium chrysogenum a pat gént körülvevő DNS szakaszának restrikciós térképe A restrikciós térképek hozzávetőleges reprodukciói a
DNS molekulán található hasítási helyeknek. A restrikciós hasítási helyek mutatott távolsága arányos a valódi távolsággal, de a valójában megfigyelt távolságok különbözhetnek ezektől. Nem mutatjuk az összes restrikciós hasítási helyet, további hasítási helyek lehetnek jelen.
A = a 14. és 15. példa szekvenciája B = a 18. példa szekvenciája
5. ábra
A választott oligonukleotid keverék szekvenciája
6. ábra
A szekvenált régiók (D. F. G) az oligonukleotidok (C. E.), a PAT 1-es polipeptidje és az ebből származtatott kódoló DNS-lánc (B) szekvenciája közötti kapcsolat sematikus ábrázolása
D = a 11. példa szekvenciája
F = a 13. példa szekvenciája
G = a 14. és 15. példa szekvenciája
7. ábra
Λ pBC200I plazmid előállítása
A teljes pat cDNS klón (felső vonalak) DNS-éből kiindulva a két EcoRI fragmentet az M13mpl9 vektorba klónozzuk. Egy oligonukleotid felhasználásával egy Ncol helyet építünk be. Az NcoI-HindlII fragment ezután a pKK33-2 expressziós vektorba építjük be.
EcoRI, HindlII, Ncol jelzik a megfelelő enzimek hasítási helyét; mcs az M13mpl9 többszörös klónozó helye: p trc a pKK33-2 trp-lac fúziós promotere; rmBTlT2 a pKK33-2 transzkripciós terminátora; bla a pKK33-2 ampicillin rezisztencia génje.
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás penicillin acil-transzferáz (PAT) enzimet kódoló DNS szekvenciát és adott esetben a kódoló DNS szekvencia transzkripicóját és transzlációját szabályozó DNS szekvenciát tartalmazó DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogyi) egy penicillint termelő gomba penicillin aciltranszferázt kódoló DNS szekvenciáját és adott esetben a kódoló DNS szekvencia transzkripcióját és transzlációját szabályozó DNS szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciarészt azonosítjuk;ii) a DNS szekvenciarészt kihasítjuk a penicillint termelő gomba genetikai anyagából; és iii) izoláljuk és tisztítjuk a DNS molekulát. (Elsőbbsége: 1988. 04. 08.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a8. ábraA pBC2002 plazmidEnnek a plazmidnak a készítése a pHS103-mal indul (Kolar et al.), amely az Aspergillus nidulans p gdp promoterét (a glicerindaldehid-foszfát-dehidrogénáz 5 gén promotere) a phleomicin rezisztencia génhez (ble) kapcsolva tartalmazza. Az ampicillin rezisztencia gén (bla) szelekciós markerként szolgál E, coliban. A pHS 103-ban a 4,8 kb méretű, a Penicillium chrysogenum pat génjét tartalmazó Sáli fragment található be- 10 építve, Sáli, EcoRI a megfelelő restrikciós enzimek hasítási helye.9. ábraReakcióséma, amely szerint a penicillin-aciltransz- 15 feráz (PAT) katalizálja az izopenicillin N transzacilezését, illetve 6-APA-vá való hasítását, valamint penicillinné való acilezésétMetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla 30 40AlaLysAlaValIleAlaArgSerlleAspPheAlaValAspLeuIleArgGlyLysThr 50 60ΣγΞΡγ
- 3ΤΗΓΑΞρ0ΐιιΟιιΕθυΕγ30].ηνΗΐΕβιι3θΓ01ηΕβα01γΑΓ9νβΐΤ. leGluGlu 70 80ArgTrpProLysTyrTyrGluGluIleArgGlylleAlaLysGlyAlaGluArgAspVal 90 100SerGluIleValMetLeuAsnThrArgThrGluPheAlaTyrGlyLeuLysAlaAlaArg 110 120AspGlyCysThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAsnTrp 130 140AspPhePheSerAlaThrLysGluAsnLeuIleArgLeuThrlleArgGlnAlaGlyLeu 150 160ΡΓθΊΉΠΐθ]3γ3Ρ1ϊ6ΐΐ6Τΐτ.Γ€1υ.Αΐ&01γΙ1βΙ1ε01γ]3γ3να101γΡΐιεΑ3η8βΓΑ1α 170 180GlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeuArgProThrGlyValPro 190 200SerHisIleAlaLeuArglleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 210 220IleValGluGlnGlyGlyMetAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAsnGlyHisGlu 230 240AlaPheGlyLeuGluPheSerProThrSerlleArgLysGlnValLeuAspAlaAsnGly 250 260ArgMetValHisThrAsnHisCysLeu.LeuGl.nHisGlyLysAsnGluLysGluLeu.Asp 270 280ProLeuProAspSerTrpAsnArgHisGlnArgMetGluPheLeuLeuAspGlyPheAsp 290 300GlyThrLysGlnAlaPheAlaGlnLeuTrpAlaAspGluAspAsnTyrProPheSerlle 310 320CysArgAlaTyrGluGluGlyLysSerArgGlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAsp 330 340HisAlaArgArgGluAlaThrValArgLeuGlyArgProThrAsnProAspGluMetPhe350ValMetArgPheAspGluGluAspGluArgSerAlaLeuAsnAlaArgLeu aminosav-szekvenciával rendelkező PAT enzimet kó- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, doló DNS molekulát izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 07. hogy a13.) 60HU 208 845 Β10 20 30 40 50 60 70GTTGATGTCCCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCAGATTGGTGGCTACGGCAATATAAATCTCAGCATGCA80 90 100 110 120 130 140GTTCCGCCTGCATGATCATCCCCAGGACGCCGTTTGTCATCTCCGTCAGCCAGGTCTCAGTTGTTTACCC 150 160 170 180 190 200 210ATCTTCCGACCCGCAGCAGAAATGCTTCACATCCTCTGTCAAGGCACTCCCTTTGAAGTAAGTGCTGCAC 220 230 240 250 260 270 280TGAATACCAGATTTTTTCCTTCTGAATCTTCCGAGTTCTGACCTGATCCAGATCGGCTACGAACATGGCT 290 300 310 320 330 340 350CTGCTGCCAAAGCCGTGATAGCCAGAAGCATTGACTTCGCCGTCGATCTCATCCGAGGGAAAACGAAGAA 360 370 380 390 400 410 420GACCGACGAAGAGCTTAAACAGGTACTCTCGCAACTGGGGCGCGTGATCGAGGAAAGATGGCCCAAATAC 430 440 450 460 470 480 490TACGAGGAGATTCGCGGTGAGTGCCACTTCGGTCTTTCCTACATTTTCTGCACCAATGCTGACCGATGAC 500 510 520 530 540 550 560CCCCGAAAAACCAGGTATTGCAAAGGGCGCTGAACGCGATGTCTCCGAGATTGTCATGCTTAATACCCGC 570 580 590 600 610 620 630ACGGAATTTGCATACGGGCTCAAGGCAGCCGTGATGGCTGCACCACTGCCTATTGTCAACTTCCAAATG 640 650 660 670 680 690 700GAGCCCTCCAGGGCCAAAACTGGGATGTACGTTAAGAGATTTTACCTCCTCATTTTATTCCATCGAATTT 710 720 730 740 750 760 770GCGCCGACTAATTTGGTTGTTCAAGTTCTTTTCTGCCACCAAAGAGAACCTGATCCGGTTAACGATCCGT 780 790 800 810 820 830 840CAGGCCGGACTTCCCACCATCAAATTCATAACCGAGGCTGGAATCATCGGGAAGGTTGGATTTAACAGTG 850 860 870 880 890 900 910CGGGGGTCGCCGTCAATTACAACGCCCTTCACCTTCAAGGTCTTCGACCCACCGGAGTTCCTTCGCATAT 920 930 940 950 960 970 980TGCCCTCCGCATAGCGCTCGAAAGCACTTCTCCTTCCCAGGCCTATGACCGGATCGTGGAGCAAGGCGGA 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050ATGGCCGCCAGCGCTTTTATCATGGTGGGCAATGGGCACGAGGCATTTGGTTTGGAATTCTCCCCCACCA 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120GCATCCGAAAGCAGGTGCTCGACGCGAATGGTAGGATGGTGCACACCAACCACTGCTTGCTTCAGCACGG 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190CAAAAATGAGAAAGAGCTCGATCCCTTACCGGACTCATGGAATCGCCACCAGCGTATGGAGTTCCTCCTC 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260GACGGGTTCGACGGCACCAAACAGGCATTTGCCCAGCTCTGGGCCGACGAAGACAATTATCCCTTTAGCA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330TCTGCCGCGCTTACGAGGAGGGCAAGAGCAGAGGCGCGACTCTGTTCAATATCATCTACGACCATGCCCG 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400TAGAGAGGCAACGGTGCGGCTTGGCCGGCCGACCAACCCTGATGAGATGTTTGTCATGCGGTTTGACGAG 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470GAGGACGAGAGGTCTGCGCTCAACGCCAGGCTTTGAAGGCTCTTCATGACGAGCCAATGCATCTTTTGTA 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540TGTAGCTTCAACCGACTCCGTCTTCACTTCTTCGCCCGCACTGCCTACCGTTTGTACCATCTGACTCATA 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610TAAATGTCTAGCCCCTACCTACACTATACCTAAGGGAGAGAAGCGTAGAGTGATTAACGTACGGGCCTAT 1620 1630 1640 1640 1660 1670 1680AGTACCCCGATCTCTAGATAGAACATTTAGTAGAGATTAGGATGCCTAACTAATTTAACTTGAGCATTGT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750CCCGTTCATATTGATTTTCATCCATTATACACTCTTAATCGTTTCCCGGTAGAAGCCGNATATATACGAC 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820CATAGGGTGTGGAGAACAGGGCTTCCCGTCTGCTTGGCCGTACTTAAGCTATATATTCTACACGGCCAAT 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890ACTCAATGTGCCCTTAGCACCTAAGCGGCACTCTAGGGTAAGTGCGGGTGATATAGGTGAGAAGTCTTAA 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960GACTGAAGACAGGATATCACGCGTTACCCTGCACCGTACCTACTACCTTCAATATCACTCTTTCAGGATG1970GACAGGGTCGACHU 208 845 Β nukleotid-szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát izolálunk. (Elsőbbsége: 1988.07. 13.)
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Penicillium chrysogenumnak a penicillin aciltranszferázát kódoló DNS-szekvencia transzkripcióját és transzlációját szabályozó nukleotid-szekvenciákat is tartalmazó DNS-molekulát izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.04.08.)
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy a10 20 30 40 505'-CCATTTGGAAGTTGACAATAGGCAGTGGTGCAGCCATCACGGGCTGCCTT60 70 80 90 100GAGCCCGTATGCAAATTCCGTGCGGGTATTAAGCATGACAATCTCGGAGA110CATCGCGTTCA-3' rész-szekvenciát is tartalmazó DNS molekulát izolál-
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, juk, (Elsőbbsége: 1988.04.08.) 15 hogy a10 20 30 40 505'-CATCACGGGCTGCCTTGAGCCCGTATGCAAATTCCGTGCGGGTATTAAGC60 70 80 90 100ATGACAATCTCGGAGACATCGCGTTCAGCGCCCTTTGCAATACCTGGTTT110 120 130 140 150TTCGGGGGTCATCGGTCAGCATTGGTGCAGAAAATGTAGGAAAGACCGAA160 170 180 190 200GTGGCACTCACCGCGAATCTCCTCGTAGTATTTGGGCCATCTTTCCTCGAT-3' rész-szekvenciát is tartalmazó DNS molekulát izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988. 04. 08.)
- 7. Eljárás penicillin acil-transzferáz enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a penicillin acil-transzferáz enzi- 30 met kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS fragmentumot inszertálunk egy alkalmas vektorba. (Elsőbbsége: 1988.07. 13.)
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-6. igénypontok bármelyike szerint izolált, penicillin acil-transzferáz enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS fragmentumot inszertálunk egy alkalmas vektorba. (Elsőbbsége: 1988. 07. 13.)
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS fragmentumot olyan vektorba inszertál- 40 juk, amely a vektor β-laktámot termelő mikroorganizmusokban való szelekcióját lehetővé tevő géneket tartalmaz. (Elsőbbsége: 1988.07. 13.)
- 10. A 8. és 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS fragmentumot egy izopenicillin N 45 szintetázt kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1988. 09. 08.)
- 11. Eljárás penicillin acil-transzferáz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogyi) egy alkalmas mikrobiális gazdasejtet transzformálunk egy 8-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektorral;ii) a transzformált sejtet megfelelő táptalajban tenyésztjük a penicillin acil-transzferáz kifejeződését lehetővé tevő körülmények között; és iii) a kifejeződött penicillin acil-transzferázt izolál35 juk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988. 07. 13.)
- 12. Eljárás penicillin előállítására, azzal jellemezve, hogyi) egy penicillint termelő gazdasejtet transzformálunk egy 8-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektorral;ii) a transzformált sejtet megfelelő táptalajban tenyésztjük a penicillin acil-transzferáz kifejeződését és a penicillin acil-transzerfáznak a penicillin termelését katalizáló hatását lehetővé tevő körülmények között; és iii) a penicillint izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1988.07. 13.)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT92288A AT390268B (de) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | Dna aus peniciliium chrysogenum sowie protein, fuer welches diese dna codiert |
| AT180688A AT391141B (de) | 1988-07-13 | 1988-07-13 | Dna, die fuer das enzym penicillinacyltransferase (pat) codiert |
| AT220188A AT391142B (de) | 1988-09-08 | 1988-09-08 | Dna aus penicillium chrysogenum |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU892092D0 HU892092D0 (en) | 1990-02-28 |
| HUT52156A HUT52156A (en) | 1990-06-28 |
| HU208845B true HU208845B (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=27146880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU892092A HU208845B (en) | 1988-04-08 | 1989-04-07 | Process for producing penicillin acyle-transferase its coding dna sequence vector containing it and host cell transformated thereby |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0336446B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0767387B2 (hu) |
| KR (1) | KR900700610A (hu) |
| AT (1) | ATE105860T1 (hu) |
| AU (1) | AU637317B2 (hu) |
| DE (1) | DE58907667D1 (hu) |
| DK (1) | DK175769B1 (hu) |
| ES (1) | ES2054916T3 (hu) |
| FI (1) | FI103053B1 (hu) |
| HK (1) | HK99996A (hu) |
| HU (1) | HU208845B (hu) |
| WO (1) | WO1989009821A1 (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747285A (en) * | 1989-02-01 | 1998-05-05 | Gist-Brocades, Nv. | DNA comprising regulatory regions from gene y of penicillium chrysogenum |
| IL95766A (en) * | 1989-09-27 | 1996-12-05 | Lilly Co Eli | Recombinant DNA expression vectors And DNA compounds. Which encode Aspergillus acyltransferase activity |
| US5882879A (en) * | 1990-02-28 | 1999-03-16 | Gist-Brocades, N.V. | Method for influencing β-lactam antibiotic production and for isolation of large quantities of ACV synthetase |
| US5168048A (en) * | 1990-04-18 | 1992-12-01 | Gist-Brocades Nv | Penicillin G acylase, a gene encoding the same and a method for the production of this enzyme |
| EP0914463A2 (en) * | 1996-07-16 | 1999-05-12 | Gist-Brocades B.V. | NOVEL PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORINS USING $i(ACREMONIUM CHRYSOGENUM) |
| WO2006089946A2 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Dsm Ip Assets B.V. | Altered isopenicillin-n acyltransferase polypeptides and related polynucleotides |
-
1989
- 1989-04-07 DE DE58907667T patent/DE58907667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-07 AT AT89106214T patent/ATE105860T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-07 EP EP89106214A patent/EP0336446B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-07 WO PCT/EP1989/000374 patent/WO1989009821A1/de active IP Right Grant
- 1989-04-07 JP JP1503743A patent/JPH0767387B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-07 AU AU33626/89A patent/AU637317B2/en not_active Expired
- 1989-04-07 KR KR1019890702284A patent/KR900700610A/ko active IP Right Grant
- 1989-04-07 HU HU892092A patent/HU208845B/hu unknown
- 1989-04-07 ES ES89106214T patent/ES2054916T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-07 FI FI895846A patent/FI103053B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-12-08 DK DK198906221A patent/DK175769B1/da not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-06-06 HK HK99996A patent/HK99996A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT52156A (en) | 1990-06-28 |
| ES2054916T3 (es) | 1994-08-16 |
| EP0336446A1 (de) | 1989-10-11 |
| DK175769B1 (da) | 2005-02-14 |
| FI103053B (fi) | 1999-04-15 |
| JPH0767387B2 (ja) | 1995-07-26 |
| KR900700610A (ko) | 1990-08-16 |
| EP0336446B1 (de) | 1994-05-18 |
| DE58907667D1 (de) | 1994-06-23 |
| AU3362689A (en) | 1989-11-03 |
| JPH02503750A (ja) | 1990-11-08 |
| WO1989009821A1 (en) | 1989-10-19 |
| ATE105860T1 (de) | 1994-06-15 |
| DK622189A (da) | 1990-02-02 |
| AU637317B2 (en) | 1993-05-27 |
| FI103053B1 (fi) | 1999-04-15 |
| HU892092D0 (en) | 1990-02-28 |
| FI895846A0 (fi) | 1989-12-07 |
| DK622189D0 (da) | 1989-12-08 |
| HK99996A (en) | 1996-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gutiérrez et al. | The cefG gene of Cephalosporium acremonium is linked to the cefEF gene and encodes a deacetylcephalosporin C acetyltransferase closely related to homoserine O-acetyltransferase | |
| Coque et al. | A gene encoding lysine 6-aminotransferase, which forms the beta-lactam precursor alpha-aminoadipic acid, is located in the cluster of cephamycin biosynthetic genes in Nocardia lactamdurans | |
| US5795733A (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 3-(carboxyethylthio) propionyl-7-ADCA | |
| JPH0751070A (ja) | ニトリラーゼ活性を有するポリペプチド | |
| JP2000342289A (ja) | ペニシリン生合成遺伝子の単離法 | |
| EP0436355A2 (en) | Process for producing 7-aminocephem compound or salts thereof | |
| US5919680A (en) | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G | |
| HU208845B (en) | Process for producing penicillin acyle-transferase its coding dna sequence vector containing it and host cell transformated thereby | |
| HU220460B1 (hu) | Új cefalosporin C aciláz | |
| US5328839A (en) | Oxido reductase enzyme system obtained from P. chrysogenum | |
| CA2389789A1 (en) | Genes involved in cyclododecanone degradation pathway | |
| US6245524B1 (en) | Phenylacetyl-CoA ligase from penicillium chrysogenum | |
| EP0566897A2 (en) | The complete gene (cefG) encoding the acetyl-CoA: deacetylcephalosporin C acetyltransferase of Cephalosporium acremonium, its isolation and use | |
| US6635458B2 (en) | Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7$B(G)-(4-Carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme D-aminoacid oxidase of trigonopsis variabilis produced in escherichia coli | |
| US5753435A (en) | Oxido reductase enzyme system obtainable from P. chrysogenum, the set of genes encoding the same and the use of oxido reductase enzyme systems or genes encoding the same for increasing antibiotic production | |
| AT391142B (de) | Dna aus penicillium chrysogenum | |
| JPH06303981A (ja) | ホルムアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにホルムアルデヒド脱水素酵素の製造法 | |
| JP2004500826A (ja) | デスアセチルセファロスポリンｃの直接的製造 | |
| JPH08103269A (ja) | カルボニルレダクターゼ遺伝子の塩基配列及びその利用法 | |
| JPH10262674A (ja) | アルカリホスファターゼをコードする遺伝子 | |
| JP3396740B2 (ja) | ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子 | |
| JP2003061682A (ja) | 還元酵素遺伝子及びその利用 | |
| Rubio Coque et al. | A gene encoding lysine 6-aminotransferase, which forms the beta-lactam precursor alpha-aminoadipic acid, is located in the cluster of cephamycin biosynthetic genes in Nocardia lactamdurans | |
| COQUE et al. | of Cephamycin Biosynthetic Genes in Nocardia lactamdurans | |
| JP2001095577A (ja) | 新規なポリペプチド、そのポリペプチドをコードするｄｎａ及びそれらの用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANDOZ AG, CH |