JP2003061682A - 還元酵素遺伝子及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸
エステルの製造方法は必ずしも工業的に十分なものでは
なく、新しい（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エ
ステルの製造方法を提供すること。 【解決手段】４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉
還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチ
ルを優先的に生産する能力を有するタンパク質のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、当該遺伝
子を含む組換ベクター、当該遺伝子又は組換ベクターが
宿主細胞に導入されてなる形質転換体及びその利用によ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元酵素をコード
する遺伝子、該酵素及びそれらの利用等に関する。

【０００２】

【従来の技術】（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸
エステルは医農薬中間体等として有用な化合物であり、
これまでに種々の製造方法が提案されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の（Ｓ）
−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法は
必ずしも工業的に十分なものではなく、新しい（Ｓ）−
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法が求
められている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、（Ｓ）−
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法につい
て種々検討した結果、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキ
シ酪酸エステルを製造するために利用可能なタンパク質
のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を
見出し、これを反応触媒として利用することにより４−
ハロ−３−オキソ酪酸エステルを不斉還元して（Ｓ）−
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを優先的に生産
するような製造方法を提供することが上記課題を解決す
るために極めて有効であると判断し、かつ多くの実験等
を経ることにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有するタンパク質が４−ハロ−３−オキソ酪酸エステ
ルを不斉還元して（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪
酸エステルを優先的に生産する能力を有することを見出
し、本発明に至った。

【０００５】即ち、本発明は、 １．下記の塩基配列のいずれかを有することを特徴とす
る遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。） ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列、 ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、４
−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード
する塩基配列、 ｃ）配列番号２で示される塩基配列； ２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項
１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなること
を特徴とする遺伝子； ３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする
組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともあ
る。）； ４．前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクター
が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換
体； ５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記
載の形質転換体； ６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記
載の形質転換体； ７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形
質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともあ
る。）； ８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工
程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法； ９．下記のアミノ酸配列のいずれかを有することを特徴
とするタンパク質（以下、本発明タンパク質と記載する
こともある。） ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、 ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの
塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、４
−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、 ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列であって、かつ、４−ブロモ−３−オキソ酪
酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルを優先的に生産する能力を有するタン
パク質のアミノ酸配列； １０．４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに前項９に記
載のタンパク質、それを産生する形質転換体又はその処
理物を作用させることを特徴とする（Ｓ）−４−ハロ−
３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法； １１．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能
力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクタ
ー； １２．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質が
グルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１１
記載の組換ベクター； １３．前項１１又は１２記載の組換ベクターが宿主細胞
に導入されてなることを特徴とする形質転換体； １４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１
３記載の形質転換体； １５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１
３記載の形質転換体； １６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能
力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有する遺伝子を保有することを特徴とする形質転
換体； １７．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質を
反応系内に共存させること特徴とする前項１０記載の
（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造
方法； １８．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質が
グルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１７
記載の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル
の製造法； １９．４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに前項１３〜
１５記載の形質転換体又はその処理物を作用させること
を特徴とする（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エ
ステルの製造方法； ２０．４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに前項１６記
載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴
とする（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル
の製造方法； 等を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】まず、本発明遺伝子について説明
する。本発明遺伝子は、天然の遺伝子であってもよく、
又は天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入
法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子
であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、４
−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば
ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）な
どのペニシリウム属に属する微生物をその対象として挙
げることができる。

【０００７】本発明遺伝子は４−ブロモ−３−オキソ酪
酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルを優先的に生産する還元反応を触媒す
る能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有している。

【０００８】本発明遺伝子において「配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡
辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発
行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション
法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（9
00mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が
挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることに
より配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを
形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（1
5mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が
挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイ
ブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。

【０００９】具体的には、例えば、配列番号１で示され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加
された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配
列相同性が８０％以上であるＤＮＡ等があげられる。か
かるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクロー
ニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされ
たＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、
置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっ
ても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。

【００１０】より具体的には、例えば、配列番号１で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮ
Ａ及び配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ
（例えば、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、配列番号２８で示される塩基配列からなるＤＮＡ
等）等が挙げられる。

【００１１】本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、以下の
ようにして調製することができる。

【００１２】ペニシリウム・シトリナム（Penicillium
citrinum）等のペニシリウム属に属する微生物等から通
常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プ
ロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀
潤社、1993年）に記載された方法）に準じてｃDNAライ
ブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを
鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行
うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示され
るアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示され
る塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子の
ＤＮＡを調製することができる。

【００１３】また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
して、かつ配列番号２３に示される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドと配列番号２４に示される塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣ
Ｒを行うことにより、配列番号２８で示される塩基配列
からなるＤＮＡを増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製
することができる。

【００１４】該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類
のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリ
ーを混合した反応液を97℃（2分間）に加熱した後、97
℃(0.25分間)‐50℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイ
クルを１０回、次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)
‐72℃(2.5分間)のサイクルを２０回行い、さらに72℃
で7分間保持する条件が挙げられる。

【００１５】なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’
末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよ
い。

【００１６】また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
して配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列
をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配
列からなるオリゴヌクレオチド）とｃＤＮＡライブラリ
ー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩
基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上
のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣ
Ｒを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番
号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発
明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。

【００１７】上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd edition」
（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「C
urrent Protocols in Molecular Biology」(1987), Joh
n Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載され
ている方法に準じてベクターにクローニングして本発明
組換ベクターを得ることができる。用いられるベクター
としては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社
製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋
紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A
（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）など
が挙げられる。

【００１８】また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、
微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたｃＤ
ＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列
をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有す
る約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプロ
ーブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プ
ローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっ
ても取得することができる。

【００１９】染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーに
プローブをハイブリダイズさせる方法としては、例え
ば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブ
リダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの
作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択す
ることができる。

【００２０】使用されるライブラリーがプラスミドベク
ターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリ
ダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブ
ラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質
転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該
希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培
養する。

【００２１】使用されるライブラリーがファージベクタ
ーを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダ
イゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生
物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混
合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天
培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。

【００２２】次いで、いずれのハイブリダイゼーション
の場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレ
ンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸
着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した
後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定す
る処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイ
ブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニト
ロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例え
ば、Hybond-N⁺（アマシャム社登録商標））を置き、約
１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写
させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば
１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）
に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることにより
ファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶
液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス
−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該
メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約
９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレ
ンに固定する。

【００２３】このように調製されたメンブレンを用い
て、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーショ
ンを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Samb
rook,E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 2^nd edition（1989）」 Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うこと
ができる。

【００２４】プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元
素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたもの
であってもよい。プローブに用いるＤＮＡを放射性同位
元素により標識する方法としては、例えば、Random Pri
mer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することによ
り、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−³²Ｐ）ｄＣＴＰ
に替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ
を行う方法が挙げられる。また、プローブに用いるＤＮ
Ａを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム
製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection
System等を用いることができる。

【００２５】ハイブリダイゼーションは、例えば、以下
の通りに行うことができる。４５０〜９００ｍＭの塩化
ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを
含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．
０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜
２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブ
ミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ
０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブ
リダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナト
リウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％
のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮ
Ａを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のよう
にして作製したメンブレン１ｃｍ²当たり５０〜２００
μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液
に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保
温する。次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナ
トリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含
み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性
した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含
み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニ
ルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含
んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましく
は、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸
ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍ
ｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ
（メンブレン１ｃｍ²当たり１．０×１０⁴〜２．０×１
０⁶cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ²
当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダ
イゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間
保温する。

【００２６】該ハイブリダイゼーション後、メンブレン
を取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５
〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量
％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは
１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナト
リウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄
液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC
（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを
例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上
のプローブの位置を検出することにより、用いたプロー
ブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に
相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣
菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離
する。

【００２７】このようにして得られるクローンを培養し
て得られる培養菌体から本発明遺伝子のＤＮＡを調製す
ることができる。

【００２８】上記のようにして調製されたＤＮＡを「Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd edition」
（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「C
urrent Protocols in Molecular Biology」(1987), Joh
n Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載され
ている方法に準じてベクターにクローニングして本発明
組換ベクターを得ることができる。用いられるベクター
としては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社
製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋
紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A
（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が
挙げられる。

【００２９】また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sang
er, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natura
l Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁
等に記載されているダイデオキシターミネーター法等に
より解析することができる。塩基配列分析用の試料調製
には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM DyeTer
minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市
販の試薬を用いてもよい。

【００３０】上述のようにして得られるＤＮＡが、４−
ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−
４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先して生産
する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードし
ていることの確認は、例えば、以下のようにして行うこ
とができる。

【００３１】まず上述のようにして得られるＤＮＡを後
述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーター
の下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベク
ターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次い
で該形質転換体の培養物を４−ブロモ−３−オキソ酪酸
メチルに作用させる。反応生成物中の（Ｓ）−４−ブロ
モ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの量を分析することによ
り、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質の
アミノ酸配列をコードすることが確認できる。

【００３２】本発明遺伝子を宿主細胞で発現させるに
は、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発
明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿
主細胞に導入する。

【００３３】ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝
子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換
させた際に、本発明遺伝子が、プロモーターの制御下に
発現するようにプロモーターと結合された状態にあるこ
とを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクト
ースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファン
オペロンのプロモーター、または、tacプロモーターも
しくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成
プロモーター等をあげることができ、ペニシリウム・シ
トリナムにおいて本発明遺伝子の発現を制御しているプ
ロモーターを利用してもよい。

【００３４】一般的には、宿主細胞において機能可能な
プロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を
前述のようなベクターに組み込んでなる組換ベクターを
宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マー
カー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマ
イシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含
むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転
換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして
選択することができる。

【００３５】宿主細胞において機能可能なプロモーター
と機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発
明組換ベクター等を導入する宿主細胞としては、例え
ば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、
Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces
属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物
等があげられる。

【００３６】宿主細胞において機能可能なプロモーター
と機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発
明組換ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いら
れる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよ
く、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al 2^nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Labor
atory Press、「Current Protocols in Molecular Biol
ogy」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-503
38-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in
Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser Syste
m」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレ
クトロポレーション法等をあげることができる。

【００３７】宿主細胞において機能可能なプロモーター
と機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発
明組換ベクター等が導入された形質転換体を選抜するに
は、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マー
カー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。該形
質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例え
ば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd e
dition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位
の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーショ
ン、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことに
より、確認することができる。

【００３８】次に本発明タンパク質について説明する。
本発明タンパク質は、下記のアミノ酸配列を有すること
を特徴とする。 ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。 ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの
塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、４
−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列であって、かつ、４−ブロモ−３−オキソ酪
酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルを優先的に生産する能力を有するタン
パク質のアミノ酸配列。

【００３９】本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち、
配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは
複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ
酸配列のＣ末端側にTrp-Ile-Ser-Thr-Lys-Leuの６アミ
ノ酸が付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。

【００４０】本発明タンパク質は、例えば、本発明遺伝
子を保有する形質転換体を培養することにより製造する
ことができる。該形質転換体を培養するための培地とし
ては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用さ
れる炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種
の培地を用いることができる。

【００４１】炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等
の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の
有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これら
の炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１
〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。

【００４２】窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプ
トン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・ステ
ィープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥
酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝
酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン
酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が
挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天
然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源と
しても使用することができる。これらの窒素源の培地へ
の添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／
ｖ）程度である。

【００４３】有機塩や無機塩としては、例えば、カリウ
ム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバル
ト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン
酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化
ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸
銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カ
リウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これら
の有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に
対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。

【００４４】さらに、tacプロモーター、trcプロモータ
ー及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導され
るタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な
形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体
の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための
誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactos
ide（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。

【００４５】本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養
は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に
準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往
復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermente
r）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げ
られる。培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で
適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地の
ｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条
件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。

【００４６】本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養
物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常
のタンパク質の精製において使用される方法を適用する
ことができ、例えば、次のような方法を挙げることがで
きる。

【００４７】まず、形質転換体の培養物から遠心分離等
により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル
処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活
性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破
砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分
離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去す
ることにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交
換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー
等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、
本発明タンパク質を精製することができる。クロマトグ
ラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシ
メチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロー
ス、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体
が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることも
でき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例え
ば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、
いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社
製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソ
ー社製）等が挙げられる。尚、本発明タンパク質を含む
画分を選抜するには、例えば、４−ブロモ−３−オキソ
酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒ
ドロキシ酪酸メチルを優先的に生産する能力を指標にし
て選抜すればよい。

【００４８】次に、本発明における（Ｓ）−４−ハロ−
３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法について説明す
る。該製造方法は４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその
処理物を作用させることを特徴とする。

【００４９】４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルは、下
記一般式（１）で示される化合物である。

【化１】 一般式（１）において、Ｒ¹は、例えば、Ｃ１−Ｃ８ア
ルキル基を表し、Ｒ²はハロゲン原子を表す。４−ハロ
−３−オキソ酪酸エステルとしては、具体的には、例え
ば、４−クロロ−３−オキソ酪酸メチル、４−クロロ−
３−オキソ酪酸エチル、４−クロロ−３−オキソ酪酸プ
ロピル、４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル、４−ブロ
モ−３−オキソ酪酸エチル、４−ブロモ−３−オキソ酪
酸プロピル及び４−ブロモ−３−オキソ酪酸オクチル等
が挙げられる。

【００５０】上記方法は、通常、水及び還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ
Ｈと記す。）の存在下に行われる。この際に用いられる
水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用い
られる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウ
ム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこ
れらの混合物が挙げられる。

【００５１】上記方法においては、水に加えて有機溶媒
を共存させることもできる。共存させることができる有
機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、
ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエー
テル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸
ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等の
エステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、
ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、
エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチ
ルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド
等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニ
トリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられ
る。

【００５２】上記方法における反応は、例えば、水、Ｎ
ＡＤＰＨ、及び４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルを、
本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又
はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を
含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することによ
り行われる。

【００５３】上記方法における反応時のｐＨは適宜選択
することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。
また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び
生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範
囲である。

【００５４】反応の終点は、例えば、反応液中の４−ハ
ロ−３−オキソ酪酸エステルの量を液体クロマトグラフ
ィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時
間から１０日間の範囲である。

【００５５】反応液からの（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒド
ロキシ酪酸エステルの回収は、一般に知られている任意
の方法で行えばよい。例えば、反応液の有機溶媒抽出操
作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマト
グラフィー、蒸留等を組み合わせて、行なうことにより
精製する方法が挙げられる。

【００５６】本発明タンパク質、それを産生する形質転
換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いるこ
とができる。

【００５７】具体的な形態としては、例えば、本発明遺
伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体
の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タン
パク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、
形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転
換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質
転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の
超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカ
リ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法とし
ては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等
の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タ
ンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリ
ルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、
アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に
本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。

【００５８】尚、本発明遺伝子を保有する形質転換体を
用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用い
るよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方
法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そ
のための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌
法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）
や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲ
ン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、
フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデ
ヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一
般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タン
パク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、
汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ま
しい。

【００５９】また、本発明の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒ
ドロキシ酪酸エステルの製造方法はＮＡＤＰＨの存在下
に行われ、４−ブロモ−３−オキソ酪酸エステルの不斉
還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＰＨは酸化型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、Ｎ
ＡＤＰ⁺と記す）に変換される。変換により生じたＮＡ
ＤＰ⁺は、ＮＡＤＰ⁺を還元型（ＮＡＤＰＨ）に変換する
能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＰＨに戻すこ
とができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤＰ⁺
をＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質を共存
させることもできる。ＮＡＤＰ⁺をＮＡＤＰＨに変換す
る能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコー
ス脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水
素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リン
ゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。また、ＮＡＤＰ⁺
をＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質がグル
コース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコー
ス等を共存させることにより該タンパク質の活性が増強
される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えても
よい。また、当該タンパク質は、酵素そのものであって
もよいし、また該酵素をもつ微生物又は該微生物の処理
物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにま
た、ＮＡＤＰ⁺をＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタ
ンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよ
い。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理
物」と同等なものを意味する。

【００６０】さらに、本発明の（Ｓ）−４−ハロ−３−
ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法では、グルコース脱
水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵
素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸
脱水素酵素等）等のようなＮＡＤＰ⁺をＮＡＤＰＨに変
換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換
体を用いて行うこともできる。この形質転換体におい
て、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例
えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細
胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに
両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細
胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の
遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入し
てもよい。尚、単一である、両者遺伝子を含むベクター
を宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモー
ター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれ
ぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築した
り、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含
むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築
してもよい。

【００６１】

【実施例】以下、実施例等により本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定さ
れるものではない。 参考例 （ｃＤＮＡライブラリー（A）の調製） ５００ｍｌフラスコに培地（水にポテト・デキストロー
ス・ブロース（ベクトン・ディッキンソン社製）を２４
g／Lの割合で溶解したもの）１００ｍｌを入れ、１２１
℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養
（３０℃、４８時間、振盪培養）したペニシリウム・シ
トリナム（Penicillium citrinum）IFO4631株の培養液
０．５ｍｌを加え、３０℃で７２時間振盪培養した。そ
の後、得られた培養液を遠心し（８０００ｘｇ、１０
分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を２０ｍＭリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０ｍｌで３回洗浄
して、約１．０ｇの湿菌体を得た。上記の湿菌体約１．
０gを用いて、チオシアン酸グアニジンフェノールクロ
ロホルム法で全ＲＮＡを調製することにより、約１．５
ｍｇの全ＲＮＡを得た。さらに０．５ｍｇの全ＲＮＡか
らOligotex(dT)30-Super(宝酒造社製)を用いてpoly(A)
を有するＲＮＡ約９．３μｇを得た。

【００６２】ｃＤＮＡライブラリーの作製はGubler and
Hoffman法に基づいて以下のとおり実施した。上記のpo
ly(A)を有するＲＮＡ（３．０μｇ）とOligo(dT)18-リ
ンカープライマー（（含XhoIサイト）宝酒造社製）、RA
V-2 Rtase及びSuperScriptII Rtaseを用いて一本鎖cD
NAを調製し、この反応液（調製された一本鎖ｃＤＮＡを
含む）にE. coli DNA polymerase、E. coli Rnase/E. c
oli DNA Ligase Mixture及びT4 DNA Polymeraseを加
え、二本鎖cDNAの合成と平滑末端化を行った。次いで、
この二本鎖ｃＤＮＡとEcoRI-NotI-BamHIアダプター（宝
酒造社製）とのライゲーションを行った。ライゲーショ
ン後のDNAをリン酸化処理、XhoIで切断、スピンカラム
(宝酒造社製)で低分子量DNAを除去、λZapII（EcoRI-Xh
oI切断）とライゲーションを行った後、in vitro packa
ging kit (STRATAGENE社製)を用いて、パッケージング
することにより、ｃＤＮＡライブラリー（以下、ｃＤＮ
Ａライブラリー（Ａ）と記す。）を得た。

【００６３】実施例１ （本発明遺伝子の取得及びその
解析） （１）本発明タンパク質の調製 参考例と同様の条件で調製したペニシリウム・シトリナ
ム（Penicillium citrinum）IFO4631株の湿菌体約２３
ｇを、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．
０）１６０ｍｌに懸濁しダイノミル（シンマルエンター
プライズ製、ガラスビーズ０．１〜０．２ｍｍΦ、３０
００ｒｐｍ、３０分）で破砕した。得られた破砕液を遠
心分離（１００００ｘｇ、１０分間）し、上清をさらに
超遠心分離（１０００００ｘｇ、１２０分間）して、超
遠心上清１６０ｍｌを得た。得られた超遠心上清１６０
ｍｌに硫酸アンモニウムをその濃度が１．５Ｍになるま
で徐々に加えた。これを疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーカラム［Hi-LoadPhenyl（26/10）（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製）］［１．５Ｍ硫酸アンモニウ
ムを含むＢＩＳ−ＴＲＩＳ−ＰＲＯＰＡＮＥバッファー
（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着
し、硫酸アンモニウムを溶解したＢＩＳ−ＴＲＩＳ−Ｐ
ＲＯＰＡＮＥバッファー（硫酸アンモニウム濃度１．５
Ｍ→０．６Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元
酵素活性を有する画分として硫酸アンモニウム濃度が
１．１〜０．９Ｍの溶出画分２０ｍｌを得た。

【００６４】この溶出画分を脱塩し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．７）に置換した。これをイ
オン交換クロマトグラフィーカラム［Hi-Load Q Sepha
rose（16/10）（アマシャムファルマシアバイオテク社
製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．
７）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶
解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０
→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵
素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．０２
〜０．０８Ｍの画分３ｍｌを得た。これを濃縮し、濃縮
液をゲル濾過［カラム：スーパーデックス200（10/30）
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動
層：BIS-TRIS-PROPANEバッファー（20ｍＭ、ｐＨ7.
0）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３
３０００ダルトンの部分１ｍｌ（以下、活性画分（Ａ）
と記す。）を得た。

【００６５】尚、クロマトグラフィー等で得られた画分
について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル（１．５６ｍｇ／ｍ
ｌ）及びＮＡＤＰＨ（０．２２６ｍｇ／ｍｌ）を溶解し
たリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．０）０．９ｍｌに
クロマトグラフィー等により得られた溶出画分を加えて
全量を１ｍｌとし、３７℃で２０秒間保温した後、３４
０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮ
ＡＤＰＨの消費量を計算して画分の還元酵素活性を求め
た。

【００６６】（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチ
ドが有するアミノ酸配列の解析 上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U.
K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後の
ゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを
切り取った。このゲルをジチオスレイトール及びヨウ化
アセトアミドを用いて還元アルキル化し、トリプシンを
処理した後、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペ
プチドをＨＰＬＣ（カラム：TSKgel ODS-80=Ts、2.0mm
×250mm（東ソー株式会社）、移動層：０．１％トリフ
ルオロ酢酸水／アセトニトリル＝１００／０→２０／８
０の濃度勾配）により分取した。分取した各画分のＴＯ
Ｆ−ＭＳスペクトルから純度が高いことが判明した５個
の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー
（４９４ｃＬＣ）により決定した。決定したアミノ酸配
列のそれぞれを配列番号３、４、５、６、７に示す。

【００６７】（３）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の
解析（その１） 配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号
８、９、１０、１１、１２、１３、１４で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た。

【００６８】配列番号８、９、１０、１１、１２、１
３、１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドプライマーのいずれかとＳＫオリゴヌクレオチドプラ
イマー（STRATAGENE社製）とをプライマーに、前記ｃＤ
ＮＡライブラリー（Ａ）を鋳型にして、下記反応液組
成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノ
スティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを
使用した。)

【００６９】[反応液組成] cDNAライブラリー原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl [反応条件]上記組成の反応液が入った容器をPERKIN EL
MER−GeneAmp PCR System2400にセットし、97℃（2分
間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐50℃(0.5分間)‐7
2℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25
分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)のサイクルを２
０回行い、さらに72℃で7分間保持した。

【００７０】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行ったところ、プライマーとし
て、配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチドプライ
マーとを用いた場合、配列番号１２で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマーとＳＫオリゴヌ
クレオチドプライマーとを用いた場合及び配列番号１４
で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライ
マーとＳＫオリゴヌクレオチドプライマーとを用いた場
合において各々約７４０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検
出された。

【００７１】約７４０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出
されたＰＣＲ反応液のそれぞれをそのまま用いて、上記
の約７４０ｂｐのＤＮＡ断片のそれぞれを、ｐCR2.1−T
OPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライ
ゲーションし（Invitrogen社製TOPO^TMTA cloningキット使
用）、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形
質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母
エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（以下、Ｘ−ｇａｌと記す）４％水溶液３０μｌ及び
０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質
転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白い
コロニーを１個ずつとり、このコロニーを５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に
接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時
間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep
Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。以
下、配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチドプライ
マーとをプライマーに用いてＰＣＲした場合に得られた
ＤＮＡ断片に由来するプラスミドをプラスミドｐ２７−
１、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチドプライ
マーとをプライマーに用いてＰＣＲした場合に得られた
ＤＮＡ断片に由来するプラスミドをプラスミドｐ２７−
２及び配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチドプラ
イマーとをプライマーに用いてＰＣＲした場合に得られ
たのＤＮＡ断片に由来するプラスミドをプラスミドｐ２
７−３と記す。

【００７２】プラスミドｐ２７−１、プラスミドｐ２７
−２及びプラスミドｐ２７−３のそれぞれに挿入された
ＤＮＡ断片の塩基配列を解析したところ、挿入されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列はプライマーの塩基は配列部分を除
き全て同一であった。プラスミドｐ２７−１に挿入され
たＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１５に示す。なお、
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析
は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready React
ion Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミド
を鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡ
の塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマ
ー製）で解析することにより行った。

【００７３】（４）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の
解析（その２） 配列番号１５で示される塩基配列を基
に配列番号１６及び配列番号１７で示される塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。

【００７４】配列番号１６で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチ
ドプライマー（STRATAGENE社製）とを、又は配列番号１
７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーとＴ７オリゴヌクレオチドプライマー（STRATAGE
NE社製）とをプライマーに、前記ｃＤＮＡライブラリー
（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲ
を行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpan
d High Fidelity PCR Systemを使用)

【００７５】［反応液組成］ cDNAライブラリー原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【００７６】［反応条件］上記組成の反応液が入った容
器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセッ
トし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐5
5℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、
次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)
のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持し
た。

【００７７】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行った結果、プライマーとして、
配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドプライマーとＳＫオリゴヌクレオチドプライマー
とを用いた場合には約３５０ｂｐのＤＮＡ断片のバンド
が検出され、配列番号１７で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーとＴ７オリゴヌクレオチ
ドプライマーとを用いた場合には約６５０ｂｐのＤＮＡ
断片のバンドが検出された。

【００７８】上記のＰＣＲで得られた約３５０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を含有するＰＣＲ反応液又は約６５０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を含有するＰＣＲ反応液をそのまま用いて、上
記の約３５０ｂｐのＤＮＡ断片と約６５０ｂｐのＤＮＡ
断片のそれぞれをｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR
Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen
社製TOPO^TMTA cloningキット使用）、それぞれのライゲー
ション液でE．coli DH5αを形質転換した。５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａ
ｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗
布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形
成したコロニーのうち白いコロニーを１個ずつとり、こ
のコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養
した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQI
Aprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラス
ミドを取り出した。以下、配列番号１６で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとＳＫオリ
ゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用いてＰＣ
Ｒすることにより得られたＤＮＡ断片に由来するプラス
ミドをプラスミドｐＢＲ−１、配列番号１７で示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとＴ７
オリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用いて
ＰＣＲすることにより得られたＤＮＡ断片に由来するプ
ラスミドをプラスミドｐＢＲ−２と記す。

【００７９】次に、プラスミドｐＢＲ−１及びプラスミ
ドｐＢＲ−２のそれぞれに挿入されたＤＮＡ断片の塩基
配列を解析した。プラスミドｐＢＲ−１に挿入されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を配列番号１８に、プラスミドｐＢ
Ｒ−２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１
９に示す。なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の
塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing
FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用い
て各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、
得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A
（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。

【００８０】（５）本発明遺伝子の塩基配列の解析 配列番号１５で示される塩基配列を基に配列番号２０で
示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを合成し、また、配列番号１９で示される塩基配列を
基に配列番号２１で示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーを合成した。

【００８１】配列番号２０で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２１で示され
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを
プライマーに、前記ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）を鋳型
にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fid
elity PCR Systemを使用)

【００８２】［反応液組成］ cDNAライブラリー原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【００８３】［反応条件］上記組成の反応液が入った容
器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセッ
トし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐5
5℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、
次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)
のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持し
た。

【００８４】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行った結果、約４００ｂｐのＤＮ
Ａ断片のバンドが検出された。

【００８５】上記のＰＣＲで得られた約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を含有するＰＣＲ反応液をそのまま用いて、上
記の約４００ｂｐのＤＮＡ断片をpCR2.1−TOPOベクター
の既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし
（Invitrogen社製TOPO^TMTA cloningキット使用）、該ライ
ゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−
ｇａｌ ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μ
ｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養し
た。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、
このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培
養した（３０℃、２４時間）。この培養菌体からQIApre
pSpin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミド
を取り出した（以下、このプラスミドをプラスミドｐＢ
Ｒ−３と記す）。

【００８６】次に、プラスミドｐＢＲ−３に挿入された
ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。プラスミドｐＢＲ−
３に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２２に
示す。なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基
配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS r
eady Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いてプ
ラスミドｐＢＲ−３を鋳型としてシークエンス反応を行
い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー37
3A（パーキンエルマー製）で解析することにより行っ
た。

【００８７】配列番号１８、１９、２２で示される塩基
配列を基にＯＲＦ検索を行い、ペニシリウム・シトリナ
ムＩＦＯ４６３１株が有する４−ブロモ−３−オキソ酪
酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルを優先的に生産する能力を有するタン
パク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号
２８）を決定した。さらに配列番号２８をもとに該タン
パク質のアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。な
お、配列番号１と配列番号３、４、５、６、７とを比較
したところ、配列番号３、４、５、６、７で示されるア
ミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部
分とほぼ一致することがわかった。

【００８８】実施例２ （本発明形質転換体の製造及び
還元反応例（その１）） （１）本発明ベクターの調製 配列番号１８に示される塩基配列を基に配列番号２３で
示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、配列番号１９で示される塩基配列を基に配列番号
２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを合成した。

【００８９】配列番号２３で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２４で示され
るオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前
記ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）を鋳型にして下記反応液
組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグ
ノスティック社製のExpand High Fidelity PCR System
を使用)

【００９０】［反応液組成］ cDNAライブラリー原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【００９１】［反応条件］上記組成の反応液が入った容
器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセッ
トし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)-55
℃(0.5分間)-72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次
いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分間)のサ
イクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。

【００９２】その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロー
スゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮ
Ａ断片のバンドが検出された。残りのＰＣＲ反応液に２
種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約１０００
ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化され
たＤＮＡ断片を精製した。一方、プラスミドベクターｐ
ＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）を２種類の制限酵素（NcoI
及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮ
Ａ断片を精製した。

【００９３】これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られ
たライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニー
の中から６コロニーを無作為に選抜した。この選抜した
コロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振
盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体
からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて
プラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれ
ぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により
２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミド
には全て前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されて
いることを確認した。（以下、このプラスミドをプラス
ミドｐＴＲＰｃと記す。）

【００９４】（２）本発明形質転換体の調製及び還元反
応例 プラスミドｐＴＲＰｃを用いてE．coli HB101を形質転
換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及
び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培
地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１
２時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．４
ｇを得た。４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル３００ｍ
ｇ、前記湿菌体０．４ｇ、ＮＡＤＰ ⁺９ｍｇ、グルコー
ス７５０ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）
１．２ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１
５ｍｌ及び酢酸ブチル１５ｍｌを混合し、３０℃で７時
間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨが６．５±
０．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に
加えた。その後、反応液を遠心分離し、有機層を得た。
この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる
含量分析を行ったところ、反応に用いた４−ブロモ−３
−オキソ酪酸メチルの量に対して４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルは９８．５％生成していることがわか
った。また、下記条件で有機層中の４−ブロモ−３−ヒ
ドロキシ酪酸メチルの光学純度を測定したところ（Ｓ）
体が９６．１ ％ｅ．ｅ．であった。さらに該有機層を
濃縮することにより、粗（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルを得る。

【００９５】（含量分析条件） カラム：ＨＲ−２０Ｍ（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１μ
ｍ）（信和化工社製） カラム温度：１２０℃（５分）?３℃／分?１５０℃（５
分）?１０℃／分?２００℃（５分） キャリアーガス：ヘリウム（流量：２０ｍｌ／分） 検出器：ＦＩＤ

【００９６】（光学純度測定条件） カラム：G-TA（０．２５ｍｍ×３０ｍ、０．１２５μ
ｍ）（アステック社製） カラム温度：１１０℃（２０分）?５℃／分?１８０℃
（１分） キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分） 検出器：ＦＩＤ スプリット比：１/５０ 尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−４−ブロモ−３−
ヒドロキシ酪酸メチルの標品と比較することにより決定
した。

【００９７】実施例３ （本発明形質転換体の製造及び
還元反応例（その２））（１）本発明ベクターの調製 プラスミドｐＴＲＰｃを２種類の制限酵素（NcoI及びBa
mHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片
を精製した。一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ
（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）
により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製
した。これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライ
ゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。得られ
た形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
るＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中か
ら６コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニ
ーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養
した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQI
Aprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラス
ミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの
一部を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重
消化した後、電気泳動することにより、取り出したプラ
スミドには全て目的とするＤＮＡ断片が挿入されている
ことを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミド
ｐＴｒｃＲＰｃと記す。）

【００９８】（２）本発明形質転換体の調製及び還元反
応例 プラスミドｐＴｒｃＲＰｃを用いてE．coli HB10
1を形質転換した。 得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１０
０ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１２時
間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．４ｇを
得た。４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル１５００ｍ
ｇ、前記湿菌体０．４ｇ、ＮＡＤＰ⁺１８ｍｇ、グルコ
ース３０００ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬
製）３ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１
５ｍｌ及び酢酸ブチル１５ｍｌを混合し、３０℃で７時
間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨが６．５±
０．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に
加えた。その後、反応液を遠心分離し、有機層を得た。
この有機層を実施例２の含量分析条件により含量分析を
行ったところ、反応に用いた４−ブロモ−３−オキソ酪
酸メチルの量に対して４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸
メチルは９９．２％生成していることがわかった。ま
た、実施例２の光学純度測定条件で有機層中の４−ブロ
モ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの光学純度を測定したと
ころ（Ｓ）体が９５．７％ｅ．ｅ．であった。さらに該
有機層を濃縮することにより、粗（Ｓ）−４−ブロモ−
３−ヒドロキシ酪酸メチルを得る。

【００９９】実施例４ （本発明形質転換体の製造及び
還元反応例（その３）） （１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調
製するための準備Bacillus megaterium IFO12108株を滅
菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養し、菌体０．４ｇを
得た。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)
を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたが
って染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記
す。）を精製した。 （２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調
製 The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.1
1, 6381-6385(1989)に記載されたBacillus megaterium
IWG3由来のグルコース脱水素酵素の配列をもとに配列番
号２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
プライマーと配列番号２６で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。配列番号
２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーと配列番号２６で示される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、前
記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして以下の反応液組成、
反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノステ
ィック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)

【０１００】［反応液組成］ 染色体DNA原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【０１０１】［PCR反応条件］上記組成に反応液が入っ
た容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400に
セットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分
間)-55℃(0.5分間)-72?（1.5分間）のサイクルを１０
回、次いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分
間)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。

【０１０２】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行った結果、約９５０ｂｐのＤＮ
Ａ断片のバンドが検出された。得られたＰＣＲ反応液と
Invitrogen社製TOPO^TMTA cloningキットVer.Eとを用いて、
ＰＣＲによって得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐ
CR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイ
ト」にライゲーションし、そのライゲーション液でE．c
oli DH5αを形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３
０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得
られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニー
のうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍ
ｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４
時間）。次いで培養菌体からQIAprepSpin Miniprep Kit
(Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り
出したプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化
し、電気泳動することにより、該プラスミドには約９５
０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
（以下、このプラスミドをプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２
と記す。）

【０１０３】次に、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に挿入
されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配
列番号２７に示す。なお、プラスミドに挿入されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列の解析は、Dye TerminatorCycle sequ
encing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）
を用いてプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシー
クエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮ
Ａシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析する
ことにより行った。

【０１０４】（３）本発明ベクターの調製 プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を２種類の制限酵素（BamH
IとXbaI）で二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片
を精製した。一方、プラスミドｐＴｒｃＲＰｃを２種類
の制限酵素（BamHIとXbaI）で二重消化させ、酵素消化
されたＤＮＡ断片を精製した。それぞれの酵素消化され
たＤＮＡ断片をT4 DNAリガーゼでライゲーションし、そ
のライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニー
から６コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロ
ニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培
養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体から
QIAprepSpin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラ
スミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれ
の一部をBamHIとXbaIの2種類の制限酵素で二重消化した
後、電気泳動することによって、取り出したプラスミド
は全て目的とする約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入さ
れていることを確認した（以下、このプラスミドを以下
プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２と記す）。

【０１０５】（４）本発明形質転換体の調製及び還元反
応例 プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２を用いてE．coli HB10
1を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭの
ＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する
滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した
（３０℃、１２時間）。得られた培養液を遠心分離し、
湿菌体０．３ｇを得た。４−ブロモ−３−オキソ酪酸メ
チル０．３ｇ、上記湿菌体０．３ｇ、ＮＡＤＰ⁺９ｍ
ｇ、グルコース７５０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）１５ｍｌ、酢酸ブチル１５ｍｌを混合
し、３０℃で７時間攪拌した。なお、攪拌中は反応液の
ｐＨが６．５±０．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム
水溶液を徐々に加えた。その後、反応液を遠心分離し、
有機層を得た。この有機層を実施例２に記載した含量分
析条件により含量分析を行ったところ、反応に用いた４
−ブロモ−３−オキソ酪酸メチルの量に対して４−ブロ
モ−３−ヒドロキシ酪酸メチルは９９％生成しているこ
とがわかった。また、実施例２に記載した光学純度測定
条件で有機層中の４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチ
ルの光学純度を測定したところ（Ｓ）体が９６．０％
ｅ．ｅ．であった。さらに得られた有機層を濃縮するこ
とにより、粗（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸
メチルを得る。

【０１０６】実施例５ (本発明形質転換体の製造及び
還元反応例（その４）)（１）本発明ベクターの調製
（３'末端欠失型の組換ベクターの構築） 配列番号１
９で示される塩基配列を基に配列番号２９で示される塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た。

【０１０７】配列番号２３で示される塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２９で示され
るオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前
記プラスミドｐＴＲＰｃを鋳型にして下記反応液組成、
反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノステ
ィック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)

【０１０８】［反応液組成］ プラスミドｐＴＲＰｃ溶液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【０１０９】［反応条件］上記組成の反応液が入った容
器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセッ
トし、97?（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)-55
℃(0.5分間)-72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次
いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分間)のサ
イクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。

【０１１０】その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロー
スゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮ
Ａ断片のバンドが検出された。残りのＰＣＲ反応液を精
製し、２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約
１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素
消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、プラスミドベ
クターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）を２種類の制限酵
素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化さ
れたＤＮＡ断片を精製した。

【０１１１】これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られ
たライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニー
の中から６コロニーを無作為に選抜した。この選抜した
コロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振
盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体
からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて
プラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれ
ぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により
２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミド
には全て前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されて
いることを確認した。（以下、このプラスミドをプラス
ミドｐＴＲＰｃSと記す。）

【０１１２】次に、プラスミドｐＴＲＰｃSに挿入され
たＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。プラスミドｐＴＲ
ＰｃSに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３
０に示す。なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の
塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing
FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用い
てプラスミドｐＴＲＰｃSを鋳型としてシークエンス反
応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケン
サー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより
行った。

【０１１３】（２）本発明形質転換体の調製及び還元反
応例 プラスミドｐＴＲＰｃSを用いてE．coli HB101を形質転
換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及
び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培
地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、１
８時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．４
ｇを得た。４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル３００ｍ
ｇ、前記湿菌体０．４ｇ、ＮＡＤＰ ⁺９ｍｇ、グルコー
ス７５０ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）
１．２ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１
５ｍｌ及び酢酸ブチル１５ｍｌを混合し、３０℃で１９
時間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨが６．５±
０．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に
加えた。その後、反応液を遠心分離し、有機層を得た。
この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる
含量分析を行ったところ、反応に用いた４−ブロモ−３
−オキソ酪酸メチルの量に対して４−ブロモ−３−ヒド
ロキシ酪酸メチルは９７．３％生成していることがわか
った。また、下記条件で有機層中の４−ブロモ−３−ヒ
ドロキシ酪酸メチルの光学純度を測定したところ（Ｓ）
体が９６．５％ｅ．ｅ．であった。さらに該有機層を濃
縮することにより、粗（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロ
キシ酪酸メチルを得る。

【０１１４】実施例６ (本発明形質転換体の製造及び
還元反応例（その４）) （プラスミドpTRPcとプラスミドpAGDH12を用いた形質転
換体の構築と反応） （１） 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質
のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を
含む組換ベクターの調製（その１：プラスミドpTGDH12
の構築） 配列番号２７で示される塩基配列を基に配列番号３１で
示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーと配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーとを合成した。配列番号３１で示
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
と配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドプライマーとをプライマーに用い、前記染色体
ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして以下の反応液組成、反応条件
でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社
製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)

【０１１５】［反応液組成］ 染色体DNA原液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【０１１６】［PCR反応条件］上記組成に反応液が入っ
た容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400に
セットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分
間)-55℃(0.5分間)-72℃（1.5分間）のサイクルを１０
回、次いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分
間)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。

【０１１７】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行った結果、約８５０ｂｐのＤＮ
Ａ断片のバンドが検出された。残りのＰＣＲ反応液を精
製し、２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約
８５０ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消
化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、プラスミドベク
ターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）を２種類の制限酵素
（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化され
たＤＮＡ断片を精製した。

【０１１８】これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られ
たライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニー
の中から６コロニーを無作為に選抜した。この選抜した
コロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振
盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体
からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて
プラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれ
ぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により
２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミド
には全て前記約８５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されてい
ることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミ
ドｐＴGDH１２と記す。）

【０１１９】（２） 酸化型β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有す
るタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
する遺伝子を含む組換ベクターの調製（その２：プラス
ミドpCGDH12の構築） プラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）の配
列をもとに配列番号３３で示される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。配列番号３３
で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライ
マーと配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、プラス
ミドｐＴGDH１２を鋳型にして以下の反応液組成、反応
条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティッ
ク社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)

【０１２０】［反応液組成］ プラスミドｐＴGDH１２溶液 1μl dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl 10xbuffer(with MgCl) 5μl enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.375μl 超純水 41.725μl

【０１２１】［PCR反応条件］上記組成に反応液が入っ
た容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400に
セットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分
間)-55℃(0.5分間)-72℃（1.5分間）のサイクルを１０
回、次いで97℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-72℃(2.5分
間)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。

【０１２２】その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガ
ロースゲル電気泳動を行った結果、約１０００ｂｐのＤ
ＮＡ断片のバンドが検出された。得られたＰＣＲ反応液
とInvitrogen社製TOPO^TMTA cloningキットVer.Eとを用い
て、ＰＣＲによって得られた約１０００ｂｐのＤＮＡ断
片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入
サイト」にライゲーションし、そのライゲーション液で
E．coli DH5αを形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶
液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこ
に得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロ
ニーのうち白いコロニーを1個とり、このコロニーを５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地
（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０
℃、２４時間）。次いで培養菌体からQIAprepSpin Mini
prep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出し
た。取り出したプラスミドの一部を制限酵素（BamHI）
で消化し、電気泳動することにより、該プラスミドには
約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確
認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐCＧＤ
Ｈ１２と記す。）

【０１２３】（３）酸化型β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有する
タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
る遺伝子を含む組換ベクターの調製（その３：プラスミ
ドpAGDH12の構築） プラスミドｐCＧＤＨ１２を制限酵素（BamHI）で消化さ
せ、酵素消化された約１０００ｂｐＤＮＡ断片を精製し
た。一方、プラスミドベクターｐACYC184（ニッポンジ
ーン社製）を制限酵素（BamHI）により消化させ、酵素
消化されたＤＮＡ断片を精製した。さらに、セルフライ
ゲーションを防ぐため、Alkaline Phospatase（宝酒造
社製）を用いて脱リン酸化処理を行った。

【０１２４】これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られ
たライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コールを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきた
コロニーの中から４コロニーを無作為に選抜した。この
選抜したコロニーをそれぞれ２０μｇ／ｍｌのクロラム
フェニコールを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種
し、試験管中で振盪培養した（３０?、２４時間）。そ
れぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qia
gen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出した
プラスミドのそれぞれの一部を制限酵素（BamHI）によ
り消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドは
に全て前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されてい
ることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミ
ドｐAGDH１２と記す。）

【０１２５】（４）本発明形質転換体の調製及び還元反
応例 プラスミドｐＴＲＰｃおよびpAGDH12を用いてE．
coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．
１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及
び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する滅
菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３
０℃、１８時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌
体０．４ｇを得た。４−ブロモ−３−オキソ酪酸メチル
３００ｍｇ、前記湿菌体０．４ｇ、ＮＡＤＰ ⁺９ｍｇ、
グルコース７５０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）１５ｍｌ及び酢酸ブチル１５ｍｌを混合し、３
０℃で１９時間攪拌した。なお、攪拌中は反応液のｐＨ
が６．５±０．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶
液を徐々に加えた。その後、反応液を遠心分離し、有機
層を得た。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフ
ィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた４−
ブロモ−３−オキソ酪酸メチルの量に対して４−ブロモ
−３−ヒドロキシ酪酸メチルは９８．６％生成している
ことがわかった。また、下記条件で有機層中の４−ブロ
モ−３−ヒドロキシ酪酸メチルの光学純度を測定したと
ころ（Ｓ）体が９６．２％ｅ．ｅ．であった。さらに該
有機層を濃縮することにより、粗（Ｓ）−４−ブロモ−
３−ヒドロキシ酪酸メチルを得る。

【０１２６】

【発明の効果】本発明によれば、（Ｓ）−４−ハロ−３
−ヒドロキシ酪酸エステルを製造するために優れた触媒
能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該タンパ
ク質、及びこれを利用した（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒド
ロキシ酪酸エステルの製造方法等が提供される。

【０１２７】「配列表フリーテキスト」 配列番号８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号１７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー

【０１２８】

【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Co., Ltd <120> Reductase gene and Use thereof <130> P153589 <150> JP 2001/175175 <151> 2001-06-11 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 325 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 1 Met Ser Asn Gly Lys Thr Phe Thr Leu Ser Asn Gly Val Lys Ile Pro 1 5 10 15 Gly Val Gly Phe Gly Thr Phe Ala Ser Glu Gly Ser Lys Gly Glu Thr 20 25 30 Tyr Thr Ala Val Thr Thr Ala Leu Lys Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp 35 40 45 Cys Ala Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Gly Glu Val Gly Glu Gly Ile Arg 50 55 60 Asp Phe Leu Lys Glu Asn Pro Ser Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe Val 65 70 75 80 Cys Thr Lys Val Trp Asn His Leu His Arg Tyr Glu Asp Val Leu Trp 85 90 95 Ser Ile Asp Asp Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Met 100 105 110 Phe Leu Val His Trp Pro Ile Ala Ala Glu Lys Asn Gly Gln Gly Glu 115 120 125 Pro Lys Ile Gly Pro Asp Gly Lys Tyr Val Ile Leu Lys Asp Leu Thr 130 135 140 Glu Asn Pro Glu Pro Thr Trp Arg Ala Met Glu Lys Ile Tyr Glu Asp 145 150 155 160 Arg Lys Ala Arg Ser Ile Gly Val Ser Asn Trp Thr Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Glu Lys Met Ser Lys Phe Ala Lys Val Met Pro His Ala Asn Gln Ile 180 185 190 Glu Ile His Pro Phe Leu Pro Asn Glu Glu Leu Val Gln Tyr Cys Phe 195 200 205 Ser Lys Asn Ile Met Pro Val Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Gln Asn 210 215 220 Gln Val Pro Thr Thr Gly Glu Arg Val Ser Glu Asn Lys Thr Leu Asn 225 230 235 240 Glu Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Thr Leu Ala Gln Val Leu Ile Ala 245 250 255 Trp Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Ser Asn Pro 260 265 270 Lys Arg Ile Glu Ser Asn Phe Lys Ser Ile Glu Leu Ser Asp Ala Asp 275 280 285 Phe Glu Ala Ile Asn Ala Val Ala Lys Gly Arg His Phe Arg Phe Val 290 295 300 Asn Met Lys Asp Thr Phe Gly Tyr Asp Val Trp Pro Glu Glu Thr Ala 305 310 315 320 Lys Asn Leu Ser Ala 325 <210> 2 <211> 978 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)...(978) <400> 2 atg tct aac gga aag act ttc aca ttg agc aac ggc gtc aag att cct 48 Met Ser Asn Gly Lys Thr Phe Thr Leu Ser Asn Gly Val Lys Ile Pro 1 5 10 15 ggc gtc ggc ttt ggt acc ttc gct agt gaa ggt tcc aag ggc gag acc 96 Gly Val Gly Phe Gly Thr Phe Ala Ser Glu Gly Ser Lys Gly Glu Thr 20 25 30 tat act gct gtc acc act gcc ctg aag acc ggt tac cgt cac ttg gac 144 Tyr Thr Ala Val Thr Thr Ala Leu Lys Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp 35 40 45 tgt gcc tgg tac tac ctg aac gag ggt gag gtt ggt gag ggt atc cgt 192 Cys Ala Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Gly Glu Val Gly Glu Gly Ile Arg 50 55 60 gac ttc ctg aag gag aac ccc tcg gtg aag cgt gag gac atc ttc gtc 240 Asp Phe Leu Lys Glu Asn Pro Ser Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe Val 65 70 75 80 tgc acc aag gtg tgg aac cac ctc cac cgt tat gag gac gtc ctc tgg 288 Cys Thr Lys Val Trp Asn His Leu His Arg Tyr Glu Asp Val Leu Trp 85 90 95 tcc att gac gac tcc ctg aag cgt ctt gga ctt gac tac gtt gat atg 336 Ser Ile Asp Asp Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Met 100 105 110 ttc ctc gtt cac tgg ccc att gct gcc gag aag aat ggc cag ggt gag 384 Phe Leu Val His Trp Pro Ile Ala Ala Glu Lys Asn Gly Gln Gly Glu 115 120 125 ccc aag att ggc cct gac ggc aaa tac gtc att ctc aag gac ctg acc 432 Pro Lys Ile Gly Pro Asp Gly Lys Tyr Val Ile Leu Lys Asp Leu Thr 130 135 140 gag aac ccc gag ccc aca tgg cgc gct atg gag aag att tat gag gat 480 Glu Asn Pro Glu Pro Thr Trp Arg Ala Met Glu Lys Ile Tyr Glu Asp 145 150 155 160 cgc aag gcc agg tcc att ggt gtc tcc aac tgg acc att gcc gac ctt 528 Arg Lys Ala Arg Ser Ile Gly Val Ser Asn Trp Thr Ile Ala Asp Leu 165 170 175 gag aag atg tcc aag ttc gcc aag gtc atg cct cac gcc aac cag atc 576 Glu Lys Met Ser Lys Phe Ala Lys Val Met Pro His Ala Asn Gln Ile 180 185 190 gag att cac ccc ttc ctg ccc aac gag gag ctg gtg cag tac tgc ttc 624 Glu Ile His Pro Phe Leu Pro Asn Glu Glu Leu Val Gln Tyr Cys Phe 195 200 205 tcc aag aac att atg ccc gtg gcc tac tct cct ctg ggc tcg cag aac 672 Ser Lys Asn Ile Met Pro Val Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Gln Asn 210 215 220 cag gtt ccc acc acc ggt gag cgg gtc agc gag aac aag act ctg aac 720 Gln Val Pro Thr Thr Gly Glu Arg Val Ser Glu Asn Lys Thr Leu Asn 225 230 235 240 gag atc gcc gag aag ggc ggc aac acc ctt gct cag gtt ctt att gcc 768 Glu Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Thr Leu Ala Gln Val Leu Ile Ala 245 250 255 tgg ggt ctg cgc cgt ggc tac gtc gtt ctc ccc aag agc tcc aac ccc 816 Trp Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Ser Asn Pro 260 265 270 aag cgc att gag tcc aac ttc aag agc att gag ctc tcc gat gcc gac 864 Lys Arg Ile Glu Ser Asn Phe Lys Ser Ile Glu Leu Ser Asp Ala Asp 275 280 285 ttt gaa gcc atc aat gcc gtt gcc aag ggt cgt cac ttc cgt ttc gtc 912 Phe Glu Ala Ile Asn Ala Val Ala Lys Gly Arg His Phe Arg Phe Val 290 295 300 aac atg aag gat act ttc gga tat gat gtc tgg ccc gag gag acc gcc 960 Asn Met Lys Asp Thr Phe Gly Tyr Asp Val Trp Pro Glu Glu Thr Ala 305 310 315 320 aag aac ctg tct gcg tga 978 Lys Asn Leu Ser Ala 325 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 3 Asn Ile Met Pro Val Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Gln Asn Gln Val 1 5 10 15 Pro <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 4 Ile Pro Gly Val Phe Gly Thr Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 5 Ser Ile Glu Leu Ser Asp Ala Asp Phe Glu Ala Ile Asn Ala Val Ala 1 5 10 15 Lys <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 6 Met Ile Gly Val Ala Asn Tyr Thr Ile Ala Asp Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 7 Tyr Glu Asp Val Leu Xaa Xaa Ile Asp Asp Ser Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 8 ggaacytgrt tytggswacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 9 tangcnacng gcataatatt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 10 tangcnacng gcataatgtt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 11 tangcnacng gcatgatatt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 12 tangcnacng gcatgatgtt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 13 tangcnacng gcattatatt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 14 tangcnacng gcattatgtt 20 <210> 15 <211> 697 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 cgctctaaaa ctantggatc ccccgggctg caggaattcg gcggcggcgg atccaacgga 60 aanactttca cactgagcaa cggcgtcaaa attcctggcg tcggctttgg tacctncgct 120 agtgaaggtt ccaagggcga aacctatnct gctgtcacca ctgccctgaa aaccggttac 180 cgtcncttgg actgtgcctg gtactacctg aacaagggtg aggttggtga gggtntccgt 240 gacttcctga aggaaaaccc ctcggtgaag cgtgaggaca tcttcgtctg caccaaggtg 300 tggaaccacc tccaccgtta tgaggacgtc ctctggtcca ttgacnactc cctgaagcgt 360 cttggacttg actacgttga tatgttcctc gttcactggc ccattgctgc cgaaaaaaat 420 ggccagggtg agcccaaaat tggccctgac ggcaaatacn tcnttctcaa ggacctgacc 480 gaaancccna ncccacctgg cgcgctatgg aaaaaatttn tgangatccc aaggccaggt 540 ccattggtgt ttccaattgg accattgccg accttgagaa gatgtccaag ttngccaagg 600 tnatgcctca cgccaaccag atcgagattc accccttcct gcccaacgag gagctggtgc 660 agtactgctt ttccaagaac antatgcccg tagcgta 697 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 16 ggaggtggtt ccacaccttg g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 17 caaccagatc gagattcacc 20 <210> 18 <211> 331 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 18 cgctctaaaa ctantggatc ccccgggctg caggaattcg gcggccgcgg atccttcatc 60 cccatcatgt ctaacggaaa gactttcaca ttgagcaacg gcgtcaagat tcctggcgtc 120 ggctttggta ccttcgctag tgaaggttcc aagggcgaga cctatactgc tgtcaccact 180 gccctgaaga ccggttaccg tcacttggac tgtgcctggt actacctgaa cgagggtgag 240 gttggtgagg gtatccgtga cttcctgaag gagaacccct cggtgaagcg tgaggacatc 300 ttcgtctgca ccaaggtgtg gaaccacctc c 331 <210> 19 <211> 743 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 19 caaccagatc gagattcacc ccttcctgcc caacgaggag ctggtgcagt actgcttctc 60 caagaacatt atgcccgtgg cctactctcc tctgggctcg cagaaccagg ttcccaccac 120 cggtgagcgg gtcagcgaga acaagactct gaacgagatc gccgagaagg gcggcaacac 180 ccttgctcag gttcttattg cctggggtct gcgccgtggc tacgtcgttc tccccaagag 240 ctccaacccc aagcgcattg agtccaactt caagagcatt gagctctccg atgccgactt 300 tgaagccatc aatgccgttg ccaagggtcg tcacttccgt ttcgtcaaca tgaaggatac 360 tttcggatat gatgtctggc ccgaggagac cgccaagaac ctgtctgcgt gaatctctac 420 gaaattataa aatnacaccn acnaaaancc aaagcganag gatgatnccc aaaanttttg 480 agggtttctt ggttgaaaac gtttantgan cccgaantga angaatagat gancntgatt 540 tctccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacggtc cgcggccgct ccnngggggg gcccggttcc 600 caattcnccc cttatnattg aattcttttt taanggggnc aaattccncc nnatttccnt 660 cnanattggn nggccgcctc caaactttcn tcntnaaagg gncccaattc ccccccnatt 720 aantggantt cctntttacc ttt 743 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed origonucleotide primer for PCR <400> 20 ccaaggtgtg gaaccacctc c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed origonucleotide primer for PCR <400> 21 ccagaggaga gtaggccacg g 21 <210> 22 <211> 417 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 22 ccaaggtgtg gaaccacctc caccgttatg aggacgtcct ctggtccatt gacgactccc 60 tgaagcgtct tggacttgac tacgttgata tgttcctcgt tcactggccc attgctgccg 120 agaagaatgg ccagggtgag cccaagattg gccctgacgg caaatacgtc attctcaagg 180 acctgaccga gaaccccgag cccacatggc gcgctatgga gaagatttat gaggatcgca 240 aggccaggtc cattggtgtc tccaactgga ccattgccga ccttgagaag atgtccaagt 300 tcgccaaggt catgcctcac gccaaccaga tcgagattca ccccttcctg cccaacgagg 360 agctggtgca gtactgcttc tccaagaaca ttatgcccgt ggcctactct cctctgg 417 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 23 gccatggcta tgtctaacgg aaagact 27 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 24 cggatccgtt ataatttcgt agagattca 29 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 25 gatcatcata gcaggagtca t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 26 gaattcaaca ccagtcagct c 21 <210> 27 <211> 786 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)...(786) <400> 27 atg tat aaa gat tta gaa gga aaa gta gtt gtc ata aca ggt tca tct 48 Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser 1 5 10 15 acc ggt tta gga aaa gca atg gcg att cgt ttt gcg aca gaa aaa gct 96 Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala 20 25 30 aaa gta gtt gtg aac tat cgt tcg aaa gaa gaa gaa gct aac agc gtt 144 Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Glu Glu Ala Asn Ser Val 35 40 45 tta gaa gaa att aaa aaa gtg ggc gga gag gct att gcc gtc aaa ggt 192 Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly 50 55 60 gat gta aca gtt gag tct gat gtg atc aat tta gtt caa tct gct att 240 Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile 65 70 75 80 aaa gaa ttt gga aag cta gac gtt atg att aat aac gca gga atg gaa 288 Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu 85 90 95 aat ccg gtt tcg tct cat gaa atg tct tta agt gat tgg aat aaa gtc 336 Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val 100 105 110 att gat acg aac tta acg gga gca ttt tta ggc agc cgt gaa gcg att 384 Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 aaa tat ttt gtg gaa aat gat att aag gga aca gtt att aac atg tcg 432 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 agt gtt cac gag aaa att cct tgg cca tta ttt gtt cat tac gca gca 480 Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160 agt aaa ggc gga atg aag ctc atg acc gaa aca ctt gca tta gaa tac 528 Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175 gct cca aaa ggt att cgt gta aat aac att gga ccg gga gcg att aat 576 Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190 aca ccg att aac gct gag aaa ttt gct gat cct gag cag cgt gca gat 624 Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp 195 200 205 gta gaa agc atg att cca atg gga tac att gga gag ccg gaa gaa att 672 Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile 210 215 220 gca gcg gtt gct gca tgg cta gct tct tca gag gca agt tat gta aca 720 Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240 ggg att aca ctc ttt gct gac ggc ggt atg aca cag tac cca tca ttc 768 Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe 245 250 255 caa gca gga cgc gga taa 786 Gln Ala Gly Arg Gly 260 <210> 28 <211> 996 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)...(978) <400> 28 atg tct aac gga aag act ttc aca ttg agc aac ggc gtc aag att cct 48 Met Ser Asn Gly Lys Thr Phe Thr Leu Ser Asn Gly Val Lys Ile Pro 1 5 10 15 ggc gtc ggc ttt ggt acc ttc gct agt gaa ggt tcc aag ggc gag acc 96 Gly Val Gly Phe Gly Thr Phe Ala Ser Glu Gly Ser Lys Gly Glu Thr 20 25 30 tat act gct gtc acc act gcc ctg aag acc ggt tac cgt cac ttg gac 144 Tyr Thr Ala Val Thr Thr Ala Leu Lys Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp 35 40 45 tgt gcc tgg tac tac ctg aac gag ggt gag gtt ggt gag ggt atc cgt 192 Cys Ala Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Gly Glu Val Gly Glu Gly Ile Arg 50 55 60 gac ttc ctg aag gag aac ccc tcg gtg aag cgt gag gac atc ttc gtc 240 Asp Phe Leu Lys Glu Asn Pro Ser Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe Val 65 70 75 80 tgc acc aag gtg tgg aac cac ctc cac cgt tat gag gac gtc ctc tgg 288 Cys Thr Lys Val Trp Asn His Leu His Arg Tyr Glu Asp Val Leu Trp 85 90 95 tcc att gac gac tcc ctg aag cgt ctt gga ctt gac tac gtt gat atg 336 Ser Ile Asp Asp Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Met 100 105 110 ttc ctc gtt cac tgg ccc att gct gcc gag aag aat ggc cag ggt gag 384 Phe Leu Val His Trp Pro Ile Ala Ala Glu Lys Asn Gly Gln Gly Glu 115 120 125 ccc aag att ggc cct gac ggc aaa tac gtc att ctc aag gac ctg acc 432 Pro Lys Ile Gly Pro Asp Gly Lys Tyr Val Ile Leu Lys Asp Leu Thr 130 135 140 gag aac ccc gag ccc aca tgg cgc gct atg gag aag att tat gag gat 480 Glu Asn Pro Glu Pro Thr Trp Arg Ala Met Glu Lys Ile Tyr Glu Asp 145 150 155 160 cgc aag gcc agg tcc att ggt gtc tcc aac tgg acc att gcc gac ctt 528 Arg Lys Ala Arg Ser Ile Gly Val Ser Asn Trp Thr Ile Ala Asp Leu 165 170 175 gag aag atg tcc aag ttc gcc aag gtc atg cct cac gcc aac cag atc 576 Glu Lys Met Ser Lys Phe Ala Lys Val Met Pro His Ala Asn Gln Ile 180 185 190 gag att cac ccc ttc ctg ccc aac gag gag ctg gtg cag tac tgc ttc 624 Glu Ile His Pro Phe Leu Pro Asn Glu Glu Leu Val Gln Tyr Cys Phe 195 200 205 tcc aag aac att atg ccc gtg gcc tac tct cct ctg ggc tcg cag aac 672 Ser Lys Asn Ile Met Pro Val Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Gln Asn 210 215 220 cag gtt ccc acc acc ggt gag cgg gtc agc gag aac aag act ctg aac 720 Gln Val Pro Thr Thr Gly Glu Arg Val Ser Glu Asn Lys Thr Leu Asn 225 230 235 240 gag atc gcc gag aag ggc ggc aac acc ctt gct cag gtt ctt att gcc 768 Glu Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Thr Leu Ala Gln Val Leu Ile Ala 245 250 255 tgg ggt ctg cgc cgt ggc tac gtc gtt ctc ccc aag agc tcc aac ccc 816 Trp Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Ser Asn Pro 260 265 270 aag cgc att gag tcc aac ttc aag agc att gag ctc tcc gat gcc gac 864 Lys Arg Ile Glu Ser Asn Phe Lys Ser Ile Glu Leu Ser Asp Ala Asp 275 280 285 ttt gaa gcc atc aat gcc gtt gcc aag ggt cgt cac ttc cgt ttc gtc 912 Phe Glu Ala Ile Asn Ala Val Ala Lys Gly Arg His Phe Arg Phe Val 290 295 300 aac atg aag gat act ttc gga tat gat gtc tgg ccc gag gag acc gcc 960 Asn Met Lys Asp Thr Phe Gly Tyr Asp Val Trp Pro Glu Glu Thr Ala 305 310 315 320 aag aac ctg tct gcg tga atctctacga aattataa 996 Lys Asn Leu Ser Ala 325 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 29 cggatccgtt cacgcagaca ggttcttgg 29 <210> 30 <211> 978 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220> <221> CDS <222> (1)...(978) <400> 30 atg tct aac gga aag act ttc aca ttg agc aac ggc gtc aag att cct 48 Met Ser Asn Gly Lys Thr Phe Thr Leu Ser Asn Gly Val Lys Ile Pro 1 5 10 15 ggc gtc ggc ttt ggt acc ttc gct agt gaa ggt tcc aag ggc gag acc 96 Gly Val Gly Phe Gly Thr Phe Ala Ser Glu Gly Ser Lys Gly Glu Thr 20 25 30 tat act gct gtc acc act gcc ctg aag acc ggt tac cgt cac ttg gac 144 Tyr Thr Ala Val Thr Thr Ala Leu Lys Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp 35 40 45 tgt gcc tgg tac tac ctg aac gag ggt gag gtt ggt gag ggt atc cgt 192 Cys Ala Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Gly Glu Val Gly Glu Gly Ile Arg 50 55 60 gac ttc ctg aag gag aac ccc tcg gtg aag cgt gag gac atc ttc gtc 240 Asp Phe Leu Lys Glu Asn Pro Ser Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe Val 65 70 75 80 tgc acc aag gtg tgg aac cac ctc cac cgt tat gag gac gtc ctc tgg 288 Cys Thr Lys Val Trp Asn His Leu His Arg Tyr Glu Asp Val Leu Trp 85 90 95 tcc att gac gac tcc ctg aag cgt ctt gga ctt gac tac gtt gat atg 336 Ser Ile Asp Asp Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Met 100 105 110 ttc ctc gtt cac tgg ccc att gct gcc gag aag aat ggc cag ggt gag 384 Phe Leu Val His Trp Pro Ile Ala Ala Glu Lys Asn Gly Gln Gly Glu 115 120 125 ccc aag att ggc cct gac ggc aaa tac gtc att ctc aag gac ctg acc 432 Pro Lys Ile Gly Pro Asp Gly Lys Tyr Val Ile Leu Lys Asp Leu Thr 130 135 140 gag aac ccc gag ccc aca tgg cgc gct atg gag aag att tat gag gat 480 Glu Asn Pro Glu Pro Thr Trp Arg Ala Met Glu Lys Ile Tyr Glu Asp 145 150 155 160 cgc aag gcc agg tcc att ggt gtc tcc aac tgg acc att gcc gac ctt 528 Arg Lys Ala Arg Ser Ile Gly Val Ser Asn Trp Thr Ile Ala Asp Leu 165 170 175 gag aag atg tcc aag ttc gcc aag gtc atg cct cac gcc aac cag atc 576 Glu Lys Met Ser Lys Phe Ala Lys Val Met Pro His Ala Asn Gln Ile 180 185 190 gag att cac ccc ttc ctg ccc aac gag gag ctg gtg cag tac tgc ttc 624 Glu Ile His Pro Phe Leu Pro Asn Glu Glu Leu Val Gln Tyr Cys Phe 195 200 205 tcc aag aac att atg ccc gtg gcc tac tct cct ctg ggc tcg cag aac 672 Ser Lys Asn Ile Met Pro Val Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Gln Asn 210 215 220 cag gtt ccc acc acc ggt gag cgg gtc agc gag aac aag act ctg aac 720 Gln Val Pro Thr Thr Gly Glu Arg Val Ser Glu Asn Lys Thr Leu Asn 225 230 235 240 gag atc gcc gag aag ggc ggc aac acc ctt gct cag gtt ctt att gcc 768 Glu Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Thr Leu Ala Gln Val Leu Ile Ala 245 250 255 tgg ggt ctg cgc cgt ggc tac gtc gtt ctc ccc aag agc tcc aac ccc 816 Trp Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Ser Asn Pro 260 265 270 aag cgc att gag tcc aac ttc aag agc att gag ctc tcc gat gcc gac 864 Lys Arg Ile Glu Ser Asn Phe Lys Ser Ile Glu Leu Ser Asp Ala Asp 275 280 285 ttt gaa gcc atc aat gcc gtt gcc aag ggt cgt cac ttc cgt ttc gtc 912 Phe Glu Ala Ile Asn Ala Val Ala Lys Gly Arg His Phe Arg Phe Val 290 295 300 aac atg aag gat act ttc gga tat gat gtc tgg ccc gag gag acc gcc 960 Asn Met Lys Asp Thr Phe Gly Tyr Asp Val Trp Pro Glu Glu Thr Ala 305 310 315 320 aag aac ctg tct gcg tga 978 Lys Asn Leu Ser Ala 325 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 31 gccatggcta tgtataaaga tttagaa 27 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 32 cggatccgtt atccgcgtcc tgc 23 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 33 cggatccgag cgcccaatac gcaaaccg 28

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/62 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 EA04 GA11 GA27 HA08 4B050 CC01 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AD64 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CB16 CB18 CD09 DA01 DA20 4B065 AA17Y AA26X AA58X AA67Y AA87X AB01 AC20 BA02 BA23 BB15 CA12 CA28 CA60

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の塩基配列のいずれかを有することを
   特徴とする遺伝子。 ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
   基配列。 ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
   基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
   イブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、４
   −ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
   −４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
   産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード
   する塩基配列。 ｃ）配列番号２で示される塩基配列。
2. 【請求項２】宿主細胞内において機能可能なプロモータ
   ーと請求項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続され
   てなることを特徴とする遺伝子。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載の遺伝子を含むことを
   特徴とする組換ベクター。
4. 【請求項４】請求項２記載の遺伝子又は請求項３記載の
   組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴と
   する形質転換体。
5. 【請求項５】宿主細胞が微生物であることを特徴とする
   請求項４記載の形質転換体。
6. 【請求項６】宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする
   請求項４記載の形質転換体。
7. 【請求項７】請求項１記載の遺伝子を保有することを特
   徴とする形質転換体。
8. 【請求項８】請求項３記載の組換ベクターを宿主細胞に
   導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造
   方法。
9. 【請求項９】下記のアミノ酸配列のいずれかを有するこ
   とを特徴とするタンパク質。 ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。 ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの
   塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、４
   −ブロモ−３−オキソ酪酸メチルを不斉還元して（Ｓ）
   −４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルを優先的に生
   産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若し
   くは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列であって、かつ、４−ブロモ−３−オキソ酪
   酸メチルを不斉還元して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒド
   ロキシ酪酸メチルを優先的に生産する能力を有するタン
   パク質のアミノ酸配列。
10. 【請求項１０】４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに請
    求項９記載のタンパク質、それを産生する形質転換体又
    はその処理物を作用させることを特徴とする（Ｓ）−４
    −ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
11. 【請求項１１】請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に
    変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコー
    ドする塩基配列を有する遺伝子を含むことを特徴とする
    組換ベクター。
12. 【請求項１２】酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタン
    パク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする
    請求項１１記載の組換ベクター。
13. 【請求項１３】請求項１１又は１２記載の組換ベクター
    が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換
    体。
14. 【請求項１４】宿主細胞が微生物であることを特徴とす
    る請求項１３記載の形質転換体。
15. 【請求項１５】宿主細胞が大腸菌であることを特徴とす
    る請求項１３記載の形質転換体。
16. 【請求項１６】請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に
    変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコー
    ドする塩基配列を有する遺伝子を保有することを特徴と
    する形質転換体。
17. 【請求項１７】酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタン
    パク質を反応系内に共存させること特徴とする請求項１
    ０記載の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステ
    ルの製造方法。
18. 【請求項１８】酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタン
    パク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする
    請求項１７記載の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪
    酸エステルの製造法。
19. 【請求項１９】４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに請
    求項１３〜１５記載の形質転換体又はその処理物を作用
    させることを特徴とする（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロ
    キシ酪酸エステルの製造方法。
20. 【請求項２０】４−ハロ−３−オキソ酪酸エステルに請
    求項１６記載の形質転換体又はその処理物を作用させる
    ことを特徴とする（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪
    酸エステルの製造方法。