JPH0853500A

JPH0853500A - 融合タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH0853500A
Application number: JP6209368A
Authority: JP
Inventors: Hideki Higashida; 英毅東田; Kimiko Murakami; 喜美子村上; Yuko Hama; 祐子浜; Yoko Tsukamoto; 洋子塚本; Atsushi Isoai; 敦礒合; Hiromichi Kumagai; 博道熊谷
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 1996-02-27

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト血清アルブミンタンパク質の立体構造を
破壊することなく、しかも生理活性を十分に発揮し得る
生理活性を有する融合タンパク質を遺伝子工学的に作製
し、提供する。【構成】ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖の少な
くとも１つ以上の所望の位置に、望ましくは、アミノ末
端、カルボキシル末端、第１〜２ドメイン間あるいは第
２〜３ドメイン間に、生理活性を有するペプチドを導入
した融合タンパク質およびこれをコードする遺伝子、並
びに、該遺伝子を用いて上記融合タンパク質を遺伝子組
換え手法によって製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生理活性、特には癌転
移阻害活性を有する融合タンパク質およびこれをコード
する遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組
換えベクターによって形質転換された宿主細胞の形質転
換体並びに該形質転換体を用いる融合タンパク質の製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌の治療には主として外科的療法、放射
線療法および化学療法が行われているが、癌の再発や転
移の防止という点ではいまだ満足すべき治療効果が挙げ
られていない。

【０００３】現在用いられている多くの制癌剤は、核酸
あるいはタンパク質の生合成系を阻害し、癌細胞を死に
至らしめるものである。しかしながらこれらの制癌剤で
は、癌細胞と正常細胞との区別が困難なため、その効果
には、特に副作用の面で大きな問題が内在している。ま
たこれらの制癌剤は原発巣を縮小させることによって治
療するものであるが、癌の治療で常に問題になるのは癌
細胞が原発巣から離れ、他の臓器に転移し、そこで増殖
し致命的な結果を招くことである。したがって癌の根本
的治療のためには、癌細胞の増殖抑制とともに、転移に
対して有効な抑制効果を示す制癌剤の開発が望まれてい
る。

【０００４】癌転移の機構の解明には多くの研究がなさ
れ、転移の抑制に関する物質の検索も広く行なわれてき
た。癌細胞は原発巣から遊離した後、血管中に侵入す
る。そして血管壁に接着後、血管内皮細胞層の下に潜り
込み細胞外基質を破壊し、標的臓器の実質中に浸潤侵入
する。このような各ステップを経て癌細胞は他の臓器に
転移すると考えられている（L.A. Liotta et al.: Lab.
Invest., 49, 636-649(1983)）。よって癌転移阻害剤
開発のためには、上記の各ステップのいずれかを抑制す
るものが開発されればよいと考えられる。例えば、癌細
胞が細胞外基質と接着するのを阻害するもの（例えば、
N.J. Humphries et al.: Science, 223, 467-470 (198
6) ）、中皮細胞層や血管内皮細胞層などの下層への浸
潤を阻害する物質（例えば、A. Isoai et al.: Jpn. J.
Cancer Res., 81, 909-914 (1990)）、細胞外基質の分
解を阻害する物質（例えば、R.M. Schultz et al.: Can
cer Res., 48, 5539-5545 (1988)）等が挙げられる。

【０００５】本発明者らは従前に、癌転移阻害活性を有
するペプチドと生体高分子との複合体を化学的結合法に
より作製している。すなわち、配列表の配列番号１のア
ミノ酸で表される癌阻害活性を有するペプチド（特開平
３−３４９９３号公報、A. Isoai et al.: Jpn. J. Can
cer Res., 81, 909-914 (1990) および A. Isoai eta
l.: Cancer Res., 52, 1422-1426 (1992) ）と、血清ア
ルブミンなどの生体高分子とを水溶性カルボジイミドで
結合させた形態において、優れた癌細胞浸潤阻害活性並
びに癌転移抑制活性をもつということを確認している
（特開平４−２５４０００号、同４−３００８９９号、
同４−３００９００号公報および Biochem. Biophys. R
es. Commun., 192, 7ー14 (1993) ）。

【０００６】このように有用な癌転移阻害活性を有する
複合体（融合タンパク質）は、通常化学的タンパク質結
合法によって作製される。しかしながらその方法はステ
ップ数が多く、また不純物である不完全合成産物の分離
を行なわなければならない。通常これらの方法は煩雑で
あり、また効率よく大量生産することが難しく、特に６
０９アミノ酸残基を有する該融合タンパク質では、従来
の化学的タンパク質−ペプチド結合法によることは、コ
スト的にも設備的にも必ずしも満足できるものではなか
った。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる事情に
鑑みてなされたもので、生理活性を有するペプチド、と
りわけ配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド
（癌転移阻害ペプチド）と血清アルブミン等の生体高分
子との複合体（癌転移阻害融合タンパク質）を、従来の
化学的タンパク質−ペプチド結合法に代えて、遺伝子組
換え技術を用いて、より効率的な遺伝子発現並びに癌転
移阻害融合タンパク質の生産をなし得るための技術を提
供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ね、遺伝子組換え技術を用
いて生理活性を有する融合タンパク質を生産する新規な
系を創出し、該融合タンパク質を生産することに成功し
た。具体的には、生理活性を有する融合タンパク質をコ
ードする遺伝子を設計、作製し、すでに確立されている
異種タンパク質生産用のベクターに該遺伝子を組み込
み、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質
転換体を作製することにより、生理活性を有する融合タ
ンパク質の生産を達成し得るというものである。

【０００９】すなわち本発明によれば、ヒト血清アルブ
ミンのポリペプチド鎖の少なくとも１つ以上の所望の位
置に生理活性を有するペプチドを導入してなる融合タン
パク質が提供される。

【００１０】ここで、上記生理活性を有するペプチドの
導入位置は、ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のア
ミノ末端、カルボキシル末端、第１〜２ドメイン間ある
いは第２〜３ドメイン間のうちのいずれか１箇所若しく
はこれらの任意の組み合わせの位置であるのが好まし
い。

【００１１】また本発明によれば、上記融合タンパク質
をコードする遺伝子が提供される。また本発明によれ
ば、上記遺伝子を含有する組換えベクターが提供され
る。

【００１２】また本発明によれば、上記組換えベクター
で宿主細胞を形質転換してなる、融合タンパク質を産生
し得る形質転換体が提供される。

【００１３】さらに本発明によれば、上記形質転換体を
培養し、培養物中に産生された融合タンパク質を単離
し、所望により精製することからなる該融合タンパク質
の製造方法が提供される。

【００１４】以下、本発明について詳述する。なお「生
理活性を有するペプチド」については、便宜上、癌転移
阻害活性を有するペプチド（癌転移阻害ペプチド）で代
表させて説明する。

【００１５】上述したように、配列番号１のアミノ酸配
列で表されるペプチド（癌転移阻害ペプチド）と血清ア
ルブミン等の生体高分子との結合体（複合体）が優れた
癌転移阻害活性をもつということが本発明者らによりす
でに確認されている。しかしながら、上記複合体は化学
的タンパク質結合法により作製されたものであり、また
上記癌転移阻害ペプチドと血清アルブミンとの両者の結
合関係は、水溶性カルボジイミドで結合された状態であ
るということ以外、明確でない。

【００１６】本発明者らは、ヒト血清アルブミンタンパ
ク質のポリペプチド鎖の所定の位置に癌転移阻害ペプチ
ドを導入することによって、ヒト血清アルブミンのタン
パク質立体構造を破壊することなくしかも癌転移阻害活
性を十分に発揮し得る癌転移阻害融合タンパク質を遺伝
子工学的に作製することに成功した。

【００１７】具体的には、まずヒト血清アルブミンをコ
ードする遺伝子と、癌転移阻害ペプチドをコードする遺
伝子をそれぞれ作製し、前者のポリペプチド鎖の所定の
位置に後者を導入し結合させて、癌転移阻害融合タンパ
ク質をコードする遺伝子を作製する。

【００１８】ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子
は、好ましくは癌転移阻害ペプチド遺伝子を導入するの
に適するように改変したものが用いるのがよい。この改
変ヒト血清アルブミン遺伝子の作製のために用いる天然
のヒト血清アルブミン遺伝子は、例えば、ヒト肝臓ｃＤ
ＮＡライブラリーよりプラスミドｐＩＬＭＡＬＢ５（国
立予防衛生研究所遺伝子バンク）の制限酵素ＰｖｕＩＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプローブとしてクローニングす
ること等により得ることができる。なお、ヒト血清アル
ブミン遺伝子には、そのアミノ酸配列が互いに若干異な
っているという多型が報告されており、上記の方法でク
ローニングしたヒト血清アルブミン遺伝子もその範疇に
入るものである。本発明における「ヒト血清アルブミ
ン」とは、これらすべての多型のものを含み得る。

【００１９】改変の対象部位である癌転移阻害ペプチド
遺伝子導入部位は、ヒト血清アルブミンのポリペプチド
鎖中の任意の位置に設定することが可能であるが、活性
を十分に発揮させ得ることを考慮すると、タンパク質の
表面に位置しており、かつ立体構造を破壊することのな
い位置であることが好ましい。例えば、アミノ末端（Ｎ
末端）あるいはカルボキシル末端（Ｃ末端）など、ヒト
血清アルブミンの立体構造の形成に影響を及ぼさないと
考えられる位置が望ましい。また、ヒト血清アルブミン
の立体構造はＸ線結晶解析よって詳細に検討されており
（Xiao, M,H.,and Carter, D.C. Nature, 358:209-215,
1992 ）、３個あるドメインの間、すなわち第１〜２ド
メイン間あるいは第２〜３ドメイン間も、導入部位の候
補となり得る。導入する癌転移阻害ペプチドの個数は、
必要に応じて、単一の位置、ないしは複数の位置に、単
数あるいは複数個導入し得る。

【００２０】ヒト血清アルブミン遺伝子の改変は、例え
ば上記癌転移阻害ペプチド遺伝子導入位置に、制限酵素
切断部位を導入することなどによって行われる。導入す
る制限酵素切断部位は、既知の制限酵素によって認識さ
れるものであればよい。望ましくは、ヒト血清アルブミ
ン中にほとんど存在しない切断部位であり、かつ切断酵
素が容易に入手できるものが望ましい。また、当然天然
のアミノ酸配列を一切変更しないことと同時に、塩基配
列もできるだけ変更しないことが望ましい。以上の点を
鑑みて、アミノ末端およびカルボキシル末端に制限酵素
ＡｆｌＩＩＩ切断部位を、第１〜２ドメイン間に制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、第２〜３ドメイン間に制
限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位をそれぞれ導入するのが最も
好ましい。なお、制限酵素切断部位導入法としては、当
業分野で常用されているＰＣＲ法等が好適に用いられ
る。

【００２１】そして、癌転移阻害ペプチド遺伝子の導入
の際には、上記制限酵素切断部位を各制限酵素にて切断
し、ここに同様に制限酵素で消化して末端調節を行った
癌転移阻害ペプチド遺伝子を組み込むことによって、癌
転移阻害融合タンパク質をコードする遺伝子を作製す
る。

【００２２】なお、上記の癌転移阻害ペプチド遺伝子の
塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプ
チドをコードするものであり、理論的には幾通りもの数
多くの配列が考えられ得るが、望ましくは遺伝子組換え
に用いる宿主細胞のコドン使用頻度に合わせたものがよ
く、最も多頻度で使用されるコドンを用いて設計するの
がよい。

【００２３】ここで、用いる宿主細胞としては特に限定
されるものではないが、望ましくは培養方法が容易で、
低コストで培養できる微生物がよく、例えば大腸菌（Es
cherichia coli）、各種酵母類、枯草菌、糸状菌等、当
業分野で常用されている宿主細胞等が挙げられる。原核
生物を宿主細胞として用いる形質転換方法では必ずしも
全てのポリペプチドに対して有効ではなく、真核生物由
来のタンパク質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同
じ立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。ま
た特有のエンドトキシンが存在する場合は、最終製品の
夾雑物になる可能性があり、好ましくない。このため好
ましくは、エンドトキシンを含まず、培養方法も確立し
ており、従来より醗酵並びに食品工業で用いられてお
り、人体に関する安全性も確立されている各種酵母類が
よい。このなかでも特に、遺伝学的並びに分子生物学的
に動物細胞に近い性質をもつとされ、より天然体に近い
遺伝子産物が得られることが期待される分裂酵母シゾサ
ッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）
が最も好ましい。このシゾサッカロミセス・ポンベの菌
株としては、例えば寄託番号ＡＴＣＣ３８３９９（leu-
32h^-）やＡＴＣＣ３８４３６（ura4-294h^-）等としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に寄託されているものが挙げられ、入手可能であ
る。

【００２４】したがって本発明においては、配列番号１
で表される癌転移阻害ペプチドをコードする遺伝子は、
シゾサッカロミセズ・ポンベでの高発現に至適なコドン
を用いて設計し、合成したものであるのが好ましい。シ
ゾサッカロミセス・ポンベの最適コドン使用頻度は、例
えば A. Nasim et al.: Molecular Biology of theFis
sion Yeast, p.263, Academic Press (1983) 等から知
ることができる。本発明者らは種々研究を重ねた結果、
配列番号２５の塩基配列で表される遺伝子が最も好適で
あるとの結論を得、設計、合成した（ただし、配列番号
２５の塩基配列は、翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）および
翻訳終了シグナル（ＴＡＡ）を付加している）。なお、
遺伝子の作製（合成）は、トリエステル法（Nuc. Acid.
Res. 10, p.6553,(1982) ）やホスホアミダイト法（Te
trahedron Letters 22, p.1859,(1981) ）などの種々の
方法がすでに開発されており、いずれの方法を用いても
よい。またＤＮＡ合成機器（ＤＮＡシンセサイザー）等
が市販されているので、それらを用いてもよい。

【００２５】次に、上記のようにして作製した新規の癌
転移阻害融合タンパク質遺伝子をベクターに組み込んで
組換えベクターを作製する。用いるベクターは特に限定
されるものではないが、宿主細胞内で自律的に複製可能
であって、癌転移阻害融合タンパク質合成遺伝子を組み
込み得る挿入部位をもち、さらにこの組み込んだ合成遺
伝子を宿主細胞内で発現せしめることを可能とする領域
を有する必要がある。このようなベクターとして、例え
ば本発明者らがすでに創出に成功しているシゾサッカロ
ミセズ・ポンベを宿主とする外来遺伝子発現ベクターｐ
ＴＬ２Ｍ（特願平５−２４９３１０号明細書）等を有利
に用いることができ、これらのベクターに上記合成遺伝
子を容易に組み込み得る。

【００２６】次いで上記組換えベクターを宿主細胞内に
導入し、形質転換体を得る。組換えベクターの宿主細胞
内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法によ
り行うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラス
ト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーショ
ン法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合
法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙げられる
が、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得
る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場合は、
例えば酢酸リチウム法（K. Okazaki et al., Nucleic A
cids Res., 18, 6485-6489(1990)）等によって効率よく
形質転換体を得ることができる。

【００２７】このようにして得られた形質転換体を培養
することにより、培養物中に癌転移阻害融合タンパク質
が産生される。これを公知の方法で単離し、場合により
精製することにより、目的とする癌転移阻害融合タンパ
ク質が得られる。

【００２８】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地などの栄養培地（M. D. Rose et al.,
"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor L
abolatory Press(1990)r）や、ＭＢ培地などの最少培地
（K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-
6489(1990)）等を用いることができる。形質転換体の培
養は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、
８〜１６８時間、好ましくは２４〜７２時間行う。振盪
培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて
攪拌や通気を加えてもよい。

【００２９】培養物中に産生した融合タンパク質の単離
・精製法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶
解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電
気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィ
ニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用す
る方法、逆相高速液体フロマトグラフィー等の疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を
利用する方法等が挙げられる。

【００３０】単離・精製した融合タンパク質の確認方法
としては、公知のウエスタンブロッティング法や活性測
定法等が挙げられる。また、精製された融合タンパク質
は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析など
によりその構造を明らかにすることができる。

【００３１】なお、本明細書中、配列表の配列番号２の
アミノ酸配列で表される融合タンパク質は、ヒト血清ア
ルブミンのポリペプチド鎖のＮ末端に配列番号１の癌転
移阻害ペプチドを導入したものであり；配列番号４のア
ミノ酸配列で表される融合タンパク質は、ヒト血清アル
ブミンのポリペプチド鎖の第１〜２ドメイン間に配列番
号１の癌転移阻害ペプチドを導入したものであり；配列
番号６のアミノ酸配列で表される融合タンパク質は、ヒ
ト血清アルブミンのポリペプチド鎖の第２〜３ドメイン
間に配列番号１の癌転移阻害ペプチドを導入したもので
あり；配列番号８のアミノ酸配列で表される融合タンパ
ク質は、ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のカルボ
キシル末端に配列番号１の癌転移阻害ペプチドを導入し
たものである。配列番号３、５、７および９の塩基配列
は、それぞれ、配列番号２、４、６および８の各アミノ
酸配列で表される癌転移阻害融合タンパク質をコードす
る遺伝子である。

【００３２】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技
術範囲が限定されるものではない。また実施例中の各操
作については、特に記載したもの以外は、当業分野で常
用されている方法（例えばJ. Sambrook et al.: Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York, USA, 1989.）に従った。

【００３３】［実施例１］癌転移阻害ペプチドをコード
する配列番号２５の塩基配列で表される遺伝子の作製配列番号１のアミノ酸配列をもとに、シゾサッカロミセ
ス・ポンベのコドン使用頻度（Nasim, A. et al: Molec
ular Biology of the Fission Yeast, Academic Press,
1989, p263.）に合せて、配列番号１０および１１の塩
基配列で表される２本の一本鎖オリゴＤＮＡを、ＤＮＡ
自動合成装置（Applied Biosystems）を用いて合成し
た。なお、配列番号１０の塩基配列は、５’末端に制限
酵素ＢａｍＨＩへの挿入部位と開始コドンＡＴＧを、
３’末端に終始コドンＴＡＡと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
への挿入部位を導入した遺伝子のセンス鎖であり、配列
番号１１の塩基配列はそのアンチセンス鎖である。脱保
護、精製後、これら２本を７０℃でアニーリングした。

【００３４】一方、これとは別にプラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造（株）製）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）で
二重消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱による精
製の後、アガロースゲル電気泳動し、約２６００塩基対
に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰ（旭硝子
（株）製）を用いたガラスビーズ法で精製した。

【００３５】これら両者の断片を、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションし
た。これを大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）に導
入して形質転換した後、アンピシリン耐性を持ち、かつ
X-gal プレート上で白コロニーを提示するポジティブ
クローンをスクリーニングし、目的のプラスミドすなわ
ち制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化時
に約７０塩基対の切断断片を示すｐＩ２Ａを得た。アル
カリ−ＳＤＳ法に従ってｐＩ２Ａを大量調製し、制限酵
素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番号２
５の塩基配列を持ったプラスミドであることを確認し
た。

【００３６】［実施例２］配列番号３の癌転移阻害融合
タンパク質遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ−
１０００の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１３の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩ（宝酒造（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩによっ
て末端調節（部分消化）を行なった。フェノール抽出、
エタノール沈澱による精製の後、アガロースゲル電気泳
動し、約１８００塩基対に相当するバンドを切出し、Ｄ
ＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入
断片とした。

【００３７】さらにこれとは別に、シゾサッカロミセス
・ポンベ発現ベクターｐＴＬ２Ｍを用意した。このベク
ターｐＴＬ２Ｍは、本願発明者らがすでに構築したもの
である（特願平５−２４９３１０号明細書）。以下にそ
の作製方法を述べる。

【００３８】［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］まず、公知
の方法で調製されたｐｃＤ４ＣＡＴをＢａｍＨＩで切断
し、ＣＡＴ遺伝子を除去後ライゲーションし、ｐｃＤ４
を作製した。ｐｃＤ４をＢａｍＨＩで部分切断し、平滑
末端化した後ライゲーションしてｐｃＤ４Ｂを作製した
（特開平５−１５３８０号公報）。

【００３９】このプラスミドｐｃＤ４Ｂを制限酵素Ｓａ
ｃＩで消化後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さらに
アガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によって約
４５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００４０】一方、これとは別に、ヒト線維芽細胞由来
の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリー（ｐｃＤベクタ
ー）を公知の方法により調製した。さらに、既に知られ
ているヒトリポコルチンＩの遺伝子配列（Nature, 320,
77,(1986)）のうち、タンパク質のＮ末端側アミノ酸配
列をコードする５０塩基の遺伝子配列をＤＮＡプローブ
として上述のライブラリーからリポコルチンＩの遺伝子
をコロニーハイブリダイゼーション法により取得し、塩
基配列を決定することにより、リポコルチンＩタンパク
質全長をコードするものであることを確認した。取得し
たクローンをｐｃＤｌｉｐｏＩと名づけた。（特開平５
−１５３８０号公報）。そしてこのヒトリポコルチンＩ
遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃＤｌｉｐｏＩを
制限酵素ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さ
らにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によっ
て約１３００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００４１】両ＤＮＡをライゲーションした後、これを
大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入して形質転換
した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的
とするベクターｐＲＬ２Ｌ（図５）を持った形質転換体
をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限
酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認し
た。

【００４２】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後、アガロース
ゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバンド
を切り出し、ガラスビーズ法で精製した。これとは別
に、公知のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り約６０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから
抽出精製した。

【００４３】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＲ
Ｌ２Ｍ（図６）をスクリーニングした。部分塩基配列の
確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであ
ることを確認した。

【００４４】［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］上記ｐＲＬ
２Ｍを鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-
TTGACTAGTTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌ
クレオチド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-
3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用
いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐ
ｅＩおよびＥｃｏＲＩで末端調節し、フェノール抽出、
エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約
６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。

【００４５】一方、これとは別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵
素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約４５００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベ
クターｐＴＬ２Ｍ（図７）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。

【００４６】このようにして作製したｐＴＬ２Ｍを制限
酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、
約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４７】そして上記挿入断片とこの発現ベクターｐ
ＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計２本
を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーショ
ンした。これを大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導
入して形質転換した後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍ
ａを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍａ
を大量調製し、制限酵素地図の作製および塩基配列決定
によって、目的の配列を持ったプラスミドであることを
確認した。

【００４８】さらに実施例１で作製したｐＩ２Ａを鋳型
として、配列番号１９および２０の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＡｆｌＩＩＩによって末端調節を行なった。
フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、アク
リルアミドゲル電気泳動により約７０塩基対に相当する
バンドを切出し、ゲルから溶出して遺伝子断片とした。

【００４９】この遺伝子断片と上記ｐＴＬ２Ｂｍａの制
限酵素ＮｃｏＩ消化物（部分消化後、約７０００塩基対
に相当するバンドをＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いて精製）と
の計２本を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライ
ゲーションした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質
転換した後、目的のプラスミドｐＴＬ２ＢｍＩ−１００
０を得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２ＢｍＩ
−１０００を大量調製し、制限酵素地図の作製および塩
基配列決定によって、配列番号３の塩基配列を持ったプ
ラスミドであることを確認した。

【００５０】［実施例３］配列番号５の癌転移阻害融合
タンパク質遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ−
０１００の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１４の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を行なっ
た。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、
アガロースゲル電気泳動し、約５５０塩基対に相当する
バンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビー
ズ法で精製し、挿入断片１とした。

【００５１】一方、これとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型
として、配列番号１５および１３の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を行なった。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱による精製の後、アガロース
ゲル電気泳動し、約１３５０塩基対に相当するバンドを
切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精
製し、挿入断片２とした。

【００５２】さらにこれとは別に、実施例２の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセズ・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００５３】そして上記挿入断片２本とこの発現ベクタ
ーｐＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計３
本を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーシ
ョンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換し
た後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｂを得た。アルカ
リ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｂを大量調製し、制
限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、目的の
塩基配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００５４】さらに実施例１で作製したｐＩ２Ａを鋳型
として、配列番号２１および２２の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩによって末端調節を行なった。フェノール抽
出、エタノール沈澱による精製の後、アクリルアミドゲ
ル電気泳動により約７０塩基対に相当するバンドを切出
し、ゲルから溶出して遺伝子断片とした。

【００５５】この遺伝子断片と上記ｐＴＬ２Ｂｍｂの制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化物（部分消化後、約７０００
塩基対に相当するバンドをＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いて精
製）との計２本を、ＤＮＡライゲーションキットを用い
てライゲーションした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入し
て形質転換した後、目的のプラスミドｐＴＬ２ＢｍＩ−
０１００を得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２
ＢｍＩ−０１００を大量調製し、制限酵素地図の作製お
よび塩基配列決定によって、配列番号５の塩基配列を持
ったプラスミドであることを確認した。

【００５６】［実施例４］配列番号７の癌転移阻害融合
タンパク質遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ−
００１０の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１６の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）によって末
端調節を行なった。フェノール抽出、エタノール沈澱に
よる精製の後、アガロースゲル電気泳動し、約１１００
塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを
用いたガラスビーズ法で精製し、挿入断片１とした。

【００５７】一方、これとは別に、同じｃＤＮＡを鋳型
として、配列番号１７および１３の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって末端調節を
行なった。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製
の後、アガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対に相
当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラ
スビーズ法で精製し、挿入断片２とした。

【００５８】さらにこれとは別に、実施例２の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセズ・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００５９】そして上記挿入断片２本とこの発現ベクタ
ーｐＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計３
本を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーシ
ョンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換し
た後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｃを得た。アルカ
リ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｂを大量調製し、制
限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、目的の
塩基配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００６０】さらに実施例１で作製したｐＩ２Ａを鋳型
として、配列番号２３および２４の塩基配列で表される
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによって末端調節を行なった。フェノール抽出、
エタノール沈澱による精製の後、アクリルアミドゲル電
気泳動により約７０塩基対に相当するバンドを切出し、
ゲルから溶出して遺伝子断片とした。

【００６１】この遺伝子断片と上記ｐＴＬ２Ｂｍｃの制
限酵素ＥｃｏＲＩ消化物との計２本を、ＤＮＡライゲー
ションキットを用いてライゲーションした。これを大腸
菌ＤＨ５株に導入して形質転換した後、目的のプラスミ
ドｐＴＬ２ＢｍＩ−００１０を得た。アルカリ−ＳＤＳ
法に従ってｐＴＬ２ＢｍＩ−００１０を大量調製し、制
限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番
号７の塩基配列を持ったプラスミドであることを確認し
た。

【００６２】［実施例５］配列番号９の癌転移阻害融合
タンパク質遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ−
０００１の作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｐＵＣ１９上にクロ
ーニングしたヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型とし
て、配列番号１２および１８の塩基配列で表されるプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＡｆｌＩＩＩによって末端調節を行なっ
た。フェノール抽出、エタノール沈澱による精製の後、
アガロースゲル電気泳動し、約１８００塩基対に相当す
るバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビ
ーズ法で精製し、挿入断片とした。

【００６３】一方、これとは別に、実施例２の場合と同
様にして作製したシゾサッカロミセズ・ポンベ発現ベク
ターｐＴＬ２Ｍを用意し、このベクターｐＴＬ２Ｍを制
限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化
し、約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００６４】そして上記挿入断片とこの発現ベクターｐ
ＴＬ２Ｍの上記制限酵素による二重消化物との計２本
を、ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーショ
ンした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入して形質転換した
後、目的のプラスミドｐＴＬ２Ｂｍｄを得た。アルカリ
−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２Ｂｍｄを大量調製し、制限
酵素地図の作製および塩基配列決定によって、目的の塩
基配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００６５】さらに実施例１で作製したｐＩ２Ａを制限
酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの二重消化によって
末端調節を行ない、フェノール抽出、エタノール沈澱に
よる精製の後、アクリルアミドゲル電気泳動により約７
０塩基対に相当するバンドを切出し、ゲルから溶出して
遺伝子断片とした。

【００６６】この遺伝子断片と上記ｐＴＬ２Ｂｍｂの制
限酵素ＡｆｌＩＩＩ消化物（部分消化後、約７０００塩
基対に相当するバンドをＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いて精
製）との計２本を、ＤＮＡライゲーションキットを用い
てライゲーションした。これを大腸菌ＤＨ５株に導入し
て形質転換した後、目的のプラスミドｐＴＬ２ＢｍＩ−
０００１を得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従ってｐＴＬ２
ＢｍＩ−０００１を大量調製し、制限酵素地図の作製お
よび塩基配列決定によって、配列番号９の塩基配列を持
ったプラスミドであることを確認した。

【００６７】ここで作製したｐＴＬ２ＢｍＩ−０００１
を、以下単にｐＴＬ２ＢｍＩと記載する。

【００６８】［実施例６］発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ
を用いたシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換シゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求性株、ｈ^-
ｌｅｕ１−３２（ＡＴＣＣ３８３９９）をロイシン含有
最少培地ＭＢ−ｌｅｕで１０⁷ 細胞数／ｍｌになるまで
生育させた。遠心集菌、水による洗菌後１０⁹ 細胞数／
ｍｌになるように１００ｍＭ酢酸リチウム（ｐＨ５．
０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。
その後、上記懸濁液１００μｌに、制限酵素ＰｓｔＩで
消化したｐＡＬ７（K. Okazaki et al.: Nucl. Acids R
es. 18, 6485-6489 (1990)）１μｇおよび２μｇの発現
ベクターｐＴＬ２ＢｍＩを１０μｌのＴＥバッファーに
溶かした溶液を加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０μ
ｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
次いで遠心分離によりＰＥＧ４０００を除去した後、１
ｍｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕに懸濁した。

【００６９】この懸濁液から１００μｌを分取し、さら
に９００μｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕで希釈し
て、３２℃３０分間インキュベートした後、３００μｌ
を最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日
間インキュベートし、得られた形質転換体をＧ４１８を
２５μｇ／ｍｌ含むＹＥＡ培地に移し、さらに３２℃で
５日間培養し、得られたクローンを目的とする各形質転
換体とした。

【００７０】一方、これとは別に、癌転移阻害ペプチド
遺伝子を持たないプラスミドｐＴＬ２Ｍ（既述）および
ｐＴＬ２Ｂｍ（特願平５−２４９３１０号明細書）につ
いても、同じ方法で形質転換体を作製し、ネガティブコ
ントロールとした。なお、プラスミドｐＴＬ２Ｂｍは以
下のようにして作製した。

【００７１】［プラスミドｐＴＬ２Ｂｍの作製］国立予
防衛生研究所遺伝子バンクより供与を受けた、ヒト血清
アルブミンｃＤＮＡを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５を
鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCA
TGGATGCACACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プ
ライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素ＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで末端調節し、フェノール抽出、エタノー
ル沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。

【００７２】これとは別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆ
ｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約５０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。

【００７３】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＴ
Ｌ２Ｂｍ（図８）をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。

【００７４】［実施例７］形質転換体の培養および無細
胞抽出液の調製抗生物質Ｇ４１８（GIBCO BRL ）を２００μｇ／ｍｌの
濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ培地［（２％グルコース
（和光純薬（株）製）、１％バクトイーストエキス（Di
fco ）、２％バクトペプトン（Difco ）］に、実施例６
で作製した形質転換体を植菌し、３２℃で５日間培養し
た。その培養液から１０⁸ 個の菌体を集菌し、洗菌後、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５) で懸濁し、超
音波破砕を行った。終濃度が１％になるように１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、８０℃で１５分間加熱した。遠心分離
によって無細胞抽出液（上清）を得た。

【００７５】これとは別に、癌転移阻害融合タンパク質
遺伝子を持たない上記ｐＴＬ２ＭおよびｐＴＬ２Ｂｍを
導入した形質転換体についても、同様の方法で無細胞抽
出液を作製し、ネガティブコントロールとした。

【００７６】［実施例８］ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による癌転移阻害融合タンパク質の発現解
析ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、実施例７で作製した各形質
転換体由来の無細胞抽出液について発現解析を行なっ
た。結果を図２に示す。同図から明らかなように、ｐＴ
Ｌ２ＢｍＩによる形質転換体では、コントロールである
ｐＴＬ２Ｂｍによる形質転換体に比較して、分子量６
９，０００のバンド（同図中、＊で示す）が、癌転移阻
害融合タンパク質を産生していることによって分子量７
１，０００の位置（同図中、＊＊で示す）に移動してい
ることが検出できた。デンシトメータによって測定した
ところ、癌転移阻害融合タンパク質の産生量は、全菌体
タンパク質の３０％程度であった。

【００７７】［実施例９］ウエスタンブロッティングに
よる癌転移阻害融合タンパク質の確認実施例７で作製した各形質転換体由来の無細胞抽出液に
ついて実施例８と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっ
た。得られたゲルをＰＶＤＦ膜（Bio-Rad ）に転写し、
癌転移阻害ペプチドに特異的な抗体（A. Isoai et al.:
Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 7-14 (1993)）
を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ（ア
マシャム（株）製）によって検出した。結果を図３に示
す。同図から明らかなように、該融合タンパク質を含む
配列に相当する分子量７１, ０００附近の位置に唯一の
明瞭なバンドが得られたことから、該融合タンパク質に
特異的なアミノ酸配列が含まれている融合タンパク質が
産生していることが確認された。

【００７８】［実施例１０］癌転移阻害融合タンパク質
の精製ｐＴＬ２ＢｍＩにより形質転換された形質転換体を、Ｇ
４１８を２５μｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ
培地で３２℃、１日間前培養した後、Ｇ４１８を２００
μｇ／ｍｌ含む１リットルのＹＰＤ培地に１×１０⁸ ／
ｍｌの割合で植菌してさらに４日間培養した。集菌後の
菌体の４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）［１２μＭのＡＰＭＳＦ（和光純薬（株）製）、２
５μＭロイペプチン（和光純薬（株）製）、２ｍＭのＥ
ＤＴＡを含む］に懸濁し等量のガラスビーズ（ビードビ
ーター）を用いて０℃で破砕した。１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した沈澱を同じ緩衝液で洗浄した
後、６Ｍグアニジン塩酸と１０ｍＭのジチオスレイトー
ルを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て５０℃１時間で可溶化した後、１２，０００rpm 、２
０分間遠心分離した上清を０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型
グルタチオンを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で１００倍（ｖ／ｖ）に４℃で徐々に希釈し
た。１晩４℃で放置後、限外濾過膜（アミコン）にて濃
縮しスーパーロース１２カラムにてゲル濾過し、各画分
についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析し分子量７１，００
０の位置に唯一のバンドが見られた画分を集め精製癌転
移阻害融合タンパク質とした。

【００７９】［実施例１１］精製癌転移阻害融合タンパ
ク質の癌細胞浸潤阻害活性の測定実施例１０で精製した癌転移阻害融合タンパク質につい
て、癌細胞の浸潤抑制効果を調べた。評価方法は Albin
i らの方法（Albini et al.: Cancer Res. 47,3239-324
5 (1987) ）に従って行った。８μｍのポアサイズを持
つポリカーボネートフィルターを用い、上層と下層に分
けられたケモタキセル（クラボウ（株）製）のフィルタ
ー上面に１０μｇのマトリゲル（コラボレーティブ
（株）製）を塗布し、室温で一晩乾燥させた。使用直前
に培養液で膨潤させ、２４穴のカルチャープレートにセ
ットした。癌細胞はＢ１６メラノーマ由来の高転移性ク
ローンＢ１６ＦＥ７を使用した。

【００８０】細胞を１．８５ｋＢｑ／ｍｌの［¹²⁵ Ｉ］
ＩＵｄＲ（アマシャム（株）製）存在下で２日間培養し
た。使用直前にトリプシン溶液で細胞を回収した後、
０．１％の牛血清アルブミンを含む培養液に懸濁し細胞
数と、取り込まれた［¹²⁵ Ｉ］ＩＵｄＲの放射能を計測
した。ケモタキセルの下層には２０μｇ／ｍｌのヒトフ
ィブロネクチンを入れ、上層には５×１０⁴ 個の細胞を
種々の濃度の癌転移阻害融合タンパク質と共に入れ、炭
酸ガスインキュベータ中で２０時間培養した。

【００８１】培養終了後、フィルターの上面に残ってい
る細胞を綿棒でかきとり、フィルターをティッシュソル
ビライザー（アマシャム（株）製）で下面に移動した細
胞と共に溶解した後、放射能を計測した。結果を図４に
示す。同図から明らかなように、本癌転移阻害融合タン
パク質により、癌細胞の浸潤が有意に阻害されることが
示された。

【００８２】なお、上記の実施例においては、ヒト血清
アルブミンのＣ末端に癌転移阻害ペプチドを結合させた
融合タンパク質を遺伝子工学的に産生せしめ、その生理
活性等の確認を行っているが、ヒト血清アルブミンのＮ
末端、第１〜２ドメイン間、第２〜３ドメイン間に癌転
移阻害ペプチドを結合させた場合においても、上記と同
様な効果が得られると考えられる。

【００８３】

【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、こ
れまで化学的合成方法および結合方法を組合わせてのみ
作製可能であった癌転移阻害融合タンパク質を組換えＤ
ＮＡ技術を用いることによって初めて直接的に、しかも
高効率に生産することができるという効果が奏される。

【００８４】したがって、本発明における形質転換体を
用いた大量培養により、目的とする癌転移阻害融合タン
パク質の高い生産性が得られ、工業スケールでの生産に
使用することが十分可能である。すなわち医薬品として
の癌転移阻害融合タンパク質を安定的に供給することが
可能になったといえる。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Glu Asp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Gly Asp Ala Lys 20 21 配列番号：２配列の長さ：６０８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ala Glu Asp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu 1 5 10 15 Gly Ala Gly Asp Ser Lys Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His 20 25 30 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile 35 40 45 Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys 50 55 60 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 65 70 75 80 Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys 85 90 95 Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 100 105 110 Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His 115 120 125 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 130 135 140 Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys 180 185 190 Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 195 200 205 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 210 215 220 Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 225 230 235 240 Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys 245 250 255 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp 260 265 270 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 275 280 285 Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys 290 295 300 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu 305 310 315 320 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys 325 330 335 Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 340 345 350 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu 355 360 365 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe 385 390 395 400 Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu 405 410 415 Leu Phe Lys Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 420 425 430 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 450 455 460 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 465 470 475 480 Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 485 490 495 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510 Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 515 520 525 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 530 535 540 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro 545 550 555 560 Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala 565 570 575 Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 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Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 340 345 350 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 355 360 365 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu 370 375 380 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 405 410 415 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 420 425 430 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 450 455 460 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 465 470 475 480 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 485 490 495 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 500 505 510 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 515 520 525 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 530 535 540 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 545 550 555 560 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 565 570 575 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Tyr Met Ala Glu Asp Gly 580 585 590 Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly Ala Gly Asp Ala 595 600 605 Lys 609 配列番号：９配列の長さ：１８３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１８３０特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG GCC GAG GAC GGT 1776 GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG GGT GCC GGT GAC GCC 1824 AAG TAA 1830 配列番号：１０配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATCC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT 50 GAG GGT GCC GGT GAC GCC AAG TA 73 配列番号：１１配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列 AGCTTA CTT GGC GTC ACC GGC ACC CTC AGC CTT CTC AGC TTG GTC GGT CTT 51 GGC GTC ACC GTC CTC GGC CAT G 73 配列番号：１２配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGACCATGGA TGCACACAAG AGTGAGGT 28 配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AATAAGCTTT TGATCTTCAT 20 配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTT GGCAACAGGC 20 配列番号：１５配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTG ATGAACTTCG GGATGAAGG 29 配列番号：１６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGAATTCA TCGAACACTT TGGC 24 配列番号：１７配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列 AGCGAATTCA AACCTCTTGT GGAAGAGCC 29 配列番号：１８配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAGAAGCTTG AATTCACATG TATAAGCCTA AGGCAGCTTG 40 配列番号：１９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCCCATGGC CGAGGACGGT GACGC 25 配列番号：２０配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCCCATGGC TTGGCGACAC CGGCACCCT 29 配列番号：２１配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTG CCGAGGACGG TGACGCCAA 29 配列番号：２２配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCAAGCTTG GCGACACCGG CACCCT 26 配列番号：２３配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGAATTCG CCGAGGACGG TGACGCCAA 29 配列番号：２４配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGAATTCC TTGGCGACAC CGGCACCCT 29 配列番号：２５配列の長さ：７１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG 50 GGT GCC GGT GAC GCC AAG TAA 71

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの構成図である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図である。

【図３】ウエスタンブロット観察図である。

【図４】癌細胞浸潤阻害活性測定結果を示すグラフであ
る。

【図５】発現ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図である。

【図６】発現ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図である。

【図７】発現ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図である。

【図８】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者塚本洋子神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者礒合敦神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者熊谷博道神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地旭硝子株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖の
少なくとも１つ以上の所望の位置に生理活性を有するペ
プチドを導入してなる融合タンパク質。
【請求項２】生理活性を有するペプチドの導入位置
が、ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末
端、カルボキシル末端、第１〜２ドメイン間あるいは第
２〜３ドメイン間のうちのいずれか１箇所若しくはこれ
らの任意の組み合わせの位置である、請求項１に記載の
融合タンパク質。
【請求項３】生理活性を有するペプチドが配列番号１
のアミノ酸配列で表される、請求項１または２に記載の
融合タンパク質。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】生理活性を有するペプチドの導入位置が
ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のアミノ末端であ
る、配列番号２のアミノ酸配列で表される、請求項１〜
３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】配列番号３の塩基配列で表される、請求
項５に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】生理活性を有するペプチドの導入位置が
ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖の第１〜２ドメイ
ン間である、配列番号４のアミノ酸配列で表される、請
求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】配列番号５の塩基配列で表される、請求
項７に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】生理活性を有するペプチドの導入位置が
ヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖の第２〜３ドメイ
ン間である、配列番号６のアミノ酸配列で表される、請
求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】配列番号７の塩基配列で表される、請
求項９に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１１】生理活性を有するペプチドの導入位置
がヒト血清アルブミンのポリペプチド鎖のカルボキシル
末端である、配列番号８のアミノ酸配列で表される、請
求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】配列番号９の塩基配列で表される、請
求項１１に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】請求項６、８、１０および１２のいず
れかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１４】前記組換えベクターがプラスミドｐＴ
Ｌ２ＢｍＩ−１０００である、請求項１３に記載の組換
えベクター。
【請求項１５】前記ベクターがプラスミドｐＴＬ２Ｂ
ｍＩ−０１００である、請求項１３に記載の組換えベク
ター。
【請求項１６】前記ベクターがプラスミドｐＴＬ２Ｂ
ｍＩ−００１０である、請求項１３に記載の組換えベク
ター。
【請求項１７】前記ベクターがプラスミドｐＴＬ２Ｂ
ｍＩ−０００１である、請求項１３に記載の組換えベク
ター。
【請求項１８】請求項１３〜１７のいずれかに記載の
組換えベクターで宿主細胞を形質転換してなる、融合タ
ンパク質を産生し得る形質転換体。
【請求項１９】宿主細胞が分裂酵母シゾサッカロミセ
ス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）である、請
求項１８に記載の形質転換体。
【請求項２０】請求項１８または１９に記載の形質転
換体を培養し、培養物中に産生された融合タンパク質を
単離し、所望により精製することからなる該融合タンパ
ク質の製造方法。