DE602004011843T2

DE602004011843T2 - Die myocardfunktion wiederherstellende peptidsubstanz

Info

Publication number: DE602004011843T2
Application number: DE602004011843T
Authority: DE
Inventors: Vladimir Khatskelevich St.Petersburg KHAVINSON; Galina Anatolievna St.Petersburg RYZHAK; Evgeny Iosifovich St.Petersburg GRIGORIEV; Irina Yurievna St.Petersburg RYADNOVA
Original assignee: Access Bioscience CJSC
Current assignee: Access Bioscience CJSC
Priority date: 2004-06-22
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2024-12-08
Also published as: RU2255756C1; EP1758923B1; ATE386047T1; ES2302067T3; EP1758923B8; EP1758923A1; DE602004011843D1; WO2006001728A1; US7662789B2; US20080269141A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf medizinische Mittel zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und kann als Mittel zur Wiederherstellung der Myokardfunktion in der Therapie verschiedener Formen dieser Pathologie verwendet werden.
Zur Zeit bleibt das Problem der Prävention und Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufgrund der Schwere und weiten Verbreitung der letzteren aktuell. Es zeigte sich eine Tendenz zur verstärkten Entwicklung einer kardiovaskulären Pathologie, was eine frühere Behinderung und Sterblichkeit herbeiführt. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung von neuen medizinischen Substanzen für die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen von immer größerem öffentlichen Interesse.
Die verbreitetsten Formen der Herzpathologie hängen mit Herzischämie zusammen, die als Ergebnis von Störungen des Gefäßsystems auftritt und in ihren schlimmen Formen einen Myokardinfarkt verursachen kann, die Haupttodesursache in der heutigen Gesellschaft. Ischämische Herzkrankheit führt häufig zu Komplikationen wie gestörte Myokardkontraktion, -erregung und -leitfähigkeit. Daneben sollte man eine getrennte Gruppe von Herzmuskelkrankheiten unterscheiden, deren Therapie hauptsächlich auf eine allgemeine Stärkungstherapie beschränkt ist und die großenteils symptomatisch ist. Zu diesen Krankheiten gehören Myokarddystrophien, Myopathien und Kardiomyopathien.
Unter den Mitteln zur Prävention einer Myokardischämie gibt es pharmakologische Substanzen verschiedener Gruppen einschließlich Antagonisten für Calcium: Amlodipin, Verapamil, Felodipin (Register of Pharmaceutical Substances of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 90, S. 180, S. 865 (rus.)) und Betablocker, wie Propanolol, Pindolol (Register of Pharmaceutical Substances of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 700, S. 659 (rus.)). Eine Besonderheit der Wirkung dieser Substanzen besteht in der Reduktion des Sauerstoffbedarfs des Myokards sowie in einer negativen inotropischen Wirkung. Zu einer weiteren Klasse von verbreitet angewendeten Präparaten gehören zum Beispiel NO-Donatoren (verschiedene Formen von Nitrosorbid und Mononitrat, sauberes Nitroglycerinpräparat in Aerosolform, Nitromint) (Register of Pharmaceutical Substances of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 588, S. 332, S. 587). Neben diesen Präparaten kann man auch natürliche oder synthetische Herzglycoside verwenden (Präparate von Digitalis L., Strophanthus, Convallaria L.) (M.D. Mashkovskij, Medicinal preparations, Moskau, Novaya Volna, 2004, S. 215 (rus.)). Die Herztätigkeit kann neben Herzglycosiden auch durch Nicht-Glycosid-Kardiotonika gestärkt werden. Zu den Kardiotonika gehören die sympathomimetischen (adrenergischen) Präparate Dobutamin und Dopamin (Register of Pharmaceutical Substances of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 296, S. 305 (rus.)). Bestimmte kardiotonische Eigenschaften zeigen Substanzen, die eine allgemeine positive Wirkung auf Stoffwechselvorgänge im Organismus ausüben.
Diese Präparate haben einen Nachteil: sie haben Nebenwirkungen und Kontraindikationen. Insbesondere hat der größte Teil dieser Präparate eine unterdrückende Wirkung auf die Empfindlichkeit des Myokards gegenüber Erregung, induziert Rhythmusstörungen, Herzversagen, Hypotonie, Bradykardie und führt zu Entzugserscheinungen.
Unter den bekannten medizinischen Präparaten, die für die Therapie der Myokardischämie verwendet werden, ist Actovegin (Register of Pharmaceutical Substances of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 63 (rus.)) als Präparat zu nennen, das auf den Zellstoffwechsel wirkt und energieabhängige Stoffwechselvorgänge in den Geweben verbessert, doch ist seine Aktivität unspezifisch.
Es gibt bekannte Peptidpräparate, die eine Wirkung auf die Myokardfunktion ausüben. Dazu gehören Opioidpeptide (A.F. Usynin, V.S. Pavlenko, V.V. Khlystov, Ischemic myocardium damage and the influence of certain pharmacological substances an it in experimental rats, Actual Issues of Cardiology, Issue 2, Tomsk, Tomsk University Publishing, 1987, S. 116–118 (rus.)) und Dalargin, ihr synthetisches Analogon (Register of Pharmaceutical Substanzes of Russia, Drug Encyclopedia, Moskau 2003, S. 249 (rus.)).
Dalargin wird bekanntermaßen für die Therapie von Myokardinfarkt als Mittel zur Prävention von Kammerflimmern verwendet ( RU-Patent Nr. 2032422 "Method of myocardium infarction therapy", MKI⁶ A61K38/00, 1995). Außerdem ist eine Substanz bekannt, die die Verbesserung des funktionellen Status des Myokards durch Korrektur von Stoffwechselstörungen auf der Basis einer kombinierten Anwendung von Dalargin und Solcoseryl ermöglicht ( RU-Patent Nr. 2061484 "Method of myocardium infarction therapy an its acute stage", MKI⁶ A61K35/14, A61K38/33, 1996).
Cordialin, ein standardisierter Komplex von niedermolekularen Peptiden aus dem Herzen hat bekanntermaßen eine herzschützende Wirkung in der Erholungsphase, wenn es nach einem landwirtschaftlichen Gift, TMTD, das Schäden an den Kardiomyocyten verursacht, verabreicht wird (Database Biosis, Datenbank-Zugriffs-Nr. PREV199395091835).
Es ist auch ein Polypeptidpräparat bekannt ( RU-Patent Nr. 1417242 für die Erfindung "Method of obtainment of the substance restoring myocardium function", MKI A 61K 35/24, 1989), das aus tierischem Herzen erhalten wird und eine ähnliche biologische Aktivität zeigt und die das nächste Analogon ist und als Prototyp für ein pharmakologisches Mittel (pharmazeutische Zusammensetzung) dient.
Die Anwendung dieses Präparats ist jedoch aufgrund des komplexen Verfahren zu seiner Gewinnung, der geringen Ausbeute an aktiven Substanzen, der erheblichen Variabilität seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie aufgrund der Möglichkeit von Nebenwirkungen in Form von allergischen Reaktionen eingeschränkt.
Es ist bemerkenswert, dass die beanspruchte Peptidsubstanz, ein Tetrapeptid, keine strukturellen Analoga hat.
Ziel der beanspruchten Erfindung ist es, eine neue biologisch aktive Substanz peptidischer Natur, die die Myokardfunktion wiederherstellt, zu gewinnen.
Die technische Lösung der Erfindung besteht in der Schaffung einer neuen Peptidsubstanz sowie eines pharmakologischen Präparats (pharmazeutische Zusammensetzung), das diese Peptidsubstanz als Peptidwirkstoff enthält, der bei Aufnahme in das Medikament zur Wiederherstellung der Myokardfunktion beiträgt.
Die Möglichkeit, das die technische Lösung bei Verwendung der Erfindung objektiv erreicht wird, wurde durch zuverlässige Daten bestätigt, die in den Beispielen gezeigt werden, welche experimentelle Daten enthalten, die in Bezug auf das auf diesem Gebiet standardisierte Verfahren erhalten wurden.
Die Erfindung bezieht sich auf das neue Tetrapeptid Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg, Sequenz 1 [SEQ ID Nr. 1].
Das Tetrapeptid wird mit Hilfe des klassischen Verfahrens der Peptidsynthese in Lösung erhalten (Jacubke H.-D., Eschkeit H., Amino acids, peptides, Proteins, Übersetzung aus dem Deutschen, Moskau, Mir Publishing Company, 1985, S. 456).
Diese Erfindung bezieht sich auf das Tetrapeptid Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg, Sequenz 1 [SEQ ID Nr. 1], das eine biologische Aktivität zeigt, die in der Wiederherstellung der Myokardfunktion besteht.
Die Aktivität des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg, die auf die Wiederherstellung der Myokardfunktion abzielt, zeigte sich im Verlauf seiner Untersuchung im Falle der experimentellen Pathologie, insbesondere wenn man die folgenden Muster verwendet:

• Wirkung des Tetrapeptids auf den Verlauf eines experimentellen Myokardinfarkts im Falle einer Vasoligation der Koronararterie bei Ratten;
• Wirkung des Tetrapeptids auf den Status des isolierten Herzens im Falle von Perfusion und Ischämie;
• Wirkung des Tetrapeptids auf den Verlauf einer Adrenalin-Dystrophie im Rattenmyokard;
• Nachweis der schützenden Aktivität des Tetrapeptids im Falle von experimentellen toxikochemischen Myokardiopathien;
• Wirkung des Tetrapeptids auf die Entwicklung und das Ergebnis einer Chlor-Calcium-Arrhythmie bei Ratten;
• Wirkung des Tetrapeptids auf das Wachstum von organotypischen Herzkulturexplantaten von pubertierenden Ratten;
• Wirkung des Tetrapeptids auf die Bioenergetik von Kardiomyocyten.

Es ist bekannt, dass die oben beschriebenen Pathologien durch die Bildung von Kardiomyocyten-Nekrose-Zonen, Reaktionen im Myokard, die von einem Sauerstoffungleichgewicht abhängen, biologischen Oxidationsvorgängen mit zunehmendem Energiemangel, dem zunehmenden Verbrauch von energiereichen Verbindungen, die Akkumulation von ungenügend oxidierten Verbindungen und Lipid-Peroxid-Oxidationsprodukte charakterisiert sind. Calciumübertragung und -stoffwechsel sowie die Verteilung des Calciums unter den zellulären Pools und im interzellulären Raum sind gestört. Die beobachteten Veränderungen führen zur Störung der kontraktiven Funktion des Myokards sowie zur Arrhythmie und verursachen die Entwicklung von kardiovaskulärer Pathologie.
Experimentelle Untersuchungen zeigten, dass das Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg nicht toxisch ist.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf das pharmakologische Präparat (die pharmazeutische Zusammensetzung), das die Myokardfunktion wiederherstellt und eine wirksame Menge des Tetrapeptids Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg, Sequenz 1 [SEQ ID Nr. 1], als Wirkstoff enthält.
Der Ausdruck "pharmakologisches Mittel (Substanz)" impliziert in diesem Patent die Verwendung einer solchen medizinischen Form, die die wirksame Menge des Tetrapeptids mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg enthält und die prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung in der Medizin als die Myokardfunktion wiederherstellendes Präparat finden kann.
Der Ausdruck "wirksame Menge" impliziert in diesem Anspruch die Verwendung einer solchen Menge an Peptidwirkstoff, die im Einklang mit den quantitativen Indices seiner Aktivität und Toxizität sowie in Bezug auf das verfügbare Wissen in dieser Darreichungsform wirksam ist.
Um notwendige pharmazeutische Zusammensetzungen zu erhalten, die dieser Erfindung genügen, wird das vorgeschlagene Tetrapeptid mit Compoundierverfahren, die in der Pharmazeutik verwendet werden, als aktiver Bestandteil mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt.
Der Träger kann verschiedene Formen haben, die von der pharmazeutischen Form des Präparats abhängen, das an den Organismus verabreicht werden muss, zum Beispiel parenteral oder oral.
In dem Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen können bekannte pharmazeutische Komponenten in der für die orale Verabreichung bevorzugten Dosierung verwendet werden.
Im Falle einer parenteralen Verabreichung enthält der Träger gewöhnlich eine sterile 0,9%ige Natriumchloridlösung oder steriles Wasser, obwohl auch andere Bestandteile, die zur Stabilität des Präparats beitragen, mitverwendet werden können.
Der Gegenstand der Erfindung wird anhand von Tabellen erläutert.
Tabelle 1 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf biochemische Indizes im Rattenmyokard in Falle eines experimentellen Infarkts (Behandlungsvariante).
Tabelle 2 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf den Status des isolierten Meerschweinchenherzens (Behandlungsvariante).
Tabelle 3 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf die Indizes der Kontraktionsfähigkeit von isoliertem Rattenherz nach Ischämie.
Tabelle 4 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf die Indizes der Peroxid-Lipid-Oxidation in Rattenmyokard im Falle einer Adrenalindystrophie 24 Stunden nach deren Induktion.
Tabelle 5 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf die Dehydrogenase-Aktivität und den Glycogengehalt in Rattenmyokard 4 Stunden nach Adrenalindystrophie.
Tabelle 6 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf cytomorphologische Indices in Myokard im Falle einer Vergiftung von Ratten mit Tetramethylthiuramdisulfid.
Tabelle 7 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf die Indizes, die die Entwicklung und das Ergebnis einer Chlor-Calcium-Anämie bei Ratten widerspiegeln.
Tabelle 8 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf das Wachstum von organotypischen Myokardgewebeexplantaten.
Tabelle 9 zeigt die Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg auf morphologische und biochemische Indices des peripheren Bluts von Meerschweinchen.
Diese Erfindung wird anhand eines Beispiels für die Synthese des Tetrapeptids mit der Formel Ala-Glu-Asp-Arg (Beispiel 1), anhand von Beispielen, die die biologische Aktivität des Tetrapeptids bestätigen (Beispiele 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), und anhand eines Beispiels für einen Tetrapeptid-Toxizitätstest (Beispiel 9), die seine pharmakologischen Eigenschaften belegen und die therapeutische Aktivität der pharmazeutischen Zusammensetzung bestätigen, veranschaulicht.
Beispiel 1. Synthese des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg

1. Produktname: L-Alanyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-arginin
2. Strukturformel: H-Ala-Glu-Asp-Arg-OH
3. Summenformel ohne Gegenion: C₁₈H₃₁N₇O₉
4. Molekulargewicht ohne Gegenion: 489,48
5. Gegenion: Acetat
6. Erscheinungsbild: weißes amorphes geruchloses Pulver
7. Syntheseverfahren: Das Peptid wird nach einem klassischen Syntheseverfahren in Lösung nach dem folgenden Schema erhalten:
Z = Benzyloxycarbonylgruppe; BOC = tert-Butyloxycarbonylgruppe; OSu = N-Oxysuccinimidester; OBzl = Benzylester; DCC = N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid; HOBT = N-Oxybenzotriazol. N,N'-Dimethylformamid wird als Lösungsmittel verwendet. Wenn man Asparaginsäure hinzufügt, wird der Schutz der α-COOH-Gruppe durch Salzbildung mit Triethylamin erreicht. Die BOC-Schutzgruppe wird mit Trifluoressigsäure(TFA)-Lösung und die Z-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung entfernt. Das Produkt wird durch das Verfahren der präparativen HPLC (high-performance liquid chromatography) auf einer Umkehrphasensäule isoliert und gereinigt.
8. Eigenschaften des fertigen Produkts: • Aminosäureanalyse: Glu 1,08; Asp 1,08; Ala 1,00; Arg 1,07; • Peptidgehalt 98,01% (durch HPLC, 220 nm); • DC – individuell, R_f = 0,59 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser 5:1:3); • Feuchtigkeitsgehalt: 8%; • pH-Wert einer 0,001%igen Lösung: 4,58; • spezifischer Drehwinkel: [α]_D ²²: –24° (c = 1, H₂O).

Synthesebeispiel:
1) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), N-tert-Butyloxycarbonyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat.
4,34 g (0,01 mol) N-Oxysuccinimidester von N-tert-Butyloxycarbonyl(γ-benzyl)glutaminsäure BOC-Glu(OBzl)-OSu wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,72 ml (0,0125 mol) Triethylamin und 2,80 g (0,0125 mol) β-Benzylaspartat versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.
Danach wird das Produkt mit 0,5 N Schwefelsäurelösung (150 ml) ausgefällt, mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert, in 0,5 N Schwefelsäurelösung (2 × 20 ml), Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (1 × 20 ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäurelösung (2 × 20 ml), Wasser gewaschen. Das Produkt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Ethylacetat wird abfiltriert und im Vakuum bei 40°C entfernt. Der Rückstand wird im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Es werden 5,68 g (≈ 100%) Öl erhalten.
R_f = 0,42 (Benzol-Aceton 2:1; Sorbfil-Platten, Silicagel 8–12 μm, Entwicklung durch UV und Chlor/Benzidin).
2) TFA·H-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), Trifluoracetat von (γ-Benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat.
5,68 g (≈ 0,01 mol) N-tert-Butyloxycarbonyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat (I) wird in 20 ml Dichlormethan-Trifluoressigsäure-Gemisch (3:1) gelöst. Zwei Stunden später wird das Lösungsmittel bei 40°C im Vakuum entfernt. Die Entfernung wird mit einer weiteren Portion Dichlormethan (2 × 10 ml) wiederholt. Der Rückstand wird im Vakuum über NaOH getrocknet. Es werden 5,80 g (≈ 100%) Öl erhalten. R_f = 0,63 (n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser, 15:10:3:12).
3) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-Carbobenzoxyalanyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat.
5,65 g (0,01 mol) Trifluoracetat von (γ-Benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat (II) werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,80 ml (0,02 mol) Triethylamin und 4,14 g (0,013 mol) N-Oxysuccinimidester von N-Carbobenzoxyalanin versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.
Das Produkt wird mit 0,5 N Schwefelsäurelösung (150 ml) ausgefällt, mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert, in 0,5 N Schwefelsäurelösung (2 × 20 ml), Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (1 × 20 ml), Wasser, 0,5 N Schwefelsäurelösung (2 × 20 ml), Wasser gewaschen. Das Produkt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Ethylacetat wird abfiltriert und im Vakuum bei 40°C entfernt. Der Rückstand wird im Ethylacetat/Hexan-System kristallisiert. Das Produkt wird abfiltriert und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Die Ausbeute beträgt 4,10 g (66%). Die Schmelztemperatur (T_m) beträgt 154°C.
R_f = 0,48 (Benzol-Aceton, 1:1), R_f = 0,72 (N-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser, 15:10:3:12).
4) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH (IV), N-Carbobenzoxyalanyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartylarginin.
5,0 g (8 mmol) N-Carbobenzoxyalanyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartat (III) und 1,35 g (10 mmol) N-Oxybenzotriazol werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird auf 0°C abgekühlt. 2,0 g (10 mmol) gekühlte N,N-Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung in 5 ml werden hinzugefügt, und das Gemisch wird 20 Minuten lang gerührt. Dann wird eine gekühlte Suspension von HCl·H-Arg-OH, 5,00 g (24 mmol) Arginin-Hydrochlorid in 15 ml Dimethylformamid hinzugefügt. Das Gemisch wird 2 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur mischen gelassen. Ein Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff und überschüssigem Arginin wird abfiltriert. 0,5 l 2 N H₂SO₄ wird in das Filtrat gegossen, bis ein gelber Niederschlag erscheint. Das Gemisch wird über Nacht im Kühlschrank gelassen. Der Niederschlag wird in 100 ml n-Butanol, das mit 2% Essigsäure gesättigt ist, gewaschen und mehrmals in 2%iger Essigsäure gewaschen. Die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert neutral ist, und im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Diethylester kristallisiert, dann filtriert und über P₂O₅ getrocknet. Die Ausbeute beträgt 2,5 g (45%).
R_f = 0,88 (n-Butanol-Essigsäure-Wasser 4:1:1).
5) H-Ala-Glu-Asp-Arg-OH (V), Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin.
2,50 g N-Carbobenzoxyalanyl(γ-benzyl)glutamyl(β-benzyl)aspartylarginin (III) wird in einem Methanol-Wasser-System (5:1) über Pd/C-Katalysator hydriert. Die Vollständigkeit der Deblockierungsreaktion wird durch DC im Benzol/Aceton- (2:1) und im Acetonitril/Essigsäure/Wasser-System (5:1:3) überwacht. Wenn die Reaktion zu Ende ist, wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird im Wasser/Methanol-System kristallisiert. Das Produkt wird im Vakuum über KOH getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1,00 g (70%).
R_f = 0,59 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser 5:1:3). Zur Reinigung werden 250 mg der Substanz in 4 ml 0,01%iger Trifluoressigsäure gelöst und einer HPLC an einer Umkehrphasensäule mit den Maßen 50 × 250 mm (Diasorb-130-C16T, 7 μm) unterzogen. Als Chromatograph wird Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module verwendet.
Chromatographiebedingungen A: 0,1% TFA; B: MeCN/0,1% TFA; Gradient B 0 → 10% in 100 min. Das Probenvolumen beträgt 5 ml, der Nachweis wird bei 215 nm durchgeführt, Scanning bei 190–600 nm, Fließgeschwindigkeit beträgt 10 ml/min.
Die Fraktion wird innerhalb von 49,0–54,0 min ausgewählt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum bei einer Temperatur, die 40°C nicht übersteigt, entfernt. Die Reinigung wird mit Hilfe des HPLC-Verfahrens unter denselben Bedingungen wiederholt. Die Fraktion wird innerhalb von 32–48 min ausgewählt. Das Lösungsmittel wird entfernt, die Entfernung wird mehrfach (fünfmal) mit 10 ml 10%iger Essigsäurelösung wiederholt. Der Rückstand wird schließlich in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst und lyophilisiert. Es werden 110 mg gereinigtes Präparat in Form eines amorphen geruchlosen weißen Pulvers erhalten.
6) Analyse des fertigen Produkts.

• Gehalt des Wirkstoffs (Peptid) wird definiert durch HPLC an Supelco LC-18-DB-Säule, LC-18-DB 4,6 × 250 mm, Gradient LC-18-DB. A: 0,1% TFA; B: MeCN/0,1% TFA; Gradient B 0 → 10% in 30 min. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 1 ml/min. Nachweis bei 220 nm, Scanning bei 190–600 nm, das Probenvolumen beträgt 20 μl. Peptidgehalt = 98,01%;
• Der Aminosäuregehalt wird definiert mit einem Analysator AAA "T-339" Prag nach 24 Stunden Hydrolyse in 6 N HCl bei 125°C. Glu 1,08; Asp 1,08; Ala 1,00; Arg 1,07;
• DC: individuell, R_f = 0,59 (Acetonitril-Essigsäure-Wasser 5:1:3). Sorbfil-Platten, Silicagel, Entwicklung in Chlor/Benzidin;
• Feuchtigkeitsgehalt: 8% (gravimetrisch, anhand des Massenverlusts beim Trocknen – 20 mg bei 100°C). pH-Wert einer 0,001%igen Lösung: 4,58 (potentiometrisch);
• spezifischer Drehwinkel: [α]_D ²²: –24° (c = 1, H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Beispiel 2. Wirkung des Tetrapeptids auf den Verlauf eines experimentellen Myokardinfarkts im Falle einer Vasoligation der Koronararterie bei Ratten.
Das Experiment wurde an 40 weißen Mischlingsratten durchgeführt, die jeweils 180–200 g wogen. Die Tiere wurden zufällig in zwei Gruppen von jeweils 20 Tieren eingeteilt. Ein Myokardinfarkt (MI) wurde durch Vasoligation der linken Koronararterie induziert. Den Tieren wurde das Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg intraperitoneal in einer Dosis von 0,05 μg pro Tier in steriler 0,9%iger NaCl-Lösung dreimal nach 1, 3 bzw. 5 Stunden nach der Koronarokklusion verabreicht. Die Ratten wurden 6 bzw. 24 Stunden nach der Operation geköpft. Tiere, die der Operation unterzogen wurden und intraperitoneal eine 0,9%ige NaCl-Lösung erhielten, dienten als Kontrolle. Die Größe der MI-Zone wurde gravimetrisch bestimmt. Myokardfragmente wurden für die Licht- und Elektronenmikroskopie fixiert, und ein Teil des Materials wurde für biochemische Studien in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Verabreichung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg verursachte während der ersten 24 Stunden nach dem Infarkt eine zuverlässige Abnahme der Mortalitätsrate bei Ratten (45% bei den Kontroll- und 15% bei den mit Tetrapeptid behandelten Ratten). Histologisch manifestierte sich dies in einer signifikanten Reduktion von Nekrosezonen bei mit Tetrapeptid behandelten Tieren bereits während der ersten Stunden der Krankheitsentwicklung. Die Analyse der Dynamik der biochemischen Indices zeigte, dass das Peptidpräparat den durch akute Myokardischämie verursachten Glucosegehalt im Blut signifikant auf fast zwei Drittel senkte. Dies ist hauptsächlich auf die beibehaltene normale Aktivität von Markerenzymen, Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Kreatinphosphokinase (CPK), zurückzuführen. Die schützende Wirkung des Tetrapeptids in diesem Modell manifestiert sich auch durch die Aufrechterhaltung des Glycogengehalts in Myokardgewebe, da dieser Index ohne Verabreichung des Präparats auf ein Drittel gesenkt wird.
Ultrastrukturelle Veränderungen im Status von Kardiomyocyten wurden mit Hilfe des Elektronenmikroskops untersucht. Die Untersuchung von 180 Elektronogrammen zeigte innerhalb von 24 Stunden seit beginn der MI eine besonders stark ausgeprägte schützende Wirkung des Tetrapeptids, was sich anhand der Tatsache zeigte, dass die Struktur der Mitochondrien intakt blieb. Unter der Wirkung des Präparats nimmt der Koeffizient der Energieeffizienz der Mitochondrien (Verhältnis aus dem Produkt aus mittlerer Gesamtmenge von Cristae und der Gesamtheit der Mitochondrienflächen in einem Elektronogramm im Falle von Pathologie zu dem Produkt derselben Indices bei normalem Herzen, ausgedrückt in Prozent) in Bezug auf die Kontrolltiere signifikant zu (93,2 ± 2,3 bzw. 41,5 ± 2,4, p < 0,05).
Das Tetrapeptid reduziert also zuverlässig den ischämischen Schaden eines Myokards vor dem Infarkt und stimuliert die Reparaturvorgänge darin, so dass die Kardiomyocyten ihre Überlebensfähigkeit beibehalten und ihre Ultrastruktur normalisiert wird, während die Kontrolltiere eine zunehmende Schwere des ischämischen Schadens zeigen, der am Ende zu ihrem Tod führt.
Beispiel 3. Wirkung des Tetrapeptids auf den Status des isolierten Herzens im Falle von Perfusion und Ischämie.
Das Experiment wurde unter Perfusionsbedingungen an isolierten Herzen von 60 männlichen Meerschweinchen nach Langendorf durchgeführt. Die Tiere wurden zufällig in mehrere Gruppen eingeteilt, die jeweils aus 6 Tieren bestanden. Eine totale Herzischämie wurde mittels einer vollständigen Abklemmung des Perfusionslösungsschlauchs während 30 Minuten induziert. Dann wurde eine Reperfusion unter denselben Bedingungen wie vor der Ischämie durchgeführt (Kontrollgruppe). Bei Versuchstieren wurde die Perfusion zusammen mit dem Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg in den Konzentrationen 0,002–0,05 μg/ml durchgeführt. Mechanische Kontraktionen wurden aufgezeichnet, Biopsien, die ungefähr 10 mg wogen, wurden mehrmals von der Oberseite des Herzens entnommen, und dann wurde der Gehalt an Malondialdehyd (MDA) darin bestimmt. Die Herzen am Ende des Experiments und teilweise vor der Ischämie wurden für die Bestimmung des ATP-, ADP- und AMP-Gehalts in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Ein weiteres Experiment war der Untersuchung der Wirkung des Tetrapeptids auf die Wiederherstellung der Fähigkeit des isolierten Rattenherzens zur Kontraktion nach einer Zeit der Ischämie gewidmet. Die Untersuchung wurde an 3 Gruppen von jeweils 8 Tieren im Falle des Arbeitsmodus des zusätzlich angespannten Herzmuskels unter Bedingungen eines induzierten Kontraktionsrhythmus und einer Erhöhung der Temperatur der Perfusionslösung auf 37°C durchgeführt.
Die Ergebnisse des Experiments sind in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Die Analyse der erhaltenen Daten lässt vermuten, dass die Wirkungen des Tetrapeptids auf normales und ischämisches Herz unterschiedlich sind. Die Verabreichung des Tetrapeptids beeinflusst den Status des normalen Herzens nicht, während die Einführung des Präparats in das Perfusat in kleinen Dosen von 0,002 bis 0,005 μg/ml im Falle einer Ischämie die Herzfunktion günstig beeinflusst. Eine Erhöhung der Leistung und Amplitude der Herzkontraktionen sowie eine signifikante Erhöhung des Gehalts an energiereichen Phosphaten wurde festgestellt, während der MDA-Gehalt sich nicht signifikant von der Norm unterschied. Die Zugabe des Tetrapeptids in die Perfusionslösung in einer Konzentration von 0,005 μg/ml verursachte eine zuverlässige Verbesserung der Kontraktionsfunktion; die Amplitude der Kontraktionen nahm zu (bis zu 75 ± 12% gegenüber dem Anfangsniveau, 43 ± 7% in der Kontrolle). Die Geschwindigkeit der Kontraktion und Relaxation war bei den Versuchstieren signifikant höher, und die Koronardurchblutung war im Vergleich zu den Kontrolltieren (8,5 ± 0,4 ml/min, p < 0,05) signifikant auf 10,8 ± 1,6 ml/min erhöht.
Die andere Versuchsreihe, die mit 12 Rattenherzen durchgeführt wurde, zielte auf die Untersuchung der schützenden Wirkung des Tetrapeptids im Falle seiner Zugabe zu dem Perfusat in der Konzentration von 10 ng/ml vor der Induktion der Ischämie. Dann wurde eine "schwere" Stimulation (Frequenz 5 Hz) im Herzen durchgeführt, und die Kontraktionstätigkeit wurde abgeschätzt. Die Untersuchung der schützenden Wirkung des Tetrapeptids im Falle seiner Verabreichung vor der induzierten Ischämie zeigte, dass das Tetrapeptid in der Dosis von 0,005 μg/ml die Zunahme der Kontraktion während der Zeit der Ischämie unterdrückt und zu ihrer Reduktion im Verlauf der Reperfusion beiträgt, während die Kontrollherzen nach der Stimulation keine Wiederherstellung der normalen Kontraktionstätigkeit im Falle der Reperfusion zeigten und die Kontraktionen bereits nach 5 Minuten Reperfusion vollständig aufhörten. Die Verabreichung des Tetrapeptids in einer sehr kleinen Dosis von 0,005 μg/ml bewahrte das Herz, das nahe daran war, aufzuhören, vor Flimmern und Abnahme der Kontraktionstätigkeit und stellte den Wert des letzteren Index wieder her.
Beispiel 4. Wirkung des Tetrapeptids auf den Verlauf einer Adrenalin-Dystrophie im Rattenmyokard.
Das Experiment wurde an 30 weißen Mischlingsratten mit einem Körpergewicht von 180–200 g durchgeführt. Die Tiere wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt, die jeweils aus 10 Tieren bestanden. Adrenalin-Dystrophie wurde induziert, indem man die frische Adrenalinlösung ("Serva", USA) intraperitoneal in einer Dosis von 2 mg/kg verabreichte. Die Kontrolltiere erhielten 0,9%ige NaCl-Lösung. Dann wurden die Versuchstiere in 1 bzw. 5 Stunden mit dem Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg in einer Dosis von 0,05 μg pro Tier in steriler 0,9%iger NaCl-Lösung behandelt. In 4 Stunden seit Beginn des Experiments wurden Herzmuskelbiopsien, die ungefähr 10 mg wogen, zur Bestimmung der Aktivität der Herz-Dehydrogenasen und des Glycogengehalts im Myokard entnommen. In 24 Stunden wurden die Tiere durch schnelles Köpfen getötet. Fragmente der linken Herzkammer wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren. In kryostatischen Schnitten wurden die Aktivität von Succinat-Dehydrogenase (SDH) sowie NADN-Dehydrogenase (NADN-DH), Lactat-Dehydrogenase und der Glycogengehalt histochemisch bestimmt.
Die Untersuchungsergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt.
Die Untersuchungen zeigten, dass die Verabreichung des Tetrapeptids in Verbindung mit einer starken adrenergischen Stimulation des Myokards die Intensität des POL-Vorgangs, der in diesem Modell einer der Myokardschädigungsfaktoren ist, zuverlässig senkt. In 24 Stunden nach der Induktion der Myokarddystrophie wurde die Menge an Dien-Konjugaten im Myokard von Versuchstieren im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant auf den Normalwert reduziert (110 ± 17 bzw. 176 ± 24 nmol/g Gewebe, p < 0,05).
Eine histochemische Untersuchung der Dehydrogenase-Aktivität und des Glycogengehalts im Myokardgewebe während der ersten Stunden seit der Adrenalinverabreichung (Tabelle 5) zeigten, dass das Tetrapeptid die Aktivität von Lactat-Dehydrogenase signifikant senkt, was zur Reduktion der Acidose und zur besseren Aufrechterhaltung des Herzmuskels unter Bedingungen der Sauerstoffknappheit beiträgt. Dies wird durch die zurückgehaltene Glycogenmenge im Herzen von Ratten, die das Tetrapeptid erhielten, im Vergleich zu den Kontrolltieren bestätigt (0,168 ± 0,021 bzw. 0,112 ± 0,017 relative Einheiten der optischen Dichte).
Die Verabreichung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg hat also eine schützende Wirkung in Bezug auf den Adrenalineinfluss auf enzymatische Systeme des Organismus, was eine Senkung der übermäßigen Intensität der Lipid-Peroxidationsvorgänge und eine Reduktion der Entwicklung einer kleinherdigen nekrobiotischen Adrenalin-Myokarddystrophie ermöglicht.
Beispiel 5. Schützende Aktivität des Tetrapeptids bei experimenteller toxikochemischer Myokardiopathie im Falle einer Vergiftung durch Tetramethylthiuramdisulfid.
Das Experiment wurde an 40 weißen Mischlingsratten mit einem Körpergewicht von 220–230 g durchgeführt. Die Tiere wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt. Die Vergiftung von Tieren mit dem Industriegift Tetramethylthiuramdisulfid (TMTD) wurde in Form eines 20-tägigen Verlaufs der intragastralen Verabreichung einer 5%igen Öl-TMTD-Lösung in einer Dosis von 25 mg/kg durchgeführt. Das Tetrapeptid wurde während der letzten 10 Tage des Experiments intramuskulär in einer Dosis von 0,05 μg pro Tier in steriler 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht. Nach Ablauf der angegebenen Fristen wurden sowohl die Kontroll- als auch die Versuchstiere durch schnelles Köpfen getötet. Myokardfragmente wurden mit 12%iger Formalinlösung fixiert. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin sowie nach Van Gison, Brachet, mit Sudan III, IV angefärbt. Intakte Tiere dienten als Kontrolle.
Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 6 gezeigt.
Eine morphologische Untersuchung zeigte die korrigierende Wirkung des Tetrapeptids im Falle einer Vergiftung der Tiere mit TMTD-Industriegift. Die Ergebnisse einer histologischen und morphometrischen Studie zeigten, dass die Verabreichung des Tetrapeptids an die intakten Tiere die Füllung des Myokards sowie das Volumen von Zellkernen der Kardiomyocyten irgendwie erhöhte (um 11% bzw. 14%). Gegen den Hintergrund des schädlichen Einflusses von TMTD trug dieses Präparat signifikant zur Wiederherstellung des Zellkern-Cytoplasma-Verhältnisses (von 0,16 ± 0,02 unter Vergiftungsbedingungen auf 0,28 ± 0,03) bei, reduzierte das Stromavolumen (von 0,218 ± 0,01 cm³/cm³ bei vergifteten Tieren auf 0,180 ± 0,02 cm³/cm³) und erhöhte das Parenchymvolumen auf die Normalwerte.
Die Studie zeigte also, dass das Tetrapeptid die Myokardstruktur wiederherstellt und die Hauptvolumenverhältnisse im Herzmuskel von vergifteten Tieren normalisiert. Dies ist ein Beweis für die positive Wirkung des Präparats auf die beschleunigte Wiederherstellung der Herzfunktion im Falle einer Vergiftung durch Industriegift.
Beispiel 6. Wirkung des Tetrapeptids auf die Entwicklung und das Ergebnis einer Chlor-Calcium-Arrhythmie bei Ratten.
Das Experiment wurde an 60 weißen Mischlingsratten mit einem Körpergewicht von 180–200 g durchgeführt. Die Tiere wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt, die jeweils aus 10 Tieren bestanden. Die Ratten wurden mit Urethan narkotisiert und erhielten 220 mg/kg 10%ige CaCl₂-Lösung. Den Tieren wurde das Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg intraperitoneal einmal in einer Dosis von 0,05–1,0 μg/kg in steriler 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht.
Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass 0,2 μg/kg die effizienteste Dosis ist. Das Tetrapeptid senkt die Todesrate der Tiere, reduziert signifikant die Häufigkeit der Entwicklung von Kammerflimmern, erhöht die Häufigkeit der Wiederherstellung des Sinusrhythmus nach der ersten CaCl₂-Verabreichung sowie einer tolerierbaren Arrhythmogendosis. Das Präparat trug in Dosen von 0,2 μg/kg und 0,5 μg/kg zur Normalisierung der Häufigkeit von Herzkontraktionen (FHC) bei: In diesem Fall zeigten bradykardische Ratten eine FHC-Erhöhung um 12,3–48,6%, und Ratten mit anfänglicher Tachykardie zeigten eine FHC-Abnahme auf die normalen Grenzen, verursacht durch das Tetrapeptid.
Die Verabreichung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg trägt also zur Normalisierung der Herzfunktion im Falle einer Arrhythmie bei.
Beispiel 7. Wirkung des Tetrapeptids auf das Wachstum von organotypischen Herzkulturexplantaten von pubertierenden Ratten.
Herzgewebeexplantate (aus der linken und rechten Kammer) von pubertierenden Wistar-Ratten wurden in Petri-Schalen mit Collagen-Bodenabdeckung kultiviert. Das Nährmedium bestand aus 35% Eagle-Medium, 35% Hank-Lösung, 25% fetalem Kälberserum und 5% Hühnerembryonenextrakt mit hinzugefügter Glucose, Insulin, Gentamicin und Glutamin. Das Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg wurde in festen Konzentrationen von 0,01 bis 20,0 ng pro ml Nährmedium in das Kulturmedium gegeben. Nach 3 Tagen Inkubation bei einer Temperatur von 37°C wurde die Erhöhung der Fläche der Explantate mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops bestimmt. Die biologische Aktivität des Präparats wurde als Änderung des Quadratindex (SI) der Explantate, die in dem Medium, das das Peptid enthielt, kultiviert wurden, im Vergleich zur Kontrolle ausgedrückt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 8 aufgeführt, die zeigt, dass das Tetrapeptid Ala-Glu-Asp-Arg das Wachstum von organotypischen Herzkulturexplantaten in einem weiten Konzentrationsbereich stimuliert. In der Zone des intensiven Wachstums unter dem Einfluss des Tetrapeptids wurden abwandernde Myokardiocyten mit großen runden Zellkernen, die für unreife Myokardiocyten charakteristisch sind, sowie Endothelzellen und Fibroblasten gefunden. Ein immunhistochemisches Verfahren zum Nachweis von proliferativem Zellkernantigen (PCNA) mit anschließender Computeranalyse von mikroskopischen Bildern zeigte, dass die Verstärkung des zellproliferativen Potentials die Hauptrolle bei der Wirkung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg spielt.
Die Verabreichung des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg trägt also zur beschleunigten Erneuerung der normalen Kardiomyocytenpopulation bei und stimuliert somit die Funktion des Myokardgewebes.
Beispiel 8. Wirkung des Tetrapeptids auf die Bioenergetik von Kardiomyocyten.
Kardiomyocyten wurden nach Vahouny aus dem Herzmuskel von pubertierenden Ratten extrahiert. Der Sauerstoffverbrauch durch isolierte Kardiomyocyten wurde polarographisch bei einer Temperatur von 30°C aufgezeichnet. Ein Teil der Kardiomyocytensuspension wurde 1–3 Stunden lang bei Raumtemperatur durch Sättigung mit Carbogen oxygeniert. Der andere Teil der Suspension wurde nicht oxygeniert (Bedingungen einer mäßigen Hypoxie). Succinat wurde in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M hinzugefügt, und die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs zeigte das Ausmaß des Schadens für die Bioenergetik der Zellen durch Hypoxie. Das Tetrapeptid wurde in einer Konzentration von 10 ng/ml in das Medium eingeführt.
Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass die Verabreichung des Tetrapeptids in das Medium den Vorgang der Succinat-Oxidation normalisierte. So betrug der Koeffizient der Atmungsstimulation (Verhältnis der Atemfrequenz in Gegenwart von Succinat zur Anfangsatemfrequenz) unter den Hypoxiebedingungen 7,35 ± 0,26, und die Verabreichung des Tetrapeptids reduzierte diesen Index auf 1,97 ± 0,26. Inzwischen änderte sich der Sauerstoffverbrauch nicht, wenn das Tetrapeptid in eine Suspension oxygenierter Zellen gegeben wurde. Es zeigte sich, dass die Verabreichung des Tetrapeptids in das Medium die NADH₂-Oxidation durch Kardiomyocyten erhöht. Das Tetrapeptid normalisiert also die Bioenergetik von Kardiomyocyten unter den Bedingungen des Sauerstoffmangels, indem es selektiv die Oxidation von Bernsteinsäure hemmt und zur NADH₂-Oxidation beiträgt.
Zusätzliche Studien, die an Myokard-Schnitten durchgeführt wurden, welche von verschiedenen Tieren entnommen wurden, zeigten die hemmende Wirkung des Tetrapeptids auf die Aktivität von Succinat-Dehydrogenase, die im Falle einer Hypoxie vermutlich dem schützenden Einfluss des Tetrapeptids auf Atemvorgänge in Myokardzellen unterliegt.
Beispiel 9. Untersuchung der gewöhnlichen Toxizität des Tetrapeptids
Die gewöhnliche Toxizität des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg wurde im Einklang mit den Erfordernissen untersucht, die im "Manual for experimental (pre-clinical) study of new pharmaceutical substances" (2000) genannt sind: akute Toxizität im Falle einer einmaligen Verabreichung der Substanz sowie subakute und chronische Toxizität im Falle einer langfristigen Verabreichung des Tetrapeptids.
Das Experiment, das auf die Untersuchung der akuten Toxizität abzielte, wurde an 66 weißen männlichen Mischlingsmäusen mit einem Körpergewicht von 20–23 g durchgeführt. Die Tiere wurden zufällig in 6 gleiche Gruppen eingeteilt. Die Substanz wurde einmal intramuskulär in einem Volumen von 0,25 ml in Dosen von 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg und 5 mg/kg in steriler 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht. Die Kontrolltiere erhielten 0,9%ige NaCl-Lösung.
Die Untersuchung der subakuten Toxizität wurde an 60 weißen männlichen Mischlingsratten mit einem Körpergewicht von 160–240 g durchgeführt. Die Versuchstiere erhielten 90 Tage lang täglich einmal pro Tag intramuskulär die Substanz in Dosen von 1 μg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg in 0,5 ml 0,9%iger NaCl-Lösung. Die Kontrolltiere erhielten 0,9%ige NaCl-Lösung in demselben Volumen. Vor der Verabreichung der Substanz sowie am 30., 60. und 90. Tag nach Beginn des Verlaufs wurden die morphologische Zusammensetzung und die Eigenschaften des peripheren Bluts der Tiere untersucht. Nach Beendigung des Experiments wurden die biochemischen und koagulologischen Indices des Bluts der Tiere untersucht.
Die Untersuchungen der chronischen Toxizität wurden 6 Monate lang auf der Basis der Dauer der empfohlenen klinischen Verabreichung des Präparats an 96 männliche Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 300–340 g durchgeführt. Die experimentellen Tiere erhielten das Tetrapeptid 6 Monate lang täglich einmal am Tag intramuskulär in Dosen von 1 μg/kg, 0,1 mg/kg und 1 mg/kg in 0,5 ml 0,9%iger NaCl-Lösung. Die Kontrolltiere erhielten 0,9%ige NaCl-Lösung in demselben Volumen und nach demselben Zeitplan. Für die Bestimmung der Menge an Erythrocyten, Hämoglobin, Reticulocyten, Thrombocyten, Leukocyten sowie der Leukocytenformel, Erythrocytensedimentationsrate (ESR) und Erythrocytenresistenz im peripheren Blut der Tiere wurden übliche Verfahren verwendet. Neben diesem allgemeinen Proteingehalt im Blut wurde das Serum nach dem Verfahren von Lowry eingeschätzt, und Kalium und Natrium wurden mit Hilfe des Verfahrens der Plasmaspektrophotometrie bestimmt. Nach Beendigung des Experiments wurde die pathomorphologische Untersuchung des Gehirns und Rückenmarks, der Rückenmarksganglien, der Schilddrüse, der Nebenschilddrüsen, Nebennieren, Hoden, der Hypophyse, des Herzens, der Lungen, der Aorta, Leber, Niere, Harnblase, des Pankreas, Magens, Dünndarms, Dickdarms, Thymus, der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks durchgeführt.
Eine Untersuchung der akuten Toxizität zeigte, dass eine einmalige Verabreichung des Tetrapeptids an die Tiere in einer Dosis, die die für die klinische Verabreichung empfohlene therapeutische Dosis um das 5000-fache überstieg, keine toxischen Reaktionen verursacht, was die große therapeutische Bandbreite der Substanz beweist.
Die Untersuchung der subakuten und chronischen Toxizität des Tetrapeptids zeigt das Fehlen von Nebenwirkungen im Falle einer langfristigen Verabreichung der Substanz in den Dosen, die die therapeutischen Dosen um das 100- bis 1000-fache überschreiten. Die Untersuchung der Wirkung des Tetrapeptids auf die morphologische Zusammensetzung von Meerschweinchenblut zeigte die Erhöhung der Leukocytenmenge in 3 und 6 Monaten nach Beginn der Verabreichung der Substanz (Tabelle 9). Die anderen Indices, die die morphologische Zusammensetzung des Bluts der Tiere widerspiegeln, blieben großenteils unver ändert. Es wurde kein signifikanter Einfluss des Präparats auf die ESR sowie auf die Erythrocytenresistenz und auf die biochemischen Indices des Blutserums beobachtet.
Die Bewertung des allgemeinen Status der Tiere sowie der morphologischen und biochemischen Indices des peripheren Bluts, des morphologischen Status von inneren Organen, des Status des Herz-Kreislauf- und des Atemsystems, der Leber- und Nierenfunktion zeigte keine pathologischen Veränderungen in dem Organismus.

Das Fehlen einer allgemeinen Toxizität erlaubt es, die pharmazeutische Substanz, die das Tetrapeptid als Peptidwirkstoff enthält, für klinische Studien zu empfehlen. Tabelle 1

Index	Kontrolle		Tetrapeptid
Index	6 Stunden	24 Stunden	6 Stunden	24 Stunden
Größe der Nekrosezone, % der Kammermasse	44,1 ± 1,7	56,2 ± 1,4	38,1 ± 1,8*	49,6 ± 1,6*
Todesrate	7	2	2	1
Gehalt im Blutserum:
– Glucose, mmol/l	4,55 ± 0,23	3,9 ± 0,15	3,12 ± 0,09	3,01 ± 0,11
– LDH, nmol/s·l	311 ± 11	252 ± 19	309 ± 16	201 ± 15*
– CPK, nmol/s·l	1326 ± 64	1073 ± 24	961 ± 52*	923 ± 38
Glycogengehalt im Myokard, g/kg des Gewebes	0,36 ± 0,07	0,38 ± 0,06	1,05 ± 0,12*	1,18 ± 0,12**

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle;
** p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle.

Indices und experimentelle Bedingungen	vor der Ischämie	Reperfusion
Indices und experimentelle Bedingungen	vor der Ischämie	15 min	30 min
Amplitude der Kontraktionen, % des Anfangswerts
– Kontrolle	100	72 ± 9	75 ± 8
– Tetrapeptid (0,002 μg/ml)	100	70 ± 13	81 ± 16
– Tetrapeptid (0,005 μg/ml)	100	89 ± 6*	93 ± 5*
– Tetrapeptid (0,01 μg/ml)	100	61 ± 4*	64 ± 3*
– Tetrapeptid (0,05 μg/ml)	100	38 ± 13*	32 ± 9*
MDA, nmol/g Gewebe
– Kontrolle	230 ± 12	195 ± 23	201 ± 19
– Tetrapeptid (0,002 μg/ml)	225 ± 23	216 ± 5	220 ± 12
– Tetrapeptid (0,005 μg/ml)	168 ± 25*	231 ± 7	186 ± 10
– Tetrapeptid (0,01 μg/ml)	203 ± 18	248 ± 8	220 ± 9
– Tetrapeptid (0,05 μg/ml)	156 ± 28*	264 ± 13*	252 ± 11*
Energiebeladung (μmol Adenosinphosphate/g Gewebe)
– Kontrolle	7,56 ± 0,25	-	3,32 ± 0,16
– Tetrapeptid (0,002–0,005 μg/ml)	7,68 ± 0,21	-	6,01 ± 0,23*
- Tetrapeptid (0,05 μg/ml)	7,78 ± 0,14	-	2,98 ± 0,35

* p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle.

Tiergruppe	Kontraktionsparameter für 10 min Reperfusion
Tiergruppe	Amplitude der Kontraktionen, des Anfangswerts	Ausmaß der Kontraktion, mm	max. Geschwindigkeit der Kontraktion, % des Anfangswerts	max. Geschwindigkeit der % des Anfangswerts	Koronardurchblutung, ml/min
Kontrolle	43 ± 7	1,2 ± 0,5	42 ± 7	46 ± 5	8,5 ± 0,4
Tetrapeptid
0,005 μg/ml	75 ± 12*	1,3 ± 0,4	56 ± 10*	69 ± 8*	10,8 ± 1,6*
0,05 μg/ml	36 ± 10*	2,5 ± 0,3	28 ± 7*	28 ± 6*	9,6 ± 0,7

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

Tiergruppe	Organ	Gehalt an Dienkonjugaten, nmol/g Gewebe	Gehalt an Malondialdehyd, nmol/g Gewebe
Kontrolle	Herz	112 ± 21	169 ± 19
Kontrolle	Leber	125 ± 18	186 ± 27
Adrenalin	Herz	176 ± 24*	153 ± 14
Adrenalin	Leber	146 ± 34	356 ± 54*
Adrenalin + Tetrapeptid	Herz	110 ± 17**	173 ± 25
Adrenalin + Tetrapeptid	Leber	92 ± 11**	270 ± 56*

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle;
** p < 0,01 im Vergleich zum Index nach der Adrenalinverabreichung.

Untersuchter Parameter	Experimentelle Bedingungen
Untersuchter Parameter	Kontrolle	Adrenalin	Adrenalin + Tetrapeptid
Glycogengehalt, rel. Einheiten der optischen Dichte	0,143 ± 0,016	0,112 ± 0,017*	0,168 ± 0,021**
Enzymaktivität im Myokardgewebe:
LDH, rel. Einheiten der optischen Dichte	0,142 ± 0,006	0,193 ± 0,10*	0,154 ± 0,011**
SDH, rel. Einheiten der optischen Dichte	0,275 ± 0,021	0,297 ± 0,012	0,284 ± 0,013
NADN-DH, rel. Einheiten der optischen Dichte	0,334 ± 0,009	0,329 ± 0,014	0,344 ± 0,019

Index	Kontrolle	Tetrapeptid	TMTD	TMTD + Tetrapeptid
Kardiomyocyten-Zellkernvolumen, μm³	336,2 ± 5,4	386,2 ± 2,1*	276,3 ± 15,9*	365,4 ± 13,8**
Stromavolumen, cm³/cm³	0,143 ± 0,03	0,159 ± 0,05	0,218 ± 0,01*	0,180 ± 0,02**
Gefäßvolumen, V_cap/V_cmc	0,06 ± 0,008	0,08 ± 0,006*	0,11 ± 0,03*	0,07 ± 0,02**
Parenchymvolumen, cm³/cm³	0,81 ± 0,03	0,82 ± 0,04	0,76 ± 0,02*	0,83 ± 0,02**
Zellkern-Cytoplasma-Verhältnis	0,29 ± 0,02	0,40 ± 0,04*	0,16 ± 0,02*	0,28 ± 0,03**

* p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle;
** p < 0,01 im Vergleich zum Index bei den Tieren, die nicht mit dem Tetrapeptid behandelt wurden;
V_cap/V_cmc = Volumenverhältnis von Kapillaren zu Kardiomyocyten

Gruppe, Präparat, Dosis	Tod nach erster Arrhythmogenverabreichung, Abs.-%	Häufigkeit der Wiederherstellung des Sinusrhythmus nach der ersten CaCl₂-Verabreichung, %	Häufigkeit der Entwicklung von Kammerflimmern im Verlauf des Experiments, %	Maximale tolerierbare Arrhythmogendosis, mg/kg
Kontrolle (CaCl₂)	7 (70)	20,0	60,0	220
Tetrapeptid in Konzentration:
0,05 μg/kg	5 (50)	27,0	60,3	220
0,1 μg/kg	5 (50)	29,6	45,8	220
0,2 μg/kg	3 (30)	49,0*	35,2*	440
0,5 μg/kg	4 (40)	39,5*	39,1*	440
1,0 μg/kg	6 (60)	16,3	43,6	220

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

Index	Konzentration des Tetrapeptids, ng/ml
Index	0,01	0,05	0,1	0,5	1,0	2,0	10,0	20,0
SI, % in Bezug auf die Kontrolle	10	20*	22*	20*	15*	20*	27*	8

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

Index	Verabreichung des Tetrapeptids (1 μg/kg)
	3 Monate		6 Monate
	Kontrolle (n = 24)	Tetrapeptid (n = 24)	Kontrolle (n = 24)	Tetrapeptid (n = 24)
Erythrocyten, × 10¹²/l	5,3 ± 0,6	5,4 ± 0,2	5,4 ± 0,3	5,2 ± 0,4
Hämoglobin, g/l	14,2 ± 1,4	13,8 ± 1,2	14,5 ± 1,3	14,2 ± 0,6
Reticulocyten, %	1,3 ± 0,07	1,2 ± 0,07	1,1 ± 0,05	1,3 ± 0,08
Thrombocyten, × 10⁹/l	143,7 ± 7,9	143,6 ± 8,4	144,5 ± 8,6	144,9 ± 9,8
Leukocyten, × 10⁹/l	9,4 ± 0,5	11,2 ± 0,8*	9,6 ± 0,5	11,9 ± 0,5*
stabkernige neutrophile Granulocyten,	0,31 ± 0,04	0,27 ± 0,07	0,33 ± 0,04	0,36 ± 0,05
segmentkernige neutrophile Granulocyten,	45,8 ± 2,1	44,9 ± 2,5	46,2 ± 3,5	43,4 ± 3,2
Eosinophile, %	0,69 ± 0,05	0,64 ± 0,04	0,72 ± 0,04	0,75 ± 0,08
Basophile, %	0,61 ± 0,04	0,69 ± 0,05	0,72 ± 0,03	0,71 ± 0,05
Monocyten, %	2,5 ± 0,02	2,4 ± 0,03	2,6 ± 0,06	2,5 ± 0,05
Lymphocyten, %	48,9 ± 2,5	50,7 ± 2,4	51,3 ± 2,7	52,7 ± 2,2
ESR, mm/Stunde	1,69 ± 0,05	1,87 ± 0,07	2,01 ± 0,05	2,05 ± 0,04
Erythrocytenresistenz, % NaCl
– maximal	0,41 ± 0,02	0,43 ± 0,04	0,42 ± 0,04	0,44 ± 0,04
– minimal	0,32 ± 0,05	0,33 ± 0,02	0,34 ± 0,04	0,35 ± 0,05
Allgemeines Protein im Blutserum, g/l	72,9 ± 3,1	72,6 ± 3,3	73,1 ± 3,4	73,1 ± 3,6
Natrium im Blutserum, mmol/l	153,9 ± 5,7	154,8 ± 6,8	155,5 ± 6,2	154,6 ± 6,9
Kalium im Blutserum, mmol/l	5,1 ± 2,3	5,3 ± 1,8	5,2 ± 2,1	5,4 ± 2,2

* p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

Sequenzprotokoll

Claims

Tetrapeptid Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg [SEQ ID Nr. 1].
Tetrapeptid Alanyl-glutamyl-aspartyl-arginin mit der allgemeinen Formel Ala-Glu-Asp-Arg [SEQ ID Nr. 1], das biologische Aktivität zeigt, die sich in der Wiederherstellung der Funktion des Myokards äußert.
Pharmazeutische Substanz von peptidischer Natur, die die Funktion des Myokards wiederherstellt, die den Peptidwirkstoff und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthält und die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine wirksame Menge des Tetrapeptids Ala-Glu-Asp-Arg [SEQ ID Nr. 1] als Peptidwirkstoff enthält.
Substanz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die parenterale oder orale Verabreichung vorgesehen ist.