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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren
von 4-Aminothalidomid. Solche
Enantiomere können
verwendet werden, um eine unerwünschte
Angiogenese in einem Menschen oder Tier zu verhindern. Genauer können solche
Enantiomere verwendet werden, um eine unerwünschte Angiogenese, insbesondere
bei von Angiogenese abhängigen
oder damit verbundenen Krankheiten, durch die Verabreichung von
Enantiomeren von 4-Aminothalidomid zu verhindern.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Unter
Angiogenese versteht man die Bildung neuer Blutgefäße in ein
Gewebe oder Organ hinein. Unter normalen physiologischen Bedingungen
läuft die
Angiogenese bei Menschen und Tieren nur in sehr spezifischen, beschränkten Situationen
ab. Zum Beispiel wird die Angiogenese normalerweise bei der Wundheilung,
bei der fötalen
und embryonalen Entwicklung und bei der Bildung des Corpus luteum,
des Endometriums und der Plazenta beobachtet.
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Die
Angiogenese wird über
ein hochgradig reguliertes System von angiogenen Stimulatoren und
Inhibitoren gesteuert. Von der Steuerung der Angiogenese wurde festgestellt,
dass sie bei bestimmten Krankheitszuständen verändert ist, und dass in vielen
Fällen
ein mit den Krankheiten verbundener pathologischer Schaden mit einer
ungesteuerten Angiogenese zusammenhängt. Sowohl von gesteuerter
als auch ungesteuerter Angiogenese glaubt man, dass sie auf eine ähnliche
Weise fortschreiten. Endotheliale Zellen und Perizyten, die von
einer Basalmembran umgeben sind, bilden Kapillarblutgefäße. Die
Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme,
die von endothelialen Zellen und Leukozyten freigesetzt werden.
Anschließend
durchtreten endotheliale Zellen, die das Lumen von Blutgefäßen auskleiden,
dann die Basalmembran. Angiogene Stimulanzien induzieren die endothelialen
Zellen, die erodierte Basalmembran zu durchwandern. Die wandernden
Zellen bilden ein von dem Elternblutgefäß abgehenden „Keim", bei dem die endothelialen
Zellen die Mitose durchlaufen und proliferieren. Die endothelialen
Keime fusionieren miteinander, um Kapillarschleifen zu bilden und
dabei ein neues Blutgefäß zu bilden.
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Eine
hartnäckige,
unregulierte Angiogenese tritt bei vielen Krankheitszuständen, Tumormetastasen und
dem abnormalem Wachstum von endothelialen Zellen auf. Die diversen
pathologischen Krankheitszustände,
bei denen eine unregulierte Angiogenese vorliegt, wurden zusammen
als von Angiogenese abhängige oder
mit Angiogenese verbundene Krankheiten eingruppiert.
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Ein
Beispiel einer durch Angiogenese vermittelten Krankheit ist die
okulare neovaskuläre
Krankheit. Diese Krankheit ist durch das Eindringen neuer Blutgefäße in Strukturen
des Auges, wie beispielsweise die Retina oder Cornea, gekennzeichnet.
Sie ist die häufigste
Ursache für
Blindheit und an ungefähr
zwanzig Augenkrankheiten beteiligt. Bei der altersabhängigen Makuladegeneration
werden die mit ihr verbundenen visuellen Probleme durch ein Einwachsen
von Aderhautkapillaren durch Schäden
in der Bruch'schen
Membran mit einer Proliferation von fibrovaskulärem Gewebe unter dem Netzhautpigmentepithel
verursacht. Auch diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, corneale
Transplantatabstoßung,
neovaskuläres
Glaukom und retrolentale Fibroplasie sind mit angiogenem Schaden
verbunden. Andere Krankheiten, die mit einer cornealen Gefäßneubildung
verbunden sind, umfassen epidemische Keratokonjunktivitis, Vitamin
A-Mangel, übermäßiges Tragen
von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, oben liegende limbische
Keratitis, ptegyriale Keratitis sicca, Sjögren'sche Krankheit, Akne rosacea, Phylectenulose,
Syphilis, Infektionen mit Mycobakterien, Lipiddegeneration, chemische
Verbrennungen, bakterielle Geschwüre, Pilzgeschwüre, Herpes
simplex-Infektion, Herpes zoster-Infektionen, Infektionen mit Protozoen,
Kaposi-Sarkom, Mooren'sches
Geschwür,
Terrien'sche marginale
Degeneration, marginale Keratolyse, rheumatoide Arthritis, systemischer
Lupus, Polyarteriitis, Trauma, Wegener'sche Sarkoidose, Skleritis, Stevens-Johnson
Krankheit, Pemphigoid und radiale Keratotomie.
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Mit
einer Gefäßneubildung
der Retina/Aderhaut verbundene Krankheiten umfassen diabetische
Retinopathie, Makuladegeneration, Sichelzellenanämie, Sarkoidose, Syphilis,
Pseudoxanthoma elasticum, Paget'sche
Krankheit, Venenverschluss, Arterienverschluss, obstruktive Karotiskrankheit,
chronische Uveitis/Glaskörperentzündung, Infektionen
mit Mycobakterien, Lyme'sche
Krankheit, systemischen Lupus erythematosis, Frühgeborenenretinopathie, Eales'sche Krankheit, Behcet'sche Krankheit, Retinitis
oder Choroiditis verursachende Infektionen, angenommene okulare
Histoplasmosis, infantile Makuladegeneration, Myopie, Sehnerventrichter,
Stargardt'sche Krankheit,
granulomatöse
Uveitis der Pars plana, chronisches Ablösen der Retina, Hyperviskositätssyndrome,
Toxoplasmose, Trauma und Komplikationen nach einer Laserbehandlung. Andere
die Augen betreffende Krankheiten umfassen Krankheiten, die mit
Rubeosis (Gefäßneubildung
des Angulus) und durch die abnormale Proliferation von fibrovaskulärem oder
fibrösem
Gewebe verursachte Krankheiten, die alle Formen von fruchtbarer
Vitreoretinopathie umfassen.
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Eine
andere mit Angiogenese verbundene Krankheit ist die rheumatoide
Arthritis. Die Blutgefäße in der
Synovialauskleidung der Gelenke durchlaufen Angiogenese. Zusätzlich zum
Bilden neuer vaskulärer
Netzwerke setzen die endothelialen Zellen Faktoren und reaktive
Sauerstoffspezies frei, die zu einem Wachstum des Pannus und zu
einer Knorpelzerstörung
führen.
Die Angiogenese kann auch bei der Osteoarthritis eine Rolle spielen.
Die Aktivierung der Chondrozyten durch die Angiogenese betreffende
Faktoren trägt
zur Zerstörung
des Gelenkes bei. In einer späteren
Phase fördern
die angiogenen Faktoren ein neues Knochenwachstum. Ein therapeutisches
Eingreifen, das die Knochenzerstörung
verhindert, könnte
das Fortschreiten der Krankheiten anhalten und Personen, die an
Arthritis leiden, Erleichterung verschaffen.
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An
einer chronischen Entzündung
kann auch eine pathologische Angiogenese beteiligt sein. Krankheiten
wie beispielsweise Colitis ulcerosa und Crohn'sche Krankheit zeigen mit dem Einwachsen
neuer Blutgefäße und den
entzündeten
Geweben histologische Veränderungen.
Die Bartonelose, eine bakterielle Infektion, die in Südamerika
gefunden wird, kann zu einer chronischen Phase führen, die durch eine Proliferation vaskulärer endothelialer
Zellen gekennzeichnet ist. Bei der Atheriosklerose wird eine weitere
pathologische Rolle festgestellt, die mit der Angiogenese verbunden
ist. Von den innerhalb des Lumens von Blutgefäßen gebildeten Plaques wurde
gezeigt, dass sie eine angiogene stimulierende Aktivität aufweisen.
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Die
Hypothese, dass das Wachstum von Tumoren von der Angiogenese abhängt, wurde
erstmalig 1971 vorgeschlagen. (Folkman, New Eng. J. Med., 285:1182–86 (1971)).
In ihrer einfachsten Form sagt diese Hypothese Folgendes aus: „Wenn erstmal
eine „Annahme" eines Tumors stattgefunden
hat, muss jeder Zunahme der Tumorzellpopulation eine Zunahme neuer
Kapillaren vorangehen, die im Tumor zusammenlaufen." Unter der Tumor-„Annahme” versteht
man zurzeit, dass sie eine vorvaskuläre Phase von Tumorwachstum
anzeigt, in der eine Population von Tumorzellen, die einige Kubikmillimeter
Volumen einnehmen und einige Millionen Zellen nicht überschreiten,
auf der Grundlage von vorhandenen Mikrogefäßen des Wirtes überleben kann.
Die Erweiterung des Tumorvolumens über diese Phase hinaus erfordert
die Induktion neuer Kapillarblutgefäße. Zum Beispiel waren pulmonare
Mikrometastasen in der frühen
vorvaskulären
Phase in Mäusen
außer durch
Mikroskopieuntersuchungen mit hoher Auflösung an histologischen Schnitten
nicht nachweisbar.
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Beispiele
für die
indirekten Belege, die dieses Konzept stützen, umfassen:
Die Wachstumsgeschwindigkeit
von in subkutane durchsichtige Kammern in Mäusen implantierten Tumoren ist
vor der Gefäßneubildung
langsam und linear und nach der Gefäßneubildung schnell und nahezu
exponentiell (Algire, et al., J. Nat. Cancer Inst., 6:73–85 (1945)).
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In
isolierten perfundierten Organen herangezogene Tumore, wo Blutgefäße nicht
proliferieren, sind auf 1–2
mm3 begrenzt, aber expandieren schnell auf
das mehr als 1000-fache
dieses Volumens, wenn sie in Mäuse
transplantiert werden und eine Gefäßneubildung stattfindet (Folkman,
et al., Annals of Surgery, 164:491–502 (1966)).
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Das
Tumorwachstum in der gefäßlosen Cornea
schreitet langsam und mit einer linearen Geschwindigkeit voran,
aber wechselt nach der Gefäßneubildung
zu exponentiellem Wachstum (Gimbrone, Jr., et al., J. Nat. Cancer
Inst., 52:421–27
(1974)).
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In
der wässrigen
Flüssigkeit
der anterioren Kammer des Kaninchenauges suspendierte Tumoren bleiben
lebensfähig,
gefäßlos und
auf eine Größe von < 1 mm3 beschränkt. Sobald
sie in das vaskuläre
Bett der Iris transplantiert werden, findet eine Gefäßneubildung
statt und sie wachsen schnell und erreichen innerhalb von 2 Wochen
das 16 000-fache ihres ursprünglichen
Volumens (Gimbrone, Jr., et al., J. Exp. Med., 136:261–76).
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Wenn
Tumore auf die Chorioallantoismembran des Hühnerembryos implantiert werden,
wachsen sie während
einer gefäßlosen Phase
von > 72 Stunden langsam, überschreiten
aber nicht einen mittleren Durchmesser von 0,93 + 0,29 mm. 24 Stunden
nach dem Beginn der Gefäßneubildung
tritt eine schnelle Tumorerweiterung auf, und bis zum Tag 7 erreichen
diese vaskularisierten Tumore einen mittleren Durchmesser von 8,0
+ 2,5 mm (Knighton, British J. Cancer, 35:347–56 (1977)).
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Vaskuläre Abdrücke von
Metastasen in der Kaninchenleber zeigen eine Heterogenität bei der
Größe der Metastasen,
zeigen aber einen vergleichsweise einheitlichen Endpunkt hinsichtlich
der Größe, bei
der die Gefäßbildung
vorliegt. Tumore sind im Allgemeinen bis zu einem Durchmesser von
1 mm gefäßlos, unterliegen aber
bei einem größeren als
diesem Durchmesser einer Gefäßneubildung
(Lien, et al., Surgery, 68:334–40 (1970)).
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Bei
transgenen Mäusen,
die Karzinome in den Betazellen der Langerhans'schen Inseln entwickeln, sind prävaskuläre hyperplastische
Inseln auf ein Größe von < 1 mm begrenzt.
Im Alter von 6–7
Wochen unterliegen 4–10%
der Inseln einer Gefäßneubildung
und aus diesen Inseln entstehen große vaskularisierte Tumore mit
einem Volumen, das mehr als das 1000-fache des Volumens der vorvaskulären Inseln
umfasst (Folkman, et al., Nature, 339:58–61 (1989)).
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Ein
spezifischer Antikörper
gegen VEGF (vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor) verringert die Dichte der Mikrogefäße und bewirkt
eine „signifikante
oder dramatische" Inhibition
des Wachstums von drei menschlichen Tumoren, die von VEGF als ihrem
einzigen Vermittler der Angiogenese abhängen (bei Nacktmäusen). Der
Antikörper
inhibiert das Wachstum der Tumorzellen in vitro nicht (Kim et al.,
Nature, 362:841–44 (1993)).
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Ein
monoklonaler anti-bFGF-Antikörper
bewirkt eine 70%-ige Inhibition des Wachstums eines Maustumors,
der von der Sekretion von bFGF als seinem einzigen Vermittler der
Angiogenese abhängt.
Der Antikörper
inhibiert nicht das Wachstum der Tumorzellen in vitro. (Hori, et
al., Cancer Res., 51:6180–84
(1991)).
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Eine
intraperitoneale Injektion von bFGF verstärkt das Wachstum eines primären Tumors
und seiner Metastasen durch das Stimulieren des Wachstums von endothelialen
Kapillarzellen in dem Tumor. Den Tumorzellen selbst fehlen Rezeptoren
für bFGF,
und bFGF ist in vitro kein Mitogen für die Tumorzellen (Gross, et
al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 31:79 (1990)).
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Ein
spezifischer Inhibitor der Angiogenese (AGM-1470) inhibiert das
Wachstum von Tumoren und Metastasen in vivo, ist aber beim Inhibieren
der Tumorzellproliferation in vitro viel weniger aktiv. Er inhibiert
die Proliferation von vaskulären
endothelialen Zellen halbmaximal 4 Logarithmen unter der Konzentration,
bei der er die Proliferation von Tumorzellen inhibiert (Ingber,
et al., Nature, 48:555–57
(1990)). Es gibt auch indirekte klinische Belege dafür, dass
ein Tumorwachstum von der Angiogenese abhängig ist.
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Menschliche
Retinoblastome, die hinsichtlich des Glaskörper metastatisch sind, entwickeln
sich zu gefäßlosen Sphäroiden,
die trotz der Tatsache, dass sie lebensfähig sind und 3H-Thymidin einbauen
(wenn sie aus einem eingekapselten Auge entfernt und in vitro analysiert
werden) auf weniger als 1 mm3 beschränkt sind.
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Karzinome
der Ovarien metastasieren zu der peritonealen Membran in der Form
von winzigen gefäßlosen weißen Samen
(1–3 mm3). Diese Implantate wachsen selten auf eine
größere Größe heran,
bis eines oder mehr als eines von ihnen einer Gefäßneubildung
unterliegt.
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Die
Intensität
der Gefäßneubildung
beim Brustkrebs (Weidner, et al., New Eng. J. Med., 324:1–8 (1991);
Weidner, et al., J. Nat. Cancer Inst., 84:1875–87 (1992)) und beim Prostatakrebs
(Weidner, et al., Am. J. Pathol., 143(2):401–09 (1993)) korreliert stark
mit dem Risiko einer zukünftigen
Metastase.
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Eine
Metastase aus menschlichem Hautmelanom tritt vor einer Gefäßneubildung
selten auf. Der Beginn der Gefäßneubildung
führt zu
einer größeren Dicke
der Verletzung und zu einem erhöhten
Risiko einer Metastase (Srivastava, et al., Am. J. Pathol., 133:419–23 (1988)).
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Beim
Blasenkrebs ist die Konzentration eines angiogenen Proteins, bFGF,
im Urin ein empfindlicherer Indikator des Status und des Ausmaßes der
Krankheit als die Zytologie. (Nguyen, et al., J. Nat. Cancer Inst., 85:241–42 (1993)).
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Somit
ist es klar, dass die Angiogenese bei der Metastase von Krebs eine
wesentliche Rolle spielt. Wenn die angiogene Aktivität unterdrückt oder
beseitigt werden könnte,
dann würde
der Tumor nicht wachsen, obwohl er anwesend ist. Im Krankheitszustand
könnte
die Verhinderung von Angiogenese den durch die Invasion des neuen
mikrovaskulären
Systems verursachten Schaden abwenden. Auf die Steuerung der angiogenen
Vorgänge
gerichtete Therapien könnten
zum Abbruch oder Abwenden dieser Krankheiten führen.
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Die
Angiogenese wurde mit einer Anzahl verschiedener Krebsarten in Zusammenhang
gebracht, einschließlich
solider Tumoren und hämatogenen
Tumoren. Solide Tumore, mit denen die Angiogenese in Verbindung
gebracht wurde, umfassen Rhabdomyosarkome, Retinoblastom, Ewing-Sarkom,
Neuroblastom und Osteosarkom. Die Angiogenese ist auch mit hämatogenen
Tumoren verbunden, wie beispielsweise Leukämien, Lymphomen, multiplen
Myelomen und jeglichen der verschiedenen akuten oder chronischen
neoplastischen Krankheiten des Knochenmarks, bei denen eine unbeschränkte Proliferation
weißer
Blutzellen stattfindet, die normalerweise von einer Anämie, gestörten Blutgerinnung
und Vergrößerung der
Lymphknoten, der Leber und der Milz begleitet wird. Man glaubt,
dass die Angiogenese eine Rolle bei den Abnormalitäten des Knochenmarks
spielt, die zum Entstehen von Leukämie und Lymphomtumoren und
multiplen Myelomkrankheiten führen.
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Eine
der häufigsten
angiogenen Krankheiten der Kindheit ist das Hämangiom. Ein Hämangiom
ist ein Tumor, der aus neu gebildeten Blutgefäßen zusammengesetzt ist. In
den meisten Fällen
sind die Tumore gutartig und bilden sich ohne ein Eingreifen zurück. In schwereren
Fällen
bilden sich die Tumore zu großen
kavernösen
und infiltrierenden Formen weiter und erzeugen klinische Komplikationen.
Systemische Formen von Hämangiomen,
Hämangiomatosen
weisen hohe Sterblichkeitsraten auf. Es gibt gegen Therapien resistente Hämangiome,
die mit den zurzeit verwendeten Therapeutika nicht behandelt werden
können.
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Die
Angiogenese ist auch für
den Schaden verantwortlich, der bei Erbkrankheiten, wie beispielsweise der
Osler-Weber-Rendu-Krankheit oder erblicher hämorrhagischer Teleangiektasie
festgestellt wird. Dabei handelt es sich um eine Erbkrankheit, die
durch zahlreiche kleine Angiome, Tumore des Blutes oder der Lymphgefäße gekennzeichnet
ist. Die Angiome werden in der Haut und in Schleimhautmembranen
festgestellt und werden häufig
von Epitaxie (Nasenbluten) oder gastrointestinalen Blutungen und
manchmal von pulmonaren oder hepatitischen arteriovenösen Fisteln
begleitet.
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Was
daher benötigt
wird, ist eine Zusammensetzung, die die Angiogenese inhibieren kann.
Was ebenfalls benötigt
wird, ist eine Zusammensetzung, die das unerwünschte Wachstum von Blutgefäßen, besonders bei
Tumoren, inhibieren kann.
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Die
Angiogenese ist auch an normalen physiologischen Vorgängen, wie
beispielsweise der Reproduktion und der Wundheilung, beteiligt.
Die Angiogenese ist ein wichtiger Schritt bei der Ovulation und
auch bei der Einnistung der Blastula nach der Befruchtung. Die Verhinderung
der Angiogenese könnte
verwendet werden, um eine Amenorrhoe zu induzieren, die Ovulation
zu blockieren, oder die Einnistung der Blastula zu verhindern.
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Bei
der Wundheilung kann ein übermäßiges Reparieren
oder eine Fibroplasie eine schädliche
Nebenwirkung von chirurgischen Eingriffen sein und durch Angiogenese
verursacht oder verschlimmert werden. Adhäsionen sind eine häufige Komplikation
bei chirurgischen Eingriffen und führen zu Problemen wie beispielsweise
einem Dünndarmverschluss.
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Es
wurden mehrere Verbindungen verwendet, um Angiogenese zu inhibieren.
Taylor, et al., (Nature, 297:307 (1982)) verwendeten Protamin, um
Angiogenese zu inhibieren. Die Toxizität von Protamin begrenzt seine
praktische Verwendung als Therapeutikum. Folkman, et al., (Science,
221:719 (1983) und
US-Pat. Nrs. 5,001,116 und
4,994,443 ) haben die Verwendung
von Heparin und Steroiden offenbart, um die Angiogenese zu steuern.
Von Steroiden wie beispielsweise Tetrahydrocortisol, denen eine
glucokortikosteroidartige und mineralkortikosteroidartige Aktivität fehlen,
wurde festgestellt, dass sie Inhibitoren der Angiogenese sind.
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Andere
endogen in Tieren festgestellte Faktoren, wie beispielsweise ein
4 kDa-Glycoprotein aus der Flüssigkeit
von Rinderglaskörpern
und ein von Knorpel abgeleiteter Faktor, wurden verwendet, um die
Angiogenese zu inhibieren. Zelluläre Faktoren, wie beispielsweise
Interferon, inhibieren die Angiogenese. Zum Beispiel wurde von Interferon-alpha
oder von menschlichem Interferon-beta gezeigt, dass sie die tumorinduzierte Angiogenese
in der Mausdermis, die durch menschliche neoplastische Zellen stimuliert
wird, inhibieren. Interferon-beta ist auch ein wirksamer Inhibitor
der durch allogene Milzzellen induzierten Angiogenese (Sidky, et al.,
Cancer Res., 47:5155–61
(1987)). Von rekombinantem menschlichen Interferon (alpha/A) wurde
berichtet, dass es erfolgreich bei der Behandlung von pulmonarer
Hämangiomatose
verwendet wurde, einer durch Angiogenese induzierten Krankheit (White,
et al., New Eng. J. Med., 320:1197–1200 (1989)).
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Andere
Agenzien, die verwendet wurden, um Angiogenese zu inhibieren, umfassen
Ascorbinsäureether
und verwandte Verbindungen. (Japanese Kokai Tokkyo Koho No. 58-13
(1978)). Das sulfatierte Polysaccharid DS 4152 inhibiert die Angiogenese
ebenfalls. (Japanese Kokai Tokkyo Koho No. 63-119500). Zusätzliche
anti-angiogene Verbindungen umfassen Angiostatin
® (
U.S.-Patente mit den Nummern 5,639,725 ;
5,792,845 ;
5,885,795 ;
5,733,876 ;
5,776,704 ;
5,837,682 ;
5,861,372 und
5,854,221 ) und Endostatin
TM (
U.S.-Patent Nr. 5,854,205 ).
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Die
US-Patente Nrs. 5,635,517 und
6,316,471 und das internationale
Patent Nr.
WO 98/03502 der
Celgene Corporation offenbaren substituierte 1-Oxo- und 1,3-Dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline,
von denen angegeben wird, dass sie die Konzentrationen von TNF-α in Säugetieren
verringern.
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Eine
andere Verbindung, von der gezeigt wurde, dass sie eine Angiogenese
inhibiert, ist Thalidomid (D'Amato,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:4082–85 (1994)). Thalidomid ist
ein Hypnosedativum, das erfolgreich verwendet wurde, um eine Anzahl
von mit Angiogenese verbundenen Krankheiten zu behandeln, wie beispielsweise
rheumatoide Arthritis (Gutierrez-Rodriguez,
Arthritis Rheum., 27(10):1118–21
(1984); Gutierrez-Rodriguez, et al., J. Rheumatol., 16(2):158–63 (1989)),
Behcet'sche Krankheit
(Handley, et al., Br. J. Dermatol., 127 Ergänzungsbd., 40:67–8 (1992);
Gunzler, Med. Hypotheses, 30(2):105–9 (1989)), die Graff-versus-host-Abstoßung (Field,
et al., Nature, 211(55):1308–10
(1966); Heney, et al., Br. J. Haematol., 78(1):23–7 (1991)),
mycobakterielle Krankheiten (Vicente, et al., Arch. Intern. Med.,
153(4):534 (1993)), Herpes simplex- und Herpes zoster-Infektionen
(Naafs, et al., Int. J. Dermatol., 24(2):131–4 (1985)), chronische Entzündung, Colitis
ulcerosa (Meza, et al., Drug Ther, 23(11): 74–80, 83 (1993); Powell, et
al., Br. J. Dermatol., 113 Ergänzungsbd.
28:141–4
(1985)), Lepra (Barnes, et al., Infect. Immun., 60(4):1441–46 (1992))
und Lupus (Burrows, BMJ, 307:939–40 (1993)).
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Obwohl
Thalidomid bei Erwachsenen minimale Nebenwirkungen aufweist, ist
es ein wirksames Teratogen. Daher bestehen Bedenken hinsichtlich
seiner Verwendung bei Frauen im gebärfähigen Alter. Obwohl sie minimal
sind, gibt es eine Reihe von Nebenwirkungen, die den Wunsch nach
der Verwendung von Thalidomid im Rahmen einer Behandlung begrenzen.
Eine solche Nebenwirkung ist die Schläfrigkeit. Bei einer Anzahl
von therapeutischen Studien musste die anfängliche Dosis Thalidomid verringert
werden, weil die Patienten lethargisch wurden und Schwierigkeiten
dabei hatten, normal zu arbeiten. Eine andere die Verwendung von
Thalidomid begrenzende Nebenwirkung ist die periphere Neuropathie,
bei der Patienten an Taubheit und einer Funktionsstörung ihrer
Extremitäten
leiden.
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Daher
werden verbesserte Zusammensetzungen benötigt, die einfach verabreicht
werden und in der Lage sind, eine Angiogenese zu inhibieren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren
von 4-Aminothalidomid bereit. Spezifisch stellt die vorliegende
Erfindung Verfahren zum Herstellen der jeweiligen R(+)- und S(–)-Enantiomere
von 4-Aminothalidomid bereit.
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Die
Enantiomere der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen
auf
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Es
ist möglich,
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellte Enantiomere von 4-Aminothalidomid für viele
Zwecke zu verwenden. Zusammensetzungen, die Enantiomere von 4-Aminothalidomid umfassen, sind
beim Inhibieren einer abnormalen Mitose und/oder einer unerwünschten
Angiogenese wirksam.
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Diese
Zusammensetzungen werden über
verschiedene Wege leicht verabreicht, die den oralen Weg umfassen,
und können
in Dosierungen verabreicht werden, die sicher sind und an inneren
Stellen eine mitotische und/oder angiogene Inhibition bereitstellen.
Die Zusammensetzungen können
zum Behandeln von Krankheiten von Säugetieren verwendet werden,
die durch eine unerwünschte
und ungesteuerte Mitose und/oder Angiogenese vermittelt werden,
durch das Verabreichen einer Zusammensetzung, die eine anti-mitotische
und/oder anti-angiogene Verbindung in einer Dosierung umfasst, die
ausreichend ist, um die Angiogenese zu inhibieren.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
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1 veranschaulicht
die Ergebnisse einer XTT-Proliferation mit HS-Sultan-Zellen.
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2 veranschaulicht
die Ergebnisse von cornealen Mikrotaschen-Tests, die die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung verwenden.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren
von 4-Aminothalidomid gerichtet. Gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellte Enantiomere können
in Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden,
die durch abnormale Mitose und/oder Angiogenese vermittelt werden.
Wie unten beschrieben, zeigen gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellte Verbindungen anti-mitotische, anti-angiogene und/oder
anti-Tumor-Eigenschaften. Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung
ein Verfahren bereitgestellt, um im Wesentlichen enantiomer reines
S(–)-4-Aminothalidomid
und R(+)-4-Aminothalidomid herzustellen. Die S(–)- und R(+)-Enantiomere von
4-Aminothalidomid weisen anti-mitotische und die Angiogenese inhibierende
Eigenschaften auf und sind für
die Behandlung einer Anzahl von Krankheiten nützlich, die verschiedene Krebsarten
und Makuladegeneration umfassen. S(–)-4-Aminothalidomid zeigte
in verschiedenen in vitro- und
in vivo-Tumor-Modellen eine wirksame anti-angiogene und anti-Tumor-Aktivität.
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Die
Enantiomere der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen
auf:
S(–)-4-Aminothalidomid
und R(+)-4-Aminothalidomid werden aus den S(–)- bzw: R(+)-Enantiomeren von
4-Nitrothalidomid synthetisiert. S(–)-4-Aminothalidomid wird gemäß dem folgenden
Reaktionsschema hergestellt: Synthese
von S(–)-4-Aminothalidomid
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Die
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellten S(–)-
und R(+)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid
können
als pharmazeutisch und physiologisch akzeptable Formulierungen unter
Verwendung von Verfahren und Techniken bereitgestellt werden, die
Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Diese Formulierungen können über Standard-Verabreichungswege
verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen über den
topischen, transdermalen, oralen, rektalen oder parenteralen (z.
B. intravenösen,
subkutanen oder intramuskulären)
Verabreichungsweg verabreicht werden. Zusätzlich können die Kombinationen in bioabbaubare
Polymere eingebaut werden, was eine anhaltende Freisetzung der Verbindung
erlaubt, wobei die Polymere in die Nähe der Stelle implantiert werden,
an der die Wirkstoffabgabe erwünscht
wird, z. B. an der Stelle eines Tumors. Die bioabbaubaren Polymere
und ihre Verwendung sind zum Beispiel detailliert in Brem et al., J.
Neurosurg. 74:441–446
(1991) beschrieben.
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Die
Dosierung der Verbindung wird von dem behandelt werdenden Zustand,
der besonderen Verbindung und anderen klinischen Faktoren, wie beispielsweise
dem Gewicht und Zustand des Menschen oder Tieres und dem Verabreichungsweg
der Verbindung abhängen.
Es soll verstanden werden, dass die Verbindungen hier sowohl bei
der menschlichen als auch bei der veterinärmedizinischen Verwendung Anwendung
finden. Zur oralen Verabreichung an Menschen ist eine Dosierung
von zwischen ungefähr
0,1 bis 300 mg/kg/Tag, bevorzugterweise zwischen ungefähr 0,5 und
50 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten zwischen ungefähr 0,1 bis 2
mg/kg/Tag im Allgemeinen ausreichend.
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Die
Formulierungen umfassen diejenigen, die für eine orale, rektale, nasale,
ophthalmische (umfassend intravitreale oder intracamerale), topische
(umfassend bukkale und sublinguale), vaginale oder parenterale (umfassend
subkutane, intramuskuläre,
intravenöse,
intradermale, intraokulare, intratracheale und epidurale) Verabreichung
geeignet sind. Die Formulierungen können praktischerweise in Einheitsdosierungsformen dargestellt
werden und durch herkömmliche
pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken umfassen
den Schritt des in-Verbindung-Bringens des aktiven Inhaltsstoffes
und des/der pharmazeutischen Träger(s)
oder des/der Bindemittel(s). Im Allgemeinen werden die Formulierungen
durch das einheitliche und nahe in-Verbindung-Bringen des aktiven
Inhaltsstoffes mit flüssigen
Trägern
oder fein zerteilten festen Trägern oder
beidem und dann, wenn nötig,
dem in-Form-Bringen des Produktes hergestellt.
-
Für die orale
Verabreichung geeignete Formulierungen, die die gemäß der vorliegenden
Erfindung synthetisierte Verbindung, nämlich 4-Aminothalidomid, umfassen,
können
als separate Einheiten, wie beispielsweise Kapseln, Cachet-Kapseln
oder Tabletten dargestellt werden, von denen jede eine vorbestimmte Menge
des aktiven Inhaltsstoffes umfasst; als ein Puder oder als Granula;
als eine Lösung
oder eine Suspension in einer wässrigen
Flüssigkeit
oder einer nicht-wässrigen
Flüssigkeit;
oder als eine flüssige
Emulsion von Öl
in Wasser oder eine Emulsion von Wasser in Öl und als Bolus etc.
-
Eine
Tablette kann durch Kompression oder Formpressen hergestellt werden,
optional mit einem oder mehr als einem Hilfsinhaltsstoff. Komprimierte
Tabletten können
durch Komprimieren des aktiven Inhaltsstoffes in einer frei fließenden Form,
wie beispielsweise in der Form von Pulver oder von Granula, optional
mit einem Binder, Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel,
oberflächenaktiven
oder dispergierenden Agens vermischt in einer geeigneten Maschine
hergestellt werden. Formgepresste Tabletten können durch das Formpressen
einer Mischung der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten
flüssigen
Verdünnungsmittel
angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.
Die Tabletten können
optional beschichtet oder markiert werden und können derart formuliert sein,
dass sie eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des darin enthaltenen
aktiven Inhaltsstoffes bereitstellen.
-
Formulierungen,
die zur topischen Verabreichung in den Mund geeignet sind, umfassen
Pastillen, die die Inhaltsstoffe in einer mit Geschmack versehenen
Basis umfassen, üblicherweise
Saccharose und arabisches Gummi oder Tragacanth; Pastillen, die
den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Basis, wie beispielsweise Gelatine
oder Glycerin oder Saccharose oder arabischem Gummi umfassen; und
Mundwasser, die den zu verabreichenden Inhaltsstoff in einem geeigneten
flüssigen
Träger
umfassen.
-
Für die topische
Verabreichung auf die Haut geeignete Formulierungen können als
Salben, Cremes, Gele und Pasten dargestellt werden, die den zu verabreichenden
Inhaltsstoff in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Ein transdermales Pflaster, das den zu verabreichenden Inhaltsstoff
enthält,
ist ein bevorzugtes topisches Abgabesystem.
-
Formulierungen
zur rektalen Verabreichung können
als Stuhlzäpfchen
mit einer geeigneten Basis dargestellt werden, die zum Beispiel
Kakaobutter oder ein Salicylat umfasst.
-
Zur
nasalen Verabreichung geeignete Formulierungen, wobei der Träger ein
Feststoff ist, umfassen ein grobes Pulver, das zum Beispiel eine
Partikelgröße im Bereich
von 20 bis 500 Mikrometer aufweist, das auf die Weise verabreicht
wird, auf die Schnupftabak verabreicht wird, d. h. durch schnelle
Inhalierung durch die Nasenwege aus einem Behälter des Pulvers, der nahe
an die Nase gehalten wird. Geeignete Formulierungen, bei denen der
Träger
eine Flüssigkeit
ist, zur Verabreichung, wie zum Beispiel ein Nasenspray oder Nasentropfen,
umfassen wässrige
oder ölige
Lösungen
des aktiven Inhaltsstoffes.
-
Zur
vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als
Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen
dargestellt werden, die zusätzlich
zu dem aktiven Inhaltsstoff solche Träger beinhalten, von denen auf
dem Gebiet bekannt ist, dass sie geeignet sind.
-
Zur
parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und
nicht-wässrige sterile
Injektionslösungen,
die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe
enthalten, die die Formulierung zum Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch
machen; und wässrige
und nicht-wässrige
sterile Suspensionen, die suspendierende Agenzien und verdickende
Agenzien umfassen können.
Die Formulierungen können
in Behältern
mit Einheits- oder Vielfachdosierungen dargestellt werden, zum Beispiel
versiegelten Ampullen und Glasfläschchen,
und können
in gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zuständen gelagert werden, die lediglich
das Zugeben des sterilen wässrigen
Trägers,
z. B. Wasser für
Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordern. Unvorbereitete
Injektionslösungen
und Suspensionen können
aus sterilen Pulvern, Granula und Tabletten der vorangehend beschriebenen
Art hergestellt werden.
-
Bevorzugte
Einheitsdosierungsformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis
oder Einheit, tägliche
Unterdosis, wie hierin oben angegeben, oder einen geeigneten Teil
davon, des verabreichten Inhaltsstoffes enthalten.
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Es
sollte verstanden werden, dass die Formulierungen zusätzlich zu
den Inhaltsstoffen, insbesondere den oben erwähnten, andere Agenzien, die
auf dem Gebiet mit Bezug auf die Art der Formulierung, die in Frage
kommt, üblich
sind, umfassen können,
zum Beispiel können
diejenigen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, mit Geschmack
versehende Agenzien umfassen.
-
Es
können
durch eine abnormale Zellmitose gekennzeichnete Krankheiten behandelt
werden. Weiterhin kann jegliche Krankheit, die durch Angiogenese
gekennzeichnet ist, behandelt werden. Solche Krankheiten umfassen:
abnormale Stimulation von endothelialen Zellen (z. B. Artheriosklerose),
solide Tumore und Tumormetastase, gutartige Tumore, z. B. Hämangiome, Akustikustumore,
Neurofibrome, Trachome und pyrogene Granulome, vaskuläre Fehlfunktionen,
abnormales Wundheilen, Entzündungs-
und Immun-Störungen,
Behcet'sche Krankheit,
Gicht oder gichtartige Arthritis, abnormale Angiogenese, die Folgendes
begleitet: rheumatoide Arthritis, Hautkrankheiten, wie beispielsweise
Psoriasis, diabetische Retinopathie und andere okulare angiogene
Krankheiten wie beispielsweise Frühgeborenenretinopathie (retrolentale
Fibroplasie), Makuladegeneration, corneale Transplantatabstoßung, neuroskulares
Glaukom, Leberkrankheiten und Oster-Webber-Syndrom (Osler-Weber-Rendu-Krankheit).
-
Mit
cornealer Gefäßneubildung
verbundene Krankheiten, die behandelt werden können, umfassen diabetische
Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie,
corneale Transplantationsabstoßung,
neovaskuläres Glaukom
und retrolentale Fibroplasien, epidemische Keratokonjunktivitis,
Vitamin A-Mangel, übermäßiges Tragen
von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, oben liegende limbische
Keratitis, ptegyriale keratitis sicca, Sjögren'sche Krankheit, Akne rosacea, Phylectenulose,
Syphilis, Infektionen mit Mycobakterien, Lipiddegeneration, chemische
Verbrennungen, bakterielle Geschwüre, Pilzgeschwüre, Herpes
simplex-Infektionen, Herpes zoster-Infektionen, Infektionen mit
Protozoen, Kaposi-Sarkom, Mooren'sches
Geschwür,
Terrien'sche marginale
Degeneration, marginale Keratolyse, Trauma, rheumatoide Arthritis,
systemischen Lupus, Polyarteriitis, Wegener'sche Sarkoidose, Skleritis, Steven-Johnson'sche Krankheit, Pemphigoid,
radiale Keratotonie und Corneatransplantatabstoßung.
-
Mit
Gefäßneubildung
der Retina/Aderhaut verbundene Krankheiten, die behandelt werden
können, umfassen
diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, Sichelzellenanämie, Sarkoidose,
Syphilis, Pseudoxanthoma elasticum, Paget'sche Krankheit, Venenverschluss, Arterienverschluss,
obstruktive Karotiskrankheit, chronische Uveitis/Glaskörperentzündung, Infektionen
mit Mycobakterien, Lyme'sche
Krankheit, systemischer Lupus erythematosus, Frühgeborenenretinopathie, Eales'sche Krankheit, Behcet'sche Krankheit, Retinitis
oder Choroiditis verursachende Infektionen, angenommene okulare
Histoplasmosis, infantile Makuladegeneration, Myopie, Sehnerventrichter,
Stargart'sche Krankheit,
granulomatöse
Uveitis der Pars plana, chronisches Ablösen der Retina, Hyperviskositätssyndrome,
Toxoplasmose, Trauma und Komplikationen nach einer Laserbehandlung.
Andere Krankheiten umfassen Krankheiten, die mit Rubeosis (Gefäßneubildung
des Angulus) verbunden sind, und Krankheiten, die durch die abnormale
Proliferation von fibrovaskulärem oder
fibrösem
Gewebe verursacht werden, die alle Formen von fruchtbarer Vitreoretinopathie
umfassen, unabhängig davon,
ob diese mit Diabetes verbunden ist oder nicht.
-
Eine
andere Krankheit, die behandelt werden kann, ist die rheumatoide
Arthritis. Man glaubt, dass die Gefäße in der Synovialauskleidung
der Gelenke eine Angiogenese durchlaufen. Zusätzlich zum Bilden neuer vaskulärer Netzwerke
setzen die endothelialen Zellen Faktoren und reaktive Sauerstoffspezies
bei, die zu einem Wachstum des Pannus und zu einer Knorpelzerstörung führen. Die
an der Angiogenese beteiligten Faktoren können aktiv zum chronisch entzündeten Zustand
der rheumatoiden Arthritis beitragen oder dabei helfen, diesen aufrechtzuerhalten.
-
Andere
Krankheiten, die behandelt werden können, sind Hämangiome,
Osler-Weber-Rendu-Krankheit oder
erbliche hämorrhagische
Teleangiektasie, solide oder hämatogene
Tumore oder erworbenes Immundefizienzsyndrom.
-
Studien
der S(–)-
und R(+)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid, insbesondere von S(–)-4-Aminothalidomid zeigen,
dass diese Verbindungen als Inhibitoren einer Angiogenese wirksam
sind. Diese Studien zeigen, dass diese Verbindungen für die Behandlung
von mit Angiogenese verbundenen Krankheiten nützlich sind. Wie oben angezeigt,
umfasst eine Gruppe von Krankheiten, die mit Angiogenese verbunden
ist, Krebs. Zahllose Tumore, die solide Tumore und hämatogene
Tumore umfassen, erfordern Angiogenese, um über eine sehr geringe Größe hinaus
zu wachsen. Die Inhibition der Angiogenese wird zur Inhibition des
Wachstums des Tumors führen.
Beispiele spezifischer Arten von Krebs, die mit den S(–)- und
R(+)-Enantiomeren von 4-Aminothalidomid behandelt werden können, umfassen
Prostatakrebs, Brustkrebs, Zervixkarzinom, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs,
Gliome, Hämangiome,
Kaposi-Sarkom, Pankreaskrebs, Retinoblastome, Melanome, Blasenkrebs,
Rhabdomyosarkome, Retinoblastome, Ewing-Sarkom, Neuroblastome, Osteosarkome, Leukämien, Lymphome,
multiple Myelome und verschiedene akute und chronische neoplastische
Krankheiten des Knochenmarks. Die S(–)- und R(+)-Enantiomere von
4-Aminohalidomid
inhibieren auch Metastasen vorhandener Tumore. Beispiele für Metastasen,
die inhibiert werden können,
umfassen Knochenmarkmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen
und peritoneale Metastasen.
-
Diese
Erfindung und Verwendungen von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurden, werden weiter durch die folgenden
Beispiele veranschaulicht. Die Tabelle unten stellt veranschaulichende
Ausführungsformen
bereit, während
die Beispiele die Synthese von repräsentativen Verbindungen bereitstellen.
-
BEISPIELE
-
Die
folgenden Verbindungen wurden durch die Modifikation von Verfahren
synthetisiert, die in Shealy et al., J. Pharm. Sci., 1968, 57, 757–764; Polonski
et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1988, 639–648; Muller et al., Bioorg.
Med. Chem. Lett., 1999, 9, 1625–1630;
Helm et al., Arzneim-Forsch./Drug Res., 1981, 31, 941–949; Shah
et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3014–3017; und Menard et al., Can.
J. Che., 1963, 41, 1722–1725,
beschrieben sind.
-
Beispiel 1
-
Synthese von S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid:
-
Zu
einer gerührten
Lösung
von Carboxybenzyloxy-L-glutamin (2,8 g, 10 mMol) in 40 ml wasserfreiem THF
(Tetrahydrofuran) wird 1,1-Carbonyldiimidazol (1,92 g, 12 mMol)
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss
18 Stunden lang erhitzt. Das THF wurde abgedampft, und das Produkt
wurde in Chloroform gelöst.
Die Chloroformschicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem CaSO4 getrocknet, gefiltert und abgedampft, um
einen weißen
Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde aus Ethylether umkristallisiert,
um 2,4 g kristallines Pulver zu ergeben (90%). Alternativ kann Carboxybenzyloxy-L-glutamin
durch 1 Stunde langes Behandeln mit SOCl2 in
DMF (N,N-Dimethylformamid)
bei –70°C bis 0°C zyklisiert
werden, um S(–)-2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid
zu bilden. Die Reaktionsmischung wurde mit CHCl3 verdünnt und
mit 5% Na2CO3 gewaschen, über wasserfreiem
Na2SO4 getrocknet,
gefiltert und abgedampft, um 2,5 g (90% Ausbeute) S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid
zu ergeben.
-
1H-NMR
in CDCl3 bestätigte, dass es sich bei dem
Produkt um S(–)-(2-benzyloxycarbonylamino)-glutarimid
handelte. 1H-NMR (CDCl3, PPM), 8,2 (1H,
s breit), 7,4 (5H, s, aromatisch), 5,8 (1H, d), 5,15 (2H, s), 4,4
(1H, dd, J = 4,5, 3), 2,95–2,4
(3H, m), 1,86 (1H, d, t, J = 11,5, 6,5). Schm.-Pkt. 122–124°C (lit =
122–124°C).
-
Beispiel 2
-
Synthese von S(–)-2-Aminoglutarimid.HBr:
-
Zu
einer Lösung
von S-(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid
(1,2 g, 4,6 mMol) in 15 ml Eisessig wurden bei 20°C 8 ml 30%
HBr/Essigsäurelösung hinzugegeben.
Die Temperatur der Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erhöht, und
sie wurde 1 Stunde lang gerührt.
Weißes
festes Pulver von S-(–)-2-Aminoglutarimid.HBr
begann, sich in der Reaktionsmischung zu zeigen. Der Feststoff wurde
gefiltert und mit 5 ml Eisessig und anschließend mit Ether gewaschen, um
1,8 g (80%) Produkt zu ergeben. Die Analyse des Produktes mit einem
Polarimeter zeigte (–)-Rotation,
[a]25D (c = 1, Wasser) = –37,5° und bestätigte, dass
es sich bei dem Produkt um S(–)-2-Aminoglutarimid
handelte. 1H-NMR in DMSO-D6 bestätigte,
dass es sich bei dem Produkt um 2-Amino-L-glutarimid.HBr handelte.
1H-NMR (DMSO-D6, PPM).
-
Beispiel 3
-
Synthese von S(–)-4-Nitrothalidomid:
-
Zu
einer Lösung
von (4,18 g, 20 mMol) 2-Aminoglutarimid-HBr in 50 ml wasserfreiem
DMF wurden 3,8 g (20 mMol) 3-Nitrophthalanhydrid hinzugegeben. Nach
dem Zugeben von 100 ml Essigsäure
(Eisessig) wurde die Reaktionsmischung ungefähr 24 Stunden lang von etwa
70°C auf
etwa 80°C
erhitzt. Danach wurden die Lösungsmittel
unter Vakuum abgedampft, um einen gebrochen weißen Feststoff zu ergeben. Beim
Hinzugeben von 10 ml Ethylalkohol zu dem Feststoff wurde ein Pulverprodukt
mit einer gebrochen weißen
Farbe gebildet. Das Produkt wurde abgetrennt und mit 20 ml Ethylalkohol
gewaschen.
-
1H-NMR
in DMSO-D6 bestätigte,
dass es sich bei dem Produkt um S(–)-4-Nitrothalidomid handelte. Schmp.
228–229°C (lit =
228,5–229,5°C). 1H-NMR
(DMSO-D6, PPM), 11,25 (1H, s breit), 8,35
(1H, d, J = 7,2), 8,25 (1H, d, J = 7,0), 8,15 (1H, t, J = 8,0),
5,2 (1H, dd, J = 5,5, 7,2), 3,00–2,85 (1H, m), 2,65–2,4 (2H,
m), 2,15–2,05
(1H, m).
-
Beispiel 4
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Synthese von S(–)-4-Aminothalidomid:
-
4-Nitrothalidomid
(1 g, 3,3 mMol) wurde in 50 ml einer 4:1-Mischung von Dioxan/Methanol
aufgelöst und
in einem Parr-Hydrogenator bei 40 psi Wasserstoff in Anwesenheit
eines Pd/C 5%-Katalysators ungefähr 4
Stunden lang hydrogeniert. Nach dem Filtern der Reaktionsmischung
durch ein Celite-Filteragens wurden die Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft,
um ein gelbes Pulver zu ergeben. Das Pulver wurde aus Ethylacetat/Dioxan
umkristallisiert, um 800 mg (85% Reinheit) S(–)-4-Aminothalidomid zu ergeben.
-
1H-NMR
in DMSO-D6 bestätigte, dass es sich bei dem
Produkt um S(–)-4-Aminothalidomid
handelte. Schmp. 318,2–319,5°C. 1H-NMR
(DMSO-D6, PPM), 11,10 (1H, s breit), 7,45
(1H, t, J = 7,5), 7,05 (1H, d, J = 5,2), 6,95 (1H, d, J = 5,2),
6,5 (2H, s breit), 5,05 (1H, dd, J = 5,0, 13,42), 2,95–2,80 (1H,
m), 2,65–2,5
(2H, m), 2,05–1,05
(1H, m). Die absolute Konfiguration wurde durch Vergleich der spezifischen
Rotation [a]25D von R- und S-4-Aminothalidomid
mit den analogen Verbindungen R(+)- und S(–)-Thalidomid bestimmt. Die
Analyse des Produktes mit dem Polarimeter zeigte eine (–)-Rotation,
[a]25D (C = 0,5, Dioxan) = 27,7, 0° und bestätigte, dass
es sich bei dem Produkt um S(–)-4-Aminothalidomid
handelte.
-
Die
beiden Enantiomere von 4-Aminothalidomid wurden durch die chirale
HPLC-Säule
Welk-01 (10 mm × 750
mm) aufgetrennt und mit einer CH3CN/MeOH/H2O 1:1:5-Mischung eluiert.
Die Retentionszeit für das
S(–)-Enantiomer
betrug bei einer Fließgeschwindigkeit
von 2 ml/Min und bei 240 nm 33,74 Minuten bzw. für das R(+)-Enantiomer 35,62
Minuten.
-
Beispiel 5
-
Synthese von R(+)-4-Aminothalidomid:
-
Die
Verbindung R-(+)-4-Aminothalidomid wurde mit der gleichen Vorgehensweise
wie bei S-(–)-4-Aminothalidomid
oben synthetisiert, abgesehen davon, dass die Synthese mit im Handel
erhältlichen
Carboxybenzyloxy-D-Glutamin begonnen wurde, das R(+)-4-Nitrothalidomid
bildete (siehe Beispiel 1). Die Analyse des Produktes mit einem
Polarimeter zeigte eine (+)-Rotation von [a]25D
(c = 1, Dioxan) = +37,1° und
bestätigte, dass
es sich bei dem Produkt um R(+)-4-Aminothalidomid handelte. 1H-NMR
in DMSO-D6 bestätigte, dass es sich bei dem
Produkt um 4-Aminothalidomid handelte.
-
Beispiel 6
-
Synthese von S(–)-4-Aminothalidomid (theoretisches
Beispiel):
-
S(–)-4-Aminothalidomid
kann durch das Auflösen
von S(–)-4-Nitrothalidomid
in konzentrierter HCl und das anschließende Behandeln der Reaktionsmischung
mit granuliertem Zinn synthetisiert werden. Nach dem ungefähr 2 Stunden
langen Erhitzen der Reaktionsmischung von ungefähr 70°C auf ungefähr 80°C sollte die Reaktionsmischung
gefiltert und die Säure
unter Vakuum abgedampft werden, um ein gelbes Pulver zu ergeben.
Das Produkt sollte aus Wasser und dann aus Ethylacetat/Dioxan umkristallisiert
werden, um S(–)-4-Amino-thalidomid
zu ergeben.
-
Beispiel 7 (Referenzbeispiel)
-
Der
Roche Cell Proliferation Kit II (XTT) ist ein nützlicher Test für das Screenen
der relativen Wirksamkeit von small molecules. Der Test bestimmt
quantitativ die zelluläre
Proliferation als Reaktion auf Agonisten und/oder Antagonisten der
Proliferation. Er basiert auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes
(XTT) durch metabolisch aktive/lebensfähige Zellen, um einen orangefarbenen
Formazanfarbstoff zu bilden. Die Bildung des löslichen Farbstoffes erlaubt
die direkte Quantifizierung unter Verwendung eines Rasterspektrophotometers
mit mehreren Näpfen.
Eine Zunahme der Anzahl von lebenden Zellen (die sich aus der Proliferation
ergeben) führt
zu einer größeren Produktion
des Formazan-Farbstoffs,
was einer Zunahme des Extinktionswertes entspricht.
-
Beim
Untersuchen von Analoga von Thalidomid oder dergleichen haben wir
HS-Sultan-Zellen
in einem in vitro-XTT-Test verwendet. In jedem Napf einer Mikrotiterplatte
mit 96 Reaktionsnäpfen
wurden Zellen bei einer Dichte von 15 000 Zellen pro 90 μl normalen
Wachsstumsmediums ungefähr
16 Stunden vor den Behandlungen angesät. Während der Kultur und den Behandlungen
werden die Zellen bei 37°C
mit 5% CO2 in einem Inkubator mit hoher
Feuchtigkeit gehalten. Die Behandlungen (10X) werden in 10 μl-Aliquots
hinzugegeben, um in jedem Reaktionsnapf eine Endbehandlungskonzentration
von 1X zu erreichen. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausführung ausgeführt. Die
XTT-Markierungsmischung
wird während
den letzten vier Stunden der 72-stündigen Behandlungszeitspanne
in 50 μl
Aliquots zu jedem Napf hinzugegeben. Wenn die Behandlung/Markierungs-Zeitspanne
abgeschlossen ist, wird die Platte auf einem spektrophotometrischen
Plattenzähler
bei einer Wellenlänge
von 470 nm und einer 650 nm-Referenzwellenlänge abgelesen.
Bei einzelnen Experimenten werden die durchschnittlichen Extinktionswerte
(mit abgezogenem Hintergrund) für
jede Behandlung gegen die Konzentration aufgetragen. Ein größerer Extinktionswert
entspricht einer größeren Menge
Proliferation. Eine Negativkontrolle (unbehandelte Zellen) wird
als Referenzpunkt verwendet, ein Extinktionswert, der niedriger
ist als die Kontrolle, spiegelt eine Inhibtion der Proliferation
wieder.
-
Beim
Vergleichen von Experimenten, die über eine bestimmte Zeitspanne
ausgeführt
wurden, können Extinktionswerte
von jedem Experiment aufgrund einer Anzahl von Faktoren (der Abbau
der XTT-Reagenzien im Verlauf der Zeit ist der häufigste Faktor) schwanken.
Wenn die Reagenzien aus einem älteren
XTT-Kit verwendet werden oder zu einem neuen Kit gewechselt wird,
können
die Gesamtextinktionswerte für
das jeweilige Experiment höher
oder niedriger sein, was einen direkten Vergleich zu einem anderen
Experiment erschwert. Daher ist es eine übliche Praxis, die Extinktionswerte
zu einem Verhältnis
der behandelten Werte geteilt durch den Wert der Negativkontrolle
(Behandlung über
Kontrolle) umzuwandeln, wenn die Ergebnisse von mehreren Experimenten
verglichen werden; die „Behandlung über Kontrolle"-Werte für jede Behandlung
werden dann gegen die μM-Konzentration
aufgetragen. 1 vergleicht die 4-Aminothalidomid-Enantiomere.
Die R- und die R,S-Auftragungen
repräsentieren
aus 3 Experimenten gesammelte Daten. Die S- und Thalidomid-Auftragungen repräsentieren
aus ungefähr
12 Experimenten gesammelte Daten. Wie in 1 veranschaulicht,
zeigen sowohl die S(–)-
und die R(+)-4-Aminothalidomid-Enantiomere eine gegen die zelluläre Proliferation
gerichtete Aktivität.
-
Beispiel 8 (Referenzbeispiel)
-
Die
Antitumor-Aktivität
wurde für
die S(–)-
und R(+)-4-Aminothalidomid-Enantiomere wie folgt untersucht. Für die HsS-Zelllinie
werden 2 Millionen Zellen in die Schwanzvene von 8 Wochen alten,
weiblichen SCID-Mäusen
injiziert. Die Behandlung wird nach zwei Wochen begonnen und täglich weitergeführt, bis
die Mäuse
sterben oder eine Paralyse der Hintergliedmaßen zeigen. Die Ergebnisse
werden als mittlere Zeit bis zum Tod in behandelten Tieren gegen
Kontroll-Tiere ausgedrückt.
Beim Lewis-Lungenmodell werden 2,5 × 10(5) Zellen intravenös in die
Schwanzvene von 6–8
Wochen alten, männlichen
C57BL/6-Mäusen injiziert,
und die Behandlung wird am Tag drei begonnen. Die Zeitspanne der
Behandlung hat gewöhnlich
eine Dauer von 11–15
Tagen. Nach dem Opfern durch CO
2-Erstickung
werden die Lungen (wo die Tumore ansetzen und wachsen) entnommen,
mit Wasser abgespült,
trocken getupft und gewogen. Die mittleren Lungengewichte von Mäusen des
gleichen Alters, die keine Tumore tragen, werden vom Gewicht der
behandelten, Tumore tragenden Mäuse
abgezogen, wobei die Ergebnisse als Lungengewichtszunahme bei behandelten
Tieren gegen Kontrolltiere ausgedrückt werden. Tabelle 1 fasst
Daten von in vivo-Experimenten in Tumorsystemen mit metastatischen
Lungen- und Plasma-Zelltumoren zusammen und vergleicht die Antitumor-Aktivität der drei
enantiomeren Präparationen
von 4-Amino-Thalidomid.
Diese Daten zeigen, dass das S(–)-Enantiomer
in jedem Tumormodell das aktivste Enantiomer von 4-Aminothalidomid
war. Tabelle 1
| Tumormodell | Testagens | Dosis
mg/kg/Tag | Aktivität |
| HsSultan-B-Zellen-Lymphom metastatisch in SCID-Mäusen | Vehikel
(0,5%
Methylzellulose) | - | 26 Tage* |
| R,S | 50 | 41
Tage* |
| R(+) | 50 | 37
Tage* |
| S(–) | 50 | 47
Tage* |
| HsSultan-B-Zellen-Lymphom metastatisch in SCID-Mäusen | Vehikel
(0,5%
Methylzellulose) | - | 26 Tage* |
| R,S | 200 | 28
Tage* |
| R(+) | 200 | 31
Tage* |
| S(–) | 200 | 47
Tage* |
| Lewis-Lungenkarzinom metastatisch
in C67BL/6-Mäusen | Vehikel
(0,5%
Methylzellulose) | - | 0,40 g# |
| R,S | 100 | 0,27
g# |
| R(+) | 100 | 0,42
g# |
| S(–) | 100 | 0,17
g# |
- * mittlere Zeit bis zum Tod
- # Gewichtszunahme der Lunge
-
Beispiel 9 (Referenzbeispiel)
-
Ein
Corneamikrotaschen-Test wurde wie in Kenyon et al., A Model of Angiogenesis
in the Mouse Cornea, Invest. Ophtalmol. & Vis. Sci., 37, 1625–1632 (1996)
beschrieben durchgeführt.
Es wurden Pellets in C57BL/6J-Mäusen
verwendet, die 80 ng bFGF oder rekombinantes menschliches VEGF (R&D Systems, Minneapolis,
Minn) enthielten. Die behandelten Gruppen erhielten an fünf (bFGF)
oder sechs (VEGF) aufeinanderfolgenden Tagen eine tägliche Verabreichung
von Thalidomid, S(–)-
und R(+)-4-Aminothalidomid [(3APG), S(–)-3APG und R(+)-3APG] (50
mg/kg), suspendiert in 0,5% Carboxymethylzellulose i. p. Die Behandlung
wurde am Tag der Pelletimplantierung begonnen; die Kontrollmäuse erhielten
nur Carboxymethylzellulose i. p. Die Fläche der vaskulären Reaktion
wurde am fünften
(bFGF) oder sechsten (VEGF) Tag nach der Operation unter Verwendung
einer Schlitzlampe eingeschätzt.
Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Wie in 2 angegeben,
waren die Unterschiede bei der mit bFGF induzierten Gefäßneubildung
zwischen S(–)-3APG
und der Kontrolle signifikant (n = jeweils 9, P < 0,0001), genauso wie die Unterschiede
zwischen S(–)-3APG
und Thalidomid (n = jeweils 9, P < 0,01).
Die Unterschiede bei der mit VEGF induzierten Gefäßneubildung
zwischen S(–)-3APG und der Kontrolle
waren signifikant (n = jeweils 9, P < 0,001), genauso wie die Unterschiede
zwischen S(–)-3APG
und Thalidomid (n = jeweils 9, P < 0,01).
-
Mit „einer
wirksamen Menge" ist
eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge gemeint. Solche
Mengen können
durch eine in geeigneter Weise qualifizierte Person leicht bestimmt
werden, wobei der zu behandelnde Zustand, der Verabreichungsweg
und andere relevante Faktoren berücksichtigt werden. Eine solche
Person wird leicht in der Lage sein, eine geeignete Dosis, einen
geeigneten Verabreichungsmodus und eine geeignete Verabreichungshäufigkeit
zu bestimmen.
