DE60027749T2

DE60027749T2 - Vermittler von "hedgehog" übermittelnden bahnen, dazugehörige zusammenetzungen und verwendungen

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Publication number: DE60027749T2
Application number: DE60027749T
Authority: DE
Inventors: David Anthony Abingdon BAXTER; Andrew Edward Didcot BOYD; M. Oivin Belmont GUICHERIT; Stephen Aylesbury Price; Lee Wellesley RUBIN
Original assignee: Curis Inc
Current assignee: Curis Inc
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: IL148972A0; IL148972A; JP4898044B2; AU1570601A; DE60027749T3; AU780612C; ATE324876T1; EP1227805B1; AU780612B2; WO2001026644A2; CA2388468A1; CA2388468C; WO2001026644A3; DE60027749D1; EP1227805B2; JP2003511411A; EP1227805A2

Description

Musterbildung ist die Aktivität, durch die Embryonalzellen geordnete räumliche Anordnungen differenzierter Geweben bilden. Die physische Komplexität höherer Organismen entsteht während der Embryogenese durch die Wechselwirkung der zellintrinsischen Abstammung und der zellextrinsischen Signalgebung. Induktive Wechselwirkungen sind für die embryonale Musterbildung bei der Entwicklung von Wirbeltieren aus der frühesten Anlage des Körperplans, für die Musterbildung der Organsysteme und für die Erzeugung verschiedener Zelltypen während der Gewebedifferenzierung wesentlich (Davidson, E. (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J. B. (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T. M. et al. (1992) Cell 68: 257-270). Die Wirkungen entwicklungsbedingter Zellwechselwirkungen sind unterschiedlich. Typischerweise werden antwortende Zellen von einem Weg der Zelldifferenzierung zu einem anderen umgeleitet, indem Zellen induziert werden, die sich sowohl von den nicht-induzierten als auch den induzierten Zuständen der antwortenden Zellen (Induktionen) unterscheiden. Manchmal veranlassen Zellen ihre Nachbarzellen, sich so zu differenzieren, wie sie selbst (homöogenetische Induktion); in anderen Fällen hemmt eine Zelle ihre Nachbarn, sich so zu differenzieren wie sie selbst. Zellwechselwirkungen in der frühen Entwicklung können sequenziell sein, so dass eine anfängliche Induktion zwischen zwei Zelltypen zu einer zunehmenden Verstärkung der Verschiedenheit führt. Ferner finden induktive Wechselwirkungen nicht nur in Embryos, sondern auch in erwachsenen Zellen statt und können morphogenetische Muster anlegen und aufrechterhalten sowie eine Differenzierung induzieren (J. B. Gurdon (1992) Cell 68: 185-199).
Mitglieder der Hedgehog-Familie von signalgebenden Molekülen vermitteln viele wichtige Musterbildungsprozesse kurzer und langer Reichweite während der Entwicklung von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. In der Fliege reguliert ein einziges Hedgehog-Gen die Musterbildung von Segment- und Imaginalscheiben. Im Gegensatz dazu ist in Wirbeltieren eine Hedgehog-Genfamilie an der Steuerung der Links-rechts-Asymmetrie, Polarität im ZNS, Ursegmente und Extremitäten, Organogenese, Chondrogenese und Spermatogenese beteiligt.
Das erste Hedgehog-Gen wurde durch eine genetische Durchmusterung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster identifiziert (Nüsslein-Volhard, C. und Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). Diese Durchmusterung identifizierte mehrere Mutationen, die die Embryonal- und Larvenentwicklung beeinflussen. 1992 und 1993 wurde die molekulare Natur des Drosophila-Hedgehog-(Hh)-Gens berichtet (C. F. Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), und seitdem wurden mehrere Hedgehog-Homologe aus verschiedenen Wirbeltierspezies isoliert. Während in Drosophila und anderen wirbellosen Tieren nur ein Hedgehog-Gen gefunden wurde, sind in Wirbeltieren mehrere Hedgehog-Gene vorhanden.
Die Familie der Hedgehog-Gene von Wirbeltieren schließt mindestens vier Mitglieder, z.B. Paraloge des einzigen Hedgehog-Gens von Drosophila, ein. Beispielhafte Hedgehog-Gene und Proteine sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 beschrieben. Drei dieser Mitglieder, die hier als Desert-Hedgehog (Dhh), Sonic-Hedgehog (Shh) und Indian-Hedgehog (Ihh) bezeichnet werden, kommen offensichtlich in allen Wirbeltieren, einschließlich Fischen, Vögeln und Säugern, vor. Ein viertes Mitglied, das hier als Tiggie-winkle-Hedgehog (Thh) bezeichnet wird, kommt speziell in Fischen vor. Desert-Hedgehog (Dhh) wird sowohl bei der Embryonalentwicklung in Mäusen als auch im erwachsenen Nager und Menschen hauptsächlich in den Hoden exprimiert; Indian-Hedgehog (Ihh) ist an der Knochenentwicklung während der Embryogenese und an der Knochenbildung in Erwachsenen beteiligt; und Shh, das vorstehend beschrieben ist, ist in erster Linie an morphogenetischen und neuroinduktiven Aktivitäten beteiligt. In Anbetracht der kritischen induktiven Rollen von Hedgehog-Polypeptiden bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Wirbeltierorganen ist die Identifizierung von in Wechselwirkung tretenden Hedgehog-Proteinen sowohl in klinischen Kontexten als auch Forschungskontexten von größter Bedeutung.
Die verschiedenen Hedgehog-Proteine bestehen aus einem Signalpeptid, einer hochkonservierten N-terminalen Region, und einer stärker divergierenden C-terminalen Domäne. Zusätzlich zu der Signalsequenzspaltung in dem sekretorischen Weg (Lee, J. J. et al. (1992) Cell 71: 33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D. E. et al. (1994) Development 120: 3339-3353) durchlaufen die Hedgehog-Vorläuferproteine eine innere autoproteolytische Spaltung, die von konservierten Sequenzen in dem C-terminalen Teil abhängt (Lee et al. (1994) Science 266: 1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374: 363-366). Diese Selbstspaltung führt zu einem N-terminalen Peptid mit 19 kD und einem C-terminalen Peptid mit 26 bis 28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D. A. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S. C. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 944-955; Lai, C. J. et al. (1995) Development 121: 2349-2360). Das N-terminale Peptid bleibt mit der Oberfläche von Zellen, in denen es gebildet wurde, fest verbunden, während das C-terminale Peptid sowohl in vitro als auch in vivo frei diffusionsfähig ist (Porter et al. (1995) Nature 374: 363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart', E. et al. (1995) Development 121: 2537-2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445-455). Interessanterweise hängt die Retention des N-terminalen Peptids an der Zelloberfläche von der Selbstspaltung ab, da eine verkürzte Form von Hh, die durch eine RNA kodiert wird, die genau an der normalen Position der inneren Spaltung endet, in vitro (Porter et al. (1995) supra und in vivo (Porter, J. A. et al. (1996) Cell 86, 21-34) diffusionsfähig ist. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die autoproteolytische Spaltung des Hh-Vorläuferproteins über eine innere Thioesterzwischenverbindung abläuft, die anschließend in einer nukleophilen Substitution gespalten wird. Es ist wahrscheinlich, dass das Nukleophil ein kleines, lipophiles Molekül ist, das kovalent an das C-terminale Ende des N-Peptids gebunden wird (Porter et al. (1996) supra), indem es an die Zelloberfläche geheftet wird. Die biologischen Auswirkungen sind tiefgreifend. Als Folge des Anheftens wird eine hohe lokale Konzentration des N-terminalen Hedgehog-Peptids auf der Oberfläche der Hedgehog produzierenden Zellen erzeugt. Es ist dieses N-terminale Peptid, das für signalgebende Aktivitäten von Hedgehog kurzer und langer Reichweite in Drosophila und Wirbeltieren sowohl notwendig als auch ausreichend ist (Porter et al. (1995 supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M. J. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81: 457-465; Mart', E. et al. (1995) Nature 375: 322-325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol. 5: 791-795; Ekker, S. C. et al. (1995) Development 121: 2337-2347; Forbes, A. J. et al. (1996) Development 122: 1125-1135).
Hh war an Musterbildungsprozessen kurzer und langer Reichweite an verschiedenen Stellen während der Drosophila-Entwicklung beteiligt. Bei der Anlage der Segmentpolarität in frühen Embryos weist es Wirkungen kurzer Reichweite auf, die offensichtlich direkt vermittelt werden, während es bei der Musterbildung der Imaginalscheiben durch die Induktion von Sekundärsignalen Wirkungen langer Reichweite induziert.
In Wirbeltieren wurden in den letzten Jahren mehrere Hedgehog-Gene kloniert. Von diesen Genen erlangte Shh die größte experimentelle Aufmerksamkeit, da es in verschiedenen Organisationszentren, die die Quellen von Signalen sind, die benachbarte Gewebe gestalten, exprimiert wird. Neuere Beweise zeigen, dass Shh an diesen Wechselwirkungen beteiligt ist.
Die Expression von Shh beginnt kurz nach dem Beginn der Gastrulation in dem vermutlichen Mittellinienmesoderm, dem Knoten in der Maus (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75: 1417-1430), der Ratte (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76: 761-775) und dem Küken (Riddle, R. D. et al. (1993) Cell 75: 1401-1416) und dem Schild im Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75: 1431-1444). In Kükenembryos entwickelt das Shh-Expressionsmuster im Knoten eine Links-rechts-Asymmetrie, die offensichtlich für die Links-rechts-Lage des Herzens verantwortlich ist (Levin, M. et al. (1995) Cell 82: 803-814).
Im ZNS löst Shh aus der Urwirbelsäule und der Bodenplatte offensichtlich den Tod ventraler Zellen aus. Wenn Shh ektopisch exprimiert wird, führt es zu einer Ventralisation großer Regionen des Mittel- und Rautenhirns in der Maus (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L. V. et al. (1996) Genes Dev. 10: 301-312), im Xenopus (Roelink, H. et al. (1994) supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6: 106-121) und im Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M. et al. (1996) Genes Dev. 10: 647-658). In Explantaten des intermediären Neuroektoderms in Bereichen des Rückenmarks induziert das Shh-Protein die Entwicklung der Bodenplatte und motorischer Neuronen mit verschiedenen Konzentrationsgrenzwerten, die Bodenplatte bei hohen Konzentrationen und die motorischen Neuronen bei niedrigeren Konzentrationen (Roelink et al. (1995) supra; Mart' et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 651-658). Ferner weist eine Blockierung durch Antikörper darauf hin, dass durch die Urwirbelsäule erzeugtes Shh für die durch die Urwirbelsäule vermittelte Induktion des Tods motorischer Neuronen erforderlich ist (Mart' et al. (1995) supra). Somit ist eine hohe Konzentration von Shh auf der Oberfläche von Shh-erzeugenden Mittellinienzellen offensichtlich der Grund für die in vitro beobachtete Kontaktvermittelte Induktion der Bodenplatte (Placzek, M. et al. (1993) Development 117: 205-218) und die Mittellinienpositionierung der Bodenplatte direkt über der Urwirbelsäule in vivo. Aus der Urwirbelsäule und der Bodenplatte freigesetzte niedrigere Konzentrationen von Shh induzieren vermutlich motorische Neuronen in weiter entfernten ventrolateralen Regionen in einem Prozess, von dem gezeigt wurde, dass er in vitro kontaktunabhängig ist (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73: 673-686). In Explantaten, die aus Bereichen des Mittelhirns und Vorderhirns entnommen wurden, induziert Shh auch die geeigneten Typen ventrolateraler, neuronaler Zellen, dopaminerger (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15: 35-44; Wang, M. Z. et al. (1995) Nature Med. 1: 1184-1188) beziehungsweise cholinerger (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81: 747-756) Vorläufer, was zeigt, dass Shh ein allgemeiner Induktor der ventralen Spezifizierung über die gesamte Länge des ZNS ist. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, wie die differenzielle Antwort auf Shh an besonderen anteroposterioren Positionen reguliert wird.
Shh aus der Mittellinie gestaltet auch die paraxialen Regionen des Wirbeltierembryos, die Ursegmente im Rumpf (Fan et al. (1995) supra) und das Kopfmesenchym rostral von den Ursegmenten (Hammerschmidt et al. (1996) supra). In Explantaten des paraxialen Mesoderms von Küken und Mäusen fördert Shh die Expression Sklerotom-spezifischer Marker, wie Pax1 und Twist, auf Kosten des dermamyotomalen Markers Pax3. Ferner weisen Experimente mit Filterbarrieren darauf hin, dass Shh die Induktion des Sklerotoms eher direkt als durch die Aktivierung eines sekundären signalgebenden Mechanismus vermittelt (Fan, C.-M. und Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186).
Shh induziert auch die Expression myotomaler Gene (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R. L. et al. (1994) Cell 79: 1165-1173; Münsterberg, A. E. et al. (1995) Genes Dev. 9: 2911-2922; Weinberg, E. S. et al. (1996) Development 122: 271-280), obwohl neuere Experimente zeigen, dass Mitglieder der WNT-Familie, Wirbeltierhomologe von Drosophila wingless, gemeinsam erforderlich sind (Münsterberg et al. (1995) supra). Rätselhafterweise erfordert eine myotomale Induktion in Küken höhere Shh-Konzentrationen als die Induktion sklerotomaler Marker (Münsterberg et al. (1995) supra), obwohl das Sklerotom von viel näher an der Urwirbelsäule liegenden Ursegmentzellen abstammt. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Zebrafisch erhalten, wo hohe Konzentrationen von Hedgehog die Expression myotomaler Markergene induzieren und die Expression sklerotomaler Markergene unterdrücken (Hammerschmidt et al. (1996) supra). Im Gegensatz zu Amnioten stimmen diese Beobachtungen jedoch mit der Architektur des Fischembryos überein, da hier das Myotom die vorherrschende und mehr axiale Komponente der Ursegmente ist. Somit modifizierten die Modulation der Signalgebung von Shh und der Erwerb neuer signalgebender Faktoren möglicherweise die Ursegmentstruktur während der Wirbeltierevolution.
In den Extremitätenknospen von Wirbeltieren reguliert eine Untergruppe von posterioren Mesenchymzellen, die „Zone polarisierender Aktivität" (ZPA), die anteroposteriore Identität der Finger (ein Überblick wurde in Honig, L. S. (1981) Nature 291: 72-73, gegeben). Die ektopische Expression von Shh oder die Anwendung von in Shh-Peptid eingeweichten Kügelchen ahmt die Wirkung von anterioren ZPA-Transplantaten nach, wobei eine Spiegelbildverdopplung der Finger erzeugt wird (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra (2g). Somit hängt die Identität der Finger offensichtlich in erster Linie von der Shh-Konzentration ab, obwohl es möglich ist, dass andere Signale diese Information über die beträchtlichen Entfernungen, die für die AP-Musterbildung (100 bis 150 μm) offensichtlich erforderlich sind, weiterleiten können. Ähnlich wie die Wechselwirkung von Hh und Dpp in den Imaginalscheiben von Drosophila aktiviert Shh in den Extremitätenknospen von Wirbeltieren die Expression von Bmp2 (Francis, P. H. et al. (1994) Development 120: 209-218), einem Dpp-Homologen. Im Gegensatz zu Dpp in Drosophila kann Bmp2 jedoch die polarisierende Wirkung von Shh nach der ektopischen Anwendung in der Extremitätenknospe von Küken nicht nachahmen (Francis et al. (1994) supra). Zusätzlich zu der anteroposterioren Musterbildung ist Shh offensichtlich auch an der Regulierung des proximodistalen Herauswachsens der Extremitäten beteiligt, indem es die Synthese des Fibroblastenwachstumsfaktors FGF4 in der posterioren, apikalen Ektodermleiste induziert (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79: 993-1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371: 609-612).
Die enge Verwandtschaft zwischen Hedgehog-Proteinen und BMPs bleibt wahrscheinlich an vielen, jedoch vermutlich nicht allen Stellen der Hedgehog-Expression von Wirbeltieren erhalten. Von Shh wurde zum Beispiel gezeigt, dass es im Enddarm von Küken die Expression von Bmp4, einem anderen Dpp-Homologen von Wirbeltieren, induziert (Roberts, D. J. et al. (1995) Development 121: 3163-3174). Ferner zeigen Shh und Bmp2, 4 oder 6 eine auffallende Korrelation ihrer Expression in Epithel- und Mesenchymzellen des Magens, des Urogenitalsystems, der Lunge, der Zahnknospen und der Haarfollikel (Bitgood, M. J. und McMahon, A. P. (1995) Dev. Biol. 172: 126-138). Ferner wird Ihh, eines der zwei anderen Hedgehog-Gene von Mäusen, benachbart zu Bmp exprimiert, wobei Zellen im Darmkanal exprimiert werden und Knorpel entwickelt wird (Bitgood und McMahon (1995) supra).
Neuere Beweise schlagen ein Modell vor, in dem Ihh bei der Regulierung der chondrogenen Entwicklung eine entscheidende Rolle spielt (Roberts et al. (1995) supra). Während der Knorpelbildung gehen Chondrozyten von einem proliferierenden Zustand über einen intermediären prähypertrophen Zustand zu differenzierten hypertrophen Chondrozyten. Ihh wird in den prähypertrophen Chondrozyten exprimiert und löst eine signalgebende Kaskade aus, die zur Blockierung der Chondrozytendifferenzierung führt. Sein direktes Ziel ist das Perichondrium in der Nähe der Ihh-Expressionsdomäne, das durch die Expression von Gli und Patched (Ptc), konservierten Transkriptionszielen von Hedgehog-Signalen, antwortet (siehe nachstehend). Dies führt höchstwahrscheinlich zu einer sekundären Signalgebung, was zur Synthese von Parathormon-verwandtem Protein (PTHrP) im periartikulären Perichondrium führt. PTHrP selbst schickt Signale zu den prähypertrophen Chondrozyten zurück, was ihre weitere Differenzierung blockiert. Gleichzeitig unterdrückt PTHrP die Expression von Ihh, wodurch eine negative Rückkopplungsschleife gebildet wird, die die Geschwindigkeit der Chondrozytendifferenzierung moduliert.
Patched wurde ursprünglich in Drosophila als ein Segmentpolaritätsgen identifiziert, eines einer Gruppe von Entwicklungsgenen, die die Zelldifferenzierung innerhalb der einzelnen Segmente, die in einer homologen Reihe entlang der anteriorposterioren Achse des Embryos vorkommen, beeinflussen. Siehe Hooper, J. E. et al. (1989) Cell 59: 751; und Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341: 508. Expressionsmuster des Wirbeltierhomologen von Patched weisen auf seine Beteiligung an der Entwicklung des Neuralrohrs, des Skeletts, der Extremitäten, der kraniofazialen Struktur und der Haut hin.
Genetische und funktionelle Untersuchungen zeigen, dass Patched ein Teil der signalgebenden Kaskade von Hedgehog, eines evolutionär konservierten Wegs, der die Expression mehrerer stromabwärts gelegener Genen reguliert, ist. Siehe Perrimon, N. (1995) Cell 80: 517; und Perrimon, N. (1996) Cell 86: 513. Patched beteiligt sich an der konstitutiven Transkriptionsrepression der Zielgene; seine Wirkung wird durch ein sezerniertes Glykoprotein, das durch Hedgehog oder ein Wirbeltierhomologes kodiert wird, das eine Transkriptionsaktivierung induziert, gehemmt. Durch diesen Weg kontrollierte Gene schließen Mitglieder der Wnt-Familie und TGF-β-Familie ein.
Patched-Proteine besitzen zwei große extrazelluläre Domänen, zwölf Transmembransegmente und mehrere zytoplasmatische Segmente. Siehe Hooper, supra; Nakano, supra; Johnson, R. L. et al. (1996) Science 272: 1668; und Hahn, H. et al. (1996) Cell 85: 841. Die biochemische Rolle von Patched in dem signalgebenden Weg von Hedgehog ist unklar. Eine direkte Wechselwirkung mit dem Hedgehog-Protein wurde jedoch berichtet (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87: 553), und Patched kann zusammen mit einem anderen Transmembranprotein, das durch das Smoothened-Gen kodiert wird, an einem Hedgehog-Rezeptorkomplex beteiligt sein. Siehe Perrimon, supra; und Chen, supra.
Das menschliche Homologe von Patched wurde kürzlich kloniert und auf dem Chromosom 9q22.3 kartiert. Siehe Johnson, supra; und Hahn, supra. Diese Region ist an dem Basalzellnävussyndrom (BCNS) beteiligt, das durch Entwicklungsanomalien, einschließlich Alterationen der Rippen und kraniofazialer Alterationen, Anomalien der Hände und Füße und Spina bifida, gekennzeichnet ist.
BCNS führt auch zu einer Prädisposition für mehrere Tumortypen, von denen die häufigsten Basalzellenkarzinome (BCC) sind, die an vielen Stellen des Körpers vorkommen und innerhalb der ersten zwei Jahrzehnte des Lebens auftreten. Die meisten Fälle von BCC sind jedoch nicht mit dem Syndrom verbunden und entstehen sporadisch in kleiner Anzahl auf der Sonne ausgesetzten Stellen von Personen mittleren Alters oder älteren Personen nordeuropäischer Abstammung.
Neuere Untersuchungen an mit BCNS verbundenem und sporadischem BCC weisen darauf hin, dass ein Funktionsverlust beider Allele von Patched zur Entwicklung von BCC führt. Siehe Johnson, supra; Hahn, supra; und Gailani, M. R. et al. (1996) Nature Genetics 14: 78. Deletionen einzelner Allele des Chromosoms 9q22.3 kommen sowohl bei sporadischem als auch hereditärem BCC häufig vor. Eine Kopplungsanalyse offenbarte, dass das defekte, vererbte Allel beibehalten wurde, und das normale Allel in Tumoren aus BCNS-Patienten verschwunden war.
Sporadische Tumoren zeigten auch einen Verlust beider funktioneller Allele von Patched. Von zwölf Tumoren, in denen Patched-Mutationen mit einem Durchmusterungstest für Einzelstrang-Konformationspolymorphismus identifiziert wurden, wiesen neun eine Chromosomendeletion des zweiten Allels auf, und die anderen drei wiesen in beiden Allelen inaktivierende Mutationen auf (Gailani, supra). Die Alterationen kamen nicht in der entsprechenden Keimbahn-DNA vor.
Die meisten der identifizierten Mutationen führten zu vorzeitigen Stoppcodons oder Rasterverschiebungen. Lench, N. J. et al., Hum. Genet., Okt. 1997, 100(5-6): 497-502. Mehrere waren jedoch Punktmutationen, die entweder in extrazellulären oder in zytoplasmatischen Domänen zu Aminosäuresubstitutionen führten. Diese Mutationsstellen können eine funktionelle Bedeutung für die Wechselwirkung mit extrazellulären Proteinen oder mit zytoplasmatischen Mitgliedern des stromabwärts gelegenen signalgebenden Wegs aufweisen.
Die Beteiligung von Patched an der Hemmung der Genexpression und das Vorkommen häufiger Alleldeletionen von Patched im BCC unterstützen eine Tumorunterdrückungsfunktion für dieses Gen. Seine Rolle bei der Regulierung von Genfamilien, von denen bekannt ist, dass sie an der Zellsignalgebung und interzellulären Kommunikation beteiligt sind, stellt einen möglichen Mechanismus der Tumorunterdrückung bereit.
WO-A-98/57933 offenbart eine spezielle Verbindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon sowie Verfahren zur Herstellung und Zwischenverbindungen bei der Herstellung davon und ein Verfahren, um Endothelin antagonistisch zu beeinflussen.
Ferner beschreibt WO-A-98/30576 zwei Polypeptide, die nach der spezifischen Spaltung an einer G∃CF-Stelle, die durch die autoproteolytische Domäne in dem nativen Protein erkannt wird, gewonnen werden.
Ferner betrifft WO-A-98/33797 definierte Verbindungen, ihre pharmazeutisch verträglichen Salze oder Hydrate davon und medizinische Zusammensetzungen, die dieselben als Wirkstoff enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung spezieller Verbindungen für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivierung eines Hedgehog-Wegs in einer Zelle sowie ein Verfahren zur Hemmung der Aktivierung eines Hedgehog-Wegs in vitro in einer Zelle zur Verfügung. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittelzubereitungen, die die vorstehend erwähnten speziellen Verbindungen umfassen. Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend erwähnten speziellen Verbindungen für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs. Ferner stellt die vorliegende Erfindung bestimmte definierte Verbindungen bereit.
Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung Verwendungen, Verfahren und Arzneimittelzubereitungen zur Hemmung der Aktivierung des signalgebenden Wegs von Hedgehog bereit, z.B. um abweichende Wachstumszustände, die sich aus Phänotypen, wie Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme, ergeben, zu hemmen, wobei die Zelle mit einem Mittel, wie einem kleinen Molekül, in einer ausreichenden Menge in Kontakt zu bringen ist, um eine normale Ptc-Aktivität agonistisch zu beeinflussen, eine normale Hedgehog-Aktivität antagonistisch zu beeinflussen oder eine Smoothened-Aktivität antagonistisch zu beeinflussen, z.B. um den abweichenden Wachstumszustand umzukehren oder zu regulieren.
Die 1 bis 31 stellen zur Herstellung von Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, verwendbare Reaktionen dar.
Die 32a-32c veranschaulicht repräsentative Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden.
Die 33A zeigt die Expression von Gli-1-mRNA in Zellen, die mit Träger (Bahn 1); 5 μM Jervin, der positiven Kontrollverbindung (Bahn 2); und 1 μM D (Bahn 3) behandelt wurden. Verglichen mit dem Träger verringerten D und Jervin die Expression von Gli-1-mRNA wesentlich.
Die 33B zeigt, dass D und Jervin die Konzentrationen von Gli-1-mRNA hemmten, was durch quantitative Echtzeit-PCR gemessen wurde.
Die 34A zeigt, dass die Zugabe von Shh-Protein zu gezüchteten Hautexplantaten zu einer Ptc-Aktivierung führte, was durch die Blaufärbung (X-gal) dieser Kulturen angezeigt wurde. Histologieproben zeigen intensiv gefärbte Zellen mit basophilen Zellkernen und einem hohen Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma (H&E [10x] und H&E [40x]). Diese Strukturen ähneln BCCs insofern, als sie in der ganzen Hautschicht in Clustern angeordnet und durch Palisaden normal aussehender Hautzellen getrennt sind. Eine Blaufärbung (Eosin + X-gal) zeigt an, dass der Patched-Weg in Zellen innerhalb der BCC-ähnlichen Strukturen aktiv war.
Die 34B veranschaulicht, dass BCC-ähnliche Cluster, von denen einer durch den Pfeil gezeigt wird, in Hautausstanzungen von Mäusen Keratin-14 (braunes Reaktionsprodukt), einen Marker undifferenzierter Keratinozyten, exprimierten. Undifferenzierte Basalzellen in der Epidermis waren ebenfalls Keratin-14-positiv. Von menschlichen BCCs wurde berichtet, dass sie Keratin-14 exprimieren.
Die 35A zeigt, dass zunehmende Konzentrationen von D mit einer dosisabhängigen Abnahme des Grads an lacZ-Reporter-Enzymaktivität in Zusammenhang stehen. Niedrigere Werte der lacZ-Aktivität weisen auf eine verringerte Aktivität des Patched-Wegs in Gegenwart von Shh-Protein hin.
Die 35B zeigt eine Färbung von mit D behandelten Explantaten und zeigt, dass, verglichen mit der intensiven X-gal-Färbung von Hautausstanzungen, die mit Shh-Protein allein behandelt wurden, 0,2 μM D die X-gal-Färbung verringerte, was eine Herunterregulierung der Expression des Ptc-Gens anzeigt.
35C stellt Histologieproben von mit D behandelten Hautausstanzungen dar (untere Reihe), was darauf hinweist, dass die Behandlung das Auftreten von durch Shh induzierten BCC-ähnlichen Strukturen hemmte.
Die 36 stellt dar, dass Hautausstanzungen, die 6 Tage mit exogenem Shh-Protein allein behandelt wurden, verglichen mit denen, die mit Träger allein behandelt wurden, eine intensive X-gal-Färbung zeigten (obere Reihe). Hautausstanzungen, die mit 10, 20 und 50 μM D 5 Stunden vorbehandelt wurden, bevor sie mit exogenem Shh-Protein behandelt wurden, zeigten eine vollständige Hemmung der durch das Shh-Protein induzierten Hochregulierung des Patched-Wegs (untere Reihe – 3 Objektträger auf der rechten Seite). Keine Hemmung wurde beobachtet, wenn die mit Träger vorbehandelten Hautausstanzungen mit exogenem Shh-Protein behandelt wurden, was durch eine intensive X-gal-Färbung gezeigt wurde (untere Reihe, auf der linken Seite). Die kurze Dauer der Vorbehandlung entsprach im Wesentlichen einer 6-tägigen Behandlung mit D, bezogen auf den Grad der Hemmung durch Ptc (Vergleich der oberen und unteren Reihe).
Die 37A zeigt, dass D mit entweder 1 oder 5 μM, verglichen mit Träger-behandelten Explantaten, die Größe und Zahl von durch Shh induzierten BCC-ähnlichen Strukturen in behandelten Hautausstanzungen wesentlich verringerte.
Die 37B veranschaulicht, dass nach 2-tägiger Behandlung mit 5 μM D (rechts) oder Träger (links) apoptotische Kerne innerhalb der BCC-ähnlichen Strukturen auftraten, was durch die braune Farbe auf den Objektträgern auf der rechten Seite angezeigt wurde.
Die 38A zeigt, dass eine Kurzzeitbehandlung mit D die Menge an X-gal-Färbung verringerte, was auf eine Herunterregulierung der Wegaktivität, verglichen mit dem Träger, hinweist.
Die 38B zeigt, dass D sogar in einer Konzentration von 1 μM die Regression von X-gal- positiven BCC-ähnlichen Strukturen, verglichen mit dem Träger, induzierte.
Die 38C stellt dar, dass die Kurzzeitbehandlung mit D die Gli-1-Transkription vollständig herunterregulierte (links). Diese Wirkung war für den Patched-Weg offensichtlich spezifisch und war nicht einfach auf eine allgemeine Zytotoxizität zurückzuführen, was durch die ziemlich konstanten mRNA-Konzentrationen eines Haushaltsenzyms, GAPDH, gezeigt wurde (rechts).
39A: Eine X-gal-Färbung der behandelten Explantate zeigte, dass in Gegenwart von Träger allein gezüchtete Hautausstanzungen intensiv blau gefärbte Herde entwickelten, die auf eine Hochregulierung des Patched-Wegs und der BCC-Strukturen hinwiesen. Verglichen mit dem Träger, verringerte 5 μM D, wie die positive Kontrolle Jervin, die Zahl und Größe von BCC-Strukturen (blaue Flecken) stark.
39B: Histologieproben zeigten, dass 5 μM D die Zahl von ultraviolett induzierten BCC-Strukturen, verglichen mit der Trägerkontrolle, verringerte.
39C: In Hautausstanzungen aus transgenen Mäusen hemmte D mit Konzentrationen von 1 und 5 μM die Konzentration von Gli-1-mRNA, verglichen mit Hautausstanzungen aus Mäusen, die mit Träger allein behandelt wurden (links). Diese Hemmung wurde offensichtlich nicht durch eine nicht-spezifische Toxizität verursacht, da ein statistischer Vergleich (unter Verwendung von ANOVA) der mRNA-Konzentrationen des Gens, das unter anderem das Haushaltsenzym GAPDH kodiert, keinen wesentlichen Unterschied in der allgemeinen Zellstoffwechselaktivität zeigte (rechts).
40A: Die für BCCs charakteristischen morphologischen Merkmale, wie Inseln undifferenzierter Basalzellen, und in einigen Fällen Palisadenbildung peripherer Zellen und Stromaspaltung wurden beibehalten, wenn Kulturen mit H&E gefärbt wurden.
40B: Das Gli-1-Gen, ein Hauptindikator der Signalgebung von Patched, blieb in hohem Grad aktiv, was rot angezeigt wurde.
41: Eine quantitative Hybridisierung in situ zeigt, dass der Grad an Gli-Expression in den mit D behandelten Proben, verglichen mit Träger-behandelten Kontrollen, verringert ist.
I. Überblick
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erkenntnis, dass durch Hedgehog, Patched (Ptc), Gli und/oder Smoothened regulierte Signaltransduktionswege durch kleine Moleküle, wenigstens teilweise, gehemmt werden können. Ohne an einer besonderen Theorie festhalten zu wollen, die Aktivierung eines Rezeptors kann der Mechanismus sein, durch den diese Mittel wirken. Die Fähigkeit dieser Mittel, die Proliferation von Zellen mit Patched-Funktionsverlust (Ptc^lof)zu hemmen, kann zum Beispiel auf die Fähigkeit solcher Moleküle, mit Hedgehog, Patched oder Smoothened in Wechselwirkung zu treten oder wenigstens die Fähigkeit dieser Proteine zur Aktivierung eines durch Hedgehog, Ptc und/oder Smoothened vermittelten Signaltransduktionswegs zu stören, zurückgeführt werden.
Es ist daher besonders beabsichtigt, dass diese kleinen Moleküle, die Aspekte der Signaltransduktionsaktivität von Hedgehog, Ptc oder Smoothened stören, auch die Proliferation (oder andere biologische Konsequenzen) in normalen Zellen und/oder Zellen, die den Phänotyp Patched-Funktionsverlust, den Phänotyp Hedgehog-Funktionszunahme oder den Phänotyp Smoothened-Funktionszunahme aufweisen, hemmen können. Somit ist es beabsichtigt, dass in bestimmten Ausführungsformen diese Verbindungen zur Hemmung der Hedgehog-Aktivität in normalen Zellen, die z.B. keine genetische Mutation, die den Hedgehog-Weg aktiviert, aufweisen, verwendbar sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind die vorliegenden Inhibitoren organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2500 amu, stärker bevorzugt weniger als 1500 amu und noch stärker bevorzugt weniger als 750 amu und können wenigstens einige der biologischen Aktivitäten von Hedgehog-Proteinen, bevorzugt besonders in Zielzellen, hemmen.
Somit schließen die Verwendungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung kleiner Moleküle, die die Hemmung der Signalgebung von Hedgehog durch Ptc, wie durch die Hemmung der Aktivierung von Smoothened oder stromabwärts gelegenen Komponenten des Signalwegs, agonistisch beeinflussen, bei der Regulierung der Wiederherstellung und/oder funktionellen Leistung eines breiten Bereiches von Zellen, Geweben und Organen, einschließlich normaler Zellen, Gewebe und Organe, sowie der, die den Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, den Phänotyp Hedgehog-Funktionszunahme oder den Phänotyp Smoothened-Funktionszunahme aufweisen, ein. Das vorliegende Verfahren weist beispielsweise therapeutische und kosmetische Anwendungen auf, die sich über die Regulierung von neuralem Gewebe, Knochen- und Knorpelbildung und -wiederherstellung, Regulierung der Spermatogenese, Regulierung von glatter Muskulatur, Regulierung von Lunge, Leber und anderen Organen, die aus dem primitiven Darmkanal entstehen, Regulierung der hämatopoetischen Funktion, Regulierung von Haut- und Haarwachstum etc. erstrecken. Ferner werden die vorliegenden Verfahren an Zellen, die in Kultur (in vitro bereitgestellt werden, durchgeführt. Die vorliegenden Verwendungen können an Zellen in einem ganzen Tier in vivo durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 (deren Beschreibungen hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen sind).
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die vorliegende Verwendung oder das vorliegende Verfahren in der Behandlung von Epithelzellen, die den Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, den Phänotyp Hedgehog-Funktionszunahme oder den Phänotyp Smoothened-Funktionszunahme aufweisen, bestehen. Das vorliegende Verfahren kann beispielsweise bei der Behandlung oder Vorbeugung von Basalzellenkarzinom oder mit dem Hedgehog-Weg verbundenen anderen Erkrankungen verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein vorliegender Antagonist, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, durch Bindung an Smoothened die Aktivierung eines Hedgehog-Wegs hemmen. In bestimmten Ausführungsformen kann ein vorliegender Antagonist durch Bindung an Patched die Aktivierung eines Hedgehog-Wegs hemmen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren als Teil eines Behandlungsschemas gegen ein malignes Medulloblastom und andere maligne neuroektodermale Primärtumoren des ZNS verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittelzubereitungen, umfassend einen Hedgehog-Antagonisten, Ptc-Agonisten oder Smoothened-Antagonisten, wie hier beschrieben, als Wirkstoff bereit, der in einer Menge formuliert wurde, die zur Hemmung der Proliferation oder anderer biologischer Konsequenzen von Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme in vivo ausreicht.
Die vorliegenden Behandlungen unter Verwendung von Hedgehog-Antagonisten, Patched-Agonisten oder Smoothened-Antagonisten können sowohl bei menschlichen als auch tierischen Patienten wirksam sein. Tierische Patienten, auf die die Erfindung anwendbar ist, erstrecken sich sowohl über Haustiere als auch Nutztiere, die entweder als Heimtiere oder für kommerzielle Zwecke gezüchtet werden. Beispiele sind Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine und Ziegen.
II. Definitionen
Geeigneterweise werden hier bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und den angefügten Ansprüchen verwendet wurden, zusammengetragen.
Der Ausdruck „abweichende Modifikation oder Mutation" eines Gens bezieht sich auf solche genetischen Läsionen, wie zum Beispiel Deletionen, Substitution oder Addition von Nukleotiden an ein Gen sowie umfassende chromosomale Umordnungen des Gens und/oder eine anomale Methylierung des Gens. Desgleichen bezieht sich Fehlexpression eines Gens auf abweichende Transkriptiongrade des Gens, bezogen auf diese Grade in einer normalen Zelle unter ähnlichen Bedingungen, sowie Nicht-Wildtyp-Splicing von aus dem Gen transkribierter mRNA.
„Basalzellenkarzinome" kommen in einer Vielzahl von klinischen und histologischen Formen, wie nodulären/ulzerativen, superfiziellen, pigmentierten, Morphea-ähnlichen, Fibroepitheliom und Nävussyndrom, vor. Basalzellenkarzinome sind die häufigsten Hautneoplasmen, die bei Menschen gefunden werden. Die Mehrheit neuer Fälle von nicht-melanombedingten Hautkrebserkrankungen fällt in diese Kategorie.
„Brandwunden" beziehen sich auf Fälle, in denen von einem Individuum auf Grund von Hitze und/oder chemischen Mitteln große Hautoberflächen entfernt oder verloren wurden.
Der Begriff „Karzinom" bezieht sich auf eine maligne Neubildung, die aus Epithelzellen besteht, und die zur Infiltration in umgebende Gewebe neigt und Metastasen verursacht. Beispielhafte Karzinome umfassen: „Basalzellenkarzinom", das ein epithelialer Tumor der Haut ist, der, obwohl er selten metastasiert, die Fähigkeit zur lokalen Invasion und Zerstörung aufweist; „Plattenepithelkarzinom", das sich auf Karzinome bezieht, die aus dem Plattenepithel entstehen und kubische Zellen aufweisen; „Karzinosarkom", das maligne Tumoren, die aus karzinomatösem und sarkomatösem Gewebe bestehen, einschließt; „adenoid-zystisches Karzinom", ein Karzinom, das durch Zylinder oder Bänder aus Hyalin oder muzinösem Stroms, die durch Nester oder Stränge kleiner Epithelzellen getrennt oder davon umgeben sind, gekennzeichnet ist, und das in den Brust- und Speicheldrüsen und Schleimdrüsen der Atemwege vorkommt; „Epidermoidkarzinom", das sich auf kanzeröse Zellen bezieht, die dazu neigen, sich auf dieselbe Art und Weise wie die der Epidermis zu differenzieren, d.h. sie neigen zur Bildung von Stachelzellen und unterliegen einer Verhornung; „nasopharyngeales Karzinom", das sich auf einen malignen Tumor bezieht, der in der Epithelauskleidung des Raumes hinter der Nase entsteht; und „Nierenzellkarzinom", das ein Karzinom des Nierenparenchyms betrifft, das aus Tubuluszellen in verschiedenen Anordnungen besteht. Andere karzinomatöse epitheliale Tumoren sind „Papillome", die sich sich auf benigne Tumoren beziehen, die sich vom Epithel ableiten und das Papillomavirus als Erreger aufweisen; und „Epidermoidome", die sich auf einen Hirn- oder Hirnhauttumor beziehen, der durch den Einschluss ektodermaler Elemente zum Zeitpunkt des Schließens der Neuralrinne gebildet wurde.
Das „Corium" oder die „Dermis" bezieht sich auf die Schicht der Haut tief unter der Epidermis, die aus einem dichten Bett von Gefäßbindegewebe besteht und die Nerven und die endständigen Sinnesorgane enthält. Die Haarwurzeln und Talg- und Schweißdrüsen sind Strukturen der Epidermis, die tief in die Dermis eingebettet sind.
„Zahngewebe" bezieht sich auf Gewebe im Mund, das Epithelgewebe ähnlich ist, zum Beispiel Zahnfleischgewebe. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Behandlung von Paradontose verwendbar.
„Hautgeschwüre" beziehen sich auf Läsionen auf der Haut, die durch einen oberflächlichen Verlust von Gewebe, in der Regel bei einer Entzündung, hervorgerufen werden. Hautgeschwüre, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Dekubitusgeschwüre, diabetische Geschwüre, venöse Stauungsgeschwüre und arterielle Geschwüre ein. Dekubituswunden beziehen sich auf chronische Geschwüre, die sich durch Druck, der eine längere Zeitdauer auf Hautbereiche ausgeübt wurde, ergeben. Wunden dieses Typs werden häufig als Bettgeschwüre oder Druckgeschwüre bezeichnet. Venöse Stauungsgeschwüre ergeben sich aus der Stagnation von Blut oder anderen Flüssigkeiten aus defekten Venen. Arterielle Geschwüre beziehen sich auf nekrotische Haut im Bereich der Arterien mit einem schlechten Blutfluss.
Der Begriff „ED₅₀" bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, die 50 % seiner maximalen Antwort oder Wirkung erzeugt.
Eine „wirksame Menge", z.B. eines Hedgehog-Antagonisten, hinsichtlich des vorliegenden Verfahrens oder der vorliegenden Verwendung bezieht sich auf eine Menge des Antagonisten in einer Zubereitung, die, wenn sie als Teil eines gewünschten Dosierungsschemas angewendet wird, z.B. eine Änderung der Zellproliferationsgeschwindigkeit und/oder des Differenzierungszustandes einer Zelle und/oder der Überlebensrate einer Zelle gemäß klinisch akzeptablen Standards für die zu behandelnde Erkrankung oder den kosmetischen Zweck bewirkt.
Die Begriffe „Epithelien", „epithelial" und „Epithel" beziehen sich auf die zelluläre Bedeckung innerer und äußerer Körperoberflächen (kutan, mukös und serös), einschließlich der Drüsen und davon abgeleiteter anderer Strukturen, z.B. Epithelzellen der Hornhaut, Speiseröhre, Epidermis und Haarfollikel. Ein anderes beispielhaftes Epithelgewebe umfasst: das Riechepithel, das das Pseudoschichtenepithel ist, das die Riechregion der Nasenhöhle auskleidet und die Rezeptoren für den Geruchssinn enthält; das Drüsenepithel, das sich auf ein Epithel bezieht, das aus sezernierenden Zellen besteht; und das Plattenepithel, das sich auf ein Epithel bezieht, das aus abgeflachten, plattenartigen Zellen besteht. Der Begriff Epithel kann sich auch auf Übergangsepithel beziehen, wie das, das charakteristischerweise in der Auskleidung von Hohlorganen gefunden wird, die auf Grund von Kontraktion und Dehnung einer großen mechanischen Änderung ausgesetzt sind, z.B. Gewebe, das einen Übergang zwischen mehrschichtigem Pattenepithel und Zylinderepithel darstellt.
Der Begriff „Epithelisierung" bezieht sich auf die Heilung durch das Wachstum von Epithelgewebe über einer freigelegten Oberfläche.
Der Begriff „epidermale Drüse" bezieht sich auf eine Aggregation von Zellen, die mit der Epidermis verbunden sind und auf die Sezernierung oder Ausscheidung von Materialien spezialisiert sind, die nicht mit ihren gewöhnlichen metabolischen Notwendigkeiten zusammenhängen. „Talgdrüsen" sind zum Beispiel holokrine Drüsen im Corium, die eine ölige Substanz und Talg sezernieren. Der Begriff „Schweißdrüsen" bezieht sich auf im Corium oder subkutanen Gewebe befindliche Drüsen, die Schweiß sezernieren, indem ein Gang an die Körperoberfläche geöffnet wird.
Der Begriff „Epidermis" bezieht sich auf die äußerste und nichtvaskuläre Schicht der Haut, die aus dem embryonalen Ektoderm abgeleitet ist, wobei die Dicke von 0,07 bis 1,4 mm variiert. An den Hand- und Fußsohlenflächen umfasst sie von innen nach außen fünf Schichten: die Basalzellenschicht, die aus senkrecht angeordneten Zylinderzellen besteht; die Stachelzellen- oder Stratum-spinosum-Schicht, die aus abgeflachten, polyedrischen Zellen mit kurzen Fortsätzen oder Stacheln besteht; die Körnerzellenschicht, die aus abgeflachten Körnerzellen besteht; die Glanzschicht, die aus mehreren Schichten heller, durchsichtiger Zellen, in denen die Kerne undeutlich sind oder fehlen, besteht; und die Hornzellenschicht, die aus abgeflachten, verhornten, kernlosen Zellen besteht. In der Epidermis der allgemeinen Körperoberfläche fehlt in der Regel die Glanzschicht.
„Exzisionswunden" schließen Risse, Abschürfungen, Schnitte, Stiche oder Lazerationen in der Epithelschicht der Haut ein und können sich in die Hautschicht und sogar in das subkutane Fett und darüber hinaus ausdehnen. Exzisionswunden können sich aus chirurgischen Verfahren oder aus einer versehentlichen Durchdringung der Haut ergeben.
Der „Wachstumszustand" einer Zelle bezieht sich auf die Proliferationsgeschwindigkeit der Zelle und/oder den Differenzierungszustand der Zelle. Ein „veränderter Wachstumszustand" ist ein Wachstumszustand, der durch eine anomale Proliferationsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist, indem z.B. eine Zelle eine erhöhte oder erniedrigte Proliferationsgeschwindigkeit, bezogen auf eine normale Zelle, zeigt.
Der Begriff „Haar" bezieht sich auf eine fadenförmige Struktur, besonders die spezialisierte epidermale Struktur, die aus Keratin besteht und sich aus einer im Corium eingebetteten Papille entwickelt und nur von Säugern erzeugt wird und für diese Gruppe von Tieren charakteristisch ist. „Haar" kann sich auch auf die Ansammlung solcher Haare beziehen. Ein „Haarfollikel" bezieht sich auf eine der röhrenförmigen Einstülpungen der Epidermis, die die Haare einschließen und aus denen die Haare wachsen. „Epithelzellen der Haarfollikel" beziehen sich auf Epithelzellen, die die Hautpapille in dem Haarfollikel umgeben, z.B. Sternzellen, Zellen der äußeren Wurzelscheide, Matrixzellen und Zellen der inneren Wurzelscheide. Solche Zellen können normale, nicht-maligne Zellen oder transformierte/immortalisierte Zellen sein.
Der Begriff „Hedgehog-Antagonist" bezieht sich auf ein Mittel, das die biologische Aktivität von Patched verstärkt oder rekapituliert, wie durch eine Unterdrückung der Transkription von Zielgenen. Bevorzugte Hedgehog-Antagonisten können verwendet werden, um einen Ptc-Funktionsverlust und/oder eine Smoothened-Funktionszunahme zu überwinden, wobei die letzteren auch als Smoothened-Antagonisten bezeichnet werden. Der Begriff „Hedgehog-Antagonist", wie hier verwendet, bezieht sich nicht nur auf ein beliebiges Mittel, das durch eine direkte Hemmung der normalen Funktion des Hedgehog-Proteins wirken kann, sondern auch auf ein beliebiges Mittel, das den signalgebenden Weg von Hedgehog hemmt und somit die Funktion von Ptc rekapituliert.
Der Begriff „Hedgehog-Funktionszunahme" bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines Ptc-Gens, Hedgehog-Gens oder Smoothened-Gens, z.B. eine abweichende Aktivierung eines Hedgehog-Wegs, oder eine Abnahme (oder einen Verlust) des Expressionsgrads eines solchen Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein ähnelt. Die Funktionszunahme kann einen Verlust der Fähigkeit des Ptc-Genprodukts, den Expressionsgrad von Ci-Genen, z.B. Gli-1, Gli-2 und Gli-3, zu regulieren, einschließen. Der Begriff „Hedgehog-Funktionszunahme" wird hier auch verwendet, um auf einen beliebigen ähnlichen zellulären Phänotyp Bezug zu nehmen (der z.B. eine übermäßige Proliferation zeigt), der auf Grund einer Alteration irgendwo in dem Hedgehog-Signaltransduktionsweg vorkommt, die eine Modifikation oder Mutation von Hedgehog selbst einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Eine Tumorzelle mit einer anomal hohen Proliferationsgeschwindigkeit auf Grund einer Aktivierung des signalgebenden Wegs von Hedgehog weist zum Beispiel den Phänotyp „Hedgehog-Funktionszunahme" auf, sogar wenn Hedgehog in dieser Zelle nicht mutiert ist.
Wie hier verwendet, beziehen sich „immortalisierte Zellen" auf Zellen, die durch chemische und/oder rekombinante Mittel so verändert wurden, dass die Zellen die Fähigkeit aufweisen, durch eine unbestimmte Anzahl von Teilungen in Kultur zu wachsen.
„Inneres Epithelgewebe" bezieht sich auf Gewebe im Inneren des Körpers, das ähnliche Eigenschaften wie die epidermale Schicht in der Haut aufweist. Beispiele schließen die Auskleidung des Darms ein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Förderung der Heilung bestimmter innerer Wunden, zum Beispiel Wunden, die sich aus einem chirurgischen Eingriff ergeben, verwendbar.
Der Begriff „Keratose" bezieht sich auf eine proliferative Hautkrankheit, die durch Hyperplasie der Hornschicht der Epidermis gekennzeichnet ist. Beispielhafte keratotische Erkrankungen schließen Keratosis follicularis, Keratosis palmaris et plantaris, Keratosis pharyngea, Keratosis pilaris und Keratosis actinica ein.
Der Begriff „LD₅₀" bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, die bei 50 % der Versuchstiere letal ist.
Der Begriff „Nagel" bezieht sich auf die hornige, kutane Platte auf der dorsalen Oberfläche des distalen Endes eines Fingers oder Zehs.
Der Begriff „Patched-Funktionsverlust" bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines Ptc-Gens, z.B. eine abweichende Aktivierung eines Hedgehog-Wegs, oder einen verringerten Expressionsgrad des Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein ähnelt. Der Funktionsverlust kann einen Verlust der Fähigkeit des Ptc-Genprodukts, den Expressionsgrad von Ci-Genen, z.B. Gli-1, Gli-2 und Gli-3, zu regulieren, einschließen. Der Begriff „Ptc-Funktionsverlust" wird hier auch verwendet, um auf einen beliebigen ähnlichen zellulären Phänotyp Bezug zu nehmen (der z.B. eine übermäßige Proliferation zeigt), der auf Grund einer Alteration irgendwo in dem Hedgehog-Signaltransduktionsweg vorkommt, die eine Modifikation oder Mutation von Ptc selbst einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Eine Tumorzelle mit einer anomal hohen Proliferationsgeschwindigkeit auf Grund einer Aktivierung des signalgebenden Wegs von Hedgehog weist zum Beispiel den Phänotyp „Ptc-Funktionsverlust" auf, sogar wenn Ptc in dieser Zelle nicht mutiert ist.
Ein „Patient" oder „Versuchstier", der/das durch das vorliegende Verfahren behandelt werden soll, kann entweder einen Menschen oder ein nicht-menschliches Tier bedeuten.
Der Begriff „Prodrug" soll Verbindungen umfassen, die unter physiologischen Bedingungen in die Arzneistoffe der vorliegenden Erfindung umgewandelt werden. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung einer Prodrug soll ausgewählte Einheiten einschließen, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysiert werden, um das gewünschte Molekül freizusetzen. In anderen Ausführungsformen wird die Prodrug durch eine enzymatische Aktivität des Wirtstiers umgewandelt.
Wie hier verwendet, beziehen sich „Proliferieren" und „Proliferation" auf Zellen, die eine Mitose erfahren.
In dieser ganzen Anmeldung bezieht sich der Begriff „proliferative Hautkrankheit" auf eine beliebige Krankheit/Erkrankung der Haut, die durch eine unerwünschte oder abweichende Proliferation von kutanem Gewebe gekennzeichnet ist. Diese Krankheiten sind typischerweise durch eine Proliferation epidermaler Zellen oder eine unvollständige Zelldifferenzierung gekennzeichnet und schließen zum Beispiel X-chromosomal rezessive Ichthyose, Psoriasis, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, epidermolytische Hyperkeratose und seborrhoische Dermatitis ein. Epidermodysplasie ist zum Beispiel eine Form einer Fehlentwicklung der Epidermis. Ein anderes Beispiel ist „Epidermolyse", die sich auf einen aufgelockerten Zustand der Epidermis mit Bildung von Bläschen und Blasen entweder spontan oder an der Stelle eines Traumas bezieht.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Psoriasis" auf eine hyperproliferative Hautkrankheit, die die Regulationsmechanismen der Haut ändert. Im besonderen werden Läsionen gebildet, die mit primären und sekundären Alterationen der epidermalen Proliferation, entzündlichen Reaktionen der Haut und der Expression von Regulationsmolekülen, wie Lymphokinen und entzündlichen Faktoren, verbunden sind. Psoriatische Haut ist morphologisch durch einen erhöhten Umsatz von epidermalen Zellen, eine verdickte Epidermis, anomale Keratinisierung, entzündliche Zellinfiltrate in die Dermisschicht und Infiltration polymorphkerniger Leukozyten in die Epidermisschicht, die zu einer Zunahme des Basalzellenzyklus führen, gekennzeichnet. Ferner sind hyperkeratotische und parakeratotische Zellen vorhanden.
Der Begriff „Haut" bezieht sich auf die äußere Schutzbedeckung des Körpers, die aus dem Corium und der Epidermis besteht und selbstverständlich die Schweiß- und Talgdrüsen sowie die Haarfollikelstrukturen enthält. In der ganzen vorliegenden Anmeldung kann das Adjektiv „kutan" verwendet werden, und sollte sich selbstverständlich allgemein auf Merkmale der Haut beziehen, wie es für den Kontext, in dem sie verwendet werden, geeignet ist.
Der Begriff „Smoothened-Funktionszunahme" bezieht sich auf eine abweichende Modifikation oder Mutation eines Smo-Gens, z.B. eine abweichende Aktivierung eines Hedgehog-Wegs, oder einen erhöhten Expressionsgrad des Gens, was zu einem Phänotyp führt, der dem Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Hedgehog-Protein ähnelt. Ohne an einer besonderen Theorie festhalten zu wollen, wird angemerkt, dass Ptc nicht direkt in die Zelle Signale übertragen kann, sondern vielmehr mit Smoothened, einem anderen membrangebundenen Protein, das sich stromabwärts von Ptc in der Signalgebung von Hedgehog befindet, in Wechselwirkung tritt (Marigo et al. (1996) Nature 384: 177-179). Das Gen Smo ist ein Segmentpolaritätsgen, das für die korrekte Musterbildung jedes Segments in Drosophila erforderlich ist (Alcedo et al. (1996) Cell 86: 221-232). Menschliche Homologe von Smo wurden identifiziert. Siehe zum Beispiel Stone et al. (1996) Nature 384: 129-134, und GenBank-Eintragung U84401. Das Smoothened-Gen kodiert ein integrales Membranprotein mit Eigenschaften heterotrimerer, G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, d.h. 7 Transmembranregionen. Dieses Protein zeigt eine Homologie zu dem Frizzled-(Fz)-Protein von Drosophila, einem Mitglied des Wingless-Wegs. Ursprünglich wurde angenommen, dass Smo einen Rezeptor des Hh-Signals kodiert. Dieser Vorschlag wurde jedoch später widerlegt, da bewiesen wurde, dass Ptc der Hh-Rezeptor ist. Zellen, die Smo exprimieren, können Hh nicht binden, was zeigt, dass Smo nicht direkt mit Hh in Wechselwirkung tritt (Nusse (1996) Nature 384: 119-120). Es wird vielmehr angenommen, dass die Bindung von Sonic-Hedgehog (Shh) an seinen Rezeptor, PTCH, eine normale Hemmung von Smoothened (Smo) durch PTCH, ein 7-fach die Membran durchspannendes Protein, verhindert.
Kürzlich wurde berichtet, dass eine Aktivierung von Smoothened-Mutationen in sporadischem Basalzellenkarzinom, Xie et al. (1998) Nature 391: 90-2, und primitiven neuroektodermalen Tumoren des Zentralnervensystems, Reifenberger et al. (1998) Cancer Res. 58: 1798-803, vorkommt.
Der Begriff „therapeutischer Index" bezieht sich auf den als LD₅₀/ED₅₀ definierten therapeutischen Index eines Arzneistoffs.
Wie hier verwendet, bezieht sich „transformierte Zellen" auf Zellen, die sich spontan in einen Zustand uneingeschränkten Wachstums umwandelten, d.h. sie erwarben die Fähigkeit, durch eine unbestimmte Anzahl von Teilungen in Kultur zu wachsen. Transformierte Zellen können hinsichtlich ihres Verlusts an Wachstumskontrolle durch solche Begriffe, wie neoplastisch, anaplastisch und/oder hyperplastisch, charakterisiert werden.
Der Begriff „Acylamino" ist in dem Fachgebiet bekannt und bezieht sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₉ wie vorstehend definiert ist, und R'₁₁ Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH₂)_m-R₈ bedeutet, wobei m und R₈ wie vorstehend definiert sind.
Der Begriff „aliphatischer Rest" bezieht sich hier auf einen unverzweigten, verzweigten oder cyclischen, aliphatischer Kohlenwasserstoffrest und schließt gesättigte und ungesättigte, aliphatische Reste, wie einen Alkylrest, einen Alkenylrest und einen Alkinylrest, ein.
Die Begriffe „Alkenyl" und „Alkinyl" beziehen sich auf ungesättigte, aliphatische Reste, die in der Länge und möglichen Substitution zu den vorstehend beschriebenen Alkylresten analog sind, die jedoch mindestens eine Doppel- beziehungsweise Dreifachbindung enthalten.
Die Begriffe „Alkoxyl" oder „Alkoxy", wie hier verwendet, beziehen sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen Sauerstoffatom. Repräsentative Alkoxylreste schließen Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen ein. Ein „Ether" besteht aus zwei Kohlenwasserstoffen, die durch einen Sauerstoff kovalent verbunden sind. Folglich ist der Substituent eines Alkylrestes, der den Alkylrest zu einem Ether macht, ein Alkoxyl oder ähnelt diesem, wie durch einen der Reste -O-Alkyl-, -O-Alkenyl, -O-Alkinyl, -O-(CH₂)_m-R₈ dargestellt werden kann, wobei m und R₈ wie vorstehend beschrieben sind.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf einen Rest aus gesättigten, aliphatischer Resten, einschließlich unverzweigter Alkylreste, verzweigter Alkylreste, Cycloalkylreste (alicyclischer Reste), alkylsubstituierter Cycloalkylreste und cycloalkylsubstituierter Alkylreste. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein unverzweigter oder verzweigter Alkylrest 30 oder weniger Kohlenstoffatome (z.B. C₁-C₃₀ für unverzweigte Ketten, C₃-C₃₀ für verzweigte Ketten) und stärker bevorzugt 20 oder weniger in seinem Gerüst auf. Desgleichen weisen bevorzugte Cycloalkylreste 3 bis 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur und stärker bevorzugt 5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in der Ringstruktur auf.
Ferner soll der Begriff „Alkyl" (oder „Niederalkyl"), wie in der ganzen Beschreibung, den Beispielen und Ansprüchen verwendet, sowohl „unsubstituierte Alkylreste" als auch „substituierte Alkylreste" einschließen, wobei sich die letzteren auf Alkyleinheiten mit Substituenten, die einen Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen, beziehen. Solche Substituenten können zum Beispiel ein Halogen, ein Hydroxyl, ein Carbonyl (wie ein Carboxyl, ein Alkoxycarbonyl, ein Formyl oder ein Acyl), ein Thiocarbonyl (wie einen Thioester, ein Thioacetat oder ein Thioformiat), ein Alkoxyl, ein Phosphoryl, ein Phosphat, ein Phosphonat, ein Phosphinat, ein Amino, ein Amido, ein Amidin, ein Imin, ein Cyano, ein Nitro, ein Azido, ein Sulfhydryl, ein Alkylthio, ein Sulfat, ein Sulfonat, ein Sulfamoyl, ein Sulfonamido, ein Sulfonyl, ein Heterocyclyl, ein Aralkyl oder eine aromatische oder heteroaromatische Einheit einschließen. Für Fachleute ist es selbstverständlich, dass die an der Kohlenstoffkette substituierten Einheiten, falls geeignet, selbst substituiert sein können. Die Substituenten eines substituierten Alkylrestes können beispielsweise substituierte und unsubstituierte Formen von Amino-, Azido-, Imino-, Amido-, Phosphoryl- (einschließlich Phosphonat und Phosphinat), Sulfonyl- (einschließlich Sulfat, Sulfonamido, Sulfamoyl und Sulfonat) und Silylgruppen sowie Ether, Alkylthioreste, Carbonylgruppen (einschließlich Ketonen, Aldehyden, Carboxylaten und Estern), -CF₃, -CN und dergleichen einschließen. Beispielhafte substituierte Alkylreste sind nachstehend beschrieben. Cycloalkylreste können mit Alkylresten, Alkenylresten, Alkoxyresten, Alkylthioresten, Aminoalkylresten, carbonylsubstituierten Alkylresten, -CF₃, -CN und dergleichen weiter substituiert sein.
Wenn die Anzahl von Kohlenstoffatomen nicht anders angegeben ist, bedeutet „Niederalkyl", wie hier verwendet, einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, der jedoch ein bis zehn Kohlenstoffatome und stärker bevorzugt ein bis sechs Kohlenstoffatome in seiner Gerüststruktur aufweist. Desgleichen weisen „Niederalkenyl" und „Niederalkinyl" ähnliche Kettenlängen auf. In der ganzen Beschreibung bevorzugte Alkylreste sind Niederalkylreste. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein hier als Alkyl bezeichneter Substituent ein Niederalkyl.
Der Begriff „Alkylthio" bezieht sich auf einen Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenem Schwefelatom. In bevorzugten Ausführungsformen wird die „Alkylthio" einheit durch einen der Reste -S-Alkyl, -S-Alkenyl, -S-Alkinyl und -S-(CH₂)_m-R₈ dargestellt, wobei m und R₈ wie vorstehend definiert sind. Repräsentative Alkylthioreste schließen Methylthio, Ethylthio und dergleichen ein.
Die Begriffe „Amin" und „Amino" sind in dem Fachgebiet bekannt und beziehen sich sowohl auf unsubstituierte als auch substituierte Amine, z.B. auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₉, R₁₀ und R'₁₀ jeweils unabhängig Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH₂)_m-R₈ bedeuten, oder R₉ und R₁₀ zusammengenommen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur vervollständigen; R₈ ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus bedeutet; und m null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist. In bevorzugten Ausführungsformen kann nur einer der Reste R₉ oder R₁₀ ein Carbonyl sein, z.B. bilden R₉, R₁₀ und der Stickstoff zusammen kein Imid. In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen bedeuten R₉ und R₁₀ (und gegebenenfalls R'₁₀) jeweils unabhängig Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH₂)_m-R₈. Somit bedeutet der Begriff „Alkylamin", wie hier verwendet, eine Amingruppe, wie vorstehend definiert, mit einem daran gebundenen substituierten oder unsubstituierten Alkyl, d.h. mindestens einer der Reste R₉ und R₁₀ ist ein Alkylrest.
Der Begriff „Amido" ist als ein aminosubstituiertes Carbonyl in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₉ und R₁₀ wie vorstehend definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen des Amids schließen keine Imide, die instabil sein können, ein.
Der Begriff „Aralkyl", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Alkylrest, der mit einem Arylrest (z.B. einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest) substituiert ist.
Der Begriff „Aryl", wie hier verwendet, schließt aromatische Reste mit einem 5-, 6- und 7-gliedrigen einzelnen Ring, der null bis vier Heteroatome einschließen kann, zum Beispiel Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin, Pyrimidin und dergleichen, ein. Diese Arylreste mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als „Arylheterocyclen" oder „heteroaromatische Verbindungen" bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, zum Beispiel Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, Heterocyclyl, aromatischen oder heteroaromatischen Einheiten, -CF₃, -CN oder dergleichen, substituiert sein. Der Begriff „Aryl" schließt auch polycyclische Ringsysteme mit zwei oder mehr cyclischen Ringen ein, in denen zwei oder mehr Kohlenstoffe zwei benachbarten Ringen (die Ringe sind „kondensierte Ringe") gemeinsam gehören, wobei mindestens einer der Ringe aromatisch ist, und z.B. die anderen cyclischen Ringe Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder heterocyclische Ringe sein können.
Der Begriff „Carbocyclus", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen aromatischen oder nichtaromatischen Ring, in dem jedes Atom des Rings Kohlenstoff ist.
Der Begriff „Carbonyl" ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt solche Einheiten ein, wie durch die allgemeine Formel dargestellt werden können:
wobei X eine Bindung ist oder Sauerstoff oder Schwefel bedeutet, und R₁₁ Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH₂)_m-R₈ oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz bedeutet, R'₁₁ Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH₂)_m-R₈ bedeutet, wobei m und R₈ wie vorstehend definiert sind. Wenn X Sauerstoff ist, und R₁₁ oder R'₁₁ kein Wasserstoff ist, stellt die Formel einen „Ester" dar. Wenn X Sauerstoff ist, und R₁₁ wie vorstehend definiert ist, wird die Einheit hier als Carboxylgruppe bezeichnet, und besonders, wenn R₁₁ Wasserstoff ist, stellt die Formel eine „Carbonsäure" dar. Wenn X Sauerstoff ist, und R'₁₁ Wasserstoff ist, stellt die Formel ein „Formiat" dar. Wenn das Sauerstoffatom der vorstehenden Formel durch Schwefel ersetzt ist, stellt die Formel im Allgemeinen eine „Thiocarbonyl"gruppe dar. Wenn X Schwefel ist, und R₁₁ oder R'₁₁ kein Wasserstoff ist, stellt die Formel einen „Thioester" dar. Wenn X Schwefel ist, und R₁₁ Wasserstoff ist, stellt die Formel eine „Thiocarbonsäure" dar. Wenn X Schwefel ist, und R'₁₁ Wasserstoff ist, stellt die Formel ein „Thioformiat" dar. Andererseits, wenn X eine Bindung ist, und R₁₁ kein Wasserstoff ist, stellt die vorstehende Formel eine „Keton"gruppe dar. Wenn X eine Bindung ist, und R₁₁ Wasserstoff ist, stellt die vorstehende Formel eine „Aldehyd"gruppe dar.
Der Begriff „Heteroatom", wie hier verwendet, bedeutet ein Atom eines beliebigen anderen Elements als Kohlenstoff oder Wasserstoff. Bevorzugte Heteroatome sind Bor, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen.
Die Begriffe „Heterocyclyl" oder „heterocyclischer Rest" beziehen sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen und stärker bevorzugt 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome einschließen. Heterocyclen können auch Polycyclen sein. Heterocyclylreste schließen zum Beispiel Thiophen, Thianthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame, wie Azetidinone und Pyrrolidinone, Sultame, Sultone und dergleichen ein. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF₃, -CN oder dergleichen, substituiert sein.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Nitro" -NO₂; bezeichnet der Begriff „Halogen" -F, -Cl, -Br oder -I; bedeutet der Begriff „Sulfhydryl" -SH; bedeutet der Begriff „Hydroxyl" -OH; und bedeutet der Begriff „Sulfonyl" -SO₂-.
Ein „Phosphonamidit" kann in der allgemeinen Formel dargestellt werden:
wobei R₉ und R₁₀ wie vorstehend definiert sind, Q₂ O, S oder N bedeutet, und R₄₈ ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet, und Q₂ O, S oder N bedeutet.
Ein „Phosphoramidit" kann in der allgemeinen Formel dargestellt werden:
wobei R₉ und R₁₀ wie vorstehend definiert sind, und Q₂ O, S oder N bedeutet.
Ein „Phosphoryl" kann allgemein durch die Formel dargestellt werden:
wobei Q₁ S oder O bedeutet, und R₄₆ Wasserstoff, ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet. Wenn der Phosphorylrest als Substituent, zum Beispiel eines Alkyls, verwendet wird, kann der Phosphorylrest des Phosphorylalkyls durch die allgemeine Formel dargestellt werden:
wobei Q₁ S oder O bedeutet, und jedes R₄₆ unabhängig Wasserstoff, ein Niederalkyl oder ein Aryl bedeutet, und Q₂ O, S oder N bedeutet. Wenn Q₁ S bedeutet, ist die Phosphoryleinheit ein „Phosphorothioat".
Die Begriffe „Polycyclyl" oder „polycyclischer Rest" beziehen sich auf zwei oder mehr Ringe (z.B. Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl- und/oder heterocyclische Ringe), in denen zwei oder mehr Kohlenstoffe zwei benachbarten Ringen gemeinsam gehören, wobei die Ringe z.B. „kondensierte Ringe" sind. Ringe, die durch nicht-benachbarte Atome verbunden sind, werden als „verbrückte" Ringe bezeichnet. Jeder der Ringe des Polycyclus kann mit solchen Substituenten, wie vorstehend beschrieben, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF₃, -CN oder dergleichen, substituiert sein.
Der Ausdruck „Schutzgruppe", wie hier verwendet, bedeutet temporäre Substituenten, die eine möglicherweise reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Umwandlungen schützen. Beispiele solcher Schutzgruppen schließen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen und Acetale und Ketale von Aldehyden beziehungweise Ketonen ein. Über das Gebiet der Schutzgruppenchemie wurde ein Überblick gegeben (Greene, T. W.; Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl.; Wiley: New York, 1991).
Ein „Selenoalkyl" bezieht sich auf einen Alkylrest mit einer daran als Substituent gebundenen Selengruppe. Beispielhafte „Selenoether", die an dem Alkyl substituiert sein können, sind ausgewählt aus -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkinyl und -Se-(CH₂)_m-R₈, wobei m und R₈ wie vorstehend definiert sind.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „substituiert" alle zulässigen Substituenten organischer Verbindungen einschließen. Unter einem breiten Aspekt schließen die zulässigen Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische Substituenten organischer Verbindungen ein. Beispielhafte Substituenten schließen zum Beispiel die hier vorstehend beschriebenen ein. Die zulässigen Substituenten können einer oder mehrere und dieselben oder verschiedene für geeignete organische Verbindungen sein. Für die Zwecke dieser Erfindung können die Heteroatome, wie Stickstoff, Wasserstoffsubstituenten und/oder beliebige zulässige Substituenten organischer Verbindungen, die hier beschrieben wurden, und die die Valenzen der Heteroatome absättigen, aufweisen. Diese Erfindung soll durch die zulässigen Substituenten organischer Verbindungen in keiner Weise eingeschränkt werden.
Es ist selbstverständlich, dass „Substitution" oder „substituiert mit" die implizierte Maßgabe einschließt, dass eine solche Substitution gemäß der zulässigen Wertigkeit des substituierten Atoms und des Substituenten erfolgt, und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt, die z.B. nicht spontan eine Umwandlung, wie durch eine Umlagerung, Cyclisierung, Elimierung etc., erfährt.
Der Begriff „Sulfamoyl" ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₉ und R₁₀ wie vorstehend definiert sind.
Der Begriff „Sulfat" ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₄₁ wie vorstehend definiert ist.
Der Begriff „Sulfonamido" ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₉ und R'₁₁ wie vorstehend definiert sind.
Der Begriff „Sulfonat" ist in dem Fachgebiet bekannt und schließt eine Einheit ein, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₄₁ ein Elektronenpaar, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl ist.
Die Begriffe „Sulfoxido" oder „Sulfinyl", wie hier verwendet, beziehen sich auf eine Einheit, die durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei R₄₄ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aralkyl oder Aryl.
Analoge Substitutionen können an Alkenylresten oder Alkinylresten durchgeführt werden, um zum Beispiel Aminoalkenylreste, Aminoalkinylreste, Amidoalkenylreste, Amidoalkinylreste, Iminoalkenylreste, Iminoalkinylreste, Thioalkenylreste, Thioalkinylreste, carbonylsubstituierte Alkenylreste oder Alkinylreste herzustellen.
Wie hier verwendet, soll die Definition jedes Ausdrucks, z.B. Alkyl, m, n etc., wenn er in einer beliebigen Struktur mehr als einmal vorkommt, unabhängig von seiner Definition anderswo in derselben Struktur sein.
Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl und Nonaflyl sind in dem Fachgebiet bekannt, und beziehen sich auf eine Trifluormethansulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Methansulfonyl- beziehungsweise Nonafluorbutansulfonylgruppe. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat und Nonaflat sind in dem Fachgebiet bekannt und beziehen sich auf eine funktionelle Trifluormethansulfonsäureester-, p-Toluolsulfonsäureester-, Methansulfonsäureester- und Nonafluorbutansulfonsäureestergruppe beziehungsweise Moleküle, die diese Gruppen enthalten.
Die Abkürzugen Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts und Ms bedeuten Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluolsulfonyl beziehungsweise Methansulfonyl. Eine umfassendere Liste der Abkürzungen, die von Durchschnittsfachleuten der organischen Chemie verwendet werden, erscheint in der ersten Ausgabe jedes Bands des Journal of Organic Chemistry; diese Liste wird typischerweise in einer Tabelle mit dem Titel Standard List of Abbrevations vorgelegt. Die in dieser Liste enthaltenen Abkürzungen und alle Abkürzungen, die von Durchschnittsfachleuten der organischen Chemie verwendet werden, sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Bestimmte Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, können in besonderen geometrischen oder stereoisomeren Formen vorkommen. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, dass alle diese Verbindungen, einschließlich der cis- und trans-Isomere, R- und S-Enantiomere, Diastereomere, (D)-Isomere, (L)-Isomere, der racemischen Gemische davon und anderer Gemische davon, in den Umfang der Erfindung fallen. In einem Substituenten, wie einem Alkylrest, können zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome vorhanden sein. Alle diese Isomere sowie Gemische davon sollen in dieser Erfindung eingeschlossen sein.
Wenn beispielsweise ein besonderes Enantiomer einer Verbindung der vorliegenden Erfindung gewünscht ist, kann es durch asymmetrische Synthese oder durch Derivatisierung mit einem chiralen Hilfsmittel hergestellt werden, wobei das so erhaltene diastereomere Gemisch getrennt und die Hilfsgruppe abgespalten wird, um die gewünschten reinen Enantiomere bereitzustellen. In einer anderen Ausführungsform können, wenn das Molekül eine basische funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe, oder eine saure funktionelle Gruppe, wie eine Carboxylgruppe, enthält, mit einer geeigneten optisch aktiven Säure oder Base diastereomere Salze gebildet werden, gefolgt von der Spaltung der so geformten Diastereomere durch fraktionierte Kristallisation oder Chromatographievorrichtungen, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, und nachfolgende Gewinnung der reinen Enantiomere.
Beabsichtigte Äquivalente der vorstehend beschriebenen Verbindungen schließen Verbindungen ein, die ihnen im Übrigen entsprechen und dieselben allgemeinen Eigenschaften wie sie aufweisen (z.B. die Fähigkeit, die Signalgebung von Hedgehog zu hemmen), wobei eine oder mehrere einfache Änderungen von Substituenten, die die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen, durchgeführt werden. Im Allgemeinen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die Verfahren, die in den allgemeinen Reaktionsschemata, wie zum Beispiel nachstehend beschrieben, veranschaulicht sind, oder durch Modifikationen davon unter Verwendung von leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien, Reagenzien und herkömmlichen Syntheseverfahren hergestellt werden. In diesen Reaktionen ist es auch möglich, von Varianten Gebrauch zu machen, die an sich bekannt sind, jedoch hier nicht erwähnt werden.
Für die Zwecke dieser Erfindung werden die chemischen Elemente gemäß dem Periodensystem der Elemente, CAS-Version, Handbook of Chemistry und Physics, 67. Aufl., 1986-87, Innenseite des Schutzumschlags, identifiziert. Ebenfalls für die Zwecke dieser Erfindung ist es beabsichtigt, dass der Begriff „Kohlenwasserstoff" alle zulässigen Verbindungen mit mindestens einem Wasserstoff- und einem Kohlenstoffatom einschließt. Unter einem breiten Aspekt schließen die zulässigen Kohlenwasserstoffe acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische, organische Verbindungen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, ein.
III. In der Erfindung verwendete beispielhafte Verbindungen
Verbindungen, die in den vorliegenden Verfahren und Verwendungen verwendbar sind, schließen Verbindungen, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ein:
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben,
R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl (z.B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH₂)_nHeteroaryl (z.B. substituiert oder unsubstituiert) darstellen;
L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt;
X und D unabhängig ausgewählt sein können aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- oder einer direkten Bindung;
Y und Z unabhängig ausgewählt sein können aus 0 und S;
E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt;
R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl (z.B. substituiert oder unsubstituiert) oder -(CH₂)_nHeteroaryl (z.B. substituiert oder unsubstituiert) darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können;
p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, bevorzugt 0 bis 3 darstellt;
n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 10, bevorzugt 0 bis 5 darstellt; und
q und r 1 darstellen,
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
In bestimmten Ausführungsformen stellt D nicht NC_1-10-Alkyl dar. In bestimmten Ausführungsformen ist D ein Aralkyl- oder Heteroaralkyl-substituiertes Amin.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₁ einen C_1-10-Alkylrest, wie einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest, zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Neopentyl, Cyclobutyl, Isobutyl, Isopropyl, sek-Butyl, Cyclobutylmetyl etc., dar.
In bestimmten Ausführungsformen sind Y und Z gleich O.
In bestimmten Ausführungsformen schließt XLR₄ zusammengenommen ein cyclisches Amin, wie ein Piperazin, ein Morpholin, ein Piperidin, ein Pyrrolidin etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen schließt R₁ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein. In bestimmten Ausführungsformen ist R₁ Niederalkyl.
In bestimmten Ausführungsformen stellt L, das an R₁ gebunden ist, O, S oder NR₈, wie NH, dar.
In bestimmten Ausführungsformen ist E gleich NR₈. In bestimmten Ausführungsformen stellt E ein Aralkyl- oder Heteroaralkyl-substituiertes Amin, das z.B. polycyclisches R₈ einschließt, dar.
In bestimmten Ausführungsformen ist X nicht NH. In bestimmten Ausführungsformen ist X in einem Ring eingeschlossen oder stellt zusammengenommen mit -(C=Y)- ein tertiäres Amid dar.
In anderen Ausführungsformen werden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, durch die allgemeine Formel (III) dargestellt:
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben,
R₁, R₄, R₈, L, X, Y, Z, n, p, q und r wie vorstehend definiert sind;
R₂ und R₃ wie R₁ und R₄ vorstehend definiert sind; und
M nicht vorhanden ist oder L, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt.
In bestimmten Ausführungsformen sind Y und Z gleich O.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₁ einen C_1-10-Alkylrest, bevorzugt einen verzweigten. Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest, zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Neopentyl, Cyclobutyl, Isobutyl, Isopropyl, sek-Butyl, Cyclobutylmetyl etc., dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt XLR₄ zusammengenommen ein cyclisches Amin, wie ein Piperazin, ein Morpholin, ein Piperidin, ein Pyrrolidin etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen schließt mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein. In bestimmten verwandten Ausführungsformen schließen mindestens zwei der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein. In bestimmten Ausführungsformen ist R₁ Niederalkyl.
In bestimmten Ausführungsformen stellt L, das an R₁ gebunden ist, O, S oder NR₈, wie NH, dar.
In bestimmten Ausführungsformen ist M nicht vorhanden.
In bestimmten Ausführungsformen ist X nicht NH. In bestimmten Ausführungsformen ist X in einem Ring eingeschlossen oder stellt zusammengenommen mit -(C=Y)- ein tertiäres Amid dar.
In bestimmten Ausführungsformen werden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, durch die allgemeine Formel (IV) dargestellt:
Formel IV wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₈, L, M, X, n und p wie vorstehend definiert sind;
In bestimmten Ausführungsformen schließt XLR₄ zusammengenommen ein cyclisches Amin, wie ein Piperazin, ein Morpholin, ein Piperidin, ein Pyrrolidin etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₁ einen Niederalkylrest, bevorzugt einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest, zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Neopentyl, Cyclobutyl, Isobutyl, Isopropyl, sek-Butyl, Cyclobutylmetyl etc., dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein. In bestimmten verwandten Ausführungsformen schließen mindestens zwei der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein. In bestimmten Ausführungsformen ist R₁ C_1-10-Alkyl.
In bestimmten Ausführungsformen stellt L, das an R₁ gebunden ist, O, S oder NR₈, wie NH, dar.
In bestimmten Ausführungsformen ist M nicht vorhanden.
In bestimmten Ausführungsformen ist X nicht NH. In bestimmten Ausführungsformen ist X in einem Ring eingeschlossen oder stellt zusammengenommen mit -(C=Y)- ein tertiäres Amid dar.
In bestimmten Ausführungsformen stellt L bei jedem Vorkommen eine direkte Bindung dar.
In bestimmten Ausführungsformen können Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, durch die allgemeine Formel (VI) dargestellt werden:
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben,
R₈, Y, n und p wie vorstehend definiert sind;
Z' -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NH)-, SO₂ oder SO, bevorzugt -C(=O)- oder -C(=S)-, darstellt;
V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt;
G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt;
J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, wie Methyl, Ethyl, Methylen, Ethylen etc., der an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, die an J benachbart sind, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind, und
R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring ein oder beide Vorkommen von N einschließt;
R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest (z.B. verzweigt oder unverzweigt), Alkenylrest (z.B. verzweigt oder unverzweigt), Alkinylrest (z.B. verzweigt oder unverzweigt), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt;
R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest, einschließlich polycyclischer Reste, darstellt; und
R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt.
In bestimmten Ausführungsformen ist Y gleich O. In bestimmten Ausführungsformen stellt Z' SO₂, -C(=O)- oder -C(=S)- dar.
In bestimmten Ausführungsformen stellt NJ₂N zusammengenommen einen heterocyclischen Ring, wie ein Piperazin etc., dar, der z.B. mit einem oder mehreren Substituenten, wie Oxo, Niederalkyl, einem Niederalkylether etc., substituiert oder unsubstituiert sein kann. In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt NJ₂ oder NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring dar, an den das andere Vorkommen von N gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen sind ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Niederalkylresten, Niederalkyletherresten, Niederalkylthioetherresten, Amidogruppen, Oxogruppen etc. substituiert. In bestimmten Ausführungsformen weist ein heterocyclischer Ring, der ein Vorkommen von J umfasst, 5 bis 8 Glieder auf.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₅ einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring, wie ein Thiophen, Furan, Oxazol, Benzodioxan, Benzodioxol, Pyrrol, Indol etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen bedeutet R₇ einen Phenylalkylrest, wie eine Benzylgruppe, der gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxyl, Niederalkyl, Nitro, Cyano, einem Niederalkylether (z.B. gegebenenfalls substituiert, wie CHF₂CF₂O) oder einem Niederalkylthioether (z.B. gegebenenfalls substituiert, wie CF₃S) substituiert ist.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₈, wenn er in V vorkommt, H oder Niederalkyl, bevorzugt H dar.
In bestimmten Ausführungsformen ist die vorliegende Verbindung aus den in 32 dargestellten Verbindungen ausgewählt.
In bestimmten Ausführungsformen können die vorliegenden Antagonisten auf der Basis ihrer Selektivität für den Hedgehog-Weg ausgewählt werden. Diese Selektivität kann für den Hedgehog-Weg gegenüber anderen Wegen bestehen oder eine Selektivität zwischen besonderen Hedgehog-Wegen, z.B. Ptc-1, Ptc-2 etc., sein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hemmen die vorliegenden Inhibitoren die durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signaltransduktion mit einer ED₅₀ von 1 mM oder weniger, stärker bevorzugt von 1 μM oder weniger und sogar noch stärker bevorzugt von 1 nM oder weniger. Entsprechend hemmen in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen die vorliegenden Inhibitoren die Aktivität des Hedgehog-Wegs mit einer K_i von weniger als 10 nM, bevorzugt weniger als 1 nM und sogar noch stärker bevorzugt weniger als 0,1 nM.
In besonderen Ausführungsformen wird das kleine Molekül für die Verwendung ausgewählt, da es für eine Patched-Isoform selektiver ist als für eine andere, z.B. 10-fach, und stärker bevorzugt mindestens 100- oder sogar 1000-fach selektiver für einen Patched-Weg (Ptc-1, Ptc-2) als für einen anderen.
In bestimmten Ausführungsformen wird eine Verbindung, die ein Antagonist des Hedgehog-Wegs ist, ausgewählt, um die Hedgehog-Aktivität gegenüber anderen Proteinkinasen als PKA, wie PKC, selektiv antagonistisch zu beeinflussen, wobei z.B. die Verbindung die Aktivität des Hedgehog-Wegs um mindestens eine Größenordnung stärker, bevorzugt mindestens zwei Größenordnungen stärker und sogar noch stärker bevorzugt mindestens drei Größenordnungen stärker moduliert als sie die Aktivität einer anderen Proteinkinase moduliert. Somit kann zum Beispiel ein bevorzugter Inhibitor des Hedgehog-Wegs die Hedgehog-Aktivität mit einer K_i, die mindestens eine Größenordnung niedriger, bevorzugt mindestens zwei Größenordnungen niedriger und sogar noch stärker bevorzugt mindestens drei Größenordnungen niedriger als seine K_i für die Hemmung von PKC ist, hemmen. In bestimmten Ausführungsformen ist die K_i für die PKA-Hemmung kleiner als 10 nM, bevorzugt kleiner als 1 nM und sogar noch stärker bevorzugt kleiner als 0,1 nM.
Die vorliegende Erfindung wird durch Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, wie vorstehend aufgezeigt, unterstützt. In einer Ausführungsform kann zum Beispiel eine Verbindung der Formel XIV gemäß dem folgenden Schema umgewandelt werden:
wobei q und r jeweils 1 darstellen;
LG eine Abgangsgruppe, wie ein Halogen (z.B. Cl, Br oder I) oder einen Sulfonsäureester (z.B. Tosylat, Mesylat, Triflat etc.), darstellt;
A Sauerstoff oder Schwefel, der an eine Säureschutzgruppe oder einen Rest der Formel NJ₂N(R₉)₂ gebunden ist, darstellt;
B eine Stickstoffschutzgruppe oder einen Rest der Formel GR₆ darstellt;
G nicht vorhanden ist oder -C(=O)-, -C(=S)- oder -SO₂- darstellt;
J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten Niederalkylrest oder Alkylenrest, wie Methyl, Ethyl etc., der an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, die an J benachbart sind, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind;
R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder Niederalkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammengenommen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring ein oder beide Vorkommen von N einschließt;
R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest, einschließlich polycyclischer Reste, darstellt; und
Y aus O und S ausgewählt sein kann; und
wobei Schritt A die Umwandlung der Hydroxylgruppe in eine Abgangsgruppe einschließt,
Schritt B den Ersatz der Abgangsgruppe durch ein Azid einschließt, und
Schritt C die Reduktion des Azids zu einem Amin einschließt.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Umwandlung der Hydroxylgruppe in eine Abgangsgruppe durch Umsetzung der Hydroxylgruppe mit einem Sulfonylhalogenid, um einen Sulfonsäureester zu erzeugen, z.B. unter Verwendung von Tosylchlorid oder Tosylanhydrid, um ein Tosylat zu erzeugen, Mesylchlorid oder Mesylanhydrid, um ein Mesylat zu erzeugen, oder Triflylchlorid oder Triflylanhydrid, um ein Triflat zu erzeugen, etc. durchgeführt werden. In bestimmten anderen Ausführungsformen kann die Umwandlung der Hydroxylgruppe in eine Abgangsgruppe durch Umsetzung der Hydroxylgruppe mit einem Halogenierungsreagenz, wie einem Thionylhalogenid, einem Phosphortrihalogenid, einem Phosphorpentahalogenid, einem Phosphoroxyhalogenid etc., durchgeführt werden. Andere Verfahren zur Umwandlung einer Hydroxylgruppe in eine Abgangsgruppe sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und können im Schritt A verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen schließt der Schritt A ferner den Ersatz einer ersten Abgangsgruppe durch eine zweite Abgangsgruppe und die Inversion der Stereochemie des die Abgangsgruppe tragenden Kohlenstoffs ein. Wenn die Hydroxylgruppe der Verbindung der Formel XIV eine stereochemische cis-Beziehung zu dem Y und A tragenden Rest aufweist, erzeugt somit zum Beispiel die Reaktion dieser Verbindung mit Mesylchlorid ein Mesylat in einer stereochemischen cis-Beziehung zu dem Y und A tragenden Rest. Die Reaktion dieses Mesylats mit einem nukleophilen Reagenz, wie NaI, führt zum Ersatz des Mesylats durch Iodid, wobei eine Verbindung der Formel XV erzeugt wird, wobei die Iod-Abgangsgruppe und der Y und A tragende Rest eine stereochemische trans-Beziehung aufweisen. Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht aus einem diastereomerenreinen Ausgangsmaterial, z.B. einer reinen Verbindung mit einer stereochemischen cis-Beziehung zwischen der Hydroxylgruppe und dem Y und A tragenden Rest, Verbindungen, die selektiv entweder eine cis- oder eine trans-Stereochemie aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen kann der Ersatz der Abgangsgruppe durch ein Azid unter Verwendung eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes eines Azidanions, wie Natriumazid, unter Verwendung eines Silylazidreagenzes, wie Trimethylsilylazid, oder unter Verwendung eines beliebigen anderen Azidreagenzes, z.B. einer nukleophilen Azidquelle, wie in dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Reduktion des Azids zu einem Amin unter Verwendung eines Hydridreagenzes, wie Lithiumaluminiumhydrid, Lithiumtrialkylborhydrid etc., unter Verwendung eines reduzierenden Metalls und einer Säurequelle, wie Zinkmetall oder Samariumdiiodid mit Essigsäure, unter Verwendung einer katalytischen Hydrierung, wie mit Wasserstoff und einem Übergangsmetallkatalysator, wie Platin oder Palladium, oder durch beliebige andere geeignete Mittel durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen stellt A ein Sauerstoffatom, das an eine Säureschutzgruppe gebunden ist, dar. Die Säureschutzgruppe kann zum Beispiel ein substituierter oder unsubstituierter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, Arylrest oder Aralkylrest sein. Beispiele solcher Gruppen schließen Methyl, Ethyl, Trimethylsilylethyl, Methylthiomethyl, Allyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, Tetrahydropyranyl (THP), t-Butyl oder eine beliebige andere geeignete Gruppe ein. Eine große Vielzahl von Säureschutzgruppen ist in dem Fachgebiet bekannt und kann in diesem Verfahren verwendet werden, ohne den Umfang und das Wesen der Erfindung zu verändern. In anderen Ausführungsformen stellt A einen Alkylthiorest dar.
In bestimmten Ausführungsformen bedeutet B eine Stickstoffschutzgruppe, wie einen substituierten oder unsubstituierten Acylrest, Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, Arylrest oder Aralkylrest, oder einen Rest, der, wenn er mit N zusammengenommen wird, ein Carbamat bildet. Allgemeine Stickstoffschutzgruppen schließen Benzyl, Allyl, p-Methoxybenzyl, Acetyl, Trifluoracetyl, t-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl etc. ein. Eine große Vielzahl von Stickstoffschutzgruppen ist in dem Fachgebiet bekannt und kann in diesem Verfahren verwendet werden, ohne den Umfang und das Wesen der Erfindung zu verändern.
In bestimmten Ausführungsformen ist Y gleich O.
In bestimmten Ausführungsformen ist B gleich GR₆, wobei R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring, wie Thiophen, Furan, Oxazol, Benzodioxan, Benzodioxol, Pyrrol, Indol etc., einschließt.
In bestimmten Ausführungsformen bedeutet A NJ₂N, das zusammengenommen ein cyclisches Diamin, wie ein Piperazin etc., darstellen kann, das z.B. mit einem oder mehreren Substituenten, wie Oxo, Niederalkyl, einem Niederalkylether etc., substituiert oder unsubstituiert sein kann. In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt NJ₂ oder NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring dar, an den das andere Vorkommen von N gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen sind ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Niederalkylresten, Niederalkyletherresten, Niederalkylthioetherresten, Amidogruppen, Oxogruppen etc. substituiert. In bestimmten Ausführungsformen weist ein heterocyclischer Ring, der ein Vorkommen von J umfasst, 5 bis 8 Glieder auf.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Verbindung der Formel XVII mit dem Isomer angereichert, in dem das Amin und der Substituent, die Y und A einschließen, eine cis-Beziehung aufweisen, z.B. >75 %, >85 % oder sogar >95 % des cis-Isomers. In anderen Ausführungsformen ist die Verbindung der Formel XVII mit dem Isomer angereichert, in dem die zwei Substituenten eine trans-Beziehung aufweisen, z.B. >75 %, >85 % oder sogar >95 % des trans-Isomers. Eine solche Anreicherung ergibt sich bevorzugt aus der Verwendung eines isomer angereicherten Ausgangsmaterials, z.B. die Verbindung der Formel XIV ist vor dem Beginn von Schritt A mit >75 %, >85 % oder sogar >95 % des cis- oder trans-Isomers angereichert.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein Amin, das eine Struktur der Formel XIII oder XVII aufweist, z.B. durch die Durchführung zusätzlicher Schritte in Richtung der Erzeugung einer Verbindung von mindestens einer der Formeln I bis VI, weiter umgewandelt werden. Somit kann zum Beispiel ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte einschließen:

D) Kupplung eines Restes -C(=Z)LR₁ oder -Z'VR₅ an das exocyclische Amin;
E) Kupplung eines Restes -R₇ oder -LR₂ an das exocyclische Amin;
F) Kupplung eines Restes -NJ₂N(R₉)₂ oder -XLR₄ an den Y tragenden Rest;
G) Kupplung eines Restes -MR₃ oder -GR₆ an den Stickstoff in dem Ring;
H) Entfernung einer Schutzgruppe von dem Stickstoff in dem Ring;
I) Entfernung einer Schutzgruppe von dem Y tragenden Rest;
J) Anbringen einer Stickstoffschutzgruppe an dem exocyclischen Amin;
K) Entfernung einer Schutzgruppe von dem exocyclischen Amin,

₉

₃

₆

₁

₂

₃

₄

₂

_n

₂

_n

₂

₈

₅

₇

Beliebige der wählbaren Schritte D bis K können, abhängig von den verschiedenen Reaktionen und verwendeten Schutzgruppen, in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, wie es in dem Fachgebiet allgemein selbstverständlich ist. Verschiedene Schutzgruppen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wurden vorstehend dargestellt und sind, wie auch zahlreiche Verfahren zur Bindung und Entfernung solcher Schutzgruppen, in dem Fachgebiet allgemein bekannt, und beliebige dieser Schutzgruppen können in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, ohne den Umfang und das Wesen der vorliegenden Erfindung zu ändern.
In bestimmten Ausführungsformen kann Schritt D durch Umsetzung des exocyclischen Amins mit einem Acylierungsmittel, wie einem Säurehalogenid, einem Isocyanat, einem Isothiocyanat, einem Halogenformiat, einem Halogenthioformiat, einem Anhydrid, einem Dicarbonat, einem Sulfonylhalogenid, einem Sulfinylhalogenid, einem Carbamylchlorid, einem Thiocarbamylchlorid oder einer aktivierten Acylierungseinheit, die in situ hergestellt wurden, durchgeführt werden. Ein Acylierungsmittel kann zum Beispiel durch Umsetzung einer Carbonsäure mit einem Aktivierungsmittel, wie einem Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid etc.), Reagenzien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen oder einem beliebigen anderen Reagenz, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert, was zu einer reaktiven Zwischenverbindung mit einer hinsichtlich der Carbonsäure erhöhten Empfindlichkeit für die Kupplung mit einem Amin führt, in situ hergestellt werden. Eine große Vielzahl solcher Reagenzien ist in dem Fachgebiet der organischen Synthese, besonders der Peptidkupplung, bekannt. Entsprechend kann ein primäres Amin oder ein primärer Alkohol mit einem Phosgenäquivalent, wie Carbonyldiimidazol, Phosgen, Triphosgen, Diphosgen etc., oder einem Thiophosgenäquivalent, wie Thiophosgen, Thiocarbonyldiimidazol etc., behandelt werden, um ein Acylierungsmittel (z.B. ein Isocyanat, Isothiocyanat, Chlorformamid oder Chlorthioformamid) zu erzeugen, das mit einem Amin reagieren kann, um einen Harnstoff oder Thioharnstoff zu bilden, ohne dass eine Isolierung oder Reinigung des Acylierungsmittels erforderlich ist.
In Ausführungsformen, in denen M oder G SO₂, C=O oder C=S darstellt, kann Schritt G unter Verwendung von Reagenzien und Verfahren, wie den für Schritt D vorstehend beschriebenen, durchgeführt werden. In Ausführungsformen, in denen M oder G nicht vorhanden ist, kann Schritt G durch Umsetzung des endocyclischen Amins mit einem Elektrophil, wie einem Alkylhalogenid oder einem Alkylsulfonat, einem Aralkylhalogenid oder einem Aralkylsulfonat, einem Heteroaralkylhalogenid oder einem Heteroaralkylsulfonat, einem Cycloalkylhalogenid oder einem Cycloalkylsulfonat, einem Cycloalkylalkylhalogenid oder einem Cycloalkylalkylsulfonat, einem Heterocyclylhalogenid oder einem Heterocyclylsulfonat oder einem Heterocyclylalkylhalogenid oder einem Heterocyclylalkylsulfonat, durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann Schritt G durch reduktive Alkylierung, z.B. durch Umsetzung des endocyclischen Amins mit einem geeignet substituierten Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Natriumborhydrid, durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann Schritt E unter Verwendung einer reduktiven Alkylierung oder durch Umsetzung des exocyclischen Amins mit einem Elektrophil, wie einem Halogenid oder Sulfonat, durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann Schritt F durch Umsetzung eines Esters, Thioesters oder Xanthats mit einer Verbindung, die zum Beispiel die Formel HNJ₂N(R₉)₂ oder HXLR₄ aufweist, z.B. in Gegenwart einer Lewis-Säure bei einer erhöhten Temperatur etc. durchgeführt werden. In anderen Ausführungsformen kann Schritt F durch Umsetzung einer Carbonsäure mit einem Aktivierungsmittel, wie einem Carbodiimid (z.B. Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid etc.), Reagenzien auf Phosphorbasis (wie BOP-Cl, PyBROP etc.), Oxalylchlorid, Phosgen, Triphosgen oder einem beliebigen anderen Reagenz, das mit einer Carbonsäuregruppe reagiert, was zu einer reaktiven Zwischenverbindung mit einer hinsichtlich der Carbonsäure erhöhten Empfindlichkeit für die Kupplung mit einem Nukleophil führt, durchgeführt werden. Andere Verfahren zur Kupplung eines Nukleophils mit einer Carbonsäure oder einem Derivat davon (wie einem Ester, Thioester etc.) sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und können anstelle der hier speziell aufgezählten eingesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen sind Y und Z gleich O.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₁ einen Niederalkylrest, wie einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest, zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Neopentyl, Cyclobutyl, Isobutyl, Isopropyl, sek-Butyl, Cyclobutylmetyl etc., dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt XLR₄ zusammengenommen ein cyclisches Amin, wie ein Piperazin, ein Morpholin, ein Piperidin, ein Pyrrolidin etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen stellt L, das an R₁ gebunden ist, O, S oder NR₈, wie NH, dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarykest ein. In bestimmten verwandten Ausführungsformen schließen mindestens zwei der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest oder einen Heteroarylrest ein.
In bestimmten Ausführungsformen ist M nicht vorhanden.
In bestimmten Ausführungsformen ist X nicht NH. In bestimmten Ausführungsformen ist X in einem Ring eingeschlossen oder stellt zusammengenommen mit -C(=Y)- ein tertiäres Amid dar.
In bestimmten Ausführungsformen stellt NJ₂N zusammengenommen ein cyclisches Diamin, wie wie ein Piperazin etc., dar, das z.B. mit einem oder mehreren Substituenten, wie Oxo, Niederalkyl, einem Niederalkylether etc., substituiert oder unsubstituiert sein kann. In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt NJ₂ oder NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring dar, an den das andere Vorkommen von N gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen sind ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Niederalkylresten, Niederalkyletherresten, Niederalkylthioetherresten, Amidogruppen, Oxogruppen etc. substituiert. In bestimmten Ausführungsformen weist ein heterocyclischer Ring, der ein Vorkommen von J umfasst, 5 bis 8 Glieder auf.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₅ einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest dar.
In bestimmten Ausführungsformen schließt R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring, wie ein Thiophen, Furan, Oxazol, Benzodioxan, Benzodioxol, Pyrrol, Indol etc., ein.
In bestimmten Ausführungsformen bedeutet R₇ einen Phenylalkylrest, wie eine Benzylgruppe, der gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxyl, Niederalkyl, Nitro, Cyano, einem Niederalkylether (z.B. gegebenenfalls substituiert, wie CHF₂CF₂O) oder einem Niederalkylthioether (z.B. gegebenenfalls substituiert, wie CF₃S) substituiert ist.
In bestimmten Ausführungsformen stellt R₈, wenn er in V vorkommt, H oder Niederalkyl, bevorzugt H dar.
IV. Beispielhafte Anwendungen des Verfahrens und der Zusammensetzungen
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren der Modulierung eines differenzierten Zustandes, des Überlebens und/oder der Proliferation einer Zelle, die einen Ptc-Funktionsverlust, eine Hedgehog-Funktionszunahme oder eine Smoothened-Funktionszunahme aufweist, durch Inkontaktbringen der Zelle mit einem Hedgehog-Antagonisten gemäß dem vorliegenden Verfahren und wie es die Umstände rechtfertigen können.
Von der Erfindung ist es beispielsweise beabsichtigt, dass, angesichts der Erkenntnisse einer offensichtlich starken Beteiligung von Hedgehog, Ptc und Smoothened an der Bildung von geordneten räumlichen Anordnungen differenzierter Gewebe in Wirbeltieren, das vorliegende Verfahren als Teil eines Verfahrens zur Erzeugung und/oder Aufrechterhaltung einer Reihe von verschiedenen Wirbeltiergeweben sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden kann. Der Hedgehog-Antagonist, ob hinsichtlich der Proliferation oder Differenzierung eines bestimmten Gewebes induktiv oder anti-induktiv, kann, wie geeignet, eine beliebige der vorstehend beschriebenen Zubereitungen sein.
Das vorliegende Verfahren ist zum Beispiel auf Zellkulturverfahren anwendbar, wobei, ob aus genetischen oder biochemischen Gründen, die Zellen den Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, den Phänotyp Hedgehog-Funktionszunahme oder den Phänotyp Smoothened-Funktionszunahme aufweisen. Neuronale Kultursysteme in vitro erwiesen sich als fundamentale und unentbehrliche Hilfsmittel für die Untersuchung der neuralen Entwicklung sowie die Identifizierung neurotropher Faktoren, wie des Nervenwachstumsfaktors (NGF), der ziliaren trophischen Faktoren (CNTF) und des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF). Eine Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann aus Kulturen neuronaler Sternzellen bestehen, wie bei der Verwendung solcher Kulturen zur Erzeugung neuer Neuronen und Glia. In solchen Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens können die gezüchteten Zellen mit einem Hedgehog-Antagonisten der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, um die Proliferationsgeschwindigkeit neuronaler Sternzellen in der Kultur zu ändern und/oder die Differenzierungsgeschwindigkeit zu ändern oder um die Integrität einer Kultur bestimmter terminal differenzierter neuronaler Zellen aufrechtzuerhalten. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um zum Beispiel sensorische Neuronen oder alternativ motorische Neuronen zu züchten. Solche neuronalen Kulturen können als geeignete Testsysteme sowie Quellen implantierbarer Zellen für therapeutische Behandlungen verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können sehr viele nicht-tumorerzeugende neurale Vorläuferzellen in vitro aufrechterhalten werden, und ihre Proliferationsgeschwindigkeit und/oder Differenzierungsgeschwindigkeit können durch den Kontakt mit Hedgehog-Antagonisten der vorliegenden Erfindung beeinflusst werden. Allgemein wird ein Verfahren, umfassend die Schritte des Isolierens neuraler Vorläuferzellen aus einem Tier, des Aufrechterhaltens dieser Zellen in vitro oder in vivo, bevorzugt in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, und des Regulierens der Differenzierung dieser Zellen zu besonderen neuralen Phänotypen, z.B. Neuronen und Glia, indem die Zellen mit einem Hedgehog-Antagonisten in Kontakt gebracht werden, bereitgestellt.
Von Vorläuferzellen wird angenommen, dass sie unter einem tonischen hemmenden Einfluss stehen, der die Vorläufer in einem unterdrückten Zustand hält, bis ihre Differenzierung erforderlich ist. Neuere Verfahren wurden jedoch bereitgestellt, die eine Proliferation dieser Zellen ermöglichen, und anders als Neuronen, die terminal differenziert und daher nicht-teilend sind, können sie in unbegrenzter Anzahl erzeugt werden und sind zur Transplantation in heterologe und autologe Wirte mit neurodegenerativen Erkrankungen äußerst geeignet.
„Vorläufer" bedeutet eine oligopotente oder multipotente Sternzelle, die sich ohne Einschränkung teilen kann und unter speziellen Bedingungen Tochterzellen erzeugen kann, die sich zum Beispiel in Neuronen und Glia terminal differenzieren. Diese Zellen können zur Transplantation in einen heterologen oder autologen Wirt verwendet werden. Heterolog bedeutet einen anderen Wirt als das Tier, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich gewonnen wurden. Analog bedeutet den identischen Wirt, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich gewonnen wurden.
Zellen können aus embryonalem, postnatalem, juvenilem oder adultem, neuralem Gewebe aus einem beliebigen Tier erhalten werden. Beliebiges Tier bedeutet ein beliebiges vielzelliges Tier, das Nervengewebe enthält. Insbesondere bedeutet es einen beliebigen Fisch, ein beliebiges Reptil, einen beliebigen Vogel, eine beliebige Amphibie oder einen beliebigen Säuger und dergleichen. Die am meisten bevorzugten Spender sind Säuger, besonders Mäuse und Menschen.
Im Fall eines heterologen Spendertiers kann das Tier getötet und das Gehirn und ein spezieller Bereich von Interesse unter Verwendung eines sterilen Verfahrens entfernt werden. Hirnbereiche von besonderem Interesse schließen einen beliebigen Bereich ein, aus dem Vorläuferzellen erhalten werden können, die zur Wiederherstellung der Funktion eines degenerierten Bereiches des Wirthirns dienen. Diese Regionen schließen Bereiche des Zentralnervensystems (ZNS), einschließlich der Großhirnrinde, des Kleinhirns, des Mittelhirns, des Hirnstamms, des Rückenmarks und des Ventrikelgewebes, und Bereiche des peripheren Nervensystems (PNS), einschließlich des Karotiskörpers und des Nebennierenmarks, ein. Insbesondere schließen diese Bereiche Regionen in den Basalganglien, bevorzugt das Striatum, das aus dem Kaudatum und Putamen besteht, oder verschiedene Zellgruppen, wie den Globus pallidus, den Nucleus subthalamicus, den Nucleus basalis, von dem festgestellt wurde, dass er bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit degeneriert ist, oder die Substantia nigra pars compacta, von der festgestellt wurde, dass sie bei Patienten mit Parkinson-Krankheit degeneriert ist, ein.
Menschliche, heterologe, neurale Vorläuferzellen können aus fetalem Gewebe, das von einem elektiven Schwangerschaftsabbruch oder von einem postnatalen, jugendlichen oder erwachsenen Spender erhalten wurde, gewonnen werden. Autologes neurales Gewebe kann durch eine Biopsie oder von Patienten, die sich einem neurochirurgischen Eingriff unterziehen, bei dem neurales Gewebe entfernt wird, im besonderen während einer Epilepsieoperation und insbesondere während temporalen Lobektomien und Hippokampusektomien erhalten werden.
Zellen können aus Donorgewebe durch Spaltung einzelner Zellen aus der extrazellulären Bindegewebsmatrix des Gewebes erhalten werden. Die Spaltung kann unter Verwendung eines beliebigen bekannten Verfahrens, einschließlich einer Behandlung mit Enzymen, wie Trypsin, Kollagenase und dergleichen, oder unter Verwendung physikalischer Spaltungsverfahren, wie mit einem stumpfen Instrument oder durch Zerschneiden mit einem Skalpell, um ein Herauswachsen spezifischer Zelltypen aus einem Gewebe zu ermöglichen, erzielt werden. Die Spaltung fetaler Zellen kann in einem Gewebekulturmedium durchgeführt werden, obwohl ein bevorzugtes Medium zur Spaltung juveniler und adulter Zellen künstliche Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (aCSF) ist. Reguläre aCSF enthält 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ und 10 mM D-Glucose. aCSF mit niedrigem Ca²⁺-Gehalt enthält dieselben Bestandteile, mit Ausnahme von MgCl₂ in einer Konzentration von 3,2 mM und CaCl₂ in einer Konzentration von 0,1 mM.
Gespaltene Zellen können in ein beliebiges bekanntes Kulturmedium, das das Zeltwachstum unterstützen kann, einschließlich MEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen, das Zusätze, die für den Zellstoffwechsel erforderlich sind, wie Glutamin und andere Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und nützliche Proteine, wie Transferrin und dergleichen, enthält, gegeben werden. Das Medium kann auch Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und dergleichen, enthalten, um eine Kontamination mit Hefe, Bakterien und Pilzen zu verhindern. In einigen Fällen kann das Medium aus Rindern, Pferden, Hühnern und dergleichen gewonnenes Serum enthalten. Ein für Zellen besonders bevorzugtes Medium ist ein Gemisch aus DMEM und F-12.
Die Bedingungen für eine Züchtung sollten physiologischen Bedingungen entsprechen. Der pH-Wert der Kulturmedien sollte in der Nähe von physiologischem pH-Wert, bevorzugt zwischen einem pH-Wert von 6 und 8, stärker bevorzugt in der Nähe eines pH-Werts von 7 und sogar insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7,4 liegen. Die Zellen sollten bei einer Temperatur, die der physiologischen Temperatur entspricht, bevorzugt zwischen 30°C und 40°C, stärker bevorzugt zwischen 32°C und 38°C und am meisten bevorzugt zwischen 35°C und 37°C, gezüchtet werden.
Man kann die Zellen in Suspension oder auf einem festen Substrat wachsen lassen, jedoch wird die Proliferation der Vorläufer bevorzugt in Suspension durchgeführt, um durch die Bildung von „Neurosphären" sehr viele Zellen zu erzeugen (siehe zum Beispiel Reynolds et al. (1992) Science 255: 1070-1709; und die PCT-Veröffentlichungen WO 93/01275, WO 94/09119, WO 94/10292 und WO 94/16718). Im Fall des Züchtens (oder Spaltens) von Zellen in Suspension werden die Kolben gut geschüttelt, und man lässt die Neurosphären sich auf den Bodenkanten des Kolbens absetzen. Die Sphären werden dann in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen werden in einer kleinen Menge an Medium mit Wachstumsfaktor resuspendiert, und die Zellen werden mechanisch gespalten und in getrennten aliquoten Teilen von Medium resuspendiert.
Zellsuspensionen in Kulturmedium werden mit einem beliebigen Wachstumsfaktor, der die Proliferation von Vorläuferzellen ermöglicht, ergänzt, und ein beliebiger Behälter, in dem Zellen gezüchtet werden können, wie vorstehend aufgezeigt, bevorzugt Kulturkolben oder Rollflaschen, wird damit angeimpft. Die Zellen proliferieren typischerweise innerhalb von 3 bis 4 Tagen in einem Inkubator mit 37°C, und die Proliferation kann danach jederzeit durch Spaltung der Zellen und Resuspension in frischem Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, erneut ausgelöst werden.
In Abwesenheit von Substrat steigen die Zellen vom Boden des Kolbens auf und proliferieren in Suspension weiter, wobei eine hohle Kugel aus undifferenzierten Zellen gebildet wird. Nach ungefähr 3 bis 10 Tagen in vitro werden die proliferierenden Cluster (Neurosphären) alle 2 bis 7 Tage und insbesondere alle 2 bis 4 Tage durch schwache Zentrifugation und Resuspension in Medium, das Wachstumsfaktor enthält, ernährt.
Nach 6 bis 7 Tagen in vitro können einzelne Zellen in den Neurosphären durch physikalische Spaltung der Neurosphären mit einem stumpfen Instrument, insbesondere durch Zerreiben der Neurosphären mit einer Pipette, abgetrennt werden. Einzelne Zellen aus den gespaltenen Neurosphären werden in Kulturmedium, das Wachstumsfaktoren enthält, suspendiert, und die Differenzierung der Zellen kann in Kultur gesteuert werden, indem die Zellen in Gegenwart eines Hedgehog-Antagonisten plattiert (oder resuspendiert) werden.
Um andere Verwendungen der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten weiter zu veranschaulichen, wird angemerkt, dass sich eine intrazerebrale Transplantation als zusätzliches Verfahren für Therapien des Zentralnervensystems herausstellte. Ein Verfahren, um geschädigte Hirngewebe wiederherzustellen, umfasst zum Beispiel die Transplantation von Zellen aus fetalen oder neugeborenen Tieren in das adulte Gehirn (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123: 265-289; und Freund et al. (1985) J Neurosci 5: 603-616). Fetale Neuronen aus einer Vielzahl von Hirnregionen können erfolgreich in das adulte Gehirn eingebracht werden, und solche Transplantate können Verhaltensdefekte lindern. Bewegungsstörungen, die durch Läsionen dopaminerger Projektionen auf die Basalganglien ausgelöst werden, können zum Beispiel durch Transplantate von embryonalen, dopaminergen Neuronen verhindert werden. Komplexe kognitive Funktionen, die nach Läsionen des Neokortex beeinträchtigt sind, können durch Transplantate von embryonalen, kortikalen Zellen ebenfalls teilweise wiederhergestellt werden. Das vorliegende Verfahren kann zur Regulierung des Wachstumszustands in der Kultur verwendet werden oder, wenn fetales Gewebe, besonders neuronale Sternzellen, verwendet wird, kann es zur Regulierung der Differenzierungsgeschwindigkeit der Sternzellen verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung verwendbare Sternzellen sind allgemein bekannt. Mehrere neurale Kammellen wurden zum Beispiel identifiziert, von denen einige multipotent sind und wahrscheinlich nicht-determinierte, neurale Kammzellen darstellen, und andere davon nur einen Zelltyp, wie sensorische Neuronen, erzeugen können und wahrscheinlich determinierte Vorläuferzellen darstellen. Die Rolle von in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Hedgehog-Antagonisten bei der Züchtung solcher Sternzellen kann in der Regulierung der Differenzierung des nicht-determinierten Vorläufers oder in der Regulierung einer weiteren Einschränkung des Entwicklungsschicksals einer determinierten Vorläuferzelle, eine terminal differenzierte neuronale Zelle zu werden, bestehen. Das vorliegende Verfahren kann zum Beispiel in vitro verwendet werden, um die Differenzierung neuraler Kammzellen in Gliazellen, Schwann'sche Zellen, chromaffine Zellen, cholinerge, sympathische oder parasympathische Neuronen sowie peptiderge und serotoninerge Neuronen zu regulieren. Die Hedgehog-Antagonisten können allein verwendet werden oder können in Kombination mit anderen neurotrophen Faktoren, die insbesondere ein spezielles Differenzierungsschicksal der neuronalen Vorläuferzelle verstärken, verwendet werden.
Zusätzlich zu der Implantation von Zellen, die in Gegenwart der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten gezüchtet wurden, betrifft noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die therapeutische Anwendung eines Hedgehog-Antagonisten zur Regulierung des Wachstumszustandes von Neuronen und an anderen neuronalen Zellen sowohl im Zentralnervensystem als auch im peripheren Nervensystem. Die Fähigkeit von Ptc, Hedgehog und Smoothened, die neuronale Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und auch vermutlich im adulten Zustand zu regulieren, zeigt, dass in bestimmten Fällen von den vorliegenden Hedgehog-Antagonisten erwartet werden kann, dass sie die Steuerung adulter Neuronen im Hinblick auf die Aufrechterhaltung, die funktionelle Leistung und das Altern normaler Zellen, Wiederherstellungs- und Regenerationsprozesse in chemisch oder mechanisch lädierten Zellen und die Behandlung einer Degeneration bei bestimmten pathologischen Zuständen erleichtern. Angesichts dieser Voraussetzung beabsichtigt die vorliegende Erfindung speziell Anwendungen des vorliegenden Verfahrens auf die Behandlungsvorschrift von (Vorbeugung und/oder Verringerung der Schwere von) neurologischen Krankheiten, die sich ableiten von: (i) einer akuten, subakuten oder chronischen Verletzung des Nervensystems, einschließlich einer traumatischen Verletzung, chemischen Verletzung, Gefäßverletzung und Ausfällen (wie der Ischämie nach einem Schlaganfall) zusammen mit einer infektiösen/entzündlichen und durch einen Tumor ausgelösten Verletzung; (ii) dem Altern des Nervensystems, einschließlich Alzheimer-Krankheit; (iii) chronischen neurodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems, einschließlich Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose und dergleichen, sowie spinozerebellären Degenerationen; und (iv) chronischen immunologischen Krankheiten des Nervensystems oder die das Nervensystem beeinflussen, einschließlich multipler Sklerose.
Wie geeignet, kann das vorliegende Verfahren auch zur Erzeugung von Nervenprothesen für die Reparatur einer Schädigung zentraler und peripherer Nerven verwendet werden. Im besonderen können, wenn ein gequetschtes oder durchtrenntes Axon unter Verwendung einer Prothesenvorrichtung intubiert wird, Hedgehog-Antagonisten zu der Prothesenvorrichtung gegeben werden, um die Wachstumsgeschwindigkeit und Regeneration der dendritischen Fortsätze zu regulieren. Beispielhafte Nervenführungskanäle sind in den U.S.-Patenten 5,092,871 und 4,955,892 beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung von neoplastischen oder hyperplastischen Transformationen, wie sie im Zentralnervensystem vorkommen können, verwendet werden. Die Hedgehog-Antagonisten können beispielsweise verwendet werden, um solche transformierten Zellen entweder in postmitotische oder apoptotische Zellen umzuwandeln. Das vorliegende Verfahren kann daher als Teil einer Behandlung von z.B. malignen Gliomen, Meningiomen, Medulloblastomen, neuroektodermalen Tumoren und Ependymomen verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren als Teil eines Behandlungsschemas gegen ein malignes Medulloblastom und andere maligne neuroektodermale Primärtumoren des ZNS verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird das vorliegende Verfahren als Teil eines Behandlungsprogramms gegen ein Medulloblastom verwendet. Ein Medulloblastom, ein primärer Hirntumor, ist der häufigste Hirntumor bei Kindern. Ein Medulloblastom ist ein primitiver, neuroektodermaler Tumor, der in der hinteren Schädelgrube entsteht. Sie sind für ungefähr 25 % aller pädiatrischen Hirntumoren verantwortlich (Miller). Histologisch sind sie kleine Rundzellentumoren, die häufig in richtigen Rosetten angeordnet sind, jedoch eine gewisse Differenzierung zu Astrozyten, Ependymzellen oder Neuronen zeigen können (Rorke; Kleihues). PNET's können in anderen Bereichen des Hirns, einschließlich der Zirbeldrüse (Pineoblastom) und des Großhirns, entstehen. Die in der supratentorialen Region entstehenden sind im Allgemeinen weitaus schlimmer als ihre PF-Gegenstücke.
Von einem Medulloblastom/PNET's ist bekannt, dass sie nach einer Resektion irgendwo im ZNS wieder auftreten und sogar in Knochen Metastasen bilden können. Eine Festsetzung der Vorbehandlung sollte daher eine Untersuchung des Rückenmarks einschließen, um die Möglichkeit von „gestreuten Metastasen" auszuschließen. Mit Gadolinium verstärktes MRI hat die Myelographie für diesen Zweck weitgehend ersetzt, und eine CSF-Zytologie wird als Routineverfahren postoperativ durchgeführt.
In anderen Ausführungsformen wird das vorliegende Verfahren als Teil eines Behandlungsprogramms gegen Ependymome verwendet. Ependymome sind für ungefähr 10 % der pädiatrischen Hirntumoren bei Kindern verantwortlich. Allgemein gesagt, sind sie Tumoren, die aus der Ependymauskleidung der Ventrikel entstehen und mikroskopisch Rosetten, Kanäle und perivaskuläre Rosetten bilden. In der CHOP-Reihe von 51 Kindern, von denen Ependymome berichtet wurden, waren 3/4 histologisch gutartig. Ungefähr 2/3 entstanden aus der Region des 4. Ventrikels. Ein Drittel lag in der supratentorialen Region vor. Das Alter beim Auftreten. zeigt einen Höchstwert zwischen der Geburt und 4 Jahren, was durch SEER-Daten sowie Daten aus CHOP gezeigt wurde. Das mittlere Alter beträgt etwa 5 Jahre. Da so viele Kinder mit dieser Krankheit Babys sind, erfordern sie häufig eine multimodale Therapie.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Beobachtung in dem Fachgebiet, dass Ptc, Hedgehog und/oder Smoothened zusätzlich zur neuronalen Differenzierung, wie vorstehend beschrieben, an morphogenetischen Signalen beteiligt sind, die an anderen organogenen Wegen von Wirbeltieren beteiligt sind, wobei sie offensichtliche Rollen bei einer anderen entodermalen Musterbildung sowie sowohl bei mesodermalen als auch entodermalen Differenzierungsprozessen spielen. Somit ist durch Erfindung beabsichtigt, dass Zusammensetzungen, umfassend Hedgehog-Antagonisten, ebenfalls sowohl für Zellkulturverfahren als auch therapeutische Verfahren, die die Erzeugung und Aufrechterhaltung von nicht-neuronalem Gewebe einschließen, verwendet werden können.
In einer Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung von der Erkenntnis Gebrauch, dass Ptc, Hedgehog und Smoothened offensichtlich an der Steuerung der Entwicklung von Sternzellen beteiligt sind, die für die Bildung des Verdauungstrakts, der Leber, der Lunge und anderer Organe, die sich vom primitiven Darmkanal ableiten, verantwortlich sind. Shh dient als induktives Signal aus dem Entoderm zum Mesoderm, das für die Morphogenese des Darmkanals kritisch ist. Daher können Hedgehog-Antagonisten des vorliegenden Verfahrens zum Beispiel zur Regulierung der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer künstlichen Leber, die die vielfachen Stoffwechselfunktionen einer normalen Leber aufweisen kann, verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um die Proliferation und Differenzierung von Sternzellen des Verdauungskanals zu regulieren, wobei Hepatozytenkulturen gebildet werden, die zur Population extrazellulärer Matrizen verwendet werden können oder die in biokompatiblen Polymeren eingekapselt werden können, um sowohl implantierbare als auch extrakorporale künstliche Lebern zu bilden.
In einer anderen Ausführungsform können therapeutische Zusammensetzungen von Hedgehog-Antagonisten in Verbindung mit einer Transplantation von künstlichen Lebern sowie embryonalen Leberstrukturen verwendet werden, um die Aufnahme des intraperitonealen Implantats, Gefäßbildung und Differenzierung in vivo und Aufrechterhaltung des transplantierten Lebergewebes zu regulieren.
In noch einer anderen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren therapeutisch verwendet werden, um solche Organe nach einer physikalischen, chemischen oder pathologischen Verletzung zu regulieren. Therapeutische Zusammensetzungen, umfassend Hedgehog-Antagonisten, können beispielsweise zur Wiederherstellung der Leber nach einer partiellen Hepatektomie verwendet werden.
Die Erzeugung der Bauchspeicheldrüse und aus Dünndarms aus dem embryonalen Darmkanal hängt von der interzellulären Signalgebung zwischen den entodermalen und mesodermalen Zellen des Darmkanals ab. Im besonderen wurde darauf hingewiesen, dass die Differenzierung des Darmmesoderms in glatte Muskeln von Signalen aus benachbarten entodermalen Zellen abhängt. Ein in Frage kommender Mediator von entodermal abgeleiteten Signalen im embryonalen Enddarm ist Sonic-Hedgehog. Siehe zum Beispiel Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7: 801-4. Das Shh-Gen wird im ganzen Entoderm des embryonalen Darmkanals exprimiert, mit Ausnahme des Entoderms der Bauchspeicheldrüsenknospen, das stattdessen hohe Konzentrationen des Homöodomänen-Proteins Ipf1/Pdx1 (Insulinpromotorfaktor 1/Bauchspeicheldrüsen- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1), eines wichtigen Regulators der frühen Bauchspeicheldrüsenentwicklung, exprimiert. Apelqvist et al., supra, untersuchten, ob die unterschiedliche Expression von Shh im embryonalen Darmkanal die Differenzierung des umgebenden Mesoderms in spezialisierte Mesodermabkömmlinge des Dünndarms und der Bauchspeicheldrüse steuert. Um dies zu untersuchen, verwendeten sie den Promotor des Ipf1/Pdx1-Gens, um Shh selektiv in dem sich entwickelnden Bauchspeicheldrüsenepithel zu exprimieren. In Ipf1/Pdx1-Shh-transgenen Mäusen entwickelte sich das Bauchspeicheldrüsenmesoderm eher zu glatter Muskulatur und interstitiellen Cajal-Zellen, die für den Darm charakteristisch sind, als zu Bauchspeicheldrüsenmesenchym und Milz. Shh ausgesetzte Bauchspeicheldrüsenexplantate unterlagen auch einem ähnlichen Programm der Darmdifferenzierung. Diese Ergebnisse liefern den Beweis, dass die unterschiedliche Expression von entodermal abgeleitetem Shh das Schicksal des benachbarten Mesoderms in verschiedenen Regionen des Darmkanals steuert.
In dem Kontext der vorliegenden Erfindung ist es daher beabsichtigt, dass die vorliegenden Hedgehog-Antagonisten verwendet werden können, um die Proliferation und/oder Differenzierung von Bauchspeicheldrüsengewebe sowohl in vivo als auch in vitro zu steuern oder regulieren.
Es gibt eine große Vielzahl von pathologischen zellproliferativen und -differenzierenden Zuständen, für die die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung einen therapeutischen Nutzen bereitstellen können, wobei die allgemeine Strategie zum Beispiel in der Korrekur einer abweichenden Insulinexpression oder Modulation der Differenzierung besteht. Ganz allgemein betrifft die vorliegende Erfindung jedoch ein Verfahren der Induktion und/oder Aufrechterhaltung eines differenzierten Zustandes, die Verbesserung des Überlebens und/oder die Beeinflussung der Proliferation von Bauchspeicheldrüsenzellen, indem die Zellen mit den vorliegenden Inhibitoren in Kontakt gebracht werden. Durch die Erfindung ist beispielsweise beabsichtigt, dass angesichts der offensichtlichen Beteiligung von Ptc, Hedgehog und Smoothened an der Bildung geordneter räumlicher Anordnungen von Bauchspeicheldrüsengeweben, das vorliegende Verfahren als Teil eines Verfahrens, um solche Gewebe sowohl in vitro als auch in vivo zu erzeugen und/oder aufrechtzuerhalten, verwendet werden kann. Die Modulation der Funktion von Hedgehog kann beispielsweise sowohl in Zellkulturverfahren als auch in therapeutischen Verfahren, die die Erzeugung und Aufrechterhaltung von β-Zellen umfassen, und möglicherweise auch für Nichtschilddrüsengewebe, wie bei der Steuerung der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Gewebe aus dem Verdauungstrakt, der Milz, der Lunge, den Urogenitalorganen (z.B. der Blase) und anderen Organen, die sich vom primitiven Darmkanal ableiten, verwendet werden.
In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung von hyperplastischen und neoplastischen Erkrankungen, die das Bauchspeicheldrüsengewebe beeinflussen, besonders denen, die durch eine abweichende Proliferation von Bauchspeicheldrüsenzellen gekennzeichnet sind, verwendet werden. Krebserkrankungen der Bauchspeicheldrüse sind beispielsweise durch eine anomale Proliferation von Bauchspeicheldrüsenzellen gekennzeichnet, die zu Änderungen der Insulinsekretionsleistung der Bauchspeicheldrüse führen kann. Bestimmte Bauchspeicheldrüsenhyperplasien, wie Bauchspeicheldrüsenkarzinome, können beispielsweise auf Grund der Dysfunktion von β-Zellen oder einer verringerten Inselzellmasse zu Hypoinsulinämie führen. Bis zu dem Grad, bei dem eine abweichende Signalgebung von Ptc, Hedgehog und Smoothened für das Fortschreiten der Krankheit angezeigt sein kann, können die vorliegenden Inhibitoren verwendet werden, um die Regeneration des Gewebes nach einer Antitumortherapie zu verbessern.
Ferner kann eine Manipulation der signalgebenden Eigenschaften von Hedgehog an verschiedenen Punkten als Teil einer Strategie zur Neubildung/Wiederherstellung von Bauchspeicheldrüsengewebe sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden. In einer Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung von der offensichtlichen Beteiligung von Ptc, Hedgehog und Smoothened an der Regulierung der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsengewebe Gebrauch. Im Allgemeinen kann das vorliegende Verfahren therapeutisch verwendet werden, um die Bauchspeicheldrüse nach einer physikalischen, chemischen oder pathologischen Verletzung zu regulieren. In noch einer anderen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren auf Zellkulturverfahren angewendet werden, und im besonderen kann es verwendet werden, um die anfängliche Erzeugung prothetischer Vorrichtungen aus Bauchspeicheldrüsengewebe zu steigern. Eine Manipulation der Proliferation und Differenzierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, indem zum Beispiel die Hedgehog-Aktivität geändert wird, kann Mittel zur sorgfältigeren Steuerung der Eigenschaften eines gezüchteten Gewebes bereitstellen. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um die Herstellung prothetischer Vorrichtungen, die β-Inselzellen erfordern, wie sie in den Einkapselungsvorrichtungen verwendet werden können, die zum Beispiel in dem U.S.-Patent Nr. 4,892,538 von Aebischer et al., dem U.S.-Patent Nr. 5,106,627 von Aebischer et al., dem U.S.-Patent Nr. 4,391,909 von Lim und dem U.S.-Patent Nr. 4,353,888 von Sefton beschrieben wurden, zu verbessern. Frühe Vorläuferzellen der Langerhans'schen Inseln sind mehrfach wirksam und coaktivieren von dem Zeitpunkt ihres erstens Auftretens an offensichtlich alle inselspezifischen Gene. Wenn die Entwicklung fortschreitet, wird die Expression inselspezifischer Hormone, wie Insulin, auf das Expressionsmuster, das für reife Inselzellen charakteristisch ist, eingeschränkt. Der Phänotyp reifer Inselzellen ist jedoch in Kultur nicht stabil, da ein Wiedererscheinen embryonaler Merkmale in reifen β-Zellen beobachtet werden kann. Unter Verwendung der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten kann der Differenzierungsweg oder Proliferationsindex der Zellen reguliert werden.
Ferner kann eine Manipulation des Differenzierungszustandes von Bauchspeicheldrüsengewebe in Verbindung mit einer Transplantation von künstlicher Bauchspeicheldrüse verwendet werden, um die Implantation, Gefäßbildung und Differenzierung in vivo und Aufrechterhaltung des transplantierten Gewebes zu fördern. Eine Manipulation der Hedgehog-Funktion, um die Gewebedifferenzierung zu beeinflussen, kann beispielsweise als Mittel zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Transplantats verwendet werden.
Bellusci et al. (1997) Development 124: 53, berichten, dass Sonic-Hedgehog die Proliferation von Lungenmesenchymzellen in vivo reguliert. Folglich kann das vorliegende Verfahren zur Regulation der Regeneration von Lungengewebe, z.B. bei der Behandlung eines Emphysems, verwendet werden.
Fujita et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 238: 658 berichteten, dass Sonic-Hedgehog in Plattenepithelkarzinom- und Adenokarzinomzellen der menschlichen Lunge exprimiert wird. Die Expression von Sonic-Hedgehog wurde auch in Plattenepithelkarzinomgeweben der menschlichen Lunge, jedoch nicht im normalen Lungengewebe desselben Patienten nachgewiesen. Sie beobachteten auch, dass Sonic-Hedgehog den Einbau von BrdU in die Karzinomzellen und ihr Zeltwachstum stimuliert, während anti-Shh-N ihr Zellwachstum hemmte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Ptc, Hedgehog und/oder Smoothened am Zellwachstum eines solchen transformierten Lungengewebes beteiligt sind, und zeigten daher, dass das vorliegende Verfahren als Teil einer Behandlung von Lungenkarzinom und Adenokarzinomen und anderen proliferativen Erkrankungen, die das Lungenepithel betreffen, verwendet werden kann.
Viele andere Tumoren können, basierend auf Beweisen, wie der Beteiligung des Hedgehog-Wegs an diesen Tumoren oder der nachgewiesenen Expression von Hedgehog oder seines Rezeptors in diesen Geweben während der Entwicklung, durch eine Behandlung mit den vorliegenden Verbindungen beeinflusst werden. Solche Tumoren schließen Tumoren, die durch das Gorlin-Syndrom bedingt sind (z.B. Basalzellenkarzinom, Medulloblastom, Meningiom etc.), Tumoren, die in Pct-Knock-out-Mäusen nachgewiesen wurden (z.B. Hämangiom, Rhabdomyosarkom etc.), Tumoren, die sich aus einer Gli-1-Amplifikation ergeben (z.B. Glioblastom, Sarkoma etc.), Tumoren, die mit TRC8, einem Ptc-Homologen, verbunden sind (z.B. Nierenkarzinom, Schilddrüsenkarzinom etc.), durch Ext-1 bedingte Tumoren (z.B. Knochenkrebs etc.), durch Shh ausgelöste Tumoren (z.B. Lungenkrebs, Chondrosarkome etc.) und andere Tumoren (z.B. Brustkrebs, Urogenitalkrebs (z.B. Niere, Blase, Harnleiter, Prostata etc.), Nebennierenkrebs, Gastrointestinalkrebs (z.B. Magen, Darm etc.) etc.) ein, sind jedoch keineswegs darauf beschränkt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Zusammensetzungen, umfassend Hedgehog-Antagonisten, bei der Erzeugung von Skelettgewebe in vitro, wie aus skelettbildenden Sternzellen, sowie für die Behandlung von Skelettgewebeverlusten in vivo verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt besonders die Verwendung von Hedgehog-Antagonisten, um die Geschwindigkeit der Chondrogenese und/oder Osteogenese zu regulieren. „Skelettgewebeverlust" bedeutet einen Verlust von Knochen oder einem anderen Skelettbindegewebe an einer beliebigen Stelle, an der es erwünscht ist, den Knochen oder das Bindegewebe wiederherzustellen, wie auch immer der Verlust entstand, z.B. ob als Ergebnis eines chirurgischen Eingriffs, der Entfernung eines Tumors, einer Geschwürbildung, eines Implantats, einer Fraktur oder anderer traumatischer oder degenerativer Zustände.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise als Teil eines Schemas zur Wiederherstellung der Knorpelfunktion von Bindegewebe verwendet werden. Solche Verfahren sind zum Beispiel für die Reparatur von Defekten oder Läsionen im Knorpelgewebe, die die Folge einer degenerativen Abnutzung, wie der, die zu Arthritis führt, sowie anderer mechanischer Störungen sind, die durch ein Trauma für das Gewebe, wie einen Ersatz von zerrissenem Meniskusgewebe, eine Meniskusentfernung, eine Verrenkung eines Gelenks durch ein gerissenes Band, eine Fehlstellung von Gelenken, eine Knochenfraktur oder durch eine hereditäre Krankheit, hervorgerufen werden können, verwendbar. Das vorliegende Wiederherstellungsverfahren ist auch zur Remodellierung von Knorpelmatrix, wie bei der plastischen oder rekonstruktiven Chirurgie sowie Parodontalchirurgie, verwendbar. Das vorliegende Verfahren kann auch zur Verbesserung eines vorangegangenen Wiederherstellungsverfahrens, zum Beispiel nach einer chirurgischen Wiederherstellung eines Meniskus, eines Bands oder eines Knorpels, angewendet werden. Ferner kann es den Beginn oder die Verschlimmerung einer degenerativen Erkrankung verhindern, wenn es früh genug nach einem Trauma angewendet wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das vorliegende Verfahren die Behandlung des betroffenen Bindegewebes mit einer therapeutisch ausreichenden Menge eines Hedgehog-Antagonisten, besonders eines für die Indian-Hedgehog-Signaltransduktion selektiven Antagonisten, um eine Knorpelwiederherstellungsantwort in dem Bindegewebe zu regulieren, indem die Differenzierungs- und/oder Proliferationsgeschwindigkeit von in dem Gewebe eingebetteten Chondrozyten gelenkt wird. Solche Bindegewebe, wie Gelenkknorpel, Gelenkzwischenscheibe (Menisken), Rippenknorpel (der die echten Rippen und das Brustbein verbindet), Bänder und Sehnen, sind für die Behandlung in Rekonstruktions- und/oder Regenerationstherapien unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens besonders geeignet. Wie hier verwendet, schließen Regenerationstherapien die Behandlung von Degenerationszuständen ein, die bis zu dem Punkt fortgeschritten sind, an dem eine Beeinträchtigung des Gewebes deutlich erkennbar ist, sowie vorbeugende Behandlungen von Gewebe, bei dem sich die Degeneration in einem Frühstadium befindet oder unmittelbar bevorsteht.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren als Teil einer therapeutischen Maßnahme bei der Behandlung des Knorpels eines Synovialgelenks, wie des Knies, des Fußknöchels, des Ellenbogens, der Hüfte, des Handgelenks, des Knöchels entweder eines Fingers oder eines Zehs oder des Kiefergelenks, verwendet werden. Die Behandlung kann auf den Meniskus des Gelenks, auf den Gelenkknorpel des Gelenks oder beide gerichtet sein. Zur weiteren Veranschaulichung, das vorliegende Verfahren kann zur Behandlung einer Degenerationskrankheit des Knies, wie sie die Folge einer traumatischen Verletzung (z.B. einer Sportverletzung oder einer übermäßigen Abnutzung) oder von Osteoarthritis sein kann, verwendet werden. Die vorliegenden Antagonisten können als Injektion in das Gelenk mit beispielsweise einer arthroskopischen Nadel verabreicht werden. In einigen Fällen kann das injizierte Mittel in Form eines Hydrogels oder eines anderen vorstehend beschriebenen Trägers zur langsamen Freisetzung vorliegen, um einen längeren und gleichmäßigeren Kontakt des Mittels mit dem behandelten Gewebe zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt ferner die Verwendung des vorliegenden Verfahrens auf dem Gebiet der Knorpeltransplantation und von Therapien mit prothetischen Vorrichtungen. Probleme entstehen jedoch beispielsweise, weil die Eigenschaften von Knorpel und Faserknorpel zwischen verschiedenen Geweben variieren: wie zwischen Gelenkknorpel, Meniskusknorpel, Bändern und Sehnen, zwischen den zwei Enden desselben Bands oder derselben Sehne und zwischen den oberflächlichen und tiefliegenden Teilen des Gewebes. Die zonenförmige Anordnung dieser Gewebe kann eine allmähliche Änderung der mechanischen Eigenschaften widerspiegeln, und ein Versagen tritt ein, wenn implantiertes Gewebe, das sich unter diesen Bedingungen nicht differenzierte, nicht die Fähigkeit zu einer geeigneten Antwort aufweist. Wenn beispielsweise Meniskusknorpel verwendet wird, um vordere Kreuzbänder wiederherzustellen, unterliegt das Gewebe einer Metaplasie zu reinem fibrösem Gewebe. Durch die Regulierung der Chondrogenesegeschwindigkeit kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um sich besonders diesem Problem zu widmen, indem es die adaptive Steuerung der implantierten Zellen in der neuen Umgebung und die wirksame Angleichung hypertropher Chondrozyten einer früheren Entwicklungsstufe des Gewebes unterstützt.
Das vorliegende Verfahren kann auf ähnliche Art und Weise verwendet werden, um sowohl die Erzeugung prothetischer Knorpelvorrichtungen als auch ihre Implantation zu verbessern. Der Bedarf an einer verbesserten Behandlung motivierte die Forschung mit dem Ziel, neuen Knorpel zu erzeugen, der auf Kollagen-Glykosaminoglykan-Templaten (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252: 129), isolierten Chondrozyten (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7: 208; und Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2: 449) und Chondrozyten, die an natürliche oder synthetische Polymere gebunden sind (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88: 753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25: 329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27: 11; und U.S.-Patent Nr. 5,041,138 von Vacanti et al.) basiert. Chondrozyten kann man zum Beispiel in Kultur auf biologisch abbaubaren, biokompatiblen, hochporösen Gerüsten wachsen lassen, die aus Polymeren, wie Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Agarosegel oder anderen Polymeren, die sich mit der Zeit als Funktion der Hydrolyse des Polymergerüsts in unschädliche Monomere zersetzen, gebildet wurden. Die Matrizen sind so konstruiert, dass ein ausreichender Nährstoff- und Gasaustausch für die Zellen ermöglicht wird, bis die Transplantation stattfindet. Die Zellen können in vitro gezüchtet werden, bis die zu implantierenden Zellen ein ausreichendes Zellvolumen und eine ausreichende Zelldichte entwickelt haben. Ein Vorteil der Matrizen besteht darin, dass sie zu einer gewünschten Form auf einer individuellen Basis gegossen oder geformt werden können, so dass das Endprodukt dem eigenen Ohr oder der eigenen Nase des Patienten (um ein Beispiel zu geben) stark ähnelt, oder flexible Matrizen können verwendet werden, die eine Manipulation zum Zeitpunkt der Implantation, wie in ein Gelenk, ermöglichen.
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden die Implantate während bestimmter Stufen des Züchtungsverfahrens mit einem Hedgehog-Antagonisten in Kontakt gebracht, um die Differenzierungsgeschwindigkeit von Chondrozyten und die Bildung hypertropher Chondrozyten in der Kultur zu lenken.
In einer anderen Ausführungsform wird die implantierte Vorrichtung mit einem Hedgehog-Antagonisten behandelt, um die implantierte Matrix aktiv zu remodellieren und sie für ihre beabsichtigte Funktion besser geeignet zu machen. Wie vorstehend im Hinblick auf Gewebetransplantate aufgezeigt, leiden die künstlichen Transplantate an derselben Unzulänglichkeit, dass sie nicht in einem Umfeld gewonnen wurden, das mit der tatsächlichen mechanischen Umgebung, in die die Matrix implantiert wird, vergleichbar ist. Die Fähigkeit, die Chondrozyten in der Matrix durch das vorliegende Verfahren zu regulieren, kann es dem Implantat ermöglichen, Eigenschaften zu erwerben, die dem Gewebe, das es ersetzen soll, ähneln.
In noch einer anderen Ausführungsform wird das vorliegende Verfahren verwendet, um die Haftung prothetischer Vorrichtungen zu verbessern. Zur Veranschaulichung, das vorliegende Verfahren kann bei der Implantation einer Parodontalprothese verwendet werden, wobei die Behandlung des umgebenden Bindegewebes die Bildung von Periodontium über der Prothese stimuliert.
In noch weiteren Ausführungsformen kann das vorliegende Verfahren als Teil eines Schemas für die Erzeugung von Knochen (Osteogenese) an einer Stelle im Tier, an der solches Skelettgewebe fehlt, verwendet werden. Indian-Hedgehog steht besonders mit den hypertrophen Chondrozyten, die schließlich durch Osteoblasten ersetzt werden, in Zusammenhang. Die Verabreichung eines Hedgehog-Antagonisten der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise als Teil eines Verfahrens zur Regulierung der Geschwindigkeit von Knochenverlust in einem Versuchstier verwendet werden. Zubereitungen, umfassend Hedgehog-Antagonisten, können zum Beispiel verwendet werden, um bei der Entwicklung eines „Modells" für die Knochenbildung die enchondrale Knochenbildung zu steuern.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Hedgehog-Antagonist verwendet werden, um die Spermatogenese zu regulieren. Von den Hedgehog-Proteinen, besonders Dhh, wurde gezeigt, dass sie an der Differenzierung und/oder Proliferation und Aufrechterhaltung von Hodenkeimzellen beteiligt sind. Die Dhh-Expression wird kurz nach der Aktivierung von Sry (Hoden-bestimmendes Gen) in Vorläufern von Sertoli-Zellen ausgelöst und bleibt bis ins Erwachsenenalter in den Hoden bestehen. Die Männchen sind lebensfähig, jedoch infolge einer völligen Abwesenheit von reifen Samenzellen unfruchtbar. Eine Untersuchung der sich entwickelnden Hoden mit verschiedenen genetischen Hintergründen weist darauf hin, dass Dhh sowohl frühe als auch späte Stufen der Spermatogense reguliert. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6: 298. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Hedgehog-Antagonist als Empfängnisverhütungsmittel verwendet werden. Auf ähnliche Art und Weise sind Hedgehog-Antagonisten des vorliegenden Verfahrens möglicherweise zum Modulieren einer normalen Eierstockfunktion verwendbar.
Das vorliegende Verfahren weist auch eine breite Anwendbarkeit auf die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die das Epithelgewebe befallen, sowie auf kosmetische Verwendungen auf. Im Allgemeinen kann das Verfahren so charakterisiert werden, dass es einen Schritt des Verabreichens einer Menge eines Hedgehog-Antagonisten, die eine Änderung des Wachstumszustands eines behandelten Epithelgewebes bewirkt, an ein Tier einschließt. Die Verabreichungsart und die Dosierungsschemata variieren abhängig von dem/den Epithelgewebe/n, das/die zu behandeln ist/sind. Topische Formulierungen sind zum Beispiel bevorzugt, wenn das behandelte Gewebe epidermales Gewebe, wie Haut- oder Schleimhautgewebe, ist.
Ein Verfahren, das „die Heilung einer Wunde fördert" führt als Ergebnis der Behandlung zu einer viel schnelleren Wundheilung als eine ähnliche Wunde ohne die Behandlung heilt.
„Förderung von Wundheilung" kann auch bedeuten, dass das Verfahren die Proliferation und/oder das Wachstum von, inter alia, Keratinozyten reguliert, oder dass die Wunde mit geringerer Narbenbildung, geringerer Wundkontraktion, geringerer Kollagenablagerung und einer größeren äußeren Oberfläche heilt. In bestimmten Fällen kann „Förderung von Wundheilung" auch bedeuten, dass bestimmte Verfahren der Wundheilung bessere Erfolgsquoten (z.B. die Anwachsgeschwindigkeiten von Hauttransplantaten) aufweisen, wenn sie zusammen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Trotz des wesentlichen Fortschritts bei rekonstruktiven chirurgischen Verfahren kann die Narbenbildung ein wichtiges Hindernis bei der Wiedererlangung einer normalen Funktion und eines normalen Aussehens von geheilter Haut darstellen. Dies trifft besonders zu, wenn eine pathologische Narbenbildung, wie Keloide oder hypertrophe Narben der Hände oder des Gesichts, eine funktionelle Behinderung oder eine körperliche Entstellung hervorrufen. Unter den schwersten Umständen kann eine solche Narbenbildung psychosoziales Leid und ein Leben mit wirtschaftlichem Verlust auslösen. Eine Wundheilung schließt die Stufen der Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung ein. Die Proliferationsphase umfasst die Vermehrung von Fibroblasten und Endothel- und Epithelzellen. Durch die Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann die Proliferationsgeschwindigkeit von Epithelzellen in der Wunde und proximal zur Wunde gesteuert werden, um den Wundverschluss zu beschleunigen und/oder die Bildung von Narbengewebe möglichst gering zu halten.
Die vorliegende Behandlung kann auch als Teil eines therapeutischen Schemas zur Behandlung von oralen und paraoralen Geschwüren, die sich z.B. aus einer Bestrahlung und/oder einer Chemotherapie ergeben, wirken. Solche Geschwüre entwickeln sich gewöhnlich innerhalb von Tagen nach einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie. Diese Geschwüre beginnen in der Regel als kleine, schmerzhafte, unregelmäßig geformte Läsionen, die in der Regel mit einer feinen, grauen, nekrotischen Membran bedeckt und von entzündlichem Gewebe umgeben sind. In vielen Fällen führt eine mangelnde Behandlung zu einer Proliferation von Gewebe auf entzündlicher Basis um den Randbereich der Läsion herum. Das Epithel, das das Geschwür begrenzt, zeigt beispielsweise in der Regel eine proliferative Aktivität, was zu einem Kontinuitätsverlust des Oberflächenepithels führt. Diese Läsionen machen wegen ihrer Größe und des Verlusts von Epithelintegrität den Körper für eine mögliche Sekundärinfektion anfällig. Eine routinemäßige Aufnahme von Nahrung und Wasser wird zu einem sehr schmerzhaften Ereignis und, wenn die Geschwüre im ganzen Verdauungskanal proliferieren, ist in der Regel eine Diarrhöe mit allen ihren Komplikationsfaktoren offensichtlich. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Behandlung für solche Geschwüre, die die Anwendung eines Hedgehog-Antagonisten einschließt, die anomale Proliferation und Differenzierung des betroffenen Epithels verringern, indem sie dazu beiträgt, die Schwere der nachfolgenden entzündlichen Ereignisse zu verringern.
Das vorliegende Verfahren und die vorliegenden Zusammensetzungen können auch zur Behandlung von Wunden, die sich aus dermatologischen Krankheiten ergeben, wie Läsionen, die aus Autoimmunkrankheiten, wie Psoriasis, resultieren, verwendet werden. Atopische Dermatitis betrifft ein Hautverletzung, die sich aus Allergien ergibt, die mit einer Immunantwort in Zusammenhang stehen, die durch Allergene, wie Pollen, Nahrungsmittel, Tierhautschuppen, Insektengifte und Pflanzentoxine, verursacht wird.
In anderen Ausführungsformen können antiproliferative Zubereitungen von Hedgehog-Antagonisten zur Hemmung der Proliferation von Epithelzellen der Augenlinse verwendet werden, um postoperative Komplikationen einer extrakapsulären Kataraktextraktion zu verhindern. Katarakt ist eine hartnäckige Augenkrankheit, und verschiedene Untersuchungen bezüglich einer Kataraktbehandlung wurden durchgeführt. Gegenwärtig jedoch wird die Kataraktbehandlung durch chirurgische Operationen erzielt. Die Kataraktchirurgie wurde lange Zeit angewendet, und verschiedene operative Verfahren wurden untersucht. Eine extrakapsuläre Linsenextraktion wurde das Verfahren der Wahl zur Entfernung von Katarakten. Die medizinischen Hauptvorteile dieses Verfahrens gegenüber einer intrakapsulären Extraktion sind das geringere Vorkommen von aphakischen, zystoiden Makulaödemen und Netzhautablösung. Eine extrakapsuläre Extraktion ist auch zur Implantation von intraokularen Linsen der hinteren Augenkammer erforderlich, die gegenwärtig in den meisten Fällen als Linsen der Wahl angesehen werden.
Ein Nachteil der extrakapsulären Kataraktextraktion ist jedoch das häufige Vorkommen einer Trübung der hinteren Linsenkapsel, die oft als Nachkatarakt bezeichnet wird, und die in bis zu 50 % der Fälle innerhalb von drei Jahren nach der Operation auftreten kann. Ein Nachkatarakt wird durch die Proliferation von Epithelzellen der äquatorialen und vorderen Linsenkapsel, die nach der extrakapsulären Linsenextraktion zurückbleiben, hervorgerufen. Diese Zellen proliferieren, wobei Sommerling-Ringe hervorgerufen werden, und zusammen mit Fibroblasten, die sich ebenfalls ablagern und auf der hinteren Kapsel vorkommen, verursachen sie eine Trübung der hinteren Kapsel, die das Sehen stört. Die Vorbeugung eines Nachkatarakts ist einer Behandlung vorzuziehen. Um die Bildung eines Sekundärkatarakts zu verhindern, stellt das vorliegende Verfahren Mittel zur Hemmung der Proliferation der verbliebenen Epithelzellen der Augenlinse bereit. Diese Zellen können zum Beispiel ruhig gestellt werden, indem nach der Linsenentfernung eine Lösung, die eine Zubereitung eines Hedgehog-Antagonisten enthält, in die vordere Augenkammer instilliert wird. Ferner kann die Lösung osmotisch ausgeglichen sein, um eine minimale wirksame Dosierung bereitzustellen, wenn sie in die vordere Augenkammer instilliert wird, wodurch ein subkapsuläres Epithelwachstum mit einer gewissen Spezifität gehemmt wird.
Das vorliegende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Hornhauterkrankungen, die durch eine Proliferation von Hornhautepithelzellen gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel bei Epithelerkrankungen des Auges, wie einem nach unten gerichteten Epithelwachstum oder Plattenepithelkarzinomen der Augenoberfläche, verwendet werden.
Levine et al. (1997) J Neurosci 17: 6277 zeigen, dass Hedgehog-Proteine die Mitogenese und Photorezeptordifferenzierung in der Wirbeltiernetzhaut regulieren können, und Ihh ein in Frage kommender Faktor aus dem pigmentierten Epithel ist, um die Proliferation von Netzhautvorläufern und die Photorezeptordifferenzierung zu fördern. Desgleichen zeigten Jensen et al. (1997) Development 124: 363, dass die Behandlung von Kulturen von Netzhautzellen perinataler Mäuse mit dem aminoterminalen Fragment des Sonic-Hedgehog-Proteins zu einer Zunahme des Anteils von Zellen, die Bromdeoxuridin einbauen, der Gesamtzahl von Zellen und von Stäbchenphotorezeptoren, amakrinen Zellen und Müller-Gliazellen führt, was darauf hinweist, dass Sonic-Hedgehog die Proliferation von Vorläuferzellen der Netzhaut fördert. Somit kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung proliferativer Krankheiten von Netzhautzellen und zur Regulierung der Photorezeptordifferenzierung verwendet werden.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des vorliegenden Verfahrens zur Regulierung von Haarwachstum. Haar besteht im Wesentlichen aus Keratin, einem zähen und unlöslichen Protein; seine Hauptfestigkeit liegt an seiner Cystindisulfidbindung. Jedes einzelne Haar umfasst einen zylindrischen Schaft und eine Wurzel und befindet sich in einem Follikel, einer flaschenartigen Vertiefung in der Haut. Der Boden des Follikels enthält einen fingerartigen Fortsatz, der als die Papille bezeichnet wird, die aus Bindegewebe besteht, aus dem das Haar wächst, und durch das Blutgefäße die Zellen mit Nahrung versorgen. Der Schaft ist der Teil, der sich außerhalb der Hautoberfläche erstreckt, während die Wurzel als intrakutaner Teil des Haares beschrieben wurde. Die Basis der Wurzel dehnt sich in die Haarzwiebel aus, die auf der Papille ruht. Zellen, aus denen das Haar erzeugt wird, wachsen in der Zwiebel des Follikels; sie werden in Form von Fasern extrudiert, wenn die Zellen in dem Follikel proliferieren. Haar"wachstum" bezieht sich auf die Bildung und Verlängerung der Haarfaser durch die sich teilenden Zellen.
Wie in dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, wird der gewöhnliche Haarzyklus in drei Stadien eingeteilt: Anagen, Katagen und Telogen. Während der aktiven Phase (Anagen) teilen sich die epidermalen Sternzellen der Hautpapille schnell. Die Tochterzellen bewegen sich aufwärts und differenzieren sich, um die konzentrischen Schichten des Haares selbst zu bilden. Das Übergangsstadium, Katagen, ist durch das Ende der Mitose der Sternzellen in dem Follikel gekennzeichnet. Das Ruhestadium ist als Telogen bekannt, in dem das Haar mehrere Wochen innerhalb der Kopfhaut zurückgehalten wird, bevor ein auftauchendes neues Haar, das sich unter ihm entwickelt, den Schaft der Telogenphase aus seinem Follikel verdrängt. Aus diesem Modell wurde deutlich, dass je größer das Reservoir an sich teilenden Sternzellen ist, die sich in Haarzellen differenzieren, umso mehr Haarwachstum stattfindet. Folglich können Verfahren zur Steigerung oder Verringerung von Haarwachstum durchgeführt werden, indem die Proliferation dieser Sternzellen verstärkt beziehungsweise gehemmt wird.
In bestimmten Ausführungsformen kann die vorliegende Erfindung als ein Weg zur Verringerung des Wachstums von menschlichem Haar im Gegensatz zu seiner herkömmlichen Entfernung durch Schneiden, Rasieren oder Depilation verwendet werden. Das vorliegende Verfahren kann beispielsweise bei der Behandlung von Trichosis, die durch ein anomal schnelles oder dichtes Haarwachstum gekennzeichnet ist, z.B. Hypertrichosis, verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform können Hedgehog-Antagonisten zur Behandlung von Hirsutismus, einer Erkrankung, die durch eine anomale Haarigkeit gekennzeichnet ist, verwendet werden. Das vorliegende Verfahren kann auch ein Verfahren zur Verlängerung des Zeitintervalls einer Depilation bereitstellen.
Da ein Hedgehog-Antagonist für Epithelzellen häufig eher zytostatisch als zytotoxisch ist, können solche Mittel ferner zum Schutz von Haarfollikelzellen vor zytotoxischen Mitteln, die für eine Wirksamkeit das Fortschreiten des Zellzyklus in die S-Phase erfordern, z.B. einem durch Bestrahlung ausgelösten Tod, verwendet werden. Eine Behandlung durch das vorliegende Verfahren kann einen Schutz bereitstellen, indem sie die Haarfollikelzellen ruhig stellt, z.B. indem sie die Zellen daran hindert, in die S-Phase einzutreten und dadurch verhindert, dass die Follikelzellen eine mitotische Katastrophe oder einen programmierten Zelltod erfahren. Hedgehog-Antagonisten können beispielsweise für Patienten, die sich einer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie unterziehen, die normalerweise zu einem Haarverlust führt, verwendet werden. Indem das Fortschreiten des Zellzyklus während solcher Therapien gehemmt wird, kann die vorliegende Behandlung Haarfollikelzellen vor dem Tod schützen, der sich sonst aus einer Aktivierung von Zelltodprogrammen ergeben kann. Nach dem Ende der Therapie kann das vorliegende Verfahren auch mit einer gleichzeitigen Abschwächung der Hemmung der Proliferation von Follikelzellen beendet werden.
Das vorliegende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Follikulitis, wie Follikulitis decalvans, Follikulitis ulerythematosa reticulata oder Keloidfollikulitis, verwendet werden. Eine kosmetische Zubereitung eines Hedgehog-Antagonisten kann zum Beispiel bei der Behandlung von Pseudofollikulitis, einer chronischen Erkrankung, die am häufigsten in der Unterkieferregion des Halses vorkommt und mit dem Rasieren in Zusammenhang steht, deren charakteristische Läsionen erythematöse Papeln und Pusteln sind, die intrakutane Haare enthalten, topisch aufgetragen werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine Differenzierung zu induzieren und/oder eine Proliferation von epithelial abgeleitetem Gewebe zu hemmen. Solche Formen dieser Moleküle können eine Basis für eine Differenzierungtherapie für die Behandlung von hyperplastischen und/oder neoplastischen Erkrankungen, umfassend Epithelgewebe, bereitstellen. Solche Zubereitungen können zum Beispiel für die Behandlung von Hautkrankheiten, bei denen eine anomale Proliferation oder ein anomales Wachstum von Hautzellen besteht, verwendet werden.
Die Arzneimittelzubereitungen der Erfindung sind beispielsweise für die Behandlung von hyperplastischen epidermalen Krankheiten, wie Keratose, sowie für die Behandlung von neoplastischen epidermalen Krankheiten, wie denen, die durch eine hohe Proliferationsgeschwindigkeit für verschiedene Hautkrebserkrankungen gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel Basalzellenkarzinom oder Plattenepithelkarzinom, beabsichtigt. Das vorliegende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die die Haut betreffen, im besonderen von dermatologischen Krankheiten, die eine krankhafte Proliferation und/oder Keratinisierung der Epidermis zur Folge haben, wie sie zum Beispiel durch Psoriasis oder atopische Dermatose hervorgerufen werden, verwendet werden.
Viele allgemeine Erkrankungen der Haut, wie Psoriasis, Plattenepithelkarzinom, Keratoakanthom und aktinische Keratose, sind durch lokalisierte anomale Proliferation und lokalisiertes anomales Wachstum gekennzeichnet. Von Psoriasis, die durch schuppige, rote, erhöhte Plaques auf der Haut gekennzeichnet ist, ist zum Beispiel bekannt, dass die Keratinozyten viel schneller als normal proliferieren und sich weniger vollständig differenzieren.
In einer Ausführungsform sind die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von dermatologischen Krankheiten geeignet, die mit Keratinisierungsstörungen verbunden sind, die eine anomale Proliferation von Hautzellen hervorrufen, wobei die Störungen entweder durch entzündliche oder durch nicht-entzündliche Komponenten gekennzeichnet sein können. Um es zu veranschaulichen, therapeutische Zubereitungen eines Hedgehog-Antagonisten, der z.B. den Ruhezustand oder die Differenzierung fördert, können verwendet werden, um verschiedene Formen von Psoriasis, ob kutan, mukosal oder ungual, zu behandeln. Psoriasis ist, wie vorstehend beschrieben, typischerweise durch epidermale Keratinozyten gekennzeichnet, die eine deutliche proliferative Aktivierung und Differenzierung entlang eines „regenerativen" Wegs zeigen. Die Behandlung mit einer antiproliferativen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens kann verwendet werden, um die pathologische epidermale Aktivierung umzukehren, und kann eine Grundlage für eine anhaltende Remission der Krankheit bereitstellen.
Eine Vielzahl von anderen keratotischen Läsionen sind ebenfalls Kandidaten für eine Behandlung durch das vorliegende Verfahren. Aktinsche Keratosen sind zum Beispiel oberflächliche, entzündliche, prämaligne Tumoren, die auf der Sonne ausgesetzter Haut und bestrahlter Haut entstehen. Die Läsionen sind erythematös bis braun mit unterschiedlicher Schuppung. Gegenwärtige Therapien schließen Exzisions- und Kryochirurgie ein. Diese Behandlungen sind jedoch schmerzhaft und erzeugen häufig eine kosmetisch unzumutbare Narbenbildung. Folglich kann die Behandlung von Keratose, wie aktinischer Keratose, die bevorzugt topische Anwendung einer Zusammensetzung eines Hedgehog-Antagonisten in einer Menge, die zur Hemmung der Hyperproliferation von epidermalen Zellen/Epidermoidzellen der Läsion ausreicht, einschließen.
Akne stellt noch eine andere dermatologische Krankheit dar, die durch das vorliegende Verfahren behandelt werden kann. Akne vulgaris ist beispielsweise eine multifaktorielle Krankheit, die am häufigsten bei Teenagern und jungen Erwachsenen vorkommt, und ist durch das Auftreten von entzündlichen und nicht-entzündlichen Läsionen auf dem Gesicht und Oberkörper gekennzeichnet. Der Grunddefekt, der Akne vulgaris hervorruft, ist eine übermäßige Verhornung des Gangs einer hyperaktiven Talgdrüse. Die übermäßige Verhornung blockiert die normale Beweglichkeit von Haut und Follikelmikroorganismen und stimuliert so die Freisetzung von Lipasen durch Propinobacterium acnes und Staphylococcus epidermidis bacteria und Pitrosporum ovale, einer Hefe. Die Behandlung mit einem antiproliferativen Hedgehog-Antagonisten, besonders topischen Zubereitungen, kann verwendet werden, um die vorübergehend auftretenden Merkmale der Gänge, z.B. eine übermäßige Verhornung, die zu Läsionsbildung führen, zu verhindern. Die vorliegende Behandlung kann ferner zum Beispiel Antibiotika, Retinoide und Antiandrogene einschließen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung verschiedener Formen von Dermatitis bereit. Dermatitis ist ein beschreibender Begriff, der sich auf schwach abgegrenzte Läsionen bezieht, die entweder pruritisch, erythematös, schuppig, blasig, nässend, rissig oder verkrustet sind. Diese Läsionen entstehen aus einem beliebigen von vielen verschiedenen Gründen. Die häufigsten Typen von Dermatitis sind atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis und Windeldermatitis. Seborrhoische Dermatitis ist eine chronische, in der Regel pruritische Dermatitis mit einem Erythem, trockener, feuchter oder fettiger Schuppung und gelben, verkrusteten Flecken in verschiedenen Bereichen, besonders der Kopfhaut, mit der Abstoßung einer übermäßigen Menge an trockenen Schuppen. Das vorliegende Verfahren kann auch bei der Behandlung von Stauungsdermatitis, einer häufig chronischen, in der Regel ekzematösen Dermatitis, verwendet werden. Aktinische Dermatitis ist eine Dermatitis, die auf aktinische Strahlung, wie die der Sonne, ultravioletter Wellen oder Röntgen- oder Gammastrahlung, zurückführbar ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von bestimmten Symptomen von Dermatitis, die durch eine unerwünschte Proliferation von Epithelzellen hervorgerufen werden, verwendet werden. Solche Therapien für diese verschiedenen Formen von Dermatitis können auch topische und systemische Corticosteroide, Antipruritika und Antibiotika einschließen.
Es ist zum Beispiel beabsichtigt, dass das vorliegende Verfahren zur Hemmung von Angiogenese verwendet werden kann. Von Hedgehog ist bekannt, dass es die Angiogenese stimuliert. Matrigel-Pfropfen, die mit Hedgehog-Protein imprägniert und Mäusen eingesetzt wurden, zeigen eine wesentliche Gefäßneubildung, während Matrigel-Pfropfen, die kein Hedgehog enthalten, eine vergleichsweise geringe Gefäßbildung zeigen. Hedgehog-Protein kann auch die Gefäßbildung der normalerweise gefäßlosen Hornhaut von Mäusen erhöhen. Das Ptc-1-Gen wird in normalen Gefäßgeweben, einschließlich der Endothelzellen der Aorta, Gefäßzellen der glatten Muskulatur, Adventitialfibroblasten der Aorta, des Herzkranzgefäßsystems und der Herzmuskelzellen des Vorhofs und der Ventrikel, exprimiert. Diese Gewebe sind auch auf Hedgehog-Protein empfindlich. Eine Behandlung mit exogenem Hedgehog verursacht eine Hochregulierung der Ptc-1-Expression. Zusätzlich stimulieren Hedgehog-Proteine die Proliferation von Gefäßzellen der glatten Muskulatur in vivo. Hedgehog-Proteine veranlassen Fibroblasten auch zu einer Erhöhung der Expression angiogener Wachstumsfaktoren, wie VEGF, bFGF, Ang-1 und Ang-2. Schließlich ist von Hedgehog-Proteinen bekannt, dass sie die Genesung von einer ischämie-bedingten Schädigung und die Bildung von Kollateralgefäßen stimulieren.
In Anbetracht der Tatsache, dass Hedgehog die Angiogenese fördert, wird von Hedgehog-Antagonisten erwartet, dass sie besonders in Situationen, in denen ein gewisser Grad der Signalgebung von Hedgehog für eine Angiogenese notwendig ist, als Angiogeneseinhibitoren wirken.
Angiogenese ist für viele Erkrankungen wesentlich. Eine anhaltende ungeregelte Angiogenese kommt in einem Bereich von Krankheitszuständen, Tumormetastasen und anomalem Wachstum von Endothelzellen vor. Das als Ergebnis angiogener Prozesse erzeugte Gefäßsystem unterstützt die bei diesen Krankheiten beobachtete pathologische Schädigung. Die auf Grund ungeregelter Angiogenese erzeugten verschiedenen pathologischen Zustände wurden als angiogen abhängige Krankheiten oder angiogene Begleitkrankheiten zu einer Gruppe zusammengefasst. Therapien, die auf eine Regulierung der angiogenen Prozesse gerichtet sind, können zu einer Beseitigung oder Linderung dieser Krankheiten führen.
Durch Angiogenese hervorgerufene, geförderte oder damit in Zusammenhang stehende Krankheiten schließen neovaskuläre Augenkrankheit, altersbedingte Makuladegeneration, diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, Hornhauttransplantatabstoßung, neovaskuläres Glaukom, retrolentale Fibroplasie, epidemische Keratokonjunktivitis, Mangel an Vitamin A, übermäßigen Gebrauch von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, durch das obere limbische System bedingte Keratitis, durch Pterygium bedingte Keratitis sicca, Sjögren-Syndrom, Akne rosacea, Phlyktänulose, Syphilis, Infektionen mit Mykobakterien, Fettdegeneration, chemische Verbrennungen, bakterielle Geschwüre, Pilzgeschwüre, Herpessimplex-Infektionen, Herpes-zoster-Infektionen, Protozoeninfektionen, Kaposi-Sarkom, Mooren-Ulkus, Tenien'sche marginale Degeneration, marginale Keratolyse, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus, Polyarteriitis, Trauma, Wegener-Sarkoidose, Skleritis, Stevens-Johnson-Krankheit, Pemphigoid, radiale Keratotomie, Hornhauttransplantatabstoßung, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, chronische Entzündung (z.B. ulzerative Colitis oder Crohn-Krankheit), Hämangiom, Osler-Weber-Rendu-Krankheit und hereditäre hämonhagische Teleangiektasie ein.
Zusätzlich spielt Angiogenese eine kritische Rolle bei Krebs. Ein Tumor kann sich ohne Blutzufuhr, wobei Nährstoffe bereitgestellt und Zellabfallprodukte entfernt werden, nicht ausbreiten. Tumoren, bei denen eine Angiogenese wichtig ist, schließen solide Tumoren, wie Rhabdomyosarkome, Retinoblastom, Ewing-Sarkom, Neuroblastom und Osteosarkom, und gutartige Tumoren, wie Akustikusneurinom, Neurofibrom, Trachom und pyogene Granulome, ein. Es wurde festgestellt, dass angiogene Faktoren mit mehreren soliden Tumoren in Zusammenhang stehen. Eine Verhinderung von Angiogenese kann das Wachstum dieser Tumoren und die daraus entstandene Schädigung für das Tier auf Grund der Gegenwart des Tumors stoppen. Angiogenese steht auch mit hämatogenen Tumoren, wie Leukämien und beliebigen verschiedenen akuten oder chronischen neoplastischen Krankheiten des Knochenmarks in Zusammenhang, bei denen eine uneingeschränkte Proliferation weißer Blutzellen auftritt, die in der Regel von Anämie, gestörter Blutgerinnung und einer Vergrößerung der Lymphknoten, Leber und Milz begleitet ist. Es wird angenommen, dass Angiogenese bei den Anomalien im Knochenmark, die leukämieartige Tumoren hervorrufen, eine Rolle spielt.
Zusätzlich zum Tumorwachstum ist Angiogenese bei der Metastasenbildung von Bedeutung. Am Anfang ist die Angiogenese bei der Gefäßbildung des Tumors wichtig, die es kanzerösen Zellen ermöglicht, in den Blutstrom einzutreten und im ganzen Körper zu zirkulieren. Nachdem die Tumorzellen die primäre Stelle verlassen und sich an der sekundären Metastasenstelle angesiedelt haben, muss eine Angiogenese eintreten, bevor der neue Tumor wachsen und sich ausbreiten kann. Daher kann eine Verhinderung von Angiogenese zu einer Vorbeugung der Metastasenbildung von Tumoren führen und möglicherweise das neoplastische Wachstum an der primären Stelle halten.
Angiogenese ist auch an normalen physiologischen Prozessen, wie der Fortpflanzung und Wundheilung, beteiligt. Angiogenese ist ein wichtiger Schritt beim Eisprung und auch bei der Einnistung der Blastula nach der Befruchtung. Eine Verhinderung von Angiogenese kann verwendet werden, um Amenorrhöe auszulösen, den Eisprung zu blockieren oder eine Einnistung der Blastula zu verhindern.
Es wird erwartet, dass die Erfindung für die Behandlung und/oder Vorbeugung des Atemnotsyndroms oder anderer Erkrankungen, die sich aus einer ungeeigneten Lungenoberflächenspannung ergeben, verwendbar ist. Das Atemnotsyndrom resultiert aus nicht ausreichendem Surfactant in den Alveolen der Lungen. Die Lungen von Wirbeltieren enthalten Surfactant, ein komplexes Gemisch aus Lipiden und Protein, das eine Zunahme der Oberflächenspannung während der Lungenfüllung und eine Abnahme der Oberflächenspannung während der Lungenentleerung verursacht. Während der Lungenentleerung nimmt das Surfactant ab, so dass keine Oberflächenkräfte bestehen, die den Alveolarkollaps anderweitig fördern. Mit Luft gefüllte Alveolen, die während der Ausatmung nicht kollabierten, ermöglichen einen kontinuierlichen Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport zwischen dem Blut und Alveolargas und erforden eine viel geringere Kraft, um sich während der nachfolgenden Einatmung zu füllen. Während der Füllung erhöht das Lungensurfactant die Oberflächenspannung, da die Alveolaroberfläche zunimmt. Eine zunehmende Oberflächenspannung in sich ausdehnenden Alveolen wirkt einer Überfüllung dieser Lufträume entgegen und lenkt die eingeatmete Luft offensichtlich in weniger gut mit Luft gefüllte Alveolen, wodurch eine gleichmäßige Lungenbelüftung erleichtert wird.
Das Atemnotsyndrom ist unter Frühgeborenen besonders häufig. Das Lungensurfactant wird bis auf die letzten sechs Wochen des fetalen Lebens normalerweise mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit gebildet. Menschliche Säuglinge, die mehr als sechs Wochen vor der normalen Schwangerschaftszeit geboren werden, weisen ein hohes Risiko auf, mit ungenügenden Mengen an Lungensurfactant und ungenügenden Geschwindigkeiten der Surfactantsynthese geboren zu werden. Je frühreifer ein Säugling geboren wird, umso schwerwiegender ist wahrscheinlich der Surfactantmangel. Ein schwerwiegender Surfactantmangel kann innerhalb weniger Minuten oder Stunden nach der Geburt zu einem Atemversagen führen. Der Surfactantmangel erzeugt wegen der abnehmenden Fähigkeit der Lunge, sich trotz einer maximalen Einatmungsanstrengung auszudehnen, einen fortschreitenden Kollaps der Alveolen (Atelektase). Folglich erreichen ungenügende Sauerstoffmengen das Blut des Säuglings. RDS kann typischerweise als Folge eines Versagens der Surfactantbiosynthese auch bei Erwachsenen vorkommen.
Das Lungengewebe von Frühgeborenen zeigt eine hohe Aktivität des signalgebenden Wegs von Hedgehog. Eine Hemmung dieses Wegs unter Verwendung von Hedgehog-Antagonisten erhöht die Bildung lamellarer Körper und erhöht die Expression von Genen, die an der Surfactantbiosynthese beteiligt sind. Lamellare Körper sind subzelluläre Strukturen, die mit der Surfactantbiosynthese in Zusammenhang stehen. Aus diesen Gründen sollte eine Behandlung von Frühgeborenen mit einem Hedgehog-Antagonisten die Surfactantbiosynthese stimulieren und RDS bessern. In Fällen, in denen RDS bei Erwachsenen mit einer Aktivierung des Hedgehog-Wegs in Zusammenhang steht, sollte eine Behandlung mit Hedgehog-Antagonisten ebenfalls wirksam sein.
Es ist ferner beabsichtigt, dass die Verwendung von Hedgehog-Antagonisten spezifisch auf Erkrankungen gerichtet sein kann, bei denen das betroffene Gewebe und/oder die betroffenen Zellen eine starke Aktivierung des Hedgehog-Wegs zeigen. Die Expression von Gli-Genen, einschließlich Gli-1, Gli-2 und Gli-3, wird durch den signalgebenden Weg von Hedgehog aktiviert. Die Gli-1-Expression ist am beständigsten mit einer signalgebenden Aktivität von Hedgehog über einen breiten Bereich von Geweben und Erkrankungen korreliert, während Gli-3 es etwas weniger ist. Die Gli-Gene kodieren Transkriptionsfaktoren, die die Expression vieler Gene aktivieren, die benötigt werden, um die vollständigen Wirkungen der Signalgebung von Hedgehog hervorzurufen. Der Gli-3-Transkriptionsfaktor kann jedoch auch als Repressor der Hedgehog-Effektorgene wirken, und daher kann die Expression von Gli-3 eine verringerte Wirkung des signalgebenden Wegs von Hedgehog verursachen. Ob Gli-3 als Transkriptionsaktivator oder -repressor wirkt, hängt von posttranslationalen Ereignissen ab, und es wird daher erwartet, dass Verfahren zum Nachweis der aktivierenden Form (gegenüber der reprimierenden Form) des Gli-3-Proteins ebenfalls ein zuverlässiges Maß für die Aktivierung des Hedgehog-Wegs darstellen. Von der Expression des Gli-2-Gens wird erwartet, dass sie einen zuverlässigen Marker für die Aktivierung des Hedgehog-Wegs bereitstellt. Das Gli-1-Gen wird bei einer umfassenden Reihe von Krebserkrankungen, Hyperplasien und unreifen Lungen stark exprimiert und dient als Marker für die relative Aktivierung des Hedgehog-Wegs. Zusätzlich werden Gewebe, wie eine unreife Lunge, die eine starke Expression des Gli-Gens aufweisen, durch Hedgehog-Inhibitoren stark beeinflusst. Folglich ist es beabsichtigt, dass der Nachweis der Expression des Gli-Gens als wirkungsvolles prognostisches Hilfsmittel zur Identifizierung von Geweben und Erkrankungen, die aus der Behandlung mit einem Hedgehog-Antagonisten einen besonderen Nutzen ziehen, verwendet werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen werden entweder durch den direkten Nachweis des Transkripts oder durch den Nachweis von Proteinkonzentrationen oder -aktivität Gli-1-Expressionsgrade nachgewiesen. Transkripte können unter Verwendung eines beliebigen aus einem breiten Bereich von Verfahren, die in erster Linie von der Hybridisierung von DNA-Sonden zu den Gli-1-Transkripten oder zu daraus synthetisierten cDNAs abhängen, nachgewiesen werden. Allgemein bekannte Verfahren schließen Northern-Blotting, PCR mit reverser Transkriptase und Mikroarrayanalyse von Transkriptkonzentrationen ein. Verfahren zum Nachweis von Gli-Proteinkonzentrationen schließen Western-Blotting, Immunpräzipitation, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D SDS-PAGE) (bevorzugt verglichen mit einem Standard, in dem die Position der Gli-Proteine bestimmt wurde) und Massenspektroskopie ein. Massenspektroskopie kann mit einer Reihe von Reinigungsschritten gekoppelt werden, um eine Identifizierung vieler verschiedener Proteinkonzentrationen in einer besonderen Probe mit einem hohen Durchsatz zu ermöglichen. Massenspektroskopie und 2D SDS-PAGE können auch verwendet werden, um posttranskriptionale Modifikationen an Proteinen, einschließlich proteolytischer Ereignisse, Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Lipidmodifikation etc., zu identifizieren. Die Gli-Aktivität kann auch beurteilt werden, indem die Bindung an Träger-DNA oder die Transkriptionsaktivierung von Zielpromotoren in vitro analysiert wird. Gel-Shift-Tests, DNA-Footprinting-Tests und DNA-Protein-Vernetzungstests sind alles Verfahren, die verwendet werden können, um die Gegenwart eines Proteins, das an Gli-Bindungsstellen auf DNA binden kann, zu beurteilen.
In bevorzugten Ausführungsformen werden Gli-Transkriptkonzentrationen gemessen und erkrankte oder gestörte Gewebe, die anomal hohe Gli-Konzentrationen zeigen, werden mit einem Hedgehog-Antagonisten behandelt. Lungengewebe von Frühgeborenen, Lungenkarzinome (z.B. Adenokarzinome, bronchoalveolare Adenokarzinome, kleinzellige Karzinome), Brustkarzinome (z.B. untere duktale Karzinome, untere lobuläre Karzinome, tubuläre Karzinome), Prostatakarzinome (z.B. Adenokarzinome) und gutartige Prostatahyperplasien zeigen in bestimmten Fällen alle stark erhöhte Gli-1-Expressionsgrade. Folglich sind Gli-1-Expressionsgrade ein wirkungsvolles diagnostisches Mittel, um zu bestimmen, welches dieser Gewebe mit einem Hedgehog-Antagonisten behandelt werden sollte. Zusätzlich gibt es einen wesentlichen korrelativen Beweis, dass Karzinome von Urothelzellen (z.B. Blasenkrebs, andere Urogenitalkarzinome) in bestimmten Fällen ebenfalls erhöhte Gli-1-Konzentrationen aufweisen. Es ist zum Beispiel bekannt, dass der Verlust von Heterozygotie auf dem Chromosom 9q22 bei Blasenkarzinomen häufig ist. Das Ptc-1-Gen befindet sich an dieser Position, und Ptc-1-Funktionsverlust ist wahrscheinlich ein partieller Grund der Hyperproliferation, wie bei vielen anderen Krebsarten. Folglich zeigen diese Karzinome auch eine starke Gli-Expression und sind für eine Behandlung mit einem Hedgehog-Antagonisten besonders geeignet.
Die Expression von Ptc-1 und Ptc-2 wird auch durch den signalgebenden Weg von Hedgehog aktiviert, jedoch sind diese Gene als Marker der Aktivierung des Hedgehog-Wegs den Gli-Genen unterlegen. In bestimmten Geweben wird nur eines der Gene Ptc-1 oder Ptc-2 exprimiert, obwohl der Hedgehog-Weg hochaktiv ist. Bei der Hodenentwicklung spielt zum Beispiel Indian-Hedgehog eine wichtige Rolle, und der Hedgehog-Weg wird aktiviert, aber nur Ptc-2 wird exprimiert. Folglich sind diese Gene als Marker für die Aktivierung des Hedgehog-Wegs einzeln unzuverlässig, obwohl eine gleichzeitige Messung beider Gene als nützlicher Indikator für mit einem Hedgehog-Antagonisten zu behandelndes Gewebe angesehen wird.
Krankheiten, die durch das vorliegende Verfahren behandelt werden können, sind Erkrankungen, die für nicht-menschliche Spezies spezifisch sind, wie Krätze.
In noch einer anderen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren bei der Behandlung von Krebserkrankungen bei Menschen, besonders Basalzellenkarzinomen und anderen Tumoren von Epithelgeweben, wie der Haut, verwendet werden. Hedgehog-Antagonisten können zum Beispiel in dem vorliegenden Verfahren als Teil einer Behandlung für das Basalzellnävussyndrom (BCNS) und andere menschliche Karzinome, Adenokarzinome, Sarkome und dergleichen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das vorliegende Verfahren als Teil eines Behandlungs- oder Prophylaxeschemas zur Behandlung (oder Vorbeugung) von Basalzellenkarzinom verwendet. Die Aufhebung der Kontrolle des signalgebenden Wegs von Hedgehog kann ein allgemeines Merkmal von durch Ptc-Mutationen hervorgerufenen Basalzellenkarzinomen sein. Eine beständige Überexpression von menschlicher Ptc-mRNA wurde in Tumoren familiärer und sporadischer BCCs beschrieben, die durch Hybridisierung in situ bestimmt wurde. Von Mutationen, die Ptc inaktivieren, kann erwartet werden, dass sie zu einer Überexpression von mutantem Ptc führen, da Ptc eine negative Selbstregulation zeigt. Frühere Forschungen zeigen, dass eine Überexpression von Hedgehog-Proteinen auch zu Tumorbildung führen kann. Durch Forschungen wurde darauf hingewiesen, dass Sonic-Hedgehog (Shh) eine Rolle bei der Tumorbildung in Mäusen spielt, wobei transgene Mäuse, die Shh in der Haut überexprimieren, nach nur wenigen Tagen der Hautentwicklung Merkmale von BCNS, einschließlich multipler BCC-ähnlicher, epidermaler Proliferationen über die gesamte Hautoberfläche, entwickelten. Eine Mutation in dem menschlichen Shh-Gen aus einem BCC wurde ebenfalls beschrieben; es wurde darauf hingewiesen, dass Shh oder andere Hh-Gene in Menschen als dominante Onkogene in Menschen wirken können. Sporadische Ptc-Mutationen wurden ebenfalls in BCCs aus ansonsten normalen Individuen beobachtet, von denen einige UV-charakteristische Mutationen sind. In einer neueren Untersuchung von sporadischen BCCs wurden fünf UV-charakteristische Mutationstypen, entweder CT- oder CCTT-Änderungen, in fünfzehn Tumoren entdeckt, von denen festgestellt wurde, dass sie Ptc-Mutationen enthalten. Eine andere neuere Analyse von sporadischen Ptc-Mutationen in BCCs und neuroektodermalen Tumoren offenbarte eine CT-Änderung in einer von drei Ptc-Mutationen, die in BCCs gefunden wurden. Siehe zum Beispiel Goodrich et al. (1997) Science 277: 1109-13; Xie et al. (1997) Cancer Res. 57: 2369-72; Oro et al. (1997) Science 276: 817-21; Xie et al. (1997) Genes Chromosomes Cancer 18: 305-9; Stone et al. (1996) Nature 384: 129-34; und Johnson et al. (1996) Science 272: 1668-71.
Das vorliegende Verfahren kann auch zur Behandlung von Patienten mit BCNS verwendet werden, um z.B. BCC oder anderen Auswirkungen der Krankheit, die sich aus einem Ptc-Funktionsverlust, einer Hedgehog-Funktionszunahme oder einer Smoothened-Funktionszunahme ergeben, vorzubeugen. Das Basalzellnävussyndrom ist eine seltene autosomal-dominante Erkrankung, die durch multiple BCCs, die im jungen Alter auftreten, gekennzeichnet ist. BCNS-Patienten sind für die Entwicklung dieser Tumoren sehr anfällig; im zweiten Lebensjahrzehnt tritt hauptsächlich auf der Sonne ausgesetzten Bereichen der Haut eine große Anzahl auf. Diese Krankheit verursacht auch mehrere Entwicklungsanomalien, einschließlich Rippen-, Kopf- und Gesichtsalterationen, und manchmal Polydaktylie, Syndaktylie und Spina bifida. Sie entwickeln zusätzlich zu BCCs auch mehrere Tumortypen: Fibrome der Eierstöcke und des Herzens, Zysten der Haut und des Kiefers und im Zentralnervensystem Medulloblastome und Meningiome. Das vorliegende Verfahren kann zur Vorbeugung oder Behandlung solcher Tumortypen bei BCNS- und Nicht-BCNS-Patienten verwendet werden. Untersuchungen von BCNS-Patienten zeigen, dass sie sowohl genomische als auch sporadische Mutationen im Ptc-Gen aufweisen, was darauf hinweist, dass diese Mutationen der letztendliche Grund dieser Krankheit sind.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittelzubereitungen, umfassend Hedgehog-Antagonisten, bereit. Die in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Hedgehog-Antagonisten können geeigneterweise zur Verabreichung mit einem biologisch verträglichen Medium, wie Wasser, gepufferter Kochsalzlösung, einem Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol, flüssigem Polyethylenglykol und dergleichen) oder geeigneten Gemischen davon, formuliert werden. Die optimale Konzentration des Wirkstoffs/der Wirkstoffe in dem gewählten Medium kann gemäß Verfahren, die Pharmakochemikern allgemein bekannt sind, empirisch bestimmt werden. Wie hier verwendet, schließt „biologisch verträgliches Medium" ein beliebiges und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien und dergleichen, die für den gewünschten Verabreichungsweg der Arzneimittelzubereitung geeignet sind, ein. Die Verwendung solcher Medien für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist in dem Fachgebiet bekannt. Außer wenn beliebige herkömmliche Medien oder Mittel mit der Aktivität des Hedgehog-Antagonisten inkompatibel sind, ist ihre Verwendung in der Arzneimittelzubereitung der Erfindung beabsichtigt. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich anderer Proteine, sind zum Beispiel in dem Buch Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) beschrieben. Diese Träger schließen injizierbare „Depotformulierungen" ein.
Arzneimittelformulierungen der vorliegenden Erfindung können auch tiermedizinische Zusammensetzungen, z.B. Arzneimittelzubereitungen der Hedgehog-Antagonisten, die für tiermedizinische Verwendungen, z.B. für die Behandlung von Vieh oder Haustieren, z.B. Hunden, geeignet sind, einschließen.
Verfahren zur Einführung können auch durch wiederbeladbare oder biologisch abbaubare Vorrichtungen bereitgestellt werden. Verschiedene polymere Vorrichtungen zur langsamen Freisetzung wurden in den letzten Jahren entwickelt und auf die gesteuerte Abgabe von Arzneistoffen, einschließlich proteinartiger Biopharmazeutika, in vivo untersucht. Eine Vielzahl von biokompatiblen Polymeren (einschließlich Hydrogelen), einschließlich sowohl biologisch abbaubarer als auch nicht-abbaubarer Polymere, kann verwendet werden, um ein Implantat für die verlängerte Freisetzung eines Hedgehog-Antagonisten an einem besonderen Zielort zu bilden.
Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden natürlich in Formen verabreicht, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Sie werden zum Beispiel in Tabletten oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, eine Augenlotion, eine Salbe, ein Suppositorium, ein Pflaster zur gesteuerten Freisetzung etc., Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation, topisch durch eine Lotion oder Salbe und rektal durch Suppositorien verabreicht. Orale und topische Verabreichungen sind bevorzugt.
Die Ausdrücke „parenterale Verabreichung" und „parenteral verabreicht", wie hier verwendet, bedeuten andere Verabreichungsarten als die enterale und topische Verabreichung, in der Regel durch Injektion, und schließen ohne Einschränkung eine intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion ein.
Die Ausdrücke „systemische Verabreichung", „systemisch verabreicht", „periphere Verabreichung" und „peripher verabreicht", wie hier verwendet, bedeuten eine andere Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneistoffs oder eines anderen Materials als direkt in das Zentralnervensystem, damit sie/er/es in das System des Patienten gelangt und somit dem Stoffwechsel und anderen ähnlichen Prozessen ausgesetzt ist, zum Beispiel eine subkutane Verabreichung.
Diese Verbindungen können Menschen oder anderen Tieren durch einen beliebigen geeigneten Verabreichungsweg, einschließlich oral, nasal, wie zum Beispiel durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazisternal und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual, zur Therapie verabreicht werden.
Ungeachtet des gewählten Verabreichungswegs werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden können, und/oder die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen, wie nachstehend beschrieben, oder durch andere herkömmliche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, formuliert.
Die tatsächlichen Dosierungshöhen der Wirkstoffe in den Arzneimitteln dieser Erfindung können so variiert werden, dass eine Menge des Wirkstoffs erhalten wird, die die gewünschte therapeutische Antwort für einen besonderen Patienten, eine besondere Zusammensetzung und eine besondere Verabreichungsart bewirkt, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Die gewählte Dosierungshöhe hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Wirksamkeit der verwendeten besonderen Verbindung der vorliegenden Erfindung oder des Esters, Salzes oder Amids davon, des Verabreichungswegs, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsgeschwindigkeit der verwendeten besonderen Verbindung, der Dauer der Behandlung, anderer Arzneistoffe, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit dem verwendeten besonderen Hedgehog-Antagonisten verwendet werden, des Alters, des Geschlechts, des Gewichts, der Krankheit, der allgemeinen Gesundheit und der vorangegangenen medizinischen Geschichte des zu behandelnden Patienten und ähnlicher Faktoren, die in den medizinischen Fachgebieten allgemein bekannt sind.
Ein Arzt oder Tierarzt mit einer normalen Fachkenntnis kann die wirksame Menge des erforderlichen Arzneimittels leicht bestimmen und verschreiben. Der Arzt oder Tierarzt kann zum Beispiel mit Dosen der in den Arzneimitteln verwendeten Verbindungen der Erfindung in Konzentrationen, die niedriger als die zur Erzielung der gewünschten therapeutischen Wirkung sind, beginnen und die Dosierung allmählich steigern, bis die gewünschte Wirkung erreicht ist.
Im Allgemeinen ist eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung der Erfindung die Menge der Verbindung, die die niedrigste Dosis ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen. Eine solche wirksame Dosis hängt im Allgemeinen von den vorstehend beschriebenen Faktoren ab. Im Allgemeinen liegen intravenöse, intrazerebroventrikuläre und subkutane Dosen der Verbindungen dieser Erfindung für einen Patienten im Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
Falls gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis des Wirkstoffs als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Subdosen verabreicht werden, die in geeigneten Zeitabständen den ganzen Tag, gegebenenfalls in Einheitsdosierungsformen, getrennt verabreicht werden.
Der Begriff „Behandlung" soll auch die Prophylaxe, Therapie und Heilung umfassen.
Der Patient, der die Behandlung erhält, ist ein beliebiges Tier, das sie benötigt, einschließlich Primaten, im besonderen Menschen, und andere Tiere, wie Pferde, Rinder, Schweine und Schafe, und Gefügel und Haustiere im Allgemeinen.
Die Verbindung der Erfindung kann als solche oder in Gemischen mit pharmazeutisch verträglichen und/oder sterilen Trägern verabreicht werden und kann auch in Verbindung mit anderen antimikrobiellen Mitteln, wie Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglykosiden und Glykopeptiden, verabreicht werden. Eine gemeinsame Therapie schließt somit die aufeinanderfolgende, gleichzeitige und getrennte Verabreichung des Wirkstoff auf eine Art und Weise ein, dass die therapeutischen Wirkungen des zuerst verabreichten Wirkstoffs nicht ganz verschwunden sind, wenn der nachfolgende Wirkstoff verabreicht wird.
V. Arzneimittel
Obwohl es möglich ist, eine in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verbindung allein zu verabreichen, wird die Verbindung bevorzugt als Arzneimittelformulierung (Zusammensetzung) verabreicht. Die in der Erfindung beschriebenen Hedgehog-Antagonisten können für die Verabreichung auf einem beliebigen geeigneten Weg zur Verwendung in der Human- oder Tiermedizin formuliert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die in der Arzneimittelzubereitung enthaltene Verbindung selbst wirksam sein oder kann eine Prodrug sein, die z.B. in einem physiologischen Umfeld in einen Wirkstoff umgewandelt werden kann.
Somit stellt eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Verbindungen, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Zusätzen) und/oder Verdünnungsmitteln formuliert wurden, bereit. Wie nachstehend ausführlich beschrieben, können die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form speziell formuliert werden, einschließlich der, die den Folgenden angepasst wurden: (1) orale Verabreichung, zum Beispiel Arzneitränke (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Boli, Pulver, Granulatkörner und Pasten zum Auftragen auf die Zunge; (2) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion als zum Beispiel eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, zum Beispiel als Creme, Salbe oder Spray, die/das auf die Haut aufgetragen wird; oder (4) intravaginal oder intrarektal, zum Beispiel als ein Pessar, eine Creme oder ein Schaum. In bestimmten Ausführungsformen können jedoch die vorliegenden Verbindungen einfach in sterilem Wasser gelöst oder suspendiert werden. In bestimmten Ausführungsformen ist die Arzneimittelzubereitung nicht-pyrogen, d.h. sie erhöht die Körpertemperatur eines Patienten nicht.
Der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet, bedeutet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, die durch die Überwindung von Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme eine gewisse gewünschte therapeutische Wirkung in mindestens einer Subpopulation von Zellen in einem Tier erzeugt und dadurch mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis, das auf eine beliebige medizinische Behandlung anwendbar ist, die biologischen Folgen dieses Wegs in den behandelten Zellen blockiert.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglich" wird hier verwendet, um die Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die innerhalb des Umfangs einer vernünftigen medizinischen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne eine übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation entsprechend einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis geeignet sind.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Träger", wie hier verwendet, bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, einen Exzipienten, ein Lösungsmittel oder ein Einkapselungsmaterial, der/das an der Übertragung oder dem Transport der vorliegenden Antagonisten von einem Organ oder einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers beteiligt ist. Jeder Träger muss in der Hinsicht „verträglich" sein, als er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Patienten nicht schädlich ist. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, schließen ein: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverisierten Tragant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Exzipienten, wie Kakaobutter und Suppositoriumswachse; (9) Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Safloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maiskeimöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol; (12) Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffersubstanzen, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotone Kochsalzlösung; (18) Ringerlösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatpufferlösungen und (21) andere nichttoxische, kompatible Substanzen, die in Arzneimittelformulierungen verwendet werden.
Wie vorstehend aufgezeigt, können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten eine basische funktionelle Gruppe, wie Amino oder Alkylamino, enthalten, und können somit mit pharmazeutisch verträglichen Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze bilden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in dieser Hinsicht auf die verhältnismäßig nicht-toxischen, anorganischen und organischen Säureadditionssalze von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können während der Endisolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung in situ hergestellt werden oder durch getrennte Umsetzung einer gereinigten Verbindung der Erfindung in Form ihrer freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolierung des so gebildeten Salzes hergestellt werden. Repräsentative Salze schließen die Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Hydrogensulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptanoat-, Lactobionat- und Laurylsulfonatsalze und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al. (1977) „Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
Die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorliegenden Verbindungen schließen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder quartären Ammoniumsalze der Verbindungen, z.B. aus nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säuren, ein. Diese herkömmlichen nichttoxischen Salze schließen zum Beispiel die von anorganischen Säuren, wie Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Sulfamin-, Phosphor-, Salpetersäure und dergleichen, abgeleiteten und die aus organischen Säuren, wie Essig-, Propion-, Bernstein-, Glykol-, Stearin-, Milch-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Palmitin-, Malein-, Hydroxymalein-, Phenylessig-, Glutamin-, Benzoe-, Salicyl-, Sulfanil-, 2-Acetoxybenzoe-, Fumar-, Toluolsulfon-, Methansulfon-, Ethandisulfon-, Oxal-, Isothionsäure und dergleichen, hergestellten Salze ein.
In anderen Fällen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und können somit mit pharmazeutisch verträglichen Basen pharmazeutisch verträgliche Salze bilden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in diesen Fällen auf die verhältnismäßig nicht-toxischen, anorganischen und organischen Basenadditionssalze von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können während der Endisolierung und Reinigung der Verbindungen desgleichen in situ hergestellt werden oder durch getrennte Umsetzung der gereinigten Verbindung in Form ihrer freien Säure mit einer geeigneten Base, wie dem Hydroxid, Carbonat oder Hydrogencarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen, primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalimetallsalze schließen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen ein. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Basenadditionssalzen verwendbar sind, schließen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al., supra).
Die Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbmittel, Trennmittel, Überzugsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe und Parfümierungsmittel, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorhanden sein.
Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Antioxidationsmitteln schließen ein: (1) wasserlösliche Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumhydrogensulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfat und dergleichen; (2) öllösliche Antioxidationsmittel, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metallchelatbildner, wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung schließen die zur oralen, nasalen, topischen (einschließlich bukkaler und sublingualer), rektalen, vaginalen und/oder parenteralen Verabreichung geeigneten ein. Die Formulierungen können geeigneterweise in einer Einheitsdosierungsform dargereicht werden und können durch beliebige Verfahren, die in dem Fachgebiet der Pharmazie allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Die Menge des Wirkstoffs, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzeldosierte Arzneiform herzustellen, variiert abhängig von dem behandelten Wirt und der besonderen Verabreichungsart. Die Menge des Wirkstoffs, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzeldosierte Arzneiform herzustellen, ist im Allgemeinen die Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung erzeugt. Im Allgemeinen liegt diese Menge, bezogen auf 100 %, im Bereich von etwa 1 % bis etwa 99 % des Wirkstoffs, bevorzugt von etwa 5 % bis etwa 70 % und am meisten bevorzugt von etwa 10 % bis etwa 30 %.
Herstellungsverfahren dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen schließen den Schritt der Vereinigung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit dem Träger und gegebenenfalls einem oder mehreren Hilfsbestandteilen ein. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden gleichmäßig und gründlich vereinigt wird und dann, wenn nötig, das Produkt geformt wird.
Formulierungen der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Cachets, Pillen, Tabletten, Pastillen (unter Verwendung einer schmackhaften Basis, in der Regel Saccharose und Gummi arabicum oder Tragant), Pulvern, Granulatkörnern oder als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als eine flüssige Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion oder als ein Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum) und/oder als Mundwasser und dergleichen vorliegen, die jeweils eine vorher festgelegte Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff enthalten. Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste verabreicht werden.
In festen Dosierungsformen der Erfindung zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulatkörner und dergleichen) wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, und/oder einem beliebigen der Folgenden gemischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel, wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummi arabicum; (3) Feuchthaltemittel, wie Glycerin; (4) Sprengmittel, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerer, wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger, wie quartäre Ammoniumverbindungen; (7) Netzmittel, wie zum Beispiel Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorptionsmittel, wie Kaolin und Bentonitton; (9) Gleitmittel, wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und (10) Farbmittel. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Arzneimittel auch Puffersubstanzen umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können ebenfalls als Füllstoffe in gefüllten Weich- und Hartgelatinekapseln unter Verwendung von solchen Exzipienten, wie Lactose oder Milchzucker, sowie Polyethylenglykolen mit hohem Molekulargewicht und dergleichen verwendet werden.
Eine Tablette kann durch Pressen oder Formpressen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen, hergestellt werden. Gepresste Tabletten können unter Verwendung eines Bindemittels (zum Beispiel Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittels, inerten Verdünnungsmittels, Konservierungsmittels, Sprengmittels (zum Beispiel Natriumstärkeglykolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven Mittels oder Dispergiermittels hergestellt werden. Formgepresste Tabletten können durch Formpressen eines Gemisches der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten, flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet wurde, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.
Die Tabletten und anderen festen Dosierungsformen der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulatkörner, können gegebenenfalls eingekerbt oder mit Überzügen und Hüllen, wie magensaftresistenten Überzügen und anderen Überzügen, die in dem Fachgebiet pharmazeutischer Formulierungen allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitgestellt wird, indem zum Beispiel Hydroxypropylmethylcellulose in unterschiedlichen Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, andere Polymermatrizen, Liposomen und/oder Mikrokügelchen verwendet werden. Sie können zum Beispiel durch Filtration durch ein Bakterienrückhaltefilter oder durch Einbringen von Sterilisierungsmitteln in Form von sterilen, festen Zusammensetzungen, die kurz vor der Verwendung in sterilem Wasser oder irgendeinem anderen sterilen, injizierbaren Medium gelöst werden können, sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten und können eine Zusammensetzung derart aufweisen, dass sie den/die Wirkstoff/e nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltrakts, gegebenenfalls auf eine verzögerte Art und Weise, freisetzen. Beispiele von Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein. Der Wirkstoff kann auch, falls geeignet, in mikroverkapselter Form mit einem oder mehreren der vorstehend beschriebenen Exzipienten vorliegen.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung der Verbindungen der Erfindung schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zum Wirkstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die gewöhnlich in dem Fachgebiet verwendet werden, wie zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, wie Ethylallcohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (im besonderen Baumwollsamen-, Erdnuss-, Maiskeim-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglykole und Sorbitanfettsäureester und Gemische davon, enthalten.
Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe, wie Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Farbmittel, Parfümierungsmittel und Konservierungsmittel, einschließen.
Suspensionen können zusätzlich zu den Wirkstoffen Suspendiermittel, wie zum Beispiel ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant, und Gemische davon enthalten.
Es ist bekannt, dass Sterole, wie Cholesterin, mit Cyclodextrinen Komplexe bilden. Somit kann in bevorzugten Ausführugsformen, der Inhibitor, wenn er ein steroidales Alkaloid ist, mit Cyclodextrinen, wie α-, β- und γ-Cyclodextrin, Dimethyl-β-cyclodextrin und 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, formuliert werden.
Formulierungen der Arzneimittel der Erfindung zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als Suppositorium dargereicht werden, das durch Mischen einer oder mehrerer Verbindungen der Erfindung mit einem oder mehreren geeigneten nicht-reizenden Exzipienten oder Trägern, umfassend zum Beispiel Kakaobutter, Polyethylenglykol, ein Suppositoriumswachs oder ein Salicylat, hergestellt werden kann und das bei Raumtemperatur fest ist, jedoch bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmilzt und den aktiven Hedgehog-Antagonisten freisetzt.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, schließen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen ein, die solche Träger enthalten, von denen in dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie geeignet sind.
Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung schließen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel ein. Der Wirkstoff kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit beliebigen Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, gemischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einem Wirkstoff dieser Erfindung Exzipienten, wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon, enthalten.
Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer Verbindung dieser Erfindung Exzipienten, wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen, enthalten. Sprays können zusätzlich gebräuchliche Treibmittel, wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige, unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie Butan und Propan, enthalten.
Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer gesteuerten Abgabe einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an den Körper auf. Solche Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren der Hedgehog-Antagonisten in dem geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können ebenfalls verwendet werden, um den Fluss der Hedgehog-Antagonisten über die Haut zu erhöhen. Die Geschwindigkeit eines solchen Flusses kann gesteuert werden, indem entweder eine geschwindigkeitssteuernde Membran bereitgestellt wird oder die Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel dispergiert wird.
Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass ophthalmische Formulierungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergleichen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen.
Arzneimittel dieser Erfindung, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen, sterilen, isotonen, wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern, die kurz vor der Verwendung in sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isoton machen, oder Suspendier- oder Verdickungsmittel enthalten können, rekonstituiert werden können.
Beispiele geeigneter wässriger und nicht-wässriger Träger, die in den Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden können, schließen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Gemische davon, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat, ein. Eine geeignete Fließfähigkeit kann zum Beispiel durch die Verwendung von Überzugsmaterialien, wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel, enthalten. Eine Vorbeugung gegen die Wirkung von Mikroorganismen kann durch den Einschluss verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen, sichergestellt werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotone Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen, in den Zusammensetzungen einzuschließen. Zusätzlich kann durch den Einschluss von Mitteln, die die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine, eine verlängern Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form bewirkt werden.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, die Absorption des Arzneistoffs aus einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen, um die Wirkung eines Arzneistoffs zu verlängern. Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension eines kristallinen oder amorphen Materials, das eine geringe Wasserlöslichkeit aufweist, erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffs hängt dann von seiner Auflösungsgeschwindigkeit ab, die wiederum von der Kristallgröße und kristallinen Form abhängen kann. In einer anderen Ausführungsform wird die verzögern Absorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform durch Lösen oder Suspendieren des Arzneistoffs in einem Ölträger erreicht.
Injizierbare Depotformen werden durch die Bildung von Mikroverkapselungsmatrizen der vorliegenden Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polylactid-Polyglykolid, hergestellt. Abhängig von dem Verhältnis von Arzneistoff zu Polymer und der Art des verwendeten besonderen Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung gesteuert werden. Beispiele anderer biologisch abbaubarer Polymere schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Injizierbare Depotformulierungen werden auch durch den Einschluss des Arzneistoffs in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Arzneistoffe an Menschen und Tiere verabreicht werden, können sie als solche oder als ein Arzneimittel, das zum Beispiel 0,1 bis 99,5 % (stärker bevorzugt 0,5 bis 90 %) des Wirkstoffs in Kombination mit einem pharmazeutisch veträglichen Träger enthält, verabreicht werden.
Die Zugabe des Wirkstoffs der Erfindung zu Tierfutter erfolgt bevorzugt durch die Herstellung einer geeigneten Futtervormischung, die den Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, und das Einbringen der Vormischung in die vollständige Ration.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Zwischenkonzentrat oder eine Futterergänzung, das/die den Wirkstoff enthält, in das Futter gemischt werden. Die Art und Weise, wie solche Futtervormischungen und vollständigen Rationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Nachschlagewerken (wie „Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman and CO., San Francisco, U.S.A., 1969 oder „Livestock Feeds and Feeding", O- und B-Bücher, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977) beschrieben.
VI. Syntheseschemata und Identifizierung aktiver Antagonisten
Die vorliegenden steroidalen Alkaloide und Vertreter davon können unter Verwendung der Kreuzkupplungsverfahren von Suzuki, Stille und dergleichen leicht hergestellt werden. Diese Kupplungsreaktionen werden unter relativ milden Bedingungen durchgeführt und tolerieren einen breiten Bereich an „Spektator"funktionalität.
a. Kombinatorische Bibliotheken
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, besonders Bibliotheken von Varianten, die verschiedene repräsentative Klassen von Substituenten aufweisen, sind durch kombinatorische Chemie und andere parallele Syntheseschemata zugänglich (siehe zum Beispiel PCT WO 94/08051). Das Ergebnis ist, dass große Bibliotheken verwandter Verbindungen, z.B. eine vielseitige Bibliothek der vorstehend dargestellten Verbindungen, in Tests mit einem hohen Durchsatz schnell durchmustert werden können, um mögliche Leitverbindungen von Hedgehog-Antagonisten zu identifizieren sowie die Spezifität, Toxizität und/oder das zytotoxischkinetische Profil einer Leitverbindung zu verbessern. Tests der biologischen Aktivität von Ptc, Hedgehog oder Smoothened, wie sie unter Verwendung von Zellen mit entweder Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme entwickelt werden können, können beispielsweise verwendet werden, um eine Bibliothek der vorliegenden Verbindungen auf die mit einer Agonistenwirksamkeit gegenüber Ptc oder einer Antagonistenwirksamkeit gegenüber Hedgehog oder Smoothened zu durchmustern.
Nur zur Veranschaulichung, eine kombinatorische Bibliothek für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch aus chemisch verwandten Verbindungen, die zusammen auf eine gewünschte Eigenschaft durchmustert werden können. Die Herstellung vieler verwandter Verbindungen in einer einzigen Reaktion verringert und vereinfacht die Zahl von Durchmusterungsverfahren, die durchgeführt werden müssen, beträchtlich. Eine Durchmusterung auf die geeigneten physikalischen Eigenschaften kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden.
Die Mannigfaltigkeit in der Bibliothek kann in einer Vielzahl von verschiedenen Graden erzeugt werden. Die in den kombinatorischen Reaktionen verwendeten Arylsubstratreste können sich beispielsweise bezüglich der Arylkerneinheit unterscheiden, z.B. eine Vielseitigkeit bezüglich der Ringstruktur aufweisen, und/oder können hinsichtlich der anderen Substituenten variiert werden.
Eine Vielzahl von Verfahren ist in dem Fachgebiet zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken von kleinen, organischen Molekülen, wie den vorliegenden Hedgehog-Antagonisten, verfügbar. Siehe zum Beispiel Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; die U.S.-Patente 5,359,115 und 5,362,899 von Affymax; das U.S.-Patent 5,288,514 von Ellman; die PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al.; die U.S.-Patente 5,736,412 und 5,712,171 von ArQule; Chen et al. (1994) JACS 116: 2661; Kerr et al. (1993) JACS 115: 252; die PCT-Veröffentlichungen WO 92/10092, WO 93/09668 und WO 91/07087; und die PCT-Veröffentlichung WO 93/20242 von Lemer et al. Folglich kann eine Vielzahl von Bibliotheken in der Größenordnung von etwa 100 bis 1000000 oder mehr Diversomeren der vorliegenden Hedgehog-Antagonisten hergestellt und auf eine besondere Aktivität oder Eigenschaft durchmustert werden.
In einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Bibliothek in Frage kommender Diversomere von Hedgehog-Antagonisten unter Verwendung eines Schemas, das den in der PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al. beschriebenen Verfahren angepasst wurde, hergestellt werden, indem sie z.B. durch eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe, die sich gegebenenfalls an einer der Positionen der in Frage kommenden Antagonisten oder eines Substituenten einer Synthesezwischenverbindung befindet, an ein Polymerkügelchen gebunden werden. Gemäß dem Verfahren von Still et al. wird die Bibliothek auf einem Satz von Kügelchen hergestellt, wobei jedes Kügelchen einen Satz von Markierungen einschließt, die das besondere Diversomer auf diesem Kügelchen identifizieren. Die Bibliothek auf den Kügelchen kann dann mit Zellen mit Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme, für die ein Hedgehog-Antagonist gesucht wird, „plattiert" werden. Die Diversomere können z.B. durch Hydrolyse von dem Kügelchen freigesetzt werden.
Die Strukturen der Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, eignen sich selbst ohne weiteres für eine wirksame Synthese. Die Art der Strukturen, wie sie durch die Formeln I bis IV allgemein beschrieben wurden, ermöglicht den Aufbau solcher Verbindungen unter Verwendung einer gewissen Kombination der R₁-, R₂-, R₃- und R₄-Einheit, wie vorstehend aufgezeigt. Diese Untereinheiten können zum Beispiel durch allgemein bekannte Acylierungs- oder Alkylierungsreaktionen an den Ringkern gebunden werden. Die große Mehrheit solcher Reaktionen, einschließlich der in den 11, 12, 15 und 16 dargestellten, ist sowohl äußerst mild als auch äußerst zuverlässig und ist somit für eine kombinatorische Chemie perfekt geeignet. Die einfache Art eines solchen kombinatorischen Verfahrens für die Erzeugung einer Bibliothek von Testverbindungen wird in dem nachstehenden beispielhaften Schema offensichtlich (P = Schutzgruppe), wobei die verschiedenen Gruppen einer Verbindung gemäß den vorstehenden Formeln kombinatorisch verbunden werden (z.B. unter Verwendung eines der vorstehend beschriebenen Verfahren). Eine noch größere Mannigfaltigkeit kann zum Beispiel unter Verwendung einer Reihe von reaktiven Funktionalitäten, wenn eine Untereinheit angefügt wird, z.B. unter Verwendung einer Reihe von R-L-C(O)Cl, PO-Ar-L-NCO, PO-Ar-L-SO₂Cl etc., wenn eine R₁-Untereinheit angefügt wird, erreicht werden.
Viele Variationen des vorstehenden Wegs und verwandter Wege ermöglichen die Synthese sehr mannigfaltiger Verbindungsbibliotheken, die als Inhibitoren der Hedgehog-Funktion untersucht werden können.
Eine Reihe von Verbindungen, die mit den hier offenbarten allgemeinen Strukturen übereinstimmen, wurde hergestellt und auf die biologische Wirksamkeit untersucht (siehe unten). Eine geeignete Kernstruktur kann, wie in dem nachstehenden Schema zusammengefasst, leicht aus im Handel erhältlichem trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt werden:
trans-4-Hydroxy-L-prolinmethylesterhydrochlorid:
Acetylchlorid (249 ml, 3,47 mol) wurde unter Rühren und Kühlen, um die Temperatur unter 30°C zu halten, tropfenweise zu Methanol (2090 ml) gegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde vor der Zugabe von trans-4-Hydroxy-L-prolin (325 g, 2,48 mol) als Feststoff zusätzliche 60 min weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h unter Rückfluss erhitzt, auf 0°C abgekühlt, und tert-Butylmethylether (TBME, 5220 ml) wurde während 30 min langsam zugegeben. Der gefällte Feststoff wurde auf einem Filter aufgenommen und mit eiskaltem TBME (2 × 1 l) gewaschen. Das Produkt wurde bei 40°C über Nacht im Vakuum getrocknet, wobei sich 424 g des gewünschten Esters ergaben.
trans-1-(tert-Butoxycarbonyl)-4-hydroxy-L-prolinmethylester:
Das Esterprodukt der vorhergehenden Reaktion (423 g, 2,32 mol) wurde in Dichlormethan (6,5 1) suspendiert. Unter Rühren und Kühlen wurde Triethylamin (1019 ml, 7,32 mol) während 30 min zugegeben, gefolgt von Di-tert-butyldicarbonat (588 g, 2,70 mol) während 30 min, um die innere Temperatur unter 15°C zu halten. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, gefolgt von der Zugabe von 1 M wässriger Citronensäurelösung (650 ml). Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, und die organische Schicht wurde abgetrennt, mit 1 M wässrigem KHCO₃ (920 ml) und Wasser (2 × 1 ) gewaschen und über MgSO₄ in Gegenwart von Aktivkohle (15 g) getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Flashchromatographie (2 × 1800 g Silicagel, Elutionsmittel Hexan:EtOAc, 3:1 bis 2:1) gereinigt, wobei sich das gewünschte Carbamat (489 g) ergab.
(4R)-1-(tert-Butoxycarbonyl)-4-[(methylsulfonyl)oxy]-L-prolinmethylester:
Das vorstehende Carbamat (478 g, 1,95 mol), N-Diisopropylethylamin (DIPEA, 373 ml, 2,15 mol) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 23,8 g, 0,195 mol) wurden in Dichlormethan (7650 ml) gelöst. Methansulfonylchlorid (167 ml, 2,15 mol) in Dichlormethan (950 ml) wurde während 50 min unter Kühlen, um die Temperatur unter 10°C zu halten, tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei –6°C 2 h gerührt, Wasser (750 ml) wurde zugegeben, das Gemisch wurde weitere 15 min gerührt, und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit 1 M wässrigem KHCO₃ (950 ml), 1 M wässr. Citronensäure (2 × 950 ml) und Wasser (750 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand kristallisierte mit Hexan (1,9 1). Das kristalline Mesylat wurde auf einem Filter aufgenommen, mit Hexan (2 × 500 ml) gewaschen und bei 40°C im Vakuum getrocknet, wobei sich 624 g des Produkts ergaben.
(4S)-1-(tert-Butoxycarbonyl)-4-azido-L-prolinmethylester:
Eine Lösung von dem vorstehenden Mesylat (624 g, 1,93 mol) und Natriumazid (716 g, 11,01 mol) in Dimethylformamid (DMF, 3120 ml) wurde 22 h bei 60°C gerührt, die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, Wasser (3 l) wurde während 40 min zugegeben, um die Temperatur unter 20°C zu halten, und EtOAC (3 l) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 20 min kräftig gerührt, die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (3 l) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (750 ml), 0,1 M wässr. HCl (400 ml) und Wasser (750 ml) gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Flashchromatographie (2 × 1800 g Silicagel, Hexan:EtOAc, 2:1) gereinigt, wobei sich das gewünschte Azid (516 g) ergab.
(4S)-4-Azido-L-prolinmethylesterhydrochlorid:
Eine gesättigte Lösung von HCl in Dioxan (1940 ml) wurde bei 10-16°C hergestellt, und eine Lösung des Azids (523 g, 1,94 mmol) in Dioxan (480 ml) wurde unter Rühren und Kühlen während 30 min, um die Temperatur unter 25°C zu halten, tropfenweise zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, TBME (2 l) wurde zugegeben, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 0°C 1 Stunde gerührt. Der gefällte Feststoff wurde auf Filterpapier aufgenommen, mit TBME (4 × 500 ml) gewaschen und bei 40°C im Vakuum getrocknet, wobei sich das gewünschte Hydrochloridsalz (348 g) ergab.
Die vorliegenden Verbindungen können aus dem vorstehenden Kern oder aus verwandten Verbindungen oder Derivaten unter Verwendung von Lösungsphasen- oder Festphasenverfahren, wie in den nachstehenden Schemata gezeigt, hergestellt werden: Schema 1: Lösungsphasenweg 1
Schema 2: Lösungsphasenweg 2
Schema 3: Festphasenweg
Diese Wege zusammen mit dem beispielhaften Festphasenweg stellen einen Zugang zu vielen verschiedenen Verbindungen mit unterschiedlichen Substituenten und stereochemischen Beziehungen bereit. Für einen Fachmann ist es selbstverständlich, dass die Verwendung von Piperazin in den vorstehenden Schemata nur beispielhaft ist, und andere Amine verwendet werden können, um eine noch mannigfaltigere Reihe der vorliegenden Verbindungen zu erhalten. Entsprechend ist die Verwendung von BOC, FMOC und anderen Schutzgruppen nur beispielhaft, und ein Fachmann kann andere Schutzgruppen, die für die funktionelle Gruppe und die nachfolgenden Reaktionsbedingungen geeignet sind, auswählen, ohne den Umfang und das Wesen der vorliegenden Erfindung zu ändern. Obwohl die vorstehenden Schemata typischerweise mit der trans-Hydroxy-L-prolinverbindung beginnen, sind außerdem alle Isomere dieser Verbindung, einschließlich der cis/trans- und D/L-Verbindungen, im Handel erhältlich, wobei ein Zugang zu vielen verschiedenen diastereomerenreinen Zwischenverbindungen und den vorliegenden Verbindungen bereitgestellt wird. Ein trans-Aminoprolinkern kann aus einem trans-Hydroxyprolinausgangsmaterial erhalten werden, indem ein intermediäres cis-Bromprolin gebildet wird (indem zum Beispiel ein Triflat oder Mesylat des Hydroxyls gebildet wird, und das Sulfonat durch ein Bromidion ersetzt wird), gefolgt von einem zweiten Ersatz durch Azid, wobei eine nettomäßige Beibehaltung der stereochemischen trans-Beziehung, wie in dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, bereitgestellt wird. In einer anderen Ausführungsform können, wie in dem vorstehenden Schema 3, Diastereomerengemische hergestellt werden, gefolgt von einer möglichen Trennung der Isomeren.
b. Durchmusterungstests
Es gibt eine Vielzahl von Tests, die zur Bestimmung der Fähigkeit einer Verbindung, die Ptc-Funktion agonistisch zu beeinflussen oder die Smoothened- oder Hedgehog-Funktion antagonistisch zu beeinflussen, verfügbar sind, von denen viele in Formaten mit einem hohen Durchsatz erstellt werden können. In vielen Arzneistoffdurchmusterungsprogrammen, die Bibliotheken von Verbindungen und natürlichen Extrakten untersuchen, sind Tests mit einem hohen Durchsatz wünschenswert, um die Zahl von Verbindungen, die in einer bestimmten Zeitdauer untersucht werden, zu maximieren. So können Bibliotheken synthetischer und natürlicher Produkte hinsichtlich anderer Verbindungen, die Hedgehog-Antagonisten sind, geprüft werden.
Zusätzlich zu zellfreien Tests können Testverbindungen auch in Tests auf Zellbasis untersucht werden. In einer Ausführungsform können Zellen, die den Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, den Phänotyp Hedgehog-Funktionszunahme oder den Phänotyp Smoothened-Funktionszunahme aufweisen, mit einem Testmittel von Interesse in Kontakt gebracht werden, wobei der Test z.B. die Hemmung der Proliferation der Zelle in Gegenwart des Testmittels bewertet.
Mehrere Genprodukte, einschließlich Patched, Transkriptionsfaktoren der Familie Cubitus interruptus (Ci), der Serin/Threonin-Kinase Fused (Fu) und der Genprodukte von Costal-2, Smoothened und Suppressor von Fused, wurden mit Patched-vermittelter Signaltransduktion in Verbindung gebracht.
Die Induktion von Zellen durch Hedgehog-Proteine bringt eine Kaskade in Gang, umfassend die Aktivierung und Hemmung von Effektoren stromabwärts, deren letzte Konsequenz in einigen Fällen eine nachweisbare Änderung der Transkription oder Translation eines Gens ist. Mögliche Transkriptionsziele des Hedgehog-vermittelten Signals sind das Patched-Gen (Hidalgo und Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996) und die Wirbeltierhomologen des Gens Cubitus interruptus von Drosophila und die Gli-Gene (Hui et al. (1994) Dev Biol 162: 402-413). Von der Patched-Genexpression wurde gezeigt, dass sie in Zellen der Extremitätenknospe und der Neuralplatte, die auf Shh antworten, induziert wird (Marigo et al. (1996) PNAS 93: 9346-51; Marigo et al. (1996) Development 122: 1225-1233). Die Gli-Gene kodieren vermeintliche Transkriptionsfaktoren, die DNA-bindende Zinkfinger-Domänen aufweisen (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4: 1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 634-642). Von der Transkription des Gli-Gens wurde berichtet, dass sie als Antwort auf Hedgehog in Extremitätenknospen hochreguliert wird, während die Transkription des Gli-3-Gens als Antwort auf eine Hedgehog-Induktion herunterreguliert wird (Marigo et al. (1996) Development 122: 1225-1233). Durch die Auswahl von transkriptionsregulierenden Sequenzen aus solchen Zielgenen, z.B. aus Patched- oder Gli-Genen, die für die Hoch- oder Herunterregulierung dieser Gene als Antwort auf die Signalgebung von Hedgehog verantwortlich sind, und die wirksame Verknüpfung solcher Promotoren mit einem Reportergen kann ein Test auf Transkriptionsbasis abgeleitet werden, der auf die Fähigkeit einer speziellen Testverbindung, Hedgehog-vermittelte Signalwege zu modifizieren, empfindlich ist. Die Expression des Reportergens stellt somit ein wertvolles Durchmusterungshilfsmittel für die Entwicklung von Verbindungen, die als Antagonisten von Hedgehog wirken, bereit.
Die Tests dieser Erfindung auf Reportergenbasis messen die Endstufe der vorstehend beschriebenen Kaskade von Ereignissen, z.B. die Transkriptionsmodulation. Folglich wird bei der Durchführung einer Ausführungsform des Tests ein Reportergenkonstrukt in die Reagenzzelle eingeführt, um ein von Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme, Smoothened-Funktionszunahme oder Stimulierung durch Shh selbst abhängiges Nachweissignal zu erzeugen. Die Menge an Transkription von dem Reportergen kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das Fachleuten als geeignet bekannt ist, gemessen werden. Die mRNA-Expression von dem Reportergen kann zum Beispiel unter Verwendung von RNAse-Schutz oder PCR auf RNA-Basis nachgewiesen werden oder das Proteinprodukt des Reportergens kann durch eine charakteristische Färbung oder eine intrinsische biologische Aktivität identifiziert werden. Die Menge an Expression von dem Reportergen wird dann mit der Menge an Expression entweder in derselben Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder sie kann mit der Menge an Transkription in einer im Wesentlichen identischen Zelle, der das Zielrezeptorprotein fehlt, verglichen werden. Eine beliebige statistisch oder anderweitig signifikante Abnahme der Transkriptionsmenge zeigt, dass die Testverbindung auf irgendeine Art und Weise das normale Ptc-Signal agonistisch beeinflusste (oder die Funktionszunahme des Hedgehog- oder Smoothened-Signals antagonistisch beeinflusste), z.B. die Testverbindung ist ein möglicher Hedgehog-Antagonist.
Veranschaulichung
Die nun allgemein beschriebene Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die nur für die Zwecke der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen, leichter verständlich.
Synthese beispielhafter Inhibitoren
N-1-[(3R,5S)-1-(1,3-Benzodiogol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrrolyl]-N-1-(4-methozybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid. "trans-Aminoprolin"
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-bromtetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarbogylat (4)
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-hydroxytetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (3) (2,0 g, 8,15 mmol) wurde in einen ofengetrockneten Kolben eingewogen und unter Verwendung von Toluol azeotrop getrocknet. Dichlormethan (16 ml) und Tetrabromkohlenstoff (10,81 g, 8,15 mmol) wurden zugegeben, und die Lösung wurde gerührt, auf 0 °C abgekühlt und mit Triphenylphosphin (8,5 g, 32,41 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde 5 h bei 0°C gerührt, dann wurde Methanol (1,8 ml) zugegeben, und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt. Das Gemisch wurde mit Diethylether (80 ml) verdünnt, und die so erhaltene Suspension wurde filtriert und mit Diethylether (30 ml) gewaschen. Die Lösungsmittel wurden vereinigt und unter reduziertem Druck abgedampft, und das Rohprodukt wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Eluieren mit Hexan/Ethylacetat (19:1 bis 4:1, Vol./Vol.) gereinigt, wobei sich das Titelbromid (4) (1,0 g, 40 %) als farbloses Öl ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,41 und 1,46 (2 × s, 9H, Rotamere), 2,38-2,46 (m, 1H), 2,75-2,87 (m, 1H), 3,67-3,74 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,96-4,07 (m, 1H) und 4,24-4,42 (m, 2H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 210 (100).
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarbozylat (5)
Eine Dispersion von Natriumazid (0,90 g, 13,84 mmol) und 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-bromtetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (4) (1,0 g, 3,24 mmol) in wasserfreiem Dimethylformamid (32 ml) wurde 64 h unter Stickstoffatmosphäre erwärmt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, in eiskaltes Wasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Eluieren mit Hexan-Ethylacetat (3:1 bis 1:1, Vol./Vol.) gereinigt, wobei sich das Titelazid (5) (0,88 g, 93 %) als blassgelbes Öl ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,41 und 1,46 (2 × s, 9H, Rotamere), 2,13-2,20 (m, 1H), 2,27-2,38 (m, 1H), 3,45-3,49 und 3,57-3,60 (2 × m, 1H, Rotamere), 3,68-3,73 (m, 1H), 3,74-3,75 (2 × s, 3H, Rotamere), 4,15-4,23 (m, 1H) und 4,30-4,35 und 4,39-4,43 (2 × m, 1H, Rotamere); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 171 [(M+H)⁺ – C₅H₉O₂] (100).
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarbozylatchlorid (6)
Palladium auf Kohle (10 %, 0,5 g) wurde zu einer Lösung von 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (5) (0,81 g, 3,0 mmol) in 2 Vol.-%iger Salzsäure in Ethanol (8 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde evakuiert und mit Stickstoff (dreimal) gespült, dann unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein Celite-Kissen filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Rohprodukt ergab. Dieses wurde mit Diethylether bei 0°C verrieben, und die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit eiskaltem Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Titelsalz (6) wurde in quantitativer Ausbeute erhalten:
δ_H (360 MHz; CD₃OD) 1,46 und 1,51 (2 × s, 9H, Rotamere), 2,35-2,47 (m, 2H), 3,50-3,55 (m, 1H), 3,74-3,86 [m, 4H {bei 3,79 und 3,80 (2 × s, 3H, Rotamere) enthalten}], 3,89-3,95 (m, 1H) und 4,46-4,50 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 210 (100).
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-[3-methozybenzyl)amino]tetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarbozylat (7)
Eine Lösung von 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylatchlorid (6) (0,83 g, 2,96 mmol) und 3-Methoxybenzaldehyd (0,38 g, 2,8 mmol) in Trimethylorthoformiat (8 ml) wurde 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde langsam mit Natriumcyanoborhydrid (0,28 g, 4,46 mmol) behandelt, und der Verlauf der Reaktion wurde durch DC-Analyse überwacht. Sobald die Reaktion beendet war (~1,5 h), wurde sie mit gesättigter, wässriger Kaliumhydrogensulfatlösung gestoppt, und es wurde mit Dichlormethan extrahiert. Der pH-Wert der wässrigen Phase wurde auf 9 eingestellt, und es wurde mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Titelamin (7) in quantitativer Ausbeute ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,40 und 1,45 (2 × s, 9H, Rotamere), 2,07-2,19 (m, 2H), 3,18-3,23 und 3,32-3,36 (2 × m, 1H), 3,43-3,53 (m, 1H), 3,70-3,74 [m, 4H {bei 3,72 und 3,73 (2 × s, 3H, Rotamere) enthalten}], 3,81 (s, 3H), 4,32-4,36 und 4,40-4,44 (2 × m, 1H), 6,79-6,81 (m, 1H), 6,87-6,89 (m, 2H) und 7,24 (t, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 265 [(M+H)⁺ – C₅H₉O₂] (100).
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methogybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarbogylat (8)
Eine Lösung von 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-[3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (7) (0,3 g, 0,82 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,106 g, 0,82 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (0,8 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde tropfenweise mit tert-Butylacetylchlorid (0,133 g, 0,99 mmol) behandelt und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie (Hexan-Ethylacetat, 2:1, Vol./Vol.) gereinigt, wobei sich das Titelamid (8) (1,0 g, 40 %) als farbloses Öl ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,01 und 1,05 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,37 und 1,41 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,87-2,56 [m, 4H (bei 2,16 (s, 2H) enthalten)], 3,17-3,35 (m, 1H), 3,62-3,85 [m, 7H {bei 3,70 und 3,79 (2 × s, 6H) enthalten}], 4,21-4,24 und 4,28-4,35 (2 × m, 1H, Rotamere), 4,40-4,58 (m, 2H), 4,73-4,95 und 5,03-5,21 (2 × m, 1H, Rotamere), 6,54-6,88 (m, 3H) und 7,19-7,31 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 363 (100).
(2S,4R)-4-[(3,3-Dimethylbutanoyl)-(3-methoxyanilino)]-2-(methoxycarbonyl)tetrahydro-1H-2-pyrrolium-2,2,2-trifluoracetat (9a)
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]-tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (8) (0,01 g, 21,6 μmol) wurde bei Raumtemperatur zu einer 30 %igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan (0,5 ml) gegeben und 30 min gerührt. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wobei sich das Titelpyrroliumsalz (9a) in quantitativer Ausbeute ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,05 (s, 9H), 2,38-2,57 (m, 4H), 3,59-3,68 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,79 (s, 3H), 4,09-4,15 (m, 1H), 4,52-4,63 (m, 2H), 4,78-4,94 (m, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,70 (d, 1H), 6,86-6,88 (dd, 1H) und 7,31 (t, 1H).
Methyl-(2S,4R)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (10)
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4R)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (8) (0,15 g, 0,32 mmol) wurde bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 30 Vol.-%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan (3 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 30 min gerührt und unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und gesättigtem, wässrigem Kaliumcarbonat verteilt und 5 nun kräftig geschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich 140 mg rohes Methyl-(2S,4R)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-3-methoxyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (9b) ergab, das in der folgenden Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung von dem vorstehend hergestellten rohen Amin (9b) (140 mg), Piperonal (74 mg, 0,49 mmol) und Eisessig (2 Tropfen) in 1,2-Dichlorethan (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur 30 min gerührt. 95 %iges Natriumcyanoborhydrid (32 mg, 0,48 mmol) wurde in kleinen Portionen zugegeben, und es wurde 1 h weiter gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 ml) gestoppt, es wurde mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Eluieren mit Dichlormethan-Ethylacetat (90:10-75:25) gereinigt, wobei sich das Titelpyrrol (10) (115 mg, 71,4 %) als blassgelbes Öl ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,98-1,08 (m, 9H), 2,09-2,59 [m, 4H {bei 2,13 (s, 2H) enthalten}], 2,96-3,07 (m, 1H), 3,47-3,85 (m, 11H), 4,46-4,63 (m, 1H), 4,83-4,94 (m, 1H), 5,92-5,95 (m, 2H), 6,63-6,89 (m, 6H) und 7,15-7,34 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 497 [(M+H)⁺] (100).
(2S,4R)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarbonsäure (11)
Lithiumhydroxidmonohydrat (17 mg, 0,405 mmol) wurde zu einer Lösung von Methyl-(2S,4R)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (10) (100 mg, 0,20 mmol) in 66 Vol.-%igem Methanol in Wasser (1,0 ml) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan (1,0 ml) und Wasser (1,0 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit 1,0 M wässriger Citronensäure angesäuert, und die zwei Schichten wurden 10 min bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die vereinigten Dichlormethanextrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich die Titelsäure (11) (70 mg, 72 %) als grauweißer Feststoff ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,00 und 1,03 (2 × s, 9H, Rotamere), 2,17-2,39 (m, 3H), 2,62-2,71 (m, 1H), 3,28-3,34 (m, 1H), 3,47-3,56 (m, 1H), 3,76 (m, 3H), 3,96-4,13 (m, 1H), 4,21-4,26 (m, 2H), 4,36-4,58 (m, 3H), 5,93 (d, 2H), 6,62-6,90 (m, 6H) und 7,21-7,25 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 483 [(M+H)⁺] (100).
tert-Butyl-4-({(2S,4R)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-3-methoxyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolyl}carbonyl)-1-piperazincarboxylat (12)
Ein Gemisch aus (2S,4R)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarbonsäure (11) (60 mg, 0,12 mmol), O- Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (48 mg, 0,15 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (54 μl, 0,31 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) wurde bei Raumtemperatur 1,5 h gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat zurückextrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Eluieren mit 100 %igem Dichlormethan, Dichlormethan/Ethylacetat (4:1, Vol./Vol.) und 100 %igem Ethylacetat teilweise gereinigt, wobei sich das mit N,N-Dimethylformamid verunreinigte Rohprodukt ergab. Dichlormethan wurde zugegeben, und die so erhaltene Lösung wurde mit Wasser gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan zurückextrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Titelpiperazin (12) (33,1 mg, 41 %) ergab:
LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 651 [(M+H)⁺] (100).
N1-[(3R,5S)-1-(1,3-Benzodiozol-5-ylmethyl)-5-(piperannocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrroliumyl]-N1-(3-methoxybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid-2,2,2-trifluoracetat (13a)
Eine Lösung von tert-Butyl-4-({(2S,4R)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-3-methoxyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolyl}carbonyl)-1-piperazincarboxylat (12) (24 mg, 36,9 μmol) in Dichlormethan (0,8 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (0,1 ml, 1,3 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und der Verlauf der Reaktion wurde durch DC-Analyse überwacht. Sobald sie beendet war, wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Titeltrifluoracetatsalz (13a) in quantitativer Ausbeute ergab. Dieses Salz wurde in dem folgenden Experiment ohne weitere Reinigung verwendet:
LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 551 [(M+H)⁺] (100).
N1-((3R,5S)-1-(1,3-Benzodiozol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrrolyl]-N1-(4-methoxybenryl)-3,3-dimethylbutanamid (13b)
Ein zweiphasiges Gemisch aus Dichlormethan (0,8 ml) und Wasser (0,8 ml), das 26 mg rohes N1-[(3R,5S)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3- pyrroliumyl]-N1-(3-methoxybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid-2,2,2-trifluoracetat (13a) enthielt, wurde kräftig gerührt und tropfenweise mit 2,0 M wässriger Natriumhydroxidlösung behandelt, bis der pH-Wert der wässrigen Phase auf 12 eingestellt war. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 × 1 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Titelpiperazin (13b) (12,7 mg, 59 %) ergab:
LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 551 [(M+H)⁺] (100).
N1-[(3S,5S)-1-(1,3-Benzodiozol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrrolyl]-N1-(4-methogybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid. "cis-Aminoprolin"
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarbozylatchlorid (16)
Eine Suspension von Palladium auf Kohle (10 %, 0,25 g) und 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (15) (1,00 g, 3,7 mmol) in einer entgasten Lösung von 2 Vol.%iger Salzsäure in Ethanol (10 ml) wurde bei Raumtemperatur unter Wasserstoffatmosphäre (1 atm) kräftig gerührt. Nach Rühren über Nacht wurde das Gemisch durch ein Celite-Kissen filtriert und sorgfältig mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde bei 0°C mit tert-Butylmethylether verrieben. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit eiskaltem tert-Butylmethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich das Titelhydrochloridsalz (16) (0,74 g, 71 %) als weißer Feststoff ergab:
δ_H (360 MHz; D₂O) 1,21 und 1,26 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,85-2,03 (m, 1H), 2,52-2,65 (m, 1H), 3,29-3,48 (m, 1H), 3,58-3,83 g(m, 5H) und 4,14-4,34 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 189 (100).
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (17)
Eine Lösung von 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylatchlorid (16) (3,00 g, 10,70 mmol) und 3-Methoxybenzaldehyd (1,30 ml, 10,7 mmol) in Trimethylorthoformiat (8 ml) wurde 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Natriumtriacetoxyborhydrid (2,26 g, 10,70 mmol) wurde in kleinen Portionen während 30 min zu der Lösung gegeben, und der Verlauf der Reaktion wurde durch DC-Analyse überwacht. Sobald die Reaktion beendet war (etwa 30 min), wurde sie mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (15 ml) gestoppt, und es wurde mit Ethylacetat (15 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 15 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie auf Silicagel unter Verwendung von 100 %igem Dichlormethan und dann 100 %igem Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, wobei sich das Titelamin (17) (2,48 g, 64 %) als gelbes Öl ergab:
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (18)
Eine Lösung von 1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-[3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-1,2-pyrroldicarboxylat (17) (1,37 g, 3,76 mmol) und Triethylamin (0,63 ml, 4,52 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (14 ml) wurde unter Rühren tropfenweise mit tert-Butylacetylchlorid (0,53 ml, 3,82 mmol) behandelt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Dichlormethan (50 ml) verdünnt und mit 1,0 M wässriger Citronensäurelösung (2 × 50 ml) gewaschen. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrigen Schichten wurden mit Dichlormethan (25 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie (Hexan/Ethylacetat, 2:1, Vol./Vol.) gereinigt, wobei sich das Titelamid (18) (1,5 g, 86 %) als blassgelbes Öl ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,00 und 1,06 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,38 und 1,42 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,81-1,93 (m, 1H), 2,15 (s, 2H) 2,30-2,51 (m, 1H), 3,18-3,25 (m, 1H), 3,62-3,85 [m, 4H {bei 3,69 (s, 3H) enthalten}], 3,78 (m, 3H), 4,15-4,25 (m, 1H), 4,45-4,61 (m, 2H), 5,10-5,23 (m, 1H), 6,64-6,82 (m, 3H) und 7,13-7,31 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 363 (100).
(2S,4S)-4-[(3,3-Dimethylbutanoyl)-(3-methoxyanilino)]-2-(methoxycarbonyl)tetrahydro-1H-2-pyrrolium-2,2,2-trifluoracetat (19a)
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (18) (524 mg, 1,13 mmol) wurde bei Raumtemperatur zu einer 21 Vol.-%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan (6,6 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 50 min gerührt und dann unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft, wobei sich 0,98 g eines Gemisches aus dem Titelpyrroliumsalz (19a) und Trifluoressigsäure ergaben:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 1,08 (s, 9H), 2,34-2,42 (m, 1H), 2,47 (s, 3H), 2,63-2,72 (m, 1H), 3,61-3,71 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 4,07-4,14 (m, 1H), 4,43-4,54 (m, 1H), 4,57-4,67 (m, 2H), 6,68-6,74 (m, 2H), 6,90-6,93 (dd, 1H) und 7,34 (t, 1H).
Methyl-(2S,4S)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (20)
1-(tert-Butyl)-2-methyl-(2S,4S)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (18) (138 mg, 0,38 mmol) wurde bei Raumtemperatur zu einer 30 Vol.-%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan (3 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 30 min gerührt und unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und gesättigtem, wässrigem Kaliumcarbonat verteilt und 5 min kräftig geschüttelt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich 140 mg rohes Methyl-(2S,4R)-4-[(3,3- dimethylbutanoyl)-3-methoxyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (19b) ergaben, das in der folgenden Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung von Methyl-(2S,4S)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (19b) (138 mg, 0,38 mmol), Piperonal (58 mg, 0,39 mmol) und Eisessig (225 μl, 3,93 mmol) in Tetrahydrofuran (2,8 ml) wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt. 95 %iges Natriumcyanoborhydrid (125 mg, 1,88 mmol) wurde in kleinen Portionen zugegeben, und es wurde 45 min bei derselben Temperatur weiter gerührt. Nach der Verdünnung mit Ethylacetat (5 ml) wurde das Reaktionsgemisch mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 5 ml) und Salzlösung (5 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Eluieren mit 100 %igem Dichlormethan und Dichlormethan-Ethylacetat (4:1, Vol./Vol.) gereinigt, wobei sich das Titelpyrrol (20) ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,89 und 0,99 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,65-1,79 (m, 1H,), 1,87-2,11 [m, 3H {bei 1,94 (s, 2H) enthalten}], 2,21-2,66 (m, 2H), 3,04-3,15 (m, 2H), 3,56 (s, 3H), 3,67-3,74 [m, 4H {bei 3,67 (s, 3H) enthalten} ], 4,43-4,64 (m, 2H), 4,74-4,92 (m, 1H), 5,10-5,14 (m, 1H), 5,74-5,88 (m, 2H), 6,49-6,78 (m, 6H) und 7,02-7,10 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 497 [(M+H)⁺] (100).
(2S,4S)-1-(1,3-Benzodiogol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methogybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarbonsäure (21)
Lithiumhydroxidmonohydrat (17 mg, 0,405 mmol) wurde zu einer Lösung von Methyl-(2S,4S)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarboxylat (20) (100 mg, 0,20 mmol) in 66 Vol.-%igem Methanol in Wasser (1,0 ml) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan (1,0 ml) und Wasser (1,0 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit 1,0 M wässriger Citronensäurelösung angesäuert, und die zwei Schichten wurden 10 min bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan zurückextrahiert. Die vereinigten Dichlormethanextrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Dichlormethan/Ethylacetat (1:1, Vol./Vol.) und dann Dichlormethan/Methanol (9:1, Vol.Nol.) als Elutionsmittel gereinigt, wobei sich die Titelsäure (21) (88 mg, 91 %) als grauweißer Feststoff ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,95 (s, 9H), 2,18 [m, 3H {bei 2,18 (s, 2H) enthalten}], 2,62-2,87 (m, 1H), 3,17-3,28 (m, 1H), 3,42-3,47 (m, 1H), 3,73 (m, 3H), 3,82-3,93 (m, 1H), 3,94-4,60 (m, 1H), 4,41-4,65 (m, 4H), 5,90-5,94 (m, 2H), 6,63-6,93 (m, 6H) und 7,21-7,25 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 483 [(M+H)⁺] (100).
tert-Butyl-4-({(2S,4S)-1-(1,3-benzodiogol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-3-methogyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolyl}carbonyl)-1-piperazincarboxylat (22)
Ein Gemisch aus (2S,4S)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-(3-methoxybenzyl)amino]tetrahydro-1H-2-pyrrolcarbonsäure (21) (96,5 mg, 0,20 mmol), O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (77 mg, 0,24 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (87 μl, 0,50 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) wurde 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat zurückextrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat (1:1, Vol./Vol.) und dann 100 %igem Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, wobei sich das Titelpiperazin (22) (89 mg, 68 %) ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,95 und 0,97 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,46 (s, 9H), 1,74 (s, 2H), 2,01-2,24 und 2,38-2,44 (2 × m, 2H, Rotamere), 2,55-2,59 und 2,70-2,81 (2 × m, 2H, Rotamere), 3,09-3,58 (m, 9H), 3,74-3,85 [m, 4H {bei 3,76 und 3,79 (2 × s, 3H, Rotamere) enthalten}], 3,94-4,05 und 4,06-4,19 (2 × m, 1H, Rotamere), 4,24-4,41 und 4,61-4,69 (2 × m, 2H, Rotamere), 4,86-4,96 und 5,11-5,21 (2 × m, 1H, Rotamere), 5,89-6,01 (m, 2H, Rotamere), 6,58-6,98 (m, 6H) und 7,13-7,18 und 7,25-7,27 (2 × m, 1H, Rotamere); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 651 [(M+H)⁺] (100).
N1-[(3S,5S)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrroliumyl]-N1-(3-methoxybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid-2,2,2-trifluoracetat (23a)
Eine Lösung von tert-Butyl-4-({(2S,4S)-1-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-[(3,3-dimethylbutanoyl)-3-methoxyanilino]tetrahydro-1H-2-pyrrolyl}carbonyl)-1-piperazincarboxylat (22) (21,7 mg, 33,3 μmol) in Dichlormethan (0,5 ml) wurde mit einer 95 Vol.-%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan (0,1 ml, 1,2 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und der Verlauf der Reaktion wurde durch DC-Analyse überwacht. Sobald sie beendet war (1 h), wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft, wobei sich 22,8 mg eines Gemisches aus dem Titeltrifluoracetatsalz (23a), Ethylacetat und Trifluoressigsäure ergaben. Dieses Salz wurde in dem folgenden Experiment ohne weitere Reinigung verwendet:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,98 (s, 9H), 2,08-2,18 (m, 1H), 2,32 (d, 1H), 2,43 (d, 1H), 2,73-2,82 (m, 1H), 3,30-3,73 (m, 8H), 3,77 (s, 3H), 3,90-3,96 (m, 1H), 4,06-4,19 (m, 1H), 4,36-4,46 (m, 2H), 4,57 (d, 1H), 4,65-4,73 (m, 1H), 5,57-6,01 (m, 2H), 6,61-6,66 (m, 2H), 6,76-6,91 (m, 4H) und 7,29 (t, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 551 [(M+H)⁺] (100).
N-1-[(3S,5S)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrrolyl]-N1-(4-methoxybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid (23b)
Ein zweiphasiges Gemisch aus Dichlormethan (0,5 ml) und Wasser (0,5 ml), das 22,8 mg rohes N-1-[(3S,SS)-1-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-(piperazinocarbonyl)tetrahydro-1H-3-pyrroliumyl]-N-1-(3-methoxybenzyl)-3,3-dimethylbutanamid-2,2,2-trifluoracetat (23a) enthielt, wurde mit 2,0 M wässriger Natriumhydroxidlösung behandelt, bis der pH-Wert der wässrigen Schicht auf 12 eingestellt war. Das Gemisch wurde 5 min bei Raumtemperatur kräftig gerührt, und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 × 0,5 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Titelpiperazin (23b) (14,5 mg, 79 %) ergab:
δ_H (360 MHz; CDCl₃) 0,97 und 1,09 (2 × s, 9H, Rotamere), 1,66-1,79 [m, 3H {bei 1,79 (s, 2H) enthalten}], 2,03 (d, 1H), 2,13 (d, 1H), 2,32-2,47 (m, 1H), 2,54-2,88 (m, 5H), 3,05-3,12 (m, 1H), 3,29-3,67 (m, 5H), 3,76 (s, 3H), 3,86 (d, 1H), 4,66 (d, 1H), 4,97 (d, 1H), 5,08-5,22 (m, 1H), 5,89-5,92 (m, 2H), 6,59-6,6,81 (m, 6H) und 7,09-7,18 (m, 1H); LRMS (aus LC-MS) (ES+) m/z 551 [(M+H)⁺] (100).
Variationen des Schutzgruppenschemas können die Effizienz und Geschwindigkeit, mit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, erhöhen. Die nachstehenden Schemata, die, bezogen auf die vorstehende Offenbarung zusammen mit bekannten Verfahren in dem Fachgebiet, von einem Fachmann leicht durchgeführt werden können, stellen schnelle, effiziente Wege zu Verbindungen, die die Hedgehog-Aktivität hemmen können, bereit. Es ist selbstverständlich, dass die besonderen Einheiten, Gruppen und Reaktionen (z.B. die elektrophile oder reduktive Alkylierung des Amins) variiert werden können, um viele verschiedene Verbindungen, die zum Beispiel eine Struktur gemäß einer beliebigen der Formeln I bis VI aufweisen, herzustellen. Siehe auch J. W. Mickelson, K. L. Belonga und E. J. Jacobsen, J. Org. Chem., 1995, 60, 4177-4183.
Schema 1
Schema 2
Schema 3
Schema 4
Festphasenweg
Der Syntheseweg, der zur Durchführung der Herstellung auf diesem Templat verwendet wurde, ist in Schema 5 beschrieben.
Schema 5
Waschvorschriften

Verfahren 1: Wasser (3 ×), Aceton (2 ×), N,N-Dimethylformamid (3 ×), Wasser (2 ×), Aceton (1 ×), N,N-Dimethylformamid (3 ×), Wasser (2 ×), Aceton (3 ×), Methanol (3 ×), Aceton (3 ×) und Methanol (3 ×);
Verfahren 2: Dichlormethan, Hexan, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Hexan, Dichlormethan und Hexan;
Verfahren 3: Wasser, N,N-Dimethylformamid, Wasser, 1,0 M wässrige Natriumhydroxidlösung, Wasser, N,N-Dimethylformamid, Wasser, 1,0 M wässrige Natriumhydroxidlösung, Wasser, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Methanol, Dichlormethan und Methanol;
Verfahren 4: N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Methanol, Dichlormethan, Methanol (2 ×) und Ether (2 ×);
Verfahren 5: N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, N,N-Dimethylformamid, Dichlormethan, Methanol, Dichlormethan und Methanol (2 ×).

Das Quellen der Harze in Lösungsmitteln basierte auf einem Standard von 10 ml Lösungsmittel pro Gramm Harz.
Schritt A: Die Herstellung von (Nitrophen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol-(Wang-PNP-carbonatpolystyrol)
Hydroxybenz-4-yloxymethylpolystyrol (Wang-Harz)
Natriummethoxid (233 g, 4,31 mol) wurde unter Rühren und Stickstoff langsam zu einem Gemisch aus Chlormethylpolystyrol (2,4 kg, 3,6 mol funktionalisierte Beladung) und 4-Hydroxybenzylalkohol (581 g, 4,68 mol) in N,N-Dimethylacetamid (10 l) gegeben. Nach der Verdünnung mit N,N-Dimethylacetamid (13 l) wurde das Gemisch 5 h auf 50°C erwärmt und dann über eine Kanüle durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert. Das Rohprodukt wurde unter Verwendung der in Verfahren 1 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und dann unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich 2630 g des Titelharzes ergaben.
(Nitrophen-4'-ylogycarbogy)benz-4-ylozymethylpolystyrol-(Wang-PNP-carbonatpolystyrol)
4-Methylmorpholin (660 ml, 6,0 mol) wurde unter Rühren und Stickstoff bei 0°C während 2 h tropfenweise zu einem Gemisch aus Hydroxybenz-4-yloxymethylpolystyrol (2000 g, 2,5 mol funktionalisierte Beladung) und 4-Nitrophenolchlorformiat (1209 g, 6,0 mol) in Dichlormethan (22 1) gegeben. Das Gemisch wurde allmählich auf Raumtemperatur erwärmt, über Nacht gerührt und über eine Kanüle durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert. Das rohe Harz wurde unter Verwendung der in Verfahren 2 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und dann unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich 2728 g eines Gemisches aus dem Titelharz und 4-Methylmorpholinhydrochlorid ergaben.
Schritt B: Die Herstellung von Wang-Harz gebundenen Diaminen
• Allgemeines Verfahren (für Piperazin, Homopiperazin und trans-1,4-Diaminocyclohexan):
Man ließ rohes (Nitrophen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol (1002,5 g, ~0,9 mol funktionalisierte Beladung) während 15 min in einem Gemisch aus wasserfreiem Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid (1:1, Vol./Vol., 9 l) unter Stickstoff quellen. N,N-Diisopropylamin (626 ml, 5 Moläquivalente) und das geeignete Diamin (5 Moläquivalente) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der in Verfahren 3 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das Harzgebundene Diamin ergab.
• An Wang-Harz gebundenes Ethylendiamin
Man ließ rohes (Nitrophen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol (1002,5 g, ~0,9 mol funktionalisierte Beladung) während 15 min in Dichlormethan (7 l) unter Stickstoff quellen und behandelte es mit Ethylendiamin (181 ml, 2,7 mol). Die so erhaltene dicke, gelbe Suspension wurde mit Dichlormethan (2 l) verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der in Verfahren 3 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das Titelharz-gebundene Diamin ergab.
• An Wang-Harz gebundenes m-Xylylendiamin
Man ließ rohes (Nitrophen-4'-yloxycarboxy)benz-4-yloxymethylpolystyrol (1002,5 g,~0,9 mol funktionalisierte Beladung) in Tetrahydrofuran (7 l) während 15 min unter Stickstoff quellen und behandelte es mit einer Lösung von m-Xylylendiamin (828 ml, 6,27 mol) in Tetrahydrofuran (1 l). Die so erhaltene dicke, gelbe Suspension wurde mit Dichlormethan (2 l) verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wurde durch ein P-ETFE-Sieb (70 μm) filtriert, unter Verwendung der in Verfahren 3 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei sich das Titelharz-gebundene Diamin ergab.
Schritt C: Beladen des Wang-Diamins mit einem Grundbaustein
Man ließ das geeignete Harz in N,N-Dimethylformamid während 15 min quellen, schüttelte es dann schwach und behandelte es mit 1-[9H-9-Fluorenylmethoxycarbonyl]-4-oxo-2(S)-pyrrolidincarbonsäure (2 Äquivalente). Nach 30 min wurden 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (2 Äquivalente) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (2 Äquivalente) zugegeben, und die Harzsuspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur schwach geschüttelt. Nach der Filtration wurde das Harz unter Verwendung der in Verfahren 4 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
Schritt D: Reduktive Aminierung am C-4
Man ließ das geeignete Harz in einem 50 Vol.%igen Gemisch aus wasserfreiem Tetrahydrofuran und Methanol während 15 min quellen, schüttelte es schwach und behandelte es mit Eisessig (10 Äquivalente). Das geeignete Amin (5 Äquivalente) und Natriumcyanoborhydrid (5 Äquivalente) wurden zugegeben, und die Harzsuspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur schwach geschüttelt. Nach der Filtration wurde das Harz unter Verwendung der in Verfahren 4 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
Schritt E: Reduktive Alkylierung oder Capping
Reduktive Alkylierung
Man ließ das geeignete Harz in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid quellen, schüttelte es dann schwach und behandelte es mit Eisessig (10 Äquivalente). Der geeignete Aldehyd (5 Äquivalente) und Natriumtriacetoxyborhydrid (5 Äquivalente) wurden zugegeben, und die Harzsuspension wurde 1 h bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Der Druck, der sich während dieser Zeitdauer in dem Reaktionsgefäß entwickelte, wurde dann aufgehoben, und die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur weiter schwach geschüttelt. Das Harz wurde dann abfiltriert, unter Verwendung der in Verfahren 4 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
• Capping mit Säurechloriden
Das geeignete Säurechlorid (5 Äquivalente) und N,N-Diisopropylethylamin (10 Äquivalente) wurden unter schwachem Schütteln zu einer Suspension des geeigneten Harzes in einem 50 Vol.-%igen Gemisch aus wasserfreiem Tetrahydrofuran und Chloroform gegeben. Nach schwachem Schütteln bei Raumtemperatur über Nacht wurde das Harz abfiltriert, unter Verwendung der in Verfahren 4 aufgeführten Reihenfolge ausgiebig gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
Schritt F: Abspaltung der N-Fmoc-Schutzgruppe
Harzanaloga wurden in einer 20 Vol.-%igen Lösung von Piperidin in N,N-Dimethylformamid suspendiert und 30 min bei Raumtemperatur schwach geschüttelt. Die Harzsuspension wurde anschließend filtriert und mit N,N-Dimethylformamid gewaschen. Diese Behandlung des Harzes mit Piperidin in N,N-Dimethylformamid wurde noch einmal wiederholt, um eine vollständige Abspaltung der N-Fmoc-Schutzgruppe sicherzustellen. Nach 30-minütigem Stehenlassen wurde das Harz abfiltriert, unter Verwendung der in Verfahren 4 aufgeführten Reihenfolge gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet.
Schritt G: Reduktive Alkylierung oder Capping am N1
• Reduktive Alkylierung
Man ließ das geeignete Harz (~60 mg pro Vertiefung in einem 2 ml Filterblock) in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (1 ml) quellen, schüttelte es dann schwach und behandelte es mit Eisessig (~50 μl, 10 Äquivalente). Der geeignete Aldehyd (5 Äquivalente) und Natriumtriacetoxyborhydrid (~85 mg, 5 Äquivalente) wurden zugegeben, und die Filterblöcke wurden dann bei Raumtemperatur über Nacht schwach geschüttelt. Jedes Harz wurde anschließend filtriert und unter Verwendung der in Verfahren 5 aufgeführten Reihenfolge gewaschen.
• Capping mit Säurechloriden
Man ließ das geeignete Harz (~60 mg pro Vertiefung in einem 2 ml Filterblock) in einem 50 Vol.-%igen Gemisch aus wasserfreiem Tetrahydrofuran und Chloroform (1 ml) quellen, schüttelte es dann schwach und behandelte es mit dem geeigneten Säurechlorid (5 Äquivalente) und N,N-Diisopropylethylamin (150 μl, 10 Äquivalente). Nach schwachem Schütteln der Filterblöcke über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Harze abfiltriert und unter Verwendung der in Verfahren 5 aufgeführten Reihenfolge gewaschen.
Schritt H: Abspaltung des Endprodukts vom Wang-Harz unter Verwendung von TFA
Man ließ das geeignete Harz in DCM quellen, und das Endprodukt wurde durch die Zugabe von 95 Vol.-%iger TFA in Dichlormethan abgespalten. Vier getrennte aliquote Teile von TFA (2 × 300 μl, 75 μl und 500 μl) wurden zugegeben, und die aus diesen erhaltenen Filtrate wurden in Platten, die 96 Vertiefungen enthielten, aufgenommen. Die aus der Zugabe der aliquoten Teile 1, 2 und 4 erhaltenen Filtrate wurden unter Verwendung derselben Platte mit 96 Vertiefungen aufgenommen. Das nach der Zugabe des aliquoten Teils 3 (75 μl) erhaltene Filtrat wurde unter Verwendung einer Analysenplatte mit 96 Vertiefungen getrennt aufgenommen. Alle Fraktionen wurden anschließend unter Verwendung eines Genevac-Geräts unter reduziertem Druck eingedampft, wobei sich das Endprodukt ergab.
Biologische Tests
Entdeckung der Leitverbindung/Durchmusterungstest mit einem hohen Durchsatz
Die zu untersuchenden Verbindungen werden in DMSO bis zu einer Konzentration von 10 mM gelöst und bei –20°C gelagert. Zur Aktivierung des Hedgehog-Wegs in den Testzellen wird eine octylierte (lipidmodifizierte) Form des N-terminalen Fragments des Sonic-Hedgehog-Proteins (OCT-SHH) verwendet. Dieses N-terminale Shh-Fragment wird bakteriell hergestellt.
Die Verbindungen können in dem nachstehenden "Gli-Luc"-Test unter Verwendung der Zelllinie 10T(s12) untersucht werden, wobei die Zellen ein auf Hedgehog antwortendes Reporterkonstrukt, das Luciferase als das Reportergen verwendet, enthalten. Auf diese Art und Weise kann die signalgebende Aktivität des Hedgehog-Wegs über die Gli-Luc-Antwort gemessen werden.
10t1/2(s12)-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte (MTP) mit 96 Vertiefungen mit 20000 Zellen/Vertiefung in Vollmedium [DMEM mit 10 % FBS] plattiert. Dann werden die Platten zur Inkubation über Nacht (O/N) bei 37°C und 5 % CO₂ in den Inkubator gestellt. Nach 24 h wird das Medium durch Luciferase-Testmedium (DMEM mit 0,5 % FBS) ersetzt. Die Verbindungen werden aufgetaut und in Testmedium 3:1000 (etwa 300-fach) verdünnt, wobei sich eine Anfangskonzentration von etwa 30 μM ergibt.
Anschließend werden 150 μl jeder 30 μM Probe in die ersten Vertiefungen (in dreifacher Ausfertigung) gegeben. Die MTP-Proben werden dann mit 3-fachen Verdünnungen in insgesamt sieben Vertiefungen verdünnt, wodurch sich schließlich eine Anzahl von sieben Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung für jede Verbindung ergibt. Als nächstes wird der Proteinligand OCT-SHH in Luciferase-Testmedium verdünnt und mit einer Endkonzentration von 0,3 μg/ml in jede Vertiefung gegeben. Die Platten werden dann zur weiteren Inkubation O/N bei 37°C und 5 % CO₂ in den Inkubator zurückgestellt. Nach etwa 24 h werden die Platten aus dem Inkubator entfernt, und das Medium wird abgesaugt/verworfen. Die Vertiefungen werden einmal mit Testpuffer [PBS + 1 mM Mg²⁺ und 1 mM Ca²⁺] gewaschen. Dann werden 50 μl Testpuffer in jede Vertiefung gegeben. Das Luciferase-Testreagenz wird, wie durch den Anbieter (LucLite-Kit von Packard) beschrieben, hergestellt, und 50 μl werden in jede Vertiefung gegeben. Die Platten werden bei Raumtemperatur (RT) etwa 30 Minuten inkubiert und danach werden die Signale auf einem Topcount (Packard) wieder bei RT abgelesen.
Die in diesem Test identifizierten Verbindungen sind in 32 dargestellt. Die Untersuchung der einzelnen Diastereomere der dargestellten Verbindungen in dem vorstehenden Test zeigte, dass die cis-Isomere offensichtlich eine größere Wirksamkeit, manchmal um mehr als das 100-fache, als die ihnen entsprechenden trans-Isomere zeigen. Ferner wurde von Ammoniumsalzderivaten, wie TFA-Salzen, der vorliegenden Verbindungen gezeigt, dass sie in dem vorstehenden Test eine ähnliche oder größere Wirksamkeit zeigen.
Die Wirksamkeiten von besonderen Verbindungen werden nachstehend in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1
Ptc-null-Test
Verfahren
Ptc-null-Zellen wurden 3 Tage in Gegenwart von einem Träger; Jervin, einem bekannten Antagonisten des Patched-Wegs (i), der hier als positive Kontrolle verwendet wurde; oder 1 μM Verbindung D gezüchtet. Die gesamte Ribonukleinsäure (RNA) wurde aus den Zellen isoliert und für die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) verwendet. Spezifische Primer für den Nachweis der Gli-1-mRNA aus Mäusen wurden in der PCR verwendet, und das Actin-Gen wurde verwendet, um zu zeigen, dass in dem Experiment äquivalente Mengen an mRNA-Proben verglichen wurden. Die Gli-1- und Actin-mRNA-Proben wurden dann auf ein 1,5 %iges Agarosegel geladen und wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen. Dieselben Proben wurden durch das Verfahren der quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion analysiert, um die Konzentrationen an Gli-1-mRNA quantitativ zu bestimmen.
Ergebnisse
33A zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments. Sie zeigt die Gli-1-mRNA-Expression in Zellen, die mit einer Trägerkontrolle (Bahn 1); 5 μM Jervin, der positiven Kontrollverbindung (Bahn 2); und 1 μM D (Bahn 3) behandelt wurden. Verglichen mit dem Träger, verringerten D und Jervin die Expression von Gli-1-mRNA in Ptc-null-Zellen wesentlich. Die Konzentrationen von Actin-mRNA waren unter allen Bedingungen äquivalent, was zeigt, dass in dem Experiment gleiche Mengen an RNA analysiert wurden. Dieses qualitative Ergebnis wurde durch die Analyse der quantitativen Echtzeit-PCR (33B) bestätigt, die zeigt, dass D und Jervin die Gli-1-mRNA-Konzentrationen herunterregulierten.
Zusammen bestätigen diese Experimente, dass eine 3-tägige Behandlung von Ptc-null-Zellen mit D den Patched-Weg herunterreguliert, was durch die Hemmung der Expression von Gli-1-mRNA-Transkripten gezeigt wurde.
Test mit Hautausstanzungen embryonaler Mäuse: Wirkung einer verlängerten Behandlung mit D
Verfahren
Ein neuer Zellkulturtest wurde zur Bestimmung der Wirkungen von D auf die Aktivierung des Patched-Wegs in der Haut etabliert. In diesem System führt eine Aktivierung des Patched-Wegs zu einer erhöhten Expression des Ptc-Gens.
Zur Überwachung der Aktivität des Patched-Wegs in embryonaler Haut züchteten wir Hautstücke aus transgenen Patched-Weg-Reportermäusen. Diese Mäuse wurden gentechnisch verändert, um ein fremdes Gen (lacZ)aufzunehmen. Das lacZ-Gen kodiert eine bakterielle β-Galactosidase. Das Gen wurde in den Ptc-Locus eingefügt, ermöglichte jedoch eine normale Ptc-Funktion. Die Ptc-Aktivierung als Antwort auf die durch Shh induzierte Aktivierung des Patched-Wegs kann dann durch die Bildung des lacZ-Genprodukts, β-Galactosidase, die durch die enzymatische Umwandlung des Substrats X-gal in ein blaugefärbtes Reaktionsprodukt nachweisbar ist, überwacht werden.
Haut von 17,5 Tagen alten Embryos wurde als kreisförmige Ausstanzungen mit 2 mm aus diesen transgenen Reportermäusen entnommen und 5 bis 7 Tage in Gegenwart von Shh-Protein gezüchtet (34). Das Shh-Protein sollte die Expression des Ptc-Gens hochregulieren und daher die Menge an X-gal-Färbung in diesen Kulturen erhöhen. Zur Untersuchung der Wirkung von D wurden Hautausstanzungen 6 Tage in Gegenwart von sowohl Shh-Protein als auch D gezüchtet (35).
Ergebnisse
Wie erwartet, führte die Zugabe von Shh-Protein zu gezüchteten Hautexplantaten zu einer Ptc-Aktivierung, was durch die blaue X-gal-Färbung dieser Kulturen angezeigt wurde (34A – X-gal).
Die Färbung von Schnittpräparaten der Hautausstanzungen mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) offenbarte intensiv gefärbte Zellen mit basophilen Kernen und einem hohen Verhältnis von Kern zu Zytoplasma (34A – H&E [10x] und H&E [40x]). Diese Strukturen ähneln BCCs insofern, als sie in der ganzen Hautschicht in Clustern angeordnet und durch Palisaden normal aussehender Hautzellen getrennt waren.
Die X-gal-Färbung zeigte, dass der Patched-Weg in Zellen innerhalb dieser BCC-ähnlichen Strukturen aktiv war (34A – Eosin + X-gal). In Übereinstimmung mit veröffentlichten Ergebnissen und ähnlich zu menschlichen BCC's exprimierten die BCC-ähnlichen Cluster in Hautausstanzungen von Mäusen Keratin-14, einen Marker undifferenzierter Keratinozyten (34B).
Die Hautausstanzungen wurden 6 Tage in Gegenwart von sowohl Shh-Protein als auch D gezüchtet, um die Wirkung von D zu untersuchen. 35 zeigt die dosisabhängige Wirkung von D auf den Grad der Aktivität des Patched-Wegs in mit Shh behandelten Hautausstanzungen. Zunehmende Konzentrationen von D (von 0,01 bis 1 μM) führten zu einer dosisabhängigen Abnahme der Menge an Wegaktivität, was durch die Menge an lacZ-Reporter-Enzymaktivität überwacht wurde (35A). Die Färbung von mit D behandelten Explantaten mit dem Reporterenzym zeigte, dass 0,2 μM D die X-gal-Färbung verringerte, verglichen mit der intensiven X-gal-Färbung von mit Shh-Protein allein behandelten Hautausstanzungen ( 35B). Dies zeigt, dass D die Aktivierung des Patched-Wegs blockierte und die Expression des Ptc-Gens herunterregulierte.
Das nächste Experiment zeigte, dass die Hemmung des Patched-Wegs mit D die Bildung BCC-ähnlicher Strukturen verhindert. 35C zeigt, dass D die Bildung BCC-ähnlicher Strukturen vollständig blockierte, ohne die Integrität normaler Hautzellen zu beeinflussen. Dies bestätigt, dass D das Auftreten BCC-ähnlicher Strukturen, die durch die Aktivierung des Patched-Wegs, desselben Wegs, dem die menschliche Erkrankung zugrunde liegt, erzeugt werden, verhindern kann.
Test mit Hautausstanzungen embryonaler Mäuse: Wirkung einer Kurzzeitvorbehandlung mit D
Verfahren
Von transgenen Mäusen stammende Hautausstanzungen wurden in Abwesenheit von Shh 5 Stunden mit Träger oder D behandelt. Nach der Vorbehandlung wurde der Träger oder D entfernt. Die Hautausstanzungen wurden zweimal gewaschen und dann in Gegenwart von Shh 6 Tage gezüchtet. Am Ende des Expermiments wurden die Hautausstanzungen fixiert und mit X-gal gefärbt, um die Aktivität des Patched-Wegs zu bestimmen.
Ergebnisse
Hautausstanzungen, die 6 Tage mit exogenem Shh-Protein allein behandelt wurden, zeigten, verglichen mit denen, die mit Träger allein behandelt wurden, eine intensive X-gal-Färbung (d.h. Aktivierung) (36, obere Reihe). Hautausstanzungen, die 5 Stunden mit 10, 20 und 50 μM D vorbehandelt wurden, bevor sie mit exogenem Shh-Protein behandelt wurden, zeigten eine vollständige Hemmung der durch das Shh-Protein induzierten Hochregulierung des Patched- Wegs, was durch das Fehlen der X-gal-Färbung angezeigt wurde (36, untere Reihe – 3 Objektträger auf der rechten Seite). Eine intensive X-gal-Färbung, die auf eine Hochregulierung des Patched-Wegs hinweist, wurde in Hautausstanzungen, die mit dem Träger vorbehandelt wurden, bevor sie mit Shh-Protein behandelt wurden, beobachtet (36, untere Reihe, links). Die kurze Dauer der Vorbehandlung entsprach im Wesentlichen einer 6-tägigen Behandlung mit D, bezogen auf den Grad der Hemmung durch Ptc (Vergleich der oberen und unteren Reihe in 36).
Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass D fest an sein Ziel bindet, und dass die Kinetik der Dissoziation langsam oder irreversibel ist. Die Daten weisen auch darauf hin, dass D die Fähigkeit aufweisen könnte, die Entwicklung von BCC zu verhindern.
Test mit Hautausstanzungen embryonaler Mäuse: Langzeitbehandlung von bereits bestehenden BCC-ähnlichen Strukturen mit D
Verfahren
Hautausstanzungen von 17,5 Tage alten Embryos aus transgenen Patched-Weg-Reportermäusen wurden in Gegenwart von Shh-Protein 7 Tage gezüchtet, um die Entwicklung von BCC-ähnlichen Strukturen zu ermöglichen. Das Shh-Protein wurde am Ende der 7 Tage entfernt. Die Kulturen wurden dann 3 Tage mit Shh-Protein plus entweder Träger oder D behandelt. Die Kulturen wurden nach 10 Tagen histologisch analysiert, um die Bildung von BCC-ähnlichen Strukturen, die auf eine Aktivierung des Patched-Wegs hinweisen, zu beurteilen.
Ergebnisse
Die histologische Analyse zeigte, dass D mit entweder 1 oder 5 μM die Größe und Zahl von durch Shh induzierten BCC-ähnlichen Strukturen in behandelten Hautausstanzungen, verglichen mit Träger-behandelten Explantaten, wesentlich verringerte (37A). Somit induzierte eine 3-tägige Behandlung bestehender BCC-ähnlicher Strukturen mit D offensichtlich die Regression dieser Strukturen. Ferner weist D offensichtlich keine allgemeinen zytotoxischen Wirkungen auf Hautzellen auf, was durch ihre normale Histologie bestimmt wurde.
Ein möglicher Mechanismus für die durch D induzierte Regression BCC-ähnilicher Strukturen kann eine Apoptose der aktivierten Zellen sein. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurden parallele Explantate 2 Tage mit 5 μM D behandelt und wurden dann durch das Verfahren der durch terminale Deoxynucleotidyltransferase-vermittelten d-UTP-Bruch-Endmarkierung (TUNEL) gefärbt, das zum Nachweis apoptotischer Kerne verwendet wird. Nach 2-tägiger Behandlung mit 5 μM D war die Zahl der apoptotischen Kerne (was durch die braune Farbe auf den Objektträgern auf der rechten Seite angezeigt wurde) innerhalb der BCC-ähnlichen Strukturen wesentlich höher als in der Trägerkontrolle auf der linken Seite (37B). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass sich die durch D induzierte Regression BCC-ähnlicher Strukturen wenigstens teilweise aus der Stimulierung des Zellsuizidwegs von Zellen, in denen der Patched-Weg aktiviert ist, ergibt.
Test mit Hautausstanzungen embryonaler Mäuse: Kurzzeitbehandlung von bereits bestehenden BCC-ähnlichen Strukturen mit D
Verfahren
Hautausstanzungen von 17,5 Tagen alten Embryos aus transgenen Patched-Weg-Reportermäusen wurden in Gegenwart von Shh-Protein 7 Tage gezüchtet. Das Shh-Protein wurde am Ende der 7 Tage entfernt. Die Hautausstanzungen wurden dann am 7. und 9. Tag 5 Stunden mit dem Träger oder 1 oder 5 μM D behandelt. Nach jeder Behandlung mit dem Träger oder D wurde der Träger oder D abgewaschen, und die Hautausstanzungen wurden in Gegenwart von Shh-Protein erneut gezüchtet. Die Kulturen wurden durch X-gal-Färbung nach 10 Tagen in vitro analysiert, um die Aktivität des Patched-Wegs zu beurteilen.
Ergebnisse
Die Kurzzeitbehandlung mit D verringerte die Menge an X-gal-Färbung, die mit der Behandlung mit Shh-Protein verbunden ist (38A), was auf eine Herunterregulierung der Wegaktivität in Hautexplantaten hinweist. Die histologische Analyse zeigte, dass D sogar in einer Konzentration von 1 μM die Regression von X-gal-positiven BCC-ähnlichen Strukturen induzierte (38B). Die quantitative Bestimmung der Gli-1-mRNA-Konzentrationen in mit D behandelten Ausstanzungen zeigte, dass die Kurzzeitbehandlung mit D die Gli-1-Transkription vollständig herunterregulierte (38C, linke Seite). Diese Wirkung war für den Patched-Weg offensichtlich spezifisch und war nicht auf eine allgemeine Zytotoxizität zurückzuführen, was durch die relativ konstanten mRNA-Konzentrationen eines Haushaltsenzyms, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase oder GAPDH, gezeigt wurde (38C, rechte Seite).
Diese Ergebnisse zeigen, dass D unter den bestimmten Bedingungen einer Kurzzeitbehandlung die Fähigkeit aufweist, die Aktivität des Patched-Wegs in gezüchteten embryonalen Hautexplantaten zu hemmen. Ferner verursachte D mit Konzentrationen von sowohl 1 als auch 5 μM die Regression von bestehenden durch Shh induzierten BCC-ähnlichen Strukturen.
Test mit Hautausstanzungen erwachsener BCC-Mäuse
Verfahren
Ptc-heterozygote, transgene Mäuse wurden 6 Monate dreimal wöchentlich bestrahlt, wobei sich während dieser Zeit viele kleine und oft mikroskopische BCC-Tumoren entwickelten. Hautausstanzungsexplantate mit einem Durchmesser von 4 mm, die vermutlich BCC-Strukturen enthielten, wurden 6 Tage in Gegenwart von Träger, der positiven Kontrolle (Jervin) oder 5 μM D gezüchtet. Am Ende des Experiments wurden die Explantate durch X-gal-Färbung, um den Grad der Aktivität des Patched-Wegs nachzuweisen, durch Histologie, um die Wirkung der Behandlung auf die Morphologie von durch ultraviolette Strahlung ausgelösten BCCs zu bestimmen, und durch quantitative Bestimmung des Grads an Gli-1-mRNA-Expression, um das Ausmaß der Weghemmung zu charakterisieren, analysiert.
Ergebnisse
Die X-gal-Färbung der behandelten Explantate zeigt, dass Hautausstanzungen, die in Gegenwart von Träger allein gezüchtet wurden; intensiv blau gefärbte Herde entwickelten, die auf eine fokale Hochregulierung des Patched-Wegs und der BCC Strukturen hinweisen (blaue Flecken in 39A). Verglichen mit dem Träger, verringerte 5 μM D, wie die positive Kontrolle, die Zahl und Größe etablierter BCC-Strukturen. Die histologische Analyse von Schnittpräparaten der Explantate zeigte, dass D, verglichen mit der Trägerkontrolle, die Regression von durch ultraviolette Strahlung ausgelösten BCC-Tumoren induzierte (39B). In Hautausstanzungen aus diesen heterozygoten, transgenen Mäusen waren die Konzentrationen von Gli-1-mRNA infolge der Aktivierung von Ptc-Zielgenen hoch. D mit Konzentrationen von 1 und 5 μM hemmte, verglichen mit dem Träger allein, auch die Gli-1-mRNA-Konzentrationen wesentlich.
Die quantitative Bestimmung der Gli-1-mRNA-Konzentrationen zeigt die fast vollständige Hemmung der Zielgenaktivierung durch D (39C). Diese Hemmung wurde offensichtlich nicht durch eine nicht-spezifische Zytotoxizität verursacht, da ein statistischer Vergleich der Konzentrationen des Haushaltsenzyms GAPDH zwischen den Bedingungen der Behandlung und des Trägers keinen wesentlichen Unterschied unter den Gruppen in der allgemeinen Zellstoffwechselaktivität zeigt. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass D den Patched-Weg hemmt und die Regression von durch ultraviolette Strahlung ausgelösten BCNS-ähnlichen BCC-Tumoren in gezüchteten Hautexplantaten induziert.
Diese Daten bestätigen die Ergebnisse vorhergehender Experimente und weisen darauf hin, dass D bei einer Behandlung von BCC wirksam sein könnte.
Züchtung menschlicher BCC-Explantate
Verfahnen
Aus chirurgischen Verfahren (wie Mohs'sche-Chirurgie oder Kürettage) erhaltene Proben wurden auf frischer, lebender Haut von 17 Tage alten Mäuseembryos, von der alle Epidermiszellen durch Verdauung unter Verwendung von Dispase entfernt worden sind, gezüchtet. Da eine Dispasebehandlung Basalmembrankomponenten verdaut, wurde Matrigel, eine im Handel erhältliche Basalmembranzubereitung, zwischen der Haut und dem BCC aufgetragen. Die Kulturen wurden auf einem Kunststoffgitter zusammengesetzt und 3 Tage (mit D in einer Konzentration von 10 μM oder ohne D) in einem für die Langzeitzüchtung von menschlicher Haut geeigneten Medium inkubiert. Nach der Züchtung wurden die Proben für eine Routinehistologie aufbereitet und einer quantitativen Hybridisierung in situ unterzogen. Kurz gesagt, Schnittpräparate mit 7 μm von mit Paraformaldehyd fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe, das große Basalzelleninseln enthielt, wurden gereinigt, erneut hydratisiert, mit Proteinase K verdaut, acetyliert und mit [³³P]-markierten RNA-Sonden über Nacht hybridisiert. Nach Waschschritten mit hoher Stringenz im Anschluss an die Hybridisierung wurden die Objektträger im Dunklen bei Raumtemperatur 4 bis 7 Tage einer PhosphorImager-Folie ausgesetzt. Nach dem Entwickeln wurde das [³³P]-Signal unter Verwendung eines Storm-Scanners (Molecular Dynamics) abgetastet. Einzelne Basalzelleninseln wurden ausgewählt, und das Signal wurde quantitativ bestimmt und unter Verwendung der Software ImageQuant 1,0 in durchschnittlichen Zählimpulsen/Pixel ausgedrückt.
Ergebnisse
Die für BCCs charakteristischen morphologischen Merkmale, wie Inseln undifferenzierter Basalzellen, und in einigen Fällen Palisadenbildung peripherer Zellen und Stromaspaltung ( 40A) wurden beibehalten, wenn BCCs in diesem System gezüchtet wurden. Desgleichen weisen die Differenzierungsmarker, die exprimiert wurden, ein zu denen der Vorkultur-Kontrollen identisches Muster auf, was durch immunhistochemische Färbung bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Das Gli-1-Gen, ein Hauptindikator der Signalgebung von Patched, blieb in unbehandelten Kulturen in hohem Grad aktiv, was aus den Schnittpräparaten, die mit ³³P-markierten RNA-Sonden behandelt wurden, bestimmt wurde (40B). Eine quantitative Hybridisierung in situ zeigte, dass der Grad an Gli-1-Expression in den mit D behandelten Proben, verglichen mit Träger-behandelten Kontrollen, stark verringert war (41).
Herstellung von in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen
a. Veranschaulichende Syntheseschemata
Beispielhafte Syntheseschemata zur Erzeugung von Hedgehog-Antagonisten, die in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind in den 1 bis 31 gezeigt.
Die Reaktionsbedingungen in den veranschaulichten Schemata der 1 bis 31 sind wie folgt:

1) R₁CH₂CN, NaNH₂, Toluol (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
2) H₂SO₄, H₂O, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
3) H₂SO₄, EtOH, Rückfluss (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242)
4) NaOH, EtOH, Rückfluss
5) (Boc)₂O, 2 M NaOH, THF
6) LiHDMS, R₁X, THF (Merck Patentanmeld. Nr. WO 96/06609)
7) Pd-C, H₂, MeOH
8) t-BuONO, CuBr, HBr, H₂O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2426)
9) ArB(OH)₂, Pd(PPh₃)₄, Dioxan (J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
10) R₁₂(H)C=CR₁₃R₁₄, Pd(OAc)₂, Et₃N, DMF (Org. React. 1982, 27, 345)
11) Tf₂O, THF (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
12) ArSnBu₃, Pd(PPh₃)₄, Dioxan (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
13) KMnO₄, Py, H₂O (J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
14) NaOR₁, THF
15) NaSR₁, THF
16) HNR₁R₁₃, THF
17) HONO, NaBF₄ (Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1-30)
18) Pd(OAC)₂, NaH, DPPF, PhCH₃, R₁OH (J. Org. Chem. 1997, 62, 5413-5418)
19) i. R₁X, Et₃N, CH₂Cl₂, ii. R₁₃X
20) SOCl₂, Kat. DMF
21) CH₂N₂, Et₂O
22) Ag₂O, Na₂CO₃, Na₂S₂O₃, H₂O (Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
23) AgO₂CPh, Et₃N, MeOH (Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
24) LiOH, THF-MeOH
25) (EtO)₂P(O)CH₂CO₂R, BuLi, THF
26) MeO₂CCH(Br)=P(Ph)₃, Benzol
27) KOH oder KOtBu
28) Base, X(CH₂)_nCO₂R
29) DPPA, Et₃N, Toluol (Synthesis 1985, 220)
30) HONO, H₂O
31) SO₂, CuCl, HCl, H₂O (Synthesis 1969,1-10, 6)
32) Lawesson-Reagenz, Toluol (Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
33) R₂M, Lösungsmittel
34) 30 % H₂O₂, Eisessig (Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
35) Triphosgen, CH₂Cl₂ (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
36) i. (EtO)₂P(O)CHLiSO₂Oi-Pr, THF, ii. NaI
37) Ph₃PCH₃I, NaCH₂S(O)CH₃, DMSO (Synthesis 1987, 498)
38) Br₂, CHCl₃ oder ein anderes Lösungsmittel (Synthesis 1987, 498)
39) BuLi, Bu₃SnCl
40) ClSO₂OTMS, CCl₄ (Chem. Ber. 1995, 128, 575-580)
41) MeOH-HCl, Rückfluss
42) LAH, Et₂O oder LiBH₄, EtOH oder BH₃-THF (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
43) MsCl, Et₃N, CH₂Cl₂ (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
44) Na₂SO₃, H₂O (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
45) R₂R₄NH, Et₃N, CH₂Cl₂
46) R₂M, Lösungsmittel
47) CH₃NH(OCH₃), EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF (Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815)
48) MeLi, THF
49) mCPBA, CH₂Cl₂
50) HONO, Cu₂O, Cu(NO₃)₂, H₂O (J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
51) R₁M, Lösungsmittel
52) HONO, NaS(S)COEt, H₂O (Org. Synth. 1947, 27, 81)
53) HSR₂ oder HSR₄, CH₂Cl₂
54) i-BuOC(O)Cl, Et₃N, NH₃, THF
55) R₂R₄NH, CH₂Cl₂, NaBH(OAc)₃
56) R₂R₄NH, MeOH/CH₃CO₂H, NaBH₃CN
57) R₂OH, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
58) R₂OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
59) R₂R₄NH, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
60) R₂R₄NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
61) POCl₃, Py, CH₂Cl₂
62) R₂R₄NCO, Lösungsmittel
63) R₂OC(O)Cl, Et₃N, Lösungsmittel
64) R₂CO₂H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
65) R₂X, Et₃N, Lösungsmittel
66) (CH₃S)₂C=N(CN), DMF, EtOH (J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66)
67) R₂SO₂Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
68) R₂- oder R₃- oder R₄CHO, MeOH/CH₃CO₂H, NaBH₃CN (Synthesis 1975, 135-146)
69) Boc(Tr)-D oder L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
70) Boc(Tr)-D oder L-CysH, NaBH₃CN, MeOH/CH₃CO₂H (Synthesis 1975, 135-146)
71) cysteinales S-Tr-N-Boc, ClCH₂CH₂Cl oder THF, NaBH(OAc)₃ (J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-3862)
72) TFA, CH₂Cl₂, Et₃SiH oder Thioanisol/Ethandithiol/DMS (3:1:1)
73) TFA, CH₂Cl₂
74) DPPA, Et₃N, Toluol, HOCH₂CH₂SiCH₃ (Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515)
75) TBAF, THF
76) Base, TrSH oder BnSH
77) Base, R₂X oder R₄X
78) R₃NH₂, MeOH/CH₃CO₂H, NaBH₃CN
79) N₂H₄, KOH
80) Pd₂(dba)₃, P(o-tol)₃, RNH₂, NaOtBu, Dioxan, R₁NH₂ (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181-7184)
81) Cyanamid
82) Fmoc-Cl, Natriumhydrogencarbonat
83) BnCOCl, Natriumcarbonat
84) AllylCOCl, Pyridin
85) Benzylbromid, Base
86) Oxalylchlorid, DMSO
87) RCONH₂
88) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
89) Thiocarbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
90) Cyanogenbromid, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
91) RCOCl, Triethylamin
92) RNHNH₂, EDC
93) RO₂CCOCl, Et₃N, DCM
94) MsOH, Pyridin (J. Het. Chem., 1980, 607)
95) Base, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, Toluol, THF)
96) H₂NOR, EDC
97) RCSNH₂
98) RCOCHBrR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992, 24,127)
99) CH₂N₂, HCl (Synthesis, 1993,197)
100) NH₂NHR, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
101) RSO₂Cl, DMAP (Tetrahedron Lett, 1993, 34, 2749)
102) Et₃N, RX (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037)
103) NOCl oder Cl₂ (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916)
104) H₂NOH, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
105) RCCR, neutrale Lösungsmittel (DCM, THF, Toluol)
106) RCHCHR, neutrale Lösungsmittel (DCM, THF, Toluol)
107) H₂NOH, HCl
108) Thiocarbonyldiimidazol, SiO₂ oder BF₃OEt₂ (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
109) Thiocarbonyldiimidazol, DBU oder DBN (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228)
110) HNO₂, HCl
111) ClCH₂CO₂Et (Org. Reactions, 1959,10,143)
112) Morpholinenamin (Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27)
113) RCOCHR'CN
114) RCOCHR'CO₂Et
115) Na₂SO₃
116) H₂NCHRCO₂Et
117) EtO₂CCHRNCO
118) RCNHNH₂
119) RCOCO₂H (J. Med. Chem., 1995, 38, 3741)
120) RCHO, KOAc
121) 2-Fluornitrobenzol
122) SnCl₂, EtOH, DMF
123) RCHO, NaBH₃CN, HOAc
124) NH₃, MeOH
125) 2,4,6-Me₃PhSO₂NH₂
126) Et₂NH, CH₂Cl₂
127) MeOC(O)Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
128) R₂NH₂, EDC, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
129) DBU, PhCH₃
130) BocNHCH(CH₂STr)CH₂NH₂, EDC, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
131) R₂NHCH₂CO₂Me, HBTU, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
132) BocNHCH(CH₂STr)CH₂OMs, LiHMDS, THF
133) R₂NHCH₂CO₂Me, NaBH(OAc)₃, ClCH₂CH₂Cl oder THF
134) R₂NHCH₂CH(OEt)₂, HBTU, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
135) NaBH(OAc)₃, ClCH₂CH₂Cl oder THF, AcOH
136) Piperidin, DMF
137) Pd(Ph₃P)₄, Bu₃SnH
138) RCO₂H, EDC, HOBT, Et₃N, DCM
139) RNH₂, neutrale Lösungsmittel
140) RCHO, NaBH₃CN, HOAC
141) RNCO, Lösungsmittel
142) RCO₂H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
143) RCOCl, Triethylamin
144) RSO₂Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
145) SnCl₂, EtOH, DMF
146) RNH₂, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
147) Dibromethan, Et₃N, CH₂Cl₂
148) Oxalylchlorid, neutrale Lösungsmittel
149) LiOH, THF-MeOH
150) Carbonyldiimidazol, neutrale Lösungsmittel (z.B. DCM, DMF, THF, Toluol)
151) RNH₂, Et₃N, CH₂Cl₂
152) Base, RX
153) DBU, PhCH₃
154) DPPA, Et₃N, Toluol(Synthesis 1985, 220)
155) SOCl₂, Kat. DMF
156) ArH, Lewis-Säure (AlCl₃, SnCl₄, TiCl₄), CH₂Cl₂
157) H₂NCHRCO₂Et, neutrale Lösungsmittel
158) BocHNCHRCO₂H, EDC oder HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂ oder DMF
159) TFA, CH₂Cl₂

Fachleute erkennen oder können unter Verwendung von nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren viele Äquivalente zu den speziellen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung ermitteln. Diese Äquivalente sollen von den folgenden Ansprüchen umfasst werden.

Claims

Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivierung eines Hedgehog-Wegs in einer Zelle, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist:
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X und D unabhängig ausgewählt sind aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈), -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r 1 darstellen, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einer Verbindung in einer ausreichenden Menge, um eine Hedgehog-Signalgebung zu inhibieren, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist:
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_n Alkenyl-, -(CH₂)_n Alkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X und D unabhängig ausgewählt sind aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus 0 und S; E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammgenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r 1 darstellen, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (III), ist:
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X ausgewählt ist aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r 1 darstellen, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einer Verbindung in einer ausreichenden Menge, um die Hedgehog-Signalgebung zu inhibieren, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (III), ist:
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X ausgewählt ist aus N(R₈), -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_n Aryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r 1 darstellen, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (IV), ist:
Formel IV wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X unabhängig ausgewählt ist aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈), -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_n Aryl oder -(CH₂)_n Heteroaryl darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; und n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einer Verbindung in einer ausreichenden Menge, um die Hedgehog-Signalgebung zu inhibieren, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (IV), ist:
Formel IV wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n Heteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n, -Alkenyl-, -Alkinyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X unabhängig ausgewählt ist aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; und n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Y und Z jeweils O darstellen.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei E gleich NR₈ ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 1, 2 oder 8, wobei D ein Aralkyl- oder Heteroaralkyl-substituiertes Amin ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 3, 4, 5 oder 6, wobei M nicht vorhanden ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X in einem Ring beinhaltet ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X in einem Diazacarbocyclus beinhaltet ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei XLR₄ ein cyclisches Amin beinhaltet.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest beinhaltet.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei R₁ einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei L, welches an R₁ gebunden ist, gleich O, S oder NR₈ ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei L bei jedem Vorkommen eine direkte Bindung darstellt.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (VI), ist:
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, Y gleich O oder S ist; Z' gleich -SO₂-, -(-C=S)- oder -(C=O)- ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt; G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt; J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, welcher an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, welche an J benachbart sind, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind; R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring ein oder beide Vorkommen von N beinhaltet; R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkykest (verzweigt oder geradkettig), Alkenylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkinylrest (verzweigt oder geradkettig), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt; R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarykest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest einschließlich polycyclischer Reste darstellt; und R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung einer Hedgehog-Weg in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einer Verbindung in einer ausreichenden Menge, um die Hedgehog-Signalgebung zu inhibieren, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (VI), ist:
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, Y gleich O oder S ist; Z' gleich -SO₂-, -(C=S)- oder -(C=O)- ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt; G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt; J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, welcher an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, welche an J benachbart sind, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind; R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring ein oder beide Vorkommen von N einschließt; R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkenylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkinylrest (verzweigt oder geradkettig), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt; R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarykest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest einschließlich polycyclischer Reste darstellt; und R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei mindestens ein Vorkommen von J Teil eines heterocyclischen Rings mit 5 bis 8 Gliedern ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei NJ₂N zusammengenommen ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Diamin darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das cyclische Diamin ein substituiertes oder unsubstituiertes Piperazin ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das cyclische Diamin mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Oxo, C_1-10-Alkyl und C_1-10-Alkylether substituiert ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei NJ₂ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist, darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist, darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus C_1-10-Alkyl, C_1-10-Alkylether, C_1-10-Alkylthioether, Amido und Oxo substituiert sind.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei R₅ einen verzweigten Alkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring beinhaltet.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei der mindestens eine heterocyclische Ring ausgewählt ist aus Thiophen, Furan, Oxazol, Benzodioxan, Benzodioxol, Pyrrol und Indol.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 29, wobei R₇ Phenylalkyl darstellt.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei R₇ ein substituierter oder unsubstituierter Benzylrest ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß Anspruch 31, wobei der Benzylrest mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C_1-10-Alkyl, Nitro, Cyano, C_1-10-Alkylether und C_1-10-Alkylthioether substituiert ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 32, wobei Y gleich O ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 33, wobei Z' gleich SO₂, -(C=O)- oder -(C=S)- ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 34, wobei R₈ H oder ein C_1-10-Alkylrest ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle den Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme aufweist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung die Weitergabe von durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelten Signalen mit einem ED₅₀ von 1 μM oder weniger hemmt.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung die Weitergabe von durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelten Signalen mit einem ED₅₀ von 1 nM oder weniger hemmt.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung als Teil einer therapeutischen oder kosmetischen Anwendung verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei die therapeutische oder kosmetische Anwendung ausgewählt ist aus der Regulierung von neuralem Gewebe, Knochen- und Knorpelausbildung und -wiederherstellung, Regulierung der Spermatogenese, Regulierung von glatter Muskulatur, Regulierung von Lunge, Leber und anderen Organen, die aus den primitiven Eingeweiden entstehen, Regulierung der hämatopoetischen Funktion und Regulierung von Haut- und Haarwachstum.
Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei die therapeutische oder kosmetische Anwendung ein Basalzellenkarzinom ist.
Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei die therapeutische oder kosmetische Anwendung die Hemmung des Haarwachstums ist.
Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei die therapeutische oder kosmetische Anwendung die Hemmung von Zellwachstum oder -proliferation ist.
Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei das Zellwachstum oder die Zellproliferation Krebszellenwachstum oder -proliferation ist.
Verfahren oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung die Übertragung von durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelten Signalen mit einem ED₅₀ von 1 mM oder weniger hemmt.
Arzneimittel, umfassend einen sterilen pharmazeutischen Exzipienten und eine Verbindung dargestellt durch die allgemeine Formel (I):
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X und D unabhängig ausgewählt sind aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus 0 und S; E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Arzneimittel, umfassend einen sterilen pharmazeutischen Exzipienten und eine Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (III):
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)Alkenyl_n(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X ausgewählt ist aus -N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Arzneimittel gemäß Anspruch 46, wobei E gleich NR₈ ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 46 oder 48, wobei D ein Aralkyl- oder Heteroaralkyl substituiertes Amin darstellt;
Arzneimittel gemäß Anspruch 47, wobei M nicht vorhanden ist.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 50, wobei mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest beinhaltet.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 51, wobei R₁ einen verzweigten Alkykest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest darstellt.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 52, wobei XLR₄ zusammengenommen ein cyclisches Amin beinhaltet.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 53, wobei Y und Z gleich O sind.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 54, wobei das an den Rest R₁ gebundene L O, S oder NR₈ darstellt.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 54, wobei L bei jedem Vorkommen eine direkte Bindung darstellt.
Arzneimittel, umfassend einen sterilen pharmazeutischen Exzipienten und eine Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (VI):
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, Y gleich O oder S ist; Z' gleich -SO₂-, -(C=S)- oder -(C=O)- ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt; G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt; J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, welcher an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, welches an J benachbart ist, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind; R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring eine oder beide Vorkommen von N beinhaltet; R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkenylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkinylrest (verzweigt oder geradkettig), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt; R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkykest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest, einschließlich polycyclischen Resten, darstellt; und R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Arzneimittel gemäß Anspruch 57, wobei mindestens ein Vorkommen von J Teil eines heterocyclischen Rings ist, welcher 5 bis 8 Glieder aufweist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 57, wobei NJ₂N zusammengenommen ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Diamin darstellt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 59, wobei das cyclische Diamin ein substituiertes oder unsubstituiertes Piperazin darstellt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 59 oder 60, wobei das cyclische Diamin mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Oxo, C_1-10-Alkyl und C_1-10-Alkylether substituiert ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 57, wobei NJ₂ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 57, wobei NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 63, wobei ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus C_1-10-Alkyl, C_1-10-Alkylether, C_1-10-Alkylthioether, Amido und Oxo substituiert sind.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 64, wobei R₅ einen verzweigten Alkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 65, wobei R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring beinhaltet.
Arzneimittel gemäß Anspruch 66, wobei der mindestens eine heterocyclische Ring ausgewählt ist aus Thiophen, Furan, Oxazol, Benzdioxan, Benzdioxol, Pyrrol und Indol.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 67, wobei R₇ Phenylalkyl darstellt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 68, wobei R₇ ein substituierter oder unsubstituierter Benzylrest ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 69, wobei der Benzylrest mit einem der mehreren Resten ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C_1-10-Alkyl, Nitro, Cyano, C_1-10-Alkylether und C_1-10-Alkylthioether substituiert ist.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 70, wobei R₈H oder einen C_1-10-Alkylrest darstellt.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 71, wobei Y gleich O ist.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 57 bis 72, wobei Z' SO₂, -(C=O)- oder -(C=S)- darstellt.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist:
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n Heteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X und D unabhängig ausgewählt sind aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (III), ist:
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_n-Aryl oder -(CH₂)_n Heteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X ausgewählt ist aus -N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (IV), ist:
Formel IV wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X unabhängig ausgewählt ist aus -N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; und n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 75, wobei Y und Z jeweils O darstellen.
Verwendung gemäß Anspruch 74, wobei E gleich NR₈ ist.
Verwendung gemäß Anspruch 74, 75 oder 78, wobei D ein Aralkyl- oder Heteroaralkylsubstituiertes Amin darstellt.
Verwendung gemäß Anspruch 75 oder 76, wobei M nicht vorhanden ist:
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 80, wobei X in einem Ring beinhaltet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 81, wobei X in einem Diazacarbocyclus beinhaltet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 82, wobei XLR₄ ein cyclisches Amin beinhaltet.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 83, wobei mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest beinhaltet.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 84, wobei R₁ einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 85, wobei L, welches an R₁ gebunden ist, O, S oder NR₈ ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 85, wobei L bei jedem Vorkommen eine direkte Bindung darstellt.
Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die Verbindung ein organisches Molekül, dargestellt durch die allgemeine Formel (VI), ist:
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, Y gleich O oder S ist; Z' gleich -SO₂-, -(C=S)- oder -(C=O)- ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt; G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt; J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, welcher an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, welches an J benachbart ist, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind; R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring eine oder beide Vorkommen von N beinhaltet; R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkenylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkinylrest (verzweigt oder geradkettig), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt; R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest, einschließlich polycyclischen Resten, darstellt; und R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung gemäß Anspruch 88, wobei mindestens ein Vorkommen von J Teil eines heterocyclischen Rings ist, welcher 5 bis 8 Glieder aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 88, wobei NJ₂N zusammengenommen ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Diamin darstellt.
Verwendung gemäß Anspruch 90, wobei das cyclische Diamin ein substituiertes oder unsubstituiertes Piperazin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 91, wobei das cyclische Diamin mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Oxo, C_1-10-Alkyl und C_1-10-Alkylether substituiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 88, wobei NJ₂ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Verwendung gemäß Anspruch 88, wobei NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 94, wobei ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus C_1-10-Alkyl, C_1-10-Alkylether, C_1-10-Alkylthioether, Amido und Oxo substituiert sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 95, wobei R₅ einen verzweigten Alkykest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 96, wobei R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring beinhaltet.
Verwendung gemäß Anspruch 97, wobei der mindestens eine heterocyclische Ring ausgewählt ist aus Thiophen, Furan, Oxazol, Benzdioxan, Pyrrol und Indol.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 98, wobei R₇ Phenylalkyl darstellt.
Verwendung gemäß Anspruch 99, wobei R₇ ein substituierter oder unsubstituierter Benzylrest ist.
Verwendung gemäß Anspruch 100, wobei der Benzylrest mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C_1-10-Alkyl, Nitro, Cyano, C_1-10-Alkylether und C_1-10-Alkylthioether substituiert ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 101, wobei Y gleich O ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 102, wobei Z' SO₂, -(C=O)- oder -(C=S)- ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 88 bis 103, wobei R₈H oder einen C_1-10- Alkylrest darstellt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 104, wobei der Krebs Zellen mit einem Phänotyp Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme beinhaltet.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 105, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 mM oder weniger hemmt.
Verwendung gemäß Anspruch 106, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 μM oder weniger hemmt.
Verwendung gemäß Anspruch 107, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 nM oder weniger hemmt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 74 bis 108, wobei der Krebs ein Basalzellenkarzinom ist.
Verbindung der Struktur der allgemeinen Formel (I):
Formel I wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X und D unabhängig ausgewählt sind aus -N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; E gleich O, S oder NR₅ ist, wobei R₅ LR₈ oder -(C=O)LR₈ darstellt; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt, oder zwei Reste R₈ zusammgenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, wobei die Verbindung für das Isomer angereichert ist, wobei die Substituenten an dem Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung der Struktur der allgemeinen Formel (III):
Formel III wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X ausgewählt ist aus -N(R₈)-, -O-, -S-, (R₈)N-N(R₈)-, -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus O und S; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; und q und r gleich 1 sind, wobei die Verbindung für das Isomer angereichert ist, wobei die Substituenten an dem Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung der Struktur der allgemeinen Formel (IV):
Formel IV wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_nHeteroaryl darstellen; L unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder -(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -(CH₂)_nAlkenyl-, -(CH₂)_nAlkinyl-, -(CH₂)_nO(CH₂)_p-, -(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-, -(CH₂)_nS(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkenyl(CH₂)_p-, -(CH₂)_nAlkinyl(CH₂)_p-, -O(CH₂)_n-, NR₈(CH₂)_n- oder -S(CH₂)_n- darstellt; X unabhängig ausgewählt ist aus N(R₈)-, -O-, -S-, -(R₈)N-N(R₈), -ON(R₈)- und einer direkten Bindung; R₈ unabhängig bei jedem Vorkommen H, C_1-10-Alkyl, -(CH₂)_nAryl oder -(CH₂)_n-Heteroaryl darstellt oder zwei Reste R₈ zusammengenommen einen 4- bis 8-gliedrigen Ring bilden können; M nicht vorhanden ist oder -L-, -SO₂L- oder -(C=O)L- darstellt; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; und n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; wobei die Verbindung für das Isomer angereichert ist, wobei die Substituenten an dem Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 111, wobei Y und Z jeweils O darstellen.
Verbindung gemäß Anspruch 110, wobei E gleich NR₈ ist.
Verbindung gemäß Anspruch 110, 111 oder 114, wobei D ein Aralkyl- oder Heteroaralkyl-substituiertes Amin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 111 oder 112, wobei M nicht vorhanden ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 116, wobei X in einem Ring beinhaltet ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 117, wobei X in einem Diazacarbocyclus beinhaltet ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 118, wobei XLR₄ ein cyclisches Amin beinhaltet.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 119, wobei mindestens einer der Reste R₁, R₂ und R₃ einen Arylrest beinhaltet.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 120, wobei R₁ einen verzweigten Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 121, wobei der an den Rest R₁ gebundene Rest L O, S oder NR₈ darstellt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 122, wobei L bei jedem Vorkommen eine direkte Bindung darstellt.
Verbindung der Struktur der allgemeinen Formel (VI):
Formel VI wobei, wenn Wertigkeit und Stabilität es erlauben, Y gleich O oder S ist; Z' gleich -SO₂-, -(C=S)- oder -(C=O)- ist; p unabhängig bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt; n einzeln bei jedem Vorkommen eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt; V nicht vorhanden ist oder O, S oder NR₈ darstellt; G nicht vorhanden ist oder -C(=O)- oder -SO₂- darstellt; J unabhängig bei jedem Vorkommen H oder einen substituierten oder unsubstituierten C_1-10-Alkylrest oder C_1-10-Alkylenrest, welcher an NC(=Y) gebunden ist, darstellt, in solchem Maße, daß beide Vorkommen von N, welches an J benachbart ist, durch mindestens ein Vorkommen von J gebunden sind;) R₉ unabhängig bei jedem Vorkommen nicht vorhanden ist oder H oder C_1-10-Alkyl darstellt, oder zwei Vorkommen von J oder ein Vorkommen von J zusammen mit einem Vorkommen von R₉ einen Ring mit 5 bis 7 Gliedern bilden, wobei der Ring eine oder beide Vorkommen von N einschließt; R₅ einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkenylrest (verzweigt oder geradkettig), Alkinylrest (verzweigt oder geradkettig), Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt; R₆ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest, Heteroaralkylrest, Heterocyclylrest, Heterocyclylalkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest, einschließlich polycyclischen Resten, darstellt; und R₇ einen substituierten oder unsubstituierten Arylrest, Aralkylrest, Heteroarylrest oder Heteroaralkylrest darstellt, wobei die Verbindung für das Isomer angereichert ist, wobei die Substituenten an dem Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung gemäß Anspruch 124, wobei mindestens ein Vorkommen von J Teil eines heterocyclischen Rings mit 5 bis 8 Gliedern ist.
Verbindung gemäß Anspruch 124, wobei NJ₂N zusammengenommen ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Diamin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 126, wobei das cyclische Diamin ein substituiertes oder unsubstituiertes Piperazin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 127, wobei das cyclische Diamin mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Oxo, C_1-10-Alkyl und C_1-10-Alkylether substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 124, wobei NJ₂ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Verbindung gemäß Anspruch 124, wobei NJR₉ zusammengenommen einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring darstellt, an welchen das andere Vorkommen von N gebunden ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 130, wobei ein oder beide Vorkommen von J mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus C_1-10-Alkyl, C_1-10-Alkylether, C_1-10-Alkylthioether, Amido und Oxo substituiert ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 131, wobei R₅ einen verzweigten Alkylrest, Cycloalkylrest oder Cycloalkylalkylrest darstellt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 132, wobei R₆ mindestens einen heterocyclischen Ring beinhaltet.
Verbindung gemäß Anspruch 133, wobei der mindestens eine heterocyclische Ring ausgewählt ist aus Thiophen, Furan, Oxazol, Benzdioxan, Pyrrol und Indol.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 134, wobei R₇ Phenylalkyl darstellt.
Verbindung gemäß Anspruch 135, wobei R₇ ein substituierter oder unsubstituierter Benzylrest ist.
Verbindung gemäß Anspruch 136, wobei der Benzylrest mit einem oder mehreren Resten ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C_1-10-Alkyl, Nitro, Cyano, C_1-10-Alkylether und C_1-10-Alkylthioether substituiert ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 137, wobei Y gleich O ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 138, wobei Z' SO₂, -(C=O)- oder -(C=S)- ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 124 bis 139, wobei R₈ H oder C_1-10-Alkyl ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 140, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 mM oder weniger hemmt.
Verbindung gemäß Anspruch 141, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 μm oder weniger hemmt.
Verbindung gemäß Anspruch 142, wobei die Verbindung eine durch Ptc-Funktionsverlust, Hedgehog-Funktionszunahme oder Smoothened-Funktionszunahme vermittelte Signalgebung mit einem ED₅₀ von 1 nM oder weniger hemmt.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 143, wobei die Verbindung > 75% diastereomerenrein ist, wobei die Substituenten an dem zentralen Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 143, wobei die Verbindung für das > 95% distereomerenrein ist, wobei die Substituenten an dem Ring in einer cis-Beziehung angeordnet sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2, 4, 6 bis 17, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 5, 74 bis 87, Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46 bis 56 oder Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 123, wobei XLR₄ zusammengenommen ein Piperazin beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2, 4, 6, 19, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 5, 18, 74 bis 76, 88, Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 46, 47, 57 oder Verbindung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 112, 124, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus den folgenden Verbindungen:
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