ES2233383T3 - Utilizacion terapeutica de un ihibidor de la via de señalizacion hedgehog. - Google Patents

Utilizacion terapeutica de un ihibidor de la via de señalizacion hedgehog.

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ES2233383T3
ES2233383T3 ES00935413T ES00935413T ES2233383T3 ES 2233383 T3 ES2233383 T3 ES 2233383T3 ES 00935413 T ES00935413 T ES 00935413T ES 00935413 T ES00935413 T ES 00935413T ES 2233383 T3 ES2233383 T3 ES 2233383T3
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Abstract

Utilización de un inhibidor de una vía de señalización Hedgehog para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de la inflamación o de un trastorno inmunitario.

Description

Utilización terapéutica de un inhibidor de la vía de señalización Hedgehog.
Campo de la invención
La presente invención se refiere la utilización de un inhibidor de una vía de señalización Hedgehog para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de inflamación o de un trastorno inmunitario.
Antecedentes
En muchos tejidos, tales como el pulmón y el riñón, la inflamación crónica no resuelta puede conducir a la remodelación en la que tienen lugar tanto la hiperplasia de las células epiteliales como la fibrosis. Además, existe una infiltración celular mononuclear acompañante en zonas locales de infiltración y producción de respuestas inmunitarias reactivas con autoantígenos. Una patología similar se observa también en el rechazo crónico de los órganos trasplantados. En general, estas enfermedades son difíciles de tratar clínicamente y esto está bien lustrado por la neumopatía obstructiva crónica en la que la intervención farmacológica actual presenta unos efectos limitados. Por consiguiente, la capacidad para controlar esta desregulación de los procesos de reparación epiteliales que conducen a respuestas anti-autoinmunitarias y a la remodelación del tejido tendrán un impacto clínico importante.
Sumario de la invención
La formación de superficies epiteliales y la regulación del crecimiento de las células epiteliales parece conservarse en gran medida entre las especies. Estudios recientes en biología del desarrollo han demostrado la importancia de los genes Shh y Wnt 1 del factor de crecimiento de las células epiteliales y de los miembros BMP4 y BMP7 de la superfamilia TGF-\beta. Estos productos génicos no sólo desempeñan una función importante en el crecimiento de las células epiteliales en desarrollo sino también en la estructuración del tejido. Esta última requiere la regulación coordinada y temporal de los programas de diferenciación celular. Durante el desarrollo, las células responden a factores de crecimiento que se encuentran en su desarrollo y es la interpretación de estas diversas vías de señalización del factor de crecimiento lo que determina que se inicie el programa de diferenciación. Hasta la fecha, se conoce poco sobre la contribución de estos genes a la remodelación del tejido y a la fibrosis que se observan en la inflamación crónica; aunque se ha implicado a BMP en la fibrosis en la osteopatía. Se ha observado que en los pulmones enfermos ha aumentado la expresión del gen parcheado que está implicado en la señalización Hedgehog. Se ha observado también que la instilación intratraqueal del ADN del plásmido para los genes Hedgehog conduce al desarrollo de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido y de la infiltración de las células mononucleares. La patología es similar a la observada en la neumopatía intersticial.
Se propone que los antagonistas de los componentes de la señalización Hedgehog y/o los antagonistas de los componentes de la señalización Hedgehog pueden impedir y/o anular enfermedades tales como la hiperplasia de las células epiteliales, la fibrosis de tejido, la inflamación crónica e impedir asimismo el rechazo del trasplante.
Exposición de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un inhibidor de una vía de señalización Hedgehog para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de la inflamación o de un trastorno inmunitario.
Dicho de otra manera, la presente invención proporciona la utilización de un antagonista de un componente de una vía de señalización de un miembro de la familia Hedgehog para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de la inflamación o de un trastorno inmunitario.
En una forma de realización, el miembro de la familia Hedgehog es Sonic Hedgehog, Indian Hedgehog o Desert Hedgehog.
En una forma de realización, la vía que es una diana de señalización Hedgehog es una vía de señalización BMP o una vía de señalización Wnt.
En una forma de realización, el antagonista es HIP, ciclopamina, Fzb, Cerberus, WIF-1, Xnr-3, Noggin, Chordin, Gremlin, o Follistatina o un derivado, fragmento, variante, mimético, homólogo o análogo de los mismos.
En otra forma de realización, el antagonista es un anticuerpo contra un componente de la vía de señalización Hedgehog.
En otra forma de realización, el antagonista es el propio componente de la vía de señalización Hedgehog.
\newpage
Preferentemente, la utilización de la presente invención se refiere al tratamiento de la hiperplasia pulmonar o de la fibrosis pulmonar.
Más preferentemente, la utilización de la presente invención se refiere al tratamiento del síndrome disneico agudo del adulto; de los trastornos obstructivos crónicos de las vías respiratorias que incluyen el asma, el enfisema y la bronquitis crónica; la atelectasia; la neumonía laboral incluyendo la silicosis; las neumonías con hipersensibilidad incluyendo la neumonitis con hipersensibilidad; las neumonías intersticiales idiopáticas incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática, las neumonías incluyendo la neumonía intersticial común, la neumonía intesticial descamante y la neumonía intersticial aguda; y la fibrosis pleural.
En una forma de realización, el trastorno inmunitario es una enfermedad autoinmunitaria o el rechazo del trasplante.
Más particularmente, la enfermedad autoinmunitaria puede ser la tiroiditis, las lesiones con inflamación, la esclerosis múltiple, la iridociclitis, la uveítis, la orquitis, la hepatitis, la enfermedad de Addison, la miastenia grave, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para su utilización en el tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de la inflamación, del cáncer o de un trastorno inmunitario que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de una vía de señalización Hedgehog o de un antagonista de la vía diana de señalización Hedgehog y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
A continuación se describen varias características y formas de realización preferidas de la presente invención a título de ejemplo no limitativo y con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
la Figura 1 presenta una representación esquemática de la señalización HH;
la Figura 2 presenta una representación esquemática de un componente de señalización HH;
la Figura 3 presenta una representación esquemática de la señalización Wnt;
la Figura 4 presenta un plásmido SPC-SV40;
la Figura 5 presenta un plásmido SPC-Shh;
la Figura 6 presenta los resultados del Ejemplo 2;
las Figura 7 a 9 presentan los resultados del Ejemplo 3;
la Figura 10 presenta los resultados del Ejemplo 4;
la Figura 11 presenta los resultados del Ejemplo 5;
la Figura 12 presenta los resultados del Ejemplo 6;
la Figura 13 presenta los resultados del Ejemplo 7;
la Figura 14 presenta los resultados del Ejemplo 8;
la Figura 15 presenta los resultados del Ejemplo 9;
la Figura 16 presenta los resultados del Ejemplo 12; y
la Figura 17 presenta los resultados del Ejemplo 13.
Para facilitar la referencia, se proporciona a continuación un resumen de los listados de las secuencias adjuntas:
la SEC. ID nº: 1 presenta la secuencia de aminoácidos deducida de SHH de ratón y la SEC. ID nº: 2 presenta la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos;
la SEC. ID nº: 3 presenta la secuencia de aminoácidos deducida de Dvl-1 de ratón y la SEC. ID nº: 4 presenta la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos;
la SEC. ID nº: 5 presenta la secuencia de aminoácidos deducida de HIP de ratón y la SEC. ID nº: 6 presenta la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos; y
\newpage
la SEC. ID nº: 7 presenta la secuencia de aminoácidos deducida de WIF-1 de ratón y la SEC. ID nº: 8 presenta la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos;
Proteínas de la familia Hedgehog
Todos los organismos multicelulares necesitan la comunicación celular para regular el crecimiento y la diferenciación en el embrión. Una estrategia para esto es crear centros de organización discretos que emitan señales para controlar de forma coordinada la proliferación celular y la determinación de la muerte celular. El gen Hedgehog (hh) se identificó al principio mediante el fenotipo con polaridad del segmento producido por su mutación en Drosophila. Los genes de la familia hh se han aislado ahora a partir de varias especies de vertebrados, incluyendo el ratón, el pollo, el pez cebra, la rata, Xenopus y el hombre. Los genes no solamente parece que presentan un grado elevado de homología estructural tanto dentro como entre las especies, sino que además presentan algunas similitudes notables en las maneras en que funcionan en varios procesos embrionarios. En los vertebrados, el Sonic Hedgehog (Shh) es una señal clave en varios centros de señalización. Existen otros dos miembros HH de mamíferos, Indian Hedgehog (Ihh) y desert Hedgehog (Dhh).
En la Tabla 1 siguiente se da un resumen de varios genes Hedgehog:
TABLA 1
1 
\vskip1.000000\baselineskip
La clasificación de los genes de diferentes especies se basa en la comparación del modelo de expresión y de la secuencia de aminoácidos. De todas las proteínas de vertebrados, DHH es la más similar a la HH de Drosophila (51% de identidad en toda la longitud de las proteínas procesadas). La identidad de aminoácidos entre SHH es 93% entre el ratón y el hombre, 84% entre el ratón y el pollo, 78% entre el ratón y Xenopus y 68% entre el ratón y el pez cebra. La comparación entre especies en el ratón pone de manifiesto una identidad del 58 al 63% en la combinación en pares entre SHH, IHH y DHH. La comparación entre las especies entre el ratón y Xenopus pone de manifiesto las mayores identidades entre IHH y XBHH (70%) y DHH y XCHH (64%).
Varias proteínas Hedgehog están constituidas por un péptido señal, con una zona N-terminal muy conservada y un dominio C-terminal más divergente. Se entiende que los péptidos Hedgehog biológicamente activos están formados de una proteína precursora mayor. Además de la escisión de la secuencia señal en la vía segregadora, las proteínas precursoras Hedgehog experimentan una escisión autoproteolítica interna. Esta autoescisión genera un péptido N-terminal (aproximadamente 19 kDa) y un péptido C-terminal (de aproximadamente 26 a 28 kDa). Es este péptido N-terminal el que es necesario para las actividades de señalización Hedgehog de corto y amplio intervalo en Drosophila y en vertebrados. El péptido N-terminal permanece estrechamente asociado en la superficie de las células en las que se sintetiza, mientras que el péptido C-terminal se puede difundir libremente.
Vía de señalización
La Figura 1 presenta una representación de la vía de señalización Hedgehog, con una referencia particular a la señalización en vertebrados.
Las células epiteliales pueden expresar el factor de transcripción de homeodominio dentado (en) y segregar la proteína Hedgehog mostrada a título ilustrativo en la Figura como Shh. Se ha observado que En desempeña una función importante en el mantenimiento de la supervivencia de linfocitos en el sistema inmunitario periférico.
En las células diana, la señalización de HH está mediada por dos proteínas de transmembrana parcheadas (Ptc) que presentan similitudes estructurales para canalizar y transportar las proteínas, y Suavizadas (Smo), una proteína siete-transmembrana similar a los receptores acoplados a la proteína-G y al receptor Frizzled de Wingless (descrito más adelante). Smo es un activador constitutivo de los genes diana de HH. Su actividad está reprimida normalmente por Ptc y su represión está aliviada por la fijación de HH a Ptc. De este modo, la fijación de HH a Ptc permite una transducción de la señal que conduce a la activación del factor de transcripción Gli, que está localizado en el núcleo de las células diana.
La señal alcanza a Gli mediante el complejo citoplasmático formado entre (1) la serina/treonina cinasa fusionada (Fu), (2) el supresor de (SU(Fu)) fusionada; y (3) Costal2 (Cos2). La señalización a través de este complejo puede ser inhibida por la proteína cinasa A (PKA) dependiente de AMPc (véase Figura 2).
Gli actúa sobre los genes diana Wingless (Wnt) y los factores de crecimiento de BMP/activina. Tanto Wnt como BMP son segregados en el fluido extracelular para fijarse a sus receptores. Este proceso está ilustrado esquemáticamente en la Figura 1.
En la Tabla 2, a continuación, se da un resumen de la comparación de los componentes de la vía de señalización Hedgehog:
TABLA 2
2
En esta memoria la nomenclatura se puede utilizar indistintamente.
Otra información en la señalización Hedgehog se puede encontrar en los siguientes artículos: Ingham; Chuang y McMahon; Pepicelli et al.; y Hammerschmidt et al.
Vía de señalización de BMP
Las proteínas morfogénicas del hueso (BMP) son citocinas multifuncionales, que son miembros de la superfamilia del factor \beta transformante de crecimiento (TGF-\beta). Ellas regulan la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis de varios tipos de células. Las actividades de la BMP son reguladas extracelularmente por las proteínas de fijación a BMP, Noggin, Chordin, Gremlin Cerberus y Xnr-3. Se ha descubierto que las BMP bloquean la neurogénesis en el desarrollo inicial, pero este se puede resolver mediante factores solubles, p. ej. Noggin y Chordin, que se segregan extracelularmente y que fijan y neutralizan las BMP que las previenen de la activación de sus receptores. Además, la señalización mediante receptores de BMP puede inhibir la expresión del ligando Delta de Notch, que se ha demostrado anteriormente que es importante en la regulación de las respuestas inmunitarias periféricas. La vía de señalización de Notch se expone en la publicación de la patente internacional nº WO98/20142.
Las BMP se fijan a dos tipos diferentes de receptores de serina-treonina cinasa, tipo I y tipo II. Como para los receptores de tipo I, las BMP se fijan al receptor de BMP tipo IA, al receptor de BMP tipo IB y al receptor de activina tipo I. Como para los receptores tipo II, las BMP se fijan al receptor de BMP tipo II, al receptor de activina tipo II y al receptor de activina tipo IIB. En los complejos receptor-ligando, los receptores tipo II fosforilan los receptores tipo I en el dominio GS (rico en restos de glicina, serina y treonina) para activar este último. Los receptores de tipo I activados fosforilan a la familia Smad, que transduce las señales del citoplasma en los núcleos. Smad1, Smad5 y posiblemente MADH6 son activados por los receptores de BMP, forman complejos heteroméricos con Smad4 y se transponen en el núcleo donde pueden activar la transcripción de varios genes. Smad6 y Smad7 son inhibidores Smad y pueden actuar como señales autocrinas de interrupción. La señalización de Smad producida por BMP regula por disminución la expresión del gen de expresión achaete/scute que se requiere para la expresión del ligando Delta de Notch. Tal como se indica en la Tabla 2 anteriormente, en Drosophila, Decapentaplégico (Dpp) es un homólogo de las BMP de mamíferos.
Vía de señalización Wingless/Wnt
Se ha examinado la función para la desregularización de la vía de señalización Wnt en la neumonía intersticial. Los genes Wnt son dianas de la vía HH y las proteínas Wnt son factores de crecimiento segregados que están implicados en la regulación de la proliferación y diferenciación de las células epiteliales en el pulmón durante el desarrollo embrionario. Se propone que la señalización de Wnt también puede regularse por incremento durante los procesos de reparación de las células epiteliales en el pulmón.
Dishevelled-1 (Dvl-1) es el homólogo murino del gen Dsh de la mosca y funciona para transmitir señales desde el receptor Wnt, Frizzled, hasta el citoplasma, donde regula la actividad de la cinasa de una serina/treonina cinasa bien conocida, GSK-3b. La sobre-expresión de Dsh en los epitelios de la mosca conduce a la activación oncogénica del epitelio aumentando la señalización de Wnt.
Una representación de esta vía se presenta en la Figura 3. Wingless (Wg), en Drosophila, y, en su homólogo vertebrado. Las vías de señalización Wnt regulan la proliferación celular. Wg y Wnt son factores de crecimiento segregados que están implicados en decisiones celulares de activación. El ligando Wg/Wnt se fija a las moléculas receptoras de la familia Frizzled (Fz) para iniciar una cascada de transducción de la señal que implica a la proteína citoplasmática Dishevelled (Dvl) (Sussman D.J. et al.). El número de registro en el GenBank para el ADNc de
Dvl-1 es U10115. El complejo ilustrado en la Figura 3 está presente en el citoplasma de la célula diana. Generalmente APC bloquea la señalización; sin embargo, en presencia de señalización procedente de Wnt, se libera \beta-catenina e interactúa con dos factores de transcripción - I.ef-l\cdotTCF-1 produciendo la expresión del gen diana. Los genes diana de Wnt incluyen En y por consiguiente indirectamente HH, c-myc y D1 de ciclina. Se apreciará que la señalización de Notch esté también regulada por la vía Wnt, ya que se ha observado que Dvl inhibe la señalización de Notch.
Inhibidores
La presente invención se refiere a la utilización de compuestos que inhiben o bloquean (antagonizan) la señalización Hedgehog. Se puede apreciar que dichos compuestos presentan el efecto de regular por disminución la expresión Hedgehog. Por comodidad dichos compuestos se pueden denominar en la presente memoria inhibidores o antagonistas.
La invención contempla que las mutaciones que producen la pérdida de la función normal de los reguladores de la vía de señalización Hedgehog o los reguladores de una vía que es una diana de la vía de señalización Hedgehog en los estados patológicos humanos en los que está implicada la infiltración de linfocitos o el fallo de un punto de comprobación en el ciclo celular. Para restaurar dicha actividad reguladora estaría por tanto indicada la genoterapia en el tratamiento de estos estados patológicos. Por otra parte, se contempla que impidiendo la expresión o inhibiendo la actividad de tales vías de señalización será útil en el tratamiento de los estados patológicos. Se contempla que la terapia de la cadena complementaria o la genoterapia podría aplicarse para regular negativamente dichas vías de señalización.
Se han identificado los antagonistas para cada componente de la vía de señalización.
Éstos se pueden resumir a continuación en la Tabla 3:
TABLA 3
3
HIP (para la proteína que interactúa con Hedgehog) es una glucoproteína de membrana que se fija por lo menos a las tres proteínas del mamífero Hedgehog con una afinidad comparable a la de Ptc. HIP parece atenuar la señalización Hedgehog como resultado de la fijación a las proteínas Hedgehog. Dicho bucle de retroalimentación negativa reguladora podría servir también para modular la respuesta a cualquier señal Hedgehog. El número de registro en el GenBank para HIP es AF116865.
Los alcaloides del Veratrum y los inhibidores distales de la biosíntesis del colesterol se han estudiado durante más de 30 años como potentes teratógenos capaces de producir ciclopia y otros defectos natales. Se ha demostrado que estos compuestos bloquean específicamente la vía de señalización Shh (Cooper et al.). Un ejemplo de dicho alcaloide de Veratrum es la ciclopamina (11-desoxojervina), esteroide aislado de la planta del desierto Veratrum californicum (Coventry et al.).
Frezzled es un antagonista segregado de la señalización de Wnt. Frezzled contiene un dominio similar a la supuesta zona de fijación de Wnt de la familia Frizzled de los receptores de transmembrana, pero carece de todos los dominios de transmembrana produciendo una supuesta proteína de fijación a Wnt segregada. Los números de registro en el GenBank para las secuencias de ADNc Frezzled de Xenopus, ratón y humanz son U68059, U68058 y U68057, respectivamente.
Cerberus es una proteína segregada y se ha observado que es un antagonista de las vías de señalización Wnt y BMP. El número de registro en el GenBank para el ADNc de Xenopus Cerberus es U64831.
WIF-1 (factor 1 inhibidor de Wnt) es una proteína segregada que se fija a las proteínas Wnt e inhibe sus actividades. Los números de registro en el GenBank para WIF-1 son: hombre, AF122922; ratón, AF122923; Xenopus, AF122924 y pez cebra, AF122925.
Noggin y Chordin se fijan a las BMP impidiendo de este modo la activación de su cascada de señalización.
Gremlin es una proteína segregada y se ha observado que es un antagonista de las vías de señalización de Wnt y BMP. Los números de registro en el GenBank para el ADNc de Gremlin son: Xenopus, AF045798; pollo, AF045799; hombre, AF045800 y ratón, AF045801.
Se ha observado que Xnr-3 es un antagonista de las vías de señalización de BMP.
Se ha observado que la follistatina inhibe otros aspectos de la actividad de BMP así como que actúa como una proteína que se fija a la activina.
Se apreciará asimismo que el propio antagonista pueda ser un componente de la vía de señalización Hedgehog. Ejemplos de dichos antagonistas incluyen los reguladores negativos de señalización de HH: Ptc, Cos2 y PKA.
En una forma de realización particularmente preferida se utiliza PKA. PKA ha estado implicado en el mecanismo de la transducción con señal Hh porque actúa para reprimir los genes diana Hh en las células disco de imagen que expresan Ci. La acción Ci como represor o activador de transcripción depende del tratamiento proteolítico dependiente de PKA, regulado por Hedgehog.
El AMP cíclico (AMPc) es un nucleótido que se genera a partir de ATP en respuesta al estímulo hormonal de los receptores superficiales de las células. AMPc actúa como una molécula de señalización activando la cinasa A; es hidrolizado a AMP por la fosfodiesterasa (PDE). Las concentraciones de AMPc afectan la escisión del codo y las concentraciones de TGF-\beta. En particular, cuando aumentan las concentraciones de AMPc, disminuyen las concentraciones de TGF-\beta y esto afectará, por ejemplo, a la fibrosis. En otra forma de realización de la invención se utilizan modificadores de AMPc. Dichos modificadores incluyen los inhibidores de PDE y los beta-agonistas como por ejemplo el agonista beta-adrenérgico. Se ha descubierto, por ejemplo, que la transcripción de ptc 1 puede estar provocada por agentes que activan la vía de transducción de la señal de AMPc.
Se introducen en las células ácidos nucleicos con cadena complementaria (preferentemente oligonucleótidos de 10 a 20 pares de bases) capaces de fijarse específicamente a las secuencias de control de expresión o el ARN (p. ej., mediante un vector vírico o un sistema de dispersión coloidal tal como un liposoma). El ácido nucleico con cadena complementaria se fija a la secuencia diana en la célula y evita la transcripción o traducción de la secuencia diana. El fosfotioato y el metilfosfato de los oligonucleótidos con cadena complementaria están contemplados por la invención para su utilización terapéutica. Los oligonucleótidos con cadena complementaria pueden ser modificados además por poli-L-lisina, polilisina de transferrina o grupos colesterol en su extremo 5'.
Asimismo están abarcados por la presente invención los productos de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos híbridos, anticuerpos injertados con CDR y fragmentos de fijación al antígeno de los mismos) y otras proteínas de fijación (tales como las identificadas en los ensayos anteriores). Las proteínas de fijación se pueden desarrollar utilizando enzimas naturales aisladas o recombinadas. Las proteínas de fijación son útiles, a su vez, para purificar enzimas recombinadas y naturales e identificar las células que producen dichas enzimas. Los análisis para la detección y cuantificación de proteínas en las células y en los fluidos pueden implicar una sola sustancia anticuerpo o múltiples sustancias anticuerpo en un formato de ensayo "sandwich" para determinar el análisis citológico de las concentraciones de proteína HH. Las proteínas de fijación son también útiles de manera manifiesta en interacciones (es decir, bloqueo, inhibición o estímulo) de modulación.
Los anticuerpos pueden ser generados administrando polipéptidos o fragmentos que contienen el epítopo a un animal, normalmente un conejo, utilizando protocolos de rutina. Ejemplos de dichas técnicas incluyen las de Kohler y Milstein.
Más generalmente, el antagonista puede ser seleccionado de polipéptidos y fragmentos de los mismos, péptidos lineales, péptidos cíclicos, compuestos sintéticos y naturales incluyendo los compuestos orgánicos o inorgánicos de peso molecular bajo. El antagonista puede proceder de un material biológico tal como un componente de la matriz extracelular.
Sustancias con polipéptidos, tales como Noggin o Chordin, pueden purificarse a partir de células de mamíferos, obtenidas por expresión recombinada en células huésped adecuadas u obtenerse comercialmente. Por otra parte, se pueden introducir por transfección construcciones de ácido nucleico que codifican los polipéptidos utilizando técnicas normalizadas o infección/transducción vírica.
Los inhibidores utilizados según la presente invención se pueden identificar convenientemente utilizando un procedimiento de cribado conveniente.
Un análisis para identificar dichos inhibidores puede implicar inmovilizar un componente de la vía oportuna, p. ej. HH, o una proteína de análisis, marcando de manera detectable el compañero de fijación no inmovilizado, incubando los compañeros de fijación conjuntamente y determinando la cantidad de marcador unido. El marcador unido indica que la proteína de análisis interactúa con el componente.
Otro tipo de análisis para identificar inhibidores implica inmovilizar un componente de la vía, p. ej. HH, o un fragmento del mismo sobre un soporte sólido recubierto (o impregnado con) un agente fluorescente, marcando una proteína de ensayo con un componente capaz de excitar al agente fluorescente, poniendo en contacto el componente inmovilizado con la proteína de ensayo marcada, detectando la emisión de luz por el agente fluorescente e identificando las proteínas interactuantes como proteínas de ensayo que producen la emisión de luz por el agente fluorescente. Como alternativa, puede inmovilizarse la supuesta proteína interactiva y el componente puede marcarse en el análisis.
Además, dichos ensayos para identificar inhibidores pueden implicar: transformar o transfectar células huésped apropiadas con una construcción de ADN que comprende un gen indicador bajo el control de un activador regulado por un factor de trascripción con un dominio de fijación al ADN y un dominio de activación; expresando en las células huésped una primera secuencia de ADN híbrido que codifica una primera fusión de parte o todos los componentes de la vía, p. ej. HH, Wnt o BMP y el dominio de fijación de ADN o el dominio de activación del factor de trascripción; expresando en las células huésped una segunda secuencia de ADN híbrido que codifica parte o toda la proteína que interactúa con dicho componente y el dominio de fijación al ADN o el dominio de activación del factor de trascripción que no está incorporado en la primera fusión; evaluando el efecto del compuesto de ensayo sobre la interacción entre dicho componente y la proteína interactiva detectando la fijación de la proteína interactiva a dicho componente en una célula huésped determinada midiendo la producción del producto del gen indicador en la célula huésped en presencia o ausencia del compuesto de ensayo; e identificando compuestos moduladores tales como los compuestos de ensayo que alteran la producción del producto del gen indicador en comparación con la producción del producto del gen indicador en ausencia del compuesto modulador. Actualmente se prefieren para su utilización en el ensayo un activador lexA para conducir la expresión del gen indicador, el gen indicador lacZ, un factor de trascripción que comprende el dominio de fijación del ADN de lexA y el dominio de transactivación GAL4 y las células huésped de levadura.
En una forma de realización particular descrita en relación con la señalización Hedgehog, la célula huésped apropiada se transforma o se transfecta con una construcción de ADN que comprende un gen indicador bajo el control del activador Ptc; expresando en dichas células una secuencia de ADN que codifica Hedgehog; evaluando el efecto de un compuesto de ensayo en la interacción entre HH y el activador Ptc en una célula huésped determinada midiendo la producción del producto del gen indicador en la célula huésped en ausencia y presencia del compuesto de ensayo; e identificando inhibidores como los compuestos de ensayo que reducen la producción del producto del gen indicador en comparación con la producción del producto del gen indicador en ausencia del compuesto de ensayo.
Se puede cribar la actividad como inhibidores en dichos ensayos de librerías combinatorias, péptidos y miméticos de péptidos, entidades químicas definidas, oligonucleótidos y bancos de productos naturales.
La presente invención se refiere asimismo a la utilización de derivados, variantes, fragmentos, análogos, homólogos y miméticos de los inhibidores mencionados anteriormente, incluyendo aquellos identificables utilizando los procedimientos de ensayo.
El término "derivado" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con los polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno (o más) restos de aminoácidos desde o hasta la secuencia con la condición que la proteína resultante, etc., posea la capacidad para antagonizar la acción de la vía de señalización.
El término "variante" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con los polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno (o más) restos de aminoácidos desde o hasta la secuencia con la condición que la proteína resultante, etc., posea la capacidad para antagonizar la acción de la vía de señalización.
El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con los polipéptidos de la presente invención, incluye una variante de polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma como parte pero no toda la secuencia de aminoácidos del polipéptido mencionado anteriormente y posee la capacidad para antagonizar la acción de la vía de señalización.
El término "análogo" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con los polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier péptidomimético, es decir, un compuesto químico que posee la capacidad de antagonizar la acción de la vía de señalización de una manera similar a la del polipéptido precursor.
El término "homólogo" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con los polipéptidos de la presente invención, incluye un polipéptido que tiene el mismo origen evolutivo que el polipéptido del paciente con la condición de que posea la capacidad de antagonizar la acción de la vía de señalización.
El término "mimético" tal como se utiliza en la presente invención en relación con los inhibidores de la presente invención, incluye un compuesto que posee también la capacidad para antagonizar la acción de la vía de señalización de una manera similar a la del compuesto precursor.
Más particularmente, el término "homólogo" abarca la identidad con respecto a la estructura y/o función que proporciona que el producto de expresión de la secuencia de nucleótidos resultantes tenga actividad inhibidora. Con respecto a la identidad (es decir similitud) de secuencia, preferentemente existe al menos el 75%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% de identidad de secuencia. Más preferentemente existe al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98%, de identidad de secuencia. Estos términos también abarcan las variaciones alélicas de las secuencias.
La identidad de secuencia con respecto a las secuencias se puede determinar mediante una simple comparación "pupila" (es decir una comparación estricta) de una o más de las secuencias con otra secuencia para ver si esta otra secuencia tiene, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la(s) secuencia(s).
La identidad relativa de la secuencia se puede determinar también mediante los programas de ordenador disponibles en el comercio que pueden calcular el % de identidad entre dos o más secuencias que utilizan algún algoritmo adecuado para determinar la identidad, utilizando por ejemplo parámetros por defecto. Un ejemplo típico de dicho programa de ordenador es CLUSTAL. Se emplea de manera ventajosa el algoritmo BLAST, con parámetros ajustados a valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe con detalle en http://WWW.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Los parámetros de búsqueda se definen a continuación, se pueden ajustar de forma ventajosa a los parámetros definidos por defecto.
De manera ventajosa, cuando se evalúa la "identidad sustancial" mediante BLAST equivale a las secuencias que son iguales a un valor de EXPECT de por lo menos aproximadamente 7, preferentemente por lo menos aproximadamente 9 y más preferentemente 10 o más. El umbral por defecto para EXPECT en la búsqueda de BLAST es normalmente 10.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es un algoritmo de búsqueda heurística empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx; estos programas adscriben significado a sus hallazgos utilizando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul (véase http://WWW.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) con unas pocas mejoras. Los programas BLAST fueron adaptados para la búsqueda de la similitud de secuencia, por ejemplo para identificar homólogos a una secuencia pregunta. Para una exposición de resultados básicos en la búsqueda de la similitud de las bases de datos de secuencias, véase Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6:119-129.
Los cinco programas BLAST disponibles en http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov realizan las tareas siguientes:
blastp - compara una secuencia pregunta de aminoácidos con una base de datos de la secuencia de proteínas.
blastn - compara una secuencia pregunta de nucleótidos con una base de datos de la secuencia de nucleótidos.
blastx - compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia pregunta de nucleótidos (ambas cadenas) con una base de datos de la secuencia de proteínas.
tblastn - compara una secuencia pregunta de proteínas con una base de datos de la secuencia de nucleótidos traducida de forma dinámica en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).
tblastx - compara las traducciones de seis marcos de una secuencia pregunta de nucleótidos con las traducciones de seis marcos de una base de datos de la secuencia de nucleótidos.
BLAST utiliza los siguientes parámetros de búsqueda:
HISTOGRAM - Presenta un histograma de puntuaciones para cada registro; por defecto es sí. (Véase el parámetro H en el Manual BLAST).
DESCRIPTIONS - Limita el número de descripciones cortas de las secuencias compatibles descritas para el número especificado; el límite por defecto es 100 descripciones. Véase el parámetro V en la página del manual).
EXPECT - Umbral del significado estadístico para describir las compatibilidades frente a las secuencias de la base de datos; el valor por defecto es 10, de modo que es de esperar que se obtengan 10 compatibilidades meramente por probabilidad, según el modelo estocástico de Karlin y Altschul (1990). Si el significado estadístico adscrito a una compatibilidad es mayor del umbral EXPECT, la compatibilidad no se describirá. Los umbrales de EXPECT menores son más restrictivos, lo que conduce a que se comuniquen compatibilidades con probabilidades menores. Los valores fraccionados son aceptables. (Véase el parámetro E en el Manual BLAST).
CUTOFF - Puntuación de corte para describir los pares de segmentos de alta puntuación. El valor por defecto se calcula a partir del valor EXPECT (véase anteriormente). Las HSP para una secuencia de la base de datos se describen solamente si el significado estadístico atribuido a ellas es al menos tan alto como se atribuiría a la HSP sola con una puntuación igual al valor CUTOFF. Los valores CUTOFF mayores son más restrictivos, lo que conduce a que se obtengan menos probabilidades de compatibilidades. (Véase el parámetro S en el Manual BLAST). Normalmente, los umbrales significativos se pueden tratar de manera más intuitiva utilizando EXPECT.
ALIGNMENTS - Limita las secuencias de la base de datos al número especificado para que se obtengan pares de segmento de alta puntuación (HSP); el límite por defecto es 50. Si aparecen más de estas secuencias de bases de datos al satisfacer el umbral con significado estadístico para la descripción (véase EXPECT y CUTOFF anteriormente), sólo se indican las compatibilidades atribuidas al significado estadístico mayor. (Véase el parámetro B en el Manual BLAST).
MATRIX - Especifica una matriz con puntuación alternativa para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz por defecto es BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992). Las diversas probabilidades alternativas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTITY. No está disponible ninguna matriz de puntuación alternativa para BLASTN; especificando la MATRIX directiva en los requisitos de BLASTN devuelve una respuesta errónea.
STRAND - Limita una búsqueda de TBLASTN para igualar la banda superior o inferior de las secuencias de la base de datos; o limita una búsqueda de BLASTN, BLASTX o TBLASTX para igualar los marcos de lectura en la banda superior o inferior de la secuencia pregunta.
FILTER - Segmentos de enmascaramiento de la secuencia pregunta que presentan baja complejidad de la composición, determinados por el programa SEG de Wooton y Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163, o los segmentos que están constituidos por repeticiones internas de periodicidad corta, determinadas por el programa XNU de Claverie y Status (1993) Computers and Chemistry 17:191-201, o, para BLASTN, mediante el programa DUST, de Tatusov y Lipman (véase http://WWW.ncbi.nln.nih.gov). La filtración puede eliminar informes estadísticamente significativos pero biológicamente no interesantes a partir de los resultados de blast (p. ej., choca contra las zonas ácidas, básicas o ricas en prolina comunes), dejando las zonas biológicamente más interesantes de la secuencia pregunta disponibles para la prueba de compatibilidad específica frente a las secuencias de la base de datos.
La secuencia de baja complejidad obtenida mediante un programa filtro se sustituye utilizando la letra "N" en la secuencia de nucleótidos (p. ej. "NNNNNNNNNNNNN") y la letra "X" en las secuencias de proteínas (p. ej., "XXXXXXXXX").
El filtrado se aplica únicamente a la secuencia pregunta (o a sus productos de traducción), no a las secuencias de la base de datos. El filtrado por defecto es DUST para BLASTN, SEG para otros programas.
No es frecuente de ninguna manera que SEG, XNU o ambos estén enmascarados cuando se aplican a las secuencias en SWISS-PROT, filtrando de este modo no es de esperar que siempre rinda un efecto. Además, en algunos casos, las secuencias están enmascaradas en su totalidad, lo que indica que el significado estadístico de algunas compatibilidades descritas frente a la secuencia pregunta no filtrada sería dudoso.
NCBI-gi - Da lugar a que los identificadores NCBI gi se deben presentar en el resultado, además del número de registro y/o de la denominación del locus.
Más preferentemente, las comparaciones de la secuencia se dirigen utilizando el algoritmo de búsqueda simple BLAST proporcionado en http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Otros procedimientos de programa de ordenador para determinar la identificación y la similitud entre las dos secuencias incluyen, sin limitarse a ellos, el paquete del programa GCG (Devereux et al. 1984 Nucleic Acids Research 12:387) y FASTA (Atschul et al. 1990 J. Molec. Biol. 403-410).
En algunos aspectos de la presente invención, no se utilizan penalizaciones por hueco cuando se determina la identidad de secuencia.
La presente invención comprende también la utilización de secuencias de nucleótidos que son complementarias con las secuencias presentadas en la presente memoria, o algún fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria con un fragmento de la misma entonces esta secuencia se puede utilizar como sonda para identificar secuencias activadoras similares en otros organismos.
La presente invención comprende asimismo la utilización de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier fragmento o derivado de las mismas.
Hibridación significa un "proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante emparejamiento de bases" (Coombs J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York, NY) así como el proceso de amplificación tal como se realiza en las tecnologías de la reacción en cadena de polimerasa como describe Dieffenbach C.W. y G.S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY).
También está incluida dentro del alcance de la presente invención la utilización de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria en condiciones de restricción intermedia a máxima. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (T_{m}) del complejo que se une al ácido nucleico, como se da a conocer en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, San Diego, CA) y confiere una "restricción" definida como se explicó anteriormente.
La restricción máxima tiene lugar normalmente a aproximadamente T_{m}-5ºC (5ºC por debajo de la T_{m} de la sonda); la restricción alta entre aproximadamente 5ºC y 10ºC por debajo de la T_{m}; la restricción intermedia entre aproximadamente 10ºC y 20ºC por debajo de T_{m}; y la restricción baja entre aproximadamente 20ºC y 25ºC por debajo de la T_{m}. Como comprenderán los expertos en la materia, una hibridación con restricción máxima se puede utilizar para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas mientras que una hibridación con restricción intermedia (o baja) se puede utilizar para identificar o detectar secuencias de nucleótidos similares o afines.
En un aspecto preferido, la presente invención abarca la utilización de secuencias de nucleótidos que se pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención en condiciones de restricción (p. ej. 65ºC y 0,1 \times SSC).
La presente invención abarca asimismo la utilización de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar secuencias que son complementarias con las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier fragmento o derivado de las mismas. Asimismo, la presente invención abarca la utilización de secuencias de nucleótidos que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridarse con la secuencia de la presente invención. Estos tipos de secuencias de nucleótidos son ejemplos de secuencias variantes de nucleótidos.
A este respecto, el término "variante" abarca las secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria. Preferentemente, sin embargo, el término "variante" abarca las secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridarse en condiciones restrictivas (p. ej. 65ºC y 0,1 \times SSC; {1 \times SSC = NaCl 0,15 M, citrato Na_{3} 0,015, pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria.
Animales transgénicos
Se describen animales transgénicos que son capaces de expresar o sobreexpresar al menos un antagonista útil en la presente invención. Preferentemente el animal expresa o sobreexpresa HIP, Frezzled-1, Noggin (Ngg) y/o WIF-1.
Los animales transgénicos pueden ser capaces de expresar o sobreexpresar por lo menos un polipéptido que es un componente de la vía de señalización Hedgehog o un componente de una vía que es una diana de la vía de señalización Hedgehog, tal como la vía de señalización Wnt o BMP. Preferentemente el animal expresa o sobreexpresa HH (más preferentemente Shh) y/o Dvl-1.
El animal transgénico normalmente es un vertebrado, más preferentemente un roedor, tal como una rata o un ratón, pero también incluye otros animales tales como el hombre, cabra, cerdo o vaca, etc.
Dichos animales transgénicos son útiles como modelos animales de la enfermedad y en ensayos de cribado para nuevos compuestos útiles. Expresando específicamente uno o más polipéptidos, tal como se definió anteriormente, se puede estudiar el efecto de dichos polipéptidos sobre el desarrollo de la enfermedad. Además, se pueden probar terapias incluyendo la genoterapia y varios fármacos en animales transgénicos. Los procedimientos para la producción de animales transgénicos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, existen varias vías posibles para la introducción de genes en los embriones. Éstas incluyen (i) la transfección directa o la infección retrovírica de células madre embrionarias seguida de la introducción de estas células en un embrión en la fase de blastocisto del desarrollo; (ii) infección retrovírica de embriones prematuros; y (iii) microinyección directa de ADN en los zigotos de las células embrionarias prematuras.
Se describen también las líneas celulares estables útiles como modelos de la enfermedad para ensayo o tratamiento.
Una línea celular estable contendrá un gen o genes recombinados, también conocidos en la presente memoria como transgén, que codifica uno o más inhibidores o componentes de una vía de señalización Hedgehog.
Preferentemente el transgén es HH (más preferentemente Shh), HIP, WIF-1, Fzb-1, Ngg y/o Dvl-1. Una línea celular que contiene un transgén, como el descrito en la presente memoria, se prepara introduciendo el transgén en una línea celular seleccionada según uno de entre varios procedimientos conocidos en la técnica para introducir un gen extraño en una célula.
Tal como se ha descrito también anteriormente, las secuencias que codifican los inhibidores y componentes de las vías de señalización, descritas en la presente memoria, se unen funcionalmente a las secuencias de control, incluyendo activadores/potenciadotes y otras señales de regulación de la expresión.
El activador se selecciona normalmente de entre activadores que son funcionales en células de mamíferos, aunque se pueden utilizar activadores procarióticos y activadores funcionales en otras células eucarióticas. El activador procede normalmente de secuencias del activador de genes víricos o eucarióticos. Por ejemplo, puede ser un activador procedente del genoma de una célula en el que debe tener lugar la expresión. Con respecto a los activadores eucarióticos, pueden ser activadores que funcionan de una manera omnipresente (tales como los activadores de a-actina, b-actina, tubulina) o, alternativamente, de una manera específica del tejido (tales como los activadores de los genes para la piruvato cinasa). Se prefieren de forma particular los activadores específicos del tejido para linfocitos, células dendríticas, piel, células del cerebro y células epiteliales o dentro del ojo, por ejemplo los activadores CD2, CD11c, queratina 14, Wnt-1 y rodopsina respectivamente. Preferentemente se utiliza el activador SPC de las células epiteliales. Éstos pueden ser activadores que responden a estímulos específicos, por ejemplo activadores que se unen a receptores de hormonas estereoideas. Se pueden también utilizar activadores víricos, por ejemplo el activador con repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el activador LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) o el activador IE del citomegalovirus humano (CMV).
También puede ser ventajoso para los activadores que sean inducibles, de modo que los niveles de expresión del gen heterólogo se puedan regular durante el periodo de vida de la célula. Inducible significa que se puedan regular los niveles de la expresión obtenidos utilizando el activador.
Además, algunos de estos activadores pueden modificarse por adición de otras secuencias reguladoras, por ejemplo las secuencias del potenciador. Se pueden utilizar también activadores híbridos que comprenden elementos de la secuencia de dos o más activadores diferentes descritos anteriormente.
Utilizaciones terapéuticas
Tal como se ha mencionado anteriormente, en muchos tejidos, tales como los de pulmón y riñón, la inflamación puede conducir a enfermedades crónicas. Por ejemplo, la neumonía crónica implica la remodelación del tejido en presencia de células inflamatorias, ejemplos son el enfisema y la neumonía intersticial (ILD). El tejido enfermo está asociado con la hiperplasia de las células epiteliales que conducen a la fibrosis y a la cicatrización patológica. Existe una infiltración de células mononucleares acompañante en puntos locales de la inflamación y la producción de respuestas inmunitarias reactivas con los autoantígenos. Similar patología se observa también en el rechazo crónico del tejido del trasplante, incluyendo los órganos trasplantados.
Hedgehog es importante en la regulación del crecimiento y en la diferenciación de las células epiteliales. Desempeña una función en la formación del notocordio, extremidades, intestinos, pulmones, piel, etc. La morfogénesis ramificada tiene lugar mediante la producción de factores de crecimiento Wnt y BMP. Se une a su receptor Ptc y Smo. Las mutaciones pueden conducir al síndrome de los carcinomas congénitos (NBCCS) con trastorno autosómico humano que se caracteriza por el desarrollo de anomalías y una gran predisposición para varias formas de cáncer principalmente los carcinomas de las células basales (BCC) muy frecuentes.
Las BMP son miembros de la superfamilia TGF-\beta. Mientras que está muy demostrado una función para TGF-\beta1 en la mediación de la fibrosis pulmonar, anteriormente BMP-4 ha estado implicado solamente en la osteopatía fibrótica.
Se proporciona ahora un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales y de la fibrosis pulmonar, particularmente en el pulmón y en el riñón. Más particularmente, las enfermedades que se pueden tratar incluyen el síndrome disneico agudo del adulto; los trastornos obstructivos crónicos de las vías respiratorias/neumonía obstructiva crónica que incluyen el asma, el enfisema y la bronquitis crónica; la atelectasia; la neumonía laboral que incluyen la silicosis; las neumonías con hipersensibilidad incluyendo la neumonitis con hipersensibilidad; las neumonías intersticiales idiopáticas incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática, la neumonía intersticial común, la neumonía intesticial descamante y la neumonía intersticial aguda; y la fibrosis pleural. Más detalles de dichas enfermedades y de las citadas anteriormente se pueden encontrar en The Merck Manual (17ª edición), publicada por Merck Research Laboratories, N.J., USA.
La presente invención también es útil en el tratamiento de los trastornos inmunitarios tales como las enfermedades autoinmunitarias o el rechazo del trasplante tal como el rechazo del alotrasplante.
Ejemplos de trastornos que se pueden tratar incluyen un grupo denominado frecuentemente enfermedades autoinmunitarias. El espectro de las enfermedades autoinmunitarias varía desde las enfermedades específicas de un órgano (tales como la tiroiditis, la insulitis, la esclerosis múltiple, la iridociclitis, la uveítis, la orquitis, la hepatitis, la enfermedad de Addison, la miastenia grave) a las enfermedades generalizadas tales como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso. Otros trastornos incluyen la hiperactividad inmunitaria, tales como las reacciones alérgicas.
Con más detalle: las enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano incluyen la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus dependiente de insulina, varias formas de anemia (aplásica, hemolítica), la hepatitis autoinmunitaria, tiroiditis, insulitis, iridociclitis, escleritis, uveítis, orquitis, miastemia grave, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedades inflamatorias de los intestinos (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa).
Las enfermedades autoinmunitarias generalizadas incluyen: artritis reumatoide, artritis juvenil, escleroderma y esclerosis generalizada, síndrome de Sjogren, síndrome del tejido conectivo indiferenciado, síndrome por antifosfolípidos, diferentes formas de vasculitis (poliarteritis nodular, granulomatosis alérgica y angitis, granulomatosis de Wegner, enfermedad de Kawasaki, vasculitis con hipersensibilidad, púrpura de Henoch-Schoenlein, síndrome de Behcet, arteritis de Takayasu, arteritis de las células de Giant, tromboangitis obliterante), lupus eritematoso, polimialgia reumática, crioglubulinemia esencial (mixta), psoriasis común y artritis psoriásica, fascitis difusa con o sin eosinofilia, polimiositis y otras miopatías idiopáticas inflamatorias, paniculitis recidivante, policondritis recidivante, granulomatosis linfomatoidea, eritema nodular, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, diferentes formas de dermatitis inflamatoria.
Una lista más exhaustiva de trastorno incluye: reacciones inmunitarias indeseables e inflamación incluyendo artritis, que incluye la artritis reumatoide, la inflamación con hipersensibilidad asociada, reacciones alérgicas, asma, lupus eritematoso generalizado, enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunitarias, inflamación con ateroesclerosis asociada, arterioesclerosis, cardiopatía aterosclerótica, lesión por reperfusión, paro cardíaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome disneico agudo u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación con úlcera péptica asociada, colitis ulcerosa y otras enfermedades del aparato digestivo, fibrosis hepática, cirrosis hepáticas u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, periodontitis u otras enfermedades dentales, orquitis o epidídimo-orquitis, infertilidad, traumatismo orquídeo u otras enfermedades testiculares inmuno-relacionadas, disfunción de la placenta, insuficiencia de la placenta, aborto recidivante, eclamsia, pre-eclamsia y otras enfermedades ginecológicas inmunitarias y/o relacionadas con la inflamación, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, p. ej., retinitis o edema cistoide macular, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentaria, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondo del ojo, componentes inflamatorios del trauma ocular, inflamación ocular producida por infección, vítreo-retinopatías proliferantes, neuropatía óptica con isquemia aguda, deformidad cicatricial, p. ej. tras la operación de glaucoma con filtración, reacción inmunitaria y/o de inflamación contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas inmunitarias e inflamatorias relacionadas, inflamación con enfermedades autoinmunitarias asociadas o enfermedades o trastornos en los que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro órgano, sería beneficiosa la supresión inmunitaria y/o de la inflamación, enfermedad de Parkinson, complicaciones y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el SIDA, encefalopatía compleja relacionada con el VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, estados o trastornos degenerativos de SNC, componentes inflamatorios de apoplejías, síndrome post-polio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, pan-encefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastemia grave, cerebro pseudo-tumoral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de la compresión del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares y enfermedades inmunitarias e inflamatorias relacionadas, estados o trastornos del sistema nervioso central y periférico, inflamación post-traumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía del órgano, complicaciones inflamatorias y/o inmunitarias y efectos secundarios de la genoterapia, p. ej., debido a la infección con un portador vírico, o inflamación con SIDA asociado, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferantes por monocitos o leucocitos, p. ej. leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o el tratamiento del rechazo del trasplante en los casos de trasplante de células naturales o artificiales, tejido y órganos tales como córnea, médula ósea, órganos, cristalino, nódulos sinoauriculares, tejido cutáneo natural o artificial.
Se ha descubierto ahora que la utilización de antagonistas de señalización Hedgehog puede prevenir y/o activar la mejoría de las enfermedades mencionadas anteriormente.
Expresión de vectores y células huésped
Se describen vectores que comprenden un polinucleótido útil en la presente invención, así como las células huésped que se modifican genéticamente con dichos vectores y la producción de polipéptidos útiles en la presente invención mediante dichas técnicas.
Para la producción recombinada, se pueden modificar genéticamente células huésped para incorporar sistemas de expresión o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótidos en la célula huésped se puede efectuar por los procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio habituales, tales como Davis et al. y Sambrook et al., como por ejemplo la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transvección, la microinyección, la transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, masa de raspadura, introducción balística e infección.
Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen las células bacterianas, tales como estreptococos, estafilococos, E. coli, estreptomicetos y células de Bacillus subtilis; células de hongos, tales como las células de levadura y las células de Aspergillus; células de insectos tales como Drosophila S2 y células de Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales.
Se puede utilizar una gran variedad de sistemas de expresión para producir un polipéptido útil en la presente invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus de vacuna, adenovirus, virus de viruela, virus de pseudorrabia y retrovirus y vectores derivados de combinaciones de éstos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener zonas de control que regulan así como engendran expresión. En general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped se puede utilizar para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las indicadas en Sambrook et al.
Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplasmático o dentro del medio extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinados por procedimientos bien conocidos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía en fosfocelulosa, la cromatografía por interacción hidrófoba, la cromatografía por afinidad, la cromatografía en hidroxilapatito y la cromatografía en lectina. Para purificación se emplea más preferentemente la cromatografía líquida de alto rendimiento. Se pueden emplear técnicas bien conocidas para el enrollamiento de las proteínas al generar la conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante el aislamiento y/o la purificación.
Procedimientos de administración
En la presente invención se puede administrar el polinucleótido a una población de células diana, ya sea ex vivo o in vivo, mediante cualquier vehículo adecuado de administración génica.
Ésta incluye pero no está limitada a, ADN, formulado en complejos de lípidos o proteínas o administrada en forma de ADN desnudo por inyección o administración biolística, virus tales como retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus de vacuna, virus adenoasociados. El GDV se puede ser diseñado por una persona normalmente experta en la técnica de la tecnología del ADN recombinado y de la expresión génica para expresar la proteína de fusión a niveles apropiados y con la especificidad celular demandada por una aplicación determinada. Como es bien conocido en la técnica, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un medio a otro. Según la presente invención, y a título de ejemplo, algunos vectores utilizados en la técnica del ADN recombinado, tales como un segmento de ADN, (como por ejemplo un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo), que debe ser transferido a la célula diana. Opcionalmente, una vez dentro de la célula diana, el vector puede servir entonces para mantener el ADN heterólogo dentro de la célula y puede actuar como unidad de replicación de ADN. Ejemplos de vectores utilizados en las técnicas de ADN recombinado incluyen plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.
El vector se puede administrar por técnicas víricas o no víricas.
Los sistemas de administración no vírica incluyen pero no se limitan a los procedimientos de transfección del ADN. En esta memoria, la transfección incluye un procedimiento que utiliza un vector no vírico para administrar un gen a una célula diana de mamífero.
Los procedimientos típicos de transfección incluyen electroporación, biolística del ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfóteros faciales catiónicos mediados por agentes catiónicos (CFA) (Nature Biotechnology 1996 14; 556), cationes multivalentes como por ejemplo espermina, lípidos catiónicos o polilisina, complejos de 1,2-bis (oleoiloxi)-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP)-colesterol (Wolff y Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16: 421) y combinaciones de los mismos.
Los sistemas de administración vírica incluyen pero no se limitan al vector de adenovirus, un vector vírico adenoasociado (AAV), un vector vírico del herpes, un vector retrovírico, un vector lentivírico o un vector baculovírico.
Ejemplos de retrovirus incluyen pero no se limitan a: virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus del tumor mamario del ratón (MMTV), virus del sarcoma de Rous (RSV), virus del sarcoma de Fujinami (FuSV), virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), virus del sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), virus de la leucemia murina de Abelson (A-MLV), virus-29 de la mielocitomatosis aviar (MC29) y virus de la eritroblastosis aviar (AEV).
Una lista detallada de retrovirus puede hallarse en Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus págs. 758-763).
Se prefieren en particular los adenovirus y los virus adenoasociados que presentan buena especificidad para las células epiteliales.
Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de administración ex vivo, que incluyen pero no se limitan a los procedimientos de transfección de ADN tales como electroporación, biolística del ADN, transfección mediada por lípidos y transfección mediada por ADN compactado.
Por tanto, los vectores de ácidos nucleicos tales como los descritos anteriormente pueden ser capaces de administrarse de manera preferencial a la célula diana. Por ejemplo en el caso de un vector retrovírico, la proteína con envoltura retrovírica puede ser capaz de dirigir el vector a un determinado tipo o tipos de células. Con este objeto, la proteína con envoltura puede ser una proteína con envoltura modificada adaptada para que presente una capacidad de direccionamiento específica, o puede ser una proteína con envoltura seleccionada procedente de una fuente vírica o retrovírica y con la capacidad de direccionamiento deseado.
Preferentemente, el ácido nucleico en un vector está funcionalmente ligado a una secuencia de control de expresión capaz de producir la expresión preferencial de la proteína de fusión en la célula diana. La secuencia de control de expresión puede ser, por ejemplo, un activador o potenciador que sea preferencialmente activo en determinados tipos de células incluyendo la célula diana, o un activador o potenciador que sea preferencialmente activo en determinadas condiciones.
El término "activador" se utiliza en el sentido normal de la técnica, p. ej. un punto de unión de ARN polimerasa en la teoría de Jacob-Monod de expresión génica.
El término "potenciador" incluye una secuencia de ADN que se fija a otros componentes de la proteína del complejo de iniciación de la transcripción y de este modo facilita la iniciación o transcripción dirigida por su activador asociado.
Preferentemente, los activadores de la presente invención son específicos del tejido. Esto es, son capaces de conducir la transcripción de un ácido nucleico en un tejido mientras que permanece "imperceptible" en su mayor parte en otros tipos de tejido. Un activador preferido en particular es el activador de las células epiteliales.
La expresión "tejido específico" significa un activador que no está limitado en su actividad a un solo tipo de tejido pero que no obstante presenta selectividad por el hecho de que puedan ser activos en un grupo de tejidos y menos activos o imperceptible en otro grupo.
Administración
Los compuestos capaces de afectar un componente de la vía de señalización de la familia Hedgehog para su utilización en terapia se formulan normalmente para la administración a pacientes con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. La formulación dependerá de la naturaleza del compuesto identificado y de la vía de administración pero normalmente se pueden formular para administración tópica, parenteral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalación intranasal, inhalación pulmonar, administración intradérmica o intra-auricular. El compuesto se puede utilizar en forma inyectable. Se puede mezclar, por lo tanto, con cualquier vehículo que sea farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, preferentemente para una inyección directa en el punto que se debe tratar, aunque se puede administrar de forma generalizada.
El vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, soluciones salinas isotónicas estériles u otras soluciones isotónicas tales como la solución salina tamponada con fosfato. Los compuestos de la presente invención se pueden mezclar con cual(es)quier(a) aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) de solubilización adecuado(s). Se prefiere también formular el compuesto en una forma activa por vía oral.
En general, una dosis oral o intravenosa diaria terapéuticamente eficaz de los compuestos de la invención, incluyendo los compuestos de fórmula (I) y sus sales, está comprendida probablemente en el intervalo entre 0,01 y 50 mg/kg de peso corporal del paciente que se debe tratar, preferentemente entre 0,1 y 20 mg/kg. Los compuestos de fórmula (I) y sus sales se pueden administrar por infusión intravenosa, a una dosis que está comprendida probablemente en el intervalo entre 0,001 y 10 mg/kg/h.
Se pueden administrar comprimidos o cápsulas de los compuestos uno a uno o dos o más a la vez, como resulte apropiado. También es posible administrar los compuestos en formulaciones de liberación lenta.
Normalmente, el médico de familia determinará la dosis real que sea la más adecuada para cada paciente y variará con la edad, el peso y la respuesta de cada paciente. Las dosis anteriores son ejemplos del caso medio. Pueden, por lo tanto, ser ejemplos individuales en los que se consideran los intervalos mayores o menores de dosificación y tales están dentro del alcance de la presente invención.
Por otra parte, los compuestos de la invención se pueden administrar por inhalación o en forma de supositorio u óvulo vaginal, o se pueden aplicar tópicamente en forma de loción, solución, crema, pomada o polvos de espolvorear. Un medio alternativo de administración transdérmica es mediante utilización de un parche dérmico. Por ejemplo, se pueden incorporar a una crema compuesta por una emulsión acuosa de polietilenglicoles o de parafina líquida. Se pueden incorporar también a una concentración entre 1 y 10% en peso, en una pomada compuesta por una cera blanca o una base de parafina blanca blanda junto con estabilizantes y conservantes según se necesite.
Para algunas aplicaciones, preferentemente las composiciones se deben administrar por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos bien solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones conteniendo agentes potenciadotes de sabor o
colorantes.
Las composiciones (así como los compuestos solos), se pueden inyectar también por vía parenteral, por ejemplo por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. En este caso, las composiciones comprenderán un vehículo o diluyente adecuado.
Para la administración parenteral, las composiciones se utilizan mejor en forma de solución acuosa esterilizada que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o monosacáridos suficientes para preparar la solución isotónica con la sangre.
Para la administración bucal o sublingual, las composiciones se pueden administrar en forma de comprimidos o pastillas que se pueden formular de forma convencional.
Para la administración oral, parenteral, bucal y sublingual a personas (tales como pacientes), la concentración de dosificación diaria de los compuestos de la presente invención y de sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables normalmente puede estar comprendida entre 10 y 500 mg (en una sola dosis o en dosis divididas). Así pues, y a título de ejemplo, los comprimidos o las cápsulas pueden contener de 5 a 100 mg de compuesto activo para la administración en forma individual, o dos o más a la vez, según sea apropiado. Como se indicó anteriormente el médico de familia determinará la dosificación real que sea más adecuada para cada paciente y ésta variará con la edad, peso y respuesta de cada paciente. Debe observarse que mientras que las dosificaciones mencionadas anteriormente son ejemplos del caso medio, desde luego, pueden existir casos individuales en los que se consideren intervalos de dosificación mayores o menores y tales intervalos de dosificación están comprendidos dentro del alcance de la presente
invención.
Las vías de administración y las dosificaciones descritas están destinadas únicamente a modo de guía ya que un especialista experto será capaz de determinar fácilmente la vía de administración óptima y la dosis para cualquier paciente en particular dependiendo, por ejemplo, de la edad, el peso y la enfermedad del paciente.
El término tratamiento o terapia tal como se utiliza en la presente memoria debería considerarse que abarca las aplicaciones de diagnóstico y profilácticas.
La utilización de la presente invención incluye las aplicaciones tanto humanas como en veterinaria.
Tal como se utiliza en la presente memoria los términos proteína y polipéptido y péptido puede suponerse que son sinónimos, utilizándose proteína meramente en sentido general para indicar una secuencia de aminoácidos relativamente más larga que la presente en un polipéptido y siendo utilizado polipéptido meramente en sentido general para indicar una secuencia de aminoácidos relativamente más larga que la presente en un péptido. En general, por facilidad de referencia únicamente nos referiremos simplemente al término polipéptido.
Se describe a continuación la invención con mayor detalle en relación con los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión SPC-Shh
Se construyó el vector SPC-Shh de ratón mostrado en la Figura 5 a partir de un vector de expresión precursor que se preparó de la forma siguiente. El vector precursor mostrado en la Figura 4 contiene un eje central de pUC18 con un gen con resistencia a la ampicilina, una secuencia de 3,7 kb que contiene la zona del activador SPC humano, un punto de clonación múltiple (MCS), un intrón T pequeño de SV40 y una secuencia de 0,4 kb que contiene un punto de poli(A) adición y con codones de terminación en los tres marcos de lectura (Korfhagen et al; Development 1997). La secuencia de ADNc que codifica el Shh de ratón se clonó en el MCS.
Se prepararon vectores adicionales incluyendo SPC-HIP, SPC-WIF-1, SPC-Dvl-1 clonando ADNc murinos para HIP, WIF-1, Dvl-1 en el MCS del vector de expresión SPC.
Ejemplo 2 Aumento de expresión de Ptc en las células epiteliales del pulmón de pacientes humanos con alveolitis idiopática fibrosa (IFA conocida también como CFA) en un modelo murino de fibrosis pulmonar intersticial (IPF)
Fig. 6C
Se trataron por vía intratraqueal ratones BALB/c con 50 \mug de FITC disuelto en solución salina tamponada fisiológica (PBS). Tres meses después se sacrificaron los ratones, se extrajeron los pulmones, se fijaron en formalina tamponada al 4% y se empaparon en parafina. Se colocaron 5 \mum de las secciones del tejido pulmonar en cubreobjetos recubiertos con TESPA y se examinó la expresión de la expresión del gen Ptc por hibridación in situ (ISH) con ARN de cadena complementaria.
Se hibridaron las secciones con sondas de ARN de cadena complementaria con digoxigenina, específicas para Ptc1 murino a 65ºC. La sonda fijada se detectó mediante anti-digoxigenina Fab de cabra conjugada con fosfatasa alcalina y se revelaron las secciones utilizando NBT y BCIP como sustrato. Se observó el aumento de expresión de Ptc en las células epiteliales del pulmón en un modelo murino de IPF. La expresión de Ptc se restringió solamente a aquellas áreas que presentan alteración. Se observó aumento de expresión de Ptc a las 24 horas de FITC por vía i.t.y se mantuvo durante por lo menos 6 meses.
Figs. 6 A y B
Tejidos de pulmón del archivo empapados en parafina de pacientes humanos diagnosticados de IFA o pacientes de referencia con tejido de pulmón sano se seccionaron en 5 \mum y se colocaron en portaobjetos recubiertos con TESPA. Se analizó a continuación la expresión génica de Ptc de los portas por hibridación in situ con ARN de cadena complementaria (véase anteriormente). Se observó aumento de expresión de Ptc en las células epiteliales del pulmón.
Ejemplo 3 La sobreexpresión de Shh conduce a la hiperplasia de las células epiteliales y a la fibrosis pulmonar Figuras 7 a 9
Se inyectaron ratones BALB/c por vía i.t. con (i) solución salina sola, (ii) 20 \mug de plásmido SPC disuelto en solución salina o (iii) 20 \mug de ADN del plásmido SPC-Shh disuelto en solución salina el día 0 y el día 5. El plásmido SPC proporciona expresión específica del tejido de un gen deseado ya que contiene la secuencia de activador de la proteína C tensioactivo específico para la célula epitelial del pulmón (es decir SPC). Se sacrificaron los ratones el día 12 y se extrajeron los pulmones el día 35 y se colocaron en formalina tamponada al 4%.
Se colocaron en portaobjetos recubiertos con poli-Li-lisina secciones de 5 \mum de tejido pulmonar (Figs. 7 y 8) o de tráquea (Fig. 9) de cada grupo en cada uno de los dos puntos de tiempo y se tiñeron utilizando hematoxilina y colorante histoquímico eosina (H & E).
Los grupos contenían:
Día 12 PBS (2 ratones), SPC (2 ratones) y SPC-shh (2 ratones)
Día 35 PBS (3 ratones), SPC (3 ratones) y SPC-shh (3 ratones)
Se analizó además la producción de colágeno en los portaobjetos el día 35 en el grupo de tratamiento utilizando tinte histoquímico Masons-trichrome. Este tipo de tinte se utilizó de forma rutinaria para teñir las fibras de colágeno en las muestras de tejido que se vuelven verdes. El aumento de las concentraciones de colágeno que se tiñe se podría identificar en el tejido pulmonar de los ratones tratados con SPC-Shh en comparación con las referencias.
Se analizó asimismo la hiperplasia potencial de la célula caliciforme en los portaobjetos del grupo de tratamiento del día 35 utilizando tinte histoquímico ácido periódico-schiff (PAS). Utilizando este tinte, las células que generan mucinas se tiñen de un color rosa intenso mientras que las cepas epiteliales de azul claro. Se observó un aumento del número de células caliciformes en el tejido pulmonar de los ratones con SPC-Shh (es decir células rosa) y aumento de secreción mucosa en las vías respiratorias. El aumento del número de células caliciformes se observó solamente en las vías respiratorias que presentan síntomas de hiperplasia del epitelio. Las vías respiratorias normales en los ratones con SPC-Shh eran equivalentes a las de los ratones de referencia.
Los portaobjetos de los grupos de tratamiento del día 12 y del día 35 se tiñeron para un marcador de índice de proliferación, Ki-67, para aportar pruebas de que los epitelios pulmonares de los ratones SPC-Shh eran activamente proliferantes. Los portaobjetos de los tres grupos de tratamiento se tiñeron con un anticuerpo específico para el antígeno Ki-67 que marca las células en la fase S del ciclo celular. Hubo un aumento en el número de células con Ki-67 + ve en el epitelio pulmonar de los ratones tratados con SPC-Shh en comparación con el epitelio de los ratones de referencia.
Ejemplo 4 Las células epiteliales expresan concentraciones elevadas de Shh tras la alteración con FITC
Se trataron ratones por vía intratraqueal con el hapteno isotiocianato de fluoresceína. Siete días después se extrajeron los pulmones y se fijaron en formalina. Se cortaron secciones y se tiñeron para Shh por inmunohistoquímica. Las Figs. 10A y 10B presentan la expresión de Shh en el pulmón de los ratones tratados con FITC, mientras que la Fig. 10C presenta la coloración de Shh observada en el pulmón de referencia. Shh podría detectarse en las células epiteliales, y se detectó una concentración mayor de Shh en una población de células basales en el intersticio pulmonar consistente en morfología con fibroblastos.
Ejemplo 5 Las células epiteliales expresan concentraciones elevadas de Shh tras la alteración con FITC
Se trataron ratones por vía intratraqueal con el hapteno isotiocianato de fluoresceína. Un mes después se extrajeron los pulmones y se fijaron en formalina. Se cortaron secciones y se tiñeron para Shh por inmunohistoquímica. Las Figs. 11A y 11B presentan la expresión de Shh en dos secciones diferentes de pulmón de los ratones tratados con FITC, mientras que las Figs. 11C y 11D presentan la coloración de Shh observada en el pulmón de referencia. Shh podría detectarse a una concentración mayor en las células epiteliales que en una población de células basales en el intersticio pulmonar.
Ejemplo 6 Las células epiteliales expresan concentraciones elevadas de Ptc tras la alteración con FITC
Se trataron ratones por vía intratraqueal con el hapteno isotiocianato de fluoresceína. Siete días después se extrajeron los pulmones y se fijaron en formalina. Se cortaron secciones y se tiñeron para Shh por inmunohistoquímica. La Fig. 12A presenta la expresión de Ptc en el pulmón de los ratones tratados con FITC, mientras que la Fig. 12B presenta la coloración de Ptc observada en el pulmón de referencia. Ptc podría detectarse en las células epiteliales y se detectó una concentración mayor de Ptc en los leucocitos de infiltración encontrados en el intersticio pulmonar.
Ejemplo 7 Tinción de Shh y Ptc en material de biopsia de pulmón humano con CFA
Se seccionó material del archivo de un paciente de CFA y se tiñó por inmunohistoquímica para la presencia de Shh-N (proteína bioactiva) y Ptc. Las Figs. 13A a C presentan la tinción para Shh y las Figs. 13D a F presentan la expresión de Ptc. Cada Fig. representa una sección en serie tomada en la misma pieza de pulmón a 10\times. Las células dentro del intersticio de las vías respiratorias y del espacio alveolar contienen leucocitos y éstos se tiñen fuertemente por Ptc.
Ejemplo 8 Tinción de Shh y Ptc en material de biopsia de pulmón humano con CFA
Se seccionó material del archivo de un paciente de CFA y se tiñó por inmunohistoquímica para la presencia de Shh-N (proteína bioactiva) y Ptc. Las Figs. 14A y B presentan la tinción para Shh y las Figs. 14C y D presentan la expresión de Ptc. Las Figs. 14 A y C representan una sección en serie tomada en la misma pieza de pulmón a 10\times, mientras que las Figs 14B y 14 D son vistas con 40\times tomadas en la parte inferior de la sección. Las células dentro de la luz de las vías respiratorias y del espacio alveolar contienen leucocitos y éstos se tiñen fuertemente por Ptc.
Ejemplo 9 Tinción de Shh y Ptc en material de biopsia de pulmón humano con CFA
Se seccionó material del archivo de un paciente de CFA y se tiñó por inmunohistoquímica para la presencia de Shh-N (proteína bioactiva) y Ptc. Las Figs. 15A y B presentan la tinción para Shh y las Figs. 15C y D presentan la expresión de Ptc. Las Figs. 15 A y C representan secciones en serie tomadas en la misma pieza de pulmón, mientras que las Figs 15B y 15 D son secciones en serie tomadas en otra sección. Las células dentro de la luz de las vías respiratorias contienen macrófagos alveolares y éstos se tiñen fuertemente por Ptc.
Ejemplo 10 Efecto de la introducción de SPC-HIP
Nuestros estudios previos han puesto de manifiesto que la desregulación de la vía de señalización de Shh durante la restauración de la célula epitelial en el pulmón, pueden conducir a la infiltración de linfocitos con la producción correspondiente de fibrosis intersticial y cicatrización. Se ha utilizado previamente un modelo nuevo de fibrosis pulmonar en el que ratones BALB/c naturales tratados por vía i.t. con 50 \mug de FITC disuelto en solución salina (PBS) conduce a una respuesta inflamatoria inicial fuerte que se resuelve el día 7, pero la hiperplasia de EC es clara en este periodo y los linfocitos comienzan a infiltrar el pulmón en los puntos de la hiperplasia de EC el día 21. El día 28 existen pruebas de fibrosis intersticial que parecen agravarse por la presencia de linfocitos en el pulmón. En este modelo se ha observado aumento de la expresión de Ptc-1 en los puntos de hiperplasia de EC pero no en las áreas normales del tejido pulmonar. Esto indica que existe desregulación de la vía Shh en el proceso de la enfermedad en los ratones tratados con FITC.
Como HIP es un antagonista natural de la proteína Shh, se sobreexpresa HIP en el pulmón utilizando el vector de expresión de SPC de la forma siguiente:
Se tratan ratones BALB/c por vía i.t. con 50 \mug de FITC disuelto en solución salina (PBS) y 1 a 3 meses después a los ratones, en los que existen puntos de tiempo donde se conoce que los ratones deberían presentar normalmente fibrosis leve a grave respectivamente, se les administra dos inyecciones de plásmido SPC solo en solución salina o SPC-HIP en solución salina por vía i.t. 7 días aparte. Se sacrifican los ratones el día 7, el día 30 y el día 60 tras la administración de SPC-HIP. Se extrae tejido pulmonar y se fija en formalina tamponada al 4%. Se examinan las secciones por H y E, PAS, Masons-trichrome y Ki-67 en varios puntos de tiempo. Además, se examina la expresión de Ptc y Shh por ISH e inmunohistoquímica. Se observa una reducción de la expresión de Ptc y de la hiperplasia de EC y de la fibrosis pulmonar cuando se compara con el epitelio de los ratones de referencia.
Ejemplo 11 Efecto de la introducción de PKA
Se tratan ratones BALB/c por vía i.t. con 50 \mug de FITC disuelto en solución salina (PBS) y 1 a 3 meses después a los ratones, en los que existen puntos de tiempo donde se conoce que los ratones deberían presentar normalmente fibrosis leve a grave respectivamente, se les administra dos inyecciones de PKA en solución salina por vía i.t. 7 días aparte. Se sacrifican los ratones el día 7, el día 30 y el día 60 tras la administración de SPC-PKA. Se extrae el tejido pulmonar y se fija en formalina tamponada al 4%. Se examinan las secciones por H y E, PAS, Masons-trichrome y Ki-67 en varios puntos de tiempo. Además, se examina la expresión de Ptc y Shh por ISH e inmunohistoquímica. Se observa una reducción de la expresión de Ptc y de la hiperplasia de EC y de la fibrosis pulmonar cuando se compara con el epitelio de los ratones de referencia.
Ejemplo 12 Las células epiteliales expresan concentraciones elevadas de Dvl-1 trás la alteración con FITC
Se trataron ratones por vía intratraqueal con el hapteno isotiocianato de fluoresceína. Siete días después se extrajeron los pulmones y se fijaron en formalina. Se cortaron secciones y se tiñeron para Dvl-1 por inmunohistoquímica. La Fig. 16A presenta la expresión de Dvl-1 en el pulmón de los ratones tratados con FITC, mientras que la Fig. 16B presenta la coloración de Dvl-1 observada en el pulmón de referencia. Se observó una expresión fuerte de Dvl-1 en las células epiteliales y en los leucocitos de infiltración.
Ejemplo 13 El adenovirus Dvl-1 produce proliferación de células epiteliales
Se trataron ratones por vía intratraqueal con un adenovirus de referencia (Figs. 17A y C) o un adenovirus conteniendo el ADNc de Dvl-1 murino (Figs. 17B y D). Cuatro días después se extrajeron los pulmones y se fijaron en formalina. Se cortaron fracciones y se tiñeron para el marcador de proliferación Ki67 por inmunohistoquímica. Las Figs. 17A y B presentan una vista del pulmón a 10\times y las Figuras 17C y D son vistas a 40\times de las secciones mostradas en la casilla punteada. Las células proliferantes expresan el antígeno Ki67 en grandes concentraciones.
Ejemplo 14 Función de desregulación de la señalización de Wnt en fibrosis pulmonar
Se sobreexpresa la proteína Dvl-1 en el epitelio pulmonar de los ratones para examinar qué efecto puede tener en el desarrollo de la fibrosis pulmonar.
Se inyectó por vía i.t. a ratones BALB/c (i) 20 \mug de plásmido SPC disuelto en solución salina o (ii) 20 \mug de ADN del plásmido SPC-Dvl-1 disuelto en solución salina el día 0 y el día 7. Se sacrificaron los ratones el día 14 y el día 35 se extrajeron los pulmones y se colocaron en formalina tamponada al 4%.
Se extrae el tejido pulmonar y se fija en formalina tamponada al 4%. Se examinan las secciones por H y E, PAS, Masons-trichrome y Ki-67 en varios puntos de tiempo. Además, se examina la expresión de Dvl-1, Ptc y Shh por ISH e inmunohistoquímica. Se observó que la sobreexpresión conduce a hiperplasia de EC y a fibrosis pulmonar.
Ejemplo 15 Examinar el efecto de la introducción del WIF-1 antagonista de Wnt
WIT-1 es una nueva proteína que se identificó recientemente que se expresa como proteína de transmembrana que se une a las proteínas Wnt para neutralizarlas. WIF-1 se expresa normalmente en el tejido pulmonar, así como en el cerebro y de este modo se llevan a cabo una serie similar de experimentos como para los protocolos SPC-HIP utilizando en su lugar SPC-WIF-1. De nuevo se observa una reducción en la hiperplasia de EC y en la fibrosis pulmonar cuando se compara con el epitelio de los ratones de referencia.
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Claims (10)

1. Utilización de un inhibidor de una vía de señalización Hedgehog para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la hiperplasia de las células epiteliales, de la fibrosis de tejido, de la inflamación o de un trastorno inmunitario.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el trastorno autoinmunitario es una enfermedad autoinmunitaria o el rechazo del trasplante.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la enfermedad autoinmunitaria es la tiroiditis, las lesiones con inflamación, la esclerosis múltiple, la iridociclitis, la uveítis, la orquitis, la hepatitis, la enfermedad de Addison, la miastenia grave, la artritis reumatoide o el lupus eritematoso.
4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vía de señalización Hedgehog es la vía de señalización del Sonic Hedgehog, del Indian Hedgehog o del Desert Hedgehog.
5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inhibidor es HIP, Fzb, Cerberus, WIF-1, Xnr-3, Noggin, Chordin, Gremlin o Follistatina o un derivado, fragmento, variante, mimético, homólogo o análogo de los mismos.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el inhibidor es Ptc, Cos2 o PKA.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el inhibidor es un anticuerpo.
8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del pulmón o del riñón.
9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del síndrome disneico agudo del adulto; de los trastornos obstructivos crónicos de las vías respiratorias incluyendo el asma, el enfisema y la bronquitis crónica; la atelectasia; la neumonía laboral incluyendo la silicosis; las enfermedades con hipersensibilidad; las neumonías intersticiales idiopáticas incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática, las neumonías incluyendo la neumonía intersticial común, la neumonía intesticial descamante y la neumonía intersticial aguda; y la fibrosis pleural.
10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inhibidor es un antagonista seleccionado de entre polipéptidos y fragmentos de los mismos, péptidos lineales, péptidos cíclicos, compuestos sintéticos y naturales incluyendo los compuestos orgánicos o inorgánicos de peso molecular bajo.
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