PT2364185E

PT2364185E - Ftalazina dissubstituída antagonista da via hedgehog

Info

Publication number: PT2364185E
Application number: PT97406136T
Authority: PT
Inventors: Jolie Anne Bastian; Philip Arthur Hipskind; Daniel Jon Sall; Takako Wilson-Nee-Takakuwa
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2013-07-24
Also published as: CL2011000979A1; ECSP11011021A; PE20110433A1; PL2364185T3; CA2742539A1; KR20110066212A; US20110190304A1; CN102202737A; AU2009320251A1; CA2742539C; DK2364185T3; JP2012507535A; MA32726B1; CY1114023T1; EP2364185A1; TN2011000166A1; HRP20130527T1; CR20110202A; CO6382123A2; BRPI0921437A2

Description

ΡΕ2364185 1 DESCRIÇÃO "FTALAZINA DISSUBSTITUÍDA ANTAGONISTA DA VIA HEDGEHOG" A presente invenção relaciona-se com antagonistas da via Hedgehog e, mais especificamente, com novas ftala-zinas 1,4-dissubstituidas e suas utilizações terapêuticas. A via de sinalização Hedgehog (Hh) desempenha um papel importante na formação de padrões embrionários e na manutenção de tecidos adultos por orientação da diferenciação e proliferação celular. A família de proteínas Hedgehog (Hh), que inclui Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh), e Desert Hedgehog (Dhh) são glicoproteínas segregadas que passam por modificações pós-traducionais, incluindo clivagem autocatalítica e acoplamento do colesterol ao grupo amino terminal do peptídeo de modo a formar o fragmento que possui a actividade de sinalização. Hh liga-se à proteína Ptch de 12-domínios transmembrana (Ptchl e Ptch2), atenuando assim a supressão do Smoothened (Smo) mediada pela Ptch. A activação do Smo desencadeia uma série de eventos intracelulares que culminam na estabilização dos factores de transcripção Gli (Glil, Gli2, e Gli3) e a expressão dos genes dependentes de Gli que são responsáveis pela proliferação celular, sobrevivência celular, angiogénese e invasão. A sinalização Hh atraiu recentemente um interesse 2 ΡΕ2364185 considerável devido à descoberta de que a activação aberrante da sinalização Shh leva à formação de vários tumores, e.g., cancro do pâncreas, meduloblastoma, carcinoma de células basais, cancro do pulmão de pequenas células, e cancro da próstata. Vários antagonistas de Hh foram descritos na arte, tal como o composto alcaloide esteroidal IP-609; o composto aminoprolina CUR61414; e o composto tiazol 2,4-dissubstituido JK18. WO2005033288 revela alguns compostos ftalazina 1,4-dissubstituida que afirma serem antagonistas de hedgehog. De modo semelhante, W02008110611 revela alguns compostos ftalazina 1,4-dissubstituidas relacionados com o diagnóstico e o tratamento de patologias relacionadas com a via hedgehog.

Continua ainda a existir a necessidade de potentes inibidores da via Hedgehog, em particular os que apresentam perfis farmacodinâmicos, farmacocinéticos e toxicológicos desejados. A presente invenção fornece novas ftalazinas 1,4-dissubstituidas que são potentes antagonistas desta via. A presente invenção fornece um composto de Fórmula I:

em que 3 ΡΕ2364185 R é hidrogénio, flúor, ciano, trifluorometilo ou metoxi; 2 ✓ R e hidrogénio, flúor ou trifluorometilo; R e hidrogénio ou cloro, desde que pelo menos um de R2 e R3 seja hidrogénio; R4 é cloro, flúor, ciano, trifluorometilo, metoxi, difluorometoxi ou trifluorometoxi; , db . ~i— representa uma piperazina-1,4-diilo substituída selecionada do grupo constituído por

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Me * 4 t / \ ~/”N -r-N i*-N Ν'Τ' "τ^~Ν N-í- y_/ ^ * \ / * , ‘ y_/ · ’ V__^ *

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ou /^ f-N N-f * \_/ ’ ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Nas estruturas de anéis das piperazinas acima deve ser entendido que o lado esquerdo do anel da piperazina, como é desenhado, está ligado ao biciclo ftalizina e o lado direito do anel da piperazina está ligado ao carbonilo.

Deve ser entendido por um perito na técnica que os compostos da presente invenção compreendem uma metade amina terciária e são capazes de reagir com vários ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição ácida 4 ΡΕ2364185 farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis e a metodologia habitual para a sua preparação são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., P. Stahl, et al.r HANDBOOK OF PHARMACEUTICALS SALTS: PROPERTIES, SELECTION and USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S. M. Berge, et ai., "Pharmaceuticals Salts, "Journal of Pharmaceuticals Sciences, Vol. 66, No. 1, Janeiro de 1977.

Formas de realização especificas da invenção incluem compostos de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: (a) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; (b) R1 é flúor; (c) R2 é hidrogénio ou flúor; (d) R2 é hidrogénio; (e) R3 é hidrogénio; (f) R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (g) R4 é flúor ou ciano; (h) R4 é flúor;

(k)

e

Me

/—(N N t i 5 ΡΕ2364185 (l) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; e R2 é hidrogénio ou flúor; (m) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; e R2 é hidrogénio; (n) R1 é flúor; e R2 é hidrogénio ou flúor; (o) R1 é flúor; e R2 é hidrogénio; (p) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio ou flúor; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (q) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (r) R1 é flúor; R2 é hidrogénio ou flúor; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluoro-metilo; (s) R1 é flúor; R2 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (t) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio ou flúor; R3 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (u) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio; R3 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluoro-metoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; (v) R1 é flúor; R2 é hidrogénio ou flúor; R3 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; e (w) R1 é flúor; R2 é hidrogénio; R3 é hidrogénio; e R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; 6 ΡΕ2364185 (x) R1 é flúor; R2 é hidrogénio; R3 é hidrogénio; e R4 é flúor; (y) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio

Π-4- ' W * / V > ua t-n N ~r _/ ® . Me e ou ou flúor; e (z) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio; ... b~\ . t~n n^~ w ; J \. i Me V—/ ; t \ ,

/ -y-N , Me N_/ ' e ou ... r\. T-k H-r (z) R1 é flúor; R2 é hidrogénio ou flúor; e +/~\4 rJ** } n·*- , Me V_/ * . e ou ; (aa) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio ou flúor; R3 é hidrogénio; R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi ou trifluorometilo; e · N N"í" \y' \™/ * / \ i ** / “fN Hi-

Ms ou ‘ ' (bb) R1 é hidrogénio, flúor ou ciano; R2 é hidrogénio; ... , T~N N*? R3 é hidrogénio; R4 é flúor ou ciano; e , /~~\ , M© T~N N7- ...../ V \ <

Me Qu \—/ · . A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um excipiente, veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável . 7 ΡΕ2364185

Os compostos da presente invenção são preferencialmente formulados como composições farmacêuticas administradas por várias vias. Preferencialmente, estas composições são para administração oral ou intravenosa. Estas composições farmacêuticas e processos para a sua preparação são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19a ed., Mack Publishing Co., 1995). A presente invenção também fornece um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento de cancro. Em particular, o cancro é seleccionado do grupo constituído por cancro cerebral, carcinoma de células basais, cancro do esófago, cancro gástrico, cancro do pâncreas, cancro do tracto biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorectal, cancro do fígado, cancro do rim ou melanoma.

Deve ser entendido que a quantidade do composto realmente administrada será determinada por um médico de clínica geral em circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto ou compostos realmente administrados, a idade, peso, e resposta do paciente individual, e a gravidade dos sintomas do paciente. Dosagens diárias normalmente estão dentro do intervalo desde cerca de 0,1 até cerca 5 mg/kg de 8 ΡΕ2364185 peso corpóreo. Em alguns casos níveis abaixo do limite inferior do intervalo anteriormente referido podem ser mais adequadas, enquanto em outros casos podem ser utilizadas doses ainda maiores. Assim, não se pretende que o intervalo limite os objectivos da invenção de qualquer modo. Esta invenção também fornece um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado como um medicamento.

Adicionalmente, esta invenção fornece uma utilização de um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para tratar cancro. Em particular, o cancro é selecionado do grupo constituído por cancro cerebral, carcinoma de células basais, cancro do esófago, cancro gástrico, cancro do pâncreas, cancro do tracto biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorectal, cancro do fígado, cancro do rim e melanoma.

Para além disso, esta invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, como um ingrediente activo para tratar cancro cerebral, carcinoma de células basais, cancro do esófago, cancro gástrico, cancro do pâncreas, cancro do tracto biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma 9 ΡΕ2364185 de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorectal, cancro do fígado, cancro do rim ou melanoma.

Os compostos de fórmula I, ou sais destes, podem ser preparados por vários processos conhecidos na técnica, assim como pelos descritos nos Esquemas, Preparações, e Exemplos abaixo. Os passos de síntese específicos para cada uma das vias descritas podem ser combinados de diferentes modos, ou em conjunto com passos de diferentes esquemas, para preparar compostos de Fórmula I, ou sais destes.

Os substituintes, a não ser no caso de indicação em contrário, são como previamente definido. Os reagentes e materiais de partida são, de um modo geral, facilmente acessíveis a um perito na técnica. Outros podem ser preparados por técnicas comuns da química orgânica e heterocíclica, técnicas que são análogas às das sínteses de compostos de estrutura semelhante conhecidos, e os procedimentos descritos nas Preparações e Exemplos que se seguem incluem quaisquer novos procedimentos.

Como são aqui utilizados, os termos que se seguem têm os significados indicados: "Et20" refere-se a éter dietílico; "DMF" refere-se a dimetilformamida; "DMSO" refere-se a dimetilsulfóxido; tv EtOAc" refere-se a acetato de etilo; "THF" refere-se a tetra-hidrofurano; "MeOH" refere-se a metanol; "MTBE" refere-se a éter metil-terc- butílico; "boc" ou "t-boc IV refere-se a terc-butoxi carbonilo; "SCX" refere-se a um permuta catiónica forte; e 10 ΡΕ2364185 "IC5o" refere-se à concentração de um agente que origina 50% da resposta inibitória máxima possível desse agente.

Esquema 1

Passo 1 α m r~\ H“N N-A w

(4a)A® boc ou (4b) A ® H

Passo 2

(3a) A® boc o« (3b) A “ H

u

(6a) A - boc ou (6b) A * H

Passo 4

Um composto de Fórmula (6b) pode ser preparado de acordo com as reacções como apresentado no Esquema 1.

No Esquema 1, Passo 1, 1,4-dicloroftalazina (2) pode reagir com uma piperazina substituída (3a) ou (3b) numa substituição nucleófila aromática (SNAr) para fornecer uma ftalazina piperazinilo de fórmula (4a) ou (4b) . A reacção tem lugar num solvente dipolar aprótico tal como DMSO ou DMF com uma base apropriada tal como trietilamina, diisopropiletilamina, ou carbonato de potássio. A mistura é aquecida a cerca de 70-150°C. O técnico perito irá 11 ΡΕ2364185 reconhecer que em algumas circunstâncias será vantajoso utilizar um grupo protector tal como um grupo t-boc numa piperazina de fórmula (3a) permitindo a protecção do átomo de azoto menos impedido, como em 3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo. Reciprocamente, quando a reacção tem lugar no átomo de azoto menos impedido pode ser possivel utilizar piperazinas não protegidas tal como cis-2,6-dimetilpiperazina ou piperazin-2-ilo-metanol. A protecção também não é necessária quando se utiliza 2,5-dimetil-piperazina.

No Passo 2, o cloreto de ftalazinilo de fórmula (4) reage com um ácido fenilborónico sob condições de acoplamento cruzado de Suzuki. 0 técnico perito irá reconhecer que existem várias condições uteis para facilitar estas reacções de acoplamento cruzado. As condições reaccionais utilizam um solvente adequado tal como dioxano ou dioxano/água. A reacção é levada a cabo na presença de uma base tal como carbonato de césio ou fluoreto de césio. A reacção tem lugar na presença de um catalisador de paládio tal como bis(di-terc-butilo(4-dimetilaminofenil)-fosfina)dicloropaládio(II), cloreto de (1,1'-bis(difenil-fosfino)ferroceno)paládio(II), ou (SP-4-1)-bis[bis(1,1-di-metiletil)(4-metoxifenil)fosfina-κΡ]dicloro-paládio (preparado de acordo com a síntese do catalisador D em J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112) sob uma atmosfera inerte a uma temperatura de cerca de 80-110°C para dar uma ftalazina fenilo piperazinilo de fórmula (6a) ou (6b). 12 ΡΕ2364185

Alternativamente, no Passo 3, um cloreto de fenilo ftalazinilo de fórmula (5) reage com uma piperazina de fórmula (3a) ou (3b) numa substituição nucleofilica aromática (SNAr) semelhante à descrita no Passo 1, acima.

No Esquema 1, Passo 4, a funcionalidade amina, tal como a que está presente na fenilo piperazinilo ftalazina de fórmula (6a), pode ser desprotegida em (6b) e continuar a reagir para dar compostos da invenção. Métodos para a remoção de grupos protectores de azoto são bem conhecidos na técnica (ver, e.g., Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley and Sons, Nova York, (1999)). Por exemplo, a desprotecção do boc do fenilo piperazinilo ftalazina de fórmula (6) pode ser levada a cabo sob condições acidicas, tal como com cloreto de hidrogénio. 0 sal de HC1 resultante pode ser transformado na amina livre utilizando uma coluna SCX ou uma base inorgânica tal como bicarbonato de sódio.

Será entendido pelo técnico perito que compostos de fórmula (5) no Esquema 1 são comercialmente disponíveis ou podem ser facilmente preparados por métodos semelhantes aos aqui descritos ou utilizando procedimentos que são estabelecidos na técnica. Por exemplo, um ácido 2-fenilcarbonilo benzóico, gerado a partir de uma reacção de Grignard de brometo de fenilo magnésio com anidrido ftálico, pode ser ciclizado com hidrazina para dar uma 4-fenil-2H-ftalazin-l-ona. 0 tratamento subsequente com oxicloreto de fósforo fornece a l-cloro-4-fenil-ftalazina de fórmula (5). Alternativamente, 1,4-dicloroftalazina pode 13 ΡΕ2364185 reagir com um ácido fenilo borónico numa reacção de acoplamento cruzado de Suzuki para dar a l-cloro-4-fenil-ftalazina de fórmula (5) correspondente.

Esquema 2

No Esquema 2, a ftalazina piperazinilo desprotegida de fórmula (6b) pode ser acilada utilizando um isocianato de fenilo substituído num solvente inerte tal como diclorometano para dar uma ureia de Fórmula (I).

As Preparações e Exemplos que se seguem são fornecidas para ilustrar a invenção em mais detalhe e representam sínteses habituais dos compostos de fórmula (I). Os nomes dos compostos da presente invenção são geralmente obtidos do ChemDraw Ultra® 10,0.

Preparação 1 4-(4-(4-Fluorofenil)ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo

14 ΡΕ2364185

Aquecer uma mistura de l-cloro-4- (4-fluoro-fenil)ftalazina (5,0 g, 19,3 mmole), 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (5,03 g, 25,1 mmole) e trietilamina (8,1 mL, 59,0 mmole) em DMSO (97 mL) a 115°C durante 3 d. Despejar a mistura reaccional em água, lavar com CH2CI2. Extrair com Et20. Lavar a fase orgânica com água (2 x) , em seguida secar sobre Na2SC>4 e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o residuo resultante por cromatografia flash sobre silica gel (gradiente de 0 a 20% EtOAc em CH2CI2) para fornecer o composto em epígrafe como uma espuma amarelo pálido (7,05 g, 84%). ES/MS m/z 423,2 (M+l).

Procedimento alternativo:

Adicionar 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (276 g, 1,38 mole) a uma suspensão espessa de l-cloro-4-(4-fluorofenil)ftalazina (275 g, 1,06 mole) e diisopropiletilamina (346 mL, 1,99 mole) em DMSO (2,56 L) a 25°C. Aquecer a mistura a 102°C durante 9 h. Arrefecer a reacção a 25°C e agitar durante 48 h. Adicionar a mistura a EtOAc (2,5 L) e água (3,5 L) . Extrair a fase aquosa com acetato de etilo (2x2,0 L) . Combinar as fases orgânicas, lavar com água (2,5 L) e concentrar numa espuma castanha. Dissolver a espuma em acetonitrilo (1,0 L) e arrefecer a 1°C durante 30 min. Filtrar o precipitado para obter um sólido acastanhado. Concentrar o licor mãe e a suspensão 15 ΡΕ2364185 espessa do resíduo em acetonitrilo (500 mL) durante 30 min. Filtrar a mistura para obter um sólido acastanhado. Combinar o sólido precipitado e secar numa estufa com vácuo (14 torr, 25°C) durante 25 h para obter o composto em epígrafe como um sólido acastanhado (435 g, 96%). ES/MS m/z 423,0 (M+l).

Preparar as piperazinilftalazinas da tabela abaixo seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 1, utilizando 1,5 eq da piperazina substituída apropriada e 3-5 eq de trietilamina a uma temperatura de 115 a 150°C durante 3 a 6 dias.

Prep. No. Nome químico Estrutura XC-ES/MS m/z 2 4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-1-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo __ VC r~\ P 432,2 (M+l) 3 4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-1-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (R) -terc-butilo M-» ®~f\ 432,2 (M+l) 4* 4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-1-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de (R)-terc-butilo N-N O-í 432,2 (M+l) 5 4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-1-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de terc-butilo -08-ói-t 432,0 (M+l) 6 4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-1-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de terc-butilo /~\ í s P F~f V-4 >-« }*-% / n~n y-J o-í 432,0 (M+l) *Utilizando DMF como solvente 16 ΡΕ2364185

Procedimento alternativo para a Preparação 2:

Adicionar l-cloro-4-(4 — fluorofenil)ftalazina (200 g, 773 mmole) a uma solução de 3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (232 g, 1,16 mole), diiso-propiletilamina (674 mL, 28,1 mole), e DMSO (2,0 L) . Aquecer a mistura to 120°C durante 60 h. Arrefecer a mistura a 25°C, despejar para água gelada (3,0 L) e filtrar. Recolher os sólidos, dissolver em CH2CI2 (2,0 L) , e extrair com água (2,0 L) . Concentrar a fase orgânica e adicionar to uma camada de silica (3,0 kg silica) eluindo com THF 3% em CH2C12 para dar o composto em epigrafe como uma espuma amarela (126 g, 38%). ES/MS m/z 423,0 (M+l).

Preparação 7 2-Etilo-4-(4-(4 — fluorofenil)ftalazin-l-ilo)piperazina-1-carboxilato de (S)-terc-butilo

Aquecer uma mistura de l-cloro-4-(4-fluorofe-nil)ftalazina (5,02 g, 19,4 mmole), 2-etilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (5,00 g, 23,3 mmole) e K2CO3 (5,38 g, 38,9 mmole) em DMSO (75 mL) a 120°C durante 1 d. Despejar a mistura reaccional para água, lavar com EtOAc. Extrair com EtOAc. Lavar a fase orgânica com água (2 x), em 17 ΡΕ2364185 seguir com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secar sobre Na2SC>4, e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o residuo resultante por cromatografia flash sobre sílica gel (gradiente de 20 a 80% EtOAc em hexanos) para fornecer o composto em epígrafe (5,11 g, 60%). ES/MS m/z 437,2 (M+l).

Preparar a piperazinilftalazina na tabela abaixo essencialmente seguindo o procedimento descrito na Preparação 7, utilizando cis-2,6-dimetilpiperazina.

Prep. No. Nome químico Estrutura LC—ES/MS m/z 8 1-{cis-3,5-dimetilpiperazin-l-il)-4-(4-fluorofenil)ftalazina N-N 337,2 (M+l)

Preparação 9 (R)-(4-(4-(4-Fluorofenil)ftalazin-l-ilo)piperazin-2- ilo)metanol

Dissolver l-cloro-4-(4 — fluorofenil)ftalazina (0,1 g, 0,39 mmole), (R)-piperazin-2-ilmetanol (0,07 g, 0,58 mmole) e diisopropiletilamina (0,34 mL, 1,93 mmole) em DMSO (1 mL) . Agitar a reacção a 120°C durante 64 h. Purificar a 18 ΡΕ2364185 mistura reaccional por cromatografia flash sobre silica gel (0-10% amónia 2 M/MeOH em CH2CI2) para dar o composto em epigrafe como um sólido castanho (0,11 g, 84%) . ES/MS m/z 339, 0 (M+l) .

Preparar as piperazinilftalazinas da tabela abaixo essencialmente seguindo o procedimento descrito na Preparação 9, utilizando a piperazina substituida apropriada.

Prep. No. Nome químico Estrutura IC—ES/MS m/z 10 (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-ilo)piperazin-2-ilo)metanol \ $ /~0H F--+ y—^—N NH 339,0 (M+l) 11 1-((2S,5S)-2,5-Dimetilpiperazin-1-il)-4-(4-fluorofenil)-ftalazina F—Ϋ y—% N nh V=s/ V~/ 337,0 (M+l) 12 1-(cis-2,5-Dimetilpiperazin-l-il)-4-(4-fluorofenil)-ftalazina (mistura racémica) \} \ f>|·» *»'/ + F—% J—% /)—N NH \=/ n~N \—( 337,0 (M+l) 13 1-(trans-2,5-Dimetilpiperazin-l-il)-4-(4-fluorofenil)-ftalazina (mistura racémica) _ O V NH W n-n W Λ %, / \ í \ F-f /}™N NH W/ N-N 337,0 (M+l) 19 ΡΕ2364185

Preparação 14 4- (4-Cloroftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-Butilo

Aquecer uma mistura de 1,4-dicloroftalazina (10,0 g, 50,2 mmole), 3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (15,1 g, 75,4 mmole) e trietilamina (21,0 mL, 150,7 mmole) em DMSO (200 mL) a 120°C durante 2 d. Despejar a mistura reaccional para água, lavar com CH2CI2. Extrair com Et20. Lavar a fase orgânica com água (2 x), secar sobre Na2S04, e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o residuo resultante por cromatografia flash sobre sílica gel (gradiente de 0 a 20% EtOAc em CH2CI2) para fornecer o composto em epígrafe como um sólido amarelo pálido (6,0 g, 33%). ES/MS m/z (35C1) 363, 0 (M+l).

Preparação 15 4- (4-Cloroftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-Butilo

Aquecer uma mistura de 1,4-dicloroftalazina (7,80 g, 39,2 mmole), 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)- 20 ΡΕ2364185 terc-butilo (4,98 g, 24,9 iranole) e trietilamina (10,3 mL, 73,9 iranole) em DMSO (110 mL) a 80°C durante 18 h. Despejar a mistura reaccional para água, lavar com EtOAc. Extrair com EtOAc. Lavar a fase orgânica com água (2 x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e secar sobre Na2S04, e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por cromatografia flash sobre sílica gel (gradiente de 20% a 80% EtOAc em hexanos) para fornecer o composto em epígrafe (4,13 g, 46%). ES/MS m/z (35C1) 363,0 (M+l).

Preparação 16 4- (4- (4-Cianofenil)ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-Butilo

Aquecer uma mistura de 4-(4-cloroftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (4,0 g, 11,0 mmole), ácido 4-cianofenilborónico (2,43 g, 16,5 mmole), carbonato de césio (14,4 g, 44,1 mmole), e (SP-4-1)-bis[bis(1,1-dimetiletil)(4-metoxifenil)fosfina-κΡ]diclo- ro-paládio (J. Org. Chem. 2007, 72, 5104 -5112) (75,4 mg, 0,11 mmole) em 1,4-dioxano (80 mL) e água (20 mL) a 90° C de um dia para o outro. Partição da mistura reaccional entre água e CH2C12. Extrair a fase aquosa com CH2C12. Secar a fase orgânica combinada sobre N&2SO4 Θ concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por 21 ΡΕ2364185 cromatografia flash sobre sílica gel (gradiente de 0 a 20% EtOAc em CH2CI2) para fornecer o composto em epígrafe como uma espuma cor de laranja claro (4,46 g, 94%) . ES/MS m/z 430,2 (M+l).

Preparar as piperazinilftalazinas da tabela abaixo seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 16, utilizando a 4-cloroftalazina e o ácido borónico apropriados. Desarejar as Preparações 19-20 antes de adicionar bis(di-terc-butilo(4-dimetilaminofenil)-fosfina)dicloropaládio(II) como o catalisador, e aquecer as misturas resultantes a 90°C durante 72 h.

Prep. No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 17 3-Metilo-4-(4-fenilftalazin-l-ilo)piperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo ,—. ^ jíP O-Q-yJ^ 405,2 (M+l) 18 4-(4-(4-Cianofenil)-ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carbo-xilato de (S)-terc-butilo 430,1 (M+l) 19 2-Metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo \=/ N-N '—' P 405,2 (M+l) 20 2-Metilo-4-(4-(4-trifluorome-til)fenil)ftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxilato de (S) -terc-butilo Ff V\ ri N-N 473,2 (M+l)

Preparação 21 4- (4- (4-metoxifenil)ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-Butilo 22 ΡΕ2364185

Tratar uma mistura desarejada de 4-(4-clorofta-lazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc- butilo (0,81 g, 2,23 mmole), ácido 4-metoxibenzenoborónico (1,07 g, 7,05 mmole) e fluoreto de césio (1,05 g, 6,94 mmole) em 1,4-dioxano (30 mL) com cloreto de (1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(II) (0,27 g, 0,33 mmole). Aquecer a mistura resultante a 95°C de um dia para o outro. Fraccionar a mistura reaccional entre água e EtOAc. Extrair a fase aquosa com EtOAc. Lavar a parte orgânica com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secar sobre Na2S04, e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o residuo resultante por cromatografia flash sobre silica gel (gradiente de 15 a 70% EtOAc em hexanos) para fornecer o composto em epígrafe (0,94 g, 96%). ES/MS m/z 435,2 (M+l).

Preparação 22 (S)-1- (4-Fluorofenil)-4-(3-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina

Tratar uma solução de 4-(4-(4-fluorofenil)fta- 23 ΡΕ2364185 lazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (7,05 g, 16,2 inmole) em 1,4-dioxano (50 mL) com HC1 4 M em 1,4-dioxano (25 mL). Adicionar MeOH para dissolver o precipitado resultante e agitar durante 2 h à temperatura ambiente. Concentrar a mistura reaccional sob pressão reduzida. Dissolver o residuo em MeOH e despejar para uma coluna Varian® SCX de 50 g. Lavar com MeOH e CH2CI2, em seguida eluir o produto com CH2CI2:amónia 2 M em MeOH 1:1. Concentrar o eluente sob pressão reduzida para fornecer o composto em epigrafe como uma espuma amarelo pálido (4,83 g, 93%). ES/MS m/z 323,2 (M+l).

Procedimento alternativo para a Preparação 22:

Arrefecer metanol (2,82 L) a 0°C usando um banho de acetona/água 1:1 com gelo seco, e adicionar cloreto de acetilo (142 mL, 2,0 mole) gota a gota ao longo de um periodo de 30 min, mantendo a temperatura abaixo de 15°C durante a adição. Agitar a mistura durante 15 min. Adicionar 4- (4- (4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-2-metilpipera-zina-l-carboxilato de (S)-terc-butilo (282 g, 667 mmole) numa porção. Agitar a mistura durante 12 h a 25°C. Concentrar, e dissolver o residuo em água (3, 0 L) . Adicionar NaHC03 sólido até o pH ser 7. Extrair o produto com CH2C12 (2 x 2,0 L) , combinar as fases orgânicas, e concentrar para dar o composto em epigrafe como uma espuma castanha deformável num rendimento guantitativo (236 g, >100%). ES/MS m/z 323,0 (M+l). - 24 - ΡΕ2364185

Preparar as piperazinilftalazinas da tabela abaixo seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 22, utilizando a piperazinilftalazina, com o grupo boc protegido, apropriada com tempos de reacção desde 2 h até de um dia para o outro. Para as Preparações 30-34 utilizou-se MeOH como solvente.

Prep. No. Nome químico Estrutura LC-ES/MS m/z 23 (S)-1-(4-fluorofenil)-4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina /H w/ N~N 323,2 (M+l) 24 (R)-1-(4-fluorofenil)-4-(3-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina p—ff ^^ ^—N \=/ h~N s—' 323,2 (M+l) 25 (R)-1-(4-fluorofenil)-4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina )—( /™\ F-nf >-N NH N-N >— 323,2 (M+l) 26 (±)-1-(4-fluorofenil)-4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina \^f Γ“\ n~n '“Λ. 323,0 (M+l) 27 (±)-1-(4-fluorofenil)-4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina N-N y-—' 323,0 (M+l) 28 (S)-1-(2-metilpiperazin-l-il)-4-fenilftalazina ~~ Y“\ / \ // \...../ A—N MH \ ff \ / m-n v-^ 305,2 (M+l) 29 (S)-4-(4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazin-l-ilo)benzonitrilo V-C >-N ,NH W/ N-N ;—1 330,2 (M+l) 30 (S)-1-(3-etilpiperazin-l-il)-4-(4-fluorofenil)ftalazina n~n 337,2 (M+l) 31 (S)-1-(3-metilpiperazin-l-il)-4-fenilftalazina /~~À / ^,NH v==/ N-N 'v~—' 305,2 (M+l) 25 ΡΕ2364185 (continuação)

Prep. No. Nome químico Estrutura LC-ES/MS m/z 32 (S)-1-(3-metilpiperazin-l-il)-4-(4-(trifluorometil)-fenil)-ftalazina ^—í >-N NH 373,0 (M+l) 33 (S)-4-(4-(3-metilpiperazi-l-ilo) ftalazin-l-ilo)benzonitrilo 330,2 (M+l) 34 (S)-1-(4-metoxifenil)-4-(3-metilpiperazin-l-il)-ftalazina \ /r\ r \ /“^ o-f Nww/ N-N '-' 335,2 (M+l)

Preparação 35

3-Fluoro-4-isocianatobenzonitrilo F

Arrefecer a solução de trifosgénio (1,09 g, 3,67 mmole) em toluene (20 mL) num banho de água gelada. Tratar com a solução d 4-amino-3-fluorobenzonitrilo (1,36 g, 10,0 mmole) e trietilamina (2,8 mL, 20,0 mmole) em toluene (30 mL) gota a gota. Aquecer a mistura resultante a 70°C durante 5 h. Arrefecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente e separar o sólido por filtração. Concentrar o filtrado sob pressão reduzida para dar um sólido branco (1,44 g, 84%) que é utilizado sem mais purificação. GC/MS m/z 162 (M+) .

Preparar isocianato conhecido da tabela abaixo a partir da anilina apropriada, seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 35. 26 ΡΕ2364185

Prep. No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z F 2-Fluoro-l-isocianato-4- 205 36 (trifluorometil)benzeno 0 — N—^ ~^*F (tf)

Exemplo 1

Cloridrato de (S) — N- (4 — fluorofenil)-4-(4-(4 — fluoro-fenil)ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida

Tratar uma solução de (S)-1-(4-fluorofenil)-4-(3-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina (1,0 g, 3,1 mmole) em CH2CI2 (31 mL) com 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (0,42 mL, 3,72 mmole). Agitar durante 3 dias à temperatura ambiente. Concentrar a mistura reaccional sob pressão reduzida. Triturar o resíduo com Et20 e filtrar. Lavar o sólido com pentano e em seguida secar numa estufa com vácuo a 45°C. Dissolver o sólido numa mistura de CH2CI2 e MeOH e tratar com 3 eq de HC1 1 M em Et20. Agitar a mistura resultante, concentrar sob pressão reduzida, e secar numa estufa com vácuo a 45°C para dar o sal cloridrato em epígrafe como uma espuma amarela (1,5 g, 98%). ES/MS m/z 460,0 (M+l).

Procedimento alternativo para o Exemplo 1:

Adicionar 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (105 mL, 27 ΡΕ2364185 930 iranole) gota a gota ao longo de 1 h a uma solução de (S)-1-(4-fluorofenil)-4-(3-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina (300 g, 930 mmole) in CH2CI2 (4,5 L) a 25°C Agitar a mistura durante 25 min, e concentrar numa espuma. Formar uma suspensão espessa da espuma em MTBE (3,0 L), e lavar o bolo húmido com MTBE (500 mL). Concentrar as águas mães num óleo. Formar uma suspensão espesso do óleo em acetato de etilo (2,0 L) para dar um sólido e filtrar. Combinar os sólidos filtrados, e secar para obter o composto em epigrafe como um sólido acastanhado (344 g, 80%) . Formar uma suspensão espessa do sólido (327 g, 711 mmole) em isopropanol (3,27 L) a 42°C e tratar com HC1 4 M em 1,4-dioxano (177 mL, 711 mmole). Aquecer a mistura resultante a 60°C durante 30 min. Arrefecer lentamente até 25°C ao longo de 2 h. Filtrar e lavar o bolo húmido com isopropanol (200 mL) e heptano (200 mL). Secar o bolo numa estufa com vácuo (12 torr, 35°C, 2 h) para obter o composto em epigrafe como um sólido amarelo pálido (308 g, 87%). ES/MS m/z 460,0 (M+l).

Exemplo 2

Cloridrato de (S)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluoro fenil) ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida

Tratar uma solução de (S)-1-(4-fluorofenil)-4-(2- 28 ΡΕ2364185 metilpiperazin-l-ilo)ftalazina (0,5 g, 1,55 mmole) em CH2CI2 (15,5 mL) com 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (0,194 mL, 1,71 mmole). Agitar de um dia para o outro à temperatura ambiente. Purificar a mistura reaccional por cromatografia flash sobre silica gel (gradiente de 0 a 3% amónia/MeOH 2 M em CH2CI2) · Dissolver a base livre purificada numa mistura de CH2CI2 e MeOH e tratar com 3 eq de HCl 1 M em Et20. Agitar a mistura resultante, concentrar sob pressão reduzida, e secar numa estufa com vácuo a 45°C para dar o sal cloridrato em epigrafe como uma espuma amarela (0,72 g, 94%). ES/MS m/z 460,0 (M+l).

Procedimento alternativo para o Exemplo 2:

Adicionar 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (27,9 mL, 245 mmole) gota a gota ao longo de 1 h a uma solução de (S)-1-(4-fluorofenil)-4-(2-metilpiperazin-l-ilo)ftalazina (72 g, 223 mmole) em CH2CI2 (500 mL) a 25°C. Agitar a mistura durante 25 min e concentrar numa espuma. Adicionar cloreto de acetilo (16,5 mL, 231 mmole) a metanol a 0o C e agitar durante 5 min. Adicionar a espuma à solução de metanol e agitar durante 1 h. Concentrar a solução até uma espuma. Formar uma suspensão espessa da espuma em acetonitrilo (200 mL) e CH2CI2 (30 mL) , filtrar e recolher o composto em epígrafe como um sólido amarelo (91 g, 86%) . ES/MS m/z 460,0 (M+l).

Preparar as ureias na tabela abaixo seguindo essencialmente os procedimentos descrito nos Exemplo 1 ou 29 ΡΕ2364185

Exemplo 2, utilizando a piperazinilftalazina apropriada e um ligeiro excesso do isocianato apropriado. Os tempos das reacções variam desde 0,5 h até 3 d. Purificar os compostos por trituração (com Et20 ou 1:1 CH2CI2 :hexanos) ou por cromatografia flash em sílica gel. Para os Exemplos 57-60 e 66-69, purificar por cromatografia em fase reversa guiada por (Waters XBridge coluna HPLC C18 ODB MS, 30x75 mm, 5 pm tamanho de partícula, gradiente de 20 a 70% acetonitrilo em água, contendo bicarbonato de amónio 0,01 M, com uma velocidade de fluxo de 85 mL/min durante 8 min) . Para os Exemplos 75-82, utilizar os isocianatos (Preparações 35-36) brutos num excesso de 1,5-2. Para os Exemplos 18, 29 e 38 omitir o MeOH do processo de formação do sal de HC1.

Prep No. Nome químico Estrutura LC-ES/MS m/z 3 Cloridrato de (±)~N~(4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxamida /®*\ MCI 460,0 (M+l) 4 Cloridrato de (+)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilo-2V- (4-(trifluorometoxi)-fenilo)piperazina-l-carboxamida HCi f '<>8<j-tCh>v 526,0 (M+l) 5 Cloridrato de (±)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida v—f \~j ^0 460,0 (M+l) 6 Cloridrato de (+)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -3-metilo-IV- (4- (trifluorometoxi) -fenilo)piperazina-l-carboxamida /ca*\ HCt p ‘-O0^ N~N V-/ 0 526,0 (M+l) ΡΕ2364185 30 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura LC-ES/MS m/z 7 Cloridrato de (R)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida '-* N—^ HCS 460,2 (M+l) 8 Cloridrato de (R)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilo-W- (4-(trifluorometoxi)-fenilo)piperazina-l-carboxamida - \-1 o HO 526,2 (M+l) 9 Cloridrato de (R)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-1-metilpiperazina-l-carboxamida 467,2 (M+l) 10 Cloridrato de (R)-N- (2,4-difluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida .-0-0 Nfw,í^ \w./ 0 HCl 478,2 (M+l) 11 Cloridrato de (R)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxamida 460,2 (M+l) 12 Cloridrato de (R)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -3-metilo-W- (4-(trifluorometoxi)-fenilo)piperazina-l-carboxamida /555\ BCJ p /1 / \ f F'~\ /-¾ T—r J-i-H \—' % 526,2 (M+l) 13 Cloridrato de (R)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida y~s o 467,2 (M+l) 14 Cloridrato de (R)-N- (2,4-difluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida ^ HCÍ ^ ^ 478,2 (M+l) ΡΕ2364185 31 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 15 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilo-W- (4-(trifluorometoxi)-fenilo)piperazina-l-carboxamida „ d/ / h /=\ hrF N“P4 / 0 HCi 526,2 (M+l) 16 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida ^ HCi 467,2 (M+l) 17 Cloridrato de (S)-N- (2,4-difluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida ^^ N-W \ MC: 478,2 (M+l) 18 Cloridrato de (S)-N- (4-fluoro-2-(trifluorometil)-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-ca rboxamida F ÍÍCE 528,2 (M+l) 19 Cloridrato de (S)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida /“< w/ n-n s—f ο α HO 35C1 494,0 (M+l) 20 Cloridrato de (S)-N- (4-clorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida 4, # / Μ /**\ jf~\ f~~\ j~~\ }*~Χ ^ HCi 35C1 476,0 (M+l) 21 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metil-N- (4-trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida \—/ o 80 510,0 (M+l) 22 Cloridrato de (S)-N- (4-difluorometoxi)- fenil-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxamida 4 # / H /*®\ /~\ /HL ^ F \sss&/ N-< 0 p HCI 508,0 (M+l) ΡΕ2364185 32 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 23 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -N-(4-metoxifenil)-2-metilpiperazina-l-carboxamida XsskZ W o HCt 472,0 (M+l) 24 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida «s»-< >~4 }-/ W r h-n 0 HC! 474,2 (M+l) 25 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(4-fluorofenil)-2-metilpiperazina-l-carboxamida Λ—JSÍ N—A ^ o HC! 467,2 (M+l) 26 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(2,4-difluorofenil)-2-metilpiperazina-l-carboxamida O ^ F W W w HÇí 485,0 (M+l) 27 Cloridrato de (S)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida f*~i *~Λ μ-n ο α HC! 35C1 500,8 (M+l) 28 Cloridrato de (S)-N- (4-clorofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida ^ # / /=\ /-λ r~\ /*-4 nss—? y—^ n n—^ ** H-N ^^ O HC! 35C1 483,0 (M+l) 29 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cia-nofenil)-ftalazin-l-ilo-W- (4-fluoro-2-(trifluorometil)-fe-nil)-2-metilpiperazina-l-carboxamida F H 3£- - ~ N '«sw v—^ 0 HCÍ 535,0 (M+l) 30 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-ilo-W-(4- (trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida NS~( Si*4 F W V« w o HO 517,0 (M+l) ΡΕ2364185 33 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 31 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilo-W- (4-(trifluorometoxi)-fenil)-piperazina-l-carboxamida \ f f h /**\ y~r na 533,0 (M+l) 32 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(4-difluorometoxi)-fenil)-2-metilpiperazina-l-carboxamida #~·ι* >*55/ 0 HC? 515,0 (M+l) 33 Cloridrato de (S)-(4-fluorofenil)-2-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il) -N-piperazina-l-carboxamida \ * n~u K—f 0 NCf 442,2 (M+l) 34 Cloridrato de (S)-N- (2,4-difluorofenil)-2-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-2-piperazina-l-carboxamida y*sn /—\ . \ j^ ^ N-N '—' O HCi 460,2 (M+l) 35 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-2-metilo-4-(4-ftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida /“X /~\ r~i n-n w 0 HCi 449,2 (M+l) 36 Cloridrato de (S)-(3-cloro-4-fluorofenil)-2-metilo-(4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida \ >-*. n~í '—( HCS 35C1 476,0 (M+l) 37 Cloridrato de (S)-N- (4-cloro-fenil)-2-metilo-4-(4-fenilfta-lazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida W/ ^—f O Hã 35C1 458,0 (M+l) 38 Cloridrato de (S)-N-(4-fluoro-2-(trifluorometil)-fenil)-2-metilo-(4-(4-fenilftalazin-l-ilo)piperazina-l-carboxamida F oR.á^r '—' 0 HCi 474,2 (M+l) ΡΕ2364185 34 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 39 Cloridrato de (S)-2-metilo-4-(4- fenilftalazin-1-il)- N-(4-(trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida 0 HCI 492,0 (M+l) 40 Cloridrato de (S)-2-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-N- (4-trifluorometoxi)-fenil)-piperazina-l-carboxamida / \ . ..... V—.« \ // / h /""X r~* ry-O-^hT'-'0 na 508,0 (M+l) 41 Cloridrato de (S)-N- (4-difluorometoxi)-fenil)-2-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida \sss/ >-* 0 net 490,0 (M+l) 42 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-metoxifenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida HCí 478,8 (M+l) 43 Cloridrato de (S)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-metoxifenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida \ /r~\ \=/ tsi-M '-f Q HCÍ 472,2 (M+l) 44 Cloridrato de (S)-N- (2,4-difluorofenil)-4-(4-(4-metoxifenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida \ r~\ 0—? /“\v na 490,2 (M+l) 45 Cloridrato de (S)-N- (4-fluoro-fenil)-2-metilo-4-(4-(4-(tri-fluorometil)- fenil)-ftalazin-l-il) - piperazina-l-carboxamida P /—í —F HO 510,2 (M+l) 46 Cloridrato de (S) —ΛΓ— (4— cianofenil)-2-metilo-4-(4-(4-(trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida t ΛΛ V~C i—£ i—N F W \ HCf 517,2 (M+l) ΡΕ2364185 35 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 47 Cloridrato de (S)-N- (2,4-diflu-orofenil)- 2-metilo-4-(4-(4-(trifluorometil)-fenil)ftala-zin-l-il)- piperazina-l-carbo-xamida F /—\ /—( ÍW~d Λ—?v( H--d r ^ N-N '—t o MCi 528,0 (M+l) 48 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilo-N- (4-trifluorometoxi)-fenil)-piperazina-l-carboxamida _ /f~\ / \ /-\ F~f y~i w ^ N~N )—/ o 526,2 (M+l) 49 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida / 467,2 (M+l) 50 Cloridrato de (S) —ΛΓ— (2,4— difluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida /“\ HCi Wv>^ / 478,2 (M+l) 51 Cloridrato de (S)-N- (4-fluoro- 2- (trifluorometil)-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)- 3- metilpiperazina-l-ca rboxamida í 528,0 (M+l) 52 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -N-(4-metoxifenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida HCf /-\ Κ></ W/ J—'' o 472,0 (M+l) 53 Cloridrato de (S)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida y=v M£í Xss/ fcí-H © Cí 35C1 494,0 (M+l) 54 Cloridrato de (S)-N- (4-clorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxamida HCt F“\ /Ή />~K )-f Q 35C1 476,0 (M+l) ΡΕ2364185 36 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 55 Cloridrato de (S)-4- (4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-3-metilo-N- (4-trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida /=V HCi o 510,0 (M+l) 56 Cloridrato de (S)-N- (4-difluorometoxi)-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida /=\ HCi w/ h-n o 508,0 (M+l) 57 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(4-fluorofenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida V-/ /' 467,0 (M+l) 58 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-cianofenilo) ftalazin-l-il)-3-metilpiperazina-l-carboxamida V—^ / 474,0 (M+l) 59 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(2,4-difluorofenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida / 485,2 (M+l) 60 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil) -ftalazin-l-il) -17-(4-fluoro-2-(trifluorometil)-fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida f «sk HCi N-N )—^ o 535,0 (M+l) 61 Cloridrato de (S)-17- (3-cloro-4-fluorofenil)-4-(4-(4-(cianofenil)-3-metilpiperazina-1-carboxamida HO vrov VwZ O Ct 35C1 501,0 (M+l) 62 Cloridrato de (S)-N- (4-clorofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxamida y*a=v HO Η~ζ M-N )—’ O 35C1 483,0 (M+l) ΡΕ2364185 37 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 63 Cloridrato de (S)-4- (4-(4-cianofenil)ftalazin-l-il)-3-metilo-N- (4-trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida Λ HCi w ^ o s 517,0 (M+l) 64 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)ftalazin-l-il) -3-metio-N- (4-trifluorometoxi)-fenil)-piperazina-l-carboxamida 533,0 (M+l) 65 Cloridrato de (S)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-N-(4-(difluorometoxi)- fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida rss\ BO itã—y~p w/ y—f o f 515,0 (M+l) 66 Cloridrato de (S)-N- (4-fluorofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida 442,2 (M+l) 67 Cloridrato de (S)-N- (4-cianofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida 449,2 (M+l) 68 Cloridrato de (S)-N- (2,4-difluorofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida / 460,0 (M+l) 69 Cloridrato de (S)-N- (4-fluoro-2-(trifluorometil)-fenil)-3-metilo-4-(4-(fenilftalazin-1-il)-piperazina-l-carboxamida F /=\ «a f—γ-ρ /“\JK /~~\ 510,0 (M+l) 70 Cloridrato de (S)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida HCi «sf N ^ N j / 0 Cí 35C1 476,0 (M+l) ΡΕ2364185 38 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 71 Cloridrato de (S)-17- (4-clorofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)- fenil)-piperazina-l-carboxamida HCi SJ ^ fl-TVc. / V~i vt'.)/ ¢5 35C1 458,0 (M+l) 72 Cloridrato de (S)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)- 17-(4-trifluorometil)-fenil)-piperazina-l-carboxamida /=\ HCí /~\ W Γ~\ f V-i >“« ^ FF Ν,1ί^ίΓ Ν~Ή D 492,0 (M+l) 73 Cloridrato de (S)-3-metilo-4-(4-feniloftalazin-l-il)-17- (4-(trifluorometoxi)- fenil)-piperazina-l-carboxamida /5=λ MC! ( /—í kf V=s=/ ?—' 0 p P 508,0 (M+l) 74 Cloridrato de (S)-17- (4-difluorometoxi)-fenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida «ss?, HCi \ ?—(\ kN N-% )~~F \asf N-íí O F 490,0 (M+l) 75 Cloridrato de (S)-N- (4-ciano-2-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-2-metilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida HO 484,8 (M+l) 76 Cloridrato de (S)-17- (2-fluoro-4-(trifluorometil)-fenil)-4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilo-piperazina-l-carboxamida ζΓ} / h k\ / F-f y-c >-n w v \sssí/ q HO 528,0 (M+l) 77 Cloridrato de (S)-17- (4-ciano-2-(fluorofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida N-f* W \ HOi 492,0 (M+l) 78 Cloridrato de (S)-17- (4-ciano-2-fluorofenil)-2-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida \ / / H k=\ /~A / \ /"Λ /)—«SM \ y~4 - N-H %—t HCf 467,0 (M+l) ΡΕ2364185 39 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura IC-ES/MS m/z 79 Cloridrato de (S)-N- (4-ciano-2-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofe-il)-ftalazin-l-il)- fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida /ssh. HO F ^ F~\ ))-\ <>-"W M—/ 'i—i? '—' N-fí )—t o 484,8 (M+l) 80 Cloridrato de (S)-N- (2-fluoro-4-(trifluorometil)-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida yssy HCí T Γ~'\ N—L· —£-F f—ζ \—ζ V w o 528,0 (M+l) 81 Cloridrato de (S)-N- (4-ciano-2-fluorofenil)-4-(4-(4-cianofenil)-ftalazin-l-il)-fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida HG* f? f 492,0 (M+l) 82 Cloridrato de (S)-N- (4-ciano-2-fluorofenil)-3-metilo-4-(4-fenilftalazin-l-il)-piperazina-1-carboxamida /S!\ HC! F \ / H )=\ \ /~~Í N-N )—f o 2” 467,0 (M+l) 83 Cloridrato de N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il) -cis-2,6- dimetilpiperazina-l-ca rboxamida /~~4 Hd 481,2 (M+l) 84 Cloridrato de N- (4-fluorofenil) -4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-cis-2,6-dimetilpiperazina-l-ca rboxamida F—t J-(\ tf—N \ss/ '“"'C HQ ' H 474,2 (M+l) 85 Cloridrato de (S) —ΛΓ— (4— cianofenil-2-etilo-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida /=!Λ /-( <3 /“4 )i~i /Λ-*S555M 481,2 (M+l) 86 Cloridrato de (S)-N- (2,4-difluorofenil)-2-etilo-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-piperazina-l-carboxamida /'™\ /—\ r~\ P F“\ }—^ —r N-N \~~f HCí / 492,2 (M+l) ΡΕ2364185 40 (continuação)

Prep No. Nome químico Estrutura LC-ES/MS m/z 87 Cloridrato de (S)-2-etilo-N- (4-fluoro-2-(trifluorometil)-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)- fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida /™\ /-\ ’7Í 542,2 (M+l) 88 Cloridrato de (S)-2-etilo-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil) -ftalazin-l-il) - fenil)-3-metilpiperazina-l-carboxamida F-4 )—ζ «βλ V_y ''~-2 M—Λ V-F H MCI 474,2 (M+l) 89 Cloridrato de (2S,5S)-N- (4-cianofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-fenil)-2,5-dimetilpiperazina-l-carboxamida ¢-¾ \ *< O /-v N-N )—f hl—<4 >-CN f H wa 481,0 (M+l)

Exemplo 90

Cloridrato de (R) — N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-2-(hidroximetil)piperazina-1- carboxamida

Tratar uma solução de (R)-(4-(4-(4-fluorofenil) ftalazin-l-ilo)piperazin-2-ilo)-metanol (0,15 g, 0,44 mmole) em CH2CI2 (3 mL) com 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (0,04 g, 0,31 mmole). Agitar a reacção à temperatura ambiente durante 30 min e em seguida concentrar a mistura reaccional. Purificar o resíduo resultante por cromatogra- 41 ΡΕ2364185 fia flash sobre sílica gel (0-50% EtOAc em hexanos, em seguida mudar par MeOH 3% em CH2CI2) para dar um sólido. Dissolver o sólido em MeOH (1 mL) e tratar com HCl aquoso 1 N (0,13 mL, 0,13 mmole). Concentrar a solução para obter o composto em epígrafe como um sólido (0,065 g, 29%) . ES/MS m/z 476,0 (M+l).

Preparar as piperazinilftalazina ureias da tabela abaixo seguindo essencialmente o procedimento descrito no Exemplo 90, utilizando a piperazinilftalazina e o isocianato apropriados.

Prep. No. Nome químico Estrutura IC—ES/MS m/z 91 Cloridrato de (R)—N- (4-fluoro-fenil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-(hidroximetil)-piperazina-l-carboxamida ^ 0 f—Ç V-4 /aav Va*/ μη* V—/ BCi 476,0 (M+l) 92 Cloridrato de (S)-N-(4-fluorofenil) -4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-(hidroximetil)-piperazina-l-carboxamida HO __ y~J /~^ n *-< /*\ N-N & mi 476,0 (M+l) 93 Cloridrato de (R)-N-(4-cianofe-nil)-4-(4-(4-fluorofenil)-ftalazin-l-il)-2-(hidroximetil)-piperazina-l-carboxamida MO 483,0 (M+l)

Exemplos 94 & 95

Cloridrato de N-(4 — fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-trans-2,5-dimetilpiperazina-l-carboxamida, Isómero 1 e Isómero 2 42 ΡΕ2364185

Tratar uma solução de 1-(tran.s-2,5-dimetilpipe-razin-l-il)-4-(4-fluorofenil)ftalazina (0,3 g, 0,89 mmole) em CH2CI2 (5 mL) com 1-fluoro-4-isocianatobenzeno (0,17 g, 1,25 mmole). Agitar a reacção à temperatura ambiente durante 1 h. Purificar a mistura reaccional por cromatografia flash sobre sílica gel (0-50% EtOAc em hexanos). Separar e concentrar as fracções apropriadas. Dissolver a mistura dos isómeros de N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-trans-2,5-dimetilpiperazina-1-carboxamida (0,3 g, 0,59 mmole) em MeOH (2 mL). Separar a mistura dos isómeros trans por cromatografia quiral (Chiralcel OJ-H, taxa de fluxo de 30 mL/min, detecção a 225 nm, 6:4 MeOH:acetonitrilo). Recolher o primeiro pico eluído como isómero 1 e segundo pico eluído como isómero 2. Separar e concentrar as fracções apropriadas. Dissolver os isómeros separados em MeOH (1 mL) e tratar cada solução com 1 equivalente de HC1 aquoso IN. Concentrar para dar os sais cloridrato do isómero 1 (0,131 g, 44%) e isómero 2 (0,129 g, 43%). Isómero 1: ES/MS m/z 474,2 (M+l), 99% ee. Isómero 2: ES/MS m/z 474,2 (M+l), 99% ee.

Exemplos 96 & 97

Cloridrato de N-(4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-cis-2,5-dimetilpiperazina-l-carboxamida, Isómero 1 e Isómero 2 ΡΕ2364185 43 f

•F HCt e HC!

Preparar os Exemplos 96 e 97, seguindo essencialmente o procedimento como descrito para os Exemplos 94 e 95, utilizando a mistura de cis-dimetilpiperazinas da Preparação 12. Separar a mistura dos isómeros cis por HPLC quiral e preparar os sais de HCl para dar o Isómero 1 (0,21 g, 34%) e o Isómero 2 (0,20 g, 33%). Isómero 1: ES/MS m/z 474,2 (M+l), 95% ee. Isómero 2: ES/MS m/z 474,2 (M+l), 92% ee.

Biologia A via de Hedgehog tem sido apontada como um factor de sobrevivência para os cancros que se seguem: carcinoma de células basais; cancros do tracto gastrointestinal superior (esófago, estômago, pâncreas, e tracto biliar); cancro da próstata; cancro da mama; cancro do pulmão de pequenas células; cancro do pulmão de não-pequenas células; Linfoma de células B; mieloma múltiplo; cancro gástrico; cancro do ovário; cancro colorectal; cancro do fígado; melanoma; cancro do rim; e cancro cerebral.

Elementos da via de Hedgehog têm sido citados 44 ΡΕ2364185 como potenciais alvos de fármacos para o tratamento de cancros. Uma linha de células Daoy estabelecida a partir de tumor meduloblastoma (ATCC, HTB-186), é sensível aos ligandos Hh. Quando estas células são tratadas com adição exógena de meio Shh condicionado, a via de sinalização de Hh é activada e resulta num aumento da expressão de GUI. Ciclopamina, um alcaloide isolado do milho lily Veratrum californicum é um antagonista fraco da via hedgehog e foi mostrado que suprime a expressão de GUI em resposta à estimulação do Shh. Observações recentes sugerem que a ciclopamina inibe o crescimento de culturas de células de meduloblastoma e transplantes alogénicos. Utilizando este modelo do sistema da linha de células Daoy, podem ser identificados potentes inibidores das vias de sinalização hedgehog. Uma vez que os compostos da presente invenção são antagonistas da via hedgehog, estes são adequados para tratar os tipos de tumores anteriormente mencionados.

Determinação da Actividade Biológica IC50 0 protocolo de ensaio que se segue e os seus resultados demonstram ainda a utilidade e eficácia dos compostos e métodos da corrente invenção. Ensaios funcionais suportam que os compostos da presente invenção apresentam a capacidade de inibir a sinalização Shh. Todos os ligandos, solventes, e reagentes utilizados nos ensaios que se seguem são facilmente acessíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser facilmente preparados por um perito na técnica. 45 ΡΕ2364185 A actividade biológica é determinada utilizando um ensaio funcional em linhas de células Daoy de cancro neuronal e por medida dos niveis de GUI no ácido ribonucleico através de um ensaio do sistema bDNA (ácido desoxirribonucleico ramificado) (Panomics, Inc., Fremont, Calif.)· Gli foi originalmente descoberto numa linha de células de Glioblastoma e codifica uma proteína zinc finger que é activada por sinalização Shh. A resposta máxima é obtida por indução da transcripção de GUI nas linhas de células Daoy com meio condicionado (células HEK-293, rim de embrião humano, expressando Shh recombinante de modo estável) durante 24 horas e em seguida mensalmente a quantidade de estimulação da transcripção de GUI. A resposta mínima é a quantidade inibição de transcripção de GUI por um composto de controlo numa linha de células Daoy que foi estimulada com meio condicionado (células HEK-293, rim de embrião humano, expressando Shh recombinante de modo estável) durante 24 horas.

Ensaio funcional para Medir a Inibição de GUI em células

Daoy 0 ensaio do sistema bDNA utiliza a tecnologia de amplificação de DNA em cadeia ramificada para permitir uma amplificação do ácido ribonucleico alvo (transcrição). A tecnologia emprega três tipos de sondas de cDNA específicas de GUI híbrido sintético curto, que determinam a especificidade do alvo da transcripção [extensores de captura 46 ΡΕ2364185 (CEs), extensores marcadores (LEs) , e bloqueadores (BLs)] que formam um híbrido como um complexo com os alvos das transcrições para amplificar o sinal da hibridização. A adição de um substracto quimiluminescente durante o passo de amplificação permite a detecção utilizando luminescência . A linha de células Daoy adquirida à American Type Culture collection (ATCC) é uma linha de células neuronais de ser humano que responde ao Shh e foi estabelecida em 1985 a partir de um tumor desmoplásico de meduloblastoma cerebral, uma linha de células tumorais com relevância psicológica. Níveis endógenos das transcrições de GUI têm níveis baixos de células Daoy mas podem ser estimulados utilizando meio condicionado retirado de células estáveis que sobre-expressam Shh humano (uma linha de células HEK-293 estável transfectada com hShh). Células Daoy são cultivadas até confluência em cultura de tecidos em frascos-T225 em meio de crescimento Daoy contendo Meio Mínimo Essencial (MEM) mais Soro Bovino Fetal (FBS) a 10% com aminoácidos não essenciais 0,1 nM e piruvato de sódio 1 mM. As células são removidas dos frascos-T225 utilizando tripsina ácido etilenodiaminote-tracético (EDTA), são centrifugadas, suspensas de novo no meio, e em seguida são contadas.

As células Daoy são em seguida semeadas a 50.000 células por poço em meio de crescimento em placas de 47 ΡΕ2364185 cultura Costar de 96 poços limpos e deixa-se a incubar de um dia para o outro a 37°C sob dióxido de carbono a 5% (CO2). As células são lavadas uma vez tampão fosfato salino (PBS) seguida pela adição de 100 pL de Meio Shh Condicionado (Shh-CM) para estimular os niveis de expressão de Glil. O Shh-CM é diluido para atingir a estimulação máxima utilizando um meio de crescimento de controlo FBS/DMEM a 0,1% (Dulbeccos Modified Eagle Médium). Células Daoy tratadas com Shh-CM são em seguida tratadas com vários concentrações de inibidores de hedgehog variando desde aproximadamente 1 μΜ até 0,1 nM. Deixam-se os compostos teste incubar durante 24 horas a 37°C sob CO2 a 5%.

As determinações da transcripção de GUI são levadas a cabo utilizando o ensaio Quantigene 2.0 Glil como descrito pelo fabricante (Panomics, Inc.). Preparar uma mistura diluida de tampão de lise (DLM), que inclui Proteinase K. Após 24 horas de incubação com composto, as células são lavadas uma vez com PBS e são adicionados 180 pL DLM às células. A placa de células contendo o tampão de lise é selada e colocada a 55°C durante 30 a 45 minutos. As células lisadas resultantes são em seguida trituradas 5 vezes. Um conjunto de sondas de trabalho contendo sondas Glil é preparado por diluição das sondas em DLM de acordo com as indicações do fabricante, e em seguida 20 pL do conjunto de sondas de trabalho são adicionados às placas de ensaio de bDNA em conjunto com 80 pL de Daoy lisadas. As placas são seladas e incubadas de um dia para o outro a 55°C. As placas de bDNA são em seguida processadas de 48 ΡΕ2364185 acordo com as indicações do fabricante. 0 sinal é quantificado por leitura das placas num leitor de detecção por luminescência Perkin Elmer Envision. 0 sinal de luminescência é directamente proporcional à quantidade de alvo da transcripção presente na amostra.

Os dados do sinal de luminescência do ensaio funcional são utilizados para calcular o IC50 do ensaio in vitro. Os resultados são calculados com base nos máximos dos valores de controlo (células Daoy tratadas com Shh-CM) e o valor de controlo minimo (células Daoy tratadas com Shh-CM e uma concentração de inibição de um composto de controlo, N-(3-(ΙΗ-benzo[d]imidazol-2-ilo)-4-clorofenil)-3,5-dimetoxibenzamida) a 1 μΜ. Um ajuste de curva logística de quatro parâmetros é utilizado para gerar os valores de IC50 utilizando a versão 5.3 do programa de software Activity Base, equação 205 (Assay Guidance Manual Version 5.0. 2008, Eli Lilly and Company e NIH Chemical Genomics

Center).

Seguindo o protocolo descrito, os compostos da invenção aqui exemplificados apresentam um IC50 de <40 nM. Por exemplo, o composto do Exemplo 2 tem um IC50 de aproximadamente 0,42 nM com um erro padrão de 0,21 (n=2) no ensaio descrito acima. Estes resultados fornecem evidências de que os compostos da presente invenção são antagonistas de hedgehog e, como tal, são uteis como agentes anti-cancro. ΡΕ2364185 49

Ensaio de Inibição CYP3A4

Amostras incubadas são preparadas adicionando uma preparação de microssomas de figado humano ao composto inibidor teste (concentrações finais proteína 0,05 mg/mL, inibidor 10 μΜ em NaP04 100 mM, tampão pH 7,4) e misturando. As amostras são pré-incubadas durante aproximada-mente cinco minutos a 37°C. A seguir ao período pré-incubação, a reacção é iniciada com a adicção de uma solução contendo NADPH e midazolam, como o substrato de enzima, (concentração final NADPH1 mM, midazolam5 μΜ). Após a adição da solução de NADPH, as amostras são incubadas durante 3 min a aproximadamente 37°C. A seguir ao período de incubação, a reacção é parada por adição de 50 pL de metanol (e um padrão interno para cromatografia) e as amostras são bem misturadas. Após a paragem da reacção, a mistura é centrifugada a aproximadamente 4000 rpm durante 15 min a aproximadamente 5°C e é analisada por análise LC/MS.

As amostras são analisadas utilizando HPLC/MS com um gradiente de eluição em colunas C18 convencionais curtas, (Fase Móvel—95/5 H2O Milli-Q/metanol (v/v) com 1% ácido acético. Fase Móvel B—80/20 H2O Milli-Q /metanol (v/v) com 1% de ácido acético. Fase Móvel C—5/95 H20 Milli-Q/metanol (v/v) com 1% de ácido acético. Lavando com Fase Móvel—75/25 H2O Milli-Q/acetonitrilo (v/v).

As amostras são injectadas num Analisador de 50 ΡΕ2364185

Espectroscopia de Massa para Monitorização Selectiva de Iões (SIM) a uma massa de 342,1 (1-OH-midazolam) e 346,1 (padrão interno a-hidroximidazolam-d4) utilizando Turbolon Spray em condições positivas. Os resultados são apresentados como % de inibição da formação de 1-OH-midazolam na presença de uma concentração de inibidor de 10 μΜ.

Seguindo o protocolo descrito, os compostos da invenção que se seguem aqui exemplificados (Exemplos 1-18, 26, 33-35, 44-51, 57-60, 66-69, e 85-94) apresentam <45% de inibição. Para além disso, os compostos dos Exemplos 1-5, 7-17, 33-35, 44, 46, 49-51, 57-59, 66-68, 85, e 89-94 apresentam <10% de inibição.

Lisboa, 17 de julho de 2013

Claims

ΡΕ2364185 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto com a seguinte fórmula:

em que, R1 é hidrogénio, flúor, ciano, trifluorometilo ou metoxi; R2 é hidrogénio, flúor ou trifluorometilo; R3 é hidrogénio ou cloro, desde que pelo menos um de R2 e R3 seja hidrogénio; R4 é cloro, flúor, ciano, trifluorometilo, difluoro-metoxi, metoxi ou trifluorometoxi; -f-N N-/- tituído subs- representa seleccionado do grupo um piperazino-1,4-diilo constituído por

Mé Me , / v . > / \ , , ·Γ \ , τ" N N—r -~r"|S| K|-f— ~f~f\i Kl—*- ’ \_/ ' ' \_/ · , * \^j * Me Me

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OH OU > •N N“ú \_t ' ou um seu sal farmaceuticamente aceitável 2 ΡΕ2364185
2. Composto da reivindicação 1 em que R1 é hidrogénio, flúor ou ciano, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. Composto de acordo com a reivindicação 2 em que R1 é flúor, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que R2 é hidrogénio ou flúor, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que R2 é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que R3 é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que R4 é flúor, cloro, ciano, trifluorometoxi, trifluorometilo ou difluorometoxi, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que R4 é flúor ou ciano, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. ΡΕ2364185 3 das
9. Composto de acordo com qualquer uma reivindicações 1 a em que > / \ . ~r _n-j- é Me ou / , N N-f ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que é (S)—N-(4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil)ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
11. Composto de acordo com a reivindicação 10 que é cloridrato de (S)-N- (4-fluorofenil)-4-(4-(4-fluorofenil) ftalazin-l-il)-2-metilpiperazina-l-carboxamida.
12. Composição farmacêutica compreendendo o composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -11, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um veiculo, diluente ou excipiente farmaceu-ticamente aceitável.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para ser utilizado como um medicamento.
14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento do cancro. 4 ΡΕ2364185
15. Composto ou sal para ser utilizado de acordo com a reivindicação 14 em que o cancro é selecionado do grupo constituído por cancro do cérebro, carcinoma basal celular, cancro do esófago, cancro gástrico, cancro pancre-ático, cancro do tracto biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro das pequenas células do pulmão, linfoma das células-B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorectal, cancro do figado, cancro do rim e melanoma. Lisboa, 17 de julho de 2013 1 ΡΕ2364185 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • WO2O0SO33288A * WO 28Ô811S81 “S A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * P. STAHL st ai. HANBBQGK Df PHARMACSJTi- GAi SAtTS: FROPERTfiES, SELECTOM AND LSSE. VCHAÍWBffjif-VCH. 2082 « SJC. SER-SE «t sl, Pi»rroacsuÉKa Ssfe. of Smncm. Jsnusty 19??., mqL >39- ξΐ « RE&KNGTQN; THE SCENCE AND PR&GTiCE. OF PHAR&ÍÂCT, Fisbãshíng Co.. 1SSS J. Oí-g, Càsm., 23Q7, 1% 5104-5112 • SRSEME; WUTS. Piatediv» Qroups Is Orgsifc S^itesss, Jshfi Wifey snd S-ors. 1SS9 Assa? -Gn&ísfstse &3®tuaí . E& »n£ Oaiapaey «5^ NÍH ChefR&si Gessasses CsrIsí', 239®