MX2011004683A - Antagonistas de la via hedgehog de ftalazina disustituida. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee antagonistas de la vía hedgehog de ftalizina 1,4-disustituida novedosos útiles en el tratamiento de cáncer.

Description

ANTAGONISTAS DE LA VIA HEDGEHOG DE FTALAZINA DISUSTITUIDA La presente invención se refiere a antagonistas de la vía Hedgehog y, más específicamente, a ftalazinas 1,4-disustituidas novedosas y uso terapéutico de las mismas. La vía de señalización Hedgehog (Hg) realiza una función importante en la formación de patrón embriónico y mantenimiento de tejido adulto al dirigir la diferenciación y proliferación celular. La familia de proteínas Hedgehog (Hh) , que incluye Hedgehog Sonic (Shh) , Hedgehog de India (Ihh) , y Hedgehog desierto (Dhh) son glicoproteínas secretadas que experimentan modificaciones post-traslacionales , incluyendo escisión auto-catalítica y acoplamiento de colesterol al péptido amino-terminal para formar el fragmento que posee la actividad de señalización. Hh se une a la proteína transmembrana de doce pasos Ptch (Ptchl y Ptch2) , aliviando de este modo la supresión mediada por Ptch de Smoothened (Smo) . La activación Smo dispara una serie de eventos intracelulares que culminan en la estabilización de los factores de transcripción Gli (Glil, Gli2, y Gli3) y la expresión de genes dependientes de Gli que son responsables de la proliferación celular, supervivencia celular, angiogenesis e invasión.

La señalización Hh recientemente ha llamado el interés considerable con base en el descubrimiento de la activación aberrante de señalización Shh lleva a la formación de varios tumores, por ejemplo, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma de célula basal, cáncer de pulmón de célula pequeña, y cáncer de próstata. Varios antagonistas de Hh se han reportado en la técnica, tal como el compuesto alcaloide esteroidal IP-609; el compuesto aminoprolina CUR61414; y el compuesto tiazol 2 , 4-disustituido JK18. WO2005033288 describe ciertos compuestos de ftalazina 1,4-di- sustituida que se afirma son antagonistas de hedgehog. Similármente, WO2008110611 describe ciertos compuestos de ftalazina 1 , -disustituida relacionados al diagnóstico y tratamiento de patologías relacionadas a la vía hedgehog.

Existe aún una necesidad de inhibidores potentes de la vía hedgehog, particularmente aquellos que tienen perfiles farmacodinámicos, farmacocinéticos y toxicológicos deseables. La presente invención provee ftalazinas 1 , 4-disustituidas novedosas que son antagonistas potentes de esta vía.

La presente invención provee un compuesto de fórmula I : Fórmula I en donde , R1 es hidrógeno, fluoro, ciano, trifluorometilo o metoxi ; R2 es hidrógeno, fluoro o trifluorometilo; R3 es hidrógeno o cloro, siempre que al menos uno de R2 y R3 sea hidrógeno; R4 es cloro, fluoro, ciano, trifluorometilo, metoxi, difluorometoxi o trifluorometoxi ; representa un piperazina-1 , 4 -diilo sustituido seleccionado del grupo que consta de Me Me Me N N- N N- N N Me Me Me o una sal f rmacéuticamente aceptable de los mismos - En las estructuras de anillo piperazina anteriores se entenderá que el lado izquierdo del anillo piperazina, como se dibuja, se enlaza a la ftalizina bicíclica y el lado derecho del anillo piperazina se enlaza al carbonilo.

Se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica que los compuestos de la presente invención comprenden un radical amina terciaria y son capaces de reaccionar con un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables . Dichas sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable y metodología común para su preparación se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, P . Stahl , et al . , HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS : PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH , 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, Enero 1977.

Modalidades específicas de la invención incluyen compuestos de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde: (a) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; (b) R1 es fluoro; (c) R2 es hidrógeno o fluoro; (d) R2 es hidrógeno; (e) R3 es hidrógeno; (f) R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (g) R4 es fluoro o ciano; (h) R4 es fluoro; (i) -7- (j) (1) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; y R ,22 es hidrógeno o fluoro; (m) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano, y R2 es hidrógeno ; (n) R1 es fluoro; y R2 es hidrógeno o fluoro; (o) R1 es fluoro; y R2 es hidrógeno; (p) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno o fluoro; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (q) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (r) R1 es fluoro; R2 es hidrógeno o fluoro; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (s) R1 es fluoro; R2 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi o trifluorometilo ; (t) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno o fluoro; R3 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (u) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno; R3 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi, difluorometoxi o trifluorometilo; (v) R1 es fluoro; R2 es hidrógeno o fluoro; R3 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; y (w) R1 es fluoro; R2 es hidrógeno; R3 es hidrógeno; y R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; (x) R1 es fluoro; R2 es hidrógeno; R3 es hidrógeno; y R4 es fluoro; (y) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno o fluoro; y (z) R1 es hidrógeno, fluoro hidrógeno; y (z) R1 es fluoro, R2 es hidrógeno o fluoro; y (aa) R1 es hidrógeno, fluoro o ci no; R2 es hidrógeno o fluoro; R3 es hidrógeno; R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , difluorometoxi o trifluorometilo; y (bb) R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es hidrógeno; R3 es hidrógeno; R4 es fluoro o ciano; y La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de la presente invención se formulan preferiblemente como composiciones farmacéuticas administradas por una variedad de rutas. Preferiblemente, dichas composiciones son para administración oral o intravenosa. Dichas composiciones farmacéuticas y procesos para su preparación se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, REMINGTO : THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds . , 19ta ed. , Mack Publishing Co., 1995).

La presente invención también provee un método para el tratamiento de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de riñon o melanoma en un paciente que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Se entenderá que la cantidad del compuesto administrada en el presente se determinará por un especialista bajo las circunstancias relevantes, incluyendo la condición a ser tratada, la ruta seleccionada de administración, el compuesto o compuestos presentes administrados, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente. Las dosis por día normalmente estarán dentro de un intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosis abajo del límite inferior del intervalo antes mencionado puede ser más que adecuado, mientras que en otros casos dosis aún más grandes se pueden emplear. Por lo tanto, el intervalo de dosis anterior no pretende limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Esta invención también provee un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usarse como un medicamento.

Adicionalmente, esta invención provee el uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En particular, el cáncer se selecciona del grupo que consta de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de riñon o melanoma.

Adicionalmente, esta invención provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como un ingrediente activo para el tratamiento de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de riñón o melanoma.

Los compuestos de fórmula I, o sales de los mismos, se pueden preparar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, así como aquellos descritos en los esquemas, preparaciones y ejemplos de abajo. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas se pueden combinar de diferentes maneras, o junto con las etapas de diferentes esquemas, para preparar compuestos de fórmula I, o sus sales.

Los sustituyentes , a menos que se indique otra cosa, son como se definió antes. Los reactivos y materiales de inicio generalmente están disponibles fácilmente por una persona con experiencia en la técnica. Otros se pueden elaborar por medio de técnicas estándar de química orgánica y heterocíclica, técnicas que son análogas a la síntesis de compuestos similares estructuralmente conocidos, y los procedimientos descritos en las preparaciones y ejemplos que siguen incluyendo cualquier procedimiento novedoso.

Como se usa aquí, los siguientes términos tienen los significados indicados: "Et20" se refiere a dietil éter, "DMF" se refiere a dimetilformamida; "DMSO" se refiere a sulfóxido de dimetilo; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; "MeOH" se refiere a metanol; "MTBE" se refiere a metil-ter-butil éter; "boc" o "t-boc" se refiere a ter-butoxicarbonilo; "SCX" se refiere a intercambio de cationes fuerte; y "IC50" se refiere a la concentración de un agente que produce 50% de la respuesta inhibidora máxima posible para ese agente.

ESQUEMA 1 etapa 4 Un compuesto de fórmula (6b) se puede preparar de acuerdo a las reacciones como se representan en el esquema 1.

En el esquema 1, etapa 1, 1 , 4 -dicloroftalazina (2) puede reaccionar con una piperazina sustituida (3a) o (3b) en una sustitución aromática nucleofílica (SNAr) para proveer una ftalazina de piperazinilo de fórmula (4a) o (4b) . La reacción toma lugar en un solvente aprótico dipolar tal como DMSO o DMF con una base apropiada tal como trietilamina, diisopropiletilamina, o carbonato de potasio. La mezcla se calienta a aproximadamente 70-150°C. La persona con experiencia en la técnica reconocerá que en algunos casos será conveniente usar un grupo de protección tal como un grupo t-boc en una piperizina de fórmula (3a) permitiendo la protección del átomo de nitrógeno menos bloqueado, como en (S) -ter-butil-3-metilpiperazina-l-carboxilato. A la inversa, cuando la reacción toma lugar en el nitrógeno menos obstruido puede ser posible usar piperazinas no protegidas tales como cis-2 , 6-dimetilpiperazina o piperazin-2-il-metanol . Ninguna protección se requiere cuando se usa 2 , 5-dimetilpiperazina .

En la etapa 2, el cloruro de ftalazinilo de fórmula (4) reacciona con un ácido fenilborónico bajo condiciones de acoplamiento cruzado de Suzuki. Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que hay una variedad de condiciones útiles para facilitar dichas reacciones de acoplamiento cruzado. Las condiciones de reacción hacen uso de un solvente adecuado tal como dioxano o dioxano/agua . La reacción se realiza en presencia de una base tal como carbonato de cesio o fluoruro de cesio. La reacción toma lugar en presencia de un catalizador de paladio tal como bis (di-ter-butil (4-dimetilaminofenil ) fosfina) dicloropaladio (II) , cloruro de (1, 1' -bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio (II) , o (SP-4-1) -bis [bis (1, 1-dimetiletil) (4-metoxifenil) fosfina- ?] dicloropaladio (preparado de acuerdo a la síntesis de catalizador D en J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112) bajo una atmósfera inerte a una temperatura de aproximadamente 80-110°C para dar un fatalazina piperazinilo fenilo de fórmula (6a) o (6b) .

Alternativamente, en la etapa 3, un cloruro de ftalazinilo fenilo de fórmula (5) reacciona con una piperazina de fórmula (3a) o (3b) en una sustitución aromática nucleofílica (SNAr) similar a la descrita en la etapa 1, anterior.

En el esquema 1, etapa 4, la funcionalidad amina, tal como la que está presente en la ftalazina piperazinilo fenilo de fórmula (6a) , se puede desproteger a (6b) y reaccionar además para dar compuestos de la invención. Métodos para retirar grupos protectores de nitrógeno se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)). Por ejemplo, la desprotección boc de ftalazina piperazinilo fenilo de fórmula (6) se puede realizar bajo condiciones acidas, tales como con cloruro de hidrógeno. La sal de HC1 resultante se puede transformar a la amina libre usando una columna SCX o una base inorgánica tal como bicarbonato de sodio.

Se apreciará por una persona con experiencia en la técnica que los compuestos de fórmula (5) en el esquema 1 son comercialmente disponibles o se pueden preparar fácilmente por métodos similares a los descritos aquí o al usar procedimientos que están establecidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido 2-fenilcarbonilo benzoico, generado de una reacción Grignard de un bromuro de fenil magnesio con anhídrido itálico, se puede ciclar con hidrazina para dar una 4-fenil-2H-ftalazin-l-ona. Tratamiento posterior con oxicloruro fosforoso provee la l-cloro-4-fenil-ftalazina de fórmula (5). Alternativamente, 1 , 4-dicloroftalazina puede reaccionar con un ácido fenil borónico en una reacción de acoplamiento cruzado Suzuki para dar la correspondiente 1-cloro-4-fenil-ftalazina de fórmula (5) .

ESQUEMA 2 (7) En el esquema 2 , la ftalazina piperazinilo desprotegida de fórmula (6b) se puede acilar usando un isocianato de fenilo sustituido en un solvente inerte tal como diclorometano para dar una urea de fórmula (I) .

Las siguientes preparaciones y ejemplos se proveen para ilustrar la invención con detalle adicional y representa la síntesis típica de los compuestos de fórmula (I) . Los nombres de los compuestos de la presente invención generalmente se proveen por ChemDraw Ultra® 10.0.

PREPARACION 1 4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo Se calienta la mezcla de l-cloro-4- (4-fluorofenil) ftalaz na (5.0 g, 19.3 mmol) , 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (5.03 g, 25.1 mmol), y trietilamina (8.1 mi, 59.0 mmol) en DMSO (97 mi) a 115°C durante 3 días. Se vierte la mezcla de reacción en agua, se enjuaga con CH2C12. Se extrae con Et20. Se lava la capa orgánica con agua (2x) , entonces se seca sobre Na2S04 y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (gradiente de 0 a 20% EtOAc en CH2C12) para proveer el compuesto del título como una espuma amarillo pálido (7.05 g, 84%) . ES/MS m/z 423.2 (M+l) .

Procedimiento alterno: Se añade 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (276 g, 1.38 mol) a una suspensión de l-cloro-4- (4 -fluorofenil) ftalazina (275 g, 1.06 mol) y diisopropiletilamina (346 mi, 1.99 mol) en DMSO (2.56 1) a 25°C. Se calienta la mezcla a 102°C durante 9 horas. Se enfría la reacción a 25°C y se agita durante 48 horas. Se añade la mezcla a EtOAc (2.5 1) y agua (3.5 1) . Se extrae la fase acuosa con acetato de etilo (2 x 2.0 1) . Se combinan las capas orgánicas, se lavan con agua (2.5 1) y se concentran a una espuma color marrón. Se disuelve la espuma en acetonitrilo (1.0 1) y se enfría a 1°C durante 30 minutos. Se filtra el precipitado para obtener un sólido color tostado. Se concentra el licor madre y se hace lechada del residuo en acetonitrilo (500 mi) durante 30 minutos. Se filtra la mezcla para obtener un sólido color tostado. Se combinan los precipitados sólidos y se secan en un horno de vacío (14 torr, 25°C) durante 25 horas para obtener el compuesto del título como un sólido color tostado (435 g, 96%) . ES/MS m/z 423.0 (M+l) .

Las piperazinilftalazinas se preparan en el cuadro de abajo esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la preparación 1, usando 1.5 equivalentes de la piperazina sustituida apropiadamente y 3-5 equivalentes de trietilamina a una temperatura de 115 a 150°C durante 3 a 6 días. *uso de DMF como el solvente Procedimiento alterno para la preparación 2 Se añade l-cloro-4- (4-fluorofenil) ftalazina (200 g, 773 mmol) a una solución de 3 -metilpiperazina-1- carboxilato de (S) -ter-butilo (232 g, 1.16 mmol), diisopropiletilamina (674 mi, 28.1 mol), y DMSO (2.0 1) . Se calienta la mezcla a 120°C durante 60 horas. Se enfría la mezcla a 25°C, se vierte en agua helada (3.0 1) y se filtra. Se colectan los sólidos, se disuelven en CH2C12 (2.0 1) y se extraen con agua (2.0 1) . Se concentra la fase orgánica y se añade a un tapón de sílice (3.0 kg de sílice) se eluye con THF 3% en CH2C12 para dar el compuesto del título como una espuma amarilla (126 g, 38%) . ES/MS m/z 423.0 (M+l) .

PREPARACION 7 2-etil-4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) piperazina- 1-carboxylato de (S) -ter-butilo Se calienta la mezcla de l-cloro-4- (4-fluorofenil) ftalazina (5.02 g, 19.4 mmol) , 2-etilpiperazina-1-carboxilato de (S) -ter-butilo (5.00 g, 23.3 mmol) y K2C03 (5.38 g, 38.9 mmol) en DMSO (75 mi) a 120°C durante 1 día. Se vierte la mezcla de reacción en agua, se enjuaga con EtoAc. Se extrae con EtOA. Se lava la capa orgánica con agua (2 x) , entonces con salmuera, se seca sobre Na2S04, y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (gradiente de 20 a 80% EtOAc en hexanos) para proveer el compuesto del título (5.11 g, 60%). ES/ S m/z 437.2 (M+1).

La piperazinilftalazina se prepara en el cuadro de abajo esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la preparación 7, usando cis-2 , 6-dimetilpiperazina.

PREPARACION 9 (R) - (4- (4- (4-Fluorofenil) ftalazin- 1-il) iperazin-2-il ) metanol Se disuelve l-cloro-4- (4-fluorofenil) ftalazina (0.1 g, 0.9 mmol) , (R) -piperazin-2-ilmetanol (0.07 g, 0.58 mmol) y diisopropiletilamina (0.34 mi, 1.93 mmol) en DMSO (1 mi). Se agita la reacción a 120°C durante 64 horas. Se purifica la mezcla de reacción por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (0-10% 2M amoníaco/MeOH en CH2C12) para dar el compuesto del título como un sólido marrón (0.11 g, 84%) .

ES/MZ m/z 339.0 (M+l) .

Se preparan la piperazinilftalazinas en el cuadro de abajo esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la preparación 9, usando la piperazina sustituida apropiadamente .

PREPARACION 14 4- (4-cloroftalazin-1-il) -3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo calienta una mezcla de 1, 4-dicloroftalazina (10.0 g, 50.2 mmol) , 3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (15.1 g, 75.4 mmol) y trietilamina (21.0 mi, 150.7 mmol) en DMSO (200 mi) a 120°C durante 2 días. Se vierte la mezcla de reacción en agua, se enjuaga con CH2C12. Se extrae con Et20. Se lava la capa orgánica con agua (2 x) , se seca sobre Na2S04, y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (gradiente de 0 a 20% EtOAc en CH2C12) para proveer el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (6.0 g, 33%). ES/MS m/z (35C1) 363.0 (M+l) .

PREPARACION 15 4- (4-cloroftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo Se calienta una mezcla de 1 , 4 -diclorof alazina (7.80 g, 39.2 mmol) , 2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (4.98 g, 24.9 mmol) y trietilamina (10.3 mi, 73.9 mmol) en DMSO (110 mi) a 80°C durante 18 horas. Se vierte la mezcla de reacción en agua, se enjuaga con EtOAc . Se extrae con EtOAc . Se lava la capa orgánica con agua (2 x) y salmuera, y se seca sobre Na2S0 , y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (gradiente de 20 a 80% EtOAc en hexanos) para proveer el compuesto del título (4.13 g, 46%). ES/MS m/z (35C1) 363.0 (M+l) .

PREPARACION 16 4- (4- (4-cianofenil) ftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo Se calienta una mezcla de 4- (4-cloroftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (4.0 g, 11.0 mmol), ácido 4-cianofenilborónico (2.43 g, 16.5 mmol), carbonato de cesio (14.4 g, 44.1 mmol) y (SP-4-1)-bis [bis (1 , l-dimetiletil) (4 -metoxifenil) fosfina-??] dicloro-paladio (J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112) (75.4 mg, 0.11 mmol) en 1,4-dioxano (80 mi) y agua (20 mi) a 90°C durante la noche. Se divide la mezcla de reacción entre agua y CH2C12. Se extrae la capa acuosa con CH2C12. Se seca la capa orgánica combinada sobre Na2S04 y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 20% EtOAc en CH2C12) para proveer el compuesto del título como una espuma color naranja ligero (4.46 g, 94%). ES/ S m/z 430.2 (M+l) .

Se preparan las piperazinilftalazinas en el cuadro posterior esencialmente siguiendo el siguiente procedimiento descrito en la preparación 16, usando la 4-cloroftalazina apropiada y ácido borónico. Las degasificaciones de preparaciones 19-20 antes de añadir bis (di-ter-butil (4-dimetilaminofenil) fosfina) dicloropaladio (II) como el catalizador, y se calientan las mezclas resultantes a 90°C durante 72 horas.

PREPARACION 21 4- (4- (4-metoxifenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo Se trata una mezcla desgasificada cloroftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato ter-butilo (0.81 g, 2.23 mmol) , ácido 4-metoxibencenoborónico (1.07 g, 7.05 mmol) y fluoruro de cesio (1.05 g, 6.94 mmol) en 1,4-dioxano (30 mi) con cloruro de (1,1'-bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio (II) (0.27 g, 0.33 mmol). Se calienta la mezcla resultante a 95°C durante la noche. La división de la mezcla de reacción entre agua y EtOAc . Se extrae la capa acuosa con EtOAc. Se lava la porción orgánica con agua y salmuera, se seca sobre NaS04 y se concentra bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante por medio de cromatografía instantánea de gel de sílice (gradiente de 15 a 70% EtOAc en hexanos para proveer el compuesto del título (0.94 g, 96%) .ES/MS m/z 435.2 (M+l) .

PREPARACION 22 (S) -1- (4-Fluorofenil) -4- (3-metilpiperazin-l-il) ftala fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (7.05 g, 16.2 mmol) en 1,4-dioxano (50 mi) con 4M HCl en 1,4-dioxano (25 mi) . Se añade MeOH para disolver el precipitado resultante y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Se concentra la mezcla de reacción bajo presión reducida. Se disuelve el residuo en MeOH y se vierte sobre una columna Varían® SCX 50 g. Se enjuaga con MeOH y CH2C12, entonces se eluye el producto con 1:1 CH2C12:2M amoníaco en MeOH. Se concentra el eluyente bajo presión reducida para proveer el compuesto del título como una espuma amarilla pálida (4.83 g, 93%). ES/MS m/z 323.3 (M+l) .

Procedimiento alterno para la preparación 22 Se enfría metanol (2.82 1) a 0°C vía un baño de acetona/agua 1:1 con hielo seco, y se añade cloruro de acetilo (142 mi, 2.0 mol) gota a gota alrededor de un periodo de 30 minutos, manteniendo la temperatura debajo de 15°C durante la adición. Se agita la mezcla durante 15 minutos. Se añade 4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (282 g, 667 mmol) en una porción. Se agita la mezcla durante 12 h a 25°C. Se concentra y se disuelve el residuo en agua (3.0 1) . Se añade NaHC03 sólido hasta que el pH es 7. Se extrae el producto con CH2C12 (2 x 2.0 1), se combinan las capas orgánicas, y se concentran para proporcionar el compuesto del título como una espuma rompible color pardo en rendimiento cuantitativo (236 g, >100%) . ES/EM m/z 323.0 (M+H) .

Se preparan las piperazinilftalazinas en el cuadro posterior al seguir esencialmente el procedimiento descrito en la preparación 22, usando la piperazinilftalazina boc-protegida apropiada con tiempos de reacción de 2 h toda la Para las preparaciones 30-34 se usa MeOH como PREPARACION 35 3-fluoro-4-isocianatobenzonitrilo Se enfría una solución de trifosgeno (1.09 g, 3.67 mmol) en tolueno (20 mi) en un baño de agua helada. Se trata con una solución de 4-amino-3-fluorobenzonitrilo (1.36 g, 10.0 mmol) y trietilamina (2.8 mi, 20.0 mmol) en tolueno (30 mi) gota a gota. Se calienta la mezcla resultante a 70°C durante 5 horas. Se enfría la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se filtra el sólido. Se concentra el filtrado bajo presión reducida para proporcionar un sólido blanco (1.44 g, 84%) que se usa sin purificación adicional. GC/EM m/z 162 (M+) .

Se prepara el isocianato conocido en el cuadro posterior de la anilina apropiada, al seguir esencialmente el procedimiento descrito en la preparación 35.

Ejemplo 1 Clorhidrato de (S) -N- (4-fluorofenil) -4- (4- fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxamida Se trata una solución de (S) -1- (4-fluorofenil) -4- (3-metilpiperazin-l-il) ftalazina (1.0 g, 3.1 mmol) en CH2C12 (31 mi) con 1-fluoro-4-isocianatobenceno (0.42 mi, 3.72 mmol) . Se agita durante 3 días a temperatura ambiente. Se concentra la mezcla de reacción bajo presión reducida. Se tritura el residuo con Et20 y se filtra. Se enjuaga el sólido con pentano y después se seca en un horno de vacío a 45°C. Se disuelve el sólido en una mezcla de CH2C12 y MeOH y se trata con 3 eq de HC1 1M en Et20. Se agita la mezcla resultante, se concentra bajo presión reducida, y se seca en un horno de vacío a 45°C para producir la sal clorhidrato del título como una espuma amarilla (1.5 g, 98%). ES/EM m/z 460.0 (M+l) .

Procedimiento alterno para el ejemplo 1 Se añade 1-fluoro-4-isocianatobenceno (105 mi, 930 mmol) gota a gota alrededor de 1 hora a una solución de (S) -1- (4-fluorofenil) -4- (3-metilpiperazin-l-il) ftalazina (300 g, 930 mmol) en CH2C12 (4.5 1) a 25°C. Se agita la mezcla durante 25 minutos, y se concentra a una espuma. Se suspende la espuma en MTBE (3.0 1), y se lava la torta húmeda con MTBE (500 mi) . Se concentra el licor madre a un aceite. Se suspende el aceite en acetato de etilo (2.0 1) para proporcionar un sólido y se filtra. Se combinan los sólidos filtrados y se secan para obtener el compuesto del título como un sólido color tostado (344 g, 80%) . Se suspende el sólido (327 g, 711 mmol) en isopropanol (3.27 1) a 42°C y se trata con HCl 4M en 1,4-dioxano (177 mi, 711 mmol). Se calienta la mezcla resultante a 60°C durante 30 minutos. Se enfría a 25°C lentamente alrededor de 2 horas. Se filtra y se lava la torta caliente con isopropanol (200 mi) y heptano (200 mi) . Se seca la torta en un horno de vacío (12 torr, 35°C, 2 h) para obtener el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (308 g, 87%). ES/EM m/z 460.0 (M+l) .

Ejemplo 2 Clorhidrato de (S) -N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -3-metilpiperazina-l-carboxamida Se trata una solución de (S) -1- (4-fluorofenil) -4-(2-metilpiperazin-l-il) ftalazina (0.5 g, 1.55 mmol) en CH2C12 (15.5 mi) con 1-fluoro-4-isocianatobenceno (0.194 mi, 1.71 mmol). Se agita toda la noche a temperatura ambiente. Se purifica la mezcla de reacción mediante cromatografía en gel de sílice instantánea (gradiente de 0 a 3% amoníaco 2M/MeOH en CH2C12) . Se disuelve la base libre purificada en una mezcla de CH2C12 y MeOH y se trata con 3 eq de HC1 1M en Et20. Se agita la mezcla resultante, se concentra bajo presión reducida, y se seca en un horno de vacío a 45°C para producir la sal clorhidrato del título como una espuma amarilla (0.72g, 94%). ES/EM m/z 460.0 (M+l) .

Procedimiento alterno para el ejemplo 2 Se añade 1-fluoro-4-isocianatobenceno (27.9 mi, 245 mmol) gota a gota alrededor de 1 hora a una solución de (S) -1- (4-fluorofenil) -4- (2-metilpiperazin-l-il) ftalazina (72 g, 223 mmol) en CH2C12 (500 mi) a 25°C. Se agita la mezcla durante 25 minutos y se concentra a una espuma. Se añade cloruro de acetilo (16.5 mi, 231 mmol) a metanol a 0°C y se agita durante 5 minutos. Se añade la espuma a la solución de metanol y se agita durante 1 hora. Se concentra la solución a una espuma. Se suspende la espuma en acetonitrilo (200 mi) y CH2C12 (30 mi) , se filtra y se colecta el compuesto del título como un sólido amarillo (91 g, 86%) . ES/E m/z 460.0 (M+l) .

Se preparan las ureas en el cuadro posterior por esencialmente los procedimientos descritos en el ejemplo 1 o ejemplo 2, usando piperazinilftalazina apropiada y un exceso ligero de isocianato apropiado. Tiempos de reacción varían de 0.5 h a 3d. Los compuestos de purificación mediante trituración (con Et20 o CH2C12 : hexanos 1:1) o mediante cromatografía en gel de sílice instantánea. Por ejemplo, 57-60 y 66-69, se purifica mediante cromatografía de fase inversa guiada de masa (Columna Waters XBridge C18 ODB EM HPLC, 30 x 75 mm, tamaño de partícula 5 µp?, gradiente de 20 a 70% de acetonitrilo en agua, que contiene bicarbonato de amonio 0.01M, en velocidad de flujo de 85 ml/min) . Para los ejemplos 75-82, el uso de isocianatos crudos (Preparaciones 35-36) en 1.5-2 veces en exceso. Para los ejemplos 18, 29 y 38 omiten MeOH del procedimiento de formación de sal HCl.

Nombre químico Estructura ES/EM m/z Clorhidrato de (R) - N- 467.2 (4-Cianofenil) -4- (4- (M+1) (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-1-carboxamida Clorhidrato de (J?) -N- 478.2 (2 , 4-Difluorofenil) -4- (M+1) (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-1-carboxamida Clorhidrato de (R) -N- 460.2 (4-Fluorofenil) -4- (4- (M+1) (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -3- metilpiperazina-1-carboxamida Clorhidrato de (i?) -4- 526.2 (4- (4-Fluorofenil) (M+1) ftalazin-l-il) -3-metil-iV- (4- ( trifluorometoxi ) fenil) piperazina-1-carboxamida Clorhidrato de (R) - N- 467.2 (4-Cianofenil) -4- (4- (M+1) (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -3- metilpiperazina-1-carboxamida Clorhidrato de (i?) -N- 478.2 (2 , 4-Difluorofenil) -4- (M+1) (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -3- metilpiperazina-1-carboxamida Ejemplo 90 Clorhidrato de (R) -N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2- (hidroximetil) piperazina-1-carboxamida Se trata una solución de (R) - (4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) iperazin-2-il) -metanol (0.15 g, 0.44 mmol) en CH2C12 (3 mi) con 1-fluoro-4-isocianatobenceno (0.04 g, 0.31 mmol). Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se concentra la mezcla de reacción. Se purifica el residuo resultante mediante cromatografía en gel de sílice instantánea (0-50% de EtOAc en hexanos, después se intercambia a 3% de MeOH en CH2C12) para producir un sólido. Se disuelve el sólido en MeOH (1 mi) y se trata con HC1 acuoso 1N (0.13 mi, 0.13 mmol). Se concentra la solución para obtener el compuesto del título como un sólido (0.065 g, 29%). ES/EM m/z 476.0 (M+l) .

Se preparan las piperazinilftalazina ureas en el cuadro posterior al esencialmente seguir el procedimiento descrito en el ejemplo 90, usando la piperazinilftalazina e isocianato apropiados.

Ejemplos 94 y 95 Clorhidrato de N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -trans-2, 5-dimetilpiperazina-l-carboxamida, isómero 1 e isómero 2 Se trata una solución de 1- (trans-2 , 5-dimetilpiperazin-l-il) -4- (4-fluorofenil) ftalazina (0.3 g, 0.89 mmol) en CH2C12 (5 mi) con 1-fluoro-4-isocianatobenceno (0.17 g, 1.25 mmol). Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Se purifica la mezcla de reacción mediante cromatografía en gel de sílice instantánea (0-50% de EtOAc en hexanos) . Se mezclan y se concentran las fracciones apropiadas. Se disuelve la mezcla de isómeros de N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -trans-2 , 5-dimetilpiperazina-l-carboxamida (0.3 g, 0.59 mmol) en MeOH (2 mi) . Se separa la mezcla de isómeros trans mediante cromatografía quiral (Chiralcel OJ-H, velocidad de flujo 30 ml/min, detección 225 nm, eOH:acetonitrilo 6:4). Se colecta primero el pico de elución como el isómero 1 y el segundo pico de elución como el isómero 2. Se mezclan y se concentran las fracciones apropiadas. Se disuelven los isómeros separados en MeOH (1 mi) y se tratan cada solución con 1 equivalente de HCl acuoso 1N. Se concentra para proporcionar sales de clorhidrato del isómero I (0.131 g, 44%) y el isómero 2 (0.129 g, 43%). Isómero 1: ES/EM m/z 474.2 (M+l) , 99% ee. Isómero 2: ES/ME m/z 474.2 (M+l), 99% ee .

Ejemplos 96 y 97 Clorhidrato de N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) cis-2 , 5-dimetilpiperazina-l-carboxamida, isómero 1 e isómero 2 Se preparan los ejemplos 96 y 97, al seguir esencialmente el procedimiento como se describe para los ejemplos 94 y 95, usando la mezcla de cis-dimetilpiperazinas a partir de la preparación 12. Se separa la mezcla de cis-isómeros mediante HPLC quiral y produce las sales HC1 para proporcionar el isómero 1 (0.21 g, 34%) y el isómero 2 (0.20 g, 33%). Isómero 1: ES/EM m/z 474.2 (M+l) , 95% ee .

Isómero 2: ES/EM m/z 474.2 (M+l), 92% ee .

Biología Hedgehog Se ha implicado como un factor de supervivencia para los siguientes cánceres: carcinoma de célula basal; cánceres del tracto gastrointestinal superior (esófago, estómago, páncreas, y tracto biliar) ; cáncer de próstata, cáncer de mama; cáncer de pulmón de célula pequeña; cáncer de pulmón de célula no pequeña; linfoma de célula B; mieloma múltiple; cáncer gástrico; cáncer ovárico; cáncer colorrectal; cáncer del hígado; melanoma; cáncer de riñon; y cáncer cerebral .

Elementos de la trayectoria de Hedgehog se han acertado por ser objetivos de fármaco potenciales para el tratamiento de cánceres. Una línea celular Daoy establecida de tumor meduloblastoma (ATCC, HTB-186) , es sensible a ligandos Hh. Cuando estas células se tratan con medio acondicionado con Shh añadido exogenosamente, la trayectoria de señalización Hh se activa y resulta en una expresión incrementada de Glil. Ciclopamina, un alcaloide aislado del lirio de maíz Veratrum californicum es una antagonista de hedgehog débil y se ha mostrado que suprime la expresión de Glil en respuesta a estimulación Shh. Observaciones recientes sugieren que la ciclopamina inhibe el crecimiento de células de meduloblastoma cultivado y aloinjertos. Usando este sistema de modelo celular Daoy, inhibidores potentes de trayectorias de señalización de hedgehog se pueden identificar. Ya que los compuestos de la presente invención son antagonistas de hedgehog, estos son adecuados para tratar los tipos de tumor mencionados anteriormente.

Determinación de actividad biológica IC50 El siguiente protocolo de ensayo y sus resultados además demuestran la utilidad y eficacia de los compuestos y métodos de la invención actual . Ensayos funcionales proveen el soporte de que los compuestos de la presente invención exhiben la capacidad de inhibir la señalización de Shh. Todos los ligandos, solventes, y reactivos empleados en el siguiente ensayo son disponibles fácilmente de fuentes comerciales o se pueden preparar fácilmente por una persona con experiencia en la técnica.

Actividad biológica se determina usando un ensayo funcional en células cancerígenas neuronales Daoy y niveles de medida de ácido ribonucleico Glil vía un sistema de ensayo de ADNb (ácido deoxiribonucleico ramificado) (Panomics, Inc., Fremont, CA) . Gli se descubre originalmente en una línea celular de glioblastoma y codifica una proteína de dedo de zinc que se activa por la señalización de Shh. La respuesta máxima se obtiene al inducir la transcripción Glil en las células Daoy con medio acondicionado (riñon embriónico humano, células HEK-293 expresan establemente Shh recombinante) durante 24 horas y después se mide la cantidad de transcripto Glil estimulado. La respuesta mínima es la cantidad de transcripto Glil inhibido con un compuesto de control en células Daoy que se han estimulado con medio acondicionado (riñon embriónico humano, células HEK-293 que expresan establemente Shh recombinante) durante 24 horas.

Ensayo funcional para medición de la inhibición de Glil en células Daoy El sistema de ensayo de ADNb utiliza la tecnología de ADN de cadena ramificada para permitir la amplificación de un ácido ribonucleico objetivo (transcripto) . La tecnología emplea tres tipos de sondas de ADNc Glil-específicas cortas híbridas sintéticas que determina la especificidad del transcripto objetivo [extensores de captura (CEs) , extensores de etiqueta (LEs) , y bloqueadores (BLs) que hibridizan como un complejo con los transcriptos objetivo para amplificar la señal de hibridación. La adición del sustrato quimioluminégico durante la etapa de amplificación se permite para la detección usando luminiscencia.

La línea celular Daoy obtenida de Colección de cultivo tipo americano (ATCC) es una línea celular de tumor neuronal humano sensible a Shh y se establece en 1985 a partir de un tumor medulablastoma cerebelar desmoplástico, una línea celular de tumor relevante fisiológicamente.

Niveles endógenos de niveles de transcriptos Glil son bajos en células Daoy pero se pueden estimular al usar medio acondicionado tomado de las células que sobre-expresan establemente Shh humano (una línea celular HEK-293 establemente transfectada con hShh) .

Células Daoy se hacen crecer para confluencia en matraces T225 de cultivo de tejido en medio de crecimiento Daoy que contiene medio esencial mínimo (MEM) más 10% de Suero bovino fetal (FBS) con aminoácidos no esenciales 0.1 nM y 1 mM de piruvato de sodio. Las células se remueven de los matraces T225 usando ácido tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) , centrifugado, resuspendido en medio y después contado .

Las células Daoy después se siembran en 50,000 células por pozo en medio de crecimiento en placas de cultivo de tejido claras de 96 pozos y se dejan incubar toda la noche a 37°C bajo 5% de dióxido de carbono (C02) . Las células se lavan una vez en solución salina regulada de pH de fosfato (PBS) seguido por la adición de 100 µ? de medio acondicionado Shh (Shh-CM) para estimular niveles de expresión Glil. Shh-CM se diluye para lograr la estimulación máxima usando medio de control de crecimiento -0.1% de FBS/DMEM (Medio Eagle modificado de Dulbeccos) . Células Daoy tratadas con Shh-CM después se tratan con varias concentraciones de inhibidores de hedgehog que varían de aproximadamente 1 µp? a 0.1 nM . Compuestos de prueba se dejan incubar durante 24 horas a 37°C bajo 5% de C02.

La medición del transcripto Glil se realiza usando el ensayo Glil Quantigene 2.0 como se describe por el fabricante (Panomics, Inc.). Se prepara un regulador de Ph de mezcla de lisis diluido (DLM) , que incluye proteinasa K. Después de 24 horas de incubación con el compuesto, las células se lavan una vez con PBS y 180 µ? de DLM se añaden a las células. La placa celular que contiene el regulador de pH de lisis se sella y se coloca a 55°C durante 30 a 45 minutos. Los lisados de célula resultantes después se trituran 5 veces. Un conjunto de sonda de trabajo que contiene sondas Glil se hace al diluir las sondas en DLM de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y después 20 µ? del conjunto de sonda de trabajo se añade a placas de ensayo de ADNb junto con 80 µ? de lisados Daoy. Las placas se sellan y se incuban toda la noche a 55°C. Las placas de ADNb después se procesan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal se cuantifica al leer las placas en un lector Envision Perkin Elmer que detecta luminiscencia. La señal luminiscente es directamente proporcionar a la cantidad de transcripto objetivo presente en la muestra.

Los datos de señal luminiscente del ensayo funcional se usan para calcular la IC50 para el ensayo in vi tro. Los datos se calculan basados en los valores de control máximo (células Daoy tratadas con Shh-CM) y el valor de control mínimo (células Daoy tratadas con Shh-CM y una concentración inhibidora de un compuesto de control , 1 µp? de N- (3- (??-benzo [d] imidazol-2-il) -4-clorofenil) -3 , 5-dimetoxibenzamida) . Un cuarto ajuste curva de logística de parámetro se usa para generar los valores de IC50 usando programas de Software ActivityBase versión 5.3, ecuación 205 (Assay Guidance Manual Versión 5.0, 2008, Eli Lilly and Company y NIH Chemical Genomics center) .

Siguiendo el protocolo descrito, los compuestos de la invención ejemplificados aquí despliegan una IC50 de <40 nM. Por ejemplo, el compuesto del ejemplo 2 tiene un IC50 de aproximadamente 0.42 nM con un error estándar de 0.21 (n=2) en el ensayo descrito anteriormente. Estos resultados proveen evidencia de que los compuestos de la presente invención so antagonistas de hedgehog y, como tal, son útiles como agentes anticancerígenos.

Ensayo de inhibición de CYP3A4 Muestras de incubación se preparan mediante la adición de una preparación microsomal de hígado humano para el inhibidor de prueba (concentraciones finales 0.05 mg/ml de proteína, 10 µ?? de inhibidor en 100 nM de NaP04, regulador de pH con pH 7.4) se mezclan. Las muestras se pre- incuban por aproximadamente cinco minutos a 37°C. Siguiendo el periodo de pre- incubación, la reacción se inicia con la adición de una solución que contiene NADPH y midazolam, como el sustrato de enzima, (concentración final 1 mM de NADPH, 5 µp? de midazolam) . Después de la adición de solución de NADPH, las muestras se incuban durante 3 minutos a aproximadamente 37°C. Siguiendo el periodo de incubación, la reacción se extingue mediante la adición de 5 µ? de metanol (y un estándar interno para cromatografía) y las muestras se mezclan bien. Después de extinguir la reacción, la mezcla se centrifuga a aproximadamente 4000 rpm durante 15 minutos a aproximadamente 5°C y se analiza por análisis de LC/EM.

Las muestras se analizan usando HPLC/EM con elución de gradiente en columnas C18 convencionales cortas, (Fase móvil de carga - 95/5 milli-Q H20/metanol (v/v) con 1% de ácido acético. Fase móvil B - 80/20 Milli-Q H20/metanol (v/v) con 1% de ácido acético. Fase móvil C - 5/95 Milli-Q H20/metanol (v/v) con 1% de ácido acético. Fase móvil de enjuague - 75/25 Milli-Q H20/acetonitrilo (v/v) .

Las muestras se inyectan en un analizador espectral de masa para monitorear ion seleccionado (SI ) en una masa de 342.1 (1-OH-midazolam) y 346.1 (a-hidroximidazolam-d4 estándar interno) usando rociador Turbolon bajo condiciones positivas. Los datos se reportan como % de inhibición de la formación de 1-OH-midazolam en la presencia de una concentración inhibidora de 10 µp?.

Siguiendo el protocolo descrito, los siguientes compuestos de la invención ejemplificados aquí (Ejemplos 1-18, 26, 33-35, 44-51, 57-60, 66-69 y 85-94) despliegan < 45% de inhibición. Además, los compuestos de los ejemplos 1-5, 7-17, 33-35, 44, 46, 49-51, 57-59, 66-68, 85 y 89-94 despliegan <10% de inhibición.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES compuesto de la siguiente fórmula R1 és hidrógeno, fluoro, ciano, trifluorometilo o metoxi ; R2 es hidrógeno, fluoro o trimetilfluoro; R3 es hidrógeno o cloro, siempre que al menos uno de R2 y R3 sea hidrógeno; R4 es cloro, fluoro, ciano, trifluorometilo, difluorometilo, metoxi o trifluorometoxi ; representa un piperazina-1, 4-diilo sustituido seleccionado del grupo que consta de Me Me Me ÷N N- N - N— -?^ N÷ Me Me Me o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .
2. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R1 es hidrógeno, fluoro o ciano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque R1 es fluoro, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. 4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque R2 es hidrógeno o fluoro, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
5. 5. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque R2 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. 6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque R3 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. 7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado además porque R4 es fluoro, cloro, ciano, trifluorometoxi , trifluorometilo o difluorometilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. 8. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque R4 es fluoro o ciano, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
9. 9. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado además porque
10. 10. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque es (S) -N- (4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque es clorhidrato de (S)-N-(4-fluorofenil) -4- (4- (4-fluorofenil) ftalazin-l-il) -2-metilpiperazina-l-carboxamidá .
12. 12. Una composición armacéutica que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable .
13. 13. Un método de tratamiento de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de riñon o melanoma en un mamífero que comprende la administración a un mamífero en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. 1 . El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento.
15. 15. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer.