KR101335746B1 - 이치환된 프탈라진 헷지호그 경로 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암의 치료에 유용한 신규 1,4-이치환된 프탈라진 헷지호그 경로 길항제를 제공한다.
<화학식 I>

Description

이치환된 프탈라진 헷지호그 경로 길항제 {DISUBSTITUTED PHTHALAZINE HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONISTS}

본 발명은 헷지호그(Hedgehog) 경로 길항제, 보다 구체적으로 신규 1,4-이치환된 프탈라진 및 그의 치료 용도에 관한 것이다. 헷지호그 (Hh) 신호전달 경로는 세포 분화 및 증식을 지시함으로써 배아 패턴 형성 및 성체 조직 유지에서 중요한 역할을 수행한다. 소닉 헷지호그 (Shh), 인디안 헷지호그 (Ihh) 및 데저트 헷지호그 (Dhh)를 포함하는 헷지호그 (Hh) 단백질 패밀리는 번역 후 변형, 예를 들어 자가촉매적 절단 및 콜레스테롤의 아미노-말단 펩티드로의 커플링을 수행하여 신호전달 활성을 보유하는 단편을 형성하는 분비성 당단백질이다. Hh는 12회-통과 막횡단 단백질 Ptch (Ptch1 및 Ptch2)에 결합하고, 이로써 스무슨드(Smoothened)(Smo)의 Ptch-매개 억제를 완화시킨다. Smo 활성화는 세포 증식, 세포 생존, 혈관신생 및 침입에 책임이 있는 Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2, 및 Gli3)의 안정화 및 Gli-의존성 유전자의 발현을 초래하는 일련의 세포내 사건을 일으킨다.

Hh 신호전달은, Shh 신호전달의 비정상적 활성화가 다양한 종양, 예를 들어 췌장암, 수모세포종, 기저 세포 암종, 소세포 폐암 및 전립선암의 형성을 야기한다는 발견에 근거하여, 최근에 상당한 관심을 불러일으켜 왔다. 스테로이드성 알카로이드 화합물 IP-609; 아미노프롤린 화합물 CUR61414; 및 2,4-이치환된 티아졸 화합물 JK18과 같은 여러 Hh 길항제가 당업계에 보고된 바 있다. WO2005033288은 헷지호그 길항제로 주장된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다. 유사하게, WO2008110611은 헷지호그 경로와 관련된 병리상태의 진단 및 치료와 관련된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다.

강력한 헷지호그 경로 억제제, 특히 바람직한 약력학, 약동학 및 독성학 프로파일을 갖는 강력한 헷지호그 경로 억제제에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 이 경로의 강력한 길항제인 신규 1,4-이치환된 프탈라진을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 수소, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 메톡시이고;

R²는 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고;

R³은 수소 또는 클로로이되, 단 R² 및 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;

R⁴는 클로로, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸, 메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메톡시이고;

은

로 이루어진 군으로부터 선택된 치환된 피페라진-1,4-디일을 나타낸다.

상기 피페라진 고리 구조에서, 도시된 바와 같이, 피페라진 고리의 좌측이 비시클릭 프탈리진에 연결되어 있고, 피페라진 고리의 우측이 카르보닐에 연결되어 있는 것으로 이해될 것이다.

당업자라면, 본 발명의 화합물이 3급 아민 잔기를 포함하고, 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 제약상 허용되는 산 부가염 및 이들을 제조하기 위한 통상의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al ., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; [S.M. Berge, et al ., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, number 1, January 1977]을 참조한다.

본 발명의 구체적 실시양태는

(a) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고;

(b) R¹이 플루오로이고;

(c) R²가 수소 또는 플루오로이고;

(d) R²가 수소이고;

(e) R³이 수소이고;

(f) R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(g) R⁴가 플루오로 또는 시아노이고;

(h) R⁴가 플루오로이고;

(i)

이

이고;

(j)

이

이고;

(k)

이

이고;

(l) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소 또는 플루오로이고;

(m) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소이고;

(n) R¹이 플루오로이고; R²가 수소 또는 플루오로이고;

(o) R¹이 플루오로이고; R²가 수소이고;

(p) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소 또는 플루오로이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(q) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(r) R¹이 플루오로이고; R²가 수소 또는 플루오로이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(s) R¹이 플루오로이고; R²가 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(t) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소 또는 플루오로이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(u) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(v) R¹이 플루오로이고; R²가 수소 또는 플루오로이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(w) R¹이 플루오로이고; R²가 수소이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

(x) R¹이 플루오로이고; R²가 수소이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로이고;

(y) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소 또는 플루오로이고;

이

이고;

(z) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소이고;

이

이고;

(z) R¹이 플루오로이고; R²가 수소 또는 플루오로이고;

이

이고;

(aa) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소 또는 플루오로이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이고;

이

이고;

(bb) R¹이 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²가 수소이고; R³이 수소이고; R⁴가 플루오로 또는 시아노이고;

이

인

화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 조합으로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로로 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 경구 또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 이의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al ., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.

본 발명은 또한 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.

실제로 투여되는 화합물의 양은 치료할 상태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 비롯한 관련된 상황 하에서 의사에 의해 결정될 것으로 이해된다. 일일 투여량은 통상적으로 체중의 약 0.1 내지 약 5 mg/kg의 범위 내에 해당된다. 일부 경우에는 상기 언급한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 훨씬 더 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 용량이 사용될 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

추가로, 본 발명은 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 특히, 이들 암은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

게다가, 본 발명은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 위한 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 당업계에 공지된 다양한 절차 뿐만 아니라, 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 기재된 것에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 당업자에게 일반적으로 쉽게 이용가능하다. 다른 것은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기술, 및 임의의 신규 절차를 비롯한 하기의 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 따라 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 하기에 나타낸 의미를 갖는다: "Et₂O"는 디에틸 에테르를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "MTBE"는 메틸-tert-부틸 에테르를 지칭하고; "boc" 또는 "t-boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "SCX"는 강 양이온 교환을 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대하여 가능한 최대 억제 반응의 50％를 생성하는 작용제의 농도를 지칭한다.

<반응식 1>

화학식 6b의 화합물은 반응식 1에 도시된 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다.

반응식 1, 단계 1에서, 1,4-디클로로프탈라진 (2)는 치환된 피페라진 (3a) 또는 (3b)와 친핵성 방향족 치환 (SNAr)에서 반응하여 화학식 4a 또는 4b의 피페라지닐 프탈라진을 제공할 수 있다. 상기 반응은 이중극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 또는 DMF 중에서 적절한 염기, 예컨대 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 또는 탄산칼륨을 사용하여 발생한다. 혼합물을 약 70-150℃에서 가열한다. 당업자는 일부 경우에 (S)-tert-부틸-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트에서와 같이 덜 가려진 질소 원자의 보호를 허용하는 보호기, 예컨대, 화학식 3a의 피페라진에서의 t-boc 기를 사용하는 것이 유리할 것임을 인지할 것이다. 반대로, 반응이 덜 가려진 질소에서 발생하는 경우, 보호되지 않은 피페라진, 예컨대 시스-2,6-디메틸피페라진 또는 피페라진-2-일-메탄올을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 2,5-디메틸피페라진을 사용하는 경우에도 보호가 요구되지 않는다.

단계 2에서, 화학식 4의 프탈라지닐 클로라이드를 스즈끼 교차-커플링 조건 하에서 페닐보론산과 반응시킨다. 당업자는 이러한 교차-커플링 반응을 용이하게 하는데 유용한 다양한 조건이 존재함을 인지할 것이다. 반응 조건은 적합한 용매, 예컨대 디옥산 또는 디옥산/물을 사용하는 것으로 이루어진다. 상기 반응은 염기, 예컨대 탄산세슘 또는 불화세슘의 존재 하에 달성된다. 상기 반응은 약 80-110℃의 온도에서 불활성 분위기 하에 팔라듐 촉매, 예컨대 비스(디-tert-부틸(4-디메틸아미노페닐)포스핀)디클로로팔라듐(II), (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 또는 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org . Chem . 2007, 72, 5104-5112]에서의 촉매 D의 합성에 따라 제조됨)의 존재 하에 수행하여 화학식 6a 또는 6b의 페닐 피페라지닐 프탈라진을 제공한다.

별법으로, 단계 3에서, 화학식 5의 페닐 프탈라지닐 클로라이드는 상기 단계 1에서 기재된 바와 유사한 친핵성 방향족 치환 (SNAr)에서 화학식 3a 또는 3b의 피페라진과 반응시킨다.

반응식 1, 단계 4에서, 아민 관능기, 예컨대 화학식 6a의 페닐 피페라지닐 프탈라진에 존재하는 아민 관능기는 화학식 6b로 탈보호될 수 있고, 추가로 반응시켜 본 발명의 화합물을 제공할 수 있다. 질소 보호기의 제거 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)] 참조). 예를 들어, 화학식 6의 페닐 피페라지닐 프탈라진의 boc 탈보호는 산성 조건, 예컨대 염화수소 하에 달성될 수 있다. 생성된 HCl 염은 SCX 칼럼 또는 무기 염기, 예컨대 중탄산나트륨을 사용하여 유리 아민으로 변형될 수 있다.

당업자라면, 반응식 1에서의 화학식 5의 화합물이 시판되거나 또는 본원에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 또는 당업계에 확립된 절차를 사용하여 쉽게 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 프탈산 무수물과 페닐 마그네슘 브로마이드의 그리냐르 반응으로부터 생성된 2-페닐카르보닐 벤조산을 히드라진과 고리화시켜 4-페닐-2H-프탈라진-1-온을 제공할 수 있다. 옥시염화인으로의 후속 처리는 화학식 5의 1-클로로-4-페닐-프탈라진을 제공한다. 별법으로, 1,4-디클로로프탈라진을 스즈키 교차-커플링 반응으로 페닐 보론산과 반응시켜 상응하는 화학식 5의 1-클로로-4-페닐-프탈라진을 제공할 수 있다.

<반응식 2>

반응식 2에서, 화학식 6b의 탈보호된 피페라지닐 프탈라진을 불활성 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 치환된 페닐 이소시아네이트를 사용하여 아실화시켜 화학식 I의 우레아를 제공할 수 있다.

하기 제조예 및 실시예는 더욱 상세히 본 발명을 설명하고 화학식 I의 화합물의 전형적인 합성을 나타내기 위해 제공된다. 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 켐드로우 울트라® 10.0에 의해 제공된다.

제조예 1

(S)-tert-부틸 4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (97 mL) 중 1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (5.0 g, 19.3 mmol), (S)-tert-부틸 2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (5.03 g, 25.1 mmol) 및 트리에틸아민 (8.1 mL, 59.0 mmol)의 혼합물을 115℃에서 3 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, CH₂Cl₂로 세정하였다. Et₂O로 추출하였다. 유기 층을 물로 세척하고 (2 ×), 이어서 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→20％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 연황색 발포체로서 수득하였다 (7.05 g, 84％).

별법의 절차:

(S)-tert-부틸 2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (276 g, 1.38 mol)를 DMSO (2.56 L) 중 1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (275 g, 1.06 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (346 mL, 1.99 mol)의 슬러리에 25℃에서 첨가하였다. 혼합물을 9 시간 동안 102℃로 가열하였다. 반응물을 25℃로 냉각시키고, 48 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (2.5 L) 및 물 (3.5 L)에 첨가하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (2 × 2.0 L)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 물 (2.5 L)로 세척하고, 갈색 발포체로 농축시켰다. 상기 발포체를 아세토니트릴 (1.0 L) 중에 용해시키고, 30 분 동안 1℃로 냉각시켰다. 침전물을 여과하여 황갈색 고체를 얻었다. 모액을 농축시키고, 잔류물을 아세토니트릴 (500 mL) 중에서 30 분 동안 슬러리화하였다. 혼합물을 여과하여 황갈색 고체를 얻었다. 고체 침전물을 합하고, 진공 오븐 (14 torr, 25℃)에서 25 시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 황갈색 고체로서 수득하였다 (435 g, 96％).

115 내지 150℃의 온도에서 3 내지 6 일 동안, 적절하게 치환된 피페라진 1.5 당량 및 트리에틸아민 3-5 당량을 사용하여 본질적으로 제조예 1에 기재된 절차에 따라 하기 표의 피페라지닐프탈라진을 제조하였다.

제조예 2에 대한 별법의 절차:

1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (200 g, 773 mmol)을 (S)-tert-부틸 3-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (232 g, 1.16 mol), 디이소프로필에틸아민 (674 mL, 28.1 mol) 및 DMSO (2.0 L)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60 시간 동안 120℃로 가열하였다. 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 빙수 (3.0 L)에 붓고, 여과하였다. 고체를 수집하고, CH₂Cl₂ (2.0 L) 중에 용해시키고, 물 (2.0 L)로 추출하였다. 유기 상을 농축하고, 실리카 플러그 (3.0 kg 실리카)에 첨가하고, CH₂Cl₂ 중 3％ THF로 용리하여 표제 화합물을 황색 발포체로서 수득하였다 (126 g, 38％).

제조예 7

(S)-tert-부틸 2-에틸-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (75 mL) 중 1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (5.02 g, 19.4 mmol), (S)-tert-부틸 2-에틸피페라진-1-카르복실레이트 (5.00 g, 23.3 mmol) 및 K₂CO₃ (5.38 g, 38.9 mmol)의 혼합물을 120℃에서 1 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 세정하였다. EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 물 (2 ×), 이어서 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 20→80％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (5.11 g, 60％).

시스-2,6-디메틸피페라진을 사용하여 본질적으로 제조예 7에 기재된 절차에 따라 하기 표의 피페라지닐프탈라진을 제조하였다.

제조예 9

(R)-(4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페라진-2-일)메탄올

1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (0.1 g, 0.39 mmol), (R)-피페라진-2-일메탄올 (0.07 g, 0.58 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.34 mL, 1.93 mmol)을 DMSO (1 mL) 중에 용해시켰다. 반응물을 120℃에서 64 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0-10％ 2 M 암모니아/MeOH) 표제 화합물을 갈색 고체로서 수득하였다 (0.11 g, 84％).

적절하게 치환된 피페라진을 사용하여 본질적으로 제조예 9에 기재된 절차에 따라 하기 표의 피페라지닐프탈라진을 제조하였다.

제조예 14

(S)-tert-부틸 4-(4-클로로프탈라진-1-일)-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (200 mL) 중 1,4-디클로로프탈라진 (10.0 g, 50.2 mmol), (S)-tert-부틸 3-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (15.1 g, 75.4 mmol) 및 트리에틸아민 (21.0 mL, 150.7 mmol)의 혼합물을 120℃에서 2 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, CH₂Cl₂로 세정하였다. Et₂O로 추출하였다. 유기 층을 물로 세척하고 (2 ×), Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→20％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 연황색 고체로서 수득하였다 (6.0 g, 33％).

제조예 15

(S)-tert-부틸 4-(4-클로로프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (110 mL) 중 1,4-디클로로프탈라진 (7.80 g, 39.2 mmol), (S)-tert-부틸 2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (4.98 g, 24.9 mmol) 및 트리에틸아민 (10.3 mL, 73.9 mmol)의 혼합물을 80℃에서 18 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 세정하였다. EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 물 (2 ×) 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 20％→80％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (4.13 g, 46％).

제조예 16

(S)-tert-부틸 4-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트

1,4-디옥산 (80 mL) 및 물 (20 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-(4-클로로프탈라진-1-일)-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (4.0 g, 11.0 mmol), 4-시아노페닐보론산 (2.43 g, 16.5 mmol), 탄산세슘 (14.4 g, 44.1 mmol) 및 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112]) (75.4 mg, 0.11 mmol)의 혼합물을 90℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 물 및 CH₂Cl₂ 사이에 분배하였다. 수성 층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→20％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 밝은 오렌지색 발포체로서 수득하였다 (4.46 g, 94％).

　　　

적절한 4-클로로프탈라진 및 보론산을 사용하여 본질적으로 제조예 16에 기재된 절차에 따라 하기 표의 피페라지닐프탈라진을 제조하였다. 제조예 19-20을 탈기시킨 후에, 비스(디-tert-부틸(4-디메틸아미노페닐)포스핀)디클로로팔라듐(II)을 촉매로서 첨가하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 72 시간 동안 가열하였다.

제조예 21

(S)-tert-부틸 4-(4-(4-메톡시페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트

1,4-디옥산 (30 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-(4-클로로프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (0.81 g, 2.23 mmol), 4-메톡시벤젠보론산 (1.07 g, 7.05 mmol) 및 불화세슘 (1.05 g, 6.94 mmol)의 탈기된 혼합물을 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 (0.27 g, 0.33 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 95℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 물 및 EtOAc 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 부분을 물 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 15→70％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (0.94 g, 96％).

제조예 22

(S)-1-(4-플루오로페닐)-4-(3-메틸피페라진-1-일)프탈라진

1,4-디옥산 (50 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (7.05 g, 16.2 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 중 4 M HCl (25 mL)로 처리하였다. MeOH를 첨가하여 생성된 침전물을 용해시키고, 2 시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH 중에 용해시키고, 50 g 배리안® SCX 칼럼에 부었다. MeOH 및 CH₂Cl₂로 세정한 다음, 생성물을 MeOH 중 1:1 CH₂Cl₂:2 M 암모니아로 용리하였다. 용리액을 감압 하에 농축하여 표제 화합물을 연황색 발포체로서 수득하였다 (4.83 g, 93％).

제조예 22를 위한 별법의 절차:

메탄올 (2.82 L)을 드라이 아이스가 있는 1:1 아세톤/수조를 통해 0℃로 냉각시키고, 30 분에 걸쳐 아세틸 클로라이드 (142 mL, 2.0 mol)를 적가하면서, 첨가 동안 온도를 15℃ 미만으로 유지하였다. 혼합물을 15 분 동안 교반하였다. (S)-tert-부틸 4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (282 g, 667 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 12 시간 동안 25℃에서 교반하였다. 농축시키고, 잔류물을 물 (3.0 L) 중에 용해시켰다. pH가 7이 될 때까지 고체 NaHCO₃을 첨가하였다. 생성물을 CH₂Cl₂로 추출하고 (2 × 2.0 L), 유기 층을 합하고, 농축하여 표제 화합물을 부스러지는 갈색 발포체로서 정량 수율로 수득하였다 (236 g, >100％).

반응 시간 2 시간 내지 밤새, 적절한 boc-보호된 피페라지닐프탈라진을 사용하여 본질적으로 제조예 22에 기재된 절차에 따라 하기 표의 피페라지닐프탈라진을 제조하였다. 제조예 30-34에 대하여 MeOH를 용매로서 사용하였다.

제조예 35

3-플루오로-4-이소시아네이토벤조니트릴

톨루엔 (20 mL) 중 트리포스겐 (1.09 g, 3.67 mmol)의 용액을 빙수조에서 냉각시켰다. 톨루엔 (30 mL) 중 4-아미노-3-플루오로벤조니트릴 (1.36 g, 10.0 mmol) 및 트리에틸아민 (2.8 mL, 20.0 mmol)의 용액으로 적하 처리하였다. 생성된 혼합물을 70℃에서 5 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 고체를 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하여 백색 고체를 수득하고 (1.44 g, 84％), 이것을 추가 정제 없이 사용하였다.

본질적으로 제조예 35에 기재된 절차에 따라, 적절한 아닐린으로부터 하기 표의 공지된 이소시아네이트를 제조하였다.

실시예 1

(S)-N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드

CH₂Cl₂ (31 mL) 중 (S)-1-(4-플루오로페닐)-4-(3-메틸피페라진-1-일)프탈라진 (1.0 g, 3.1 mmol)의 용액을 1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (0.42 mL, 3.72 mmol)으로 처리하였다. 3 일 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 Et₂O로 연화처리하고, 여과하였다. 고체를 펜탄으로 세정하고, 이어서 진공 오븐 내 45℃에서 건조시켰다. 고체를 CH₂Cl₂와 MeOH의 혼합물 중에 용해시키고, Et₂O 중 1 M HCl 3 당량으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 교반하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 오븐 내 45℃에서 건조시켜 표제의 히드로클로라이드 염을 황색 발포체로서 수득하였다 (1.5 g, 98％).

실시예 1에 대한 별법의 절차:

1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (105 mL, 930 mmol)을 CH₂Cl₂ (4.5 L) 중 (S)-1-(4-플루오로페닐)-4-(3-메틸피페라진-1-일)프탈라진 (300 g, 930 mmol)의 용액에 25℃에서 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 25 분 동안 교반하고, 발포체로 농축시켰다. 발포체를 MTBE (3.0 L) 중에 슬러리화하고, 습윤 케이크를 MTBE (500 mL)로 세척하였다. 모액을 오일로 농축시켰다. 오일을 에틸 아세테이트 (2.0 L) 중에 슬러리화하여 고체를 얻고, 여과하였다. 여과된 고체를 합하고, 건조시켜 표제 화합물을 황갈색 고체로서 수득하였다 (344 g, 80％). 고체 (327 g, 711 mmol)를 이소프로판올 (3.27 L) 중에 42℃에서 슬러리화하고, 1,4-디옥산 중 4 M HCl (177 mL, 711 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 30 분 동안 60℃로 가열하였다. 2 시간에 걸쳐 25℃로 서서히 냉각시켰다. 여과하고, 습윤 케이크를 이소프로판올 (200 mL) 및 헵탄 (200 mL)으로 세척하였다. 케이크를 진공 오븐 (12 torr, 35℃, 2 시간) 내에서 건조시켜 표제 화합물을 연황색 고체로서 수득하였다 (308 g, 87％).

실시예 2

(S)-N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-3-메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드

CH₂Cl₂ (15.5 mL) 중 (S)-1-(4-플루오로페닐)-4-(2-메틸피페라진-1-일)프탈라진 (0.5 g, 1.55 mmol)의 용액을 1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (0.194 mL, 1.71 mmol)으로 처리하였다. 밤새 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (CH₂Cl₂ 중 0→3％ 2 M 암모니아/MeOH의 구배). 정제된 유리 염기를 CH₂Cl₂와 MeOH의 혼합물 중에 용해시키고, Et₂O 중 1 M HCl 3 당량으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 교반하고, 감압 하에 농축시키고, 진공 오븐 내 45℃에서 건조시켜 표제의 히드로클로라이드 염을 황색 발포체로서 수득하였다 (0.72 g, 94％).

실시예 2에 대한 별법의 절차:

1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (27.9 mL, 245 mmol)을 CH₂Cl₂ (500 mL) 중 (S)-1-(4-플루오로페닐)-4-(2-메틸피페라진-1-일)프탈라진 (72 g, 223 mmol)의 용액에 25℃에서 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 25 분 동안 교반하고, 발포체로 농축시켰다. 아세틸 클로라이드 (16.5 mL, 231 mmol)를 0℃에서 메탄올에 첨가하고, 5 분 동안 교반하였다. 발포체를 메탄올 용액에 첨가하고, 1 시간 동안 교반하였다. 용액을 발포체로 농축시켰다. 발포체를 아세토니트릴 (200 mL) 및 CH₂Cl₂ (30 mL) 중에 슬러리화하고, 여과하고, 표제 화합물을 황색 고체로서 수집하였다 (91 g, 86％).

적절한 피페라지닐프탈라진 및 약간 과량의 적절한 이소시아네이트를 사용하여 본질적으로 실시예 1 또는 실시예 2에 기재된 절차에 따라 하기 표의 우레아를 제조하였다. 반응 시간은 0.5 시간 내지 3 일로 다양하였다. 화합물을 연화처리 (Et₂O 또는 1:1 CH₂Cl₂:헥산) 또는 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 실시예 57-60 및 66-69에 대하여, 질량-지시 역상 크로마토그래피 (워터스 엑스브릿지 C18 ODB MS HPLC 칼럼, 30×75 mm, 5 μm 입자 크기, 물 중 20→70％ 아세토니트릴의 구배, 0.01 M 중탄산암모늄 함유, 8 분 동안 85 ml/분의 유속)로 정제하였다. 실시예 75-82에 대하여, 조질 이소시아네이트 (제조예 35-36)를 1.5-2 배 과량으로 사용하였다. 실시예 18, 29 및 38에 대하여, HCl 염 형성 과정으로부터 MeOH를 생략하였다.

실시예 90

(R)-N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드

CH₂Cl₂ (3 ml) 중 (R)-(4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페라진-2-일)-메탄올 (0.15 g, 0.44 mmol)의 용액을 1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (0.04 g, 0.31 mmol)으로 처리하였다. 반응물을 주위 온도에서 30 분 동안 교반하고, 이어서 반응 혼합물을 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 0-50％ EtOAc, 이어서 CH₂Cl₂ 중 3％ MeOH로 교체) 고체를 얻었다. 고체를 MeOH (1 mL) 중에 용해시키고, 1 N 수성 HCl (0.13 mL, 0.13 mmol)로 처리하였다. 용액을 농축시켜 표제 화합물을 고체로서 수득하였다 (0.065 g, 29％).

적절한 피페라지닐프탈라진 및 이소시아네이트를 사용하여 본질적으로 실시예 90에 기재된 절차에 따라 하기 표에서의 피페라지닐프탈라진 우레아를 제조하였다.

실시예 94 & 95

N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-트랜스-2,5-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드, 이성질체 1 및 이성질체 2

CH₂Cl₂ (5 mL) 중 1-(트랜스-2,5-디메틸피페라진-1-일)-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (0.3 g, 0.89 mmol)의 용액을 1-플루오로-4-이소시아네이토벤젠 (0.17 g, 1.25 mmol)으로 처리하였다. 반응물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (헥산 중 0-50％ EtOAc). 적절한 분획을 모으고 농축시켰다. N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-트랜스-2,5-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 이성질체 (0.3 g, 0.59 mmol)의 혼합물을 MeOH (2 mL) 중에 용해시켰다. 트랜스-이성질체의 혼합물을 키랄 크로마토그래피로 분리하였다 (키랄셀 OJ-H, 유속 30 ml/분, 검출 225 nm, 6:4 MeOH:아세토니트릴). 첫번째 용리 피크를 이성질체 1로서 수집하고, 두번째 용리 피크를 이성질체 2로서 수집하였다. 적절한 분획을 모으고 농축시켰다. 분리된 이성질체를 MeOH (1 mL) 중에 용해시키고, 각각의 용액을 1 당량의 1 N 수성 HCl로 처리하였다. 농축시켜 이성질체 1 (0.131 g, 44％) 및 이성질체 2 (0.129 g, 43％)의 히드로클로라이드 염을 수득하였다.

실시예 96 & 97

N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-시스-2,5-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드, 이성질체 1 및 이성질체 2

제조예 12로부터의 시스-디메틸피페라진의 혼합물을 사용하여　본질적으로 실시예 94 및 95에 기재된 바와 같은 절차에 따라 실시예 96 및 97을 제조하였다. 시스-이성질체의 혼합물을 키랄 HPLC로 분리하고, HCl 염을 제조하여 이성질체 1 (0.21 g, 34％) 및 이성질체 2 (0.20 g, 33％)를 수득하였다.

생물학

헷지호그는 기저 세포 암종; 상부 위장관 암 (식도, 위, 췌장 및 담관); 전립선암; 유방암; 소세포 폐암; 비-소세포 폐암; B-세포 림프종; 다발성 골수종; 위암; 난소암; 결장직장암; 간암; 흑색종; 신장암; 및 뇌암과 같은 암에 대한 생존 인자로서 관련된 것으로 시사되어 왔다.

헷지호그 경로의 요소들은 암의 치료를 위한 잠재적 약물 표적이라고 주장되어 왔다. 수모세포종 종양으로부터 확립된 Daoy 세포주 (ATCC, HTB-186)는 Hh 리간드에 반응한다. 이들 세포를 외인성 첨가된 Shh-조절 배지로 처리하는 경우, Hh 신호전달 경로가 활성화되어, Gli1 발현의 증가를 야기한다. 익시아(corn lily) 베라트룸 칼리포르니쿰(Veratrum californicum)으로부터 단리된 알칼로이드인 시클로파민은 약한 헷지호그 길항제이고, Shh 자극에 반응하여 Gli1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 최근의 관찰은 시클로파민이 배양된 수모세포종 세포 및 동종이식편의 성장을 억제함을 시사한다. 이러한 Daoy 세포 모델 시스템을 사용하여, 헷지호그 신호전달 경로의 강력한 억제제를 확인할 수 있다. 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이므로, 이들은 전술한 종양 유형의 치료에 적합하다.

생물학적 활성 IC₅₀의 측정

하기의 검정 프로토콜 및 그의 결과는 화합물의 유용성 및 효능, 및 본 발명의 방법을 추가로 증명한다. 기능적 검정은 본 발명의 화합물이 Shh 신호전달을 억제하는 능력을 나타낸다는 근거를 제공한다. 하기 검정에 사용된 모든 리간드, 용매 및 시약은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.

생물학적 활성은 Daoy 뉴런 암 세포에서의 기능적 검정을 이용하여 측정되며, bDNA (분지형 데옥시리보핵산) 검정 시스템 (파노믹스, 인크.(Panomics, Inc.), 캘리포니아주 프레몽트)를 통해 Gli1 리보핵산의 수준을 측정한다. Gli는 교모세포종 세포주에서 최초로 발견되었고, Shh 신호전달에 의해 활성화되는 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 코딩한다. 최대 반응은 조건화 배지를 사용하는 Daoy 세포 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)에서 24 시간 동안 Gli1 전사를 유도한 다음, 자극된 Gli1 전사체의 양을 측정함으로써 수득하였다. 최소 반응은 조건화 배지로 자극된 Daoy 세포 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)에서 24 시간 동안 대조군 화합물에 의해 억제된 Gli1 전사체의 양이다.

Daoy 세포에서 Gli1의 억제를 측정하기 위한 기능적 검정

bDNA 검정 시스템은 표적 리보핵산 (전사체)의 증폭을 가능하게 하는 분지쇄 DNA의 기술을 활용한다. 이 기술은 표적 전사체와 복합체로서 혼성화하여 혼성화 신호를 증폭시키는 표적 전사체 [포획 익스텐더 (CE), 표지 익스텐더 (LE), 및 차단제 (BL)]의 특이성을 결정하는 합성 하이브리드인 짧은 Gli1-특이적 cDNA 프로브의 3가지 유형을 사용한다. 증폭 단계 동안 화학 발광성 기질의 첨가는 발광을 이용하는 검출을 허용한다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture collection)(ATCC)으로부터 입수한 Daoy 세포주는 Shh-반응성 인간 뉴런 종양 세포주이고, 섬유조직형성의 소뇌 수모세포종 종양, 생리학적으로 적절한 종양 세포주로부터 1985년에 확립되었다. Gli1 전사체 수준의 내인성 수준은 Daoy 세포에서는 낮지만, 인간 Shh를 안정하게 과다발현하는 세포 (hShh로 안정하게 형질감염된 HEK-293 세포주)로부터 획득한 조건화 배지를 사용하여 자극될 수 있다.

Daoy 세포는 조직 배양 T225-플라스크에서 0.1 nM 비-필수 아미노산 및 1 mM 나트륨 피루베이트를 포함하는 10％ 태아 소 혈청 (FBS)을 더한 최소 필수 배지 (MEM)를 함유하는 Daoy 성장 배지 중에서 전면배양으로 성장시켰다. 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 T225-플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하고, 배지 중에 재현탁한 다음, 계수하였다.

이어서, Daoy 세포를 코스타 96 웰 투명 조직 배양 플레이트 내 성장 배지 중에 각 웰 당 50,000개의 세포를 접종하고, 5％ 이산화탄소 (CO₂) 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 인산염 완충 염수 (PBS) 중에서 1회 세척하고, 이어서 Shh 조건화 배지 (Shh-CM) 100 ㎕를 첨가하여 Gli1 발현 수준을 자극하였다. 대조군 성장 배지-0.1％ FBS/DMEM (둘베코 변형 이글 배지)을 사용하여 최대 자극을 달성하기 위해 Shh-CM을 희석하였다. 이어서, Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포를 대략 1 μM 내지 0.1 nM 범위의 헷지호그 억제제의 다양한 농도로 처리하였다. 시험 화합물은 5％ CO₂ 하에 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.

Gli1 전사체의 측정은 제조사 (파노믹스, 인크.)에 의해 기재된 바와 같은 퀀티젠(Quantigene) 2.0 Gli1 검정을 이용하여 수행하였다. 프로테이나제 K를 포함하는 희석된 용해 혼합물 (DLM) 완충액을 제조하였다. 화합물과 24시간 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, DLM 180 ㎕를 세포에 첨가하였다. 용해 완충액을 함유하는 세포 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 30분 내지 45분 동안 두었다. 그 후, 생성된 세포 용해물을 5회 연화처리하였다. 제조사의 지시에 따라 DLM 중 프로브로 희석시켜 Gli1 프로브를 함유하는 작용 프로브 세트를 제조한 다음, 작용 프로브 세트 20 ㎕를 Daoy 용해물 80 ㎕와 함께 bDNA 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 bDNA 플레이트를 처리하였다. 발광을 검출하는 퍼킨 엘머 엔비젼(Perkin Elmer Envision) 판독기 상에서 플레이트를 판독하여 신호를 정량화하였다. 발광 신호는 샘플 중에 존재하는 표적 전사체의 양에 직접적으로 비례하였다.

기능적 검정으로부터의 발광 신호 데이터는 시험관내 검정에 대한 IC₅₀을 계산하기 위해 사용하였다. 데이터는 최대 대조군 값 (Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포) 및 최소 대조군 값 (Shh-CM 및 억제 농도의 대조군 화합물, 1 μM의 N-(3-(1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-클로로페닐)-3,5-디메톡시벤즈아미드로 처리된 Daoy 세포)을 기준으로 계산하였다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트는 액티비티베이스 소프트웨어 프로그램 버전 5.3, 방정식 205 (Assay Guidance Manual Version 5.0, 2008, Eli Lilly and Company and NIH Chemical Genomics Center)를 사용하여 IC₅₀ 값을 생성하기 위해 사용하였다.

기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 본 발명의 화합물은 < 40 nM의 IC₅₀을 나타낸다. 예를 들어, 실시예 2의 화합물은 상기 기재된 검정에서 0.21 (n=2)의 표준 오차를 갖는 대략 0.42 nM의 IC₅₀을 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이고, 그 자체로 항암제로서 유용하다는 증거를 제공한다.

CYP3A4 억제 검정

인큐베이션 샘플은 인간 간 마이크로솜 제제를 시험 억제제에 첨가하고 (최종 농도 0.05 mg/단백질 ml, 100 mM NaPO₄ 중 10 μ M 억제제, pH 7.4 완충액) 혼합함으로써 제조하였다. 샘플을 37℃에서 대략 5 분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비-인큐베이션 기간 후에, NADPH 및 미다졸람을 효소 기질로서 함유하는 용액을 첨가하여 반응을 개시하였다 (최종 농도 1 mM NADPH, 5 μM 미다졸람). NADPH 용액을 첨가한 후에, 샘플은 대략 37℃에서 3 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후에, 50 μL의 메탄올 (및 크로마토그래피를 위한 내부 표준)을 첨가함으로써 반응물을 켄칭하고, 샘플을 잘 혼합하였다. 반응물을 켄칭한 후에, 혼합물을 대략 5℃에서 15 분 동안 대략 4000 rpm에서 원심분리하고, LC/MS 분석에 의해 분석하였다.

샘플을 짧은 통상의 C18 칼럼 상에서 구배 용리로 HPLC/MS를 이용하여 분석하였다 (로딩 이동상 - 95/5 밀리-Q H₂O/메탄올 (v/v) + 1％ 아세트산. 이동상 B - 80/20 밀리-Q H₂O/메탄올 (v/v) + 1％ 아세트산. 이동상 C - 5/95 밀리-Q H₂O/메탄올 (v/v) + 1％ 아세트산. 세정 이동상 - 75/25 밀리-Q H₂O/아세토니트릴 (v/v)).

샘플을 양성 조건 하에 터보이온 스프레이(TurboIon Spray)를 이용하여 342.1 (1-OH-미다졸람) 및 346.1 (α-히드록시미다졸람-d4 내부 표준)의 질량에서 선택 이온 모니터링(Selected Ion Monitoring) (SIM)을 위한 질량 분광 분석기 내로 주입하였다. 데이터는 10 μM의 억제제 농도의 존재 하에 1-OH-미다졸람 형성의 ％ 억제로서 보고되었다.

기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 본 발명의 화합물 (실시예 1-18, 26, 33-35, 44-51, 57-60, 66-69 및 85-94)은 <45％ 억제를 나타냈다. 또한, 실시예 1-5, 7-17, 33-35, 44, 46,49-51, 57-59, 66-68, 85 및 89-94의 화합물은 <10％ 억제를 나타냈다.

Claims (15)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
   

   

   
   상기 식에서,
   R¹은 수소, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 메톡시이고;
   R²는 수소, 플루오로 또는 트리메틸플루오로이고;
   R³은 수소 또는 클로로이고, 단 R² 및 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;
   R⁴는 클로로, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 메톡시 또는 트리플루오로메톡시이고;
   

   

   은
   

   

   로 이루어진 군으로부터 선택된 치환된 피페라진-1,4-디일을 나타낸다.
2. 제1항에 있어서, R¹이 플루오로인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R²가 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R³이 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R⁴가 플루오로 또는 시아노인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   

   이

   

   인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, (S)-N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
8. 제7항에 있어서, (S)-N-(4-플루오로페닐)-4-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드인 화합물.
9. 삭제
10. 제1항 또는 제2항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 암 치료용 제약 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제