KR101260116B1 - 이치환된 프탈라진 헤지호그 경로 길항제 - Google Patents

이치환된 프탈라진 헤지호그 경로 길항제 Download PDF

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KR101260116B1
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필립 아서 힙스킨드
타카코 윌슨
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 암 치료에 유용한 신규 1,4-이치환된 프탈라진 헤지호그 경로 길항제를 제공한다.

Description

이치환된 프탈라진 헤지호그 경로 길항제 {DISUBSTITUTED PHTHALAZINE HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONISTS}
본 발명은 헤지호그 경로 길항제, 보다 구체적으로는 신규 이치환된 프탈라진 및 그의 치료적 용도에 관한 것이다.
헤지호그 (Hh) 신호 경로는 세포 분화 및 증식을 지시함으로써 배아 형태 형성 및 성체 조직 유지에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 소닉 헤지호그 (Shh), 인디안 헤지호그 (Ihh), 및 데저트 헤지호그 (Dhh)를 포함하는 헤지호그 (Hh) 단백질 군은 번역 후 변형, 예를 들어 자가촉매적 절단 및 콜레스테롤의 아미노 말단 펩티드로의 커플링을 수행하여 신호전달 활성을 보유하는 단편을 형성하는 분비된 당단백질이다. Hh는 12회-통과 막횡단 단백질 Ptch (Ptch1 및 Ptch2)에 결합함으로써 Smo (Smoothened)의 Ptch-매개 억제를 완화시킨다. Smo 활성화는 세포 증식, 세포 생존, 혈관신생 및 침입에 관여하는 Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2, 및 Gli3)의 안정화 및 Gli-의존 유전자의 발현을 초래하는 일련의 세포내 반응을 촉발시킨다.
Hh 신호전달은, Shh 신호전달의 비정상적 활성화가 예를 들어 췌장암, 수모세포종, 기저세포암종, 소세포폐암, 및 전립선암과 같은 다양한 종양의 형성을 야기한다는 발견에 근거하여 최근에 상당한 관심을 불러일으켜 왔다. 스테로이드성 알카로이드 화합물 IP-609; 아미노프롤린 화합물 CUR61414; 및 2,4-이치환된 티아졸 화합물 JK18과 같은 여러 Hh 길항제가 당업계에 보고된 바 있다. WO2005033288은 헤지호그 길항제로 주장된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다.
강력한 헤지호그 경로 저해제, 특히 바람직한 약역학적, 약물동력학적 및 독성학 프로필을 갖는 것들에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 이 경로의 강력한 길항제인 신규 1,4-이치환된 프탈라진을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112010069996756-pct00001
상기 식에서,
R1은 수소, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸, 메톡시 또는 트리플루오로메톡시이고;
R2는 수소 또는 메틸이고;
R3, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 수소, 클로로, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이며, 단 R3, R4, R5, R6 및 R7 중 적어도 2개는 수소이다.
당업자라면, 본 발명의 화합물이 3급 아민 잔기를 포함하고, 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가 염을 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 제약상 허용되는 산 부가 염 및 이들을 제조하기 위한 통상의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; 문헌 [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참고한다.
본 발명의 특정 실시양태는
(a) R1이 수소이고;
(b) R1이 플루오로이고;
(c) R2가 수소이고;
(d) R2가 메틸이고;
(e) R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(f) R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(g) R1이 수소이고, R2가 수소이고;
(h) R1이 플루오로이고, R2가 수소이고;
(i) R1이 수소이고, R2가 메틸이고;
(j) R1이 플루오로이고, R2가 메틸이고;
(k) R1이 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(l) R1이 플루오로이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(m) R2가 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(n) R2가 메틸이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이고;
(o) R1이 수소이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(p) R1이 플루오로이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(q) R2가 수소이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(r) R2가 메틸이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(s) R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸이고;
(t) R1이 수소이고, R2가 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(u) R1이 수소이고, R2가 메틸이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(v) R1이 플루오로이고, R2가 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(w) R1이 플루오로, R2가 메틸이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(x) R1이 수소이고, R2가 수소이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(y) R1이 수소이고, R2가 메틸이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(z) R1이 플루오로이고, R2가 수소이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(aa) R1이 플루오로이고, R2가 메틸이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(bb) R1이 수소이고, R2가 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(cc) R1이 수소이고, R2가 메틸이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(dd) R1이 플루오로이고, R2가 수소이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(ee) R1이 플루오로이고, R2가 메틸이고, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고, R5가 플루오로, 트리플루오로메틸, 또는 트리플루오로메톡시이고;
(ff) R1이 수소이고, R2가 수소이고, R3이 트리플루오로메틸이고, R5가 플루오로이고;
(gg) R1이 플루오로이고, R2가 수소이고, R3이 트리플루오로메틸이고, R5가 플루오로이고;
(hh) R1이 수소이고, R2가 메틸이고, R3이 트리플루오로메틸이고, R5가 플루오로이고;
(ii) R1이 플루오로이고, R2가 메틸이고, R3이 트리플루오로메틸이고, R5가 플루오로이고;
(jj) R3, R4, R5, R6 및 R7 중 3개가 수소이고;
(kk) R3, R4, R5, R6 및 R7 중 4개가 수소인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물은, 바람직하게는 다양한 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 바람직하게는, 그러한 조성물은 경구 또는 정맥내 투여용이다. 그러한 제약 조성물 및 이를 제조하는 공정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al ., eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참고한다.
본 발명은 또한, 수모세포종, 기저세포암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료가 필요한 포유동물에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.
실제로 투여되는 화합물의 양은 치료될 증상, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 또는 화합물들, 개인 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 비롯한 관련된 상황 하에서 의사에 의해 결정될 것으로 이해된다. 일일 투여량은 통상적으로 체중의 약 0.1 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 해당된다. 몇몇 경우에서 상기 범위의 하한보다 낮은 투여량 수준이 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 훨씬 많은 투여량이 이용될 수 있다. 그러므로, 상기 투여량 범위는 어떤 식으로든지 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 암 치료를 위한 약제의 제조에서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 특히, 이들 암은 수모세포종, 기저세포암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 및 흑색종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
게다가, 본 발명은 수모세포종, 기저세포암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 위한 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 지시한 의미를 갖는다: "Et2O"는 디에틸 에테르를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "boc" 또는 "t-boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 지칭하고; "PyBOP"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "prep"는 제조예를 지칭하고; "ex"는 실시예를 지칭하고; "IC50"은 약제에 대하여 가능한 최대 저해 반응의 50%를 나타내는 약제의 농도를 지칭한다.
<반응식 1>
Figure 112010069996756-pct00002
화학식 I의 화합물은 반응식 1에 도시된 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다.
1-클로로 치환된 프탈라진 (2)을 친핵성 방향족 치환 (SNAr)으로 4-아미노 boc 보호된 피페리딘 (3a)과 반응시켜 화학식 (4)의 피페리딘 치환된 프탈라진을 제공한다. 예를 들면, 클로라이드 (2)는 트리에틸아민과 같은 유기 염기 또는 포타슘 카르보네이트와 같은 무기 염기의 존재하에 DMF 또는 DMSO와 같은 양극성의 비양성자성 용매 중에서 화학식 (3a)의 피페리딘과 반응시킬 수 있으며, 100-140℃로 가열할 수 있다.
화학식 (4)의 피페리디닐 프탈라진에 존재하는 것과 같은 아민 관능기는 탈보호할 수 있고, 추가로 반응시켜 본 발명의 추가의 화합물을 제공할 수 있다. 질소 및 산소 보호기의 도입 및 제거를 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)]을 참고함). 예를 들면, 화학식 (4)의 아미노 피페리디닐 프탈라진의 boc 탈보호는 염화수소 또는 트리플루오로아세트산과 같은 산성 조건하에서 달성될 수 있다. 별법으로, HCl은 0-20℃에서 톨루엔 중의 메탄올과 같은 알콜 용매의 용액에 아세틸 클로라이드를 적가하고, 이어서 화학식 (4)의 화합물을 첨가하고 용액을 30-60℃로 가열하여 화학식 (5)의 화합물을 제공함으로써 계내에서 생성시킬 수 있다. 화학식 (5)의 화합물이 히드로클로라이드 아민 염과 같은 염으로서 단리되고, 단계 3으로 이동하거나, 또는 포타슘 카르보네이트와 같은 무기 염기를 사용하여 유리 아민으로 변형될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 4-아미노 피페리딘은 디클로로메탄 또는 디옥산과 같은 불활성 용매 중 치환된 벤조일 클로라이드, 및 트리에틸아민 또는 피리딘과 같은 염기를 사용하여 아실화시켜 화학식 I의 아미드 화합물을 제공할 수 있다. 별법으로, 화학식 (5)의 화합물은 디클로로메탄과 같은 불활성 용매 중 트리에틸아민과 같은 적절한 염기 및 PyBOP와 같은 적절한 커플링 시약과 치환된 벤조산을 사용하거나, 또는 DMF와 같은 양극성의 비양성자성 용매 중 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 및 1-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 아실화시킬 수 있다.
별법으로, 1-클로로 치환된 프탈라진 (2)을 단계 1a에서 전술한 바와 같이 친핵성 방향족 치환 (SNAr)으로 화학식 (3b)의 N-피페리딘-4-일-벤즈아미드와 반응시켜 화학식 I의 화합물을 직접 제공한다. 예를 들면, 클로라이드 (2)는 트리에틸아민과 같은 염기의 존재하에 DMF 또는 DMSO와 같은 양극성의 비양성자성 용매 중 화학식 (3b)의 N-피페리딘-4-일-벤즈아미드와 반응시키고 80-140℃로 가열하여 화학식 I의 아미드를 제공할 수 있다.
당업자라면, 반응식 1에서의 화학식 (2)의 화합물이 상업적으로 이용가능하거나 또는 본원에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 또는 당업계에 확립된 절차를 사용하여 쉽게 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 프탈산 무수물과 페닐 브로마이드의 그리나르 (Grignard) 반응으로부터 생성된 2-페닐카르보닐 벤조산을 히드라진과 고리화시켜 4-페닐-2H-프탈라진-1-온을 제공할 수 있다. 포스포러스 옥시클로라이드로의 후속 처리는 화학식 (2)의 1-클로로-4-페닐-프탈라진을 제공한다. 별법으로, 1,4-디클로로프탈라진을 스즈키 교차-커플링 반응으로 페닐 보론산과 반응시켜 상응하는 화학식 (2)의 1-클로로-4-페닐-프탈라진을 제공할 수 있다.
<반응식 2>
Figure 112010069996756-pct00003
화학식 I의 화합물은 반응식 2에 도시된 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다. 단계 1에서, 1,4-디클로로프탈라진 (6)을, 포타슘 카르보네이트 또는 트리에틸아민과 같은 적절한 염기와 함께 N-메틸피롤리돈 또는 DMSO과 같은 양극성의 비양성자성 용매 중에서 4-아미노 boc 보호된 피페리딘 (3a)과 반응시킬 수 있다. 혼합물을 70-95℃에서 가열하여 화학식 (7)의 화합물을 제공한다. 단계 5에 나타낸 한가지 방법에서, 화학식 (7)의 화합물을 탈보호한 다음, 트리에틸아민과 같은 염기와 함께 디클로로메탄과 같은 불활성 용매 중에서 치환된 벤조일 클로라이드를 사용하여 단계 6의 아민으로 아실화하여 화학식 (9)의 아미드를 제공할 수 있다. 별법으로, 화학식 (7)의 화합물은 실온에서 디클로로메탄과 같은 불활성 용매 중에서 치환된 페닐 카르복실산 및 PyBOP와 같은 적절한 커플링 시약 및 트리에틸아민과 같은 적합한 염기를 사용하거나, 또는 DMF와 같은 적절한 용매와 1-히드록시벤조트리아졸 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 사용하여 아실화 할 수 있다. 단계 7에서, 화학식 (9)의 프탈라지닐 클로라이드를 스즈키-미야우라(Suzuki-Miyaura) 교차 커플링 조건하에서 페닐보론산과 반응시킨다. 당업자는 그러한 교차-커플링 반응을 촉진시키는데 유용한 다양한 조건이 존재함을 인식할 것이다. 반응 조건은 디옥산/물과 같은 적합한 용매를 사용한다. 반응은 포타슘 포스페이트 3염기 모노히드레이트, 소듐 카르보네이트, 포타슘 카르보네이트, 또는 세슘 카르보네이트와 같은 염기의 존재 하에 달성된다. 반응은 불활성 분위기 하에서 약 80-160℃의 온도에서 트리시클로헥실포스핀과 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0) 또는 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org . Chem . 2007, 72, 5104-5112]에서 촉매 D의 합성에 따라 제조함)과 같은 팔라듐 촉매의 존재 하에 수행하여 화학식 I의 화합물을 제공한다.
별법으로, 화학식 (7)의 프탈라지닐 클로라이드를 먼저 전술한 바와 같이 스즈키-미야우라 조건하에 단계 2에 나타낸 바와 같이 페닐보론산과 커플링시켜 화학식 (4)의 페닐프탈라진을 제공할 수 있다. 단계 3에서, 화학식 (4)의 화합물을 탈보호한 다음, 전술한 바와 같이 치환된 벤조일 클로라이드 또는 페닐 카르복실산을 사용하여 단계 4에 나타낸 바와 같이 아민으로 아실화하여 화학식 I의 화합물을 제공한다.
하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하고, 화학식 I의 화합물의 전형적인 합성을 나타내기 위해 제공된다. 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 ChemDraw Ultra(등록상표) 10.0에 의해 제공된다.
제조예 1
{1-[4-(4-플루오로-페닐)프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르
Figure 112010069996756-pct00004
1-클로로-4-(4-플루오로페닐)-프탈라진 (3.00 g, 11.6 mmol)을 DMF (30 mL) 중 메틸-피페리딘-4-일-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (2.98 g, 13.9 mmol) 및 트리에틸아민 (3.52 g, 34.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 3일 동안 130℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 염수로 세척하였다. 소듐 술페이트로 유기상을 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬(flash) 크로마토그래피 (메탄올 중 20:5:1, 헥산:에틸 아세테이트:2 M 암모니아)에 의해 정제하여 고체 (4.45 g, 88%)로서 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 437.2 (M+1).
별법의 과정:
디메틸 술폭시드 (500 mL) 중에서 메틸-피페리딘-4-일-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (75 g, 349 mmol), 1-클로로-4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진 (75 g, 289 mmol), 및 포타슘 카르보네이트 (80 g, 579 mmol)을 합하고, 혼합물을 110℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응을 주변온도로 냉각시키고, 슬러리를 물 (1.0 L)에 부었다. 여과에 의해 고체를 수집하고, 진공 오븐에서 3일 동안 건조하여 백색 고체 (120 g, 95%)로서 표제 화합물을 제공하였다. ES/MS m/z 437.3 (M+1).
본질적으로 제조예 1에 기재된 과정을 따르되 적절한 클로로프탈라진 및 tBOC 보호된 아미노피페리딘을 사용하여, 하기 표에서의 피페리디닐프탈라진을 제조하였다:
제조예 화학명 ES / MS m/z
2 메틸-[1-(4-페닐프탈라진-1-일)-피페리딘-4-일]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 419.2 (M+1)
3 tert-부틸 1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일카르바메이트 423.2 (M+1)
4 tert-부틸 1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일카르바메이트 405.2 (M+1)
제조예 5
{1-[4-(4-플루오로-페닐)프탈라진-1-일]피페리딘-4-일}메틸아민
Figure 112010069996756-pct00005
트리플루오로아세트산 (100 mL)을 디클로로메탄 (100 mL) 중 {1-[4-(4-플루오로-페닐)프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (11.2 g, 10.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하고, 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 1 N NaOH 및 염수로 세척하였다. 유기상을 소듐 술페이트로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 헥산/디클로로메탄으로부터 표제 화합물을 결정화하여 표제 화합물 (8.46 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS m/z 337.2 (M+1).
별법의 과정 (히드로클로라이드로서 단리됨):
톨루엔 (500 mL) 및 메탄올 (30 mL)을 10℃에서 합하였다. 아세틸 클로라이드 (29 mL, 410 mmol)를 20분에 걸쳐 적가하였다. 첨가 동안 온도를 15℃ 미만으로 유지시켰다. {1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (71 g, 164 mmol)를 첨가하였다. 슬러리를 35℃로 2시간 동안 가열하였다. 슬러리를 주변온도로 냉각시키고, 여과에 의해 고체를 수집하였다. 진공 오븐에서 40℃에서 12시간 동안 건조시켜 백색 고체 (58 g, 95%)로서 표제 화합물을 제공하였다. ES/MS m/z 337 (M+1).
본질적으로 제조예 5에 기재된 과정을 따르되 적절한 tBOC 보호된 아미노피페리디닐프탈라진을 사용하여, 하기 표에서의 탈보호된 아미노피페리디닐프탈라진을 제조하였다:
제조예 화학명 ES / MS m/z
6 메틸-[1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일]-아민 319.2 (M+1)
7 1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 323.2 (M+1)
8 1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 305.2 (M+1)
제조예 9
tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트
Figure 112010069996756-pct00006
N-메틸피롤리돈 (50.0 mL) 중에서 1,4-디클로로프탈라진 (5.00 g, 24.6 mmol), tert-부틸 메틸(피페리딘-4-일)카르바메이트 (5.54 g, 25.8 mmol), 및 포타슘 카르보네이트 (29.5 mmol; 4.08 g)를 합하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3일 동안 가열하고, 반응 혼합물을 빙수에 부었다. 진공 여과를 통해서 여과하여 황색이 도는 고체를 수득하고, 진공 오븐에서 실온에서 건조시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피 (1:1, 헥산:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 원하는 생성물 (5.79 g, 62%)을 수득하였다. ES/MS m/z 377.2 (M+1).
별법의 과정:
1,4-디클로로프탈라진 (7.04 g, 35.4 mmol), tert-부틸 메틸(피페리딘-4-일)카르바메이트 (5.54 g, 37.2 mmol), 트리에틸아민 (7.4 mL, 53.1 mmol) 및 DMSO (85 mL)를 합하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 3일 동안 또는 출발 물질의 완전 소모시까지 가열하였다. 냉각 후에, 반응 혼합물을 디에틸 에테르를 함유하는 분별 깔때기로 옮기고, 물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, MgSO4로 건조하고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 0-10% 메탄올)에 의해 정제하여 표제 화합물 (7.6 g, 57%)을 수득하였다. ES/MS m/z 377.2 (M+1).
제조예 10
tert-부틸 메틸(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트
Figure 112010069996756-pct00007
tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (0.201 g, 0.534 mmol), 4-(트리플루오로메틸)페닐보론산 (122 mg, 0.640 mmol), 포타슘 포스페이트 3염기 모노히드레이트 (209 mg, 0.907 mmol), 트리시클로헥실포스핀 (19 mg, 0.064 mmol), 1,4-디옥산 (3.5 mL) 및 물 (1.5 mL)을 마이크로웨이브 용기에 충진시켰다. 반응 혼합물에 5분 동안 질소를 버블링하였다. 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0) (0.027 mmol, 25 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물에 5분 더 질소를 버블링하였다. 밀봉된 반응 용기를 마이크로웨이브에서 150℃에서 1시간 동안 가열하였다. 에틸 아세테이트로 용출시키는 실리카 겔 패드에 반응 혼합물을 통과시켰다. 진공에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (30:70, 에틸 아세테이트:헥산)를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (0.170 g (65%)을 수득하였다. ES/MS m/z 486.8 (M+1).
제조예 11
N-메틸-1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 디히드로클로라이드
염화수소 (디옥산 중 4.0 N, 20 mL; 80.0 mmol)를 tert-부틸 메틸 (1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트 (0.158 g, 0.325 mmol)에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하였다. 조 물질 (0.169 g, >100%)을 그 자체로 사용하였다. ES/MS m/z 387.0 (M+1).
제조예 12
tert-부틸 1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트
tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (400 mg, 1.06 mmol), 1,4-디옥산 (12 mL), 물 (4 mL), 4-시아노페닐보론산 (467 mg, 3.18 mmol), 및 세슘 카르보네이트 (1.40 g, 4.24 mmol)를 압력관에 충진하였다. 반응 혼합물에 5분 동안 질소를 버블링하였다. (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org . Chem . 2007, 72, 5104-5112]) (36.0 mg, 0.053 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물에 수 분 동안 질소를 버블링하고, 반응 용기를 밀봉하였다. 반응을 90℃에서 밤새 가열하였다. 에틸 아세테이트로 용출시키는 실리카 겔 패드에 반응 혼합물을 여과하였다. 감압 하에 용매를 제거하고, 실리카 겔 크로마토그래피 (30:70, 에틸 아세테이트:헥산)를 사용하여 생성된 잔류물을 정제하여 표제 화합물 (0.392 g, 83%)을 수득하였다. ES/MS m/z 444.2 (M+1).
제조예 13
4-(4-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)프탈라진-1-일)벤조니트릴 디히드로클로라이드
본질적으로 제조예 11에 기재한 바와 같은 과정을 따르되 tert-부틸 1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (0.385 g, 0.868 mmol)를 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 후속 반응에서 조 물질 (0.378 g, >100%)을 그 자체로 사용하였다. ES/MS m/z 344.2 (M+1).
제조예 14
1-(4-클로로프탈라진-1-일)-N-메틸피페리딘-4-아민 디히드로클로라이드
염화수소 (디옥산 중 4.0 N, 100 mL; 400 mmol)를 메탄올 (100 mL) 중 tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (7.60 g; 1.00 당량; 20.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하여 표제 화합물 (7.05 g, 100%)을 수득하였다. ES/MS m/z 277.2 (M+1).
제조예 15
N-(1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드
Figure 112010069996756-pct00008
디클로로메탄 (30 mL) 중에 1-(4-클로로프탈라진-1-일)-N-메틸피페리딘-4-아민 디히드로클로라이드 (1.01 g, 2.89 mmol) 및 트리에틸아민 (1.2 mL, 8.61 mmol)을 합하였다. 반응 바이알을 질소로 플러싱하고, 3-트리플루오로메틸벤조일 클로라이드 (0.46 mL, 3.12 mmol)를 첨가하였다. 반응을 질소 블랭킷 하에 두고, 실온에서 밤새 교반하였다. 잔류물로 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 0-10% 메탄올)를 사용하여 정제하여 표제 화합물 (1.11 g, 86%)을 수득하였다. ES/MS m/z 449.2 (M+1).
본질적으로 제조예 15에 기재된 과정을 따르되 적절한 산 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다:
제조예 화학명 ES / MS m/z
16 N-(1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-시아노-N-메틸벤즈아미드 406.2 (M+1)
17 N-(1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-플루오로-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 467.2 (M+1)
18 N-(1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 465.2 (M+1)
실시예 1
N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00009
메틸{1-[4-(4-플루오로-페닐)프탈라진-1-일]피페리딘-4-일}메틸아민 (100 mg, 0.300 mmol), 트리에틸아민 (0.12 mL, 0.89 mmol) 및 디클로로메탄 (2 mL)을 실온에서 합하였다. 4-(트리플루오로메톡시)-벤조일 클로라이드 (100 mg, 0.45 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (메탄올 중 20:5:1, 헥산:에틸 아세테이트:2 M 암모니아)에 의해 정제하였다. 디에틸 에테르 중 1 N HCl을 디클로로메탄/메탄올 중 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 질소 기체 흐름 하에 용매를 제거하여 고체 (98 mg, 58%)인 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 525.0 (M+1).
별법의 과정:
{1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-아민 히드로클로라이드 (58 g, 155 mmol)를 1,4-디옥산 (580 mL)에 첨가하였다. 트리에틸아민 (86 mL, 622 mmol)을 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 4-(트리플루오로메톡시)벤조일 클로라이드 (24 mL,155 mmol)를 20분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 주변 온도에서 한 시간 동안 교반하였다. 물 (100 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추출하고, 감압 하에 유기 부분을 농축하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하고, 1 kg의 실리카 플러그 상에서 에틸 아세테이트로 용출시켜 무색 오일 (58 g, 71%)인 생성물을 수득하였다. 톨루엔 (586 mL)을 에탄올 (117 mL)과 합하고 3℃로 냉각하였다. 20분의 기간에 걸쳐 아세틸 클로라이드 (8 mL, 111 mmol)를 첨가하였다. 20분 동안 교반한 다음, 톨루엔 (40 mL) 중 N-{1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-N-메틸-4-트리플루오로메톡시-벤즈아미드 (58 g, 111 mmol)를 한번에 첨가하였다. 12시간 동안 교반하였다. 1/3 부피로 농축하였다. 여과에 의해 침전물을 수집하였다. 진공 오븐에서 고체를 40℃에서 밤새 건조시켜 백색 고체 (42 g, 67%)인 표제 화합물을 제공하였다. ES/MS m/z 525.0 (M+1).
본질적으로 실시예 1에 기재된 과정을 따르되 적절한 산 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다:
Figure 112010069996756-pct00010
실 시예 화학명 벤즈아미드 치환기 ES / MS m/z
2 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CF3 509.2 (M+1)
3 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CF3 509.2 (M+1)
4 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3 509.2 (M+1)
5 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-OCF3 525.2 (M+1)
6 2,6-디플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-F 477.2 (M+1)
7 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-CF3
527.2 (M+1)
8 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2,5-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 5-CF3 576.8
(M+1)
9 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-CF3
527.0 (M+1)
10 2,4-디클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 4-Cl 509.0 (M+1)
11 2,4,6-트리플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-F, 6-F 495.0 (M+1)
12 5-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 5-F 527.0 (M+1)
13 3-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-F, 4-CF3 527.0 (M+1)
14 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 3-CF3, 527.0 (M+1)
15 2-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드, 히드로클로라이드 2-Cl, 5-CF3 543.0 (M+1)
16 3-클로로-2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 3-Cl, 6-CF3 561.0 (M+1)
17 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-3-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-OCF3 525.2 (M+1)
18 2-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl 475.0 (M+1)
19 3-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 3-Cl 475.0 (M+1)
20 4-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 4-Cl 475.0 (M+1)
21 2,4-디플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-F 477.0 (M+1)
22 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 5-CF3
527.0 (M+1)
23 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2,4-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-CF3 577.0 (M+1)
24 4-시아노-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CN 466.2 (M+1)
25 2,6-디클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 6-Cl 509.0 (M+1)
26 3-시아노-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CN 466.2 (M+1)
27 4-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-Cl 542.6 (M+1)
28 2,4-디클로로-5-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 4-Cl, 5-F 526.6 (M+1)
29 5-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 5-Cl 543.2 (M+1)
30 4-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-F 527.0 (M+1)
실시예 30에 대한 별법의 과정:
{1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-아민 히드로클로라이드 (80 g, 240 mmol)를 물 (500 mL)에 첨가하여 슬러리를 형성하였다. 포타슘 카르보네이트를 pH가 10이 될 때까지 첨가하였다. 메틸렌 클로라이드 (400 mL)를 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 격렬하게 교반하였다. 유기층을 분리하고 투명한 오일 (74 g, 220 mmol)로 농축하여 1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-아민을 제공하였다.
{1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-메틸-아민 (12 g, 35 mmol), 피리딘 (20 mL, 247 mmol) 및 1,4-디옥산 (120 mL)을 합하였다. 반응을 20분 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (25 mL)을 첨가하였다. 슬러리를 20분 동안 교반하였다. 4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)벤조일 클로라이드 (6.5 mL, 43 mmol)를 20분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (100 mL)에 붓고, 디클로로메탄 (200 mL)으로 추출하고 감압 하에 농축하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (1:1, 에틸 아세테이트:헥산)에 의해 잔류물을 정제하여 백색 고체 (10.3 g, 55%)인 생성물을 수득하였다. 4-플루오로-N-{1-[4-(4-플루오로-페닐)-프탈라진-1-일]-피페리딘-4-일}-N-메틸-2-트리플루오로메틸-벤즈아미드 (10 g, 19.85 mmol)를 톨루엔 (125 mL)에 첨가하여 슬러리를 수득하였다. 메탄올 (30 mL)을 첨가하여 균질한 용액을 만들었다. 염화수소 (5.21 mL, 1,4-디옥산 중에 4.0 N, 20 mmol)를 한번에 첨가하였다. 1시간 동안 교반되도록 하고, 1/3 부피로 농축하였다. 고체를 수집하고 진공 오븐에서 12시간 동안 35℃에서 건조하여 백색 고체 (9.5 g, 85%)인 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 527.0 (M+1).
실시예 31
4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00011
메틸-[1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일]-아민 (800 mg, 2.51 mmol), 트리에틸아민 (1.05 mL, 7.54 mmol) 및 디클로로메탄 (20 mL)을 실온에서 합하였다. 4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)벤조일 클로라이드 (683 mg, 3.01 mmol)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (메탄올 중에 20:5:1, 헥산:에틸 아세테이트:2 M 암모니아)에 의해 정제하였다. 디에틸 에테르 중의 1 N HCl을 디클로로메탄/메탄올 중의 단리된 생성물의 용액에 첨가하였다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 (1.13 g, 88%)을 수득하였다. ES/MS m/z 509.2 (M+1).
본질적으로 실시예 31에 기재된 과정을 따르되 적절한 산 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다. 여과에 의해 또는 용매의 증발에 의해 HCl 염을 단리하였다:
Figure 112010069996756-pct00012
실시예 화학명 벤즈아미드 치환기 ES / MS m/z
32 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-OCF3 507.2 (M+1)
33 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-OCF3 507.2 (M+1)
34 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3 491.2 (M+1)
35 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CF3 491.2 (M+1)
36 2-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-CF3 509.2 (M+1)
37 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CF3 491.2 (M+1)
38 2-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-CF3 509.2 (M+1)
39 2,4-디클로로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 4-Cl 491.0 (M+1)
40 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2,4-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-CF3 559.2 (M+1)
41 4-시아노-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CN 448.2 (M+1)
42 3-클로로-2-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 3-Cl, 6-CF3 543.0 (M+1)
43 5-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 5-F 509.2 (M+1)
44 N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2,5-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 5-CF3 559.2 (M+1)
45 2-클로로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 5-CF3 525.2 (M+1)
46 2-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 5-CF3 509.2 (M+1)
47 3-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-F, 4-CF3 509.2 (M+1)
48 2-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 3-CF3 509.2 (M+1)
실시예 49
N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00013
1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 (110 mg, 0.34 mmol), 트리에틸아민 (0.14 mL, 1.02 mmol) 및 디클로로메탄 (2 mL)을 실온에서 합하였다. 4-(트리플루오로메틸)-벤조일 클로라이드 (85 mg, 0.41 mmol)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (메탄올 중 20:5:1, 헥산:에틸 아세테이트:2 M 암모니아)에 의해 정제하였다. 디에틸 에테르 중 1 N HCl을 디클로로메탄/메탄올 중 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 질소 기체 흐름 하에 용매를 제거하여 고체 (57 mg, 32%)인 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 495.2 (M+1).
본질적으로 실시예 49에 기재된 과정을 따르되 적절한 산 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다:
Figure 112010069996756-pct00014
실 시예 화학명 벤즈아미드 치환기 ES / MS m/z
50 4-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-F 445.2 (M+1)
51 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CF3 495.2 (M+1)
52 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-OCF3 511.2 (M+1)
53 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3 495.2 (M+1)
54 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-OCF3 511.0
(M+1)
55 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-OCF3 511.0 (M+1)
56 4-시아노-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CN 452.0 (M+1)
57
2,6-디플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-F 463.0 (M+1)
58 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-CF3 513.0 (M+1)
59 2,4,6-트리플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-F, 6-F 481.0 (M+1)
60 2-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 5-CF3 513.0 (M+1)
61 4-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-F 513.0 (M+1)
62 N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2,4-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-CF3 563.0 (M+1)
63 2-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl 461.0 (M+1)
64 3-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-Cl 461.0 (M+1)
65 4-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-Cl 461.0 (M+1)
66 2,4-디클로로-5-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl, 4-Cl, 5-F 512.6 (M-1)
67 4-클로로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-Cl 528.6 (M+1)
실시예 68
N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00015
1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 (110 mg, 0.34 mmol), 트리에틸아민 (0.140 mL, 1.02 mmol), 및 디클로로메탄 (2 mL)을 실온에서 합하였다. 4-(트리플루오로메틸)-벤조일 클로라이드 (85 mg, 0.41 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (메탄올 중 20:5:1, 헥산:에틸 아세테이트:2 M 암모니아)에 의해 정제하였다. 디에틸 에테르 중 1 N HCl을 디클로로메탄/메탄올 중 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 질소 기체 흐름 하에 놓아서 용매를 제거하여 고체 (116 mg, 67%)인 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 477.2 (M+1).
본질적으로 실시예 68에 기재된 과정을 따르되 적절한 산 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다:
Figure 112010069996756-pct00016
실 시예 화학명 벤즈아미드 치환기(들) ES / MS m/z
69 4-플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-F 427.2 (M+1)
70 N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CF3 477.2 (M+1)
71 N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3 477.2 (M+1)
72 N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-OCF3 493.0 (M+1)
73 N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-3-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-OCF3 493.0 (M+1)
74 4-시아노-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-CN 434.0 (M+1)
75 3-시아노-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-CN 434.0 (M+1)
76 2,4-디플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-F 445.0 (M+1)
77 2,6-디플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-F 445.0 (M+1)
78 2-플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-6-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 6-CF3 495.0 (M+1)
79 2,4,6-트리플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 4-F, 6-F 463.0 (M+1)
80 2-플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-F, 5-CF3 495.0 (M+1)
81 4-플루오로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-F 495.0 (M+1)
82 N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2,4-비스(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-CF3, 4-CF3 545.0 (M+1)
83 2-클로로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 2-Cl 443.0 (M+1)
84 3-클로로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 3-Cl 443.0 (M+1)
85 4-클로로-N-(1-(4-페닐프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 4-Cl 443.0 (M+1)
실시예 86
N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00017
1-클로로-4-(4-플루오로페닐)프탈라진 (150 mg, 0.58 mmol), N-(피페리딘-4-일)벤즈아미드 (178 mg, 0.87 mmol), 트리에틸아민 (0.404 mL, 2.9 mmol) 및 디메틸포름아미드 (1 mL)를 실온에서 합하였다. 100℃로 가열하고, 밤새 교반하였다. 조 반응 혼합물을 강한 양이온 교환 페노메넥스 스트라타 (Phenomenex Strata)(등록상표) SCX (55 ㎛, 70 Å) 10 g/60 mL 컬럼 (벤젠 술폰산 관능기를 포함함)에 부었다. 2 N 메탄올성 암모니아 (40 mL)로 바람직한 생성물을 용출하고 농축하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 중의 20-30% [에틸 아세테이트 중의 10% 2 N 메탄올성 암모니아])에 의해 잔류물을 정제하였다. 디에틸 에테르 중의 1 N 염산을 디클로로메탄/메탄올 중의 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 질소 기체 흐름 하에 용매를 제거하여 고체 (137 mg, 51%)인 표제 화합물을 수득하였다. ES/MS m/z 427.2 (M+1).
실시예 87
N-(1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-4-플루오로-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00018
4-(4-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)프탈라진-1-일)벤조니트릴 디히드로클로라이드 (44.7 mg, 0.107 mmol), 디클로로메탄 (1 mL), 및 트리에틸아민 (0.0598 mL, 0.429 mmol)을 4 mL 반응 바이알에 충진하였다. 반응 바이알을 질소로 플러싱하고, 4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)벤조일 클로라이드 (0.033 g, 0.14 mmol)를 첨가하였다. 바이알에 캡을 씌우고, 반응이 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 잔류물로 증발시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (40:60, 에틸 아세테이트:헥산, 그 후 에틸 아세테이트)를 사용하여 정제하였다. 디에틸 에테르 중의 1 N HCl을 디클로로메탄/메탄올 중의 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 질소 기체 흐름 하에 놓아서 용매를 제거하였다. 진공 오븐에서 50℃에서 건조하여 표제 화합물 (36.0 mg, 59%)을 수득하였다. ES/MS m/z 533.8 (M+1).
본질적으로 실시예 87에 기재된 과정을 따르되 제조예 11 또는 제조예 13으로부터의 적절한 시작 물질 및 4-(트리플루오로메톡시)벤조일 클로라이드를 사용하여, 하기 표에서의 아미드를 제조하였다:
Figure 112010069996756-pct00019
실시 예 화학명 구조 ES / MS m/z
88 N-(1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CN 532.2 (M+1)
89 N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CF3 575.2 (M+1)
실시예 90
N-메틸-2-(트리플루오로메틸)-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112010069996756-pct00020
N-(1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (0.101 g, 0.23 mmol), 4-(트리플루오로메틸)페닐보론산 (0.171 g, 0.9 mmol), 세슘 카르보네이트 (0.295 g, 0.91 mmol), 1,4-디옥산 (3 mL), 및 물 (1 mL)을 마이크로웨이브 용기에 충진하였다. 반응 바이알을 질소로 2회 퍼징하였다. (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org . Chem . 2007, 72, 5104-5112]) (0.002 g; 0.003 mmol)을 첨가하고, 90℃에서 16시간 동안 반응을 가열하였다. 냉각 후, 2개의 층들을 분리하고, 물을 제거하였다. 질소 흐름으로 유기 용매를 증발시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 0-10% 메탄올)를 사용하여 유기층으로부터 잔류물을 정제하였다. 디옥산 중 4 N HCl을 메탄올 중 단리된 생성물의 용액에 첨가하고, 진공에서 용매를 제거하여 표제 화합물 (0.100 g, 75%)을 수득하였다. ES/MS m/z 559.2 (M+1).
본질적으로 실시예 90에 기재된 과정을 따르되 제조예 15-18로부터 적절한 시작 물질 및 적절한 보론산을 사용하여, 하기 표에서의 화합물을 제조하였다:
Figure 112010069996756-pct00021
실시예 화학명 R 기
(달리 나타내지 않는다면 Rx = H)		 ES / MS m/z
91 3-시아노-N-메틸-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CF3; R4 = CN 516.2 (M+1)
92 N-(1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CN; R3 = CF3 516.2 (M+1)
93 N-(1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-5-플루오로-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CN; R3 = CF3; R6 = F 534.2 (M+1)
94 3-시아노-N-(1-(4-(4-시아노페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = CN; R4 = CN 473.2 (M+1)
95 5-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCF3; R3 = CF3; R6 = F 593.2 (M+1)
96 N-메틸-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCF3; R3 = CF3 575.2 (M+1)
97 3-시아노-N-(1-(4-(4-메톡시페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCH3; R4 = CN 478.2 (M+1)
98 3-시아노-N-메틸-N-(1-(4-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCF3; R4 = CN 532.2 (M+1)
99 N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)-N-
(1-(4-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)
프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)벤즈아미드 히드로클로라이드 		R1 = OCF3; R5 = OCF3 591.2 (M+1)
100 N-(1-(4-(4-메톡시페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCH3; R5 = OCF3 537.2 (M+1)
101 5-플루오로-N-(1-(4-(4-메톡시페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCH3; R3 = CF3; R6 = F 539.2 (M+1)
102 N-(1-(4-(4-메톡시페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 R1 = OCH3; R3 = CF3 521.2 (M+1)
소닉 헤지호그 (Shh) 경로는 배발생 동안 중요하지만, 대부분의 조직에서 초기의 생후 발달 후에 하향조절된다. 대조적으로, 인간 수모세포종의 30% 초과는 높은 수준의 Gli1 (신경교종-연관 종양유전자 동족체 1) 발현을 나타내며, 이는 Shh 경로의 비정상적 활성화가 소아 뇌 종양의 일부에서 중요함을 암시한다. 소뇌의 푸르키니에 (Purkinje) 세포에 의해 분비된 Shh는 과립 전구세포의 증식을 촉진하며, 이는 헤지호그 (Hh) 경로의 통제되지 않은 활성화가 수모세포종의 발달을 지속시킬 수 있음을 암시한다. 본 가설은 패치드 (Patched) 유전자 (Ptch -/+) 마우스에서 수모세포종의 발달에 의해 확인된다. 헤지호그 길항제로의 이들 마우스의 치료는 종양 성장을 억제하였다. 게다가, 헤지호그 길항제 치료가 이들 뇌 종양에서 Gli1 발현의 저해를 초래하였다는 사실이 문서화되어 있다.
통제되지 않는 헤지호그 경로 활성은 많은 다른 암에서도 보고되어 왔다. 예를 들면, 헤지호그는 다음의 암에 대해 생존 인자로서 시사되어 왔다: 기저세포암종; 상부위장관암 (식도, 위, 췌장, 및 담관); 전립선암; 유방암; 소세포폐암; 비-소세포폐암; B-세포 림프종; 다발성 골수종; 위암; 난소암; 결장직장암; 간암; 흑색종; 신장암 및 수모세포종.
헤지호그 경로의 요소들은 암의 치료를 위한 잠재적 약물 표적이라고 주장되어 왔다. 수모세포종 종양으로부터 확립된 다오이 (Daoy) 세포주 (ATCC, HTB-186)는 Hh 리간드에 반응한다. 이들 세포를 외인성 첨가 Shh-조절된 배지로 처리하는 경우, Hh 신호전달 경로가 활성화되어 증가된 Gli1의 발현을 야기한다. 콘 릴리 베라트룸 칼리포르니쿰 (Veratrum californicum)으로부터 단리된 알칼로이드인 시클로파민은 약한 헤지호그 길항제이고, Shh 자극에 반응하여 Gli1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 최근의 관찰은 시클로파민이 배양된 수모세포종 세포 및 동종이식편의 성장을 저해함을 제안한다. 이러한 다오이 세포 모델 계를 사용하여, 헤지호그 신호전달 경로의 강한 저해제를 확인할 수 있다. 본 발명의 화합물이 헤지호그 길항제이므로, 이들은 전술한 종양 타입의 치료에 적합하다.
생물적 활성 IC50 의 측정
본 발명의 화합물 및 방법의 유용성과 효능을 추가로 입증하는 다음의 검정 프로토콜 및 그의 결과는 예시를 목적으로 제시되며, 어떠한 방식으로든 한정하고자 하는 것은 아니다. 관능적 검정은 본 발명의 화합물이 Shh 신호전달을 저해하는 능력을 나타낸다는 근거를 제공한다. 다음의 검정에서 이용된 모든 리간드, 용매, 및 시약은 상업적인 공급원으로부터 쉽게 이용가능하거나 또는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
생물적 활성은 다오이 뉴론의 암 세포에서 관능적 검정을 사용하여 결정되며, bDNA (분지된 데옥시리보핵산) 검정계 (Panomics, Inc., Fremont, CA)를 통해 Gli1 리보핵산의 수준을 측정한다. Gli는 교아세포종 세포주에서 최초로 발견되었고, Shh 신호전달에 의해 활성화되는 진크 핑거 (zinc finger) 단백질을 코딩한다. 최대 반응은 조정배지를 이용해서 다오이 세포 (안정적으로 재조합 Shh를 발현하는 HEK-293 세포)에서 24시간 동안 Gli1 전사를 유도한 다음, 자극된 Gli1 전사체의 양을 측정함으로써 수득된다. 최소 반응은 조정배지로 자극된 다오이 세포 (인간 배아 신장, 안정적으로 재조합 Shh를 발현하는 (HEK)-293 세포)에서 24시간 동안 대조군 화합물로 저해된 Gli1 전사체의 양이다.
다오이 세포에서 Gli1 의 저해를 측정하기 위한 관능적 검정
bDNA 검정계는 표적 리보핵산 (전사체)의 증폭을 가능케하는 분지쇄 DNA의 기술을 이용한다. 이 기술은 표적 전사체와 복합체로서 혼성화하여 혼성화 신호를 증폭시키는 표적 전사체 (포획 익스텐더 (CE), 표지 익스텐더 (LE), 및 차단제 (BL))의 특이성을 결정하는 합성 하이브리드인 짧은 Gli1-특이적 cDNA 프로브의 세 종류를 이용한다. 증폭 단계 동안 화학발광성 기질의 첨가는 발광을 이용하는 검출을 가능케 한다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture collection) (ATCC)으로부터 수득한 다오이 세포주는 Shh-반응성 인간 뉴론의 종양 세포주이고, 1985년에 섬유조직형성의 소뇌의 수모세포종 종양, 생리적으로 관련된 종양 세포주로부터 확립되었다. 다오이 세포에서 Gli1 전사체 수준 중 내인성 수준은 낮지만, 인간 Shh를 안정적으로 과다발현하는 세포 (hShh로 안정적으로 형질감염된 HEK-293 세포주)로부터 얻어진 조정배지를 사용하여 자극될 수 있다.
다오이 세포는 최소 필수 배지 (MEM)에 더하여 0.1 nM 비-필수 아미노산 및 1 mM 나트륨 피루브산염을 포함한 10% 우태혈청 (FBS)을 함유하는 다오이 성장 배지로 조직 배양 T225-플라스크에서 전면배양으로 성장시켰다. 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 T225-플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하고, 배지 중에 재현탁한 다음, 계수하였다.
그 후, 다오이 세포를 코스타 (Costar) 96 웰 투명 조직 배양 플레이트 중의 성장 배지에 각 웰마다 50,000 세포를 접종하고, 5% 이산화탄소 (CO2)하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 인산염완충염수 (PBS) 중에서 1회 세척하고, 이어서 100 ㎕의 Shh 조정배지 (Shh-CM)를 첨가하여 Gli1 발현 수준을 자극하였다. 대조군 성장 배지-0.1% FBS/DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)을 사용하여 최대 자극을 달성하기 위해 Shh-CM을 희석시켰다. 그 후, Shh-CM으로 처리된 다오이 세포를 대략 1 μM 내지 0.1 nM 범위 농도인, 헤지호그 저해제의 다양한 농도로 처리하였다. 화합물을 5% CO2 하에 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
Gli1 전사체의 측정은 제조사 (Panomics, Inc.)에 의해 기재된 바와 같은 퀀티젠(Quantigene) 2.0 Gli1 검정을 사용하여 수행하였다. 프로테이나제 K를 포함하는 희석된 용해 혼합물 (DLM) 완충액을 제조하였다. 화합물과 24시간 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 180 ㎕의 DLM을 세포에 첨가하였다. 용해 완충액을 함유하는 세포 플레이트를 밀봉하고, 55 ℃에서 30분 내지 45분 동안 두었다. 그 후, 생성된 세포 용해물을 5회 분쇄하였다. 제조사의 지시에 따라 DLM 중 프로브의 희석에 의해 Gli1 프로브를 함유하는 워킹 프로브 세트를 만든 다음, 80 ㎕의 다오이 용해물과 함께 20 ㎕의 워킹 프로브 세트를 bDNA 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 55 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 bDNA 플레이트를 처리하였다. 발광을 검출하는 퍼킨 엘머 엔비젼 (Perkin Elmer Envision) 판독기 상에서 플레이트를 판독하여 신호를 정량하였다. 발광 신호는 샘플 중에 존재하는 표적 전사체의 양에 직접적으로 비례하였다.
기능적 검정으로부터 발광 신호 데이터는 시험관 내 검정에 대해 IC50을 계산하는데 사용되었다. 데이터는 최대 대조군 값 (Shh-CM으로 처리된 다오이 세포) 및 최소 대조군 값 (Shh-CM 및 저해농도의 대조군 화합물, 1 μM의 N-(3-(1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-클로로페닐)-3,5-디메톡시벤즈아미드로 처리된 다오이 세포)을 기초로 계산하였다. 4개 매개변수 로지스틱 곡선 피트는 액티비티베이스 (ActivityBase) 소프트웨어 프로그램 vs. 5.3, 방정식 205 (Guidance for Assay Development and HTS, vs 5, Copyright 2005, Eli Lilly and Co. and The National Institutes of Health Chemical Genomics Center)를 사용하여 IC50 값을 생성시키는데 사용되었다. 4개 매개변수 방정식은 다음과 같다: 피트(Fit) = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))이고, 여기서 A=하부, B=상부, C=IC50 및 D=힐 계수이다. 기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 화합물은 30 nM 미만의 IC50을 나타냈다. 실시예 36의 화합물은 상기 기재된 검정에서 0.150 (n=2)의 표준오차로 약 2.37 nM의 IC50을 나타냈다. 이들 결과는 본 발명의 화합물이 헤지호그 길항제이고, 그에 따라 항암제로서 유용하다는 증거를 제공한다.

Claims (23)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure 112010069997904-pct00023

    상기 식에서,
    R1은 수소, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸, 메톡시, 또는 트리플루오로메톡시이고;
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R3, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 수소, 클로로, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이며, 단 R3, R4, R5, R6 및 R7 중 적어도 2개는 수소이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서, R1이 플루오로인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  4. 제2항에 있어서, R2가 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  5. 제3항에 있어서, R2가 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  6. 제2항에 있어서, R2가 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  7. 제3항에 있어서, R2가 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  8. 제4항에 있어서, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  9. 제5항에 있어서, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  10. 제6항에 있어서, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  11. 제7항에 있어서, R3이 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  12. 제8항에 있어서, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  13. 제9항에 있어서, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  14. 제10항에 있어서, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  15. 제11항에 있어서, R5가 플루오로, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  16. 제13항에 있어서, 4-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  17. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 암 치료용 제약 조성물:
    Figure 112012075380077-pct00028

    상기 식에서,
    R1은 수소, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸, 메톡시, 또는 트리플루오로메톡시이고;
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R3, R4, R5, R6 및 R7은 독립적으로 수소, 클로로, 플루오로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이며, 단 R3, R4, R5, R6 및 R7 중 적어도 2개는 수소이다.
  18. 제17항에 있어서, 암이 수모세포종, 기저세포암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물:
    Figure 112012075380077-pct00029

    상기 식에서,
    R1은 수소 또는 플루오로이고;
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R3은 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로메톡시이고;
    R5는 플루오로, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸이다.
  20. 제19항에 있어서, 4-플루오로-N-(1-(4-(4-플루오로페닐)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
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