DE69736484T2

DE69736484T2 - Hedgehog wechselwirkende proteine und ihre darauf bezogenen anwendungen

Info

Publication number: DE69736484T2
Application number: DE69736484T
Authority: DE
Inventors: P. Andrew Lexington MCMAHON; Tien Pao Cambridge CHUANG
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2017-09-20
Also published as: ATE335819T1; IL181578A; IL128999A; EP0935656A1; US7585671B2; WO1998012326A1; JP4083810B2; US20030143595A1; AU4489297A; DE69736484D1; US7115394B2; EP0935656B1; DK0935656T3; IL128999A0; ES2278396T3; US20070054290A1; CA2266429C; US6514724B1; IL181578A0; AU742972B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Musterbildung stellt die Aktivität dar, durch die Embryonalzellen geordnete räumliche Anordnungen von differenzierten Geweben bilden. Die physikalische Komplexität höherer Organismen entsteht während der Embryogenese durch das Zwischenspiel von zellintrinsischer Abstammung und zellextrinsischem Signalisieren. Induktive Interaktionen sind für die embryonale Musterbildung bei der Entwicklung von Vertebraten von der frühesten Etablierung des Körperplanes bis zur Musterbildung der Organsysteme, bis zur Generierung diverser Zelltypen während der Gewebsdifferenzierung wesentlich (Davidson, E., (1990) Development 108: 365–389; Gurdon, J. B., (1992) Cell 68: 185–199; Jessell, T. M. et al., (1992) Cell 68: 257–270). Die Effekte der Zellinteraktionen während der Entwicklung sind unterschiedlich. In der Regel werden ansprechende Zellen durch induzierende Zellen, die sich sowohl von nicht induzierten als auch induzierten Zuständen der ansprechenden Zellen (Induktionen) unterscheiden, von einer Route der Zelldifferenzierung zu einer anderen umgeleitet. Manchmal induzieren Zellen ihre Nachbarn, sich wie sie selbst zu differenzieren (homoiogenetische Induktion); in anderen Fällen inhibiert eine Zelle ihre Nachbarn, sich wie sie selbst zu differenzieren. Zellinteraktionen in der frühen Entwicklung können sequenziell auftreten, dergestalt, dass eine initiale Induktion zwischen zwei Zelltypen zu einer progressiven Amplifikation der Diversität führt. Induktive Interaktionen kommen überdies nicht nur in Embryos, sondern auch in adulten Zellen vor und können bei der Etablierung und Aufrechterhaltung morphogenetischer Muster ebenso wie bei der Induktion der Differenzierung wirken (J. B. Gurdon (1992) Cell 68: 185–199).
Die Entstehung des Nervensystems kann bei allen Vertebraten bis zum Ende der Gastrulation zurückverfolgt werden. Zu diesem Zeitpunkt ändert das Ektoderm in der dorsalen Seite des Embryos sein Schicksal von epidermal nach neutral. Das neu gebildete Neuroektoderm verdickt sich zur Bildung einer abgeflachten, als Neuralplatte bezeichneten Struktur, die bei einigen Vertebraten durch eine zentrale Rinne (Neuralrinne) und verdickten lateralen Rändern (Neuralfalten) gekennzeichnet ist. Auf diesen frühen Differenzierungsstufen weist die Neuralplatte bereits Zeichen einer regionalen Differenzierung entlang seiner anterior-posterioren (A-P) und mediolateralen (M-L) Achse auf. Die Neuralfalten fusionieren allmählich an der dorsalen Mittellinie zur Bildung des Neuralrohrs, das sich an seinem anterioren Ende zum Gehirn und an seinem posterioren Ende zum Rückenmark entwickelt. Der Schluss des Neuralrohrs führt aufgrund der vorherigen mediolateralen Differenzierung dorsale/ventrale Unterschiede herbei. Folglich weist das Neuralrohr am Ende der Neurulation deutliche anterior-posteriore (A-P), dorsoventrale (D-V) und mediolaterale (M-L) Polaritäten auf (siehe zum Beispiel Principles in Neural Science (3. Aufl.), Hrsg. Kandel, Schwartz und Jessell, Elsevier Science Publishing Company: NY, 1991; und Developmental Biology (3. Aufl.), Hrsg. S. F. Gilbert, Sinauer Associates: Sunderland MA, 1991). Induktive Interaktionen, die das Schicksal von Zellen im Neuralrohr definieren, etablieren das initiale Muster des embryonalen Nervensystems von Vertebraten. Im Rückenmark wird die Identifikation von Zelltypen teilweise durch Signale aus zwei Zellgruppen der Mittellinie, der Chorda dorsalis und der Bodenplatte kontrolliert, die die Zellen der Neuralplatte zur Differenzierung in die Bodenplatte, in Motoneuronen und andere ventrale neuronale Typen induzieren (van Straaten et al. (1988) Anat. Embryol. 177: 317–324; Placzek et al. (1993) Development 117: 205–218; Yamada et al. (1991) Cell 64: 035–647; und Hatta et al. (1991) Nature 350: 339–341). Außerdem sind Signale von der Bodenplatte für die Orientierung und Richtung von kommissuralen neuronalen Auswüchsen verantwortlich (Placzek, M. et al., (1990) Development 110: 19–30). Die Chorda dorsalis und die Bodenplatte sind außer für die Musterbildung des Neuralrohrs auch für die Bildung von Signalen verantwortlich, welche die Musterbildung der Somiten durch Inhibition der Differenzierung von dorsalen Somiten-Derivaten in den ventralen Regionen kontrollieren (Brand-Saberi, B. et al., (1993) Anal. Embryol. 188: 239–245; Porquie, O. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5242–5246).
Ein anderes wichtiges Signalzentrum existiert im posterioren Mesenchym von sich entwickelnden Extremitätenknospen, das als die „Zone of Polarising Activity" oder „ZPA" bezeichnet wird. Wenn Gewebe aus der posterioren Region der Extremitätenknospe an den anterioren Saum einer zweiten Extremitätenknospe transplantiert wird, entwickelt sich die resultierende Extremität mit zusätzlichen Digiti in einer spiegelbildlichen Sequenz entlang der anteroposterioren Achse (Saunders und Gasseling, (1968) Epithelial-Mesenchymal Interaction, S. 78–97). Dieser Befund hat zum Modell geführt, dass die ZPA für die normale anteroposteriore Musterbildung in den Extremitäten verantwortlich ist. Es wurde hypothetisiert, dass die ZPA durch Freigabe eines Signals funktioniert, das als ein „Morphogen" bezeichnet wird, welches einen Gradienten über die frühe embryonale Knospe bildet. Gemäß diesem Modell wird das Schicksal der Zelle bei verschiedenen Entfernungen von der ZPA durch die lokale Konzentration des Morphogens bestimmt, wobei spezifische Schwellen des Morphogens sukzessive Strukturen induzieren (Wolpert, (1969) Theor. Biol. 25: 1–47). Dies wird von dem Befund unterstützt, dass sich das Ausmaß der Digiti-Duplikation proportional zur Zahl implantierter ZPA-Zellen verhält (Tickle, (1981) Nature 254: 199–202).
Obwohl die Existenz von Induktionssignalen in der ZPA seit Jahren bekannt gewesen ist, beginnen die molekularen Identitäten dieser Signale erst jetzt aufgeklärt zu werden. Ein wichtiger Schritt nach vorn stellte die Entdeckung dar, dass das sezernierte Protein Sonic-Hedgehog (Shh) in mehreren Geweben mit organisierenden Eigenschaften, einschließlich der Chorda dorsalis, der Bodenplatte und der ZPA gebildet wird (Echelard et al. (1993), Cell 75: 1417–1430; Bitgood, MJ. und A. P. McMahon (1995) Dev. Biol. 172: 126–38). Die Missexpression von Shh mimickt die induktiven Wirkungen auf die ektope Chorda dorsalis im Neuralrohr und die Somiten (Echelard et al. (1993) vorstehend) und mimickt auch die ZPA-Funktion der Extremitätenknospe (Riddle et al. (1993) Cell 75: 1401–16; Chang et al. (1994) Development 120: 3339–53).
Die Vertebratenfamilie der Hedgehog-Gene schließt mindestens vier Mitglieder, wie zum Beispiel Paraloge des einzelnen Drosophila-Hedgehog-Gens ein. Beispielhafte Hedgehog-Gene und -Proteine sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 beschrieben. Drei dieser Mitglieder, auf die hierin als auf Desert-Hedgehog (Dhh), Sonic-Hedgehog (Shh) und Indian-Hedgehog (Ihh) verwiesen wird, existieren scheinbar in allen Vertebraten, einschließlich Fischen, Vögeln und Säugetieren. Ein viertes Mitglied, auf das hierin als auf Tiggie-Winkle-Hedgehog (Thh) verwiesen wird, scheint für Fische spezifisch zu sein. Desert-Hedgehog (Dhh) wird in erster Linie in den Testes, sowohl in der embryonalen Entwicklung der Maus als auch im adulten Nagetier und im Menschen exprimiert; Indian-Hedgehog (Ihh) ist an der Knochenentwicklung während der Embryogenese und bei der Knochenentwicklung im Adulten beteiligt; und Shh ist, wie vorstehend beschrieben, primär an morphogenen und neuroinduktiven Aktivitäten beteiligt. Angesichts der kritischen induktiven Rollen der Hedgehog-Polypeptide bei der Entwicklung und Erhaltung der Organe von Vertebraten, ist die Identifikation von Hedgehog-interagierenden Proteinen, sowohl in klinischen als auch Forschungskontexten, von höchster Signifikanz.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist die Entdeckung einer neuen Klasse von Hedgehog-Bindungsprotein, auf das hierin als auf HIP (für Hedgehog-interagierendes Protein) verwiesen wird. Die erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide schließen Polypeptide ein, die die Produkte der Hedgehog-Genfamilie binden. Die Mitglieder der Hedgehog-Familie sind bekannt für ihre breitgefächerte Beteiligung an der Bildung und Aufrechterhaltung der geordneten räumlichen Anordnungen von differenzierten Geweben in Vertebraten, in adulten ebenso wie in embryonalen, und können zur Generierung und/oder Aufrechterhaltung eines Arrays verschiedener Vertebraten-Gewebe sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden.
Im Allgemeinen werden erfindungsgemäß isolierte HIP-Polypeptide, bevorzugt im Wesentlichen reine Präparationen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide, zur Geltung gebracht. Gegenstand der Erfindung sind auch die Bereitstellung rekombinant produzierter HIP-Polypeptide. In bevorzugten Ausführungsformen weist das Polypeptid eine biologische Aktivität auf, welche die Fähigkeit zur Bindung eines Hedgehog-Proteins mit hoher Affinität, zum Beispiel mit einer nanomolaren oder kleineren Dissoziationskonstante (K_D) einschließt. HIP-Polypeptide, welche solche Aktivitäten, wie sie zum Beispiel durch Trunkationsmutanten bereitgestellt werden können, spezifisch antagonisieren, werden auch spezifisch in Betracht gezogen.
In einer Ausführungsform ist das Polypeptid identisch mit oder homolog zu einem HIP-Polypeptid, das in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, oder der Core-Polypeptid-Sequenz davon (die zum Beispiel den Resten 16–678 von SEQ ID NO: 5 oder 6 entspricht). Verwandte Mitglieder der HIP-Familie werden auch in Betracht gezogen, zum Beispiel weist ein HIP-Polypeptid bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 65 %, 67 %, 69 %, 70 %, 75 % oder 80 % homolog zu einem Polypeptid ist, das durch SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, obwohl Polypeptide mit höheren Sequenzhomologien von zum Beispiel 82 %, 85 %, 90 % und 95 % auch in Betracht gezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das HIP-Polypeptid durch eine Nucleinsäure codiert, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die in jedweder einen oder mehr von SEQ ID NO: 1–4 und 9–14 dargestellt ist. Homologe der erfindungsgemäßen HIP-Proteine schließen auch Versionen des Proteins ein, die gegen eine Posttranslationsmodifikation, wie zum Beispiel aufgrund von Mutationen, welche die Modifikationsstellen verändern (wie zum Beispiel Tyrosin-, Threonin-, Serin- oder Asparaginreste) oder die die Glycosylierung des Proteins verhindern oder die Interaktion des Proteins mit einem HIP-Liganden, wie zum Beispiel einem Hedgehog-Polypeptid, verhindern, resistent sind.
Das HIP-Polypeptid kann ein Protein voller Länge umfassen, wie es zum Beispiel in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 dargestellt ist, oder es kann die Core-Polypeptidsequenz davon (die zum Beispiel den Resten 16–678 von SEQ ID NO: 5 oder 6 entspricht) einschließen, oder es kann ein Fragment, entsprechend einem oder mehr von bestimmten Motiven/Domänen oder arbiträren Größen, zum Beispiel mindestens 5, 10, 25, 50, 100, 150 oder 200 Aminosäuren in Länge einschließen. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das HIP-Polypeptid einen ausreichenden Anteil der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne ein, um spezifisch zur Bindung an einen Hedgehog-Liganden, bevorzugt mit einem K_D von 9 μM oder weniger und noch bevorzugter von 9 nM oder weniger, fähig zu sein. Trunkierte Formen des Proteins schließen lösliche Fragmente der Ligandenbindungsdomäne ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In bestimmten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird ein gereinigtes oder rekombinantes HIP-Polypeptid mit einem Molekulargewicht des Core-Polypeptids von ca. 78,4 kD zur Geltung gebracht. In anderen Ausführungsformen weist der Peptid-Core eines maturen HIP-Proteins bevorzugt ein Molekulargewicht im Bereich von 38,6 bis 76,8 kD auf. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen, zum Beispiel Glycosylierung, Prenylierung, Myristylierung und dergleichen, das scheinbare Molekulargewicht des HIP-Proteins bezogen auf die nicht modifizierte Polypeptidkette steigern können.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auch als chimäre Moleküle, wie zum Beispiel in der Form von Fusionsproteinen, bereitgestellt werden. Das HIP-Protein kann zum Beispiel als ein rekombinantes Fusionsprotein bereitgestellt werden, das Folgendes einschließt: einen zweiten Polypeptidanteil, zum Beispiel ein zweites Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die nicht mit dem HIP-Polypeptid verwandt (heterolog) ist, wobei zum Beispiel der zweite Polypeptidanteil Glutathion-S-Transferase darstellt, wobei zum Beispiel der zweite Polypeptidanteil eine enzymatische Aktivität, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase aufweist, wobei zum Beispiel der zweite Polypeptidanteil ein Epitop-Tag darstellt.
In einer noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden HIP-Polypeptide codierende Nucleinsäuren zur Geltung gebracht, welche die Fähigkeit zur Modulation besitzen, die zum Beispiel mindestens einen Anteil der Aktivität eines Wildtyp-HIP-Polypeptids entweder mimicken oder antagonisieren. Beispielhafte HIP-codierende Nucleinsäuresequenzen sind durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt.
In einer anderen Ausführungsform schließen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren Codiersequenzen ein, die unter stringenten Bedingungen mit allen oder einem Anteil der Codiersequenzen, die in einer oder mehr von SEQ ID NO: 1–4 festgelegt sind, hybridisieren. Die Codiersequenzen der Nucleinsäuren können Sequenzen umfassen, die mit den in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 dargestellten Codiersequenzen identisch sind, oder sie können lediglich zu diesen Sequenzen homolog sein. In bevorzugten Ausführungsformen codieren die Nucleinsäuren Polypeptide, die durch Wirkung, als entweder Agonisten oder Antagonisten, eine oder mehr der Bioaktivitäten von Wildtyp-HIP-Polypeptiden spezifisch modulieren.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließen die erfindungsgemäßen HIP-Nucleinsäuren überdies eine transkriptionale Regulationssequenz, zum Beispiel mindestens eine von einem transkriptionalen Promotor oder einer transkriptionalen Enhancer-Sequenz ein, welche Regulationssequenz funktionsfähig mit den HHP-Gensequenzen verknüpft ist. Solche Regulationssequenzen können verwendet werden, um die HIP-Gensequenzen zur Verwendung als ein Expressionsvektor geeignet zu machen. Die transkriptionale Regulationssequenz kann von einem HIP-Gen oder von einem heterologen Gen stammen.
Es werden erfindungsgemäß auch die mit dem Expressionsvektor transfizierten Zellen, ob prokaryotisch oder eukaryotisch, und ein Verfahren zur Herstellung von HIP-Proteinen durch Einsatz dieser Expressionsvektoren in Betracht gezogen.
Die Anmeldung offenbart auch ein Genaktivierungskonstrukt, worin das Genaktivierungskonstrukt zur Rekombination mit einem genomischen HIP-Gen in einer Zelle bestimmt ist, um zum Beispiel durch heterologe Rekombination, eine heterologe transkriptionale Regulationssequenz bereitzustellen, die funktionsfähig mit einer Codiersequenz eines genomischen HIP-Gens verknüpft ist. Zellen mit genomischen HIP-Genen, die durch Genaktivierungskonstrukte modifiziert sind, werden auch spezifisch in Betracht gezogen.
In einer noch anderen Ausführungsform werden erfindungsgemäß Nucleinsäuren bereitgestellt, die unter stringenten Bedingungen an Nucleinsäuresonden hybridisieren, die Folgendem entsprechen: mindestens 12 konsekutiven Nucleotiden von entweder Sense- oder Antisense-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4; obwohl bevorzugt mindestens 25 konsekutiven Nucleotiden; und bevorzugter mindestens 40, 50 oder 75 konsekutiven Nucleotiden von entweder Sense- oder Antisense-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
Ein noch anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Immunogen, umfassend ein HIP-Polypeptid in einer immunogenen Präparation, wobei das Immunogen in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, die für ein HIP-Polypeptid spezifisch ist; zum Beispiel eine humorale Antwort, zum Beispiel eine Antikörperantwort; zum Beispiel eine Zellantwort. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Immunogen eine Antigendeterminante, zum Beispiel eine einzigartige Determinante, von einem Protein, das durch eine von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 8 dargestellt ist.
Ein noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt bringt Antikörper und Antikörper- Präparationen zur Geltung, die mit einem Epitop des HIP-Immunogens spezifisch reaktiv sind.
Es werden erfindungsgemäß auch transgene, nicht humane Tiere, zum Beispiel Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hühner, Frösche oder Schweine mit einem Transgen zur Geltung gebracht, zum Beispiel Tiere, die eine heterologe Form von einem hierin beschriebenen HIP-Gen einschließen (und bevorzugt exprimieren), oder die ein endogenes HIP-Gen missexprimieren, zum Beispiel ein Tier, in dem die Expression von einem oder mehr der erfindungsgemäßen HIP-Proteine disrupiert ist. Ein derartiges transgenes Tier kann als ein Tiermodell zur Untersuchung von Zell- und Gewebserkrankungen, umfassend mutierte oder missexprimierte HIP-Allele, oder zur Verwendung beim Screening von Arzneimitteln dienen.
Die Anmeldung offenbart auch eine Sonde/einen Primer, umfassend ein im Wesentlichen gereinigtes Oligonucleotid, worin das Oligonucleotid eine Nucleotidsequenzregion umfasst, die unter stringenten Bedingungen an mindestens 12 konsekutive Nucleotide von Sense- oder Antisense-Sequenzen von jedweder einen oder mehr von SEQ ID NO: 1–4 und 9–14 hybridisiert, oder natürlich vorkommende Mutanten davon. In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Sonde/der Primer weiter eine Markierungsgruppe ein, die daran gebunden ist und nachgewiesen werden kann. Die Markierungsgruppe kann zum Beispiel aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Radioisotopen, Fluoreszenzverbindungen, Enzymen und Enzym-Cofaktoren. Erfindungsgemäße Sonden können als ein Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifikation von mit einer Missexpression eines HIP-Proteins einhergehenden Dysfunktionen, wie zum Beispiel dem Nachweis in einer aus einem Patienten isolierten Zellprobe, einem Spiegel von einer ein HIP-Protein codierenden Nucleinsäure; zum Beispiel zum Messen eines HIP-mRNA-Spiegels in einer Zelle oder zur Bestimmung, ungeachtet, ob ein genomisches HIP-Gen mutiert oder deletiert wurde, verwendet werden. Diese sogenannten erfindungsgemäßen „Sonden/Primer" können auch als ein Teil der „Antisense"-Therapie verwendet werden, die auf die Verabreichung oder In-situ-Generierung von Oligonucleotidsonden oder ihre Derivate verweist, die unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA, codierend ein oder mehr der erfindungsgemäßen HIP-Proteine, um auf diese Weise die Expression dieses Proteins, zum Beispiel durch die Inhibition der Transkription und/oder Translation, zu inhibieren, spezifisch hybridisieren (zum Beispiel binden). Das Oligonucleotid ist bevorzugt mindestens 12 Nucleotide lang, obwohl Primer von 25, 40, 50 oder 75 Nucleotiden in Länge auch in Betracht gezogen werden.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Assay zum Screening von Testverbindungen auf Inhibitoren oder – als Alternative – Potenziatoren einer Interaktion zwischen einem Hedgehog-Protein und einem HIP-Polypeptid-Receptor bereitgestellt. Ein beispielhaftes Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (a) Bildung eines Reaktionsgemischs, das Folgendes einschließt: (i) ein Hedgehog-Polypeptid, (ii) ein HIP-Polypeptid und (iii) eine Testverbindung; und (b) Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide. Eine statistisch signifikante Änderung (Potenzierung oder Inhibition) der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide in Anwesenheit der Testverbindung, bezogen auf die Interaktion in Abwesenheit der Testverbindung, deutet auf einen potenziellen Agonisten (Mimetikum oder Potenziator) oder Antagonisten (Inhibitor) der Hedgehog-Bioaktivität für die Testverbindung hin. Das Reaktionsgemisch kann eine zellfreie Proteinpräparation, zum Beispiel ein rekonstituiertes Proteingemisch oder ein Zelllysat darstellen, oder es kann eine rekombinante Zelle, einschließlich einer heterologen Nucleinsäure darstellen, die das HIP-Polypeptid rekombinant exprimiert.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt der Schritt zum Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide einen kompetitiven Bindungsassay dar. In anderen bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet der Schritt zum Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide den Nachweis, in einem zellbasierenden Assay, der Änderungen) des Spiegels eines intrazellulären zweiten Boten, die auf das durch das HIP-Polypeptid vermittelte Signalisieren anspricht/ansprechen. In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt zum Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide den Nachweis, in einem zellbasierenden Assay, der (eine) Änderungen) des Expressionsspiegels eines Gens, die durch eine transkriptionale Regulationssequenz kontrolliert wird/werden, die auf das Signalisieren durch das HIP-Polypeptid anspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Schritte des Assays für eine vielfältige Bibliothek mit mindestens 100 verschiedenen Testverbindungen, bevorzugter mindestens 10³, 10⁴ oder 10⁵ verschiedenen Testverbindungen wiederholt. Die Testverbindung kann zum Beispiel ein Peptid, eine Nucleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein kleines organisches Molekül oder einen Naturproduktextrakt (oder eine Fraktion davon) darstellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter die pharmazeutische Formulierung von einem oder mehr Mittel(n), die in solchen Arzneimittel-Screening-Assays identifiziert wurden.
In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird ein Molekül, bevorzugt ein kleines organisches Molekül bereitgestellt, das an HIP bindet und entweder das Hedgehog-induzierte Signalisieren in HIP exprimierenden Zellen mimickt oder antagonisiert.
Die Anmeldung offenbart auch ein Verfahren zur Modulation von einem oder mehr von Wachstum, Differenzierung oder Überleben einer Zelle durch Modulation der HIP-Bioaktivität, zum Beispiel durch Potenzieren oder Disruptieren bestimmter Protein-Protein-Interaktionen. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren, ungeachtet, ob in vivo, in vitro oder in situ durchgeführt, die Behandlung der Zelle mit einer wirksamen Menge eines HIP-Therapeutikums, um auf diese Weise, bezogen auf die Zelle in Abwesenheit einer Behandlung, mindestens eines von Folgendem zu verändern: (i) die Wachstumsrate, (ii) die Differenzierung oder (iii) das Überleben der Zelle. Das Verfahren kann demgemäß mit HIP-Therapeutika, wie zum Beispiel Peptid- und Peptidomimetika oder anderen Molekülen durchgeführt werden, die in den vorstehend erwähnten Arzneimittel-Screens identifiziert wurden, welche die Effekte des Signalisierens von einem HIP-Protein oder der Ligandenbindung eines HIP-Proteins, zum Beispiel eines Hedgehog-Proteins, agonisieren oder antagonisieren. Andere HIP-Therapeutika schließen folgende ein: Antisense-Konstrukte zur Inhibition der Expression von HIP-Proteinen, dominant-negative Mutanten von HIP-Proteinen, die Ligandeninteraktionen stromaufwärts und die Signaltransduktion stromabwärts vom Wildtyp-HIP-Protein kompetitiv inhibieren, und Gentherapie-Konstrukte, einschließlich Genaktivierungskonstrukten.
In einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Modulieren der HIP-Bioaktivität in der Behandlung von Testiszellen angewendet werden, um auf diese Weise die Spermatogenese zu modulieren. In einer anderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Modulieren der Osteogenese angewendet, umfassend die Behandlung von osteogenen Zellen mit einem Mittel, das die HIP-Bioaktivität moduliert. Wenn es sich bei der behandelten Zelle um eine chondrogene Zelle handelt, wird das vorliegende Verfahren gleichermaßen zur Modulation der Chondrogenese angewendet. In einer noch anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Modulieren der Differenzierung einer Neuronenzelle, zur Aufrechterhaltung einer Neuronenzelle im differenzierten Zustand und/oder zur Förderung des Überlebens einer Neuronenzelle, zum Beispiel zur Verhinderung der Apoptose oder anderer Formen des Zelltods, angewendet werden. Das vorliegende Verfahren kann zum Beispiel zur Auswirkung auf die Differenzierung von Neuronenzellen, wie zum Beispiel von Motoneuronen, cholinergen Neuronen, dopaminergen Neuronen, serotonergen Neuronen und peptidergen Neuronen angewendet werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Anmeldung offenbart ein Verfahren zur Bestimmung, ob bei einem Individuum, zum Beispiel einem Tierpatienten, ein Risiko für eine Erkrankung besteht, die durch eine unerwünschte Zellproliferation oder aberrante Kontrolle der Differenzierung oder Apoptose gekennzeichnet ist. Das Verfahren schließt den Nachweis, in einem Gewebe des Individuums, auf die An- oder Abwesenheit einer genetischen Läsion ein, die durch mindestens eines von Folgendem gekennzeichnet ist: (i) eine Mutation eines ein HIP-Protein codierenden Gens; oder (ii) die Missexpression eines HIP-Gens. In bevorzugten Ausführungsformen schließt der Nachweis der genetischen Läsion die Ermittlung der Existenz von mindestens einem des Folgenden ein: eine Deletion von einem oder mehr Nucleotid(en) aus einem HIP-Gen; eine Addition von einem oder mehr Nucleotid(en) an das Gen, eine Substitution von einem oder mehr Nucleotid(en) des Gens, ein makroskopisches chromosomales Rearrangement des Gens; eine Veränderung des Spiegels eines Boten-RNA-Transkripts des Gens; die Anwesenheit eines Nichtwildtyp- Spleißungsmusters von einem Boten-RNA-Transkript des Gens; einen Nichtwildtyp-Spiegel des Proteins; und/oder einen aberranten Spiegel von löslichem HIP-Protein.
Der Nachweis der genetischen Läsion kann zum Beispiel Folgendes einschließen: (i) Bereitstellung einer Sonde/eines Primers, einschließlich eines Oligonucleotids, enthaltend eine Region mit einer Nucleotidsequenz, die an eine Sense- oder Antisense- Sequenz eines HIP-Gens oder natürlich vorkommende Mutanten davon hybridisiert, oder natürlich mit dem HIP-Gen assoziierte 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen; (ii) Exponieren der Sonde/des Primers gegenüber der Nucleinsäure des Gewebes; und (iii) Nachweis durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nucleinsäure, der An- oder Abwesenheit der genetischen Läsion; zum Beispiel worin der Nachweis der Läsion die Verwendung der Sonde/des Primers zur Bestimmung der Nucleotidsequenz des HIP-Gens und optional der flankierenden Nucleinsäuresequenzen umfasst. Die Sonde/Der Primer kann zum Beispiel in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) oder in einer Ligationskettenreaktion (LCR) eingesetzt werden. In alternativen Ausführungsformen wird der Spiegel eines HIP-Proteins in einem Immunassay unter Verwendung eines Antikörpers, der sich mit dem HIP-Protein spezifisch immunreaktiv verhält, eingesetzt.
Die erfindungsgemäße praktische Ausführung setzt, sofern nicht anderweitig angegeben wird, in der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, der transgenen Biologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie übliche Verfahren ein, die sich alle im Stand der Technik befinden. Diese Verfahren sind in der Literatur ausführlich erklärt. Siehe zum Beispiel Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Aufl., Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Vol. I und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Multis et al. US-Patent Nr.: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines & S. J. Higgins, Hrsg. 1984); Transcription And Translation (B. D. Haines & S. J. Higgins, Hrsg. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); die Abhandlung, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vol. 154 und 155 (Wu et al., Hrsg.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrsg., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Vol. I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).
Andere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen hervorgehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A stellt ein Alignment der HIP-Proteinsequenzen für Maus-, Human-, Hühner- und Zebrafisch-Homologe dar. Der Aufwärtspfeil deutet den C-terminalen hydrophoben Anker an.
1B stellt ein Alignment der Codiersequenzen für aus der Maus, dem Menschen, Huhn und Zebrafisch isolierten HIP-cDNAs dar.
2 stellt eine schematische Darstellung des HIP-Proteins dar.
3 zeigt zwei Scatchard-Plots von der Bindung eines Shh-AP-Fusionsproteins (AP = alkalische Phosphatase) mit HIP- und PTC-Proteinen.
4 stellt einen Northern-Blot auf HIP-Transkripte an multiplem humanem Gewebe dar.
5 stellt einen Northern-Blot auf HIP-Transkripte an multiplem Gewebe der Maus dar.
6 erläutert, dass trunkierte Formen des HIP-Proteins, denen in diesem Fall die C-terminalen 22 Aminosäuren mangelt, in den Zellüberstand sezerniert werden, wohingegen das HIP-Protein voller Länge in der Zellfraktion zurückgehalten wird, zum Beispiel an die Membran gebunden bleibt. In Anwesenheit von Shh, kann anti-Shh überdies einen Komplex immunpräzipitieren, der die sezernierte Form des HIP-Proteins einschließt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Von besonderer Bedeutung in der Entwicklung und Aufrechterhaltung des Gewebes in Vertebraten-Tieren ist ein Typ der extrazellulären Kommunikation, der als Induktion bezeichnet wird, die zwischen benachbarten Zellschichten und Geweben auftritt. Bei induktiven Interaktionen beeinflussen von einer Zellpopulation sezernierte chemische Signale das Entwicklungsschicksal einer zweiten Zellpopulation. Zellen, die in der Regel auf induktive Signale ansprechen, werden von einem Zellschicksal zu einem anderen umgeleitet, bei denen es sich bei keinem um das gleiche wie das Schicksal der signalisierenden Zellen handelt.
Induktive Signale stellen wichtige Regulationsproteine dar, die bei der Musterbildung in Vertebraten funktionieren und in wichtigen Signalzentren, von denen bekannt ist, dass sie embryonal funktionieren, um zum Beispiel die Organisation des Vertebratenembryos zu definieren. Diese signalisierenden Strukturen schließen zum Beispiel die Chorda cordalis, eine transiente Struktur ein, welche die Bildung des Nervensystems initiiert und hilft, die verschiedenen Neuronentypen darin zu definieren. Die Chorda cordalis reguliert auch die mesodermale Musterbildung entlang der Körperachse. Eine andere distinkte Zellgruppe mit scheinbarer Signalaktivität stellt die Bodenplatte des Neuralrohrs (des Präkursors des Rückenmarks und Gehirns) dar, die auch die Differenzierung der verschiedenen Nervenzelltypen signalisiert. Es wird allgemein auch angenommen, dass die Region des Mesoderms am Boden der Knospen, welche die Extremitäten bilden (als die Zone of Polarizing Activity oder ZPA bezeichnet), als ein Signalzentrum durch Sezernieren eines Morphogens funktioniert, wodurch letztendlich die korrekte Musterbildung der sich entwickelnden Extremitäten produziert wird.
Die Regulation des Hedgehog-Protein-Signalisierens stellt einen wichtigen Mechanismus für die Entwicklungskontrolle dar. Gegenstand der Erfindung ist die Entdeckung einer neuen Familie von Hedgehog-Bindungsproteinen, auf die hierin als auf „Hedgehog-interagierende Proteine" oder „HIPs" verwiesen wird, von denen nachgewiesen wurde, dass sie Hedgehog-Polypeptide mit hoher Affinität binden. Der HIP-Clon der Maus wurde erstmals durch Expressions-Clonierungs-Verfahren durch seine Fähigkeit, an Hedgehog-Protein zu binden, identifiziert. Anschließend wurde eine Reihe verschiedener anderer Vertebraten-Homologen unter Verwendung von Sonden und Primern, basierend auf dem Maus-Clon, wiederum mithilfe von Standardverfahren cloniert. Die Vertebraten-HIP-Proteine weisen, wie hierin beschrieben, räumlich und temporal restriktierte Expressionsdomänen auf, die für die wichtigen Rollen bei der Hedgehog-vermittelten Induktion Indikativ sind.
Die Sequenz beispielhafter HIP-Gene, die aus verschiedenen Vertebraten cloniert wurden (vgl. Tabelle 1, nachstehend), deutet darauf hin, dass sie ein sezerniertes Protein kodiert, das an der Zellmembran verankert sein kann. Der Vergleich von HIP-Sequenzen aus der Maus, dem Menschen, dem Huhn und Zebrafisch (siehe 1) weist auf eine konservierte Signalpeptidsequenz, eine konservierte Hedgehog-Bindungsdomäne und eine potenzielle Transmembrandomäne hin. Darüber hinausgehend deutet die Analyse der Proteinsequenzen auf zwei EGF-ähnliche Domänen im C-terminalen Anteil des Proteins hin (siehe 2). Mit Ausnahme dieser Domänen zeigen die HIP-Codiersequenzen keine enge Sequenzhomologie zu jedweden zuvor identifizierten Genen, was darauf hindeutet, dass diese Gene eine neue Genfamilie umfassen.
Die HIP-Proteine sind durch ihre Fähigkeit, an Hedgehog-Proteine zu binden, scheinbar zur Modulation des Hedgehog-Signalisierens in der Lage. Die HIP-Proteine können als ein Hedgehog-Receptor (oder eine Untereinheit davon) funktionieren oder können zum Sequestrieren der Hedgehog-Proteine an die Zelloberfläche wirken und folglich die wirksame Konzentration des Hedgehog-Polypeptids kontrollieren, das für andere Hedgehog-Receptoren, wie zum Beispiel Patched, zur Verfügung steht Die HIP-Proteine können die Bildung eines Hedgehog-Gradienten durch Bildung von Komplexen mit löslichen Hedgehog-Proteinen vermitteln und sich auf die Fähigkeit von diesen Proteinen auswirken, mit Zelloberflächenreceptoren zu interagieren. Folglich können sich die erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide auf eine Anzahl von Hedgehog-vermittelte biologische Aktivitäten auswirken, einschließlich: einer Fähigkeit zur Modulation der Proliferation, des Überlebens und/oder der Differenzierung von mesodermal hergeleitetem Gewebe, wie zum Beispiel Gewebe, das sich vom dorsalen Mesoderm, Knorpel und Gewebe, das an der Spermatogenese beteiligt ist, herleitet; der Fähigkeit zur Modulation der Proliferation, des Überlebens und/oder der Differenzierung von ektodermal hergeleitetem Gewebe, wie zum Beispiel sich von der Epidermis, dem Neuralrohr, der Neuralleiste oder sich vom Kopfmesenchym herleitendem Gewebe; der Fähigkeit zur Modulation der Proliferation, des Überlebens und/oder der Differenzierung von entodermal hergeleitetem Gewebe, wie zum Beispiel sich vom primitiven Darmkanal herleitendem Gewebe.
Eine HIP-cDNA von der Maus wurde in einem Screen auf potenzielle Hedgehog-Bindungsproteine unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von murinen Extremitätenknospen, cloniert in ein Plasmid, das die Expression in Zellen zuließ, identifiziert und die Menge an markiertem Shh-Protein nachgewiesen, die spezifisch an die exprimierten Proteine gebunden ist. Es wurde unter den 70 000 gescreenten ein einzelner positiver Clon identifiziert. Liganden-Receptor-Bindungsstudien deuten darauf hin, dass das HIP-Polypeptid verschiedene Mitglieder der Hedgehog-Familie mit hoher Affinität binden kann. Die Bindung des murinen HIP-Polypeptids an jeweils jedes von Shh und Dhh trat zum Beispiel mit einer Dissoziationskonstante (k_d) von ca. 1 nM auf. Siehe zum Beispiel 3. Diese Bindung ist mit der Hedgehog-Bindungsaffinität vergleichbar, die für Patched beobachtet wurde (siehe 3). Dieser Befund weißt darauf hin, dass HIP-cDNA von der Maus ein allgemeines Hedgehog-Bindungsprotein im Gegensatz zu einem Bindungsprotein, das selektiv zwischen Hedgehog-Homologen diskriminiert, codieren kann. Es wird jedoch angenommen, dass andere Homologe dieses Proteins gegebenenfalls in der Lage sein können, mittels der Bindungsaffinität zwischen Shh, Ihh und Dhh zu unterscheiden.
Außer dem murinen HIP-Clon wurden auch cDNA-Clone von anderen Vertebraten, einschließlich humaner HIP-Gene und solcher von Vögeln und Fischen unter Nutzung der Maus-cDNA als eine Sonde erhalten. Gemäß dem anhängenden Sequenzprotokoll (siehe auch Tabelle 1) wird ein murines HIP-Polypeptid durch SEQ ID NO: 1 codiert; wird ein humanes HIP-Polypeptid durch SEQ ID NO: 2 codiert; wird ein HIP-Polypeptid vom Huhn durch SEQ ID NO: 3 codiert; und wird ein HIP-Polypeptid vom Zebrafisch durch SEQ ID NO: 4 codiert.
TABELLE 1 Leitfaden zu den HIP-Sequenzen im Sequenzprotokoll
Die Gesamtsequenzhomologie zwischen den HIP-Proteinen ist in Tabelle 2 ersichtlich.
TABELLE 2 Identität der Aminosäuresequenz zwischen HIP-Proteinen von
Mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde an der chromosomalen Position 4Q31 ein humanes HIP-Gen lokalisiert. Wie in den 4 und 5 erläutert wird, weist die Northern-Blot-Analyse darauf hin, dass ein HIP-Gen in bestimmten adulten Geweben exprimiert wird, wobei höhere Spiegel im Herz, Skelettmuskel und Pankreas, zumindest in den bisher getesteten Gewebeproben angezeigt wurden.
Es wird erfindungsgemäß in Betracht gezogen, dass die im anhängenden Sequenzprotokoll aufgeführten clonierten HIP-Gene, zusätzlich zur Darstellung einer Interspeziesfamilie von verwandten Genen, auch jeweils für einen Teil einer Intraspeziesfamilie stehen. Das heißt, es wird antizipiert, dass andere Paraloge der humanen und murinen HIP-Proteine in diesen Tieren existieren und Orthologe von jedem HIP-Gen unter anderen Tieren konserviert sind. Bei geringen bis mittleren Stringenzbedingungen wurden anhand der Northhern-Analyse von Mausproben zum Beispiel Transkripte von ca. 4,4 kb und 9 kb beobachtet (siehe 5), wobei Letzteres ein mögliches Paralog und/oder eine Spleißvariante der in SEQ ID NO: 1 dargelegten HIP-cDNA darstellt.
Außer der Sequenzvariation zwischen den verschiedenen HIP-Homologen, kommen die Vertebraten-HIP-Proteine in einer Anzahl von verschiedenen Formen, einschließlich einer Proform, scheinbar natürlich vor. Die Proform schließt ein N-terminales Signalpeptid (ca. 1–15 N-terminale Reste) zur gerichteten Sekretion von mindestens der N-terminalen Domäne des Proteins ein, während der maturen Form voller Länge diese Signalsequenz mangelt. Weiteres Processing der maturem Form kann in einigen Fällen auch auftreten, um biologisch aktive Fragmente des Proteins zu ergeben.
Das HIP-Protein voller Länge schließt, wie in 6 erläutert, gleichermaßen auch eine Membran-Anker-Domäne, wie zum Beispiel eine Transmembrandomäne ein, die aus den ca. C-terminalen 22 Aminosäuren des Proteins besteht. Es wird gezeigt, dass HIP-Polypeptide, denen diese Sequenz mangelt, vollständig sezerniert werden, anstelle membrangebunden zu sein. Kurz gesagt wurde ein myc-tagged Fusionsprotein mit der HIP-Sequenz voller Länge, myc-HIP-1, und einer trunkierten Form von HIP, der die C-terminalen 22 Aminosäuren fehlen, myc-HIP-1 (Δ22), gebildet. Es wurde gezeigt, dass das myc-HIP-1-Fusionsprotein eben gerade etwas langsamer läuft (hohes MG) als das HIP-Protein voller Länge, wenn jedes anhand von anti-myc- bzw. anti-HIP-Antikörpern nachgewiesen wurde. Der anti-myc-Antikörper wurde zum Immunblotting von Proben von Zellpellets und vom Zellüberstand verwendet, die von Zellen hergestellt wurden, die entweder das myc-HIP-1-Fusionsprotein oder das myc-HIP-1-(Δ22)-Fusionsprotein exprimieren. Für die Zellen, die myc-HIP-1 exprimieren, zum Beispiel die die putative Membran-Anker-Domäne beibehalten, wurde das Protein im Wesentlichen ausschließlich im Zellpellet nachgewiesen. Das myc-HIP-1-(Δ22)-Protein konnte andererseits sowohl im Überstand als auch im Zellpellet nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte das myc-HIP-1-(Δ22)-Protein durch anti-Shh-Antikörper immunpräzipitiert werden, wenn das HIP-Protein mit Shh-Protein inkubiert wurde.
Obwohl derzeit kein Hinweis besteht, der darauf hindeutet, dass das Wildtyp-Protein glycosyliert wird, ist es formell möglich, dass die HIP-Proteine unter bestimmten Umständen auch posttranslational, wie zum Beispiel durch O-, S- und/oder N-verknüpfte Glycosylierung, modifiziert werden können. Zu potenziellen Asn-Glycosylierungsstellen in Bezug auf die HIP-Proteinsequenz der Maus gehören Asn99, Asn416, Asn447 und Asn459. Potenzielle Anheftungsstellen für Proteoglykan-ähnliche GAG-Ketten (zum Beispiel Heparansulfat, Chondroitinsulfat und dergleichen) schließen Ser235 ein.
Zur Bestimmung des Expressionsmusters der verschiedenen HIP-Clone über die Spezies hinweg wurden In-situ-Hybridisierungsstudien zur Entwicklung von Maus-, Hühner- und Fisch-Embyos durchgeführt. Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, ist die Verteilung von HIP-RNA und seine temporale Expression mit einer Rolle von HIP-Polypeptiden als unterstromige Targets des Hedgehog-Signalisierens konsistent. Die In-situ-Hybridisierung von Maus-Embryos deutet darauf hin, dass HIP-RNA an Stellen, an denen das Hedgehog-Signalisieren minimal ist, das heißt die Expression von Shh, Ihh oder Dhh minimal ist und eine dramatische Upregulation der HIP-Expression als Antwort auf die Hedgehog-Upregulation auftritt, in geringen Spiegeln exprimiert wird. Die Upregulation von HIP-Polypeptiden fällt erstens temporär mit der hh-Upregulation zusammen, und seine Expression tritt an der gegenüberliegenden Stelle zur hh-Genexpression auf. Die ektope Expression von HIP (RNA) tritt zweitens als Antwort auf die ektope Expression von Shh im ZNS auf. Die HIP-Expression wird überdies als Antwort auf die Expression einer dominanten negativen Form der cAmp-abhängigen Proteinkinase A (PKA) aktiviert, die auch andere hh-Targetgene, wie zum Beispiel Patched aktiviert Eine Analyse von null Dhh-defizienten mutanten Mäusen gibt überdies den Verlust der HIP-Expression in den Testes zu erkennen, bei denen es sich um die Targetstelle für das Dhh-Signalisieren handelt.
Bestimmte erfindungsgemäße Aspekte betreffen demgemäß Nucleinsäuren, codierend HIP-Polypeptide, die HIP-Polypeptide selbst (einschließlich verschiedener Fragmente), mit HIP-Proteinen immunreaktive Antikörper und Präparationen von diesen Zusammensetzungen. Gegenstand der Erfindung ist überdies die Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Assays und Reagenzien zum Nachweis und zur Behandlung von Erkrankungen, die zum Beispiel die abberante Expression (oder den Verlust davon) von HIP, HIP-Liganden (insbesondere Hedgehog-Proteinen) oder Signaltransducer davon beinhalten.
Außerdem werden Arzneimittelentdeckungsassays zur Identifikation von Mitteln bereitgestellt, welche die biologische Funktion von HIP-Proteinen, wie zum Beispiel durch Änderung der Bindung von HIP-Molekülen an Hedgehog-Proteine oder andere extrazelluläre Faktoren/Matrixfaktoren oder die Fähigkeit des gebundenen HIP-Proteins zur Transduktion von Hedgehog-Signalen modulieren können. Solche Mittel können zur Veränderung des Wachstums, der Aufrechterhaltung und/oder Differenzierung eines Gewebes, insbesondere eines sich von Mesoderm herleitenden Gewebes wie Knorpel, eines an der Spermatogenese beteiligten Gewebes und eines sich vom dorsalen Mesoderm herleitenden Gewebes; eines sich vom Ektoderm herleitenden Gewebes, wie zum Beispiel sich von der Epidermis herleitendem Gewebe, des Neuralrohrs, der Neuralleiste oder dem Kopfmesenchym; sich von Entoderm herleitendem Gewebe, wie zum Beispiel sich vom primitiven Darmkanal herleitendem Gewebe, therapeutisch nützlich sein. Andere erfindungsgemäße Aspekte werden nachstehend beschrieben oder werden dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden bestimmte in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen eingesetzte Begriffe hier zusammengetragen.
Unter dem Begriff „Hedgehog-Bindungsprotein" oder „HIP"-Polypeptid" versteht man eine Familie von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens teilweise identisch sind oder sich einen Grad der Sequenzhomologie mit allen oder einem Anteil des einen HIP-Polypeptids teilen, das in jedweder von SEQ ID NO: 5–8 dargestellt ist. Die HIP-Polypeptide können cloniert oder aus jedwedem von einer Anzahl eukaryotischer Organismen, besonders Vertebraten und insbesondere Säugern gereinigt werden. Überdies können andere HIP-Polypeptide erfindungsgemäß generiert werden, welche Polypeptide gewöhnlich nicht in der Natur vorkommen, sondern vielmehr durch nicht natürliche mutagene Verfahren generiert werden.
Bei einer Inspektion wurden eine Anzahl von Merkmalen des HIP-Proteins beobachtet. Es wurde insbesondere bemerkt, dass die HIP-Sequenz für ein sezerniertes Protein mit einer sekretorischen Signalsequenz (zum Beispiel einem Peptidylanteil, der die extrazelluläre Sekretion von mindestens einem Anteil des Proteins veranlasst) codiert, die den Resten 1–15 von SEQ ID NO: 5 entspricht. Eine Membran-Anker-Domäne, zum Beispiel in der Form einer Transmembrandomäne, kann durch Reste bereitgestellt werden, die entweder 357–377 oder 680–700 von SEQ ID NO: 5 entsprechen.
Unter einer „Membran-verankernden" Region versteht man eine Sequenz von Aminosäuren, die dazu fähig ist, das HIP-Polypeptid an der Zelloberfläche zurückzuhalten.
Ein „glycosyliertes" HIP-Polypeptid stellt ein HIP-Polypeptid mit einer kovalenten Verknüpfung mit einer Glycosylgruppe (zum Beispiel eine mit einem Kohlenhydrat derivatisierte) dar. Das HIP-Protein kann zum Beispiel an einen existierenden Rest glycosyliert werden oder kann zum Ausschluss der Kohlenhydrat-Anheftung mutiert werden oder kann zur Bereitstellung neuer Glycosylierungsstellen, wie zum Beispiel für N-verknüpfte oder O-verknüpfte Glycosylierung, mutiert werden.
Wie hierin verwendet, versteht man unter dem Begriff „Vertebraten-Hedgehog-Protein" mit dem Drosophila-Hedgehog-Protein verwandte interzelluläre signalisierende Moleküle. Drei der Vertebraten-Hedgehog-Proteine, Desert-Hedgehog (Dhh), Sonic-Hedgehog (Shh) und Indian-Hedgehog (Ihh) kommen scheinbar in allen Vertebraten, einschließlich Amphibien, Fischen, Vögeln und Säugern vor. Andere Mitglieder dieser Familie, wie zum Beispiel Banded-Hedgehog, Cephalic-Hedgehog, Tiggy-Winkle Hedgehog und Echidna-Hedgehog wurden bisher in Fischen und/oder Amphibien identifiziert. Beispielhafte Hedgehog-Polypeptide werden in den PCT-Anmeldungen WO96/17924, WO96/16668, WO95/18856 beschrieben.
Unter dem Begriff „Nucleinsäure", wie hierin verwendet, versteht man Polynucleotide, wie zum Beispiel Desoxyribonucleinsäure (DNA) und gegebenenfalls Ribonucleinsäure (RNA). Der Begriff sollte auch so ausgelegt werden, dass er – als Äquivalente – Analoge von entweder RNA oder DNA, die aus Nucleotidanalogen hergestellt sind und je nachdem wie auf die beschriebene Ausführungsform zutreffend, ein- (Sense- oder Antisense-) und doppelsträngige Polynucleotide einschließt.
Unter dem Begriff „Gen" oder „rekombinantes Gen", wie hierin verwendet, versteht man eine Nucleinsäure, die einen offenen Leserahmen, codierend ein HIP-Polypeptid, einschließlich sowohl Exon- als auch (optional) Intronsequenzen umfasst. Unter einem „rekombinanten Gen" versteht man eine Nucleinsäure, codierend ein HIP-Polypeptid und umfassend HIP-codierende Exonsequenzen, obwohl es optional Intronsequenzen einschließen kann, die sich von zum Beispiel einem chromosomalen HIP-Gen oder von einem nicht verwandten chromosomalen Gen herleiten können. Beispielhafte rekombinante Gene, codierend das erfindungsgemäße HIP-Polypeptid sind im anhängenden Sequenzprotokoll dargestellt. Unter dem Begriff „Intron" versteht man eine DNA-Sequenz, die in einem gegebenen HIP-Gen anwesend ist, das nicht in das Protein translatiert ist und im Allgemeinen zwischen Exonen gefunden wird.
Unter dem Begriff „Transfektion", wie hierin verwendet, versteht man die Einführung einer Nucleinsäure, zum Beispiel eines Expressionsvektors, in eine Empfängerzelle anhand des Nucleinsäurevermittelten Gentransfers. Unter „Transformation", wie hierin verwendet, versteht man ein Verfahren, worin der Genotyp einer Zelle aufgrund der zellulären Aufnahme von exogener DNA oder RNA verändert ist und die transformierte Zelle zum Beispiel eine rekombinante Form eines HIP-Polypeptids exprimiert oder, wenn eine Antisense-Expression aus dem transferierten Gen auftritt, die Expression einer natürlich vorkommenden Form des HIP-Proteins disruptiert ist.
Unter dem Begriff „spezifisch hybridisieren", wie hierin verwendet, versteht man die Fähigkeit einer/eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuresonde/-primers an mindestens 15 konsekutive Nucleotide eines HIP-Gens, wie zum Beispiel eine HIP-Sequenz, die in jedweder einen oder mehr von SEQ ID NO: 1–4 und 9–14 bezeichnet ist, oder eine dazu komplementäre Sequenz, oder natürlich vorkommende Mutanten davon dergestalt zu hybridisieren, dass sie/er weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 % und bevorzugter weniger als 5 % Hintergrundhybridisierung an eine zelluläre Nucleinsäure (zum Beispiel mRNA oder genomische DNA), codierend ein Protein mit Ausnahme eines HIP-Proteins, wie hierin definiert ist, aufweist.
Unter einer „wirksamen Menge" eines Hedgehog-Polypeptids oder eines bioaktiven Fragments davon, versteht man unter Bezug auf das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren eine Menge eines Agonisten oder Antagonisten in einer Präparation, die – wenn sie als ein Teil eines gewünschten Dosierungsregimes angewendet wird – eine Modulation des Wachstums, der Differenzierung oder des Überlebens von Zellen, wie zum Beispiel eine Modulation der Spermatogenese, der neuronalen Differenzierung oder Skeletogenese, zum Beispiel Osteogenese, Chondrogenese oder Extremitäten-Musterbildung bereitstellt.
Unter „Phänotyp", wie hierin verwendet, versteht man den gesamten physikalischen, biochemischen und physiologischen Aufbau einer Zelle, die zum Beispiel jedwede eine Eigenschaft oder jedwede Gruppe von Eigenschaften aufweist.
Unter den Begriffen „Induktion" oder „induzieren", wie sie sich auf die biologische Aktivität eines Hedgehog-Proteins beziehen, versteht man im Allgemeinen das Verfahren oder den Vorgang zur Veranlassung, dass eine spezifische Wirkung auf den Phänotyp der Zelle auftritt. Ein solcher Effekt kann in der Form der Veranlassung einer Änderung im Phänotyp, zum Beispiel einer Differenzierung in einen anderen Phänotyp der Zelle vorliegen, oder kann in der Form der Aufrechterhaltung der Zelle in einer speziellen Zelle vorliegen, wobei zum Beispiel die Dedifferenzierung oder Promotion des Überlebens einer Zelle verhindert wird.
Unter einem zu behandelnden „Patienten" oder „Individuum" kann man entweder ein humanes oder ein nicht humanes Tier verstehen.
Unter dem Begriff „Vektor", wie hierin verwendet, versteht man ein Nucleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer anderen Nucleinsäure, mit der es verknüpft wurde, in der Lage ist. Ein Typ eines bevorzugten Vektors stellt ein Episom, das heißt eine Nucleinsäure dar, die zur extrachromosomalen Replikation fähig ist. Bevorzugte Vektoren stellen die dar, die zur autonomen Replikation und/oder Expression von Nucleinsäuren, mit denen sie verknüpft sind, fähig sind. Unter Vektoren, die zum Richten der Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, fähig sind, versteht man hierin „Expressionsvektoren". Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren von Nutzen in rekombinanten DNA-Verfahren in der Form von „Plasmiden" vor, unter denen man im Allgemeinen kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleifen versteht, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" gegenseitig austauschbar verwendet, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Vektorform handelt. Es ist jedoch erfindungsgemäß beabsichtigt, dass solche anderen Formen von Expressionsvektoren eingeschlossen werden, die entsprechenden Funktionen dienen und die im Stand der Technik anschließend hierzu bekannt werden.
„Transkriptionale Regulationssequenz" stellt einen generischen Begriff dar, der in der Beschreibung durchweg verwendet wird, um auf DNA-Squenzen, wie zum Beispiel Initiationssignale, Enhancer und Promotoren, zu verweisen, die die Transkription von Protein-Codiersequenzen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, induzieren oder kontrollieren. In bevorzugten Ausführungsformen befindet sich die Transkription eines rekombinanten HIP-Gens unter der Kontrolle einer Promotor-Sequenz (oder einer anderen transkriptionalen Regulationssequenz), welche die Expression des rekombinanten Gens in einem Zelltyp, in dem eine Expression beabsichtigt ist, kontrolliert. Man sollte auch zur Kenntnis nehmen, dass sich das rekombinante Gen unter der Kontrolle von transkriptionalen Regulationssequenzen befinden kann, die gleich sind oder die sich von den Sequenzen unterscheiden, die die Transkription der natürlich vorkommenden Formen der HIP-Gene kontrollieren.
Unter dem Begriff „Gewebe-spezifischer Promotor", wie hierin verwendet, versteht man eine DNA-Sequenz, die als ein Promotor dient, das heißt der die Expression einer ausgewählten DNA-Sequenz reguliert, die funktionsfähig mit dem Promotor verknüpft ist und der die Expression der ausgewählten DNA-Sequenz in spezifischen Zellen eines Gewebes, wie zum Beispiel Zellen von neuronaler oder hämatopoetischer Herkunft einwirkt. Der Begriff deckt auch die sogenannten „leaky" Promotoren ab, die die Expression einer ausgewählten DNA, primär in einem Gewebe regulieren, aber zumindest auch in anderen Geweben eine geringgradige Expression veranlassen können.
Unter dem Begriff „Targetgewebe", wie hierin verwendet, versteht man Bindegewebe, Knorpel, Knochengewebe oder Extremitätengewebe, das entweder in einem Tier, zum Beispiel einem Säuger, zum Beispiel einem Menschen anwesend ist oder in einer In-vitro-Kultur, zum Beispiel einer Zellkultur, anwesend ist.
Ein „transgenes Tier", wie hierin verwendet, stellt jedwedes Tier dar, bevorzugt einen nicht humanen Säuger, einen Vogel oder eine Amphibie, worin eine oder mehr der Zellen des Tieres heterologe Nucleinsäure enthalten, die durch menschliche Intervention, wie zum Beispiel durch im Stand der Technik überall bekannte transgene Verfahren eingeführt wird. Die Nucleinsäure wird, direkt oder indirekt, durch Einführung in einen Präkursor der Zelle, über die bewusste genetische Manipulation, wie zum Beispiel durch Mikroinjektion oder durch Infektion mit einem rekombinanten Virus in die Zelle eingeführt. Der Begriff genetische Manipulation schließt nicht die klassische Kreuzzüchtung oder In-vitro-Fertilisation ein, sondern richtet sich vielmehr an die Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls. Dieses Molekül kann in ein Chromosom integriert werden, oder es kann die DNA extrachromosomal replizieren. In einem beispielhaften transgenen Tier veranlasst das Transgen Zellen zur Expression einer rekombinanten Form eines HIP-Proteins, zum Beispiel entweder agonistischer oder antagonistischer Formen. Transgene Tiere, in denen das rekombinante HIP-Gen jedoch still ist, werden auch in Betracht gezogen, wie zum Beispiel die nachstehend beschriebenen FLP- oder CRE-Rekombinase-abhängigen Konstrukte. Überdies schließt „transgenes Tier" auch die rekombinanten Tiere ein, worin die Gendisruption von einem oder mehr HIP-Gen(en) durch menschliche Intervention, einschließlich sowohl Rekombination als auch Antisense-Verfahren herbeigeführt wird.
Die erfindungsgemäßen „nicht humanen Tiere" schließen Vertebraten, wie zum Beispiel Nagetiere, nicht humane Primaten, Vieh, Vogelspezies, Amphibien, Reptilien usw. ein. Der Begriff „chimäres Tier" wird hierin verwendet, um auf Tiere zu verweisen, in denen das rekombinante Gen gefunden wird oder in denen das rekombinante Gen in einigen, aber nicht allen Zellen des Tieres exprimiert wird. Der Begriff „Gewebe-spezifisches chimäres Tier" deutet darauf hin, dass ein rekombinantes HIP-Gen anwesend ist und/oder in einigen Geweben, aber nicht in anderen exprimiert oder disruptiert wird.
Unter dem Begriff „Transgen", wie hierin verwendet, versteht man eine Nucleinsäuresequenz (die zum Beispiel für ein HIP-Polypeptid codiert, oder ein Antisense-Transkript daran anhängt), die teilweise oder vollkommen heterolog, das heißt für das transgene Tier oder die Zelle, in die es eingeführt wird, fremd ist oder für ein endogenes Gen des transgenen Tiers oder der Zelle, in die es eingeführt wird, homolog ist, die aber zur Einführung bestimmt ist oder in das Genom des Tieres auf solche Weise eingeführt wird, dass sie das Genom der Zelle, in die sie insertiert wird, verändert (sie wird zum Beispiel an einer Stelle insertiert, die sich von der des natürlichen Gens unterscheidet, oder ihre Insertion führt zu einem Knockout). Ein Transgen kann eine oder mehr transkriptionale Regulationssequenz(en) und jedwede andere Nucleinsäure, wie zum Beispiel Introne einschließen, die zur optionalen Expression einer ausgewählten Nucleinsäure gegebenenfalls notwendig sein können.
Wie überall bekannt ist, können Gene für ein bestimmtes Polypeptid in einzelnen oder mehrfachen Kopien im Genom eines Individuums existieren. Solche duplizierten Gene können identisch sein oder sie können bestimmte Modifikationen, einschließlich Nucleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen aufweisen, die alle noch für Polypeptide mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität codieren. Unter dem Begriff „DNA-Sequenz, codierend ein HIP-Polypeptid" kann man deshalb ein oder mehrere Gene) in einem bestimmten Individuum verstehen. Bestimmte Unterschiede können überdies in Nucleotidsequenzen zwischen Individuen der gleichen Spezies bestehen, die als Allele bezeichnet werden. Solche Allelenunterschiede können gegebenenfalls zu Unterschieden in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids führen, jedoch immer noch für ein Protein mit der gleichen biologischen Aktivität codieren.
Unter „Homologie" und „Identität" versteht man jede Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen, wobei die Identität einen strikteren Vergleich darstellt. Homologie und Identität können jeweils durch Vergleich einer Position in jeder Sequenz, die zum Zweck des Vergleichs alignt werden kann, bestimmt werden. Wenn eine Position in der verglichenen Sequenz vom gleichen Aminosäurerest eingenommen wird, dann kann auf die Polypeptide als an dieser Position identisch verwiesen werden: wenn die entsprechende Stelle von der gleichen Aminosäure (zum Beispiel identisch) oder von einer ähnlichen Aminosäure (zum Beispiel ähnlich in sterischer und/oder elektronischer Hinsicht) eingenommen wird, dann kann auf die Moleküle als auf an dieser Position homolog verwiesen werden. Ein Prozentsatz von Homologie oder Identität zwischen Sequenzen stellt eine Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder homologen Positionen dar, die von den Sequenzen geteilt werden. Eine „nicht verwandte" oder „nicht homologe" Sequenz teilt sich weniger als 40 Prozent Identität, obwohl weniger als 25 Prozent Identität mit einer erfindungsgemäßen HIP-Sequenz bevorzugt sind.
Unter dem Begriff „Ortholog" versteht man Gene oder Proteine, die über die Speziation Homologe, wie zum Beispiel eng verwandte, darstellen und von denen angenommen wird, dass sie basierend auf strukturellen und funktionellen Erwägungen eine gemeinsame Abstammung aufweisen. Orthologe Proteine funktionieren mit erkennbar der gleichen Aktivität in verschiedenen Spezies. Unter dem Begriff „Paralog" versteht man Gene oder Proteine, die über die Genduplikation, zum Beispiel duplizierte Varianten eines Gens in einem Genom, Homologe darstellen. Siehe auch Fritch, WM (1970) Syst Zool 19: 99–113.
„Zellen", „Wirtszellen" oder „rekombinante Wirtszellen" stellen Begriffe dar, die hierin gegeneinander ausgetauscht werden können. Es ist zur Kenntnis zu nehmen, dass solche Begriffe nicht nur auf die entsprechende erfindungsgemäße Zelle, sondern auch auf die Abkömmlinge oder potenziellen Abkömmlinge einer solchen Zelle verweisen. Da in nachfolgenden Generationen aufgrund von entweder Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, können Abkömmlinge faktisch nicht mit der Elternzelle identisch, aber noch im Rahmen des wie hierin verwendeten Begriffs eingeschlossen sein.
Ein „chimäres Protein" oder „Fusionsprotein" stellt eine Fusion einer ersten Aminosäuresequenz dar, codierend ein HIP-Polypeptid mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die eine Domäne (zum Beispiel einen Polypeptidanteil) definiert, die fremd für und im Wesentlichen nicht homolog mit jedweder Domäne eines HIP-Proteins ist. Ein chimäres Protein kann eine Fremddomäne präsentieren, die (wenngleich auch in einem unterschiedlichen Protein) in einem Organismus gefunden wird, der auch das erste Protein exprimiert, oder es kann eine „Interspezies-", „intergene" usw. Fusion von Proteinstrukturen darstellen, die von unterschiedlichen Organismusarten exprimiert werden. Ein Fusionsprotein kann im Allgemeinen durch die allgemeine Formel X-HIP-Y dargestellt werden, worin HIP einen Anteil des Fusionsproteins darstellt, der sich von einem HIP-Protein herleitet, und X und Y unabhängig abwesend sind oder Aminosäuresequenzen darstellen, die nicht mit HIP-Sequenzen in einem Organismus verwandt sind.
Ein „Reportergenkonstrukt", wie hierin verwendet, stellt eine Nucleinsäure dar, die ein „Reportergen" einschließt, das funktionsfähig mit transkriptionalen Regulationssequenzen verknüpft ist. Die Transkription des Reportergens wird von diesen Sequenzen kontrolliert. Die Aktivität von mindestens einer oder mehr dieser Kontrollsequenzen wird direkt oder indirekt durch einen Signaltransduktionspfad reguliert, der eine Phospholipase beinhaltet, zum Beispiel direkt oder indirekt von einem zweiten Boten kontrolliert wird, der durch die Phospholipase-Aktivität gebildet wird. Die transkriptionalen Regulationssequenzen können einen Promotor und andere Regulationsregionen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, einschließen, die die Aktivität des Promotors modulieren, oder Regulationssequenzen, die die Aktivität oder Effizienz der RNA-Polymerase, die den Promotor erkennt, oder Regulationssequenzen, die von Effektormolekülen erkannt werden, einschließlich denen, die nach Aktivierung einer Phospholipase spezifisch induziert werden, modulieren. Die Modulation der Aktivität des Promotors kann zum Beispiel durch Veränderung der RNA-Polymerasebindung an die Promotorregion, oder als Alternative durch Eingreifen in die Initiierung der Transkription oder Elongation der mRNA bewirkt werden. Auf solche Sequenzen wird hierin kollektiv als auf transkriptionale Regulationselemente oder -sequenzen verwiesen. Das Konstrukt kann außerdem Sequenzen von Nucleotiden einschließen, die die Stabilität oder Translationsrate der sich ergebenden mRNA als Antwort auf zweite Botschaften verändern, wobei die Menge des Reportergenprodukts verändert wird.
Die Begriffe „transformierender Wachstumsfaktor-β" und „TGF-β", wie hierin verwendet, bezeichnen eine Familie von strukturell verwandten parakrinen Polypeptiden, die ubiquitär in Vertebraten zu finden sind, und prototypisch für eine große Familie des Metazoonwachstums, Differenzierung und Morphogenesefaktoren sind (für eine Übersicht siehe Massaque et al. (1990) Ann Rev Cell Biol 6: 597–641; und Sporn et al. (1992) J Cell Biol 119: 1017–1021). Eingeschlossen in diese Familie sind die „Bone Morphogenetic Proteins" oder „BMPs", die auf Proteine verweisen, die aus dem Knochen isoliert werden und Fragmente davon und synthetische Peptide, die zur Induktion der Knochenablagerung allein oder wenn sie mit geeigneten Cofaktoren kombiniert werden, fähig sind. Die Präparation von BMPs, wie zum Beispiel BMP-1, -2, -3 und -4, wird zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung WO 88/00205 beschrieben. Wozney, (1989) Growth Fact Res 1: 267–280, beschreibt zusätzliche BMP-Proteine, die mit BMP-2 eng verwandt sind und die als BMP-5, -6 und -7 bezeichnet wurden. Die PCT-Veröffentlichungen WO89/09787 und WO89/09788 beschreiben ein als „OP-1" bezeichnetes Protein, von dem nun bekannt ist, dass es sich um BMP-7 handelt. Andere BMPs sind im Stand der Technik bekannt.
Der Begriff „isoliert", wie hierin in Bezug auf Nucleinsäuren, wie zum Beispiel DNA und RNA, verwendet, verweist auf Moleküle, die von anderen DNAs bzw. RNAs, getrennt sind, die in der natürlichen Quelle des Makromoleküls anwesend sind. So schließt zum Beispiel eine isolierte Nucleinsäure, codierend ein HIP-Polypeptid, bevorzugt nicht mehr als 10 Kilobasen (kb) der Nucleinsäuresequenz, die das HIP-Gen in der genomischen DNA unmittelbar natürlich flankiert, bevorzugter nicht mehr als 5 kb von diesen natürlich vorkommenden flankierenden Sequenzen und am bevorzugtesten weniger als 1,5 kb von dieser natürlich vorkommenden flankierenden Sequenz, ein. Unter dem Begriff „isoliert", wie hierin verwendet, versteht man auch eine Nucleinsäure oder ein Peptid, die/das im Wesentlichen frei von Zellmaterial oder Kulturmedium ist, wenn es durch rekombinante DNA-Verfahren oder chemische Präkursoren oder – wenn es chemisch synthetisiert wird – andere Chemikalien, hergestellt wird. Überdies versteht man unter einer „isolierten Nucleinsäure", dass sie Nucleinsäurefragmente einschließt, die als Fragmente nicht natürlich vorkommen und nicht im natürlichen Zustand gefunden würden.
Wie nachstehend beschrieben wird, betrifft ein erfindungsgemäßer Aspekt isolierte Nucleinsäuren, die Nucleotidsequenzen umfassen, codierend HIP-Polypeptide und/oder Äquivalente von solchen Nucleinsäuren. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „Nucleinsäure", wie hierin verwendet, zum Einschluss von Fragmenten als Äquivalente beabsichtigt ist. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass der Begriff äquivalent Nucleotidsequenzen einschließt, codierend funktionell äquivalente HIP-Polypeptide oder funktionell äquivalente Peptide mit einer Aktivität eines HIP-Proteins, wie es zum Beispiel hierin beschrieben ist. Äquivalente Nucleotidsequenzen schließen Sequenzen ein, die sich durch eine oder mehr Nucleotidsubstitution(en), Addition(en) oder Deletion(en), wie zum Beispiel Allelen-Varianten, unterscheiden; und schließen deshalb Sequenzen ein, die sich von der Nucleotidsequenz der HIP-Codiersequenzen unterschieden, die in jedweder einen oder mehr von SEQ ID NO: 1–4 und 9–14 aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes gezeigt sind. Äquivalente schließen auch Nucleotidsequenzen ein, die unter stringenten Bedingungen (das heißt äquivalent bis ca. 20–27 °C unter der Schmelztemperatur (T_m) des in ca. 1 M Salz gebildeten DNA-Duplexes) an die in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 dargestellten Nucleotidsequenzen hybridisieren. In einer Ausführungsform schließen Äquivalente weiter Nucleinsäuresequenzen ein, die sich von in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 gezeigten Nucleotidsequenzen herleiten und evolutionär verwandt mit ihnen sind.
Darüber hinausgehend wird im Allgemeinen erkannt werden, dass unter gewissen Umständen die Bereitstellung von Homologen eines HIP-Polypeptids, die in einer limitierten Kapazität als eines von entweder einem Agonisten (der zum Beispiel eine Bioaktivität des Wildtyp-HIP-Proteins mimickt oder potenziert) oder einem Antagonisten (der zum Beispiel die Bioaktivität des Wildtyp-HIP-Proteins inhibiert) funktionieren, um nur ein Subset der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins zu fördern oder zu inhibieren, vorteilhaft sein kann. Folglich können durch Behandlung mit einem Homolog von limitierter Funktion spezifische biologische Wirkungen ausgelöst werden. So können zum Beispiel trunkierte Formen des Hedgehog-interagierenden Proteins, zum Beispiel lösliche Fragmente der extrazellulären Domäne, zur kompetitiven Inhibition der Ligandenbindung (Hedgehog-Bindung) an das Wildtyp-HIP-Protein bereitgestellt werden.
Homologe des erfindungsgemäßen HIP-Proteins können durch Mutagenese, wie zum Beispiel durch diskrete Punktmutation(en) oder durch Trunkation generiert werden. Die Mutation kann zum Beispiel veranlassen, dass Homologe, die im Wesentlichen die gleiche, oder lediglich ein Subset der biologischen Aktivität des HIP-Polypeptids beibehalten, aus dem es sich herleitete. Als Alternative können antagonistische Formen des Proteins generiert werden, die zur Inhibition der Funktion der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie zum Beispiel durch kompetitive Bindung an Hedgehog-Proteine und Konkurrieren mit dem Wildtyp-HIP, oder Bindung an andere Hedgehog-interagierende Proteine (wie zum Beispiel Subeinheiten eines Hedgehog-Receptors) zur Bildung nicht ansprechender Hedgehog-Receptor-Komplexe fähig sind. Folglich können das erfindungsgemäß bereitgestellte HIP-Protein und Homologe davon entweder positive oder negative Regulatoren des Zellwachstums, Tods und/oder der Differenzierung darstellen.
Im Allgemeinen wird hierin auf Polypeptide mit einer Aktivität eines HIP-Proteins (sie sind zum Beispiel „bioaktiv") als auf Polypeptide verwiesen, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die allen oder einem Anteil der Aminosäuresequenzen des in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 gezeigten HIP-Proteins entsprechen (zum Beispiel identisch oder homolog), und die alle oder einen Anteil der biologischen/biochemischen Aktivitäten eines natürlich vorkommenden HIP-Proteins agonisieren oder antagonisieren. Beispiele einer solchen biologischen Aktivität schließen die Fähigkeit zur Bindung mit hoher Affinität von Hedgehog-Proteinen ein. Die Bioaktivität von bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide kann hinsichtlich der Fähigkeit zur Förderung der Differenzierung und/oder der Aufrechterhaltung von Zellen und Gewebe von mesodermal hergeleitetem Gewebe, wie zum Beispiel sich von dorsalem Mesoderm herleitendem Gewebe; ektodermaler Herkunft, wie zum Beispiel sich aus dem Neuralrohr, der Neuralleiste oder dem Kopfmesenchym herleitendem Gewebe; oder sich entodermal herleitendem Gewebe, wie zum Beispiel sich aus dem primitiven Darmkanal herleitendem Gewebe, gekennzeichnet sein.
Andere biologische Aktivitäten der erfindungsgemäßen HIP-Proteine werden hierin beschrieben oder werden dem Fachmann ziemlich offensichtlich sein. Erfindungsgemäß weist ein Polypeptid biologische Aktivität auf, wenn es einen spezifischen Agonisten oder Antagonisten einer natürlich vorkommenden Form eines HIP-Proteins aufweist.
Bevorzugte Nucleinsäuren codieren ein HIP-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60 %, 70 % oder 80 % homolog, bevorzugter mindestens 85 % homolog und am bevorzugtesten mindestens 95 % homolog mit einer Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden HIP-Proteins ist, wie es zum Beispiel in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 dargestellt ist. Nucleinsäuren, die Polypeptide codieren, die mindestens ca. 98–99 % homolog mit einer in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz sind, befinden sich selbstverständlich auch im erfindungsgemäßen Rahmen, ebenso wie Nucleinsäuren, die hinsichtlich der Sequenz mit der aufgezählten HIP-Sequenz im Sequenzprotokoll identisch sind. In einer Ausführungsform stellt die Nucleinsäure eine cDNA, codierend ein Polypeptid, mit mindestens einer Aktivität des erfindungsgemäßen HIP-Polypeptids dar.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird erfindungsgemäß ein gereinigtes oder rekombinantes HIP-Polypeptid mit einer Peptidkette mit einem Molekulargewicht im Bereich von 68 kD bis 88 kD, noch bevorzugter im Bereich von 76 kD bis 80 kD (für ein HIP-Protein voller Länge) zur Geltung gebracht. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen, zum Beispiel Glycosylierung, Phosphorylierung und dergleichen, das scheinbare Molekulargewicht des HIP-Proteins im Vergleich zu der nicht modifizierten Polypeptidkette steigern können, und die Spaltung bestimmter Sequenzen, wie zum Beispiel Prosequenzen, können das scheinbare Molekulargewicht auf gleiche Weise vermindern. Andere bevorzugte HIP-Polypeptide schließen folgende ein: ein matures HIP-Polypeptid, dem das Signalsequenzpeptid, zum Beispiel entsprechend den Resten 16–700 von SEQ ID NO: 5, zum Beispiel mit einem Molekulargewicht von 76,8 kD; ein matures, extrazelluläres Fragment (löslich) des Receptors, zum Beispiel entsprechend den Resten 16–356 von SEQ ID NO: 5, zum Beispiel mit einem Molekulargewicht von ca. 74,4 kD; oder zum Beispiel entsprechend den Resten 16–679 von SEQ ID NO: 5, zum Beispiel mit einem Molekulargewicht von ca. 38,6 kD mangelt. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Nucleinsäure für ein HIP-Polypeptid, das die Hedgehog-Bindungsdomäne einschließt. Unter einem „Molekulargewicht von ca." versteht man innerhalb von ca. ± 5 kD.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt eine Nucleinsäure bereit, die unter hohen oder geringen Stringenzbedingungen an eine oder mehr der Nucleinsäuren, dargestellt durch SEQ ID NO: 1–4 und 9–14, hybridisiert. Geeignete Stringenzbedingungen, welche die DNA-Hybridisierung fördern, zum Beispiel 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ca. 45 °C, gefolgt von einer Wäsche von 2,0 × SSC bei 50 °C, sind dem Fachmann bekannt oder können in Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, gefunden werden. Die Salzkonzentration im Waschschritt kann zum Beispiel aus einer geringen Stringenz von ca. 2,0 × SSC bei 50 °C bis zu einer hohen Stringenz von ca. 0,2 × SSC bei 50 °C ausgewählt werden. Außerdem kann die Temperatur im Waschschritt von geringen Stringenzbedingungen bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) bis zu hohen Stringenzbedingungen bei ca. 65 °C erhöht werden.
Nucleinsäuren mit einer Sequenz, die sich von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gezeigten Nucleotidsequenzen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden, befinden sich auch im erfindungsgemäßen Rahmen. Solche Nucleinsäuren codieren funktionell äquivalente Peptide (das heißt ein Peptid mit einer biologischen Aktivität eines HIP-Polypeptids), unterscheiden sich aber hinsichtlich der Sequenz von der im Sequenzprotokoll gezeigten Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes. Eine Anzahl von Aminosäuren sind durch mehr als ein Triplett gekennzeichnet. Codone, die die gleiche Aminosäure spezifizieren, oder Synonyme (zum Beispiel codieren CAU und CAC jeweils für Histidin) können zu „stillen" Mutationen führen, die sich nicht auf die Aminosäuresequenz eines HIP-Polypeptids auswirken. Es wird jedoch erwartet, dass DNA-Sequenz-Polymorphismen, die zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide führen, unter zum Beispiel Menschen existieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Variationen in einem oder mehr Nucleotid(en) (bis zu ca. 3–5 % der Nucleotide) der Nucleinsäuren, codierend Polypeptide mit einer Aktivität eines HIP-Polypeptids unter Individuen einer gegebenen Spezies aufgrund der natürlichen Allelen-Variation existieren können.
Unter einem HIP-Genfragment, wie hierin verwendet, versteht man eine Nucleinsäure mit weniger Nucleotiden als die Nucleotidsequenz, die für die gesamte mature Form eines HIP-Proteins codiert, die aber dennoch (bevorzugt) für ein Polypeptid codiert, das einen Teil der biologischen Aktivität des Proteins der vollen Länge beibehält. Die erfindungsgemäß in Betracht gezogenen Fragmentgrößen schließen zum Beispiel 5, 10, 25, 50, 75, 100 oder 200 Aminosäuren in Länge ein. In einer bevorzugten Ausführungsform eines trunkierten Receptors schließt das Polypeptid alle oder einen ausreichenden Anteil der Ligandendomäne zur Bindung an ein Hedgehog-Polypeptid ein.
Wie durch die nachstehend dargelegten Beispiele angezeigt ist, können die HIP-Protein-codierenden Nucleinsäuren aus mRNA erhalten werden, die in Zellen von Metazoon-Organismen anwesend ist. Der Erhalt von Nucleinsäuren, codierend erfindungsgemäße HIP-Polypeptide aus genomischer DNA von sowohl Adulten als auch Embryos, sollte auch möglich sein. So kann zum Beispiel ein Gen, codierend ein HIP-Protein, aus entweder einer cDNA oder einer genomischen Bibliothek gemäß den hierin beschriebenen Protokollen ebenso wie den dem Fachmann allgemein bekannten, cloniert werden. Eine cDNA, codierend ein HIP-Protein, kann durch Isolation einer Gesamt- mRNA aus einer Zelle, wie zum Beispiel einer Säugerzelle, zum Beispiel einer humanen Zelle, gegebenenfalls erhalten werden. Aus der Gesamt-mRNA können doppelsträngige cDNAs hergestellt werden und anschließend unter Verwendung von jedweder einen von einer Anzahl von bekannten Verfahren in einen geeigneten Plasmid- oder Bacteriophagenvektor insertiert werden. Das ein HIP-Protein codierende Gen kann auch unter Verwendung etablierter Polymerasekettenreaktionsverfahren gemäß der erfindungsgemäß bereitgestellten Nucleotidsequenzinformation cloniert werden. Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann DNA oder RNA darstellen. Eine bevorzugte Nucleinsäure stellt eine cDNA, einschließlich einer durch jedwede eine von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, oder SEQ ID No: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 dargestellten Nucleotidsequenz dar.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Anwendung der isolierten Nucleinsäure in der „Antisense"-Therapie. Unter „Antisense"-Therapie, wie hierin verwendet, versteht man die Verabreichung oder die In-situ-Generierung von Oligonucleotidsonden oder ihren Derivaten, die spezifisch unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA, codierend ein erfindungsgemäßes HIP-Protein, um auf diese Weise die Expression dieses Proteins, zum Beispiel durch Inhibition der Transkription und/oder Translation zu inhibieren, hybridisieren (zum Beispiel binden). Die Bindung kann durch übliche Basenpaarkomplementarität, oder zum Beispiel im Fall der Bindung an DNA-Duplexe, durch spezifische Interaktionen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Im Allgemeinen verweist „Antisense"-Therapie auf den Bereich von Verfahren, der im Stand der Technik allgemein eingesetzt wird und schließt jedwede Therapie ein, die sich auf die spezifische Bindung an Oligonucleotidsequenzen verlässt.
Ein erfindungsgemäßes Antisense-Konstrukt kann zum Beispiel als ein Expressionsplasmid abgegeben werden, das – wenn es in der Zelle transkribiert wird – RNA produziert, die sich zu mindestens einem einzigartigen Anteil der zellulären mRNA, die für ein HIP-Protein codiert, komplementär verhält. Als Alternative stellt das Antisense-Konstrukt eine Oligonucleotidsonde dar, die ex vivo generiert wird und die, wenn sie in die Zelle eingeführt wird, die Inhibition der Expression durch Hybridisierung mit der mRNA und/oder den genomischen Sequenzen eines HIP-Gens veranlasst. Solche Oligonucleotidsonden stellen bevorzugt modifizierte Oligonucleotide dar, die gegen endogene Nucleasen, zum Beispiel Exonucleasen und/oder Endonucleasen resistent und deshalb in vivo stabil sind Beispielhafte Nucleinsäuremoleküle zur Verwendung als Antisense-Oligonucleotide stellen Phosphoramidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-Analoge von DNA (siehe auch US-Patente 5,176,996; 5,264,564; und 5,256,775) oder Peptid-Nucleinsäuren (PNAs) dar. Außerdem wurde ein allgemeiner Überblick über Ansätze zur Konstruktion von in der Antisense-Therapie nützlichen Oligomeren, zum Beispiel von Van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6: 958–976; und Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659–2668, gegeben.
Demzufolge sind die erfindungsgemäßen modifizierten Oligomere in therapeutischen, diagnostischen und Forschungskontexten nützlich. In therapeutischen Applikationen werden die Oligomere auf eine Weise genutzt, die für die Antisense-Therapie im Allgemeinen geeignet ist. Für eine derartige Therapie können die erfindungsgemäßen Oligomere für viele verschiedene Verabreichungsrouten, einschließlich einer systemischen und topischen oder lokalisierten Verabreichung, formuliert werden. Die Verfahren und Formulierungen können im Allgemeinen in Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA, eingesehen werden. Für die systemische Verabreichung sind Injektionen, einschließlich intramuskulärer, intravenöser, intraperitonealer und subkutaner bevorzugt. Für Injektionszwecke können die erfindungsgemäßen Oligomere in flüssigen Lösungen, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern, wie zum Beispiel in Hankscher Lösung oder Ringer-Lösung, formuliert werden. Die Oligomere können außerdem in fester Form formuliert und unmittelbar vor Gebrauch wieder aufgelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind auch eingeschlossen.
Die systemische Verabreichung kann auch über transmucosale oder transdermale Mittel erfolgen, oder die Verbindungen können oral verabreicht werden. Für die transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Penetrationsmittel, die zur Permeation der Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrationsmittel sind im Stand der Technik allgemein bekannt und schließen zum Beispiel für die transmucosale Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate ein. Zur Erleichterung der Permeation können außerdem Detergenzien verwendet werden. Die transmucosale Verabreichung kann über Nasensprays oder unter Verwendung von Suppositorien erfolgen. Zur oralen Verabreichung werden die Oligomere in üblichen oralen Verabreichungsformen, wie zum Beispiel Kapseln, Tabletten und Tonika, formuliert. Zur topischen Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Oligomere, wie im Stand der Technik allgemein bekannt ist, in Salben, Unguenta, Gelen oder Cremes formuliert.
Zusätzlich zur Anwendung in der Therapie können die erfindungsgemäßen Oligomere als diagnostische Reagenzien zum Nachweis der An- oder Abwesenheit der Target-DNA- oder -RNA-Sequenzen, an die sie spezifisch binden, verwendet werden. Derartige diagnostische Tests werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Genauso können die erfindungsgemäßen Antisense-Konstrukte durch Antagonisierung der normalen biologischen Aktivität eines HIP-Proteins, zum Beispiel durch Reduktion des Grades seiner Expression, bei der Manipulation von Gewebe, zum Beispiel zur Gewebeerhaltung, Differenzierung oder Wachstum, sowohl in vivo als auch ex vivo verwendet werden.
Die Antisense-Verfahren (zum Beispiel Mikroinjektion von Antisense-Molekülen oder Transfektion mit Plasmiden, deren Transkripte in Bezug auf eine HIP-mRNA oder Gensequenz Antisense sind) können überdies zur Untersuchung der Rolle von HIP in Entwicklungsereignissen ebenso wie der normalen Zellfunktion von HIP in adultem Gewebe untersucht werden. Solche Verfahren können in der Zellkultur genutzt werden, sie können aber auch bei der Erzeugung transgener Tiere (hierin nachstehend beschrieben) verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäure enthalten, codierend ein HIP-Polypeptid, das funktionsfähig mit mindestens einer transkriptionalen Regulationssequenz verknüpft ist. Es ist beabsichtigt, dass man unter funktionsfähig verknüpft versteht, dass die Nucleotidsequenz mit einer Regulationssequenz auf eine Weise verknüpft ist, die die Expression der Nucleotidsequenz zulässt. Regulationssequenzen sind im Stand der Technik anerkannt und werden zur direkten Expression der erfindungsgemäßen HIP-Proteine ausgewählt. Demgemäß schließt der Begriff transkriptionale Regulationssequenz Promotoren, Enhancer und Expressionskontrollelemente ein. Derartige Regulationssequenzen sind in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben. So kann zum Beispiel jedwede Reihe vieler verschiedener Expressionskontrollsequenzen, Sequenzen, die die Expression einer DNA- Sequenz kontrollieren, wenn sie funktionsfähig mit ihr verknüpft sind, in diesen Vektoren zur Expression von DNA-Sequenzen verwendet werden, die diese erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide codieren. Derartig nützliche Expressionskontrollsequenzen schließen zum Beispiel ein virales LTR, wie zum Beispiel die LTR des Moloney-Maus-Leukämie-Virus, die frühen und späten Promotoren von SV40, das Adenovirus oder den unmittelbar frühen Promotor des Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, den T7-Promoter, dessen Expression durch die T7-RNA-Polymerase gerichtet ist, die bedeutenden Operator- und Promoterregionen des Phagen λ, die Kontrollregionen für das fd-Hüllprotein, den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, zum Beispiel Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren, den Polyeder-Promotor des Baculovirus-Systems und andere zur Kontrolle der Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihren Viren bekannte Sequenzen und verschiedene Kombinationen davon ein. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass das Design des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle und/oder des Proteintyps, dessen Expression erwünscht ist, abhängen kann.
Überdies sollten die Kopienzahl des Vektors, die Fähigkeit zur Kontrolle dieser Kopienzahl und die Expression von jedweden anderen durch den Vektor codierten Proteinen, wie zum Beispiel antibiotische Marker, in Erwägung gezogen werden. In einer Ausführungsform schließt der Expressionsvektor ein rekombinantes Gen, codierend ein Polypeptid mit einer agonistischen Aktivität eines erfindungsgemäßen HIP-Polypeptids oder als Alternative, codierend ein Polypeptid, das eine antagonistische Form des HIP-Proteins darstellt, ein. Ein beispielhaftes erfindungsgemäßes HIP-Polypeptid stellt eine lösliche trunkierte Form des Proteins, welche die Ligandenbindungsdomäne beibehält, die zum Beispiel die Fähigkeit zur Bindung an Hedgehog-Polypeptide beibehält, bereit. Solche Expressionsvektoren können zur Transfektion von Zellen verwendet werden und dadurch Polypeptide, einschließlich Fusionsproteinen, die durch Nucleinsäuren, wie hierin beschrieben, codiert sind, produzieren.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können überdies auch als ein Teil eines Gentherapie-Protokolls zur Abgabe von Nucleinsäuren, zum Beispiel zum Codieren von entweder einer agonistischen oder antagonistischen Form eines erfindungsgemäßen HIP-Proteins oder eines wie vorstehend beschriebenen Antisense-Moleküls verwendet werden. Folglich bringt ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt die Expressionsvektoren für die In-vivo- oder In-vitro-Transfektion und – Expression eines HIP-Polypeptids oder Antisense-Moleküls, insbesondere Zelltypen zur Geltung, um auf diese Weise die Funktion der gesamten oder einen Anteil der biologischen Funktion der HIP-induzierten Transkription in einem Gewebe, in dem die natürlich vorkommende Form des Proteins missexprimiert wird (oder disruptiert wurde) zu rekonstituieren oder als Alternative außer Kraft zu setzen; oder um eine Form des Proteins, das die Aufrechterhaltung oder Differenzierung von Gewebe verändert oder das die neoplastische oder hyperplastische Proliferation inhibiert, abzugeben.
Expressionskonstrukte der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide ebenso wie Antisense-Konstrukte können in jedwedem biologisch wirksamen Träger, zum Beispiel in jedweder Formulierung oder Zusammensetzung, die zur wirksamen Abgabe des rekombinanten Gens an Zellen in vivo fähig ist, verabreicht werden Ansätze schließen die Insertion des erfindungsgemäßen Gens in virale Vektoren, einschließlich rekombinanter Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren und Herpes-simplex-Virus Typ 1 oder rekombinanter bakterieller oder eukaryotischer Plasmide ein. Virale Vektoren transfizieren Zellen direkt; Plasmid-DNA kann mithilfe von zum Beispiel kationischen Liposomen (Lipofectin) oder derivatisierten (zum Beispiel Antikörper-konjugierten), Polylysin-Konjugaten, Gramacidin S, artifiziellen Virsushüllen oder anderen solcher intrazellulären Träger ebenso wie die direkte Injektion des Genkonstrukts oder CaPO₄-Präzipitation in vivo ausgeführt werden Es wird erkannt werden, dass die Wahl des speziellen Genabgabesystems von solchen Faktoren, wie dem Phänotyp des beabsichtigten Targets und der Verabreichungsroute, zum Beispiel lokal oder systemisch abhängt, weil die Transduktion geeigneter Targetzellen den kritischen ersten Schritt der Gentherapie darstellt. Darüber hinaus wird erkannt werden, dass das spezielle Genkonstrukt, das für die In-vivo-Transduktion der HIP-Expression bereitgestellt wird, auch für die In-vitro-Transduktion von Zellen, wie zum Beispiel zum Gebrauch in den nachstehend beschriebenen Ex-vivo-Gewebskultursystemen, nützlich ist.
Ein bevorzugter Ansatz zur In-vivo-Einführung einer Nucleinsäure in eine Zelle erfolgt durch Verwendung eines viralen Vektors, enthaltend Nucleinsäure, zum Beispiel eine cDNA, codierend das spezielle erwünschte HIP-Polypeptid. Die Infektion von Zellen mit einem viralen Vektor weist den Vorteil auf, dass ein großer Anteil der targetierten Zellen die Nucleinsäure aufnehmen kann. Außerdem werden Moleküle, die im viralen Vektor, zum Beispiel durch eine im viralen Vektor enthaltene cDNA codiert sind, wirksam in Zellen exprimiert, die eine Nucleinsäure des viralen Vektors aufgenommen haben. Retrovirus-Vektoren, Adenovirus-Vektoren und Adeno-assoziierte Virusvektoren stellen ein beispielhaftes rekombinantes Genabgabesystem für den Transfer von exogenen Genen in vivo, insbesondere in Menschen dar. Diese Vektoren stellen die effiziente Abgabe von Genen in Zellen bereit, und die transferierten Nucleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA des Wirts integriert.
Zusätzlich zu viralen Transferverfahren, wie zum Beispiel die vorstehend erläuterten, können auch nicht virale Verfahren eingesetzt werden, um die Expression eines erfindungsgemäßen HIP-Polypeptids im Gewebe eines Tieres zu veranlassen. Die meisten nicht viralen Verfahren des Gentransfers verlassen sich auf die üblichen Mechanismen, die von Säugerzellen zur Aufnahme und zum intrazellulären Transport von Makromolekülen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen verlassen sich erfindungsgemäße nicht virale Genabgabesysteme auf endocytische Pfade zur Aufnahme des erfindungsgemäßen HIP-Polypeptidgens durch die targetierte Zelle. Beispielhafte Genabgabesysteme dieses Typs schließen liposomal hergeleitete Systeme, Polylysin-Konjugate und artifizielle Virushüllen ein.
Im klinischen Umfeld können die Genabgabesysteme für das therapeutische HIP-Gen in einen Tier-Patienten durch jedwede Anzahl von Verfahren eingeführt werden, von denen jedes im Stand der Technik bekannt ist. Eine pharmazeutische Präparation des Genabgabesystems kann zum Beispiel systemisch, zum Beispiel durch intravenöse Injektion eingeführt werden, und die spezifische Transduktion des Proteins in den Targetzellen tritt überwiegend aufgrund der Spezifität der Transfektion auf, die vom Genabgabevehikel, der Zelltyp- oder der Gewebetyp-Expression aufgrund der transkriptionalen Regulationssequenzen, kontrollierend die Expression des Receptorgens oder eine Kombination davon, bereitgestellt wird. In anderen Ausführungsformen ist die initiale Abgabe des rekombinanten Gens limitierter, wobei die Einführung in das Tier ziemlich lokalisiert erfolgt. So kann das Genabgabevehikel zum Beispiel durch einen Katheter (siehe US-Patent 5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion zum Beispiel Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054–3057) eingeführt werden. Ein HIP-Gen kann in einem Gentherapie-Konstrukt durch Elektroporation unter Verwendung von zum Beispiel von Dev et al. ((1994) Cancer Treat Rev 20: 105–115), beschriebenen Verfahren abgegeben werden.
Die pharmazeutische Präparation des Gentherapie-Konstrukts kann im Wesentlichen aus dem Genabgabesystem in einem verträglichen Verdünnungsmittel bestehen, oder es kann eine Matrix zur langsamen Freisetzung umfassen, worin das Genabgabevehikel eingebettet ist. Wenn das komplette Genabgabesystem als Alternative intakt aus rekombinanten Zellen, zum Beispiel retroviralen Vektoren, hergestellt werden kann, kann die pharmazeutische Präparation eine oder mehr Zelle(n) umfassen, die das Genabgabesystem produzieren.
In einer noch anderen Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein „Genaktivierungs"-Konstrukt bereitgestellt, das durch homologe Rekombination mit einer genomischen DNA die transkriptionalen Regulationssequenzen eines endogenen HIP-Gens verändert. Das Genaktivierungs-Konstrukt kann zum Beispiel den endogenen Promotor eines HIP-Gens durch einen heterologen Promotor, zum Beispiel einen, der eine konstitutive Expression des HIP-Gens herbeiführt oder der die induzierbare Expression des Gens unter Bedingungen veranlasst, die vom normalen Expressionsmuster von HIP abweichen, ersetzen. Es sind eine Reihe verschiedener Formate für die Genaktivierungs-Konstrukte verfügbar. Siehe zum Beispiel die Transkaryotic Therapies, Inc, PCT-Veröffentlichungen WO93/09222, WO95/31560, WO96/29411, WO95/31560 und WO94/12650.
In bevorzugten Ausführungsformen kann die als Genaktivierungskonstrukt verwendete Nucleotidsequenz aus Folgendem bestehen: (1) DNA aus einem Anteil des endogenen HIP-Gens (Exonsequenz, Intronsequenz, Promotorsequenzen usw.), das die Rekombination richtet und (2) (eine) heterologe transkriptionale Regulationssequenz(en), die funktionsfähig mit der Codiersequenz für das genomische HIP-Gen nach Rekombination des Genaktivierungskonstrukts verknüpft werden soll(en). Zum Gebrauch bei der Generierung von Kulturen aus HIP-produzierenden Zellen, kann das Konstrukt weiter ein Reportergen zum Nachweis der Anwesenheit des Knockout-Konstrukts in der Zelle einschließen.
Das Genaktivierungskonstrukt wird in eine Zelle insertiert und integriert mit der genomischen DNA der Zelle in einer solchen Position dergestalt, um die heterologen Regulationssequenzen in funktionsfähiger Assoziation mit dem nativen HIP-Gen bereitzustellen. Eine derartige Insertion tritt durch homologe Rekombination auf, das heißt Rekombinationsregionen des Aktivierungskonstrukts, die zu der endogenen HIP-Gensequenz homolog sind, hybridisieren an die genomische DNA und rekombinieren mit den genomischen Sequenzen, damit das Konstrukt in die entsprechende Position der genomischen DNA inkorporiert wird.
Unter den Begriffen „Rekombinationsregion" oder „Targetsequenz" versteht man ein Segment (das heißt einen Anteil) eines Genaktivierungskonstrukts mit einer Sequenz, die im Wesentlichen mit einer genomischen Gensequenz identisch oder im Wesentlichen komplementär ist, zum Beispiel 5'-flankierende Sequenzen des genomischen Gens einschließt, und die homologe Rekombination zwischen der genomischen Sequenz und dem Targeting-Transgen-Konstrukt fördern kann.
Unter dem Begriff „Ersatzregion", wie hierin verwendet, versteht man einen Anteil eines Aktivierungskonstrukts, das nach der homologen Rekombination zwischen einer Rekombinationsregion und einer genomischen Sequenz in einen endogenen chromosomalen Ort integriert wird.
Die heterologen Regulationssequenzen, zum Beispiel die, die in der Ersatzregion bereitgestellt werden, können eines oder mehr von einer Reihe verschiedener Elemente einschließen, einschließlich: Promotoren (wie zum Beispiel konstitutive oder induzierbare Promotoren), Enhancer, negative Regulationselemente, Locus-Kontrollregionen, Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen oder Kombinationen davon. Promotoren/Enhancer, die zur Kontrolle der Expression des targetierten Gens in vivo verwendet werden können, schließen Folgendes ein, sind aber nicht beschränkt auf Promotor/Enhancer des Cytomegalovirus (CMV) (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med., 169: 13), den humanen β-Aktinpromotor (Gunning et al. (1987) PNAS 84: 4831–4835), den Glucocorticoid-induzierbaren Promotor, der im Long Terminal Repeat des Maus-Mammatumorvirus (MMTV LTR) vorliegt (Klessig et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4: 1354–1362), die Long Terminal Repeat Sequenzen des Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MuLV LTR) (Weiss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), den SV40-Promotor der frühen oder späten Region (Bernoist et al. (1981) Nature 290: 304–310; Templeton et al. (1984) Mol Cell Biol, 4: 817; und Sprague et al. (1983) J. Virol, 45: 773), den im 3' Long Terminal Repeat des Rous-Sarcoma-Virus (RSV) enthaltenen Promotor (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22: 787–797), den Thymidinkinase-Promotor/-Enhancer des Herpes-simplex-Virus (HSV) (Wagner et al. (1981) PNAS 82: 3567–71) und den LAT-Promotor des Herpes-simplex-Virus (Wolfe et al. (1992) Nature Genetics, 1: 379–384).
In noch anderen Ausführungsformen deletiert die Ersatzregion lediglich ein negatives transkriptionales Kontrollelement des nativen Gens, zum Beispiel zur Aktivierung der Expression, oder Ablation eines positiven Kontrollelements, zum Beispiel zur Inhibition der Expression des targetierten Gens.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft rekombinante Formen der HIP-Proteine. Erfindungsgemäß bevorzugte rekombinante Polypeptide zusätzlich zu nativen HIP-Proteinen, sind mindestens zu 60 % oder 70 % homolog, bevorzugter mindestens zu 80 % homolog und am bevorzugtesten mindestens zu 85 % homolog mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine oder mehr von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 dargestellt ist. Polypeptide, die eine Aktivität eines HIP-Proteins (das heißt entweder agonistisch oder antagonistisch) besitzen und die mindestens zu 90 %, bevorzugter mindestens zu 95 % und am bevorzugtesten mindestens zu ca. 98–99 % homolog mit SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 8 sind, fallen auch in den erfindungsgemäßen Rahmen. Solche Polypeptide, wie vorstehend beschrieben, schließen verschiedene trunkierte Formen des Proteins ein.
Unter dem Begriff „rekombinantes HIP-Polypeptid" versteht man ein Polypeptid, das durch rekombinante DNA-Verfahren produziert wird, worin im Allgemeinen DNA, codierend ein HIP-Polypeptid, in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, der wiederum zur Transformation einer Wirtszelle zur Herstellung eines heterologen Proteins verwendet wird. Überdies versteht man unter der Phrase „hergeleitet von" in Bezug auf ein rekombinantes HIP-Gen, dass sie im Rahmen der Bedeutung von „rekombinantem Protein" die Proteine mit einer Aminosäuresequenz von einem nativen HIP-Protein oder einer dazu ähnlichen Aminosäuresequenz einschließt, die durch Mutationen, einschließlich Substitutionen und Deletionen (einschließlich Trunkation) von einer natürlich vorkommenden Form des Proteins generiert wird.
Gegenstand der Erfindung sind weiter rekombinante Formen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide, die durch Gene codiert werden, die sich von einem Säuger (zum Beispiel einem Menschen), einem Reptil oder einer Amphibie herleiten und die Aminosäuresequenzen aufweisen, die evolutionär mit dem HIP-Protein verwandt sind, das in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 dargestellt ist. Solche rekombinanten HIP-Polypeptide sind bevorzugt zur Funktion in einer von beiden Rollen eines Agonisten oder Antagonisten von mindestens einer biologischen Aktivität eines Wildtyp-HIP-Proteins („authentischen" HIP-Proteins) des anhängenden Sequenzprotokolls in der Lage. Der Begriff „evolutionär verwandt mit" in Bezug auf Aminosäuresequenzen von HIP-Proteinen, verweisen sowohl auf Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die natürlich entstanden sind, als auch auf Mutationsvarianten von HIP-Polypeptiden, die sich zum Beispiel von der kombinatorischen Mutagenese herleiten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide. So kann zum Beispiel eine Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäurevektor transfiziert ist, der die Expression einer Nucleotidsequenz richtet, codierend die erfindungsgemäßen Polypeptide, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um das Auftreten der Expression des Peptids zu erlauben. Wenn das rekombinante Protein nicht mit einem Sekretionssignalpeptid, wie zum Beispiel im Fall eines GST-Fusionsproteins, bereitgestellt wird, können die Zellen geerntet, lysiert und das Protein isoliert werden. Eine Zellkultur schließt Wirtszellen, Medien und andere Nebenprodukte ein. Für die Zellkultur geeignete Medien sind im Stand der Technik überall bekannt. Das rekombinante HIP-Polypeptid kann aus dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden unter Verwendung von im Stand der Technik zur Reinigung von Proteinen bekannten Verfahren, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese und Immunaffinitätsreinigung mit für ein solches Peptid spezifischen Antikörpern isoliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das rekombinante HIP-Polypeptid ein Fusionsprotein dar, enthaltend eine Domäne, welche seine Reinigung fördert, wie zum Beispiel das GST-Fusionsprotein oder das Poly(His)-Fusionsprotein.
Gegenstand dieser Erfindung ist eine transfizierte Wirtszelle zur Expression rekombinanter Formen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide. Bei der Wirtszelle kann es sich um jedwede eukaryotische oder prokaryotische Zelle handeln. Folglich kann eine Nucleotidsequenz, die sich vom Clonieren von HIP-Proteinen herleitet, codierend alle oder einen ausgewählten Anteil eines Proteins voller Länge, zur Herstellung einer rekombinanten Form eines HIP-Polypeptids über mikrobielle oder eukaryotische zelluläre Vorgänge verwendet werden. Das Ligieren der Polynucleotidsequenz in ein Genkonstrukt, wie zum Beispiel in einen Expressionsvektor, und Transformieren oder Transfizieren in Wirte, entweder eukaryotische (Hefe, Vögel, Insekten oder Säuger) oder prokaryotische (Bakterienzellen), stellen Standardverfahren dar, die bei der Herstellung anderer überall bekannter Proteine, wie zum Beispiel von Hedgehog-Proteinen, TGF-β-Proteinen ebenso wie eine Reihe vieler verschiedener Receptoren, verwendet werden. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen davon können erfindungsgemäß zur Herstellung rekombinanter HIP-Polypeptide durch mikrobielle Mittel oder die Gewebskultur-Technologie eingesetzt werden.
Die rekombinanten HIP-Gene können durch Ligation der Nucleinsäure, codierend ein HIP-Polypeptid in einen Vektor, der zur Expression in entweder prokaryotische Zellen, eukaryotische Zellen oder beide geeignet ist, hergestellt werden. Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten Formen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide schließen Plasmide und andere Vektoren ein. Geeignete Vektoren zur Expression eines HIP-Polypeptids schließen zum Beispiel Plasmide der folgenden Typen ein: pBR322-hergeleitete Plasmide, pEMBL-hergeleitete Plasmide, pEX-hergeleitete Plasmide, pBTac-hergeleitete Plasmide und pUC-hergeleitete Plasmide zur Expression in prokaryotische Zellen, wie zum Beispiel E. coli.
Für die Expression von rekombinanten Proteinen in Hefe existieren eine Anzahl von Vektoren. So stellen zum Beispiel YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 und YRP17 Clonierungs- und Expressionsvehikel dar, die bei der Einführung genetischer Konstrukte in S. cerevisiae nützlich sind (siehe zum Beispiel Broach et al. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. M. Inouye Academic Press, S. 83, unter Bezugnahme hierin aufgenommen). Diese Vektoren können aufgrund der Anwesenheit von pBR322 ori in E. coli und aufgrund der Replikationsdeterminanten des 2-Mikron-Plasmids von Hefe in S. cerevisiae replizieren. Außerdem können auch Arzneimittel-Resistenzmarker, wie zum Beispiel Ampicillin verwendet werden. In einer erläuternden Ausführungsform wird ein HIP-Polypeptid rekombinant produziert, das sich einen Expressionsvektor zu Nutze macht, der durch Subclonierung der Codiersequenz eines in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten HIP-Gens generiert wird.
Die bevorzugten Säuger-Expressionsvektoren enthalten sowohl prokaryotische Sequenzen zur Förderung der Propagation des Vektors in Bakterien als auch eine oder mehr eukaryotische Transkriptionseinheit(en), die in eukaryotischen Zellen exprimiert werden. Die sich von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg herleitenden Vektoren stellen Beispiele von Säuger-Expressionsvektoren dar, die zur Transfektion eukaryotischer Zellen geeignet sind. Einige dieser Vektoren sind mit Sequenzen aus Bakterienplasmiden, wie zum Beispiel pBR322, zur Förderung der Replikation und Arzneimittel-Resistenzauswahl sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen, modifiziert. Als Alternative können Derivate von Viren, wie zum Beispiel dem bovinen Papillomavirus (BPV-I) oder dem Epstein-Barr-Virus (pHEBo, pREP-hergeleitet und p205) für die transiente Expression von Proteinen in eukaryotischen Zellen verwendet werden. Die verschiedenen bei der Herstellung der Plasmide eingesetzten Verfahren und die Transformation von Wirtsorganismen sind im Stand der Technik überall bekannt. Andere geeignete Expressionssysteme, sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen, ebenso wie allgemeine rekombinante Verfahren können in Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Aufl., Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), Kapitel 16 und 17, eingesehen werden.
In einigen Fällen könnte es wünschenswert sein, das rekombinante HIP-Polypeptid durch die Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems zu exprimieren. Beispiele solcher Baculovirus-Expressionssysteme schließen pVL-hergeleitete Vektoren (wie zum Beispiel pVL1392, pVL1393 und pVL941), pAcUW-hergeleitete Vektoren (wie zum Beispiel pAcUW1) und pBlueBac-hergeleitete Vektoren (wie zum Beispiel das β-gal-enthaltende pBlueBac III) ein.
Wenn die Expression von nur einem Anteil eines HIP-Proteins, wie zum Beispiel eine Form, der ein Anteil des N-Terminus mangelt, das heißt eine Trunkationsmutante, der das Signalpeptid mangelt, erwünscht ist, kann das Zufügen eines Startcodons (ATG) zum Oligonucleotidfragment, enthaltend die gewünschte zu exprimierende Sequenz, notwendig sein. Es ist im Stand der Technik überall bekannt, dass ein Methionin an der N-terminalen Position durch die Verwendung des Enzyms Methioninaminopeptidase (MAP) enzymatisch gespalten werden kann. MAP wurde aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 751–757) und Salmonella ryphimurium cloniert und seine In-vitro-Aktivität wurde an rekombinanten Proteinen nachgewiesen (Miller et al. (1987) PNAS 84: 2718–1722). Deshalb kann die Entfernung eines N-terminalen Methionins gegebenenfalls entweder in vivo durch Expression von HIP-hergeleiteten Polypeptiden in einem Wirt, der MAP produziert (zum Beispiel E. coli oder CM89 oder S. cerevisiae) oder in vitro durch gereinigtes MAP (zum Beispiel mit dem Verfahren von Miller et al., vorstehend) erreicht werden.
Als Alternative können die Codiersequenzen für das Polypeptid als ein Teil eines Fusionsgens, einschließlich einer Nucleotidsequenz, codierend ein unterschiedliches Polypeptid, inkorporiert werden. Dieser Typ des Expressionssystems kann unter Bedingungen nützlich sein, wenn die Herstellung eines immunogenen Fragments von einem HIP-Protein erwünscht ist. So kann zum Beispiel das VP6-Capsidprotein des Rotavirus als ein immunologisches Trägerprotein für Anteile des HIP-Polypeptids, entweder in der monomeren Form oder in der Form eines Viruspartikels verwendet werden. Die Nucleinsäuresequenzen, die dem Anteil eines erfindungsgemäßen HIP-Proteins entsprechen, für das Antikörper gebildet werden sollen, können in ein Fusionsgenkonstrukt inkorporiert werden, das Codiersequenzen für ein spätes Strukturprotein des Vaccinia-Virus einschließt, um eine Reihe rekombinanter Viren zu produzieren, die Fusionsproteine exprimieren, umfassend HIP-Epitope als ein Teil des Virions. Es wurde mit der Verwendung von immunogenen Fusionsproteinen, die sich Fusionsproteine des Hepatitis-B-Oberflächenantigens zu Nutze machen, nachgewiesen, dass rekombinante Hepatitis-B-Virionen auch in dieser Rolle genutzt werden können. Ähnlich können chimäre Konstrukte, codierend für Fusionsproteine, die einen Anteil eines HIP-Proteins enthalten und das Poliovirus-Capsidprotein zur Förderung der Immunogenizität der Reihe von Polypeptid-Antigenen gebildet werden (siehe zum Beispiel EP-Veröffentlichung Nr: 0259149; und Evans et al. (1989) Nature 339: 385; Huang et al. (1988) J. Virol. 62: 3855; und Schlienger et al. (1992) J. Virol. 66: 2).
Das Multiple Antigen-Peptid-System für die auf Peptid basierende Immunisierung kann auch zur Bildung eines Immunogens verwendet werden, worin ein gewünschter Anteil eines HIP-Polypeptids direkt aus der organo-chemischen Synthese des Peptids an einen oligomeren sich verzweigenden Lysin-Core erhalten werden kann (siehe zum Beispiel Posnett et al. (1988) JBC 263: 1719 und Nardelli et al. (1992) J. Immunol. 148: 914). Antigendeterminanten von HIP-Proteinen können auch exprimiert und anhand von Bakterienzellen dargestellt werden.
Außer der Verwendung von Fusionsproteinen zur Förderung der Immunogenizität wird überall erkannt, dass Fusionsproteine auch die Expression von Proteinen fördern können und demzufolge bei der Expression der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide, insbesondere trunkierter Formen des HIP-Proteins, verwendet werden können. So können zum Beispiel HIP-Polypeptide als Glutathion-S-Transferase-Proteine (GST-Fusionsproteine) gebildet werden. Solche GST-Fusionsproteine können die leichte Reinigung des HIP-Polypeptids, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Glutathion-derivatisierten Matrices, ermöglichen (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. (N. Y.: John Wiley & Sons, 1991)).
In einer anderen Ausführungsform kann ein Fusionsgen, codierend für eine Reinigungs-Leader-Sequenz, wie zum Beispiel die Spaltungsort-Sequenz einer Poly-(His)/Enterokinase am N-Terminus des gewünschten Anteils des rekombinanten Proteins, die Reinigung des exprimierten Fusionsproteins mittels der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Ni₂+-Metallharzes ermöglichen. Die Reinigungs-Leadersequenz kann dann anschließend durch Behandlung mit Enterokinase zur Bereitstellung des gereinigten Proteins entfernt werden (siehe zum Beispiel Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411: 177; und Janknecht et al. PNAS 88: 8972).
Verfahren zur Herstellung von Fusionsgenen sind dem Fachmann bekannt. Im Wesentlichen wird das Zusammenfügen von verschiedenen DNA-Fragmenten, codierend für verschiedene Polypeptidsequenzen gemäß den üblichen Verfahren durchgeführt, wobei Termini mit stumpfen Enden oder versetzten Enden zur Ligation, zum Verdau des Restriktionsenzyms zur Bereitstellung geeigneter Termini, gegebenenfalls Filling-in von kohäsiven Enden, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung eines unerwünschten Zusammenfügens und der enzymatischen Ligation eingesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mithilfe üblicher Verfahren, einschließlich automatisierter DNA-Synthesizer, synthetisiert werden. Als Alternative kann die PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Anker-Primern durchgeführt werden, die Anlass zu komplementären Überhängen zwischen zwei konsekutiven Genfragmenten geben, die anschließend zur Generierung einer chimären Gensequenz annealt werden können (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).
Die HIP-Polypeptide können zur Herbeiführung von HIP-Derivaten durch Bildung kovalenter oder aggregierter Konjugate mit anderen chemischen Komponenten, wie zum Beispiel Glycosylgruppen, Lipiden, Cholesterol, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen, auch chemisch modifiziert werden. Kovalente Derivate von HIP-Proteinen können durch Verknüpfung der chemischen Komponenten mit funktionellen Gruppen an Aminosäure-Seitenketten des Proteins oder am N-Terminus oder am C-Terminus des Polypeptids hergestellt werden.
Gegebenenfalls werden auch Formulierungen von multimeren HIP-Polypeptiden bereitgestellt. Die Multimere der löslichen Formen der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide können gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. In einer Ausführungsform werden die HIP-Multimere unter Verwendung bekannter Verfahren, welche zur Bildung von entweder Dimeren oder höheren Multimeren der löslichen Formen der HIP-Polypeptide führen, chemisch vernetzt. Eine andere Weise zur Herstellung der Multimeren der löslichen Formen der HIP-Polypeptide erfolgt durch rekombinante Verfahren, zum Beispiel durch Einschluss von Hinge-Regionen. Dieser Linker kann die verbesserte Flexibilität des chimären Proteins fördern, wobei die verschiedenen HIP-monomeren Untereinheiten frei und (optional) gleichzeitig mit einem HIP-Liganden interagieren dürfen, wobei sowohl die sterische Hinderung zwischen den beiden Fragmenten reduziert wird als auch das Auftreten von angemessenem Falten eines jeden Anteils zugelassen wird. Der Linker kann von natürlichem Ursprung, wie zum Beispiel eine Sequenz sein, von der bestimmt wurde, dass sie in einem regellosen Knäuel zwischen zwei Domänen eines Proteins existiert. Als Alternative kann der Linker von synthetischem Ursprung sein. So kann zum Beispiel die Sequenz (Gly₄Ser)₃ als ein synthetischer unstrukturierter Linker verwendet werden. Linker dieses Typs werden in Huston et al. (1988) PNAS 85: 4879; und in den US-Patenten Nr. 5,091,513 und 5,258,498, beschrieben. Natürlich vorkommende unstrukturierte Linker humanen Ursprungs sind bevorzugt, da sie das Immunogenizitätsrisiko reduzieren.
Jedes Multimer umfasst zwei oder mehr Monomere, wobei jedes die lösliche Form eines HIP-Polypeptids oder eines Salzes oder eines funktionellen Derivats davon umfasst. Die obere Grenze für die Anzahl an Monomeren in einem Multimer ist nicht wichtig, und Liposomen mit vielen solcher Momomeren daran können verwendet werden. Solche Multimere weisen bevorzugt 2–5 und bevorzugter 2 oder 3 Monomere auf.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Zurverfügungstellen isolierter HIP-Polypeptide, die aus anderen zellulären Proteinen isoliert werden oder anderweitig im Wesentlichen frei von ihnen sind, insbesondere Rezeptoren und/oder andere induktive Polypeptide, die in der Regel mit dem HIP-Polypeptid assoziiert sein können. Der Begriff „im Wesentlichen frei von anderen zellulären Proteinen" (auf den hierin auch als auf „kontaminierende Proteine" verwiesen wird) oder „im Wesentlichen rein oder gereinigte Präparationen" wird dahingehend definiert, dass er Präparationen aus HIP-Polypeptiden mit weniger als 20 Gew.-% (Trockengewicht) kontaminierendem Protein und bevorzugt weniger als 5 % kontaminierendem Protein aufweist. Funktionelle Formen der erfindungsgemäßen Polypeptide können erstmals unter Verwendung eines wie hierin beschriebenen clonierten Gens als gereinigte Präparationen hergestellt werden. Unter „gereinigt" versteht man, wenn man auf eine Peptid- oder DNA- oder RNA-Sequenz verweist, dass das angezeigte Molekül bei der weitgehenden Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen, wie zum Beispiel anderen Proteinen, anwesend ist. Unter dem Begriff „gereinigt", wie hierin verwendet, versteht man, dass bevorzugt mindestens 80 Gew.-% (Trockengewicht), bevorzugter im Bereich von 95–99 Gew.-% und am bevorzugtesten mindestens 99,8 Gew.-% biologische Makromoleküle des gleichen Typs anwesend sind (aber Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, besonders Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 anwesend sein können). Der Begriff „rein", wie hierin verwendet, weist bevorzugt die gleichen zahlenmäßigen Einschränkungen wie „gereinigt" unmittelbar vorstehend auf. „Isoliert" und „gereinigt" umfassen weder natürliche Materialien in ihrem nativen Zustand noch natürliche Materialien, die in Komponenten aufgetrennt wurden (zum Beispiel in einem Acrylamidgel), aber weder als reine (zum Beispiel mangelnde kontaminierende Proteine oder Chromatographie-Reagenzien, wie zum Beispiel Denaturierungsmittel und Polymere, zum Beispiel Acrylamid oder Agarose) Substanzen noch Lösungen erhalten werden. In bevorzugten Ausführungsformen mangeln gereinigten HIP-Präparationen jedwede kontaminierenden Proteine vom gleichen Tier, von dem HIP in der Regel produziert wird, wie durch die rekombinante Expression, von zum Beispiel einem Säuger-HIP-Protein in einer Hefe- oder Bakterienzelle, erreicht werden kann.
Wie vorstehend für rekombinante Polypeptide beschrieben wurde, können isolierte HIP-Polypeptide alle oder einen Anteil von (einer) Aminosäuresequenz(en), entsprechend einem HIP-Polypeptid, das in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 dargestellt ist oder homologe Sequenzen dazu einschließen.
Isolierte Peptidyl-Anteile von HIP-Proteinen können auch durch das Screening von Peptiden erhalten werden, die aus dem entsprechenden Fragment der Nucleinsäure, codierend solche Peptide, rekombinant produziert werden. Außerdem können Fragmente unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie zum Beispiel der üblichen Merrifield-Festphasen-f-Moc- oder -t-Boc-Chemie, chemisch synthetisiert werden. Ein erfindungsgemäßes HIP-Polypeptid kann zum Beispiel arbiträr in Fragmente der gewünschten Länge mit keiner Überlappung der Fragmente aufgeteilt werden oder bevorzugt in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge aufgeteilt werden. Die Fragmente können (rekombinant oder durch chemische Synthese) hergestellt und zur Identifikation der Peptidyl-Fragmente testet werden, die entweder als Agonisten oder Antagonisten eines Wildtyp-HIP-Proteins (zum Beispiel eines „authentischen" HIP-Proteins) funktionieren können. Román et al. (1994) Eur J Biochem 222: 65–73, beschreiben zum Beispiel die Verwendung von kompetitiven Bindungsassays unter Verwendung von kurzen überlappenden synthetischen Peptiden aus größeren Proteinen zur Identifikation von Bindungsdomänen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten HIP-Polypeptide schließen auch Homologe der authentischen HIP-Proteine, wie zum Beispiel Versionen von dem Protein ein, das gegen die proteolytische Spaltung, wie zum Beispiel aufgrund von Mutationen, welche die Ubiquitinierung, Prenylierung oder dergleichen verändern, enzymatische Freisetzung der extrazelluläen Domäne oder anderes mit dem Protein assoziiertes enzymatisches Targeting, resistent sind.
Die Modifikation der Struktur der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide kann für solche Zwecke wie die Verbesserung der therapeutischen oder prophylaktischen Wirksamkeit, Stabilität (zum Beispiel Exvivo-Haltbarkeit und Widerstandsfähigkeit gegen proteolytischen Abbau in vivo) oder posttranslationale Modifikationen vorgenommen werden. Solche modifizierten Peptide, wenn sie zur Beibehaltung von mindestens einer Aktivität der natürlich vorkommenden Form des Proteins oder zur Herstellung spezifischer Antagonisten davon bestimmt sind, werden als funktionelle Äquivalente der HIP-Polypeptide in Betracht gezogen (obwohl sie für die Bioaktivitäten des authentischen Proteins agonistisch oder antagonistisch sein können). Solche modifizierten Peptide können zum Beispiel durch Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition, hergestellt werden.
Man kann zum Beispiel durchaus erwarten, dass ein isolierter Austausch eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonins durch ein Serin, oder ein ähnlicher Austausch einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure (das heißt isosterische und/oder isoelektrische Mutationen) keine bedeutende Wirkung auf die biologische Aktivität des sich ergebenden Moleküls ausüben wird. Ein konservativer Austausch stellt der dar, der innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfindet, die hinsichtlich ihrer Seitenketten verwandt sind. Genetisch codierte Aminosäuren können in vier Familien aufgeteilt werden: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht polar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal zusammen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Auf ähnliche Weise kann das Aminosäure-Repertoir wie folgt gruppiert werden: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin, (3) aliphatisch = Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, wobei Serin und Threonin optional getrennt als aliphatisches Hydroxyl gruppiert werden; (4) aromatisch = Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan; (5) Amid = Asparagin, Glutamin; und (6) schwefelhaltig = Cystein und Methionin, (siehe zum Beispiel, Biochemistry, 2. Aufl., Hrsg. L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981). Ob eine Änderung der Aminosäuresequenz eines Peptids in einem funktionellen HIP-Homolog resultiert (zum Beispiel funktionell im Sinne, dass das sich ergebende Polypeptid die authentische Form mimickt oder antagonisiert), kann ohne weiteres durch Beurteilung der Fähigkeit des varianten Peptids, eine Antwort in Zellen auf eine Weise hervorzwufen, die dem Wildtyp-Protein ähnlich ist, oder eine derartige Antwort kompetitiv inhibiert, bestimmt werden. Polypeptide, in denen mehr als ein Austausch stattgefunden hat, können ohne weiteres auf die gleiche Weise getestet werden.
Es wird erfindungsgemäß weiter ein Verfahren zur Bildung von Sets kombinatorischer Punkmutanten der erfindungsgemäßen HIP-Proteine ebenso wie Trunkationsmutanten in Betracht gezogen, und dies ist zur Identifikation potenzieller Varianten-Sequenzen (zum Beispiel Homologen) besonders nützlich, die beim Modulieren der Signaltransduktion und/oder der Ligandenbindung funktionell sind. Der Zweck des Screenings solcher kombinatorischer Bibliotheken besteht in der Generierung, von zum Beispiel neuen HIP-Homologen, die entweder als Agonisten oder Antagonisten wirken können, oder als Alternative alle zusammen neue Aktivitäten besitzen. HIP-Homologe können, zur Erläuterung, mithilfe des vorliegenden Verfahrens zur Bereitstellung einer selektiven, konstitutiven Aktivierung der Hedgehog-Aktivität, oder als Alternative, um für dominante negative Inhibitoren der HIP-abhängigen Signaltransduktion zu stehen, manipuliert werden. Die Mutagenese kann zum Beispiel HIP-Homologe bereitstellen, die fähig sind, extrazelluläre Liganden zu binden, jedoch nicht fähig sind, über intrazelluläre Regulationsproteine zu binden oder zu signalisieren.
In einem Aspekt dieses Verfahrens sind die Aminosäuresequenzen für eine Population von HIP-Homologen von unterschiedlichen Spezies oder anderen verwandten Proteinen, bevorzugt zur Förderung der höchstmöglichen Homologie, alignt. Eine derartige Varianten-Population kann zum Beispiel HIP-Homologe aus einer oder mehr Spezies einschließen. Aminosäuren, die an jeder Position der alignten Sequenzen in Erscheinung treten, werden zur Bildung einer degenerierten Reihe kombinatorischer Sequenzen ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vielfältige Bibliothek von HIP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf der Nucleinsäureebene generiert und wird durch eine vielfältige Genbibliothek codiert. So kann zum Beispiel ein Gemisch aus synthetischen Oligonucleotiden enzymatisch zu Gensequenzen dergestalt ligiert werden, dass die degenerierte Reihe potenzieller HIP-Sequenzen als individuelle Polypeptide, oder als Alternative als eine Reihe größerer Fusionsproteine (zum Beispiel zum Phagen-Display), enthaltend die Reihe von HIP-Sequenzen darin, exprimierbar sind.
In einer erläuternden Ausführungsform werden die in 1 alignten Sequenzen voller Länge verglichen, um eine degenerierte Bibliothek aus potenziellen HIP-Agonisten und -Antagonisten zu generieren. Eine Bibliothek aus HIP-Polypeptiden kann zum Beispiel generiert werden, um eine degenerierte Core-Polypeptidsequenz einzuschließen, die durch die folgende allgemeine Formel dargestellt ist:
worin jedes Auftreten von X unabhängig jedweden (natürlichen) Aminosäurerest darstellt, obwohl es bevorzugter einen Aminosäurerest (oder Gap) darstellt, der aus den Resten ausgewählt ist, die an der entsprechenden Position in den in 1 gezeigten Maus-, Menschen- oder Hühner-Proteinen vorkommen, oder eine konservative Substitution dafür, und noch bevorzugter einen Aminosäurerest (oder Gap) darstellt, der aus den Resten ausgewählt ist, die an der in 1 gezeigten entsprechenden Position in den Maus-, Menschen- oder Hühnerproteinen auftreten. Als für den Screening-Assay geeignet können die Polypeptide der Bibliothek eine Sekretionssignalsequenz und/oder eine sich von einem der HIP-Proteine herleitende C-terminale Membran-Anker-Sequenz einschließen.
In einer anderen Ausführungsform basiert die degenerierte Bibliothek auf dem Vergleich der Human- und Maussequenzen und kann eine degenerierte Core-Polypeptidsequenz einschließen, die durch die folgende allgemeine Formel dargestellt ist:
worin jedes Auftreten von X unabhängig von jedwedem (natürlichen) Aminosäurerest, obwohl bevorzugter einen Aminosäurerest (oder Gap) darstellt, aus den Resten ausgewählt ist, die an der in 1 gezeigten entsprechenden Position in den Maus- oder Menschenproteinen oder einer konservativen Substitution dafür vorkommen, und noch bevorzugter einen Aminosäurerest (oder Gap) darstellt, der aus den Resten ausgewählt ist, die an der entsprechenden Position in den in 1 gezeigten Maus- oder humanen Proteinen auftreten.
Es gibt viele Arten und Weisen, über die solche Bibliotheken von potenziellen HIP-Homologen aus einer degenerierten Oligonucleotidsequenz generiert werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatischen DNA-Synthesizer durchgeführt werden, und die synthetischen Gene dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Der Zweck einer degenerierten Reihe von Genen besteht darin, in einem Gemisch alle die Sequenzen bereitzustellen, die die gewünschte Reihe potenzieller HIP-Sequenzen codieren. Die Synthese von degenerierten Oligonucleotiden ist im Stand der Technik überall bekannt (siehe zum Beispiel Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1981), Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Hrsg. AG Walton. Amsterdam: Elsevier, S. 273–289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477. Solche Verfahren wurden in der gerichteten Evolution anderer Proteine eingesetzt (siehe zum Beispiel Scott et al. (1990) Science 249: 386–390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429–2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378–6382; ebenso wie US-Patente Nr. 5,223,409, 5,198,346 und 5,096,815).
Auf ähnliche Weise kann eine Bibliothek von Codiersequenz-Fragmenten für einen HIP-Clon bereitgestellt werden, um eine vielfältige Population von HIP-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Auswahl von bioaktiven Fragmenten zu generieren. Eine Reihe vieler verschiedener Verfahren sind im Stand der Technik zum Generieren solcher Bibliotheken, einschließlich der chemischen Synthese, bekannt. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von Codiersequenz-Fragmenten wie folgt generiert werden: (i) Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments von einer HIP-Codiersequenz mit einer Nuclease unter Bedingungen, worin Nicking nur ungefähr einmal pro Molekül auftritt; (ii) Denaturierung der doppelsträngigen DNA; (iii) Renaturierung der DNA zur Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen nicked Produkten einschließen kann; (iv) Entfernung einsträngiger Anteile aus „reformierten" Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuclease; und (v) Ligieren der sich ergebenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Anhand dieses beispielhaften Verfahrens kann eine Expressionsbibliothek hergeleitet werden, die für N-terminale, C-terminale und interne Fragmente verschiedener Größen codieren.
Im Stand der Technik sind eine Reihe vieler verschiedener Verfahren zum Screening von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken, die durch Punktinutationen oder Trunkation hergestellt werden, und zum Screening von cDNA-Bibliotheken auf Genprodukte mit einer bestimmten Eigenschaft bekannt. Solche Verfahren sind im Allgemeinen zum Schnellscreening der Genbibliotheken, die durch die kombinatorische Mutagenese von HIP-Homologen generiert wurden, adaptierbar. Die am verbreitetsten verwendeten Verfahren zum Screening großer Genbibliotheken umfassen in der Regel das Clonieren der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, wobei die geeigneten Zellen mit der resultierenden Bibliothek von Vektoren transformiert und die kombinatorischen Gene unter Bedingungen exprimiert werden, bei denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität eine relativ leichte Isolation des Vektors fördert, codierend das Gen, dessen Produkt nachgewiesen wurde.
In einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Bibliothek von HIP-Varianten als ein Fusionsprotein auf der Oberfläche eines Viruspartikels exprimiert und die Viruspartikel werden auf einer Hedgehog-Matrix dem „Panning" unterzogen. In dem filamentösen Phagensystem können zum Beispiel Fremdpeptidsequenzen auf der Oberfläche eines infektiösen Phagen exprimiert werden, wodurch zwei signifikante Vorteile verliehen werden. Erstens, da dieser Phage bei sehr hohen Konzentrationen auf Affinitätsmatrices appliziert werden kann, kann eine große Anzahl von Phagen gleichzeitig gescreent werden. Zweitens, da jeder infektiöse Phage das kombinatorische Genprodukt auf seiner Oberfläche aufweist, kann der Phage, wenn ein bestimmter Phage von einer Affinitätsmatrix in geringer Ausbeute zurückgewonnen wird, anhand einer anderen Infektionsrunde amplifiziert werden. Die Gruppe von fast identischen filamentösen Phagen M13, fd und fl von E. coli, die am häufigsten in Phagen-Display-Bibliotheken entweder als die Phagen gIII- oder gVIII-Hüllproteine verwendet werden, können zur Generierung von Fusionsproteinen, ohne Disruptieren der letztendlichen Verpackung des Viruspartikels verwendet werden (Ladner et al. PCT-Veröffentlichung WO 90/02909; Garrard et al. PCT-Veröffentlichung WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007–16010; Griffiths et al. (1993) EMBOJ 12: 725–734; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624–628; und Barbas et al. (1992) PNAS 89: 4457–4461). Das rekombinante Phagen-Antikörper-System (RPAS, Pharmacia Katalog-Nummer 27-9400-01) kann zum Beispiel zum Gebrauch bei der Expression und zum Screening von HIP-kombinatorischen Bibliotheken durch Panning auf Matrix-immobilisierte Hedgehog-Polypeptide zur Anreicherung für HIP-Homologe mit verbesserter Fähigkeit zur Bindung des Liganden leicht modifiziert werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Reduktion des HIP-Proteins zum Generieren von Mimetika, zum Beispiel Peptid- oder Nichtpeptidmitteln, die zum Disruptieren einer biologischen Aktivität eines erfindungsgemäßen HIP-Polypeptids, zum Beispiel als Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen, wie zum Beispiel mit Ligandenproteinen, fähig sind. Folglich sind solche, wie vorstehend beschriebenen, mutagenen Verfahren auch zur Kartierung der Determinanten der HIP-Proteine nützlich, die an den Protein-Protein-Interaktionen teilnehmen, die zum Beispiel an der Interaktion des erfindungsgemäßen HIP-Polypeptids mit Hedgehog-Polypeptiden beteiligt sind. Als Alternative kann ein ähnliches System zum Herleiten von Fragmenten aus einem Hedgehog-Protein verwendet werden, das an ein HIP-Protein bindet und die Bindung des Hedgehog-Proteins voller Länge kompetitiv inhibiert.
Zur weiteren Erläuterung sei angemerkt, dass die kritischen Reste von entweder einem HIP-Protein oder einem Hedgehog-Protein, die an der Molekülerkennung des anderen beteiligt sind, bestimmt und zur Generierung sich von HIP-herleitenden oder Hedgehog-herleitenden Peptidomimetika, welche die Interaktionen des Hedgehog-/HIP-Proteins kompetitiv inhibieren, verwendet werden können. Durch Einsatz von zum Beispiel der Scanning-Mutagenese zur Kartierung der Aminosäurereste eines Proteins, das an der Bindung anderer Proteine beteiligt ist, können Peptidomimetika generiert werden, welche diese Reste mimicken, die die Interaktion fördern. Solche Mimetika können dann zum Eingreifen in die normale Funktion eines HIP-Proteins (oder seines Liganden) verwendet werden. So können zum Beispiel nicht hydrolysierbare Peptid-Analoge von solchen Resten unter Verwendung von Benzodiazepin (siehe zum Beispiel Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leyden, Niederlande, 1988), Azepin (siehe zum Beispiel Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall, Hrsg. ESCOM Publisher: Leyden, Niederlande, 1988), substituierten γ-Lactamringen (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall, Hrsg., ESCOM Publisher: Leyden, Niederlande, 1988), Ketomethylen-Pseudopeptiden (Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295; und Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-Schleifen der Dipeptid-Cores (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; und Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231), und β-Aminoalkoholen (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419; und Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71) generiert werden.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft einen Antikörper, der mit einem HIP-Protein spezifisch reaktiv ist. Zum Beispiel können unter Verwendung von sich von einem HIP-Protein herleitenden Immunogenen, zum Beispiel basierend auf den cDNA-Sequenzen, Antiprotein-/Antipeptid-Antisera oder monoklonalen Antikörpern anhand von Standardprotokollen hergestellt werden (siehe zum Beispiel Antibodies: A Laboratory Manual, Hrsg. Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ein Säuger, wie zum Beispiel eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen können mit einer immunogenen Form des Peptids (zum Beispiel einem HIP-Polypeptid oder einem antigenen Fragment, das zur Auslösung einer Antikörper-Antwort fähig ist) immunisiert werden. Verfahren zur Verleihung von Immunogenizität an ein Protein oder an Peptide schließen die Konjugation an Träger oder andere im Stand der Technik überall bekannte Verfahren ein. Ein immunogener Anteil eines HIP-Proteins kann in Anwesenheit eines Adjuvans verabreicht werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann durch Nachweis von Antikörperlitern in Plasma oder Serum überwacht werden. Standardmäßige ELISA- oder andere Immunassays können mit dem Immunogen als Antigen zur Beurteilung der Antikörperspiegel verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antikörper immunspezifisch für Antigendeterminanten eines HIP-Proteins von einem Organismus, wie zum Beispiel von einem Säuger, zum Beispiel Antigendeterminanten von einem Protein, das durch SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 oder eng verwandte Homologe (zum Beispiel mindestens zu 70 % homolog, bevorzugt mindestens zu 80 % homolog und am bevorzugtesten mindestens zu 90 % homolog) dargestellt ist. In einer noch weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, um zum Beispiel Antikörper bereitzustellen, die für diskrete HIP-Homologe immunselektiv sind, weisen die anti-HIP-Polypeptid-Antikörper keine ausgeprägte Kreuzreaktion mit einem Protein auf (das heißt sie reagieren nicht spezifisch mit einem Protein), das zum Beispiel weniger als 85 %, 90 % oder 95 % homolog zu dem ausgewählten HIP ist Unter „keine ausgeprägte Kreuzreaktion" versteht man, dass der Antikörper eine Bindungsaffinität für ein nicht homologes Protein aufweist, welches mindestens eine Größenordnung, bevorzugter mindestens zwei Größenordnungen und noch bevorzugter mindestens drei Größenordnungen geringer als die Bindungsaffinität des Antikörpers für das beabsichtigte Target-HIP ist.
Nach der Immunisierung eines Tieres mit einer Antigen-Präparation aus einem HIP-Polypeptid können anti-HIP-Antisera gewonnen werden und gegebenenfalls polyklonale anti-HIP-Antikörper aus dem Serum isoliert werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können Antikörper-produzierende Zellen (Lymphocyten) aus einem immunisierten Tier geerntet und mithilfe von Standardverfahren zur Fusion somatischer Zellen mit immortalisierenden Zellen, wie zum Beispiel Myelomzellen, zum Erhalt von Hybridomzellen fusioniert werden. Derartige Verfahren sind im Stand der Technik überall bekannt und schließen zum Beispiel das Hybridom-Verfahren (ursprünglich entwickelt von Kohler und Milstein, (1975) Nature, 256: 495–497), das humane B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), und das EBV-Hybridom-Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) ein. Hybridomzellen können immunchemisch auf die Produktion von Antikörpern gscreent werden, die mit einem erfindungsgemäßen HIP-Polypeptid und monoklonalen Antikörpern, die aus einer Kultur isoliert werden, umfassend solche Hybridomzellen, spezifisch reaktiv sind.
Es ist beabsichtigt, dass der Begriff Antikörper, wie hierin verwendet, Fragmente davon einschließt, die auch mit einem HIP-Polypeptid spezifisch reaktiv sind. Die Antikörper können unter Verwendung üblicher Verfahren fragmentiert werden, und die Fragmente auf die gleiche Weise, wie vorstehend für ganze Antikörper beschrieben wurde, auf Nützlichkeit gescreent werden. F(ab)₂-Fragmente können zum Beispiel durch Behandlung der Antikörper mit Pepsin generiert werden. Das resultierende F(ab)₂-Fragment kann zur Reduktion der Disulfidbrücken zur Herstellung von Fab-Fragmenten behandelt werden. Es wird weiter beabsichtigt, dass der erfindungsgemäße Antikörper bispezifische und chimäre Moleküle mit einer Affinität zu einem HIP-Protein einschließen soll, die durch mindestens eine CDR-Region des Antikörpers verliehen wird.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper (Ak), die gegen authentische HIP-Polypeptide, oder HIP-Varianten gerichtet sind, und Antikörper- Fragmente, wie zum Beispiel Fab, F(ab)₂, Fv und scFv, können zur Blockierung der Wirkung eines HIP-Proteins verwendet werden und ermöglichen die Untersuchung der Rolle dieser Proteine, zum Beispiel bei der Differenzierung von Gewebe. Experimente dieser Art können bei der Abklärung der Rolle der HIP-Proteine helfen, die an der Kontrolle der Proliferation versus Differenzierung, zum Beispiel bei der Musterbildung und der Gewebebildung beteiligt sein können.
Antikörper, die spezifisch HIP-Epitope binden, können auch zur immunhistochemischen Färbung von Gewebeproben verwendet werden, um die Fülle und das Muster der Expression von jedem der erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide zu bewerten. Anti-HIP-Antikörper können diagnostisch bei der Immunpräzipitation und dem Immunblotting zum Nachweis und zur Bewertung von HIP-Proteinspiegeln im Gewebe als ein Teil eines klinischen Testverfahrens verwendet werden. Solche Messungen können zum Beispiel bei prädiktiven Bewertungen für den Beginn oder die Progression proliferativer oder differenzierender Erkrankungen nützlich sein. Auf ähnliche Weise kann die Fähigkeit zur Überwachung von HIP-Proteinspiegeln in einem Individuum die Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsregimes für ein an einer solchen Erkrankung leidenden Individuums ermöglichen. Der Spiegel von HIP-Polypeptiden kann von sich in der Körperflüssigkeit befindenden Zellen, zum Beispiel in Cerebospinal- oder Amnionflüssigkeitsproben, gemessen werden, oder kann zum Beispiel in mithilfe der Biopsie gewonnenem Gewebe gemessen werden. Diagnostische Assays unter Verwendung von anti-HIP-Antikörpern können zum Beispiel Immunassays einschließen, die zur Unterstützung bei der Frühdiagnose einer Krankheit, insbesondere derjenigen, die bei der Geburt manifest sind, bestimmt werden. Diagnostische Assays unter Verwendung von anti-HIP-Polypeptid-Antikörpern können auch Immunassays einschließen, die zur Unterstützung bei der Frühdiagnose und der Phänotypisierung neoplastischer oder hyperplastischer Erkrankungen bestimmt sind.
Eine andere Anwendung für erfindungsgemäße anti-HIP-Antikörper besteht im immunologischen Screening von cDNA-Bibliotheken, die in Expressionsvektoren, wie zum Beispiel λgt11, λgt18-23, γZAP und λORF8, aufgebaut sind. Boten-Bibliotheken von diesem Typ mit im korrekten Leserahmen und in der korrekten Orientierung insertierter Codiersequenz können Fusionsproteine produzieren. So produziert λgt11 zum Beispiel Fusionsproteine, deren Aminotermini aus β-Galactosidase-Aminosäuresequenzen und deren Carboxytermini aus einem Fremdpolypeptid bestehen. Antigen-Epitope eines HIP-Proteins, zum Beispiel Orthologe des HIP-Proteins von anderen Spezies, können dann mit Antikörpern, wie zum Beispiel von infizierten Platten mit anti-HIP-Antikörpern abgehobenen reagierenden Nitrocellulosefiltern nachgewiesen werden. Der anhand dieses Assays nachgewiesene positive Phage kann dann von der infizierten Platte isoliert werden. Folglich kann die Anwesenheit von HIP-Homologen genauso nachgewiesen und aus anderen Tieren cloniert werden, wie dies auch mit alternativen Isoformen (einschließlich Spleißvarianten) von Menschen der Fall ist.
Überdies ermöglichen die aus der Clonierung von HIP-Genen aus Organismen bestimmten Nucleotidsequenzen die Generierung von Sonden und Primern, die zum Gebrauch bei der Identifizierung und/oder Clonierung von HIP-Homologen in anderen Zelltypen, zum Beispiel aus anderen Geweben, ebenso wie HIP-Homologen aus anderen Organismen, bestimmt sind. Gegenstand der Erfindung ist zum Beispiel auch die Bereitstellung einer Sonde/eines Primers, umfassend ein im Wesentlichen gereinigtes Oligonucleotid, welches Oligonucleotid eine Region aus einer Nucleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an mindestens 15 konsekutive Nucleotide einer Sense- oder Antisense-Sequenz hybridisiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder natürlich vorkommende Mutanten davon. Primer, die zum Beispiel auf der Nucleinsäure basieren, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, können in PCR-Reaktionen zum Clonieren von HIP-Homologen verwendet werden. Auf ähnliche Weise können auf den erfindungsgemäßen HIP-Sequenzen basierende Sonden zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, codierend die gleichen oder homologe Proteine, verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde weiter eine Markierungsgruppe, die daran gebunden ist und nachgewiesen werden kann, zum Beispiel wird die Markierungsgruppe aus unter Radioisotopen, Fluoreszenzverbindungen, Enzymen und Enzym-Cofaktoren ausgewählt.
Derartige Sonden können auch als ein Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifikation von Zellen oder Gewebe verwendet werden, die ein HIP-Protein missexprimieren, wie zum Beispiel durch Messen eines Spiegels einer HIP-codierenden Nucleinsäure in einer Zellprobe aus einem Tierpatienten; zum Beispiel zum Nachweis von HIP-mRNA-Spiegeln oder Bestimmung, ob ein genomisches HIP-Gen mutiert oder deletiert ist.
Zur Erläuterung sei angemerkt, das Nucleotidsonden aus den erfindungsgemäßen HIP-Genen generiert werden können, welche das histologische Screening von intaktem Gewebe und Gewebeproben auf die Anwesenheit (oder Abwesenheit) von HIP-codierenden Transkripten fördern. Ähnlich den diagnostischen Verwendungszwecken von anti-HIP-Antikörpern kann die Verwendung von Sonden, die auf die HIP-Botschaften oder auf genomische HIP-Sequenzen gerichtet sind, sowohl für die prädiktive als auch therapeutische Bewertung von Allelen-Mutationen verwendet werden, die zum Beispiel in degenerativen Erkrankungen, die durch Verlust bestimmter Zelltypen, Apoptose, neoplastische und/oder hyperplastische Erkrankungen (zum Beispiel unerwünschtes Zellwachstum) oder abnorme Differenzierung von Gewebe gekennzeichnet sind, manifest sein könnten. Wenn die Oligonucleotidsonden zusammen mit Immunassays, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, können sie bei der Erleichterung der Bestimmung der molekularen Basis für eine Entwicklungsstörung helfen, die einen gewissen Grad an mit der Expression assoziierter Abnormalität eines HIP-Proteins (oder einen Mangel davon) beinhalten kann. Eine Variation der Polypeptidsynthese kann zum Beispiel von einer Mutation in einer Codiersequenz differenziert werden.
Das vorliegende Verfahren stellt demzufolge ein Verfahren zur Bestimmung bereit, ob ein Individuum ein Erkrankungsrisiko aufweist, das durch aberrante Apoptose, Zellproliferation und/oder -differenzierung gekennzeichnet ist. In bevorzugten Ausführungsformen kann das Verfahren im Allgemeinen als der Nachweis in einer Zellprobe von dem Individuum, umfassend die An- oder Abwesenheit einer genetischen Läsion, durch mindestens eines von Folgendem gekennzeichnet sein: (i) einer Veränderung, die sich auf die Integrität eines Gens auswirkt, codierend ein HIP-Protein, oder (ii) die Missexpression des HIP-Gens. Es sei erläuternd angemerkt, dass derartige genetische Läsionen durch Ermittlung des Vorliegens von mindestens einem von Folgendem nachgewiesen werden kann: (i) einer Deletion von einem oder mehr Nucleotid(en) aus einem HIP-Gen, (ii) einer Addition von einem oder mehr Nucleotid(en) an ein HIP-Gen, (iii) einer Substitution von einem oder mehr Nucleotid(en) von einem HIP-Gen, (iv) einem makroskopischen chromosomalen Rearrangement von einem HIP-Gen, (v) einer makroskopischen Veränderung des Spiegels von einem Messenger-RNA-Transkript von einem HIP-Gen, (vii) einer aberranten Modifikation von einem HIP-Gen, wie zum Beispiel des Methylierungsmusters der genomischen DNA, (vii) der Anwesenheit eines Nichtwildtyp-Spleißmusters von einem Boten-RNA-Transkript von einem HIP-Gen, (viii) einem Nichtwildtyp-Spiegel von einem HIP-Protein und (ix) einer unangemessenen posttranslationalen Modifikation von einem HIP-Protein. Gegenstand der Erfindung ist, wie nachstehend dargelegt ist, die Bereitstellung einer großen Anzahl an Assay-Verfahren zum Nachweis von Läsionen in einem HIP-Gen, und besonders wichtig, die Bereitstellung der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen molekularen Ursachen, welche dem HIP-abhängigen aberranten Zellwachstum, der Proliferation und/oder Differenzierung zu Grunde liegen, eine bedeutende Rolle spielt.
In einer beispielhaften Ausführungsform ist eine Nucleinsäure-Zsuammensetzung bereitgestellt, umfassend eine (gereinigte) Oligonucleotidsonde, die eine Region einer Nucleotidsequenz einschließt, die zur Hybridisierung einer Sense- oder Antisense-Sequenz von einem HIP-Gen fähig ist, wie es zum Beispiel durch jedwede eine von SEQ ID NO: 1–4 und 9–14, oder natürlich vorkommende Mutanten davon, oder 5'-oder 3'-flankierende Sequenzen oder Intronsequenzen, die natürlich mit den erfindungsgemäßen HIP-Genen assoziiert sind oder natürlich vorkommende Mutanten davon, dargestellt ist. Die Nucleinsäure einer Zelle wird für die Hybridisierung zugänglich gemacht, die Sonde wird der Nucleinsäure der Probe ausgesetzt, und die Hybridisierung der Sonde an die Nucleinsäure in der Probe wird nachgewiesen. Solche Verfahren können zum Nachweis von Läsionen an entweder dem genomischen Spiegel oder dem mRNA-Spiegel, einschließlich Deletionen, Substitutionen usw., ebenso wie zur Bestimmung der mRNA-Transkriptspiegel verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Nachweis der Läsion die Verwendung der Sonde/des Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202), wie zum Beispiel Anker-PCR oder RACE-PCR oder als Alternative in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe zum Beispiel Landegran et al. (1988) Science 241: 1077–1080; und Nakazawa et al. (1944) PNAS 91: 360–364), wobei die letztere besonders nützlich zum Nachweis von Punktmutationen im HIP-Gen sein kann. In einer lediglich erläuternden Ausführungsform schließt das Verfahren die folgenden Schritte ein: (i) Sammeln einer Zellprobe von einem Patienten, (ii) Isolieren der Nucleinsäure (zum Beispiel genomisch, mRNA oder beides) aus den Zellen der Probe, (iii) Kontaktieren der Nucleinsäureprobe mit einem oder mehr Primer(n), die spezifisch an ein HIP-Gen unter Bedingungen dergestalt hybridisieren, dass die Hybridisierung und Amplifikation des HIP-Gens (wenn anwesend) auftritt, und (iv) Nachweis der An- oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder Nachweis der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleich der Länge mit einer Kontrollprobe.
In einer noch anderen Ausführungsform kann der Spiegel von einem HIP-Protein mithilfe eines Immunassays nachgewiesen werden. So können zum Beispiel die Zellen einer Biopsie-Probe lysiert werden, und der Spiegel eines in der Zelle vorliegenden HIP-Proteins kann mithilfe von standardmäßigen Immunassay-Verfahren quantifiziert werden. In einer noch anderen beispielhaften Ausführungsform können aberrante Methylierungsmuster eines HIP-Gens durch Verdau der genomischen DNA aus einer Patientenprobe mit einer oder mehr Restriktionsendonuclease(n) nachgewiesen werden, die für die Methylierung empfindlich sind und für die Erkennungsstellen im HIP-Gen (einschließlich in den flankierenden Sequenzen und Intronsequenzen) existieren. Siehe zum Beispiel Buiting et al. (1994) Human Mol Genet 3: 893–895. Die verdaute DNA wird mithilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt und mit sich von zum Beispiel genomischen Sequenzen oder cDNA-Sequenzen herleitenden Sonden hybridisiert. Der Methylierungszustand des HIP-Gens kann durch Vergleich des Restriktionsmusters, das aus der Proben-DNA generiert wird, mit dem für einen Standard einer bekannten Methylierung bestimmt werden.
In noch anderen Ausführungsformen kann die Ligandenbindungsdomäne des HIP- Receptors zum quantitativen Nachweis des Spiegels von HIP-Liganden, zum Beispiel Hedgehog-Proteinen verwendet werden. Erläuternd sei angemerkt, dass eine lösliche Form des HIP-Proteins gebildet werden kann, das die Hedgehog-Bindungsaktivität beibehält. Proben von Körperflüssigkeit(en), zum Beispiel Plasma, Serum, Lymphe, Mark, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin und dergleichen können mit dem Receptor unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, worin die Liganden-/Receptorbindung auftreten kann, und der Spiegel der gebildeten Liganden-/Receptorkomplexe kann mithilfe von jedwedem unter einer Reihe vieler verschiedener im Stand der Technik bekannter Verfahren nachgewiesen werden. So können zum Beispiel kompetitive Bindungsassays unter Verwendung standardisierter Hedgehog-Proteinproben zur Quantifizierung der Menge des aus der Flüssigkeitsprobe gebundenen Analyten verwendet werden.
In noch anderen Ausführungsformen können derartige HIP-Receptoren zum Nachweis der Anwesenheit eines HIP-Liganden auf einer Zelloberfläche verwendet werden. Das HIP-Protein kann zum Beispiel mit Zellen von einer Biopsie in Kontakt gebracht werden, und die Fähigkeit des HIP-Proteins zur „Dekoration" bestimmter Zellen in der Probe wird ermittelt. Die Bindung des HIP-Proteins an Zellpopulationen der Probe kann zum Beispiel durch die Verwendung von Antikörpern gegen das HIP-Protein oder durch den Nachweis einer mit dem HIP-Protein assoziierten Markierung nachgewiesen werden. Im Fall des Letzteren kann das HIP-Protein zum Beispiel durch chemische Modifikation oder als ein Fusionsprotein markiert werden. Beispielhafte Markierungen schließen Radioisotope, Fluoreszenz-Verbindungen, Enzym-Cofaktoren, die durch chemische Modifikation des Proteins zugefügt werden können, und Epitop-Tags, wie zum Beispiel myc, pFLAG und dergleichen, oder enzymatische Aktivitäten, wie zum Beispiel GST oder alkalische Phosphatase, die entweder durch chemische Modifikation oder durch Generierung eines Fusionsproteins zugefügt werden können, ein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist überdies auch der Nachweis von löslichen Formen des HIP-Receptors in Körperflüssigkeitsproben. Wie im Stand der Technik beschrieben wird, siehe zum Beispiel Diez-Ruiz et al. (1995) Eur J Haematol 54: 1–8 und Owen-Schaub et al. (1995) Cancer Lett 94: 1–8, [worin CNTF-Receptoren beschrieben sind] besteht die Annahme, dass in bestimmten Fällen lösliche Formen von Receptoren eine Rolle als Modulatoren der biologischen Funktion ihrer verwandten Liganden in einem Agonisten-/Antagonistenmuster spielen. In verschiedenen pathologischen Zuständen kann die Produktion und Freisetzung von löslichen HIP-Proteinen die Antwort des Wirts vermitteln und den Verlauf und Ausgang der Erkrankung durch Interaktion mit HIP-Liganden und Konkurrieren mit Zelloberflächen-Receptoren bestimmen. Bei der Bestimmung von löslichen HIP-Receptoren in Körperflüssigkeiten handelt es sich um ein neues Werkzeug zum Gewinn von Informationen über verschiedene Krankheitszustände und kann für einen Kliniker von prognostischem Wert sein. Der Spiegel von löslichem HIP-Protein in einer Körperflüssigkeit kann zum Beispiel nützliche Informationen zur Überwachung von unter anderem neurologischen Erkrankungen ebenso wie in der Behandlung neoplastischer oder hyperplastischer Transformationen von ektodermalem, mesodermalem oder entodermalem Ursprung vermitteln.
Der Spiegel des in einer gegebenen Probe vorliegenden löslichen Receptors kann angesichts der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung bekannter Verfahren und Techniken quantifiziert werden. Antikörper, die zum Beispiel für die Ligandenbindungsdomäne des HIP-Proteins immunselektiv sind, können zum Nachweis und zur Quantifizierung seines Vorliegens in einer Probe, zum Beispiel durch überall bekannte Immunassay-Verfahren, nachgewiesen werden. Als Alternative kann zum Nachweis des Vorliegens des Receptors in der Flüssigkeitsprobe ein markierter Ligand des Receptors verwendet werden.
Im Stand der Technik liegen eine Anzahl von Verfahren zur nunmehrigen Identifikation zusätzlicher Liganden am HIP-Receptor vor. Die Expression-Clonierung kann zum Beispiel an einer DNA- oder genomischen Bibliothek durch Isolieren von mit einer markierten Form des Receptors „dekorierten" Zellen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren den HIP-Receptor in einem In-situ-Assay zum Nachweis von HIP-Liganden in Gewebeproben und intakten Organismen. Im Allgemeinen beinhaltet der nachstehend beschriebene RAP-in-situ-Assay (RAP steht für Receptor-Affinity Probe) von Flanagan und Leder (siehe PCT-Veröffentlichung WO 92/06220; und auch Cheng et al. (1994) Cell 79: 157–168) die Verwendung eines Expressions-Clonierungs-Systems, wobei der HIP-Ligand durch die Vergabe eines Scores auf der Basis der Bindung an ein HIP-/alkalische Phosphatase-Fusionsprotein bewertet wird. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren Folgendes: (i) Bereitstellung eines Hybridmoleküls (die Affinitätssonde), einschließlich des HIP-Receptors, oder mindestens der Ligandenbindungsdomäne davon, die kovalent an ein enzymatisch aktives Tag gebunden ist, für das bevorzugt chromogene Substrate existieren, (ii) Kontaktieren des Gewebes oder Organismus mit der Affinitätssonde zur Bildung von Komplexen zwischen der Sonde und einem verwandten Liganden in der Probe, wobei die ungebundene Sonde entfernt wird und (iii) Nachweis des Affinitätskomplexes unter Verwendung eines chromogenen Substrats für die mit der Affinitätssonde assoziierte enzymatische Aktivität.
Im Gegensatz zu anderen Verfahren im Stand der Technik, die nur an dispergierten Zellkulturen durchgeführt werden, stellt dieses Verfahren ein Mittel zum Sondieren nicht dispergierter und des intakten fixierten Gewebes („wholemount" Gewebe) und auch von Tierproben bereit. Das Verfahren kann zusätzlich zur Förderung der Clonierung von HIP-Liganden auch zum Nachweis von Expressionsmustern für bestimmte Liganden des HIP-Rezeptors, zur Messung der Affinität von Receptor-/Liganden-Interaktionen in Gewebeproben ebenso wie für die Generierung von Arzneimittel-Screening-Assays in Gewebeproben verwendet werden. Die Affinititätsonde kann überdies auch beim diagnostischen Screening zur Bestimmung, ob ein HIP-Ligand missexprimiert wird, Verwendung finden.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt können die erfindungsgemäßen HIP-Polypeptide zur Generierung eines „Zwei-Hybrid-Assays" oder eines „Interaction Trap"-Assays (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und Brent WO94/10300), zur Isolation von Codiersequenzen für andere Proteine, die HIPs ("HIP-Bindungsproteine" oder „HIP-bp") binden, verwendet werden.
Kurz zusammengefasst sei angemerkt, dass sich der „Interaction Trap" auf die Rekonstitution in vivo eines funktionellen transkriptionalen Aktivatorproteins aus zwei separaten Fusionsproteinen verlässt. Das Verfahren macht insbesondere Gebrauch von chimären Genen, die Hybridproteine exprimieren. Zur Erläuterung sei angemerkt, dass ein erstes Hybrid-Gen die Codiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne eines transkriptionalen Aktivators, fusioniert in Frame an die Codiersequenz für ein HIP-Polypeptid umfasst. Das zweite Hybridprotein codiert eine transkriptionale Aktivierungsdomäne, fusioniert in Frame an ein Proben-Gen aus einer cDNA-Bibliothek. Wenn die Köder- und Proben-Hybridproteine zur Interaktion, zum Beispiel zur Bildung eines HIP-abhängigen Komplexes, fähig sind, bringen sie die beiden Domänen des transkriptionalen Aktivators in enge Proximität zueinander. Diese Proximität ist ausreichend, um die Transkription eines Reportergens, das mit einem transkriptionalen Regulationsort, der für den transkriptionalen Aktivator responsiv ist, funktionsfähig verknüpft ist, zu veranlassen, und die Expression des Reportergens kann nachgewiesen und zur Vergabe eines Scores für die Interaktion der HIP- und Probenproteine verwendet werden.
Durch Zurverfügungstellung gereinigter und rekombinanter erfindungsgemäßer HIP-Polypeptide wird überdies die Entwicklung von Assays gefördert, die zum Screening auf Arzneimittel, die entweder Agonisten oder Antagonisten der normalen Zellfunktion der erfindungsgemäßen HIP-Proteine darstellen, oder in ihrer Rolle bei der Pathogenese der Zellerhaltung, Differenzierung und/oder Proliferation und damit verwandten Erkrankungen, verwendet werden können. Im allgemeinen Sinne bewertet der Assay die Fähigkeit einer Verbindung zur Modulation der Bindung zwischen einem HIP-Polypeptid und einem Molekül, zum Beispiel einem Liganden, wie zum Beispiel einem Hedgehog-Protein, das mit dem HIP-Polypeptid interagiert. Beispielhafte Verbindungen, die gegen solche HIP-vermittelten Interaktionen gescreent werden können, schließen Peptide, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, kleine organische Moleküle und Naturproduktextrakt-Bibliotheken, wie zum Beispiel aus Tieren, Pflanzen, Pilzen und/oder Mikroben isolierte ein.
In vielen Arzneimittel-Screening-Programmen, die Bibliotheken von Verbindungen und Naturextrakten testen, sind Hochdurchsatz-Assays zur Maximierung der Anzahl an Verbindungen, die in einer gegebenen Zeitperiode durchmustert werden können, wünschenswert. Assays, die in zellfreien Systemen durchgeführt werden, die zum Beispiel von gereinigten oder semigereinigten Proteinen hergeleitet werden können, sind häufig als „primäre" Screens dahingehend bevorzugt, dass sie zur Ermöglichung der schnellen Entwicklung und des relativ leichten Nachweises einer Veränderung in einem molekularen Target, das durch eine Testverbindung vermittelt wird, generiert werden können. Die Wirkungen der Zelltoxizität und/oder der Bioverfügbarkeit der Testverbindung können überdies im Allgemeinen im In-vitro-System ignoriert werden, wobei der Assay anstelle dessen primär auf die Wirkung des Arzneimittels auf das molekulare Target fokussiert wird, wie in einer Veränderung der Bindungsaffinität mit einem Liganden manifest werden kann. Demzufolge wird in einem beispielhaften erfindungsgemäßen Screening-Assay ein Reaktionsgemisch generiert, das ein HIP-Polypeptid, (eine) Verbindungen) von Interesse und ein „Targetmolekül", zum Beispiel ein Protein einschließt, das mit dem HIP-Polypeptid interagiert. Beispielhafte Targetmoleküle schließen Liganden, wie zum Beispiel Hedgehog-Proteine ebenso wie andere Peptid- und Nichtpeptid-Interaktionsmoleküle ein. Der Nachweis und die Quantifizierung der Interaktion des HIP-Polypeptids mit dem Targetmolekül stellt ein Mittel zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Verbindung bei der Inhibition (oder Potenzierung) der Interaktion zwischen dem HIP- und dem Targetmolekül bereit. Die Wirksamkeit der Verbindung kann durch Erstellung von Dosis-Wirkungskurven von Daten, die unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Testverbindung erhalten werden, beurteilt werden. Darüber hinausgehend kann auch ein Kontrollassay zur Bereitstellung einer Baseline zum Vergleich durchgeführt werden. Im Kontrollassay wird die Interaktion des HIP-Polypeptids und Targetmoleküls in Abwesenheit der Testverbindung quantifiziert.
Die Interaktion zwischen dem HIP-Polypeptid und dem Targetmolekül kann mittels einer Reihe verschiedener Verfahren nachgewiesen werden. Die Modulation der Bildung von Komplexen kann unter Verwendung von zum Beispiel nachweisbar markierten Proteinen, wie zum Beispiel radiomarkierter, fluoreszenzmarkierter oder enzymatisch markierter HIP-Polypeptide, durch einen Immunassay, durch chromatographischen Nachweis oder durch Nachweis der intrinsischen Aktivität der Acetylase, quantifiziert werden.
In der Regel ist es wünschenswert, entweder das HIP- oder das Targetmolekül zu immobilisieren, um die Trennung von Komplexen aus nicht komplexierten Formen von einem oder beiden Proteinen) zu erleichtern, ebenso wie der Automatisierung des Assays Rechnung zu tragen. Die Bindung von HIP an das Targetmolekül, in An- und Abwesenheit eines Kandidatenmittels kann in jedwedem für die Aufnahme der Reaktanten geeigneten Behältnis erreicht werden. Zu Beispielen gehören: Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne zufügt, die Bindung des Proteins an eine Matrix zulässt. So können zum Beispiel Glutathion-S-Transferase/HIP-Fusionsproteine (GST/HIP-Fusionsproteine) an Glutathion-Sepharose-Beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit den Zelllysaten, zum Beispiel einer ³⁵S-markierten und der Testverbindung kombiniert werden, und das Gemisch unter Bedingungen inkubiert wird, die der Komplexbildung, zum Beispiel bei physiologischen Bedingungen für Salz und pH, förderlich sein können, obwohl geringgradig stringentere Bedingungen gegebenenfalls erwünscht sein könnten. Nach der Inkubation werden die Beads zur Entfernung von jedweder ungebundenen Markierung gewaschen und die Matrix immobilisiert und die Radiomarkierung direkt (zum Beispiel indem die Beads in eine Szintillationslösung gegeben werden) oder im Überstand bestimmt, nachdem die Komplexe anschließend dissoziiert worden sind. Als Alternative können die Komplexe von der Matrix dissoziiert und durch SDS-PAGE getrennt und der Spiegel des in der Bead-Fraktion gefundenen Targetmoleküls aus dem Gel unter Verwendung von standardmäßigen elektrophoretischen Verfahren quantifiziert werden.
Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen und anderen Molekülen auf den Matrices stehen auch zur Verwendung im erfindungsgemäßen Assay zur Verfügung. So kann zum Beispiel entweder das HIP- oder das Targetmolekül unter Verwendung der Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte HIP-Moleküle können zum Beispiel aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von im Stand der Technik überall bekannten Verfahren (zum Beispiel mit dem Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) hergestellt und in den Vertiefungen von mit Streptavidin-beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Als Alternative können mit HIP reaktive Antikörper, die aber nicht in die Interaktion zwischen dem HIP- und Targetmolekül eingreifen, an die Vertiefungen der Platte derivatisiert und HIP in den Vertiefungen durch Antikörperkonjugation festgehalten werden. Wie vorstehend werden die Präparationen eines Targetmoleküls und einer Testverbindung in den HIP-präsentierenden Vertiefungen der Platte inkubiert, und die Menge des in der Vertiefung festgehaltenen Komplexes kann quantifiziert werden. Beispielhafte Verfahren zum Nachweis solcher Komplexe, zusätzlich zu den vorstehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschriebenen, schließen die Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von mit dem Targetmolekül reaktiven Antikörpern oder die mit dem HIP-Protein reaktiv sind und mit dem Targetmolekül konkurrieren, ebenso wie Enzyme-linked-Assays, die sich auf den Nachweis einer mit dem Targetmolekül assoziierten enzymatischen Aktivität, entweder intrinsischen oder extrinsischen Aktivität verlassen, ein. Im Fall des Letzteren kann das Enzym chemisch konjugiert oder als ein Fusionsprotein mit dem Targetmolekül bereitgestellt werden. Erläuternd sei angemerkt, dass das Targetmolekül chemisch vernetzt oder mit Meerrettichperoxidase (wenn es sich um ein Polypeptid handelt) genetisch fusioniert werden kann, und die Menge des im Komplex eingeschlossenen Polypeptids kann mit einem chromogenen Substrat des Enzyms, zum Beispiel mit 3,3'-Diaminobenzadin-tetrahydrochlorid oder 4-Chlor-1-napthol beurteilt werden. Auf ähnliche Weise kann ein Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid und die Glutathion-S-Transferase, bereitgestellt und die Komplexbildung durch Nachweis der GTS-Aktivität unter Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzen quantifiziert werden (Habig et al (1974) J Biol Chem 249: 7130).
Für Verfahren, die sich auf die Immundetektion zur Quantifizierung von in den Komplex eingeschlossenen Proteine verlassen, können Antikörper gegen das Protein, wie zum Beispiel anti-HIP-Antikörper, verwendet werden. Als Alternative, kann das nachzuweisende Protein im Komplex in der Form eines Fusionsproteins, das zusätzlich zur HIP-Sequenz ein zweites Polypeptid einschließt, für das Antikörper (zum Beispiel aus gewerblichen Quellen) ohne weiteres verfügbar sind, „Epitop-getagged" werden. Die vorstehend beschriebenen GST-Fusionsproteine können zum Beispiel auch für die Quantifizierung der Bindung unter Verwendung von Antikörpern gegen die GST-Komponente verwendet werden. Andere nützliche Epitop-Tags schließen myc-Epitope (siehe zum Beispiel Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266: 21150–21157) ein, die eine aus 10 Resten bestehende Sequenz aus c-myc ebenso wie das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.) oder das pEZZ-Protein-A-System (Pharamacia, NJ) einschließen.
Ein beispielhafter erfindungsgemäßer Arzneimittel-Screening-Assay schließt die folgenden Schritte ein: (a) Bildung eines Reaktionsgemischs, einschließlich: (i) eines Hedgehog-Polypeptids, (ii) eines HIP-Polypeptids und (iii) einer Testverbindung; und (b) Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide. Eine statistisch signifikante Änderung (Potenzierung oder Inhibition) hinsichtlich der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide in Anwesenheit der Testverbindung in Bezug auf die Interaktion in Abwesenheit der Testverbindung deutet auf einen potenziellen Agonisten (Mimetikum oder Potenziator) oder Antagonist (Inhibitor) der Hedgehog-Bioaktivität für die Testverbindung hin. Das Reaktionsgemisch kann eine zellfreie Proteinpräparation, zum Beispiel ein rekonstituiertes Proteingemisch oder ein Zelllysat darstellen, oder es kann eine rekombinante Zelle, einschließlich einer heterologen Nucleinsäure, die das HIP-Polypeptid rekombinant exprimiert, darstellen.
Wenn das HIP-Polypeptid als ein Teil eines einen Hedgehog-Receptor bildenden oligomeren Komplexes partizipiert, welcher Komplex zum Beispiel andere Protein-Untereinheiten einschließt, kann das zellfreie System, wie zum Beispiel eine Zellmembranpräparation, ein rekonstituiertes Proteingemisch oder ein Liposom, das die Receptor-Untereinheiten als einen Hedgehog-Receptor rekonstituiert, darstellen. Als Alternative können liposomale Präparationen unter Verwendung eines rekonstituierten HIP-Proteins verwendet werden. Die Protein-Unterheiten eines Hedgehog-Receptor-Komplexes können aus Detergens-Extrakten von sowohl authentischer als auch rekombinanter Herkunft gereinigt werden, können in artifiziellen Lipidvesikeln (zum Beispiel Phosphatidylcholin-Liposomen) oder in sich von Zellmembranenherleitenden Vesikeln rekonstituiert werden (siehe zum Beispiel Bear et al. (1992) Cell 68: 809–818; Newton et al. (1983) Biochemistry 22: 6110–6117; und Reber et al. (1987) J Biol Chem 262: 11369–11374). Die lamellare Struktur und Größe der sich ergebenden Liposomen können mithilfe des Elektronenmiskroskops charakterisiert werden. Die externe Orientierung des HIP-Proteins in den rekonstituierten Membranen kann zum Beispiel mithilfe der Immunelektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Die Interaktion eines Hedgehog-Proteins mit Liposomen, enthaltend solche HIP-Komplexe, und Liposomen ohne das Protein, in Anwesenheit der Kandidatenmittel, können zur Identifikation potenzieller Modulatoren der Hedgehog-HIP-Polypeptid-Interaktion verglichen werden.
In einer noch anderen Ausführungsform leitet sich der Arzneimittel-Screening-Assay dergestalt her, dass er eine intakte Zelle einschließt, die ein HIP-Polypeptid exprimiert. Die Fähigkeit eines Testmittels zur Veränderung der Aktivität des HIP-Proteins kann mittels der Analyse der rekombinanten Zelle nachgewiesen werden. So lassen sich zum Beispiel Agonisten und Antagonisten der biologischen HIP-Aktivität durch Vergabe von Scores für Veränderungen des Wachstums oder der Differenzierung (Phänotyp) der Zelle nachweisen. Allgemeine Verfahren zum Nachweis von jedem sind überall bekannt und variieren in Bezug auf die Quelle der in jedwedem gegebenen Assay verwendeten entsprechenden Reagenzzelle. Für die zellbasierenden Assays stellt die rekombinante Zelle bevorzugt eine Metazoon-Zelle, zum Beispiel eine Säugerzelle, zum Beispiel eine Insektenzelle, zum Beispiel eine Xenopus-Zelle, zum Beispiel einen Oocyt dar. In anderen Ausführungsformen kann der Hedgehog-Receptor in einer Hefezelle rekonstituiert werden.
In einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Zelle, die den HIP-Receptor exprimiert, zum Beispiel ungeachtet, ob endogen oder heterolog, mit einem Liganden des HIP-Receptors, zum Beispiel einem Hedgehog-Protein kontaktiert werden, das zur Induktion einer Signaltransduktion aus einem Receptor fähig ist, und das sich ergebende Signalisieren entweder an verschiedenen Punkten im Pfad oder auf der Basis einer phänotypischen Änderung an der Reagenzzelle nachgewiesen werden. In einer Ausführungsform wird die Reagenzzelle mit einem Antikörper kontaktiert, der eine Vernetzung des Receptors veranlasst, und die durch diese Vernetzung induzierte Signalkaskade wird anschließend nachgewiesen. Eine Testverbindung, die diesen Pfad moduliert, zum Beispiel potenziert oder inhibiert, kann durch Vergleich mit Kontrollexperimenten, denen entweder der Receptor oder die Testverbindung mangelt, nachgewiesen werden. Zur Bestimmung, ob die biologische Aktivität des targetierten HIP-Proteins durch das zugefügte Mittel beeinflusst wurde, kann zum Beispiel von der visuellen Inspektion der Morphologie der Reagenzzelle Gebrauch gemacht werden.
Zusätzlich zu morphologischen Studien können (eine) Änderungen) des Spiegels von einem intrazellulären zweiten Boten, der auf das Signalisieren durch das HIP-Polypeptid anspricht, nachgewiesen werden. Der Assay kann zum Beispiel in verschiedenen Ausführungsformen die Fähigkeit des Testmittels bei der Veranlassung von Veränderungen der Phosphorylierungsmuster, der Adenylat-Cyclase-Aktivität (cAMP-Produktion), der GTP-Hydrolyse, der Calcium-Mobilisierung und/oder der Phospholipidhydrolyse (IP₃, DAG-Produktion) nach der Stimulierung des Receptors beurteilen. Durch den Nachweis von Änderungen der intrazellulären Signale, wie zum Beispiel der Veränderungen in den zweiten Boten oder der Gen-Expression in Zellen, die mit einem Hedgehog-Polypeptid in Kontakt gebracht werden, können Kandidaten-Agonisten und -Antagonisten für das HIP-abhängige Hedgehog-Signalisieren identifiziert werden.
Die Transduktion bestimmter intrazellulärer Signale kann durch die spezifische Interaktion eines hh-Polypeptids mit HIP-Protein initiiert werden, während andere Signale durch diese Interaktion indirekt verändert werden können. In Drosophila- und vermutlich auch in Vertebratenzellen wurde eine Anzahl an Genprodukten, einschließlich HIP, Patched, des Transkriptionsfaktors Cubitus interruptus (ci), der Serin-/Threoninkinase Fused (fu) und der Genprodukte von Costal-2, Smoothened und Suppressor of Fused als putative Komponenten von Hedgehog-abhängigen Signaltransduktionspfaden impliziert. Das Clonieren von Vertebraten-Homologen von Drosophila-Genen in letzter Zeit weist darauf hin, dass der Hedgehog-Signalisierungspfad von Drosophila- zu Vertebraten-Spezies hoch konserviert ist. Die Aktivität von jedem dieser Proteine kann (wie zum Beispiel die Kinaseaktivität von Fused) direkt nachgewiesen werden, oder kann durch Überwachung des Spiegels der zweiten Boten, der stromabwärts im Signalpfad produziert wird, indirekt nachgewiesen werden.
Zur weiteren Erläuterung haben neuere Studien die Proteinkinase A (PKA) als mögliche Komponente des Hedgehog-Signalisierens in Drosophila- und Vertebraten-Organismen impliziert (Hammerschmidt et al. (1996) Genes & Dev 10: 647). Es wurde gezeigt, dass eine hohe PKA-Aktivität in diesen Systemen das Hedgehog-Signalisieren antagonisiert. Obwohl es unklar ist, ob PKA direkt stomabwärts oder parallel mit dem Hedgehog-Signalisieren wirkt, ist es möglich, dass Hedgehog-Signalisieren, das durch ein HIP-Protein auftritt, die Inhibition der PKA-Aktivität bewirkt. Folglich stellt der Nachweis der PKA-Aktivität eine potenzielle Ablesung für die vorliegenden Assays bereit.
Die Bindung von Hedgehog an HIP-Proteine kann die Aktivität von Phospholipasen stimulieren. Inositollipide können extrahiert und unter Verwendung von standardmäßigen Lipidextraktionsverfahren analysiert werden. Wasserlösliche Derivate von allen drei Inositollipiden (IP₁, IP₂, IP3) können unter Verwendung von Radiomarkierungsverfahren oder der HPLC auch quantifiziert werden.
Die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium oder der Influx von Calcium von der Außenseite der Zelle kann gegebenenfalls eine Antwort auf die Hedgehog-Stimulation oder einen Mangel davon darstellen. Die Messung des Calciumfluxes in der Reagenzzelle kann unter Verwendung von Standardverfahren erfolgen. Die Wahl des geeigneten Calcium-Indikators, fluoreszierend, biolumineszierend, metallochrom oder von Ca⁺⁺-sensitiven Mikroelektroden hängt vom Zelltyp und von der Größe und den Zeitkonstanten des untersuchten Ereignisses ab (Borle (1990) Environ Health Perspect 84: 45–56). Als beispielhaftes Verfahren des Ca⁺⁺-Nachweises könnten die Zellen mit dem Ca⁺⁺-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 oder Indo-1 unter Verwendung von Standardverfahren beladen und jedwede Änderung des Ca⁺⁺ mit einem Fluorometer gemessen werden.
In bestimmten Ausführungsformen des Assays kann das Screening auf Änderungen der zellulären Phosphorylierung wünschenswert sein. Das Drosophila-Gen Fused (fu), das für eine Serin-/Threoninkinase codiert, wurde zum Beispiel als ein potenzielles Target stromabwärts beim Hedgehog-Signalisieren identifiziert. (Preat et al., 1990 Nature 347, 87–89; Therond et al. 1993, Mech. Dev. 44. 65–80). Die Fähigkeit von Verbindungen, die Serin-/Threoninkinase-Aktivierung zu modulieren, könnte unter Verwendung des Immunoblotting von Kolonien (Lyons und Nelson (1984) PNAS 81: 7426–7430) unter Verwendung von Antikörpern gegen phosphorylierte Serin- oder Threoninreste gescreent werden. Reagenzien zur Durchführung solcher Assays sind gewerblich erhältlich, zum Beispiel sind Phosphoserin- und Phosphothreonin-spezifische Antikörper, die Phosporylierungssteigerungen dieser Reste messen, von kommerziellen Quellen erhältlich.
Die Interaktion eines Hedgehog-Proteins mit einem HIP-Protein kann eine Kaskade in Gang setzen, die die Aktivierung und Inhibition von sich stromabwärts befindenden Effektoren beinhaltet, wobei die Konsequenz letztendlich darin besteht, dass in einigen Fällen eine nachweisbare Änderung der Transkription oder Translation eines Gens auftritt. Potenzielle transkriptionale Targets von HIP-abhängigem Hedgehog-Signalisieren schließen das HIP-Gen selbst, das Patched Gen (Hidalgo und Ingham (1990) Development 110, 291–301; Marigo et al. (1996) Development 122: 1225–1233), und die Vertebraten-Homologe des Gens von Drosophila Cubitus interruptus (ci) und die GLI-Gene (Hui et al. (1994) Dev Biol 162: 402–413) ein. Es wurde gezeigt, dass die Patched Gen-Expression in Zellen der Extremitätenknospe und der Neuralplatte, die auf Shh ansprechen, induziert werden (Marigo et al. (1996) PNAS, im Druck; Marigo et al., vorstehend). Die GLI-Gene codieren für putative Transkriptionsfaktoren mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4: 1053–1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 634–642). Es wurde berichtet, dass die Transkription des GLI-Gens als Antwort auf Hedgehog in Extremitätenknospen upreguliert wird, während die Transkription des GLI3-Gens als Antwort auf die Hedgehog-Induktion downreguliert wird (Marigo et al. (1996) Development 122: 1225–1233). Durch Auswahl transkriptionaler Regulationssequenzen von solchen Targetgenen, zum Beispiel von HIP- oder GLI-Genen, die für die Up- und Downregulation dieser Gene als Antwort auf die Hedgehog-Induktion verantwortlich sind und solche Promotoren funktionsfähig mit einem Reportergen verknüpfen, stellt erfindungsgemäß einen auf einer Transkription basierenden Assay bereit, der für die Fähigkeit einer spezifischen Testverbindung zur Beeinflussung von Hedgehog-Signalisierungspfaden empfindlich ist.
In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst der Schritt zum Nachweis der Interaktion der Hedgehog- und HIP-Polypeptide den Nachweis, in einem zellbasierenden Assay, (eine) Änderung/Änderungen des Expressionsspiegels eines Gens, der durch eine transkriptionale Regulationssequenz, die auf das Signalisieren durch das HIP-Polypeptid anspricht, kontrolliert wird. Die auf dem Reportergen basierenden erfindungsgemäßen Assays messen die Endphase der vorstehend beschriebenen Ereigniskaskade, wie zum Beispiel der transkriptionalen Modulation. Gemäß der praktischen Ausführung einer Ausführungsform des Assays wird ein Reportergen-Konstrukt in die Reagenzzelle insertiert, um ein vom Hedgehog-Signalisieren abhängiges Nachweissignal zu generieren. Die Expression des Reportergens stellt folglich ein wertvolles Screening-Werkzeug für die Entwicklung von Verbindungen bereit, die als Agonisten oder Antagonisten der HIP-abhängigen Hedgehog-Induktion wirken.
In der praktischen Ausführung einer Ausführungsform des Assays wird ein Reportergen-Konstrukt in die Reagenzzelle insertiert, um ein von zweiten Boten abhängiges Nachweissignal zu generieren, das von der HIP-abhängigen Induktion mit einem Hedgehog-Protein generiert wird. Das Reportergen-Konstrukt schließt in der Regel ein Reportergen in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem oder mehr transkriptionalen Regulationselement(en), das/die auf die Hedgehog-Aktivität anspricht/ansprechen, mit dem Expressionsspiegel des Reportergens ein, welches das Hedgehog-abhängige Nachweissignal bereitstellt. Die Transkriptionsmenge aus dem Reportergen kann unter Verwendung von jedwedem Verfahren gemessen werden, das dem Fachmann als geeignet bekannt ist. Die mRNA-Expression aus dem Reportergen kann unter Verwendung der RNAse-Protektion oder der auf RNA basierenden PCR nachgewiesen werden, oder das Proteinprodukt des Reportergens kann mittels einer charakteristischen Färbung oder einer intrinsischen Aktivität identifiziert werden. Die Expressionsmenge aus dem Reportergen wird dann mit der Expressionsmenge in entweder der gleichen Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder sie kann mit der Transkriptionsmenge in einer im Wesentlichen identischen Zelle, der das Targetreceptorprotein mangelt, verglichen werden. Jedweder statistisch oder anderweitig signifikante Unterschied in der Transkriptionsmenge deutet darauf hin, dass die Testverbindung in einer Weise die induktive Aktivität des Hedgehog-Proteins verändert hat.
Wie nachstehend weiter ausführlich beschrieben wird, wird in bevorzugten Ausführungsformen das Genprodukt des Reporters mittels einer mit diesem Produkt assoziierten intrinsischen Aktivität nachgewiesen. Das Reportergen kann zum Beispiel für ein Genprodukt codieren, das durch enzymatische Aktivität Anlass zu einem auf Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz basierenden Nachweissignal gibt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen stellt das Reporter- oder Markergen einen selektiven Wachstumsvorteil bereit, das Reportergen kann zum Beispiel die Zellviabilität fördern, die Ernährungsanforderungen der Zelle vermindern und/oder Resistenz gegen ein Arzneimittel bereitstellen. Dem Fachmann sind viele Reportergene bekannt, und andere lassen sich anhand von dem Fachmann bekannten Verfahren identifizieren oder synthetisieren. Ein Reportergen schließt jedwedes Gen ein, das ein nachweisbares Genprodukt exprimiert, bei dem es sich um eine RNA oder ein Protein handeln kann.
Bevorzugte Reportergene stellen die dar, die ohne weiteres nachweisbar sind. Das Reportergen kann auch in das Konstrukt in der Form eines Fusionsgens mit einem Gen eingeschlossen werden, das gewünschte transkriptionale Regulationssequenzen einschließt oder andere wünschenswerte Eigenschaften aufweist. Beispiele von Reportergenen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase) (Alton und Vapnek (1979), Nature 282: 864–869) Luciferase und andere Enzymnachweissysteme, wie zum Beispiel β-Galactosidase; Glühwürmchen-Luciferase (deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 725–737); bakterielle Luciferase (Engebrecht und Silverman (1984), PNAS 1: 4154–4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663–3667); alkalische Phosphatase (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231–238, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101) und in der humanen Placenta sezernierte alkalische Phosphatase (Cullen und Malim (1992) Methods in Enzymol. 216: 362–368).
Demzufolge stellt eine noch andere Ausführungsform dieser erfindungsgemäßen Arzneimittel-Screening-Assays eine rekombinante Zelle, zum Beispiel zur Durchführung bestimmter vorstehender Arzneimittel-Screening-Verfahren bereit, umfassend: (i) ein exprimierbares rekombinantes Gen, codierend ein heterologes HIP-Polypeptid, dessen Signaltransduktionsaktivität durch Bindung an ein Hedgehog-Protein moduliert wird; und (ii) ein Reportergen-Konstrukt, enthaltend ein Reportergen in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem oder mehr transkriptionalen Regulationselement(en), das/die auf die Signaltransduktionsaktivität des HIP-Polypeptids anspricht/ansprechen. Ein noch anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Kit zum Screening von Testverbindungen zur Identifikation von Mitteln, welche die Bindung der Hedgehog-Proteine mit einem Hedgehog-Receptor modulieren, einschließlich der vorstehend erwähnten Zelle und einer Präparation aus gereinigtem Hedgehog-Polypeptid, bereit.
In einer noch anderen Ausführungsform eines Arzneimittel-Screenings kann ein Zwei-Hybrid-Assay (vorstehend beschrieben) mit einem HIP-Polypeptid und einem Targetmolekül generiert werden. Die Arzneimittel-abhängige Inhibition oder Potenzierung der Interaktion kann durch Vergabe eines Scores bewertet werden.
Nach der Identifikation bestimmter Testverbindungen als potenzielle Modulatoren von einer oder mehr Bioaktivitäten) eines HIP-Proteins (wie zum Beispiel Hedgehog-Bindung), kann derjenige, der den erfindungsgemäßen Assay praktisch durchführt, damit fortfahren, die Wirksamkeit und Spezifität der ausgewählten Verbindungen sowohl in vitro als auch in vivo zu testen Ungeachtet, ob für das sich anschließende Testen in vivo oder für die Verabreichung eines zugelassenen Arzneimittels an ein Tier, können die im erfindungsgemäßen Assay identifizierten Mittel in pharmazeutische Präparationen zur Verabreichung in vivo an ein Tier, bevorzugt einen Menschen, formuliert werden.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Induktion und/oder Aufrechterhaltung eines differenzierten Zustands, der das Überleben fördert und/oder die Proliferation einer Zelle durch Kontaktieren der Zellen mit einem Mittel, das die HIP-abhängigen Signaltransduktionspfade moduliert, inhibiert (oder als Alternative potenziert). Das erfindungsgemäße Verfahren könnte zur Generierung und/oder Aufrechterhaltung eines Arrays aus verschiedenem Gewebe sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden Ein "HIP-Therapeutikum", ungeachtet, ob inhibitorisch oder potenzierend in Bezug auf die Modulation der Aktivität eines HIP-Proteins, kann gegebenenfalls jedwede der vorstehend beschriebenen Präparationen, einschließlich isolierter HIP-Polypeptide (einschließlich sowohl Agonisten- als auch Antagonistenformen), Gentherapie-Konstrukte, Antisense-Moleküle, Peptidomimetika oder Mittel, die in den hierin bereitgestellten Arzneimittel-Assays identifiziert wurden, dargestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen können lösliche Formen des HIP-Proteins, einschließlich der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne des Receptors als ein Mittel zum Antagonisieren der Bindung eines HIP-Liganden an einen Zelloberflächen-HIP-Receptor bereitgestellt werden. Derartige Formen des Receptors können zum Beispiel zum Antagonisieren der Bioaktivität eines Liganden des Receptors Verwendung finden.
Die erfindungsgemäßen HIP-Therapeutika werden möglicherweise in der Modulation der zellulären Proliferation und Aufrechterhaltung von zum Beispiel neuronaler, testikulärer, osteogener oder chondrogener Gewebe während Krankheitszuständen eine wichtige Rolle spielen. Man wird auch erkennen, dass durch die transiente Verwendung von Modulatoren der HIP-Aktivitäten die In-vivo-„Reformation" von Gewebe, zum Beispiel in der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Organen, wie zum Beispiel der ektodermen Musterbildung ebenso wie bestimmter mesodermaler und entodermaler Differenzierungsvorgänge erreicht werden kann. Durch Kontrolle des proliferativen und differenzierenden Potenzials für verschiedene Zellen können die erfindungsgemäßen HIP-Therapeutika zur Reformation von verletztem Gewebe oder zur Verbesserung der Transplantation und der Morphologie transplantierter Gewebe verwendet werden. HIP-Antagonisten und -Agonisten können zum Beispiel in einer differenzierenden Weise zur Regulation der verschiedenen Stufen der Organreparatur nach einem physikalischen, chemischen oder pathologischen Insult eingesetzt werden. Das vorliegende Verfahren ist auch auf Zellkulturverfahren anwendbar.
Zur weiteren Erläuterung dieses erfindungsgemäßen Aspekts hat sich erwiesen, dass es sich bei neuronalen Kultursystemen in vitro um fundamentale und unentbehrliche Werkzeuge für die Studie der neuralen Entwicklung ebenso wie die Identifikation neurotropher Faktoren, wie zum Beispiel des Nervenwachstumsfaktors (NGF), der Ciliary Trophic Factors (CNTF) und des Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) handelt. Sobald eine Neuronenzelle terminal differenziert worden ist, verändert sie sich in der Regel nicht zu einem anderen terminal differenzierten Zelltyp. Trotzdem können Neuronenzellen jedoch ohne weiteres ihren differenzierten Zustand verlieren. Dies wird häufig beobachtet, wenn sie in einer Kultur aus adultem Gewebe wachsen und wenn sie während der Regeneration ein Blastem bilden. Das vorliegende Verfahren stellt ein Mittel zur Gewährleistung einer angemessen restriktiven Umgebung bereit, um die Neuronenzellen auf verschiedenen Stufen der Differenzierung aufrechtzuerhalten, und kann zum Beispiel in Zellkulturen eingesetzt werden, die zum Testen spezifischer Aktivitäten von anderen trophischen Faktoren bestimmt sind. In solchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die kultivierten Zellen mit einem HIP-Therapeutikum in Kontakt gebracht werden, wie zum Beispiel einem Mittel, das in den vorstehend beschriebenen Assays identifiziert wurde, die HIP-abhängige Hedgehog-Bioaktivitäten potenzieren, um die neuronale Differenzierung (zum Beispiel einer Stammzelle) zu induzieren oder die Integrität einer Kultur aus terminal differenzierten Neuronenzellen durch Verhinderung des Differenzierungsverlusts aufrechtzuerhalten. Als Alternative kann ein Antagonist der Hedgehog-Induktion, wie dies von bestimmten der erfindungsgemäßen HIP-Homologe erwartet wird, zur Verhinderung der Differenzierung von Progenitorzellen in Kultur verwendet werden.
Zur weiteren Erläuterung der Anwendungen von HIP-Therapeutika, die entweder Hedgehog-Agonisten oder Antagonisten darstellen können, sei angemerkt, dass die intracerebrale Transplantation als ein zusätzlicher Ansatz zu Therapien für das Zentralnervensystem hervorgegangen ist. Ein Ansatz zur Reparatur von geschädigtem Hirngewebe beinhaltet zum Beispiel die Transplantation von Zellen von fetalen oder neonatalen Tieren in das adulte Gehirn (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123: 265–289; und Freund et al. (1985) J Neurosci 5: 603–616). Fetale Neuronen aus einer Reihe von vielen verschiedenen Hirnregionen können erfolgreich in das adulte Gehirn inkorporiert werden, und solche Transplantate können Verhaltensdefekte lindern. So können zum Beispiel Bewegungsstörungen, die durch Läsionen der dopaminergen Projektionen an die Basalganglien induziert wurden, durch Transplantationen embryonaler dopaminerger Neuronen verhindert werden. Komplexe kognitive Funktionen, die nach Läsionen des Neocortex beeinträchtigt sind, können mithilfe von Transplantationen embryonaler Kortikalzellen auch teilweise wiederhergestellt werden. Die unterschiedliche Anwendung von Hedgehog-Agonisten und -Antagonisten in der Kultur kann den durch die Kultur zugänglichen richtigen Zeitpunkt und den Typ der Differenzierung durch die Kultur kontrollieren.
Zusätzlich zur Implantation von Zellen, die in Anwesenheit von Hedgehog- Agonisten und -Antagonisten kultiviert werden, und andere Anwendungen in vitro, betrifft ein noch anderer erfindungsgemäßer Aspekt die therapeutische Applikation eines HIP-Therapeutikums zur Verbesserung des Überlebens von Neuronen und anderer Neuronenzellen sowohl im Zentralnervensystem als auch im peripheren Nervensystem. Die Fähigkeit des Hedgehog-Proteins bei der Regulation der neuronalen Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und vermutlich auch im adulten Zustand deutet darauf hin, dass man von bestimmten Hedgehog-Proteinen und demzufolge HIP-Therapeutika, die die Hedgehog-Bioaktivitäten modulieren, durchaus erwarten kann, dass sie die Kontrolle von adulten Neuronen in Bezug auf die Aufrechterhaltung, Funktionsleistung und das Altern normaler Zellen; die Reparatur- und Regenerationsvorgänge in chemisch oder mechanisch läsionierten Zellen; und die Verhinderung der Degeneration und des prämaturen Tods, der sich aus dem Verlust der Differenzierung bei bestimmten pathologischen Erkrankungen ergibt, fördern. Angesichts dieses Verständnisses werden erfindungsgemäß spezifisch Anwendungen der erfindungsgemäßen HIP-Therapeutika zur Behandlung (Verhinderung und/oder Reduktion des Schweregrads) neurologischer Erkrankungen in Betracht gezogen, die sich herleiten von: (i) akuter, subakuter oder chronischer Verletzung des Nervensystems, einschließlich traumatischer Verletzung, chemischer Verletzung, vasaler Verletzung und Defiziten (wie zum Beispiel der Ischämie in Folge eines Schlaganfalls), zusammen mit infektiöser/inflammatorischer und Tumor-induzierter Verletzung; (ii) Altern des Nervensystems, einschließlich der Alzheimer-Krankheit; (iii) chronischneurodegenerativer Erkrankungen des Nervensystems, einschließlich der Parkinson- Krankheit, Chorea Huntington, amyotropher lateraler Sklerose und dergleichen, ebenso wie spinocerebellarer Degenerationen; und (iv) chronisch-immunologischer Erkrankungen des Nervensystems oder denen, die sich auf das Nervensystem auswirken, einschließlich multipler Sklerose.
Viele neurologische Erkrankungen gehen mit einer Degeneration diskreter Populationen neuronaler Elemente einher und könnten mit einem therapeutischen Regime behandelbar sein, das ein als ein Hedgehog-Agonist wirkendes HIP-Therapeutikum einschließt. Die Alzheimer-Krankheit geht zum Beispiel mit Defiziten in mehreren Neurotransmittersystemen einher, sowohl denjenigen, die zum Neocortex projizieren als auch denen, die sich im Cortex befinden. Es wurde zum Beispiel beobachtet, dass der Nucleus basalis bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit im Vergleich zu altersmäßig abgestimmten Kontrollen einen profunden (75%igen) Verlust der Neuronen aufweist. Obwohl die Alzheimer-Krankheit bei weitem die häufigste Form der Demenz darstellt, können auch mehrere andere Erkrankungen zur Demenz führen. Bei mehreren von diesen handelt es sich um degenerative Erkrankungen, die durch den Tod von Neuronen in verschiedenen Teilen des Zentralnervensystems, insbesondere dem cerebralen Cortex gekennzeichnet sind. Einige Demenzformen gehen jedoch mit der Degeneration des Thalamus oder der unter dem cerebralen Cortex liegenden weißen Substanz einher. Hier entsteht die kognitive Dysfunktion aus der Isolation der kortikalen Areale durch die Degeneration efferenter und afferenter Nerven. Die Chorea Huntington beinhaltet die Degeneration von intrastriatalen und kortikalen cholinergen und GABAergen Neuronen. Bei dem Pick-Syndrom handelt es sich um eine schwergradige neuronale Degeneration im Neocortex der frontalen und anterioren Temporallappen, die manchmal vom Tod der Neuronen im Striatum begleitet ist. Die Behandlung von an solchen degenerativen Erkrankungen leidenden Patienten kann die Applikation von HIP-Therapeutika einschließen, um zum Beispiel die Differenzierung und apoptotischen Ereignisse, die Anlass zum Verlust von Neuronen, (zum Beispiel zur Verbesserung des Überlebens existierender Neuronen) ebenso wie zur Förderung der Differenzierung und Repopulation mit Progenitorzellen im betroffenen Areal geben, zu kontrollieren.
Außer bei den degenerativ-induzierten Demenzen kann eine pharmazeutische Präparation aus einem oder mehr erfindungsgemäßen HIP-Therapeutikum/Therapeutika in der Behandlung der neurodegenerativen Erkrankungen, die sich mit Tremor und unfreiwilligen Bewegungen manifestieren, opportun appliziert werden. Die Parkinson-Krankheit wirkt sich zum Beispiel primär auf die subkortikalen Strukturen aus und ist gekennzeichnet durch die Degeneration der nigrostriatalen Bahn, der Raphe nuclei, des Locus caeruleus und des motorischen Kerns des Vagus. Ballismus geht in der Regel mit einer Schädigung des Nucleus subthalamicus einher, die häufig auf einen akuten vaskulären Insult zurückzuführen ist. Auch eingeschlossen sind neurogene und myopathische Erkrankungen, die sich letztendlich auf die somatische Teilung des peripheren Nervensystems auswirken und sich als neuromuskuläre Erkrankungen manifestieren. Beispiele schließen chronische Atrophien, wie zum Beispiel die amyotrophe laterale Sklerose, das Guillain-Barre-Syndrom und die chronische periphere Neuropathie ebenso wie andere Erkrankungen ein, die sich als progressive Bulbärparalysen oder Spinalmuskelatrophien manifestieren können. Das vorliegende Verfahren ist der Behandlung von Erkrankungen des Cerebellums, die zur Hypotonie oder Ataxie führen, wie zum Beispiel den Läsionen im Cerebellum, die Störungen in den Extremitäten ipsilateral zur Läsion hervorrufen, zugänglich. Es kann zum Beispiel eine Präparation aus einem HIP-Therapeutikum zur Behandlung einer restriktierten Form der cerebellaren kortikalen Degeneration, an der die anterioren Lappen (Vermis- und Beinareale), wie zum Beispiel bei alkoholabhängigen Patienten, beteiligt sind, angewendet werden.
In einer erläuternden Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung der amyotrophen lateralen Sklerose angewendet. ALS stellt eine Bezeichnung dar, die einem Krankheitskomplex gegeben wurde, der die oberen und unteren Motoneuronen umfasst. Bei den Patienten kann sich eine progressive Spinalmuskelatrophie, progressive Bulbärparalyse, primäre Lateralsklerose oder eine Kombination dieser Erkrankungen zeigen. Die bedeutende pathologische Abnormalität ist gekennzeichnet durch eine selektive und progressive Degeneration der unteren Motoneuronen im Rückenmark und den oberen Motoneuronen im cerebralen Cortex. Die therapeutische Applikation eines Hedgehog-Agonisten kann allein oder zusammen mit anderen neurotrophen Faktoren, wie zum Beispiel CNTF, BDNF oder NGF zur Verhinderung und/oder Umkehr der Motoneuronen-Degeneration bei ALS-Patienten angewendet werden.
Erfindungsgemäße HIP-Therapeutika können auch bei der Behandlung autonomer Erkrankungen des peripheren Nervensystems angewendet werden, die Erkrankungen einschließen, die sich auf die Innervation der Glattmuskulatur und das endokrine Gewebe (wie zum Beispiel das Drüsengewebe) auswirken. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Beispiel zur Behandlung der Tachykardie oder der Vorhofarrhythmien, die aus einer degenerativen Erkrankung der Nerven, die die quergestreifte unwillkürliche Muskulatur des Herzens innervieren, entstehen können.
Eine potenzielle Rolle für bestimmte HIP-Therapeutika leitet sich überdies von der Rolle der Hedgehog-Proteine bei der Entwicklung und der Aufrechterhaltung der dendritischen Fortsätze der axonalen Neuronen her. Zu den potenziellen Rollen für Hedgehog-Agonisten gehören folglich die Führung für axonale Projektionen und die Fähigkeit, die Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung der innervierenden Zellen an ihre axonalen Fortsätze aufrechtzuerhalten. Demzufolge können Zusammensetzungen, die HIP-Therapeutika umfassen, welche die Hedgehog-Aktivität agonisieren, zur Unterstützung des Überlebens und der Reprojektion mehrerer Typen ganglionärer Neuronen, sympathischer und sensorischer Neuronen ebenso wie Motoneuronen, eingesetzt werden. Solche therapeutischen Zusammensetzungen können insbesondere in Behandlungen nützlich sein, die zur Rettung von zum Beispiel verschiedenen Neuronen der Läsions-induziertem Tod sowie als Führung der Reprojektion dieser Neuronen nach einer solchen Schädigung nützlich sind. Solche Erkrankungen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: Trauma, Infarkt und Infektion (wie zum Beispiel eine Virusinfektion mit Varicella-zoster) des ZNS, Stoffwechselerkrankungen, Ernährungsdefizienz, toxische Mittel (wie zum Beispiel die Cisplatin-Behandlung).
Bestimmte HIP-Therapeutika (zum Beispiel die, welche die Hedgehog-Induktion antagonisieren) können überdies bei der selektiven Ablation sensorischer Neuronen, zum Beispiel bei der Behandlung chronischer Schmerzsyndrome, nützlich sein.
Gegebenenfalls können HIP-Therapeutika in Nervenprothesen für die Reparatur der zentralen und peripheren Nervenschädigung angewendet werden. Insbesondere, wenn ein zerquetschtes oder durchtrenntes Axon durch Verwendung einer Prothesenvorrichtung „intubiert" wird, können der prothetischen Vorrichtung bestimmte HIP-Therapeutika zur Steigerung der Wachstumsrate und Regeneration der dendritischen Fortsätze zugefügt werden. Beispielhafte Nervenleitkanäle werden in US-Patenten 5,092,871 und 4,955,892 beschrieben. Demzufolge kann ein durchtrennter axonaler Fortsatz auf die Nervenendigung gerichtet werden, von der er durch eine prothetische Vorrichtung zur Führung der Nerven durchtrennt wurde.
In einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Behandlung von neoplastischen oder hyperplastischen Transformationen, wie sie zum Beispiel im Zentralnervensystem auftreten können, angewendet werden. So können zum Beispiel bestimmte HIP-Therapeutika, die die Differenzierung neuronaler Zellen induzieren, zur Herbeiführung dieser transformierten Zellen verwendet werden, damit sie entweder postmitotisch oder apoptotisch werden. Die Behandlung mit einem HIP-Therapeutikum kann die Disruption von autokrinen Schleifen, wie zum Beispiel die autostimulatorischen TGF-β- oder PDGF-Schleifen fördern, von denen angenommen wird, dass sie an der neoplastischen Transformation mehrerer neuronaler Tumoren beteiligt sind. HIP-Therapeutika können deshalb folglich in der Behandlung von zum Beispiel malignen Gliomen, Medulloblastomen, neuroektodermalen Tumoren und Ependymonen von Nutzen sein.
In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt betrifft die Applikation der Entdeckung, dass Hedgehog-Proteine morphogene Signale darstellen, die zusätzlich zur neuronalen Differenzierung, wie vorstehend beschrieben, an anderen organogenen Pfaden von Vertebraten beteiligt sind, scheinbar eine Rolle in einer anderen entodermalen Musterbildung ebenso wie bei mesodermalen und entodermalen Differenzierungsvorgängen spielen. Wie in der Literatur beschrieben wird, spielt Shh eine Rolle beim vorschriftsmäßigen Extremitätenwachstum und bei der Musterbildung durch Initiierung der Expression von Signalmolekülen, einschließlich BMP-2 im Mesoderm und Fgf-4 im Ektoderm. Folglich wird erfindungsgemäß in Betracht gezogen, dass Zusammensetzungen, die bestimmte der HIP-Therapeutika umfassen, auch für die Zellkultur ebenso wie für therapeutische Verfahren, die die Generation und Aufrechterhaltung von nicht neuronalem Gewebe beinhalten, verwendet werden können.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Gebrauch von der Entdeckung gemacht, dass Hedgehog-Proteine, wie zum Beispiel Shh, scheinbar an der Kontrolle der Entwicklung von Stammzellen beteiligt sind, die für die Bildung des Verdauungskanals, der Leber, Lungen und anderer Organe, die sich vom primitiven Darmkanal herleiten, verantwortlich sind. Shh dient als ein Induktionssignal aus dem Entoderm an das Mesoderm, was für die Morphogenese des Darmkanals kritisch ist. Deshalb können Hedgehog-Agonisten zum Beispiel bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer artifiziellen Leber, die mehrere metabolische Funktionen einer normalen Leber verrichten kann, eingesetzt werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann ein als ein Hedgehog-Agonist wirkendes HIP-Therapeutikum zur Induktion der Differenzierung der Stammzellen des Verdauungstrakts zur Bildung von Hepatozytenkulturen verwendet werden, die zur Besiedlung extrazellulärer Matrices verwendet werden können oder die in biokompatiblen Polymeren zur Bildung sowohl von implantierbaren als auch extrakorporalen artifiziellen Lebern eingekapselt werden können.
In einer anderen Ausführungsform können therapeutische Zusammensetzungen von Hedgehog-Agonisten zusammen mit Transplantationen solcher artifiziellen Lebern ebenso wie embryonalen Leberstrukturen zur Förderung der intraperitonealen Implantation, Vaskularisation und In-vivo-Differenzierung und -Aufrechterhaltung des transplantierten Lebergewebes angewendet werden.
In einer noch anderen Ausführungsform können HIP-Therapeutika zur Regulation solcher Organe nach einem physikalischen, chemischen oder pathologischen Insult therapeutisch eingesetzt werden. So können zum Beispiel therapeutische Zusammensetzungen, die Hedgehog-Agonisten umfassen, nach einer partialen Hepatektomie bei der Lebeneparatur eingesetzt werden. Auf ähnliche Weise können therapeutische Zusammensetzungen, die Hedgehog-Agonisten enthalten, zur Förderung der Regeneration von Lungengewebe in der Behandlung des Emphysems angewendet werden.
In einer noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können Zusammensetzungen, umfassend HIP-Therapeutika, in der In-vitro-Generierung von Skelettgewebe, wie zum Beispiel von skeletogenen Stammzellen ebenso wie in der In-vivo-Behandlung von Defizienzen des Skelettgewebes verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere das Inbetrachtziehen der Verwendung von HIP-Therapeutika, die einen Hedgehog einer skeletogenen Aktivität, wie zum Beispiel eine Fähigkeit zur Induktion der Chondrogenese und Osteogenese antagonisieren. Unter „Defizienz des Skelettgewebes" versteht man eine Defizienz des Knochen- oder anderen Skelettbindegewebes an jedweder Stelle, an der die Wiederherstellung des Knochen- oder Bindegewebes, ungeachtet, wie die Defizienz ursprünglich entstand, zum Beispiel ob aufgrund einer chirurgischen Intervention, eines Tumors, einer Ulceration, Implantation, Fraktur oder anderer traumatischer oder degenerativer Zustände, erwünscht ist.
Es werden erfindungsgemäß zum Beispiel wirksame therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen zur Wiederherstellung der Knorpelfunktion an ein Bindegewebe zur Verfügung gestellt. Solche Verfahren sind zum Beispiel nützlich bei der Reparatur von Defekten oder Läsionen in Knorpelgewebe, die sich infolge des degenerativen Verschleißes ergeben, der zum Beispiel in Arthrose ebenso wie in anderen mechanischen Schädigungen resultiert, die durch Trauma am Gewebe, wie zum Beispiel einer Dislokation von gerissenem Meniskusgewebe, Meniskektomie, einer Gelenksluxation durch ein gerissenes Ligament, Fehlstellung von Gelenken, Knochenfraktur oder durch eine hereditäre Erkrankung verursacht werden. Das vorliegende Reparaturverfahren ist auch nützlich für das Remodellieren der Knorpelmatrix, wie zum Beispiel in der Plastik- oder Rekonstruktionschirurgie ebenso wie in der periodontalen Chirurgie. Das vorliegende Verfahren kann auch zur Verbesserung eines vorherigen Reparaturverfahrens, zum Beispiel nach der chirurgischen Reparatur eines Meniskus, Ligaments oder Knorpels angewendet werden. Es kann überdies den Beginn oder die Exazerbation der degenerativen Erkrankung verhindern, wenn es früh genug nach einem Trauma angewendet wird.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Behandlung des betroffenen Bindegewebes mit einer therapeutisch ausreichenden Menge eines Hedgehog-Agonisten, insbesondere eines HIP-Therapeutikums, das die Ihh-Aktivität agonisiert, um eine Knorpelreparatur-Response im Bindegewebe durch die Stimulation der Differenzierung und/oder Proliferation von in das Gewebe eingebetteten Chondrocyten auszulösen. Die Induktion von Chondrocyten durch Behandlung mit einem Hedgehog-Agonisten kann anschließend in der Synthese einer neuen Knorpelmatrix durch die behandelten Zellen resultieren. Derartige Bindegewebe wie Gelenkknorpel, Zwischengelenkknorpel (Menisken), Rippenknorpel (der die echten Rippen und das Sternum verbindet), Ligamente und Sehnen sind der Behandlung mit rekonstruktiven und/oder regenerativen Therapien unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders zugänglich. Wie hierin verwendet, schließen regenerative Therapien die Behandlung degenerativer Zustände ein, die bis zu dem Punkt fortgeschritten sind, an dem die Schädigung des Gewebes offensichtlich manifest ist, ebenso wie in Präventivbehandlungen des Gewebes, wenn sich die Degeneration in ihren frühesten Stadien befindet oder imminent ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Verhinderung der Ausbreitung der Mineralisierung in das fibrotische Gewebe durch Aufrechterhaltung einer konstanten Produktion von neuem Knorpel verwendet werden.
In einer erläuternden Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von Knorpel einer Diarthrose, wie zum Beispiel einem Knie, einem Köchel, einem Ellbogen, einer Hüfte, einem Handgelenk, einem Finger- oder Zehenknöchel oder einem Temperomandibulargelenk angewendet werden. Die Behandlung kann auf den Meniskus des Gelenks, auf den Gelenkknorpel oder beide gerichtet werden. Zur weiteren Erläuterung sei angemerkt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer degenerativen Erkrankung des Knies verwendet werden kann, bei der es sich zum Beispiel um die Folge einer traumatischen Verletzung (zum Beispiel einer Sportsverletzung oder eines exzessiven Verschleißes) oder Osteoarthrose handeln kann. Eine Injektion eines HIP-Therapeutikums in das Gelenk mit zum Beispiel einer arthroskopischen Kanüle, kann zur Behandlung des betroffenen Knorpels verwendet werden. In einigen Fällen kann das injizierte Mittel in der Form eines Hydrogels oder eines anderen Vehikels mit langsamer Freisetzung, wie vorstehend beschrieben, vorliegen, um einen verlängerteren und regulären Kontakt des Mittels mit dem behandelten Gewebe zuzulassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter das Inbetrachtziehen der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Bereich der Knorpeltransplantation und der Therapien mit prothetischen Vorrichtungen. Bisher ist das Wachstum von neuem Knorpel aus entweder der Transplantation von autologem oder allogenem Knorpel größtenteils erfolglos gewesen. Probleme entstehen zum Beispiel, weil die Merkmale des Knorpels und Faserknorpels zwischen verschiedenen Geweben, wie zum Beispiel zwischen Gelenkknorpel, Meniskusknorpel, Ligamenten und Sehnen, zwischen den beiden Enden des gleichen Ligaments oder der gleichen Sehnen und zwischen den oberflächlich und tiefer liegenden Teilen des Gewebes variieren. Die zonenmäßige Anordnung dieser Gewebe kann eine graduelle Änderung der mechanischen Eigenschaften widerspiegeln, und Versagen tritt auf, wenn implantiertem Gewebe, das sich unter diesen Bedingungen nicht differenziert hat, die Fähigkeit mangelt, angemessen anzusprechen. Wenn Meniskusknorpel zum Beispiel zur Reparatur der anterioren Kreuzbänder verwendet wird, unterzieht sich das Gewebe einer Metaplasie zu reinem Fasergewebe. Durch Förderung der Chondrogenese kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um sich insbesondere an dieses Problem zu wenden, indem es die implantierten Zellen dazu veranlasst, anpassungsfähiger an die neue Umgebung zu werden und auf wirksame Weise den hypertrophen Chondrocyten einer früheren Entwicklungsstufe des Gewebes ähnlich zu werden. Folglich können die Chondrogenese-Wirkung im implantierten Gewebe, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt wird, und die mechanischen Kräfte auf das sich aktiv remodellierende Gewebe synergieren, um ein verbessertes Implantat herzustellen, das für die neue Funktion, die es übernehmen soll, geeignet ist.
Auf ähnliche Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung von sowohl der Generierung von prothetischen Knorpelvorrichtungen als auch ihrer Implantation angewendet werden. Der Bedarf an einer verbesserten Behandlung hat die auf die Herbeiführung von neuem Knorpel, der auf Collagen-Glycosaminoglykan-Templates basiert (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252: 129), isolierten Chondrocyten (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7: 208; und Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2: 449), und Chondrocyten, die an natürliche oder synthetische Polymere angeheftet sind (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88: 753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25: 329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27: 11; und Vacanti et al., US-Patent Nr. 5,041,138), abgezielte Forschung motiviert. So können die Chondrocyten zum Beispiel in Kultur auf biologisch abbaubaren, biokompatiblen, hoch porösen Gerüsten, die aus Polymeren, wie zum Beispiel Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Agarosegel oder anderen Polymeren gebildet sind, die sich in Abhängigkeit von der Zeit als eine Funktion der Hydrolyse der Polymerhauptkette zu harmlosen Monomeren abbauen, gezüchtet werden. Die Matrices sind konzipiert, um eine(n) adäquate(n) Ernährung und Gasaustausch an die Zellen bis zum Auftreten des Engraftments zu ermöglichen. Die Zellen können in vitro kultiviert werden, bis sich ein adäquates Zellvolumen und eine angemessene Dichte für die zu implantierenden Zellen entwickelt hat. Ein Vorteil der Matrices besteht darin, dass sie in die gewünschte Form auf individueller Basis gegossen oder geformt werden können, so dass das Endprodukt dem eigenen Ohr oder der eigenen Nase des Patienten (zum Beispiel) sehr ähnlich ist, oder es können flexible Matrices verwendet werden, die zum Zeitpunkt der Implantation, wie zum Beispiel in ein Gelenk, Manipulation zulassen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Implantate während des Kulturverfahrens mit einem HIP-Therapeutikum, wie zum Beispiel einem Ihh-Agonisten, in Kontakt gebracht, um die differenzierten Chondrocyten in der Kultur zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten, um die Knorpelmatrixproduktion im Implantat weiter zu stimulieren. Auf diese Weise können die kultivierten Zellen veranlasst werden, einen Phänotyp aufrechtzuerhalten, der für eine chondrogene Zelle typisch (das heißt hypertroph) ist und folglich die Besiedlung der Matrix und die Produktion von Knorpelgewebe fortsetzt.
In einer anderen Ausführungsform wird die implantierte Vorrichtung mit einem HIP-Therapeutikum behandelt, um die implantierte Matrix aktiv zu remodellieren und sie für ihre beabsichtigte Funktion geeigneter zu machen. Wie vorstehend in Bezug auf Gewebetransplantationen dargelegt ist, sind die artifiziellen Transplantate von der gleichen Defizienz dahingehend betroffen, dass sie nicht in einer Umgebung hergeleitet werden, die mit der tatsächlichen mechanischen Umgebung, in die die Matrix implantiert wird, vergleichbar ist. Die Aktivierung der Chondrocyten in der Matrix mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, kann dem Implantat ermöglichen, Merkmale zu erwerben, die dem Gewebe ähnlich sind, für dessen Ersatz es beabsichtigt ist.
In einer noch anderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Fixierung der prothetischen Vorrichtungen verwendet. Zur Erläuterung sei angemerkt, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei der Implantation einer periodontalen Prothese verwendet werden kann, worin die Behandlung des umgebenden Bindegewebes die Bildung des periodontalen Ligaments über der Prothese stimuliert ebenso wie die Bildung von fibrotischem Gewebe in der Nähe der prothetischen Vorrichtung inhibiert wird.
In noch weiteren Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Generierung von Knochen (Osteogenese) an einer Stelle im Tier eingesetzt werden, an der dieses Skelettgewebe defizient ist. Indian-Hedgehog ist insbesondere mit den hypertrophen Chondrocyten assoziiert, die letztendlich durch Osteoblasten ersetzt werden. Die Verabreichung eines erfindungsgemäßen HIP-Therapeutikums kann zum Beispiel als Teil eines Verfahrens zur Behandlung des Knochenverlusts in einem Individuum, zum Beispiel zur Verhinderung und/oder Umkehrung der Osteoporose und anderer osteopenischer Erkrankungen ebenso wie zur Regulation des Knochenwachstums und der Maturation eingesetzt werden. Die Präparationen, umfassend Hedgehog-Agonisten können zum Beispiel zur Induktion der endochondralen Ossifikation, zumindest insoweit, um die Bildung von Knorpelgewebe-Präkursoren zur Bildung des „Modells" zur Ossifikation zu fördern, eingesetzt werden. Therapeutische Zusammensetzungen von HIP-Therapeutika können gegebenenfalls mit anderen osteoinduktiven Faktoren, wie zum Beispiel Knochenwachstumsfaktoren (zum Beispiel TGF-β-Faktoren, wie zum Beispiel den Bone Morphogenetic Factors BMP-2 und BMP-4, ebenso wie Aktivin) supplementiert werden und können auch einen Inhibitor der Knochenresorption, wie zum Beispiel Estrogen, Bisphosphonat, Natriumfluorid, Calcitonin oder Tamoxifen oder verwandte Verbindungen einschließen oder in Kombination damit verabreicht werden. Man wird jedoch erkennen, dass sich Hedgehog-Proteine, wie zum Beispiel Ihh und Shh, möglicherweise stromaufwärts von den BMPs befinden, zum Beispiel wird die Behandlung mit einem Hedgehog-Agonisten den Vorteil der Initiierung der endogenen Expression von BMPs zusammen mit anderen Faktoren aufweisen.
In einer noch anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße HIP-Therapeutikum in der Behandlung der testikulären Zellen verwendet werden, um auf diese Weise die Spermatogenese zu modulieren. Angesichts des Befundes, dass Hedgehog-Proteine an der Differenzierung und/oder Proliferation und Aufrechterhaltung testikulärer Keimzellen beteiligt sind, kann der Hedgehog-Antagonist zur Blockierung der Wirkung eines natürlich vorkommenden Hedgehog-Proteins verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert das HIP-Therapeutikum die biologische Aktivität von Dhh in Bezug auf die Spermatogenese durch die kompetitive Bindung von Hedgehog in den Testes. Das heißt, dass das HIP-Therapeutikum als eine kontrazeptive Formulierung verabreicht werden kann. Als Alternative können HIP-Therapeutika, welche die spermatogene Aktivität von Dhh agonisieren, als Fertilitätsenhancer verwendet werden. Auf ähnliche Weise sind Hedgehog-Agonisten und -Antagonisten zur Modulation der normalen Ovarialfunktion potenziell nützlich.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt bringt transgene, nicht humane Tiere zur Geltung, die ein erfindungsgemäßes heterologes HIP-Gen exprimieren und/oder die ein oder mehr genomische(s) HIP-Gen(e) aufgewiesen haben, das/die in mindestens einem Gewebe oder in Zelltypen des Tieres disruptiert war/waren. Demgemäß wird erfindungsgemäß ein Tiermodell für Entwicklungskrankheiten zur Geltung gebracht, welches Tier ein oder mehr HIP-Allel(e) aufweist, das/die missexprimiert wird/werden. So kann zum Beispiel ein Tier generiert werden, das ein oder mehr HIP-Allel(e) aufweist, das/die deletiert ist/sind oder anderweitig inaktiv gemacht wurde(n). Ein solches Modell kann dann zur Untersuchung von Erkrankungen, die aus missexprimierten HIP-Genen entstehen, ebenso wie für die Bewertung potenzieller Therapien für ähnliche Erkrankungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere schließen im Rahmen einer Vielzahl ihrer Zellen alle ein erfindungsgemäßes Transgen ein, welches Transgen den Phänotyp der „Wirtszelle" in Bezug auf die Regulation durch das HIP-Protein, zum Beispiel das Zellwachstum, den Zelltod und/oder die Differenzierung verändert. Da es möglich ist, erfindungsgemäße transgene Organismen zu produzieren, die sich ein oder mehr der hierin beschriebenen Transgen-Konstrukte zu Nutze machen, wird eine allgemeine Beschreibung von der Produktion von transgenen Organismen unter allgemeiner Bezugnahme auf exogenes genetisches Material gegeben. Diese allgemeine Beschreibung kann vom Fachmann angepasst werden, um spezifische Transgen-Sequenzen in die Organismen zu inkorporieren, die sich die hierin beschriebenen Verfahren und Materialien und die, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, zu Nutze machen.
In einer Ausführungsform stellt das transgene Konstrukt ein Knockout-Konstrukt dar. Solche Transgen-Konstrukte stellen im Allgemeinen Konstrukte des Insertionstyps oder Ersatztyps dar (Hasty et al. (1991) Mol Cell Biol 11: 4509). Die Transgen-Konstrukte zur Disruption eines HIP-Gens sind zur Förderung der homologen Rekombination mit einem Anteil des genomischen HIP-Gens bestimmt, um auf diese Weise die funktionelle Expression des endogenen HIP-Gens zu verhindern. In bevorzugten Ausführungsformen kann sich die als das Knockout-Konstrukt verwendete Nucleotidsequenz aus Folgendem zusammensetzen: (1) DNA aus einem Anteil des endogenen HIP-Gens (Exonsequenz, Intronsequenz, Promotorsequenzen usw.), welche die Rekombination richtet und (2) einer Markersequenz, die zum Nachweis der Anwesenheit des Knockout-Konstrukts in der Zelle verwendet wird. Das Knockout-Konstrukt wird in eine Zelle insertiert und mit der genomischen DNA der Zelle in einer solchen Position integriert, um auf diese Weise die Transkription des nativen HIP-Gens zu verhindern oder zu unterbrechen. Eine derartige Insertion kann durch homologe Rekombination auftreten, das heißt Regionen des Knockout-Konstrukts, die mit der endogenen HIP-Gensequenz homolog sind, hybridisieren an die genomische DNA und rekombinieren mit den genomischen Sequenzen, damit das Konstrukt in die entsprechende Position der genomischen DNA inkorporiert wird. Das Knockout-Konstrukt kann Folgendes umfassen: (1) eine vollständige oder partielle Sequenz aus einem oder mehr Exon(en) und/oder Intron(en) des zu disruptierenden HIP-Gens, (2) Sequenzen, welche die 5'- und 3'-Enden der Codiersequenz des HIP-Gens codieren oder (3) eine Kombination davon.
Ein bevorzugtes Knockout-Konstrukt deletiert, durch targetierte homologe Rekombination, wesentliche Strukturelemente eines endogenen HIP-Gens. Das Targeting-Konstrukt, das zum Beispiel mit dem genomischen HIP-Gen rekombinieren kann, kann einen Anteil der Codiersequenz und/oder wesentliche transkriptionale Regulationssequenzen des Gens deletieren.
Das Knockout-Konstrukt kann als Alternative zum Unterbrechen wesentlicher Struktur- und/oder Regulationselemente eines endogenen HIP-Gens durch targetierte Insertion einer Polynucleotidsequenz verwendet werden. So kann zum Beispiel ein Knockout-Konstrukt mit einem HIP-Gen rekombinieren und eine nicht homologe Sequenz, wie zum Beispiel eine Neoexpressionskassette, in ein Strukturelement (zum Beispiel ein Exon) und/oder Regulationselement (zum Beispiel Enhancer, Promotor, Intronspleißort, Polyadenylierungsort usw.) insertieren, um ein targetiertes HIP-Allel mit einer insertionalen Disruption zu ergeben. Die insertierte Nucleinsäure kann im Größenbereich von einem Nucleotid (zum Beispiel zur Herstellung eines Frameshift) bis zu mehreren Kilobasen oder mehr liegen und ist nur durch die Effizienz des Targeting-Verfahrens begrenzt.
Abhängig vom Ort und den Merkmalen der Disruption können die Transgen-Konstrukte zur Generierung eines transgenen Tiers verwendet werden, in dem im Wesentlichen die gesamte Expression des targetierten HIP-Gens in mindestens einem Anteil der Zellen des Tiers inhibiert wird. Wenn nur Regulationselemente targetiert werden, kann eine etwas geringgradige Expression des targetierten Gens auftreten (das heißt das targetierte Allel ist „leaky").
Die Nucleotidsequenz(en), umfassend das/die Knockout-Konstrukt(e), können unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die im Stand der Technik überall bekannt sind. Solche Verfahren schließen zum Beispiel folgende ein: Screening der genomischen Bibliotheken mit HIP-cDNA-Sonden, um das entsprechende genomische HIP-Gen und die Regulationssequenzen zu identifizieren. Dort wo die cDNA-Sequenz als Alternative als Teil des Knockout-Konstrukts verwendet werden soll, kann die cDNA durch Screening einer cDNA-Bibliothek, wie vorstehend dargelegt ist, erhalten werden.
In einer anderen Ausführungsform werden the erfindungsgemäßen „transgenen nicht humanen Tiere" durch Einführen von Transgenen in die Keimbahn des nicht humanen Tieres produziert. Embryonale Targetzellen auf verschiedenen Entwicklungsstufen können zur Einführung von Transgenen verwendet werden. Es werden in Abhängigkeit von der Entwicklungsstufe der embryonalen Targetzelle verschiedene Verfahren verwendet. Die spezifische(n) Linie(n) von jedwedem Tier, das zur erfindungsgemäßen praktischen Ausführung verwendet wird/werden, wird/werden hinsichtlich eines guten allgemeinen Gesundheitszustands, guter Embryoausbeuten, guter pronucleärer Sichtbarkeit im Embryo und guter reproduktiver Tauglichkeit ausgewählt. Außerdem stellt der Haplotyp einen signifikanten Faktor dar. Wenn zum Beispiel transgene Mäuse produziert werden sollen, werden häufig Stämme, wie zum Beispiel C57BL/6- oder FVB-Linien verwendet (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Bevorzugte Stämme stellen die mit H-2^b-, H-2^d- oder H-2^q-Haplotypen, wie zum Beispiel C57BL/6 oder DBA/1 dar. Die zur erfindungsgemäßen praktischen Ausführung verwendete(n) Linie(n) können selbst Transgene sein und/oder sie können Knockouts sein (das heißt von Tieren erhalten werden, die ein oder mehr partiell oder vollkommen supprimiertes) Gene) aufweisen).
In einer Ausführungsform wird das Transgen-Konstrukt in einen Embryo im Einzellstadium eingeführt. Die Zygote stellt das beste Target für die Mikroinjektion dar. Die Verwendung von Zygoten als ein Target für den Gen-Transfer besitzt einen bedeutenden Vorteil dahingehend, dass die injizierte DNA in den meisten Fällen vor der ersten Spaltung in das Wirtsgen inkorporiert wird (Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438–4442). Folglich tragen alle Zellen des transgenen Tiers das inkorporierte Transgen. Dies spiegelt sich im Allgemeinen auch in der effizienten Transmission des Transgens der Nachkommen des Startindividuums („Founders") wider, da 50 % der Keimzellen das Transgen beherbergen.
Die Einführung der Transgen-Nucleotidsequenz in den Embryo kann durch jedwedes im Stand der Technik bekannte Mittel, wie zum Beispiel Mikroinjektion, Elektroporation oder Lipofection erreicht werden. Nach Einführung der Transgen-Nucleotidsequenz in den Embryo, kann der Embryo in vitro für eine unterschiedliche Zeitdauer inkubiert oder in den Surrogatwirt reimplantiert oder beides werden. Die Inkubation in vitro bis zur Maturität befindet sich im erfindungsgemäßen Rahmen. Ein allgemeines Verfahren besteht, in Abhängigkeit von der Spezies, aus der Inkubation der Embryos in vitro über ca. 1–7 Tage und dann ihrer Reimplantation in den Surrogatwirt.
Jedwedes Verfahren, das das Zufügen des exogenen genetischen Materials in das genetische Material der Nucleinsäure vorsieht, kann verwendet werden, solange es die Zelle, die nucleäre Membran oder andere existierende zelluläre oder genetische Strukturen nicht zerstört. Das exogene genetische Material wird bevorzugt mittels Mikroinjektion in das genetische Material der Nucleinsäure insertiert. Die Mikroinjektion von Zellen und zellulären Strukturen ist im Stand der Technik bekannt und wird verwendet.
Die Reimplantation wird unter Verwendung von Standardverfahren erreicht. Der Surrogatwirt wird gewöhnlich anästhesiert, und die Embryos werden in den Ovidukt insertiert. Die Anzahl der in einen bestimmten Wirt implantierten Embryos wird je nach den Spezies variieren, sie ist jedoch im Allgemeinen mit der Zahl der von der Spezies natürlich produzierten Nachkommen vergleichbar.
Die transgenen Nachkommen des Surrogatwirtes können auf die Anwesenheit und/oder Expression des Transgens mithilfe eines jeden geeigneten Verfahrens gescreent werden. Das Screening wird häufig mittels der Southern-Blot- oder Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Sonde erreicht, die zu mindestens einem Anteil des Transgens komplementär ist. Die Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen das durch das Transgen codierte Protein kann als eine Alternative oder ein zusätzliches Verfahren zum Screening auf die Anwesenheit des Transgen-Produkts eingesetzt werden. Die DNA wird in der Regel aus exzidiertem Gewebe hergestellt und mittels der Southern-Analyse oder der PCR auf das Transgen analysiert. Als Alternative werden die Gewebe oder Zellen, von denen angenommen wird, dass sie das Transgen bei den höchsten Spiegeln exprimieren, auf die Anwesenheit und Expression des Transgens unter Verwendung der Southern-Analyse oder der PCR getestet, obwohl jedwede Gewebe oder Zelltypen für diese Analyse verwendet werden können.
Die retrovirale Infektion kann auch zur Einführung eines Transgens in ein nicht humanes Tier verwendet werden. Die Entwicklung des nicht humanen Embryos kann in vitro bis zum Blastocystenstadium kultiviert werden. Während dieser Zeit können die Blastomeren Targets für eine retrovirale Infektion darstellen (Jaenich. R. (1976) PNAS 73: 1260–1264). Eine effiziente Infektion der Blastomeren wird durch die enzymatische Behandlung zur Entfernung der Zona pellucida erhalten (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan Hrsg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). Das zur Einführung des Transgens verwendete virale Vektorsystem stellt in der Regel ein das Transgen tragendes Replikations-defektes Retrovirus dar (Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927–6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148–6152). Die Transfektion wird leicht und effizient durch Kultivieren der Blastomeren auf einer einlagigen Schicht von Virus-produzierenden Zellen erreicht (Van der Putten, vorstehend; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383–388). Als Alternative kann die Infektion auf einer späteren Stufe durchgeführt werden. Das Virus oder Virus-produzierende Zellen können in das Blastocoel injiziert werden (Jahner et al. (1982) Nature 298: 623–628). Die meisten der Startindividuen werden für das Transgen ein Mosaik darstellen, da die Inkorporation nur in einem Subset der Zellen auftritt, die das transgene nicht humane Tier bildeten. Das Startindividuum kann weiter verschiedene retrovirale Insertionen des Transgens an verschiedenen Positionen im Genom enthalten, die sich im Allgemeinen in den Nachkommen segregieren. Es ist außerdem auch möglich, Transgene durch intrauterine retrovirale Infektion des Embryos in der Gestationsmitte in die Keimbahn einzuführen (Jahner et al. (1982) vorstehend).
Ein dritter Targetzelltyp für die Transgen-Einführung stellt die embryonale Stammzelle (ES) dar. ES-Zellen werden aus präimplantierten Embryos gewonnen, die in vitro kultiviert und mit Embryos fusioniert werden (Evans et al. (1981) Nature 292: 154–156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255–258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065–9069; und Robertson et al. (1986) Nature 322: 445–448). Transgene können durch DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion effizient in die ES-Zellen eingeführt werden. Solche transformierten ES-Zellen können danach mit Blastocysten aus einem nicht humanen Tier kombiniert werden. Danach kolonisieren die ES-Zellen den Embryo und tragen zur Keimbahn des sich ergebenden chimären Tieres bei. Für einen Überblick siehe Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468–1474.
In einer Ausführungsform kann das Gen-Targeting, bei dem sich um ein Verfahren unter Verwendung homologer Rekombination zur Modifikation eines Genoms des Tieres handelt, zur Einführung von Änderungen in kultivierte embryonale Stammzellen verwendet werden. Durch Targeting des HIP-Gens in ES-Zellen können diese Änderungen in die Keimbahn von Tieren zur Generierung von Chimären eingeführt werden. Das Gen-Targeting-Verfahren wird von der Einführung von Gewebekulturzellen eines DNA-Targeting-Konstrukts begleitet, das ein Segment einschließt, das homolog zu einem HIP-Locus ist, und das auch eine beabsichtigte Sequenzmodifikation an der genomischen HIP-Sequenz (zum Beispiel Insertion, Deletion, Punktmutation) einschließt. Die behandelten Zellen werden dann als akkurates Targeting gescreent, um die zu identifizieren und zu isolieren, die vorschriftsmäßig targetiert wurden.
Beim Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen handelt es sich faktisch um ein erfindungsgemäßes Schema, das als ein Mittel zum Disruptieren einer HIP-Genfunktion durch die Verwendung eines targetierenden Transgen-Konstrukts, das dazu bestimmt ist, sich der homologen Rekombination mit den genomischen HIP-Sequenzen zu unterziehen, in Betracht gezogen wird. Das Targeting-Konstrukt kann dergestalt angeordnet werden, dass nach der Rekombination mit einem Element von einem HIP-Gen ein positiver Selektionsmarker in Codiersequenzen des targetierten HIP-Gens insertiert (oder ersetzt) wird. Die insertierte Sequenz disruptiert funktionell das HIP-Gen, während auch eine positive Selektionseigenschaft bereitgestellt wird.
Die embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), die im Allgemeinen zur Produktion der Knockout-Tiere verwendet werden, sind von der gleichen Spezies wie das zu generierende Knockout-Tier. Folglich werden zum Beispiel embryonale Stammzellen von der Maus gewöhnlich zur Generierung einer HIP-Knockout-Maus verwendet.
Embryonale Stammzellen werden unter Verwendung von dem Fachmann überall bekannten Verfahren, wie zum Beispiel den von Doetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27–45) beschriebenen, generiert und aufrechterhalten. Es kann jedwede Linie von ES-Zellen verwendet werden, die gewählte Linie wird jedoch in der Regel nach der Fähigkeit der Zellen ausgewählt, in die Keimbahn eines sich entwickelnden Embryos zu integrieren und ein Teil davon zu werden, um auf diese auf diese Weise eine Keimbahn-Transmission des Knockout-Konstrukts zu bilden. Folglich wird angenommen, dass jedwede ES-Zelllinie, die diese Fähigkeit besitzt, zur Verwendung hierin geeignet ist. Die Zellen werden kultiviert und für die Insertion des Knockout-Konstrukts unter Verwendung von dem Fachmann überall bekannten Verfahren, wie zum Beispiel denen, die wie von Robertson in: Teratocarcinomas and Embryonic Stein Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg. IRL Press, Washington, D. C. [1987]); von Bradley et al. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20: 357–371); und von Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1986]) dargelegt, präpariert wurden.
Die Insertion des Knockout-Konstrukts in die ES-Zellen kann unter Verwendung einer Reihe vieler verschiedener im Stand der Technik überall bekannter Verfahren, einschließlich zum Beispiel Elektroporation, Mikroinjektion und Calciumphosphat-Behandlung erreicht werden. Die Elektroporation stellt ein bevorzugtes Insertionsverfahren dar.
Jedes in die Zelle zu insertierende Knockout-Konstrukt muss sich zuerst in der linearen Form befinden. Wenn das Knockout-Konstrukt in einen Vektor inserriert wurde, wird deshalb eine Linearisierung durch Verdau der DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease, die nur zum Schneiden in der Vektorsequenz und nicht in der Knockout-Konstrukt-Sequenz ausgewählt wird, erreicht.
Das Knockout-Konstrukt wird den ES-Zellen zwecks einer dem Fachmann bekannten Insertion unter geeigneten Bedingungen für das gewählte Insertionsverfahren, ausgewählt. Wenn mehr als ein Konstrukt in die ES-Zelle eingeführt werden soll, kann jedes Knockout-Konstrukt gleichzeitig oder jeweils eines auf einmal eingeführt werden.
Wenn die ES-Zellen elektroporiert werden sollen, werden die ES-Zellen und die DNA des Knockout-Konstrukts unter Verwendung einer Elektroporationsmaschine und unter Befolgung der Gebrauchsanleitung des Herstellers einem elektrischen Puls ausgesetzt. Nach der Elektroporation dürfen sich die ES-Zellen unter geeigneten Inkubationsbedingungen in der Regel erholen. Die Zellen werden dann auf die Anwesenheit des Knockout-Konstrukts gescreent.
Das Screening kann unter Verwendung einer Reihe verschiedener Verfahren erreicht werden. Wenn es sich bei dem Markergen um ein Antibiotika-Resistenzgen handelt, können die ES-Zellen in Anwesenheit einer andernfalls letalen Antibiotika-Konzentration kultiviert werden. Die ES-Zellen, die überleben, haben vermutlich das Knockout-Konstrukt integriert. Wenn das Markergen anders als ein Antibiotika- Resistenzgen ist, kann ein Southern-Blot von der genomischen DNA der ES-Zelle mit einer DNA-Sequenz sondiert werden, die zum Hybridisieren von nur der Marker-Sequenz bestimmt ist. Als Alternative kann die PCR verwendet werden. Wenn das Markergen letztendlich ein Gen darstellt, das ein Enzym codiert, dessen Aktivität (zum Beispiel β-Galactosidase) nachgewiesen werden kann, kann das Enzym-Substrat den Zellen unter geeigneten Bedingungen zugefügt werden, und die enzymatische Aktivität kann analysiert werden. Einem Fachmann werden andere nützliche Marker und die Mittel zum Nachweis ihrer Anwesenheit in einer gegebenen Zelle vertraut sein. Es wird auch in Betracht gezogen, dass sich alle solche Marker, die eingeschlossen werden, im Rahmen dieser erfindungsgemäßen Lehre befinden.
Das Knockout-Konstrukt kann in mehrere Stellen im ES-Zellgenom integrieren und kann aufgrund des Auftretens von zufälligen Insertionsereignissen in eine unterschiedliche Stelle in jedem Genom der ES-Zelle integrieren. Die gewünschte Insertionsstelle befindet sich in einer komplementären Position zu der durch Knockout auszuschaltenden DNA-Sequenz, wie zum Beispiel der HIP-Codiersequenz und der transkriptionalen Regulationssequenz. usw. In der Regel integrieren weniger als ca. 1–5 Prozent der das Knockout-Konstrukt aufnehmenden ES-Zellen, die das Knockout-Konstrukt tatsächlich in die gewünschte Stelle integrieren. Zur Identifikation der ES-Zellen mit ordnungsgemäßer Integration des Knockout-Konstrukts kann die Gesamt-DNA unter Verwendung von Standardverfahren aus den ES-Zellen extrahiert werden. Die DNA kann dann auf einem Southern-Blot mit einer Sonde oder Sonden sondiert werden, die zur Hybridisierung in einem spezifischen Muster an genomische DNA, die mit (einem) bestimmten Restriktionsenzymen) verdaut wurde, bestimmt ist. Als Alternative oder zusätzlich kann die genomische DNA durch die PCR mit Sonden, die speziell zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten einer bestimmten Größe und Sequenz bestimmt sind, amplifiziert werden (das heißt nur die Zellen, die das Knockout-Konstrukt in der richtigen Position halten, werden DNA-Fragmente der richtigen Größe generieren).
Nachdem geeignete ES-Zellen, die das Knockout-Konstrukt an der richtigen Stelle enthalten, identifiziert wurden, können die Zellen in einen Embryo insertiert werden. Die Insertion kann auf viele verschiedene dem Fachmann bekannte Weisen erreicht werden, ein bevorzugtes Verfahren stellt jedoch die Mikroinjektion dar. Für die Mikroinjektion werden ca. 10–30 Zellen in eine Mikropipette gesammelt und in Embryos injiziert, die sich auf der richtigen Entwicklungsstufe befinden, um die Integration der ES-Fremdzelle, enthaltend das Knockout-Konstrukt, in den sich entwickelnden Embryo zu erlauben. Die transformierten ES-Zellen können zum Beispiel in Blastocyten mikroinjiziert werden.
Nachdem die ES-Zelle in den Embryo eingeführt wurde, kann der Embryo in den Uterus einer pseudoschwangeren Ersatzmutter („foster mother") zur Gestation implantiert werden. Während jedwede Ersatzmutter verwendet werden kann, wird die Ersatzmutter in der Regel aufgrund ihrer Fähigkeit, brüten und reproduzieren zu können sowie aufgrund ihrer Fähigkeit, für den Nachwuchs sorgen zu können, ausgewählt. Solche Ersatzmütter werden in der Regel durch Paarung mit vasektomierten männlichen Individuen der gleichen Spezies vorbereitet. Das Stadium der pseudoschwangeren Ersatzmutter ist für die erfolgreiche Implantation wichtig, und sie ist Spezies-abhängig.
Nachkommen, die von der Ersatzmutter geboren werden, können initial auf HIP-Disruptanten gescreent werden, DNA aus dem Gewebe der Nachkommen kann auf die Anwesenheit des Knockout-Konstrukts unter Verwendung der Southern-Blots und/oder PCR, wie vorstehend beschrieben, gescreent werden. Nachkommen, die Mosaike zu sein scheinen, können dann miteinander gekreuzt werden, wenn die Ansicht besteht, dass sie das Knockout-Konstrukt in ihrer Keimbahn tragen, um homozygote Knockout-Tiere zu generieren. Homozygote können durch das Southern-Blotting von äquivalenten Mengen genomischer DNA aus Tieren, bei denen es sich um das Produkt dieser Kreuzung handelt, ebenso wie Tieren, bei denen es sich um bekannte Heterozygote und Wildtyp-Tiere handelt, identifiziert werden.
Andere Mittel zur Identifikation und Charakterisierung der Knockout-Nachkommen stehen zur Verfügung. Die Northern-Blots können zum Beispiel zum Sondieren der mRNA auf die An- oder Abwesenheit von Transkripten von entweder dem HIP-Gen, dem Markergen oder beiden verwendet werden. Außerdem können Western-Blots zur Beurteilung des (Verlusts des) Expressionsspiegels des durch Knockout ausgeschalteten HIP-Gens in verschiedenen Geweben der Nachkommen durch Sondieren des Western-Blots mit einem Antikörper gegen das HIP-Protein oder einen Antikörper gegen das Markergen-Produkt, wenn dieses Gen exprimiert wird, verwendet werden. Letztendlich kann eine In-situ-Analyse (zum Beispiel das Fixieren der Zellen und Markieren mit einem Antikörper) und/oder der FACS-Analyse von verschiedenen Zellen (Analyse durch Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren von Zellen) aus den Nachkommen unter Verwendung geeigneter Antikörper oder HIP-Liganden, zum Beispiel Hedgehog-Proteinen durchgeführt werden, um die An- oder Abwesenheit des Genprodukts des Knockout-Konstrukts zu ermitteln.
Tiere, die mehr als ein Knockout-Konstrukt und/oder mehr als ein Transgen-Expressionskonstrukt enthalten, werden auf jedwede von mehreren Weisen hergestellt. Die bevorzugte Herstellungsweise besteht in der Generierung einer Reihe von Tieren, von denen jedes gewünschte transgene Phänotypen enthält. Solche Tiere werden durch eine Reihe von Kreuzungen, Rückkreuzungen und Selektionen zusammen gezüchtet, um letztendlich ein einzelnes Tier zu generieren, das alle gewünschten Knockout-Konstrukte und/oder Expressionskonstrukte enthält, wenn das Tier, abgesehen von der Anwesenheit des Knockout-Konstrukts/der Knockout-Konstrukte und/oder dem/den Transgen(en), anderweitig congenisch (genetisch identisch) mit dem Wildtyp ist. Folglich kann eine transgene Vogelspezies durch Züchten eines ersten transgenen Vogels, in dem das Wildtyp-HIP-Gen disruptiert ist, mit einem zweiten transgenen Vogel, der manipuliert wurde, um ein mutantes HIP zu exprimieren, das die meisten anderen biologischen Funktionen des Receptors beibehält, generiert werden.
Die transformierten Tiere, ihre Abkömmlinge und erfindungsgemäßen Zelllinien stellen mehrere wichtige Verwendungszwecke bereit, die vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres erkannt werden.
Zur Erläuterung sei angemerkt, dass die transgenen Tiere und Zelllinien insbesondere beim Screening von Verbindungen nützlich sind, die ein Potenzial als prophylaktische oder therapeutische Behandlungen von Erkrankungen aufweisen, die zum Beispiel an der aberranten Expression oder dem Verlust eines HIP-Gens, oder der aberranten oder unerwünschten Aktivierung des Receptor-Signalisierens beteiligt sein könnten. Das Screening auf ein nützliches Arzneimittel würde die Verabreichung des Kandidatenarzneimittels über einen Dosisbereich an das transgene Tier und die Bestimmung an verschiedenen Zeitpunkten auf die Wirkungen) des Arzneimittels auf die zu bewertende Erkrankung oder Störung beinhaltet. Als Alternative oder zusätzlich könnte das Arzneimittel gegebenenfalls vor der Exposition gegenüber der Induktion der Erkrankung oder gleichzeitig verabreicht werden.
In einer Ausführungsform werden Kandidatenverbindungen gescreent, wobei sie an das transgene Tier über einen Dosisbereich hinweg verabreicht werden und das physiologische Ansprechen des Tieres auf die Verbindungen) in Abhängigkeit zur Zeit bewertet wird. Die Verabreichung kann oral oder durch eine geeignete Injektion in Abhängigkeit von der chemischen Natur der zu bewertenden Verbindung erfolgen. In einigen Fällen könnte es gegebenenfalls angemessen sein, die Verbindung zusammen mit Cofaktoren zu verabreichen, die die Wirksamkeit der Verbindung verstärken würden.
Beim Screening von sich von erfindungsgemäßen transgenen Tieren herleitenden Zelllinien auf Verbindungen, die in der Behandlung verschiedener Erkrankungen nützlich sind, wird die Testverbindung dem Zellkulturmedium am entsprechenden Zeitpunkt zugefügt, und die zelluläre Antwort auf die Verbindung wird in Abhängigkeit zur Zeit unter Verwendung der entsprechenden biochemischen und/oder histologischen Assays bewertet. In einigen Fällen könnte es angemessen sein, die Verbindung von Interesse dem Kulturmedium zusammen mit Cofaktoren zuzufügen, die die Wirksamkeit der Verbindung verstärken würden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und/oder rekombinant hergestelltes HIP-(Hedgehog-interagierendes Protein-)Polypeptid, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit irgendeiner von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 identisch ist, oder Hedgehog-interagierendes Fragment desselben, wobei das HIP-Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert und wobei das HIP-Polypeptid Hedgehog-Protein an der Zelloberfläche sequestriert, um die wirksame Konzentration von Hedgehog-Protein zu regulieren.
HIP-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Säugerpolypeptid ist.
HIP-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein menschliches Polypeptid ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid durch eine Nucleinsäure codiert sein kann, die sich unter strikten Bedingungen an eine Sequenz hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 und 14.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Polypeptid längenmäßig mindestens 25 Aminosäurereste umfasst und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet.
Polypeptid nach Anspruch, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 16–678 Resten von SEQ ID NO: 5 und 16–678 Resten von SEQ ID NO: 6, und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, welches Polypeptid die Proliferation von Chondrocyten reguliert.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, welches Polypeptid ein Fusionsprotein ist.
Polypeptid nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid die Differenzierung oder das Überleben von Neuronenzellen fördert und wobei die Neuronenzelle ein dopaminerges Neuron oder ein Motoneuron ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 70 Prozent mit einer Sequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 80 Prozent mit einer Sequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 80 Prozent mit einer Sequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95 Prozent mit einer Sequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit einer Sequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Nucleinsäure codiert ist, die sich unter strikten Bedingungen, einschließlich eines Waschschritts von 0,2 × SSC bei 65 °C, zur Nucleinsäure von SEQ ID NO: 2 hybridisiert und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei die HIP-Aminosäuresequenz einem Fragment von mindestens 100 Aminosäureresten entspricht und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine HIP-Aminosäuresequenz umfasst, die immunologisch mit einem Antikörper kreuzreaktiv ist, der spezifisch ein HIP-Protein bindet, das eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
Isolierter und/oder rekombinant hergestellter Antikörper oder isoliertes und/oder rekombinant hergestelltes Antikörperfragment, der bzw. das mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 spezifisch immunreaktiv ist.
Monoklonaler Antikörper, der mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 spezifisch immunreaktiv ist.
Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 9 erzeugt.
Isolierte Nucleinsäure umfassend eine Codiersequenz, die ein HIP-Polypeptid codiert, welche Nucleinsäure sich unter strikten Bedingungen, einschließlich eines Waschschritts von 0,2 × SSC bei 65 °C, zu einer Sequenz hybridisert, die durch mindestens eine von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 und 14 repräsentiert ist und wobei die Nucleinsäure ein Polypeptid codiert, das sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert, wobei das HIP-Polypeptid Hedgehog-Protein an der Zelloberfläche sequestriert, um die wirksame Konzentration des Hedgehog-Proteins zu regulieren und wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei das HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 70 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8 und wobei die Nucleinsäure ein Polypeptid codiert, das sich an ein Hedgehog-Protein bindet und das Hedgehog-Signalisieren moduliert.
Nucleinsäure umfassend (i) eine Codiersequenz nach Anspruch 21 oder 22 und (ii) eine heterologe transkriptionelle Regulationssequenz.
Expressionsvektor, der in der Lage ist, sich in mindestens einer unter einer prokaryotischen Zelle und eukaryotischen Zelle zu replizieren, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 21 oder 22.
Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 24 transfiziert ist und das rekombinante Polypeptid exprimiert.
Methode zum Herstellen eines rekombinanten HIP-Polypeptids, umfassend das Züchten der Zelle aus Anspruch 25 in einem Zellkulturmedium zum Exprimieren des HIP-Polypeptids und Isolieren des HIP-Polypeptids von der Zellkultur.
Rekombinantes Transfektionssystem, umfassend: (i) ein Genkonstrukt, enthaltend die Nucleinsäure nach Anspruch 21 oder 22, die funktionsfähig mit einer transkriptionellen Regulationssequenz verknüpft ist, um die Expression des HIP-Polypeptids in eukaryotischen Zellen zu verursachen und (ii) eine Genabgabezusammensetzung für das Abgeben des Genkonstrukts an eine Zelle und Verursachen, dass die Zelle mit dem Genkonstrukt transfiziert wird.
Rekombinantes Transfektionssystem nach Anspruch 27, wobei die Genabgabezusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend einem rekombinanten Virenpartikel, einem Liposom und einem polykationischen Nucleinsäurebindemittel.
Gereinigte Zusammensetzung einer Antisense-Nucleinsäure, die sich unter physiologischen Bedingungen spezifisch zu einem HIP-Gen hybridisiert und die Expression desselben hemmt, welches HIP-Gen eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die sich unter strikten Bedingungen, einschließlich eines Waschschritts von 0,2 × SSC bei 65 °C, zu einer Sequenz hybridisiert, die in mindestens einer von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 und 14 repräsentiert ist und welches HIP-Gen eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8, wobei die Antisense-Nucleinsäure mindestens eine ist von (i) einem synthetischen Oligonucleotid, (ii) einstrangig, (iii) linear (iv) längenmäßig 10 bis 50 Nucleotide umfasst und (v) einem DNA-Analog, das gegen Nucleaseabbau widerstandsfähig ist.
Zubereitung nach Anspruch 29, wobei die Antisensenucleinsäure ein DNA-Analog ist, das gegen Nucleaseabbau widerstandsfähig ist.
Nichtmenschliches transgenes Tier, bei dem HIP-abhängige Transduktionswege in einem oder mehreren Geweben des Tiers durch Unterbrechung eines HIP-Gens gehemmt sind, wobei das HIP-Gen eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die sich unter strikten Bedingungen, einschließlich eines Waschschritts von 0,2 × SSC bei 65 °C, zu einer Sequenz hybridisiert, die in mindestens einer von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 und 14 repräsentiert ist und wobei die Nucleinsäure ein Polypeptid codiert, das sich an ein Hedgehog-Protein bindet und die Hedgehog-Signalisierung moduliert und wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8.
Assay für das Identifizieren von Verbindungen, die die biologische HIP-Aktivität modulieren, umfassend: (a) das Bilden einer Reaktionsmischung enthaltend: (i) ein HIP-Polypeptid, welches HIP-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Nucleinsäuresequenz codiert ist, die sich unter strikten Bedingungen, einschließlich eines Waschschritts von 0,2 × SSC bei 65 °C zu einer Sequenz hybridisiert, die in mindestens einer von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 repräsentiert ist und wobei das Polypeptid sich an ein Hedgehog-Protein bindet und die Hedgehog-Signalisierung moduliert und wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 60 % mit einer Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8, (ii) ein Hedgehog-Protein und (iii) eine Testverbindung; und (b) Nachweis der Wechselwirkung des HIP-Polypeptids und Hedgehog-Proteins; wobei eine Änderung der Wechselwirkung des Hedgehog-Proteins und HIP-Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung im Vergleich mit der Wechselwirkung in Abwesenheit der Testverbindung eine potenzielle HIP-Modulieraktivität für die Testverbindung anzeigt.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Reaktionsmischung eine zellfreie Proteinzubereitung ist.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Reaktionsmischung eine rekombinante Zelle umfasst, die eine heterologe Nucleinsäure einschließt, die rekombinant das HIP-Polypeptid exprimiert.
Assay nach Anspruch 32, wobei der Schritt des Nachweises der Wechselwirkung des Hedgehog-Proteins und HIP-Polypeptids einen kompetitiven Bindungsassay umfasst.
Assay nach Anspruch 34, wobei der Schritt des Nachweises der Wechselwirkung des Hedgehog-Proteins und HIP-Polypeptids den Nachweis der Änderung des Niveaus an intrazellulärem zweitem Boten umfasst, der auf das Signalisieren durch Hedgehog-Protein anspricht.
Assay nach Anspruch 34, wobei der Schritt des Nachweises der Wechselwirkung des Hedgehog-Proteins und HIP-Polypeptids den Nachweis der Änderung des Expressionsniveaus eines Gens umfasst, das von einer transkriptionellen Regulationssequenz kontrolliert ist, die für Hedgehog-Signaltransduktion empfänglich ist.
Assay nach Anspruch 34, wobei der rekombinanten Zelle im Wesentlichen die Expression eines endogenen HIP-Proteins fehlt.
Assay nach Anspruch 34, wobei die rekombinante Zelle ein Patched-Protein koexprimiert.
Assay nach Anspruch 34, wobei die rekombinante Zelle ein Smoothened-Protein koexprimiert.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Reaktionsmischung eine Zellmembranzubereitung ist.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Reaktionsmischung eine rekonstituierte Proteinmischung ist.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Reaktionsmischung ein Liposom ist, das das HIP-Polypeptid als Hedgehog-Rezeptor rekonstituiert.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Schritte des Assays für eine vielfältige Bibliothek von mindestens 100 verschiedenen Testverbindungen wiederholt werden.
Assay nach Anspruch 32, wobei die Testverbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus kleinen organischen Molekülen und natürlichen Produktextrakten.