ES2278396T3 - Proteinas que interaccionan con hedgehog y usos relacionados de las mismas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA FAMILIA DE PROTEINAS QUE SE UNEN A HEDGEHOG, DENOMINADAS AQUI PROTEINAS QUE INTERACCIONAN CON HEDGEHOG O HIPS, LAS CUALES SE HA DEMOSTRADO QUE SE UNEN A LOS POLIPEPTIDOS HEDGEHOG CON ELEVADA AFINIDAD. COMO SE DESCRIBE EN LA INVENCION, LAS PROTEINAS HIP DE VERTEBRADOS PRESENTAN DOMINIOS DE EXPRESION ESPACIAL Y TEMPORALMENTE RESTRINGIDOS, INDICATIVOS DE ROLES IMPORTANTES EN LA INDUCCION MEDIADA POR HEDGEHOG.

Description

Proteínas que interaccionan con hedgehog y usos relacionados de las mismas.

Antecedentes de la invención

La formación de modelos es la actividad por la cual las células embriónicas forman arreglos de tejidos diferenciados espacialmente ordenados. La complejidad física de organismos superiores se presenta durante la embriogénesis a través de la interacción del linaje intrínseco de células y la señalización extrínseca de células. Las interacciones inductivas son esenciales para los modelos embriónicos en el desarrollo de los vertebrados desde el primer establecimiento del plan del cuerpo, para los modelos de los sistemas de órganos, para la generación de diversos tipos de células durante la diferenciación de tejidos (E. Davidson (1990) Development 108: 365-389; J. B. Gurdon (1992) Cell 68: 185-199; T. M. Jessell y col., (1992) Cell 68: 257-270). Los efectos del desarrollo de las interacciones de las células son variados. De forma típica, las células que responden son desviadas de una ruta de diferenciación de células a otra por las células inductoras que difieren tanto de los estados no inducidos como inducidos de las células que responden (inducciones). Algunas veces las células inducen a sus vecinas para diferenciarse al igual que ellas mismas (inducción homoiogenética); en otros casos una célula inhibe a sus vecinas de la diferenciación al igual que ella misma. Las interacciones de células en el desarrollo inicial pueden ser secuenciales, tal como una inducción inicial entre dos tipos de células conduce a una amplificación progresiva de la diversidad. Además, las interacciones inductivas se producen no sólo en embriones, sino también en células adultas, y pueden actuar para establecer y mantener modelos morfogenéticos así como para inducir diferenciación (J.B. Gurdon (1992) Cell 68: 185-199).

El origen del sistema nervioso en todos los vertebrados puede ser rastreado hasta el final de la gastrulación. En este momento, el ectodermo en el lado dorsal del embrión cambia su destino de epidermal a neural. El neuroectoderma recién formado se espesa para formar una estructura aplanada llamada la placa neural que es caracterizada, en algunos vertebrados, por un surco central (surco neural) y ejes laterales espesos (pliegues neurales). En sus primeros estadios de diferenciación, la placa neural ya muestra signos de diferenciación regional junto con su eje posterior anterior (A-P) y mediolateral (M-L). Los pliegues neurales se fusionan eventualmente en la línea media dorsal para formar el tubo neural que se diferenciará en el cerebro en su terminación anterior y la médula espinal en su terminación posterior. El cierre del tubo neural crea diferencias dorsal/ventral en virtud de la diferenciación mediolateral previa. De este modo, al final de la neurulación, el tubo neural tiene una clara polaridad anterior-posterior (A-P), dorsal ventral (D-V) y mediolateral (M-L) (ver, por ejemplo, Principles in Neural Science (3ª), eds. Kandel, Schwartz y Jessell, Elsevier Science Publishing Company: NY, 1991; y Developmental Biology (3ª), ed. S.F. Gilbert, Sinauer Associates: Sunderland MA, 1991). Las interacciones inductivas que definen el destino de las células en el tubo neural establecen el modelo inicial del sistema nervioso vertebrado embriónico. En la médula espinal, la identidad de los tipos de células es controlada, en parte, por señales a partir de dos grupos de células de la línea media, la placa notocordal y el suelo del tubo neural, que inducen a las células de la placa neural a diferenciarse entre el suelo del tubo neural, las neuronas motores, y otros tipos neuronales ventrales (van Straaten y col. (1988) Anat. Embryol. 177: 317-324; Placzek y col. (1993) Development 117: 205-218; Yamada y col. (1991) Cell 64: 035-647; y Hatta y col. (1991) Nature 350: 339-341). Además, las señales del suelo del tubo neural son responsables de la orientación y dirección del sobre crecimiento del la neurona de la comisura (M. Placzek y col., (1990) Development 110: 19-30). Además de modelar el tubo neural, la placa notocordal y el suelo del tubo neural son también responsables de la producción de señales que controlan el diseño de los somitas por inhibición de la diferenciación de los derivados del somita dorsal en las regiones ventrales (B. Brand-Saberi y col., (1993) Anat. Embryol. 188: 239-245; O. Porquie y col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5242-5246).

Existe otro importante centro de señalización en el mesénquima posterior de las yemas de los miembros en desarrollo, llamado Zona de Polarización de la Actividad, o "ZPA". Cuando el tejido de la región posterior de la yema del miembro es injertada al borde anterior de una segunda yema de un miembro, el miembro resultante se desarrollará con dígitos adicionales una secuencia de imagen especular junto con el eje anteroposterior (Saunders y Gasseling, (1968) Epithelial-Mesenchymal Interaction, págs. 78-97). Este descubrimiento ha conducido al modelo del que la ZPA es responsable para el diseño anteroposterior en el miembro. Se ha sostenido la hipótesis de que la ZPA funciona por la liberación de una señal, llamada un "morfogen", que forma un gradiente a través de la temprana yema embriónica. De acuerdo con este modelo, el destino de las células a diferentes distancias de la ZPA viene determinada por la concentración local del morfogen, con umbrales específicos del morfogen que induce estructuras sucesivas (Wolpert, (1969) Theor. Biol. 25: 1-47). Esto viene soportado por el descubrimiento de la extensión de la duplicación de dígitos es proporcional al número de las células de la ZPA implantada (Tickle, (1981) Nature 254: 199-202).

Aunque se conoce desde hace años la existencia de señales inductivas en la ZPA, sólo ahora se empiezan a elucidar las identidades moleculares de estas señales. Una importante etapa adicional ha sido el descubrimiento de que la proteína secretada Sonic hedgehog (Shh) es producida en varios tejidos con propiedades de organización, incluyendo la placa notocordal y el suelo del tubo neural y la ZPA (Echelard y col., (1993), Cell 75: 1417-1430; M.J. Bitgood y A.P. McMahon (1995) Dev. Biol. 172: 126-38). La Shh mal expresada mimetiza los efectos inductivos en la placa notocordal extópica en el tubo neural y somitas (Echelard y col. (1993) supra) y también mimetiza la función de la ZPA
en la yema del miembro (Riddle y col. (1993) Cell 75: 1401-16; Chang y col. (1994) Development 120: 3339-53).

La familia de vertebrados de los genes de hedgehog incluye al menos cuatro miembros, por ej., paralogos del gen hedgehog de la drosophila única. Se han descrito ejemplos de genes de hedgehog y proteínas en las publicaciones de patentes PCT WO 95/18856 y WO 96/17924. Tres de estos miembros, a los que se hace referencia en la presente invención como Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) y Indian hedgehog (Ihh), que aparentemente existen en todos los vertebrados, incluyendo peces, pájaros y mamíferos. Un cuarto miembro, al que se hace referencia en la presente invención como hedgehog de bígaro (Thh), parece específico de peces. El Desert hedgehog (Dhh) es expresado principalmente en ensayos, tanto en desarrollos embriónicos de ratón como el roedores adultos y humanos; el Indian hedgehog (Ihh) está implicado en el desarrollo de huesos durante la embriogénesis y en la formación de huesos en el adulto; y Shh, que tal como se ha descrito anteriormente, es implicado ante todo en las actividades morfogénicas y neuroinductivas. Dados los papeles inductivos críticos de los polipéptidos de hedgehog en el desarrollo y el mantenimiento de los órganos de vertebrados, es de suma importancia la identificación de las proteínas de interacción del hedgehog tanto en contextos clínicos como de investigación.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva clase de proteínas que se unen al hedgehog, al que se hace referencia como HIP (para proteína de interacción del hedgehog). Los polipéptidos del HIP de la presente invención incluyen polipéptidos que unen los productos de la familia del gen hedgehog. Los miembros de la familia hedgehog son conocidos por su amplia implicación en la formación y el mantenimiento de distribuciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados, tanto adultos como embriónicos, y pueden ser utilizados para generar y/o mantener una selección de diferentes tejidos de vertebrados tanto in vitro como in vivo.

En general, la invención pone de relieve polipétidos de la HIP aislados, preferiblemente preparaciones sustancialmente puras de la materia polipéptidos de la HIP. La invención también proporciona polipéptidos de la HIP producidos de forma recombinante. En las realizaciones preferidas el polipéptido tiene una actividad biológica que incluye la capacidad de unir una proteína hedgehog con alta afinidad, por ej., con una constante de disociación nanomolar o menor (K_{D}). Se contemplan de forma específica los polipéptidos de la HIP que antagonizan de forma específica dichas actividades, tal como pueden ser proporcionadas por mutantes de trucación.

En una realización, el polipéptido es idéntico con o homólogo a un polipéptido de la HIP representado en la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, o la secuencia de polipéptido del núcleo del mismo (por ej., correspondiente a los residuos 16-678 de la SEC ID Nos: 5 o 6). También se contemplan los miembros relacionados de la familia de la HIP, por ejemplo, un polipéptido de la HIP tiene preferiblemente una secuencia de amino ácidos de al menos un 65%, 67%, 69%, 70%, 75% o 80% homóloga a un polipéptido representado por la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8 si bien también se contemplan los polipéptidos con homologías de secuencia superiores de, por ejemplo, 82%, 85%, 90% y 95%. En una realización preferida, el polipéptido de la HIP es codificado por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones astringentes con una secuencia de ácido nucleico representada por uno o más de las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14. Los homólogos de la materia proteínas de la HIP también incluyen versiones de la proteína que son resistentes a la modificación post-traducción, tal como por ejemplo, debido a mutaciones que alteran los sitios de modificación (tales como los residuos de tirosina, treonina, serina o asparagina), o que previenen la glicosilación de la proteína, o previenen la interacción de la proteína con un ligando de la HIP, por ej., un polipéptido de hedgehog.

El polipéptido de la HIP puede comprender una proteína de longitud completa, tal como la representada en la SEC ID No:5, SEC ID No: 6 o la SEC ID No: 7, o puede incluir la secuencia de polipéptido del núcleo del mismo (por ej., correspondiente a los residuos 16-678 de la SEC ID Nos. 5 o 6), o puede incluir un fragmento correspondiente a uno o más motivos/dominios particulares, o a tamaños arbitrarios, por ej., al menos 5, 10, 25, 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas, el polipéptido de la HIP incluye una parte suficiente del dominio de unión del ligando extracelular capaz de unirse de forma específica a un ligando hedgehog, preferiblemente con una K_{D} de 9 \muM o menos o incluso más preferiblemente de 9 nM o menos. Las formas truncadas de la proteína incluyen, pero no están limitadas a, fragmentos del dominio de unión del ligando soluble.

En ciertas realizaciones preferidas, la invención pone de relieve un polipéptido de la HIP purificado o recombinante que tiene un peso molecular del polipéptido del núcleo de aproximadamente 78,4 kd. En otras realizaciones, el núcleo del péptido de una proteína de la HIP madura tiene preferiblemente un peso molecular en el intervalo de 38,6 a 76,8 kD. Se deberá entender que ciertas modificaciones post-traduccionales, por ej., la glicosilación, prenilación, miristilación y similares, pueden incrementar el peso molecular aparente de la proteína de la HIP en relación a la cadena de polipéptido no modificada.

Las proteínas objeto también pueden ser proporcionadas como moléculas quiméricas, tales como en la forma de proteínas de fusión. Por ejemplo, la proteína de la HIP puede ser proporcionada como una proteína de fusión recombinante que incluye una segunda parte de polipéptido, por ej., un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos no relacionada (heteróloga) al polipéptido de la HIP, por ej., la segunda porción del polipéptido es glutationa-S-transferasa, por ej., la segunda porción del polipéptido es una actividad enzimática tal como la fosfatasa alcalina, por ej., la segunda parte del polipéptido es una marca de epitope.

En todavía otra realización, la invención pone de relieve que los ácidos nucleicos que codifican los polipétidos de la HIP, que tienen la capacidad de modular, por ej., tanto mimetizar como antagonizar, al menos una parte de la actividad de un polipéptido de la HIP de tipo salvaje. Ejemplos de las secuencias de ácido nucleico que codifican la HIP están representados por la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 o SEC ID No: 4.

En otra realización, los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen las secuencias de codificación que hibridan bajo condiciones astringentes con todas o una parte de las secuencias de codificación designadas en una o más de las SEC ID Nos: 1-4. Las secuencias de codificación de los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias que son idénticas a las secuencias de codificación representadas en las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, o pueden ser simplemente homólogas a dichas secuencias. En realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos codifican polipéptidos que modulan de forma específica, actuando tanto como agonistas o como antagonistas, una o más de las bioactividades de los polipéptidos de la HIP de tipo salvaje.

Además, en ciertas realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos de la HIP objeto de la invención incluirán una secuencia reguladora transcripcional, por ej. al menos uno de los promotores transcripcionales o la secuencia de intensificación transcripcional, cuya secuencia reguladora está unida de forma operable a las secuencias del gen de la HIP. Dichas secuencias reguladoras pueden ser utilizadas para dar lugar a secuencias del gen de la HIP adecuadas para uso como un vector de expresión. La secuencia reguladora transcripcional puede ser de un gen de la HIP, o de un gen heterólogo.

Esta invención también contempla las células transfectadas con dicho vector de expresión tanto procarióticas como eucarióticas y un método para la producción de proteínas de la HIP mediante el uso de dichos vectores de expresión.

La solicitud también describe una construcción de activación del gen, en donde la construcción de activación del gen está diseñada para recombinar con un gen de la HIP genómica en una célula para proporcionar, por ej., por recombinación heteróloga, una secuencia reguladora transcripcional heteróloga unida de forma operativa a una secuencia de codificación de un gen de la HIP genómico. También se contemplan de forma específica las células que tienen genes de la HIP genómicos modificados por construcciones de activación del gen.

En todavía otra realización, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones astringentes a sondas de ácidos nucleicos correspondientes a al menos 12 nucleótidos consecutivos tanto de secuencias con sentido o antisentido de la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 y la SEC ID No: 4; aunque preferiblemente a al menos 25 nucleótidos consecutivos; y más preferiblemente a al menos 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos tanto de la secuencia con sentido o anti sentido de la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 y la SEC ID No: 4.

Todavía otro aspecto de la presente invención concierne a un inmunogen que comprende un polipéptido de la HIP en una preparación inmunogénica, siendo el inmunogen capaz de elucidar una respuesta inmune específica para el polipéptido de la HIP; por ej., una respuesta humoral, por ej., una respuesta de anticuerpo; por ej., una respuesta celular. En realizaciones preferidas, el inmunogen comprende un determinante antigénico, por ej., un único determinante, a partir de una proteína representada por una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y/o SEC ID No:
8.

Todavía otro aspecto adicional de la presente invención concierne a anticuerpos y preparaciones de anticuerpos específicamente reactivos con un epitope del inmunogen de la HIP.

La invención también se refiere a animales no humanos transgénicos, por ej., ratones, ratas, conejos, pollos, ranas o cerdos, que tengan un transgen, por ej., animales que incluyan (y preferiblemente expresen) un heterólogo a partir de un gen de la HIP descrito en la presente invención, o que expresen mal un gen de la HIP endógeno, por ej., un animal en el que esté interrumpida la expresión de una o más de las proteínas de la HIP del sujeto. Dicho animal transgénico puede servir como un modelo animal para estudiar los trastornos celulares y del tejido que comprenden alelos de la HIP mutados o mal expresados o para uso en la selección de fármacos.

La solicitud también describe una sonda/prímero que comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado, en donde el oligonucleótido comprende una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes a al menos 12 nucleótidos consecutivos de secuencias con sentido o antisentido de cualquiera o más de las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14, o a los mutantes del mismo que se producen de forma natural. En las realizaciones preferidas, la sonda/prímero incluye de forma adicional un grupo marcado unido al mismo y capaz de ser detectado. El grupo marcado puede ser seleccionado, por ej., entre un grupo que consiste en radioisótopos, compuestos fluorescentes, enzimas, y cofactores de la enzima. Las sondas de la invención pueden ser utilizadas como una parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar las disfunciones asociadas con una mala expresión de la proteína de la HIP, tal como para la detección en una muestra de células aisladas de un paciente, un nivel de un ácido nucleico que codifica una proteína de la HIP; por ej., la medición de un nivel de mARN de la HIP en una célula, o la determinación de si un gen de la HIP genómico ha sido mutado o suprimido. Estas "sondas/prímeros" así llamados de la invención pueden también ser utilizadas como parte de la terapia "antisentido" que hace referencia a la administración o a la generación in situ de sondas de oligonucleótidos o sus derivados que se hibridan de forma específica (por ej., se unen) bajo condiciones celulares, con el mARN celular y/o el ADN genómico que codifica uno o más de las proteínas de la HIP del sujeto de modo que inhiban la expresión de dicha proteína, por ej., por inhibición de la transcripción y/o traducción. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene una longitud de al menos 12 nucleótidos, aunque también se contemplan los prímeros de una longitud de 25, 40, 50 ó 75 nucleótidos.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un ensayo para la selección de compuestos de ensayo para inhibidores, o de forma alternativa, potenciadores, de una interacción entre una proteína hedgehog y un receptor del polipéptido de la HIP. Un método de ejemplo incluye las etapas de (a) formación de una mezcla de reacción que incluye: (i) un polipéptido hedgehog, (ii) un polipéptido de la HIP, y (iii) un compuesto de ensayo; y (b) la detección de la interacción entre los polipéptidos hedgehog y de la HIP. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) en la interacción de los polipéptidos hedgehog y de la HIP en la presencia del compuesto de ensayo, relativo a la interacción en ausencia del compuesto del ensayo, indica un agonista potencial (mimético o potenciador) o un antagonista (inhibidor) de la bioactividad de hedgehog para el compuesto del ensayo. La mezcla de reacción puede ser una preparación de proteína libre de células, por ej., una mezcla de proteínas reconstituida o un lisado de células, o puede ser una célula recombinante incluyendo un ácido nucleico heterólogo que exprese de forma recombinante el polipéptido de las HIP.

En realizaciones preferidas, la etapa de detección de la interacción de los polipétidos hedgehog y de la HIP es un ensayo de unión competitivo. En otras realizaciones preferidas, la etapa de interacción de la detección de los polipéptidos hedgehog y de la HIP implica la detección, en un ensayo de base celular, de cambio(s) en el nivel de un segundo mensajero intracelular responsable para la señalización mediada por el polipéptido de la HIP. En todavía otra realización preferida, la etapa de detección de la interacción de los polipétidos de hedgehog y de la HIP comprende la detección, en un ensayo de base celular, de cambio(s) en el nivel de expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora transcripcional responsable de la señalización para el polipétido de la HIP.

En realizaciones preferidas, las etapas del ensayo son repetidas para una amplia biblioteca de al menos 100 compuestos de ensayo diferentes, más preferiblemente al menos 10^{3}, 10^{4} o 10^{5} compuestos de ensayo diferentes. El compuesto de ensayo puede ser, por ej., un péptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, una molécula orgánica pequeña, o un extracto de producto natural (o fracción del mismo).

La presente invención contempla además la formulación farmacéutica de uno o más agentes identificados en dichos ensayos de selección de fármacos.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona una molécula, preferiblemente una molécula orgánica pequeña, que se une a la HIP y que tanto mimetiza como antagoniza la señalización inducida por hedgehog en células que expresan la HIP.

La solicitud también describe un método de modular una o más variables como el crecimiento, la diferenciación o la supervivencia de una célula por modulación de la bioactividad de la HIP, por ej., por potenciación o interrupción de ciertas interacciones proteína-proteína. En general, tanto si se lleva a cabo in vivo, in vitro, o in situ, el método comprende el tratamiento de la célula con una cantidad efectiva de un terapéutico de la HIP de modo que altere, en relación a la célula en ausencia de tratamiento, al menos uno de (i) velocidad de crecimiento, (ii) diferenciación, o (iii) supervivencia de la célula. De acuerdo con ello, el método puede ser llevado a cabo con terapéuticos de la HIP tales como péptidos y peptidomiméticos u otras moléculas identificadas en las selecciones de fármacos anteriormente referenciados que agonizan o antagonizan los efectos de señalización a partir de una proteína de la HIP o ligando de unión de una proteína de la HIP, por ej., una proteína de hedgehog. Otros terapéuticos de la HIP incluyen construcciones antisentido para la inhibición de la expresión de proteínas de la HIP, mutantes negativos dominantes de proteínas de la HIP que inhiben de forma competitiva las interacciones de ligandos contra corriente y la transducción de la señal en el sentido de la corriente de la proteína de la HIP de tipo salvaje, y las construcciones de terapia génica incluyendo las construcciones de activación del gen.

En una realización, puede utilizarse el método objeto de modulación de la bioactividad de la HIP en el tratamiento de células testiculares, de modo que module la espermatogénesis. En otra realización, el método sujeto es utilizado para modular la osteogénesis, comprendiendo el tratamiento de células osteogénicas con un agente que modula la bioactividad de la HIP. Del mismo modo, cuando la célula tratada es una célula condrogénica, el presente método se utiliza para modular la condrogénesis. En todavía, otra realización, el método sujeto puede ser utilizado para modular la diferenciación de una célula neuronal, para mantener una célula neuronal en un estado diferenciado, y/o para intensificar la supervivencia de una célula neuronal, por ej., para prevenir la apoptosis u otras formas de muerte celular. Por ejemplo el presente método puede ser utilizado para afectar la diferenciación de células neuronales tales como neuronas motores, neuronas colinérgicas, neuronas dopaminérgicas, neuronas serotonérgicas, y neuronas peptodérgi-
cas.

Otro aspecto de la presente solicitud incluye un método para la determinación de si un sujeto, por ej., un paciente animal, está en riesgo de un trastorno caracterizado por la proliferación de células indeseadas o el control aberrante de la diferenciación a la apoptosis. El método incluye la detección, en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión génica caracterizada por al menos uno de (i) una mutación de un gen que codifica una proteína de la HIP; o (ii) la mala expresión de un gen de la HIP. En realizaciones preferidas, la detección de la lesión genética incluye el establecimiento de la existencia de al menos uno de: una eliminación de uno o más nucleótidos de un gen de la HIP; una adición de uno o más nucleótidos al gen, una sustitución de uno o más nucleótidos del gen, un gran reordenamiento cromosomal del gen; una alteración en el nivel de un trascrito de ARN mensajero del gen; la presencia de un modelo de empalme de tipo no salvaje de un transcrito de ARN mensajero del gen; un nivel de la proteína de tipo no salvaje; y/o un nivel aberrante de proteína de la HIP soluble.

Por ejemplo, la detección de la lesión genética puede incluir (i) proporcionar una sonda/prímero que incluya un oligonucleótido que contenga una región de la secuencia de nucleótido que hibrida para una secuencia con sentido o antisentido de un gen de la HIP o mutantes que se produzcan de forma natural del mismo, o secuencias 5’ o 3’ flanqueadas asociadas de forma natural con el gen de la HIP; (ii) exposición de la sonda/prímero al ácido nucleico del tejido; y (iii) detección, por hibridación de la sonda/prímero al ácido nucleico, la presencia o ausencia de la lesión genética; por ej., en donde la detección de la lesión comprende la utilización de la sonda/prímero para determinar la secuencia de nucleótidos del gen de la HIP y, opcionalmente, de las secuencias de ácido nucleico flanqueantes. Por ejemplo, la sonda/prímero puede ser utilizada en una reacción de cadena de polimerasa (PCR) o en una reacción de cadena de unión (LCR). En realizaciones alterativas, el nivel de proteína de la HIP es detectado en un inmunoensayo utilizando un anticuerpo que es específicamente inmunoreactivo con la proteína de la HIP.

La práctica de la presente invención utilizará, a no ser que se especifique de otro modo, las técnicas convencionales de biología de la célula, del cultivo de la célula, de la biología molecular, la biología transgénica, la microbiología, el ADN recombinante, y la inmunología, que están en el estado de la técnica. Dichas técnicas son explicadas con todo detalle en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); ADN Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y col., patente U.S. No. 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor laboratory); Methods In Enzimology, Vols. 154 y 155 (Wu y col., eds), Immunochemical methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring harbor Laboratory press, cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

Otras características y ventajas de la invención se harán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es una alineación de las secuencias de proteína de la HIP para los homólogos de ratón, humano, pollo y el pez cebra. La flecha hacia arriba indica el ancla hidrofóbico del C terminal.

La Figura 1B es una alineación de las secuencias de codificación para los cADNs aislados de la HIP de ratón, humano, pollo y pez cebra.

La Figura 2 es una representación esquemática de la proteína de la HIP.

La Figura 3 muestra dos representaciones de la unión de una proteína de fusión de la Shh-AP (Ap = fosfatasa alcalina) con proteínas de la HIP y PTC.

La Figura 4 es una representación Northern del tejido múltiple humano para transcritos de la HIP.

La Figura 5 es una representación Northern del tejido múltiple de ratón para transcritos de la HIP.

La Figura 6 ilustra que formas truncadas de la proteína de la HIP, a las que les falta en este ejemplo el C-terminal de 22 aminoácidos, son segregadas en el sobrenadante de la célula, mientras que la longitud total de la proteína de la HIP es retenida en la fracción de células, por eje., permanece unida a la membrana. Además, en presencia de Shh, el anti-Shh puede inmunoprecipitar un complejo incluyendo la forma segregada de la proteína de la HIP.

Descripción detallada de la invención

Es de particular importancia en el desarrollo y mantenimiento del tejido en animales vertebrados un tipo de comunicación extracelular llamada inducción, que se produce entre capas de células vecinas y tejidos. En interacciones inductivas, las señales químicas segregadas por una población de células influencian el destino del desarrollo de una segunda población de células. De forma típica, las células responden a las señales inductivas son desviadas de un destino celular a otro, ninguna de las cuales es la misma que el destino de las células de señalización.

Las señales inductivas son las proteínas reguladoras clave que funcionan en la formación del modelo en vertebrados, y están presentes en importantes centros de señalización conocidos por operar de forma embriónica, por ejemplo, para definir la organización del embrión de vertebrados. Por ejemplo, estas estructuras de señalización incluyen la notocuerda, una estructura transitoria que inicia la formación del sistema nervioso y ayuda a definir los diferentes tipos de neuronas en la misma. La notocuerda también regula el diseño mesodermal a lo largo del eje del cuerpo. Otro grupo distinto de células que tienen una actividad de señalización aparente es la placa del suelo del tubo neural (el precursor de la médula espinal y del cerebro) que también señala la diferenciación de diferentes tipos de células nerviosas. Se cree de forma general que la región del mesodermo en el extremo de las yemas que forman los miembros (llamada la Zona de Polarización de la Actividad o ZPA) opera como un centro de señalización por selección de un morfogen que produce en última instancia el correcto diseño de los miembros en desarrollo.

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La regulación de la señalización de la proteína hedgehog es un mecanismo importante para el control del desarrollo. La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva familia de proteínas de unión del hedgehog, a las que hace referencia en el presente documento como "proteínas de interacción del hedgehog" o "HIPs", que han demostrado unirse a los polipéptidos del hedgehog con alta afinidad. En primer lugar se identificó el clon de al HIP de ratón por técnicas de clonación de expresión por su capacidad para unir se a la proteína hedgehog. Posteriormente, se han clonado una variedad de otros homólogos de vertebrados utilizando sondas y prímeros basados en el clon del ratón, de nuevo por técnicas estándar. Tal como se describe en el presente documento, las proteínas HIP de vertebrados muestran dominios de expresión espacialmente y temporalmente restringidos indicativos de los papeles importantes en la inducción mediada del hedgehog.

La secuencia de genes de la HIP de ejemplo clonados de diferentes vertebrados (ver Tabla 1, a continuación) indica que codifica una proteína segregada que puede estar anclada en la membrana de la célula. La comparación de las secuencias de la HIP de ratón, humano, pollito y pez cebra (ver Figura 1) sugiere una secuencia del péptido señal conservada, un dominio de unión del hedgehog conservada, y un dominio transmembrana potencial. Además, el análisis de las secuencias de proteína sugiere 2 dominios de tipo EGF en la parte del C terminal de la proteína (ver Figura 2). Otros dominios diferentes de estos, las secuencias de codificación de la HIP no muestran una homología de secuencia próxima a cualquiera de los genes previamente identificado, sugiriendo que estos genes comprenden una nueva familia de genes.

Las proteínas HIP, a través de su capacidad para unir las proteínas hedgehog, son aparentemente capaces de modular la señalización de hedgehog. Las proteínas de HIP pueden funcionar como un receptor de hedgehog (o subunidad del mismo), o puede actuar para secuestrar las proteínas de hedgehog a la superficie de la célula y de este modo controlar la concentración efectiva del polipéptido hedgehog disponible a otros receptores hedgehog tales como los parcheados. Las proteínas de la HIP pueden mediar la formación de un gradiente hedgehog por formación de complejos con proteínas hedgehog solubles y afectando la capacidad de aquellas proteínas para interaccionar con los receptores de la superficie de las células. De este modo, los polipéptidos de la HIP de la presente invención pueden afectar a un número de actividades biológicas mediadas por hedgehog incluyendo: una capacidad para modular la proliferación, supervivencia y/o diferenciación de tejido derivado mesodérmicamente, tal como el tejido derivado del mesodermo dorsal, cartílago y tejido implicado en la espermatogénesis; la capacidad para modular la proliferación, supervivencia y/o la diferenciación del tejido derivado ectodérmicamente, tal como el tejido derivado de la epidermis, del tubo neural, o de la mesénquima de la cabeza; la capacidad para modular la proliferación, la supervivencia y/o diferenciación del tejido derivado endodérmicamente, tal como el tejido derivado del intestino primitivo.

Se identificó un cADN de la HIP de ratón en una selección para proteínas de unión a hedgehog potenciales utilizando una biblioteca de cADN de yema de miembro de ratón clonada en un plásmido que permitió la expresión en células, y detección la cantidad de proteína Shh marcada que se une específicamente a las proteínas expresadas. Se identificó un único cono positivo entre 70.000 seleccionados. Los estudios de unión ligando-receptor indican que el polipéptido de la HIP puede unir varios miembros de la familia de hedgehog con una alta afinidad. Por ejemplo, la unión del polipétido de la HIP de murino a cada uno de los Shh y Dhh se produjo con una constante de disociación (k_{d}) de aproximadamente 1 nM. Por ejemplo, ver la Figura 3. Esta unión es comparable a la afinidad de unión de hedgehog observada para parcheados (ver Figura 3). Este descubrimiento sugiere que el cADN de la HIP de ratón puede codificar una proteína de unión de hedgehog general en oposición a la proteína de unión que discrimina de forma selectiva entre homólogos de hedgehog. Sin embargo, se anticipa que otros homólogos de dicha proteína puedan ser capaces de distinguir, por afinidad de unión, entre Shh, Ihh y Dhh.

Además del clon de la HIP de murino, también hemos obtenido clones de cADN de otros vertebrados, incluyendo genes de la HIP de humanos, aves y peces, utilizando el cADN de ratón como una sonda. De acuerdo con el listado de la secuencia del apéndice, (ver también la Tabla 1) se codificó un polipéptido de la HIP de murino por la SEC ID No: 1; se codificó un polipéptido de la HIP humano por la SEC ID No: 2; se codificó un polipéptido de la HIP de pollo por la SEC ID No: 3; y se codificó un polipéptido de la HIP de pez cebra por la SEC ID No: 4.

TABLA 1 Guía de las secuencias de la HIP en el Listado de Secuencia

1

La homología de la secuencia global entre las proteínas de la HIP se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Identidad de la secuencia de amino ácidos entre las proteínas de la HIP de vertebrados

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Mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH), se ha localizado un gen de la HIP humano en la posición cromosomal 4Q31. Tal como se ha ilustrado en las Figuras 4 y 5, el análisis de manchas Northern sugiere que el gen de la HIP está expresado en ciertos tejidos adultos, con mayores niveles indicados en el corazón, músculo esquelético y páncreas, al menos en las muestras de tejido ensayadas hasta la fecha.

Se contempla por la presente invención que los genes de la HIP clonados establecidos en el listado de la secuencia del apéndice, además de representar una familia inter-especies de genes relacionados, son también cada parte de una familia intra-especies. Es decir, se ha anticipado que otros paralogos de las proteínas de la HIP humana y de ratón existen en aquellos animales, y ortólogos de cada gen de la HIP son conservados entre otros animales. Por ejemplo, en condiciones de estringencia baja o media, los transcritos de aproximadamente 4,4 kb y 9 kb se observaron por el análisis Northern de las muestras de ratón (ver Figura 5), representando el último un probable paralogo y/o variante de empalme del cADN de la HIP tal como se ha establecido en la SEC ID No: 1.

Además de la variación de secuencia entre los varios homólogos de la HIP, las proteínas de la HIP de vertebrados está presentes de forma aparentemente natural en un número de diferentes formas, incluyendo una pro-forma. La pro-forma incluye un péptido señal N-terminal (de aproximadamente 1 - 15 residuos N-terminal) para la secreción dirigida de al menos el dominio N terminal de la proteína, mientras que la forma madura de longitud completa le falta esta secuencia de la señal. Además del procesamiento de la forma madura también puede ocurrir en algunos casos que rinda fragmentos biológicamente activos de la proteína.

Del mismo modo, tal como se ha ilustrado en la Figura 6, la proteína de la HIP de longitud completa también incluye un domino de ancla de membrana, por ej., un dominio de transmembrana, comprendido de aproximadamente los 22 aminoácidos del C-terminal. Los polipéptidos de la HIP a los que les falta esta secuencia muestran ser completamente segregados más que unidos de la membrana. Brevemente, se creó una proteína de fusión myc-etiquetada con la secuencia de la HIP de longitud completa, la myc-HIP-1, y una forma truncada de la HIP a la que le faltaban los 22 amino ácidos de C-terminal, myc-HIP-1 (\Delta22). La proteína de fusión myc-HIP-1 demostró que corría sólo ligeramente más lenta (alto PM, peso molecular) que la proteína de la HIP de longitud completa cuando cada una de ellas se detectó por anticuerpos de anti-myc y anti-HIP, respectivamente. Se utilizó el anticuerpo anti-myc para inmunobot las muestras de pellets de células y el sobrenadante producido por células que expresan tanto la proteína de fusión myc-HIP-1 como la proteína de fusión myc-HIP-1 (\Delta22). Para las células que expresan la myc-HIP-1, por ej., que retienen el dominio de anclaje de la membrana putativa, se detecto la proteína esencialmente exclusivamente en el pellet de la célula. Por otra parte, la proteína de myc-HIP-1 (\Delta22) puede ser detectada tanto en el sobrenadante como en el pellet de la célula. Además, la proteína de la myc-HIP-1 (\Delta22) puede ser inmunoprecipitada por el anticuerpo de anti-SHH cuando la proteína de la HIP fue incubada con la proteína de Shh.

Aunque actualmente no hay evidencia que sugiera que la proteína de tipo salvaje es glicosilada, formalmente es posible que las proteínas de la HIP pueden, bajo ciertas circunstancias, también puedas ser modificadas post-traduccionalmente, tal como por glicosilación de unión a O-, S- y/o N-. Los sitios de potencial glicosilacion de Asn, en relación a la secuencia de proteína de la HIP de ratón, incluyen Asn99, Asn416, Asn447 y Asn459. Los sitios de unión para las cadenas de GAG de tipo proteoglicano (por ej., el sulfato de heparan, el sulfato de condroitin y similares) incluyen el Ser235.

Con el fin de determinar, el modelo de expresión de los diferentes clones de la HIP en diferentes especies, se llevaron a cabo estudios de hibridación in situ en el desarrollo de embriones de ratones, pollo y peces. Tal como se describe en los Ejemplos de a continuación, la distribución de ARN de la HIP y su expresión temporal es consistente con un papel de los polipéptidos de la HIP como objetivos en el sentido de la corriente de la señalización de hedgehog. La hibridación in situ de embriones de ratón indican que el ARN de la HIP es expresado a niveles bajos en los sitios en donde la señalización del hedgehog es mínima, es decir, la expresión del Shh, Ihh o Dhh, es mínima y se produce una dramática sobreregulación de la expresión de la HIP en respuesta a la sobreregulación de hedgehog. En primer lugar, la sobreregulación de los polipéptidos de la HIP coincide de forma temporal con la sobreregulación de hh y su expresión se produce en oposición al sitio de expresión del gen hh. En segundo lugar, la expresión ectópica de la HIP (ARN) se produce en respuesta a la expresión ectópica de Shh en el SNC (sistema nervioso central). Además, la expresión de la HIP es activada en respuesta a la expresión de una forma negativa dominante de la proteína quinasa A (PKA) dependiente de cAmp, que también activa otros genes objetivo hh tales como los parcheados. Además, el análisis de ratones mutantes deficientes de Dhh revela una pérdida de la expresión de la HIP en los análisis, que es el sitio objetivo para la señalización de Dhh.

De acuerdo con ello, ciertos aspectos de la presente invención se refieren a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la HIP, los mismos polipéptidos de la HIP (incluyendo varios fragmentos), anticuerpos inmunoreactivos con proteínas de la HIP, y preparaciones de dichas composiciones. Además, la presente invención proporciona ensayos y reactivos terapéuticos y de diagnóstico para la detección y el tratamiento de trastornos que implican, por ejemplo, la expresión aberrante (o la pérdida del mismo) de la HIP, de ligandos de la HIP (particularmente de proteínas hedgehog), o de transductores de señal del mismo.

Además, se proporcionan los ensayos de descubrimiento de fármacos para identificar agentes que puedan modular la función biológica de las proteínas de la HIP, tal como por alteración de la unión de moléculas de la HIP a proteínas de hedgehog u otros factores extracelulares/de matriz, o la capacidad de la unión de la proteína de la HIP para translucir las señales de hedgehog. Dichos agentes pueden ser terapéuticamente útiles para alterar el crecimiento, el mantenimiento y/o la diferenciación de un tejido, de forma particular un tejido derivado del mesodermo, tal como cartílago, tejido implicado en la espermatognénesis y tejido derivado del mesodermo dorsal; tejido derivado ectodérmicamente, tal como tejido derivado de la epidermis, tubo neural, cresta neural, o mesénquima de la cabeza; tejido derivado endodérmicamente, tal como tejido derivado del intestino primitivo. Otros aspectos de la invención están descritos a continuación o serán aparentes para los expertos en la materia a la luz de la presente descripción.

Para una mayor conveniencia, ciertos términos utilizados en la especificación y en las reivindicaciones del apéndice son recogidos a continuación.

El término "proteína de unión de hedgehog" o polipéptido de la "HIP" hace referencia a una familia de polipéptidos caracterizados al menos en parte por ser idénticos o compartir un grado de homología de secuencia con todos o parte de un polipéptido de la HIP representado en cualquiera de las SEC ID Nos: 5-8. Los polipéptidos de la HIP pueden ser clonados o purificados a partir de un número de organismos eucarióticos, especialmente vertebrados, y particularmente mamíferos. Además, otros polipéptidos de la HIP pueden ser generados de acuerdo con la presente invención, de modo que dichos polipéptidos no existan de forma ordinaria en la naturaleza, sino que sean generados por técnicas mutagénicas no naturales.

Con la inspección se han observado un número de características de la proteína de la HIP. En particular, hemos notado que la secuencia de la HIP que codifica una proteína segregada que tiene una secuencia de la señal secretora (por ej., una parte peptidil que causa la secreción extracelular de al menos una parte de la proteína) correspondiente a los residuos 1-15 de la SEC ID No. 5. Puede proporcionarse un dominio de anclaje de membrana, por ej., en la forma de
un dominio de transmembrana, por los residuos correspondientes tanto a los 357-377 o 680-700 de la SEC ID No: 5.

Una región de "anclaje de la membrana" hace referencia a la secuencia de amino ácidos que son capaces de retener el polipéptido de la HIP en la superficie de la célula.

Un polipéptido de la HIP "glicosilado" es un polipéptido de la HIP que tiene una unión covalente con un grupo glicosilo (por ej., un derivatizado con un carbohidrato). Por ejemplo, la proteína de la HIP puede ser glicosilada en un residuo existente, o puede ser mutada para excluir la unión del carbohidrato, o puede ser mutada para proporcionar nuevos sitios de glicosilación, tales como para la glicosilación unida a N- o a O-.

Tal como se usa en la presente invención, el término ``proteína de hedgehog de vertebrado se refiere a moléculas de señalización intercelular relacionadas con la proteína de hedgehog de Drosophilia. Tres de las proteínas de hedgehog de vertebrados, Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh) existen aparentemente en todos los vertebrados, incluyendo anfibios, peces, pájaros, y mamíferos. Otros miembros de esta familia, tales como Banded hedgehog, Cephalic hedgehog, tiggy-winkle hedgehog, y echidna hedgehog han sido también identificados en peces y/o anfibios. Ejemplos de polipéptidos de hedgehog se describen en las solicitudes de patentes PCT WO 96/17924, WO 96/16668, WO 95/18856.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ácido nucleico" hace referencia a polinucleótidos tales como el ácido deoxiribonucleico (ADN), y, en el caso en que sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término también debe ser entendido que incluye, como equivalentes, análogos tanto de ARN como de ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos, y, cuando sea aplicable a la realización a describir, polinucleótidos de hebra única y de doble hebra (sentido o antisentido).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "gen" o "gen recombinante" hace referencia a un ácido nucleico que comprende una estructura de lectura abierta que codifica un polipéptido de la HIP, incluyendo tanto secuencias de exón como de intrón (opcionalmente). Un "gen recombinante" hace referencia a ácido nucleico que codifica un polipéptido de la HIP y que comprende secuencias de exón que codifican la HIP, si bien puede incluir de forma opcional secuencias de intrón que son derivadas de, por ejemplo, un gen de la HIP cromosomal o de un gen cromosomal no relacionado. Ejemplos de genes recombinantes que codifican el polipéptido de la HIP sujeto están representados en el Listado de Secuencias del apéndice. El término "intrón" hace referencia a una secuencia de ADN presente en un gen de la HIP dado que no está traducido en proteína y que se encuentra generalmente entre exones.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico, por ej., un vector de expresión, en una célula recipiente por una transferencia del gen mediado por ácido nucleico. "Transformación", tal como se utiliza en la presente invención, hace referencia a un procedimiento en el que se cambia un genotipo de las células como resultado de la captación celular de ADN o de ARN, y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de un polipéptido de la HIP o, cuando se produce la expresión anti-sentido a partir del gen transferido, se interrumpe la expresión de la forma de la proteína de la HIP que se produce de forma natural.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "hibrida de forma específica" hace referencia a la capacidad de una sonda/prímero de ácido nucleico de la invención para hibridar a al menos 15 nucleótidos consecutivos de un gen de la HIP, tal como una secuencia de la HIP designada en cualquiera una o más de las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14, o una secuencia complementaria de la misma, o mutantes que se produzcan de forma natural de la misma, de modo que tengan menos del 15%, preferiblemente menos del 10%, y más preferiblemente menos del 5% de hibridación de fondo a un ácido nucleico celular (por ej., mARN o ADN genómico) que codifica una proteína diferente de una proteína de la HIP, tal como se define en la presente invención.

Una "cantidad efectiva" de un polipéptido de hedgehog, o un fragmento bioactivo del mismo, con respecto al método sujeto del tratamiento, hace referencia a una cantidad de agonista o antagonista en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosis deseado, proporciona modulación del crecimiento, diferenciación de la supervivencia de células, por ej., modulación de la espermatogénesis, diferenciación neuronal, o esqueletogénesis, por ej., osteogénesis, condrogénesis, o modelaje de miembros.

Tal como se utiliza en la presente invención, "fenotipo" hace referencia al maquillaje completo físico, bioquímico, y fisiológico de una célula, por ej., teniendo cualquier rasgo o cualquier grupo de rasgos.

El término "inducción" o "induce", como relativo a la actividad biológica de una proteína de hedgehog, hace referencia generalmente al procedimiento o acto de causar que se produzca un efecto específico en el fenotipo de la célula. Dicho efecto puede ser en forma de causar un cambio en el fenotipo, por ej., la diferenciación a otro fenotipo de célula, o puede estar en forma de mantener la célula en una célula particular, por ej., evitando la diferenciación o favoreciendo la supervivencia de una célula.

Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado puede significar tanto un humano como un animal no humano.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha estado unida. Un tipo de vector preferido es un epitoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosomal. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma operativa son referidos en la presente invención como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de "plásmidos" que hacen referencia generalmente a bucles de ADN de doble hebra circular que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se utilizan de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión que sirven de funciones equivalentes y que se han conocido en el estado de la técnica con posterioridad a las mismas.

"Secuencia reguladora transcripcional" es un término genérico utilizado a lo largo de la especificación para hacer referencia a las secuencias de ADN. Tales como señales de iniciación, intensificadores, y promotores, que inducen o controlan la transcripción de las secuencias que codifican la proteína con la que están unidas de forma operativa. En realizaciones preferidas, la transcripción de un gen de la HIP recombinante es bajo control de una secuencia de promotor (u otra secuencia regulatoria transcripcional) que controla la expresión del gen recombinante en un tipo de célula en el que se intenta la expresión. También deberá entenderse que el gen recombinante puede estar bajo el control de secuencias reguladoras transcripcionales que son iguales o que son diferentes de aquellas secuencias que controlan la transcripción de las formas de genes de la HIP que se producen de forma natural.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "promotor específico del tejido" significa una secuencia de ADN que sirve como un promotor, es decir, que regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada unida de forma operable al promotor, y que lleva a cabo la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas de un tejido, tal como las células de origen neuronal o hematopoiético. El término también cubre los promotores llamados "agujereados", que regulan la expresión de un ADN primariamente seleccionado en un tejido, pero que pueden causar al menos un bajo nivel de expresión también en otros tejidos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "tejido objetivo" hace referencia al tejido conectivo, cartílago, tejido óseo o tejido del miembro, que tanto está presente en un animal, por ej., un mamífero, por ej., un humano o está presente en un cultivo in vitro, por ej., un cultivo de células.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "animal transgénico" es cualquier animal, preferiblemente un mamífero no humano, pájaro o un anfibio, en el que una o más células del animal contienen ácido nucleico heterólogo introducido por vía de la intervención humana, tal como por técnicas transgénicas bien conocidas en el estado de la técnica. El ácido nucleico es introducido en la célula, directamente o indirectamente por introducción en un precursor de la célula, por vía de manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. El término manipulación genética no incluye la reproducción cruzada clásica, o la fertilización in vitro, sino que está dirigida a la introducción de una molécula de ADN recombinante. Esta molécula puede estar integrada en un cromosoma, o puede ser ADN extra-cromosomicamente replicante. En una animal transgénico de ejemplo, el transgen causa que las células expresen una forma recombinante de la proteína de la HIP, por ej., tanto formas agonísticas como antagonísticas. Sin embargo, también se contemplan los animales transgénicos en los que el gen de la HIP recombinante es silencioso, como por ejemplo, el FLP o las construcciones dependientes de la recombinasa de la CRE que se describen a continuación. Además, "animal transgénico" también incluye aquellos animales recombinantes en los que la interrupción del gen de uno o más genes de la HIP es causada por intervención humana, incluyendo tanto la recombinación como técnicas antisentido.

Los "animales no humanos" de la invención incluyen vertebrados tales como roedores, primates no humanos, ganado, especies de aves, anfibios, reptiles, etc. El término "animal quimérico" se utiliza en la presente invención para hacer referencia a animales en los que se encuentra el gen recombinante, o en los que el recombinantes es expresado en algunas pero no en todas las células del animal. El término "animal quimérico específico del tejido" indica que un gen recombinante de la HIP está presente y/o expresado o interrumpido en algunos tejidos pero no en otros.

Tal como se utiliza en la presente invención "transgen" significa una secuencia de ácido nucleico (que codifica, por ej., un polipéptido de la HIP, o pendiente un transcrito antisentido del mismo), que es parcialmente o enteramente heterólogo, es decir, extraño al animal transgénico o célula en la que se introduce, o, es homólogo a un gen endógeno del animal transgénico o célula en la que se introduce, pero que está designado para ser insertado, o es insertado en el genoma del animal de un modo tal que altere el genoma de la célula en la que se va a insertar (por ej., es insertado en una localización que difiere de la del gen natural o su inserción da lugar a una eliminación). Un transgen puede incluir una o más secuencias transcripcionales reguladora y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que pueden ser necesarios para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.

Tal como es bien conocido, los genes para un polipéptido particular pueden existir en copias únicas o múltiples dentro del genoma de un individuo. Dichos genes duplicados pueden ser idénticos o pueden tener ciertas modificaciones, incluyendo sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, que todos ellos todavía codifican para polipéptidos que tengan sustancialmente la misma actividad. De este modo, el término "secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la HIP" puede referirse a uno o más genes en un individuo particular. Además, pueden existir ciertas diferencias en las secuencias de nucleótidos entre individuos de las mismas especies, que son llamadas alelos. Dichas diferencias alélicas pueden o no resultar en diferencias en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado que todavía codifica una proteína con la misma actividad biológica.

"Homología" e "identidad" hace referencia cada uno a la semejanza de secuencia entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad una comparación más estricta. La homología y la identidad pueden determinarse cada uno de ellas por comparación de una posición en cada secuencia que puede estar alineada para objetivos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por el mismo residuo de amino ácido, entonces los polipéptidos pueden ser referidos como idénticos en dicha posición: cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo amino ácido (por ej., idéntico) o un amino ácido similar (por ej., similar en la naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden ser referidas como homólogas en dicha posición. Un porcentaje de homología o de identidad entre secuencias es una función del número de posiciones equivalentes o homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 por cien de identidad, si bien preferiblemente menos del 25 por cien de identidad, con una secuencia de la HIP de la presente invención.

El término "ortólogo" hace referencia a los genes o proteínas que son homólogos por vía de las especies, por ejemplo, íntimamente relacionado y asumido que tienen descendencia común en base a consideraciones estructurales y funcionales. La función de las proteínas ortólogas como la misma actividad en diferentes especies de forma reconocible. El término "paralogo" hace referencia a los genes o proteínas que son homólogos vía la duplicación de genes, por ej., variantes duplicadas de un gen en un genoma. Ver también, WM Fritch (1970) Syst Zool 19: 99-113.

"Células", "células huésped" o "células huésped recombinantes" son términos utilizados de forma intercambiable en la presente invención. Se entiende que dichos términos hacen referencia no sólo a la célula sujeto en particular sino a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las sucesivas generaciones, debido tanto a la mutación como a influencias medioambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula padre, pero todavía se incluiría dentro del alcance del término utilizado en la presente invención.

Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" es una fusión de una primera secuencia de amino ácidos que codifica un polipéptido de la HIP con una segunda secuencia de amino ácidos que define un dominio extraño a y no sustancialmente homólogo con cualquier dominio de una proteína de la HIP (por ej., una porción de polipéptido). Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño que se encuentra (aunque en una proteína diferente) en un organismo que también expresa la primera proteína, o puede ser una "entre-especies", "intergénica", etc. fusión de estructuras de proteínas expresadas por diferentes tipos de organismos. En general, una proteína de fusión puede ser representada por la fórmula general X-HIP-Y, en donde la HIP representa una parte de la proteína de fusión que está derivada de una proteína de la HIP, y X e Y están, de forma independiente, ausentes o representan secuencias de amino ácidos que no están relacionadas con unas secuencias de la HIP en un organismo.

Tal como se utiliza en la presente invención, una "construcción de un gen reportero" en un ácido nucleico que incluye un "gen reportero" unido de forma operativa a unas secuencias reguladoras transcripcionales. La transcripción de un gen reportero es controlada por estas secuencias. La actividad de al menos uno o más de estas secuencias de control está directa o indirectamente regulada por un segundo mensajero producido por la actividad de la fosfolipasa. Las secuencias reguladoras transcripcionales pueden incluir un promotor y otras regiones reguladoras, tales como secuencias intensificadoras, que modulan la actividad del promotor, o secuencias reguladoras que modulan la actividad o la eficiencia de la polimerasa de ARN que reconoce el promotor, o las secuencias reguladoras que son reconocidas por las moléculas efector, incluyendo aquellas que son inducidas de forma específica con la activación de una fosfolipasa. Por ejemplo, la modulación de la actividad del promotor puede ser efectuada por alteración de la unión de la polimerasa de ARN a la región del promotor, o, de forma alternativa, por interferencia con la iniciación de la transcripción o la elongación de la mARN. Dichas secuencias son referidas en la presente invención de forma colectiva como los elementos o las secuencias reguladoras transcripcionales. Además, la construcción puede incluir secuencias de nucleótidos que alteran la estabilidad o la velocidad de traducción del mARN resultante en respuesta a los segundos mensajes, con lo que alteran la cantidad de producto del gen reportero.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "factor de crecimiento transformante - beta" y "TGF-\beta" denotan una familia de polipéptidos de paracrine relacionados estructuralmente encontrados de forma ubicua en vertebrados, y prototípico de una gran familia de factores de crecimiento metazoano, de diferenciación y de morfogénesis (ver, para revisión, Massaque y col. (1990) Ann Rev Cell Biol 6: 597-641; y Sport y col. (1992) J. Cell Biol. 119: 1017-1021). En esta familia están incluidas las "proteínas morfogenéticas de huesos" o "BMPs", que hacen referencia a las proteínas aisladas de huesos, y fragmentos de las mismas y a péptidos sintéticos que son capaces de inducir la deposición de huesos sola o cuando se combina con cofactores apropiados. La preparación de BMPs, tales como los BMP-1, -2, -3, y -4, está descrita en, por ejemplo, las publicaciones de patentes PCT WO 88/00205. Wozney (1989) Growth Fact Res 1: 267-280 describe las proteínas de la BMP adicionales íntimamente relacionadas con la BMP-2, y que han sido designadas como BMP-5, -6 y -7. Las publicaciones de patente PCT WO 89/09787 y WO 89/09788 describen
una proteína llamada "OP-1", ahora conocida como BMP-7. En el estado de la técnica se conocen otras BMPs.

El término "aislado" tal como también se utiliza en la presente invención con respecto a los ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, hace referencia a las moléculas separadas de otros ADNs, o ARNs, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de la HIP incluye de forma preferible no más de 10 kilobases (kb) de la secuencia de ácido nucleico que flanquean de forma inmediatamente natural el gen de la HIP en el ADN genómico, de forma más preferible no más de 5 kb de dichas secuencias de flanqueo que se producen de forma natural, y más preferiblemente menos de 1,5 kb de dicha secuencia de flanqueo que se produce de forma natural. El término aislado tal como se utiliza en la presente invención también hace referencia a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular, o el medio de cultivo cuando es producido por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Además, un "ácido nucleico aislado" pretende incluir fragmentos de ácido nucleico que no se producen de forma natural como fragmentos y que no encontrarían en el estado natural.

Tal como se describe a continuación, un aspecto de la invención pertenece a ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de la HIP, y/o equivalentes de dichos ácidos nucleicos. El término ácido nucleico tal como se utiliza en la presente invención pretende incluir fragmentos como equivalentes. El término equivalente se entiende que incluir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de la HIP funcionalmente equivalentes o péptidos funcionalmente equivalentes que tienen una actividad de una proteína de la HIP tal como se ha descrito en la presente invención. Las secuencias de nucleótidos equivalentes incluirán secuencias que difieren en una o más sustituciones de nucleótidos, adiciones o eliminaciones, tales como variantes alélicas; y que, por consiguiente, incluyen secuencias que difieren de la secuencia de nucleótidos de las secuencias de codificación de la HIP que se muestran en cualesquiera una o más de las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14 debido a la degeneración del código genético. Los equivalentes también incluirán secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones de restricción (es decir, equivalentes a aproximadamente 20-27ºC por debajo de la temperatura de fusión (T_{m}) del duplicado de ADN formado en aproximadamente sal 1 M) a las secuencias de nucleótidos representadas en la SEC ID No: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 o 14. En una realización, los equivalentes incluirán de forma adicional secuencias de ácidos nucleicos derivadas de y relacionadas de forma evolucionada con, unas secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 y SEC ID No: 4.

Además, será bien apreciado que, bajo ciertas circunstancias, puede ser ventajoso proporcionar homólogos de un polipéptido de la HIP que funcionen en una capacidad limitada tanto como agonistas como antagonistas (por ej., inhibiendo una bioactividad de una proteína de la HIP de tipo salvaje), con el fin de favorecer o inhibir sólo un subconjunto de las actividades biológicas de la forma de la proteína que se produce de forma natural. De este modo, pueden obtenerse los efectos biológicos específicos por tratamiento con un homólogo de función limitada. Por ejemplo, las formas truncadas de la proteína de interacción de hedgehog, por ej., fragmentos solubles del dominio extracelular, pueden ser proporcionados para inhibir de forma competitiva el ligando (hedgehog) que se une a la proteína de la HIP de tipo salvaje.

Los homólogos de la proteína de la HIP objeto pueden ser generadas por mutagénesis, tales como por mutación(es) de punto discreto, o por truncación. Por ejemplo, la mutación puede dar un aumento a homólogos que sustancialmente retienen la misma, o simplemente un subconjunto, de la actividad biológica del polipéptido de la HIP a partir del que deriva. De forma alternativa, pueden generarse formas antagonísticas de la proteína que sean capaces de inhibir el funcionamiento de la forma de la proteína que se produce de forma natural, tal como por unión competitiva a las proteínas hedgehog y competir con la HIP de tipo salvaje, o unirse a otras proteínas que interaccionan con la hedgehog (tales como subunidades de un receptor de hedgehog) para formar complejos del receptor de hedgehog no receptivos. De este modo, la proteína de la HIP y los homólogos de la misma proporcionados por el sujeto de la invención pueden tanto ser reguladores positivos como negativos del crecimiento, muerte y/o diferenciación de las células.

En general, los polipéptidos a los que se hace referencia en la presente invención por tener una actividad de la proteína de la HIP (por ej., son "bioactivos") son definidos como polipéptidos que incluyen la secuencia de amino ácidos correspondiente (por ej., idéntica o homóloga) para todas o una parte de las secuencias de amino ácidos de la proteína de la HIP que se muestra en la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 o SEC ID No: 8, y que agonizan o antagonizan todas o una parte de las actividades biológicas/bioquímicas de una proteína de la HIP que se producen de forma natural. Ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen la capacidad para unirse a proteínas de la hedgehog de alta afinidad. La bioactividad de ciertas realizaciones de los polipéptidos de la HIP objeto puede ser caracterizada en términos de una capacidad para favorecer la diferenciación y/o el mantenimiento de las células y tejidos a partir del tejido derivado mesodérmicamente, tal como el tejido derivado del mesodermo dorsal; de origen ectodérmico, tal como el tejido derivado del tubo neural, de la cresta neural, o del mesénquima de la cabeza; o del tejido derivado endodérmicamente, tal como el tejido derivado del intestino primitivo.

Otras actividades biológicas de las proteínas de la HIP objeto son descritas en la presente invención o serán razonablemente aparentes para los expertos en la materia. De acuerdo con la presente invención, un polipéptido tiene actividad biológica si es un agonista o antagonista específico de una forma de la proteína de la HIP que se produce de forma natural.

Los ácidos nucleicos preferidos que codifican un polipéptido de la HIP comprenden una secuencia de amino ácidos homóloga en al menos el 60%, el 70% o el 80%, más preferiblemente de al menos homóloga en un 85% y más preferiblemente de al menos homóloga en un 95% con una secuencia de amino ácidos de una proteína de la HIP que se produzca de forma natural, por ej., tal como la representada en la SEC ID No: 5, la SEC ID No: 6, la SEC ID No: 7 o la SEC ID No: 8. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de al menos aproximadamente entre un 98-99% de homología con una secuencia de amino ácidos representada en la SEC ID No: 5, la SEC ID No: 6, la SEC ID No: 7 o la SEC ID No: 8 se encuentran también naturalmente dentro del alcance de la invención, tal como los son los ácidos nucleicos idénticos en secuencia con la secuencia de la HIP enumerada del listado de Secuencias. En una realización, el ácido nucleico es un cADN que codifica un polipéptido que tiene al menos una actividad del polipéptido de la HIP sujeto.

En ciertas realizaciones preferidas, la invención se refiere a un polipéptido de la HIP purificado o recombinante que tiene la cadena de péptido con un peso molecular en el intervalo de 68 kd a 88 kd, incluso más preferiblemente en el intervalo de 76 kd a 80 kd (para una proteína de la HIP de cadena completa). Se entenderá que ciertas modificaciones post-traduccionales, por ej., la glicosilación, la fosforilación y similares, pueden incrementar el peso molecular aparente de la proteína de la HIP relativa a la cadena de polipéptido no modificada, y la rotura de ciertas secuencias, tales como pro-secuencias, puede igualmente disminuir el peso molecular aparente. Otros polipéptidos de la HIP preferidos incluyen: un polipéptido de la HIP maduro que le falta el péptido de la secuencia señal, por ej., correspondiente a los residuos 16-700 de la SEC ID No: 5, que tienen un peso molecular de aproximadamente 76,8 kD; un fragmento extracelular, maduro (soluble) del receptor, por ej., correspondiente a los residuos 16-356 de la SEC ID No: 5, por ej., teniendo un peso molecular de aproximadamente 74,4 kD; o por ej., correspondiente a los residuos 16-679 de la SEC ID No: 5, por ej., teniendo un peso molecular de aproximadamente 38,6 kD. En unas realizaciones preferidas, el ácido nucleico codifica un polipéptido de la HIP que incluye el dominio de unión de la hedgehog. Por un "peso molecular de aproximadamente" se quiere significar que es de aproximadamente \pm 5 kd.

Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de alta o baja estringencia a uno o más de los ácidos nucleicos representados por las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14. Son conocidas por los expertos en la materia condiciones de estringencia apropiadas que favorecen la hibridación del ADN por ejemplo, 6,0 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado de 2,0 x SSC a 50ºC, o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede estar seleccionada entre una baja estringencia de aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC hasta una alta estringencia de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede ser incrementada desde condiciones de baja estringencia a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones de alta estringencia a aproximadamente 65ºC.

Los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere de las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 o la SEC ID No: 4 debido a la degeneración en el código genético también se encuentran dentro del alcance de la invención. Dichos ácidos nucleicos codifican los péptidos funcionalmente equivalentes (es decir, un péptido que tiene una actividad biológica de un polipéptido de la HIP) pero que difiere en secuencia de la secuencia que se muestra en el listado de secuencias debido a la degeneración en el código genético. Por ejemplo, un número de amino ácidos son designados por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo amino ácido, o los sinónimos (por ejemplo CAU y CAC que codifican cada uno de ellos la histidina) pueden dar lugar a mutaciones "silenciosas" que no afectan la secuencia de amino ácidos de un polipéptido de la HIP. Sin embargo, es esperable que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de amino ácidos de los polipéptidos de la HIP del sujeto existirán entre, por ejemplo, los humanos. Un experto en la materia apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (de hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que tengan una actividad de un polipéptido de la HIP puedan existir entre individuos de unas especies dadas debido a la variación alélica natural.

Tal como se utiliza en la presente invención, un fragmento del gen de la HIP hace referencia a un ácido nucleico que tienen menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la forma totalmente madura de una proteína de la HIP que todavía (preferiblemente) codifica un polipéptido que retiene alguna actividad biológica de la proteína de longitud total. Los tamaños de los fragmentos contemplados por la presente invención incluyen, por ejemplo una longitud de 5, 10, 25, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos. En una realización preferida de un receptor truncado, el polipéptido incluirá toda o una parte suficiente del dominio del ligando que se une a un polipéptido de la hedgehog.

Tal como se indica por los ejemplos que se establecen a continuación, los ácidos nucleicos que codifican la proteína de la HIP pueden ser obtenidos a partir del mARN presente en células de organismos metazoanos. Debe ser posible obtener ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la HIP de la presente invención a partir del ADN genómico tanto de adultos como de embriones. Por ejemplo, un gen que codifica una proteína de la HIP puede ser clonado a partir tanto de un cADN como de una biblioteca genómica de acuerdo con los protocolos descritos en la presente invención, así como con los conocidos de forma general por los expertos en la materia. Un cADN que codifica una proteína de la HIP puede ser obtenido por aislamiento del mARN total a partir de una célula, tal como una célula de mamífero, por ej., una célula humana, si así se desea. Los cADNs de doble hebra pueden ser preparados a partir del mARN total, e insertados de forma subsiguiente en un plásmido adecuado o vector bacteriófago utilizando cualquiera de las diferentes técnicas conocidas. El gen que codifica una proteína de la HIP también puede ser clonado utilizando técnicas establecidas de reacción de la cadena de polimerasa de acuerdo con la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada por la invención. El ácido nucleico de la invención puede ser ADN o ARN. Un ácido nucleico preferido es un cADN que incluye una secuencia de nucleótido representada por cualquiera de las SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3, SEC ID No: 4, SEC ID No: 9, SEC ID No: 10, o SEC ID No: 11, SEC ID No: 12, SEC ID No: 13 o SEC ID No: 14.

Otro aspecto de la invención está relacionado con el uso del ácido nucleico aislado en la terapia "antisentido". Tal como se utiliza en la presente invención, la terapia "antisentido" hace referencia a la administración o a la generación in situ de sondas de oligonucleótidos o de sus derivados que hibridan de forma específica (por ej., se unen) bajo condiciones celulares, con el mARN celular y/o el ADN genómico que codifica una proteína de la HIP sujeto de modo que inhibe la expresión de dicha proteína, por ej., por inhibición de la transcripción y/o traducción. La unión puede ser por complementariedad del par de bases convencionales, o, por ejemplo, en la fase de unión a los duplicados de ADN, mediante interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. En general, la terapia "antisentido" hace referencia a la gama de técnicas que se utilizan de forma general en el estado de la técnica, e incluyen cualquier terapia que se base en la unión específica a las secuencias de oligonucleótidos.

Una construcción antisentido de la presente invención puede ser liberada, por ejemplo, como una plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN que es complementario a al menos una porción única del mARN celular que codifica una proteína de la HIP. De forma alternativa, la construcción antisentido es una sonda de oligonucleótido que es generada ex vivo y que, cuando se introduce en la célula causa la inhibición de la expresión por hibridación con el mARN y/o las secuencias genómicas de un gen de la HIP. Dichas sondas de oligonucleótidos son preferiblemente oligonucleótidos modificados que son resistentes a las nucleasas endógenas, por ej., las exonucleasas y/o las endonucleasas, y por consiguiente son estables in vivo. Ejemplos de moléculas de ácidos nucleicos para uso como oligonucleótidos antisentido son los análogos de ADN fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato (ver también las patentes U.S. 5.176.996, 5.264.564; y 5.256.775), o los ácidos nucleicos (PNAs). De forma adicional, han sido revisadas las aproximaciones generales a las construcciones de oligómeros útiles en la terapia antisentido, por ejemplo, por Van der Krol y col., (1988) Biotechniques 6: 958-976; y Stein y col. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668.

De acuerdo con ello, los oligómeros modificados de la invención son útiles en contextos de terapéutica, diagnóstico, e investigación. En aplicaciones terapéuticas, los oligómeros son utilizados de una forma apropiada para la terapia antisentido en general. Para dicha terapia, los oligómeros de la invención pueden ser formulados por una variedad de rutas de administración, incluyendo administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas de formulación pueden generalmente encontrarse en Remmington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, P.A. Para la administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo la intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, y subcutánea. Para la inyección, los oligómeros de la invención pueden ser formulados en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank o la solución de Ringer. Además, los oligómeros pueden ser formulados en forma sólida y redisueltos o suspendidos inmediatamente antes de su uso. Las formas liofilizadas también se encuentran incluidas.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos, o los compuestos pueden ser administrados de forma oral. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se utilizan agentes penetrantes apropiados para que pueda penetrarse la barrera. Dichos agentes penetrantes son generalmente conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden utilizarse detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede ser a través de sprays nasales o utilizando supositorios. Para la administración oral, los oligómeros son formulados en formas de administración convencionales tales como cápsulas, comprimidos, y tónicos. Para la administración tópica, los oligómeros de la invención son formulados en pomadas, ungüentos, geles, o cremas tal como se conoce generalmente en el estado de la técnica.

Además al uso en terapia, los oligómeros de la invención pueden ser utilizados como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de las secuencias de ADN o de ARN objetivo a las que se une de forma específica. Dichos ensayos de diagnóstico están descritos con mayor detalle a continuación.

Igualmente, las construcciones antisentido de la presente invención, mediante la antagonización de la actividad biológica normal de la proteína de la HIP, por ej., por reducción del nivel de su expresión, pueden ser utilizadas en la manipulación del tejido, por ej., el mantenimiento del tejido, la diferenciación o el crecimiento tanto in vivo como ex vivo.

Además, las técnicas anti-sentido (por ej., la microinyección de moléculas antisentido, o la transfección con plásmidos cuyos transcritos son anti-sentido con respecto a un mARN de la HIP o secuencia del gen) pueden ser utilizados para investigar el papel de la HIP en los sucesos de desarrollo, así como la normal función celular de la HIP en tejido adulto. Dichas técnicas pueden ser utilizadas en cultivo celular, pero también pueden ser utilizadas en la creación de animales transgénicos (descritos infra).

Esta invención también proporciona vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la HIP, unido de forma operable a al menos una secuencia reguladora transcripcional. Unido de forma operable pretende significar que la secuencia de nucleótido está unida a una secuencia reguladora de un modo que permita la expresión de la secuencia de nucleótido. Las secuencias reguladoras son reconocidas en el estado de la técnica y son seleccionadas para dirigir la expresión de las proteínas de la HIP que son objeto. De acuerdo con ello, el término secuencia reguladora transcripcional incluye promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión. Dichas secuencias reguladoras están descritas en Goeddel; Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquier amplia variedad de secuencias de control de expresión, secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se une de forma operativa a la misma, puede ser utilizada en estos vectores para expresar las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de la HIP de esta invención. Dichas secuencias de control de la expresión útiles, incluyen, por ejemplo, un LTR viral, tal como el LTR del virus de la leucemia murina Molones, los promotores tempranos y tardíos del SV40, el promotor inmediato temprano del adenovirus o del citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la polimerasa del ARN T7, las principales regiones del operador y promotor del fago \lambda, las regiones de control para la proteína de capa fd, el promotor para la quinasa 3-fosfoglicerato u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatas ácida, por ej, Pho 5, los promotores de los factores de unión \alpha de levadura, el promotor polihedron del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas para control de la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de las mismas. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped a transformar y/o del tipo de proteína que se desee expresar.

Además, también debe considerarse el número de copias del vector, la capacidad para controlar que el número de copias y la expresión de muchas otras proteínas codificadas por el vector, tal como marcadores antibióticos. En una realización, el vector de expresión incluye un gen recombinante que codifica un polipéptido que tiene una actividad agonística de un polipéptido de la HIP que sea objeto, o de forma alternativa, que codifica un polipéptido que es una forma antagonista de la proteína de la HIP. Un polipéptido de la HIP de ejemplo de la presente invención es una forma truncada soluble de la proteína que retiene el dominio de unión del ligando, por ejemplo, retiene la capacidad de unión a los polipétidos de hedgehog. Dichos vectores de expresión pueden ser utilizados para transfectar células y producir por tanto polipéptidos, incluyendo proteínas de fusión, codificadas por ácidos nucleicos tal como se describe en la presente invención.

Además, las construcciones de genes de la presente invención también pueden ser utilizadas como una parte de un protocolo de terapia génica para liberar ácidos nucleicos, por ej., que codifiquen tanto una forma agonística como antagonística de unas proteínas de la HIP objeto o una molécula antisentido descrita anteriormente. De este modo, otro aspecto de la invención se refiere a vectores de expresión para la transfección in vivo o in vitro y a la expresión de un polipéptido de la HIP o molécula antisentido en tipos de células particulares de modo que se reconstituya la función de, o alternativamente, se suprima toda o una parte de la función biológica de la transcripción inducida por la HIP en un tejido en el que la forma que se produce de forma natural de la proteína esté mal expresada (o haya sido interrumpida); o para liberar una forma de la proteína que altere el mantenimiento o la diferenciación del tejido, o que inhiba la proliferación neoplástica o hiperplástica.

Las construcciones de expresión de los polipéptidos de la HIP que son objeto, así como las construcciones antisentido, pueden ser administradas en cualquier soporte biológicamente efectivo, por ej., cualquier formulación o composición capaz de liberar de forma efectiva el recombinante a las células in vivo. Las aproximaciones incluyen la inserción del gen sujeto en vectores virales incluyendo retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados, y virus-1 del herpes-simplex, o plásmidos bacteriales o eucarióticos recombinantes. Los vectores virales transfectados directamente de células; el ADN de plásmido puede ser liberado con la ayuda de, por ejemplo, liposomas catiónicos (lipofectina) o derivatizados (por ej., conjugados de anticuerpos), conjugados de polilisina, gramacidina S, cubiertas virales artificiales u otos soportes intracelulares, así como inyección directa de la construcción del gen o precipitación de CaPO_{4} llevada a cabo in vivo. Será bien apreciado que debido a que la transducción de células objetivo apropiadas representa la primera etapa crítica en la terapia génica, la selección del sistema de liberación del gen particular dependerá de dichos factores así como el fenotipo del objetivo pretendido y la ruta de administración, por ej. localmente o sistémicamente. Además, se reconocerá que la construcción del gen particular proporcionada para la transducción in vivo de la expresión de la HIP son también útiles para la transducción de células in vivo, tales como para uso en los sistemas de cultivo de tejido ex vivo que se describen a continuación.

Una aproximación preferida para la introducción in vivo del ácido nucleico en una célula es por uso de un vector viral conteniendo ácido nucleico, por ej., un cADN que codifica el polipéptido de la HIP particular deseado. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que una gran proporción de las células objetivo pueden recibir el ácido nucleico. De forma adicional, las moléculas codificadas con el vector viral, por ej., por un cADN contenido en el vector viral, son expresadas de forma eficiente en células que llevan el ácido nucleico del vector viral. Los vectores de retrovirus, los vectores de adenovirus y los vectores de virus adeno-asociados son sistemas de liberación de genes de ejemplo para la transferencia de genes exógenos in vivo, particularmente en humanos. Estos vectores proporcionan liberación eficiente de genes en las células, y los ácidos nucleicos transferidos son integrados de forma estable en el ADN cromosómico del huésped.

Además de los métodos de transferencia virales, tales como los ilustrados anteriormente, también pueden utilizarse métodos no virales para causar la expresión de un polipéptido de la HIP sujeto en el tejido de un animal. La mayoría de los métodos no virales de transferencia génica se basan en mecanismos normales utilizados por las células de mamíferos para la captación y el transporte intracelular de macromoléculas. En las realizaciones preferidas, los sistemas de liberación de genes no virales de la presente invención se basan en vías endocíticas para la captación del gen del polipéptido de la HIP sujeto por la célula objetivo. Ejemplos de sistemas de liberación de genes de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, conjugados de polilisina, y cubiertas víricas artificiales.

En escenarios clínicos, los sistemas de liberación de genes para el gen de la HIP terapéutico pueden ser introducidos en un animal paciente por cualquiera de un número de métodos, cada uno de los cuales es familiar en el estado de la técnica. Por ejemplo, una preparación farmacéutica del sistema de liberación del gen puede ser introducido de forma sistemática, por ej., por inyección intravenosa y la transducción específica de la proteína en las células objetivo se produce de forma predominante a partir de la transfección proporcionada por el vehículo de liberación del gen, la expresión del tipo de célula o del tipo de tejido debida a las secuencias reguladoras transcripcionales que controlan la expresión del gen del receptor, o una combinación de los mismos. En otras realizaciones, la liberación inicial del gen recombinante es más limitada con la introducción en el animal estando bastante localizada. Por ejemplo, el vehículo de liberación del gen puede ser introducido por catéter (ver patente U.S. 5.328.470) o por inyección estereotáctica (por ej., Chen y col., (1994) PNAS 91: 3054-3057). Un gen de la HIP puede ser liberado en una construcción de terapia génica por
electrofiltración utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, por Dev y col. ((1994) Cancer Treta Rev 20: 105-115).

La preparación farmacéutica de la construcción de terapia génica puede consistir de forma esencial del sistema de liberación del gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está metida el vehículo de liberación del gen.

En todavía otra realización, la presente invención proporciona una construcción de "activación del gen" que, por recombinación homóloga con un ADN genómico, altera las secuencias regulatorias transcripcionales de un gen de la HIP endógeno. Por ejemplo, la construcción de activación del gen puede sustituir el promotor endógeno de un gen de la HIP con un promotor heterólogo, por ej., uno que cause la expresión constitutiva del gen de la HIP o que cause la expresión inducible del gen bajo condiciones diferentes del modelo de expresión normal de la HIP. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patentes PCT de Transkaryotic Therapies, Inc. WO93/09222, WO95/31560, WO96/29411, WO95/31560 y WO94/12650.

En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos utilizada como construcción de activación del gen puede estar comprendida por (1) ADN de alguna porción del gen de la HIP endógeno (secuencia de exón, secuencia de intrón, secuencias de promotor, etc.) que dirige la recombinación y (2) secuencia(s) regulatoria(s) transcripcional(es) heteróloga(s) que se unen de forma operable a la secuencia de codificación para el gen de la HIP genómico con recombinación de la construcción de activación del gen. Para uso en la generación de cultivos de las células que producen la HIP, la construcción puede incluir además un gen reportero para detectar la presencia de la construcción de eliminación en la célula.

La construcción de activación del gen está insertada en una célula, e integra con el ADN genómico de la célula en una posición tal que proporciona las secuencias reguladoras heterólogas en asociación operativa con el gen de la HIP original. Dicha inserción se produce por recombinación homóloga, es decir, regiones de recombinación de la construcción de activación que son homólogas a la secuencia del gen de la HIP endógeno que hibrida al ADN genómico y recombina con las secuencias genómicas de modo que la construcción está incorporada en la correspondiente posición del ADN genómico.

Los términos "región recombinante" o "secuencia del objetivo" hacen referencia a un segmento (es decir, una parte) de una construcción de activación del gen que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica a o sustancialmente complementaria a una secuencia del gen genómico, por ej., las secuencias de flanqueo 5’ del gen genómico, y pueden facilitar la recombinación homóloga entre la secuencia genómica y la construcción del transgen objetivo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "región de sustitución" hace referencia a una parte de una construcción de activación que se integra en una localización cromosómica endógena después de la recombinación homóloga entre una región recombinante y una secuencia genómica.

Las secuencias reguladoras heterólogas, por ej., las que son proporcionadas en la región de sustitución, pueden incluir uno o más de una variedad de elementos, incluyendo: promotores (tales como los promotores constitutivos o inducibles), intensificadores, elementos reguladores negativos, regiones de control del sitio, sitios de unión del factor de transcripción, o combinaciones de los mismos. Los promotores/intensificadores que pueden utilizarse para controlar la expresión del gen objetivo in vivo incluyen, pero no están limitados a, el promotor/intensificador de citomegalovirus (CMV) (Karasuyama y col., 1989, J. Exp. Med., 169: 13), el promotor de \beta-actina humana (Gunning y col., (1987) PNAS 84: 4831-4835), el promotor inducible de glucocorticoide presente en la repetición del terminal largo del virus del tumor mamario de ratón (MMTV LTR) (Klessig y col., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 1354-1362), las secuencias del terminal largo del virus de leucemia de murino Molones (Mil V LTR) (Weiss y col. (1985) ARN Tumor Virases, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), el promotor de la región cercana o retrasada de SV40 (Bermoist y col. (1981) Nature 290: 304-310; Templeton y col. (1984) Mol. Cell Biol., 4: 817; y Sprague y col., (1983) J.Virol., 45: 773), el promotor contenido en la repetición del terminal largo 3’ del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto y col., 1980, Cell, 22: 787-797), el promotor/intensificador de la timidita quinasa del virus del herpes simplex (HSV) (Wagner y col. (1981) PNAS 82: 3567-71), y el promotor LAT del virus del herpes simplex (Wolfe y col. (1991) Nature Genetics, 1: 379-384).

En todavía otras realizaciones, la región de sustitución únicamente suprime un elemento de control transcripcional negativo del gen originario, por ej., para activar la expresión, o ablacionar un elemento de control positivo, por ej., para inhibir la expresión del gen objetivo.

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a las formas recombinantes de las proteínas de la HIP. Los polipéptidos recombinantes preferidos por la presente invención, además de las proteínas de la HIP originarias, son al menos un 60% o un 70% homólogas, más preferiblemente al menos un 80% homólogas y más preferiblemente al menos un 85% homólogas con una secuencia de aminoácidos representada por una o más de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8. Los polipéptidos que poseen una actividad de una proteína de la HIP (es decir tanto agonística como antagonística), y que son al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente entre el 98-99% homólogas con la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y/o SEC ID No: 8 también se encuentran dentro del alcance de la invención. Dichos polipéptidos, tal como se ha descrito anteriormente, incluyen varias formas truncadas de la proteína.

El término "polipéptido de la HIP recombinante" hace referencia a un polipéptido que es producido por técnicas de ADN recombinante, en las que generalmente, el ADN que codifica un polipéptido de la HIP es insertado en un vector de expresión adecuado que a su vez es utilizado para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. Además, la frase "derivado de", con respecto a un gen de la HIP recombinante, significa que incluye en el significado de "proteína recombinante" aquellas proteínas que tienen una secuencia de amino ácidos de una proteína de la HIP originaria, o una secuencia de amino ácidos similar a la que es generada por mutaciones que incluyen sustituciones y eliminaciones (incluyendo la truncación) de una forma de proteína que se produce de forma natu-
ral.

La presente invención se refiere además a formas recombinantes de los polipéptidos de la HIP sujeto de la invención que son codificados por genes derivados de un mamífero (por ej., un humano), reptil o anfibio y que tienen secuencias de amino ácidos relacionadas de forma evolucionada a la proteína de la HIP representada en la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8. Dichos polipéptidos de la HIP recombinantes son preferiblemente capaces de funcionar en uno de cada uno de los papeles agonista o antagonista de al menos una actividad biológica de una proteína de la HIP de tipo salvaje ("auténtica") del listado de secuencias del apéndice. El término "relacionado de forma evolucionada", con respecto a las secuencias de amino ácidos de las proteínas de la HIP, hace referencia tanto a los polipéptidos que tienen secuencias de amino ácidos que han surgido de forma natural, y también a variante mutacionales de polipéptidos de la HIP, que son derivados, por ejemplo, por mutagénesis combinatoria.

La presente invención también proporciona métodos de producir los polipéptidos de la HIP que son objeto de la invención. Por ejemplo, puede cultivarse una célula huésped transfectada con un vector de ácido nucleico que dirige la expresión de una secuencia de nucleótido que codifica los polipéptidos que son objeto de la invención bajo condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del péptido. Si no se proporciona la proteína recombinante con un péptido de la señal de secreción, como en el caso de una proteína de fusión de GST, las células pueden ser recogidas, lisadas y puede aislarse la proteína. Un cultivo de células incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo de células son bien conocidos en el estado de la técnica. El polipéptido de la HIP recombinante puede ser aislado del cultivo de células, las células huésped, o ambas utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica para la purificación de proteínas incluyendo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración sobre gel, la ultrafiltración, la electroforesis, y la purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para dichos péptidos. En una realización preferida, el polipéptido de la HIP recombinante es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación, tal como la proteína de fusión GST o la proteína de fusión poli(His).

Esta invención también se refiere a una célula huésped transfectada para expresar formas recombinantes de los polipéptidos de la HIP objeto de la invención. La célula huésped puede ser cualquier célula eucariótica o procariótica. De este modo, puede utilizarse una secuencia de nucleótidos derivada de la clonación de las proteínas de la HIP, que codifican toda o una parte seleccionada de una proteína de longitud completa, para producir una forma recombinante de un polipéptido de la HIP por medio de un procedimiento celular microbiano eucariótico. La unión de la secuencia de polinucleótidos en una construcción de gen, tal como un vector de expresión, y la transformación o la transfección en huéspedes, tanto eucarióticos (levadura, ave, insecto o mamífero) o procarióticas (células bacterianas), son procedimientos estándar utilizados en la producción de otras proteínas bien conocidas, por ej., proteínas de hedgehog, proteínas TGF\beta, así como un amplio rango de receptores. Pueden utilizarse procedimientos similares, o modificaciones de los mismos, para preparar polipéptidos de la HIP recombinantes por medios microbianos o por tecnología de cultivo de tejidos de acuerdo con la presente invención.

Los genes de la HIP recombinantes pueden ser producidos por unión del ácido nucleico que codifica un polipéptido de la HIP en un vector adecuado para la expresión tanto de células procarióticas, células eucarióticas, o ambas. Los vectores de expresión para la producción de formas recombinantes de los polipéptidos de la HIP objeto de la invención incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados para la expresión de un polipéptido de la HIP incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procarióticas, tales como la E. coli.

Para la expresión de proteínas recombinantes en levaduras existen un número de vectores. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, y YRP17 son vehículos de clonación y de expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae (ver, por ejemplo Broach y col. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expresión, ed. M. Inouye Academia Press, p. 83, que se incorpora a la presente memoria por referencia). Estos vectores pueden replicar en E. coli debido a la presencia del ori pBR322, y en S. cerivisiae debido a la replicación determinante del plásmido de 2 micras de la levadura. Además, pueden utilizarse los marcadores resistentes al fármaco tales como ampicilina. En una realización ilustrativa, se produce un polipéptido de la HIP de forma recombinante utilizando un vector de expresión generado por sub-clonación de la secuencia de codificación de un gen de la HIP representado en la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 o la SEC ID No: 4.

Los vectores de expresión de mamíferos preferidos contienen tanto secuencias procarióticas, para facilitar la propagación del vector en las bacterias, y una o más unidades de transcripción eucarióticas que son expresadas en células eucarióticas. Los vectores derivados de pcADNI/amp, pcADNI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para la transfección de células eucarióticas. De forma alternativa, los derivados de virus tales como los papilomavirus de bovino (BPV-1), o los virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivados de pREP y p205) pueden ser utilizados para la expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas. Los diferentes métodos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de organismos huésped son bien conocidos en el estado de la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas, así como para los procedimientos recombinantes generales, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed. Ed. Por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Capítulos 16 y 17.

En algunos ejemplos, puede ser deseable expresar el polipéptido recombinante por uso de un sistema de expresión de baculovirus. Ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tales como el \beta-gal conteniendo pBlueBac III).

Cuando es deseable expresar sólo una parte de una proteína de la HIP, tal como una forma a la que le falta una parte del N-terminal, es decir, un mutante de truncación al que le falta la señal del péptido, puede ser necesario añadir un codón de inicio (ATG) al fragmento de oligonucleótido que contiene la secuencia deseada a expresar. Es bien conocido en el estado de la técnica que una metionina en la posición N-terminal puede ser rota de forma enzimática mediante el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). La MAP ha sido clonada a partir de E. coli (Ben-Bassat y col. (1987) J. Bacterial. 169: 751-757) y Salmonella typhimurium y se ha demostrado su actividad in vitro en proteínas recombinantes (Millar y col. (1987) PNAS 84: 2718-1722). Por consiguiente, la eliminación de una metionina N-terminal, en el caso en que se dese, puede conseguirse tanto in vivo por expresión de los polipéptidos derivados de la HIP en un huésped que produce MAP (por ej., E. coli o CM89 o S. cerevisiae), o in vitro por uso de MAP purificado (por ej., procedimiento de Millar y col., supra).

De forma alternativa, las secuencias de codificación para el polipéptido pueden ser incorporadas como una parte de un gen de fusión incluyendo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diferente. Este tipo de sistema de expresión puede ser útil bajo condiciones en las que sea deseable producir un fragmento inmunogénico de una proteína de la HIP. Por ejemplo, la proteína capside VP6 del rotavirus puede ser utilizada como una proteína de soporte inmunológico para partes del polipéptido de la HIP, tanto en la forma monomérica como en la forma de una partícula viral. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes a la parte de una proteína de la HIP objeto al que se van a aumentar los anticuerpos puede ser incorporada en una construcción de un gen de fusión que incluye secuencias de codificación para que una proteína estructural del virus vaccinia tardío produzca un grupo de proteínas de fusión que expresan los virus recombinantes comprendiendo epitopes de la HIP como parte del virus. Se ha demostrado con el uso de proteínas de fusión inmunogénicas utilizando las proteínas de fusión del antígeno de superficie de la hepatitis B que los virus de la hepatitis B recombinantes pueden ser utilizados también en este papel. De forma similar, las construcciones quiméricas que codifican para las proteínas de fusión contienen una parte de una proteína de la HIP y la proteína cápside de poliovirus puede ser creada para intensificar la inmunogenicidad del grupo de antígenos de polipéptidos (ver, por ejemplo, la publicación de patente EP No: 0259149; y Evans y col. (1989) Nature; Huang y col. (1988) J. Virol. 62: 3855; y Schlienger y col. (1992) J. Virol. 66: 2).

El sistema de Multiple Antigen Peptide para la inmunización de base peptídico también puede ser utilizado para generar un inmunogen, en donde una parte deseada de un polipéptido de la HIP es obtenida directamente a partir de la síntesis organo-química del péptido en un núcleo de lisina con ramificaciones oligoméricas (ver, por ejemplo, Posnett y col. (1988) JBC 263: 1719 y Nardelli y col. (1992) J. Inmunol. 148: 914). Los determinantes antigénicos de las proteínas de la HIP también pueden ser expresadas y presentadas por células bacterianas.

Además de utilizar proteínas de fusión para intensificar la inmunogenicidad, es ampliamente apreciado que las proteínas de fusión también pueden facilitar la expresión de proteínas, y de acuerdo con ello, pueden ser utilizadas en la expresión de los polipéptidos de la HIP de la presente invención, particularmente de formas trucadas de la proteína de la HIP. Por ejemplo, los polipéptido de la HIP pueden ser generados como proteínas de glutation-S-transferasa (fusión de GST). Dichas proteínas de fusión de GST son capaces de una fácil purificación del polipéptido de la HIP, como por ejemplo por el uso de matrices derivatizadas de glutationa (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)).

En otra realización, un gen de fusión codificando para una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia del sitio de rotura de una poly-(His)/enteroquinasa en el N-terminal de la parte deseada de la proteína recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada por cromatografía de afinidad utilizando una resina de metal de Ni2+. La secuencia líder de purificación puede entonces ser separada de forma subsiguiente por tratamiento con enteroquinasa para proporcionar la proteína purificada (por ej., ver Hochuli y col. (1987) J. Chromatography 411: 177; y Jankmecht y col. PNAS 88: 8972).

Las técnicas para hacer genes de fusión son conocidas por los expertos en la materia. Esencialmente, la unión de varios fragmentos de ADN codificando para diferentes secuencias de polipéptidos es llevada a cabo de acuerdo con las técnicas convencionales, utilizando para la unión terminales acabados en punta o acabados de forma escalonada, digestión de la enzima de restricción para proporcionar terminaciones apropiadas, llenado de las terminaciones cohesivas en el caso en que sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y unión enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales incluyendo los sintetizadores de ADN automáticos. De forma alternativa, puede llevarse a cabo la amplificación de PCR de fragmentos de genes utilizando prímeros de ancla que dan un aumento a salientes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden ser templados de forma subsiguiente para generar una secuencia de gen quimérico (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col. John Wiley & Sons:
1992).

Los polipéptidos de la HIP también pueden ser químicamente modificados para crear derivados de la HIP por formación de conjugados covalentes o agregados con otras mitades químicas, tales como grupos glicosilo, lípidos, colesterol, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de las proteínas de la HIP pueden ser preparados por unión de las mitades químicas a grupos funcionales en cadenas laterales de amino ácidos de la proteína o en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido.

En el caso en que sea apropiado, también pueden proporcionarse las formulaciones de polipéptidos de la HIP multiméricas de formas solubles de los polipéptidos de la HIP sujeto de acuerdo con los métodos conocidos en el estado de la técnica. En una realización, los multímeros de la HIP son químicamente reticulados por la utilización de métodos conocidos que resultarán en la formación tanto de dímeros como de multímeros superiores de las formas solubles de los polipéptidos de la HIP. Otro modo de producir multímeros de las formas solubles de los polipéptidos de la HIP es por técnicas recombinantes, por ej., por inclusión de regiones bisagra. Este medio de unión puede facilitar la flexibilidad incrementada de la proteína quimérica permitiendo que varias subunidades monoméricas de la HIP interaccionen libremente y (opcionalmente) de forma simultánea con un ligando de la HIP por reducción del impedimento estérico entre los dos fragmentos, así como permitiendo que se produzca el apropiado plegamiento de cada parte. El agente de unión puede ser de origen natural, tal como una secuencia determinada a existir en una espiral al azar entre dos dominios de una proteína. De forma alternativa, el agente de unión puede ser de origen sintético. Por ejemplo, la secuencia (Gly_{4}Ser_{3}) puede ser utilizada como un agente de unión no estructurado sintético. Los agentes de unión de este tipo se encuentran descritos en Huston y col. (1988) PNAS 85: 4879; y en las patentes U.S. Nos. 5.091.513 y 5.258.498. Los agentes de unión que se producen de forma natural de origen humano son preferidos ya que reducen el riesgo de inmunogenicidad.

Cada multímero comprende dos o más monómeros, comprendiendo cada uno de ellos la forma soluble de un polipéptido de la HIP o una sal o un derivado funcional del mismo. El límite superior para el número de monómeros en un multímero no es importante y pueden utilizarse los liposomas que tienen muchos de dichos monómeros. Dichos multímeros tienen 2-5 monómeros y más preferiblemente 2 o 3.

La presente invención también hace asequible los polipéptidos de la HIP aislados que son aislados de, o, de otro modo, sustancialmente libres de otras proteínas celulares, especialmente de receptores y/o de otros polipéptidos inductivos que pueden normalmente estar asociados con el polipéptido de la HIP. El término "sustancialmente libre de otras proteínas celulares" (al que también se hace referencia en la presente invención como "proteínas contaminantes") o "preparaciones sustancialmente puras o purificadas" se define como abarcando las preparaciones de polipéptidos de la HIP que tienen menos del 20% (en peso seco) de proteína contaminante, y preferiblemente tienen menos del 5% de proteína contaminante. Las formas funcionales de los polipéptidos objeto de la invención pueden ser preparadas, en una primera vez, como preparaciones purificadas mediante la utilización de un gen clonado tal como se describe en la presente memoria. Por "purificado", se pretende significar, cuando se hace referencia a un péptido o secuencia de ADN o de ARN, que la molécula indicada está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, tales como otras proteínas. El término "purificado" tal como se utiliza en la presente invención significa preferiblemente al menos un 80% en peso seco, más preferiblemente en el intervalo de 95-99% en peso, y más preferiblemente al menos un 99,8% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presente (pero pueden estar presentes agua, tampones, y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tengan un peso molecular de menos de 5000). El término "puro" tal como se utiliza en la presente invención tiene preferiblemente los mismos límites numéricos que el inmediatamente término "purificado" anterior. "Aislado" y "purificado" no abarcan tanto materiales naturales en estado natural o materiales naturales que han sido separados en sus componentes (por ej., en un gel de acrilamida) sino que han sido obtenidos como sustancias o soluciones puras (por ej., con falta de proteínas contaminantes, o reactivos de cromatografía tales como agentes desnaturalizantes y polímeros, por ej., acrilamida o agarosa). En realizaciones preferidas, las preparaciones de la HIP purificadas a las que les faltará cualquier proteína contaminante del mismo animal del que la HIP es normalmente producida, tal como puede conseguirse por expresión recombinante de, por ejemplo, una proteína de la HIP de mamífero en una levadura o célula bacteriana.

Tal como se ha descrito para los polipéptidos recombinante, los polipéptidos de la HIP aislados pueden incluir todas o una parte de las secuencias de amino ácidos correspondientes a un polipéptido de la HIP representado en la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8 o secuencias homólogas de las mismas.

Las porciones peptídicas aisladas de proteínas de la HIP también pueden ser obtenidas por selección de péptidos producidos de forma recombinante a partir del correspondiente fragmento de ácido nucleico que codifica dichos péptidos. Además, los fragmentos pueden ser químicamente sintetizados utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica tales como la química convencional del f-Moc o del t-Boc en fase sólida de Merrifield. Por ejemplo, un polipéptido de la HIP de la presente invención puede ser dividido de forma arbitraria en fragmentos de longitud deseada sin solapamiento de los fragmentos, o dividido de forma preferible en fragmentos solapados de una longitud deseada. Los fragmentos pueden ser producidos (de forma recombinante o por síntesis química) y ensayados para identificar aquellos fragmentos peptídicos que pueden funcionar tanto como agonistas como antagonistas de una proteína de la HIP de tipo salvaje (por ej., "auténtico"). Por ejemplo, Román y col. (1994) Eur J Biochem 222: 65-73 describe el uso de ensayos de unión competitiva utilizando péptidos sintéticos cortos, solapados, a partir de proteínas más largas para identificar los dominios de unión.

Los polipéptidos de la HIP recombinantes de la presente invención también incluyen homólogos de las proteínas de la HIP auténticas, tales como versiones de dichas proteínas que son resistentes a la rotura proteolítica, tal como por ejemplo, las debidas a mutaciones que alteran la ubiquitación, prenilación o similares, liberación enzimática del dominio extracelular, u otros objetivos enzimáticos asociados con la proteína.

La modificación de la estructura de los polipéptidos de la HIP objeto de la invención pueden ser para objetivos tales como la intensificación de la eficacia terapéutica o profiláctica, la estabilidad (por ej., la vida media ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo), o las modificaciones post-traduccionales. Dichos péptidos modificados, cuando son designados para retener al menos una actividad de la forma de la proteína que se obtiene de forma natural, o para producir antagonistas específicos del mismo, son considerados equivalentes funcionales de los polipéptidos de la HIP (aunque pueden ser agonísticos o antagonísticos de las bioactividades de la proteína auténtica). Dichos péptidos modificados pueden ser producidos, por ejemplo, por sustitución, eliminación o adición de amino
ácidos.

Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un amino ácido con un amino ácido relacionado de forma estructural (es decir, mutaciones isostéricas y/o isoeléctricas) no tendrán un efecto mayor en la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar en una familia de amino ácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los amino ácidos codificados genéticamente pueden ser divididos en cuatro familias: (1) ácido = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, histidina; (3) no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado = glicina, asparagina, glutamina, cisterna, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina algunas veces son clasificados conjuntamente como amino ácidos aromáticos. De un modo similar, el repertorio de amino ácidos puede ser agrupado como (1) ácido = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, histidina; (3) alifático = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, con serina y treonina opcionalmente agrupados de forma separada como hidroxil-alifáticos; (4) aromático = fenilalanina, tirosina, triptófano; (5) amida = asparagina, glutamina; y (6) conteniendo azufre = cisterna y metionina. (Ver, por ejemplo, Biochemistry, 2ª ed. Ed. Por L. Stryer, WH Freeman y Co.: 1981). El que un cambio en la secuencia de amino ácidos de un péptido de lugar a un homólogo funcional de la HIP (por ej., funcional en el sentido de que el polipéptido resultante mimetice o antagonice la forma auténtica) puede ser fácilmente determinado mediante la valoración de la capacidad del péptido variante para producir una respuesta en las células de un modo similar al de la proteína de tipo salvaje, o competitivamente inhibir dicha respuesta. Los polipéptidos en los que ha tenido lugar más de una sustitución pueden se fácilmente ensayados del mismo
modo.

Esta invención contempla además un método de generar grupos de mutantes de punto combinatorios de las proteínas de la HIP objeto de la invención así como de mutantes de truncación, y es especialmente útil para la identificación de potenciales secuencias variantes (por ej., homólogos) que son funcionales en modular la transducción de la señal y/o la unión del ligando. El objetivo de la selección de dichas bibliotecas combinatorias es generar, por ejemplo, nuevos homólogos de la HIP que puedan actuar tanto como agonistas como antagonistas, o de forma alternativa, posean nuevas actividades todos juntos. Para ilustrar, los homólogos de la HIP pueden ser diseñados por el método presente para proporcionar activación selectiva, constitutiva de la actividad de hedgehog, o de forma alternativa, para ser inhibidores negativos dominantes de la transducción de la señal dependiente de la HIP. Por ejemplo, la mutagénesis puede proporcionar homólogos de la HIP que sean capaces de unir ligandos extracelulares que aún sean inestables para unir o señalar mediante las proteínas reguladoras intracelulares.

En un aspecto de este método, las secuencias de amino ácidos para una población de homólogos de la HIP a partir de especies diferentes o de otras proteínas relacionadas está alineado, preferiblemente para favorecer la mayor homología posible. Dicha población de variantes puede incluir, por ejemplo, los homólogos de la HIP de una o más especies. Se seleccionan los amino ácidos que aparecen en cada posición de las secuencias alineadas para crear un grupo degenerado de secuencias combinatorias. En una realización preferida, se generó la variada biblioteca de variantes de la HIP por mutagénesis combinatoria en el nivel del ácido nucleico, y se codificó por una variedad de biblioteca génica. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ser ligada de forma enzimática en secuencias de genes de modo el grupo degenerado de secuencias de la HIP potenciales sea expresable como polipéptidos individuales, o de forma alternativa, como un grupo de proteínas de fusión más largas (por ej., para visualizar los fagos) conteniendo el grupo de secuencias de la HIP de la presente invención.

En una realización ilustrativa, las secuencias de longitud total alineadas en la Figura 1 son comparadas con el fin de generar una biblioteca degenerada de potenciales agonistas y antagonistas de la HIP. Por ejemplo, puede generarse una biblioteca de polipéptidos de la HIP para incluir una secuencia de polipéptidos de núcleo degenerado representada por la fórmula general:

3

en donde cada manifestación de X es, de forma independiente, cualquier residuo de amino ácido (natural), aunque más preferiblemente es un residuo de amino ácido (o intervalo) seleccionado entre aquellos residuos que se producen en la posición correspondiente en las proteínas de ratón, humano o pollo que se muestran en la Figura 1 o una sustitución conservadora del mismo, e incluso más preferiblemente es un residuo de amino ácido (o intervalo) seleccionado entre aquellos residuos que se producen en la correspondiente posición en las proteínas de ratón, humano o pollo tal como se muestra en la Figura 1. En el caso en que sea apropiado para el ensayo de selección, los polipéptidos de la biblioteca pueden incluir una secuencia de la señal de secreción y/o una secuencia ancla de membrana C-terminal derivada de una de las proteínas de la HIP.

En otra realización, la biblioteca degenerada está basada en la comparación de las secuencias humanas y de ratón, y puede incluir una secuencia de polipéptidos del núcleo degenerada representada por la fórmula general:

4

en donde cada manifestación de X es, de forma independiente, cualquier residuo de amino ácido (natural), aunque más preferiblemente es un residuo de amino ácido (o intervalo) seleccionado entre aquellos residuos que se producen en la posición correspondiente en las proteínas de ratón o humano que se muestran en la Figura 1 o una sustitución conservadora del mismo, e incluso más preferiblemente es un residuo de amino ácido (o intervalo) seleccionado entre aquellos residuos que se producen en la correspondiente posición en las proteínas de ratón o humano que se muestran en la Figura 1.

Hay muchas maneras por las que pueden generarse dichas bibliotecas de homólogos potenciales de la HIP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. Puede llevarse a cabo la síntesis química de una secuencia de genes degenerada en un sintetizador de ADN automático, y a continuación los genes sintéticos ligados en un vector de expresión apropiado. El objetivo de un grupo degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el grupo deseado de potenciales secuencias de la HIP. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es bien conocida en el estado de la técnica (ver por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1981) Recombinant ADN, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Ámsterdam: Elsevier págs. 273-289; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y col. (1984) Science 198: 1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477. Dichas técnicas se han utilizado en la evolución directa de otras proteínas (ver, por ejemplo, Scout y col. (1990) Science 249: 386-390; Roberts y col. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin y col. (1990) Science 249: 404-
406; Cwirla y col. (1990) PNAS 87: 6378-6382; así como las patentes U.S. Nos. 5.223.409, 5.198.346, y 5.096.815).

Del mismo modo, puede proporcionarse una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación para un clon de la HIP con el fin de generar una población variada de fragmentos de la HIP para la valoración y la subsiguiente selección de fragmentos bioactivos. Se conocen una variedad de técnicas en el estado de la técnica para generar dichas bibliotecas, incluyendo síntesis químicas. En una realización, puede generarse una biblioteca de fragmentos de la secuencia de codificación por (i) tratamiento de un fragmento de la PCR de doble hebra de una secuencia de codificación de la HIP con una nucleasa bajo condiciones en las que sólo ocurre el corte aproximadamente una vez por molécula; (ii) desnaturalización del ADN de doble hebra; (iii) renaturalización del ADN para formar ADN de doble hebra el cual puede incluir pares con sentido/anti-sentido a partir de diferentes productos cortados; (iv) eliminación de la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método de ejemplo, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica para el N-terminal, el C-terminal y fragmentos internos de varios tamaños.

Se conocen en el estado de la técnica una amplia gama de técnicas para la valoración de productos genéticos de bibliotecas combinatorias realizadas por mutaciones o truncación de punto, y por selección de bibliotecas de cADN para los productos de genes que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas serán generalmente adaptables para la selección rápida de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de la HIP. Las técnicas más ampliamente utilizadas para la selección de grandes bibliotecas de genes comprenden de forma típica la clonación de bibliotecas de genes en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con las bibliotecas resultantes de vectores, y expresando los genes combinatorios bajo condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector de codificación del gen cuyo producto se ha detectado.

En una realización de ejemplo, se expresó una biblioteca de variantes de la HIP como una proteína de fusión en una superficie de una partícula viral, y las partículas virales se colocaron en una matriz de hedgehog. Por ejemplo, en el sistema de fago filamentoso, pueden expresarse las secuencias de péptidos extrañas en la superficie del fago infeccioso, con lo que se confieren dos beneficios significativos. En primer lugar, ya que estos fagos pueden ser aplicados a matrices de afinidad a concentraciones muy altas, puede seleccionarse a la vez un gran número de fagos. En segundo lugar, ya que cada fago infeccioso muestra el producto del gen combinatorio en su superficie, si un fago particular es recuperado de una matriz de afinidad en bajo rendimiento, el fago puede ser amplificado por otra nueva infección. El grupo de fagos filamentosos de E. coli casi idénticos M13, fd., y fl son utilizados más a menudo en la bibliotecas de muestra de fagos, ya que pueden utilizarse tanto las proteínas de cobertura del fago gIII o gVIII para generar proteínas de fusión sin interrupción del ultimo combinado de partícula viral (Ladner y col. publicación de la patente PCT WO 90/0290; Garrad y col., publicación de la patente PCT WO 92/09690; Marks y col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Griffiths y col. (1993) EMBO J 12: 725-734; Claxon y col. (1991) Nature 352: 624-628; y Barbas y col. (1992) PNAS 89: 4457-4461). Por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes (RPAS, Pharmacia Catalog number 27-9400-01) puede ser fácilmente modificado por uso en la expresión y selección de bibliotecas combinatorias de la HIP mediante la situación en polipéptidos de hedgehog inmovilizados en una matriz para enriquecer para los homólogos de la HIP con una capacidad intensificada para unir el ligando.

La invención también proporciona la reducción de la proteína de la HIP para generar miméticos, por ej., agentes de tipo péptido o no péptido, que son capaces de interrumpir una actividad biológica de un polipéptido de la HIP de la presente invención, por ej., como inhibidores de las interacciones proteína-proteína, tales como con proteínas de ligando.. De este modo, dichas técnicas mutagénicas tal como se han descrito anteriormente también son útiles para trazar un plano de los determinantes de las proteínas de la HIP que participan en las interacciones proteína-proteína implicadas en, por ejemplo, la interacción del polipéptido de la HIP objeto de la invención con polipéptidos de hedgehog. De forma alternativa, puede utilizarse un sistema similar para derivar fragmentos de una proteína de hedgehog que se une a una proteína de la HIP e inhibir de forma competitiva la unión de la proteína de hedgehog de longitud completa.

Para ilustrar además, los residuos críticos tanto de una proteína de la HIP como de un proteína de hedgehog que están implicados en el reconocimiento molecular del otro pueden ser determinados y utilizados para generar peptidomiméticos derivados de hedgehog que inhiben de forma competitiva las interacciones hedgehog/ proteína de la HIP. Mediante la utilización, por ejemplo, de mutagénesis de selección para situar los residuos de amino ácidos de una proteína que está implicada en la unir otras proteínas, los compuestos peptidomiméticos pueden ser generados de modo que mimeticen aquellos residuos que facilitan la interacción. Dichos miméticos pueden entonces ser utilizados para interferir con la función normal de una proteína de la HIP (o su ligando). Por ejemplo, los análogos de péptidos no hidrolizables de dichos residuos pueden ser generados utilizando benzodiacepina (por ej., ver Freidinger y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher; Leiden, Holanda, 1988), azepina (por ej., ver Huffman y col., en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Holanda, 1988), pseudopéptidos de ceto-metileno (Ewenson y col. (1986) J Med Chem 29: 295; y Ewenson y col. en Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), núcleos de dipéptido de giro-b (Nagai y col. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; y Sato y col. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231), y b-aminoalcoholes (Gordon y col. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419; y Dann y col. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71).

Otro aspecto de la invención pertenece a un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína de la HIP. Por ejemplo, mediante la utilización de inmunogenes derivados de un proteína de la HIP, por ej., basada en las secuencias de cADN, pueden preparase antisueros anti-proteína/anti-péptido o anticuerpos monoclonales por protocolos estándar (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo puede ser inmunizado con una forma inmunogénica del péptido (por ej., un polipéptido de la HIP o un fragmento antigénico que sea capaz de obtener una respuesta de anticuerpo). Las técnicas para conferir inmunogenicidad en una proteína o péptido incluyen la conjugación a soportes u otras técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Una parte inmunogénica de una proteína de la HIP puede ser administrada en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede ser monitorizado por detección de valoradotes de anticuerpos en plasma o suero. Puede utilizarse el ELISA estándar u otros inmunoensayos con el inmunogen como antígeno para valorar los niveles de anticuerpos. En una realización preferida, los anticuerpos objeto de la invención son inmunoespecíficos para determinantes antigénicos de una proteína de la HIP de un organismo, tal como un mamífero, por ej., determinantes antigénicos de una proteína representada por la SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8 u homólogos íntimamente relacionados (por ej., al menos un 70% homólogos, preferiblemente al menos un 80% homólogos, y más preferiblemente al menos un 90% homólogos). En todavía una realización preferida adicional de la presente invención, con el fin de proporcionar, por ejemplo, anticuerpos que sean inmuno-selectivos para los homólogos de la HIP discretos los anticuerpos de los polipéptidos anti-HIP no se reticulan de forma sustancial (es decir, no reaccionan de forma específica) con una proteína que es, por ejemplo, menos del 85%, 90% o 95% homóloga con la HIP seleccionada. Por "no reticula de forma sustancial", se quiere significar que el anticuerpo tiene una afinidad de unión para una proteína no-homóloga que es de al menos un orden de magnitud, más preferiblemente al menos 2 órdenes de magnitud, e incluso más preferiblemente al menos 3 ordenes de magnitud menos que la afinidad de unión del anticuerpo para la HIP pretendida como objetivo.

Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido de la HIP, puede obtenerse antisueros anti-HIP y, en el caso en que se desee, anticuerpos anti-HIP policlonales aislados del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden obtenerse las células que producen anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionadas por procedimientos de fusión de células somáticas estándar con células inmortalizadas tales como células de mieloma para rendir células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en el estado de la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica del hibridoma de célula B humana (Kozbar y col., (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, págs. 77-96). Las células de hibridoma pueden ser seleccionadas de forma inmunoquímica para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido de la HIP de la presente invención y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.

El término anticuerpo tal como se utiliza en la presente invención pretende incluir fragmentos del mismo que también sean específicamente reactivos con un polipéptido de la HIP. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos seleccionados para determinar la utilidad del mismo modo que se ha descrito anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)_{2} pueden ser generados por tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2} resultante puede ser tratado para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos de Fab. Se pretende que el anticuerpo de la presente invención incluya de forma adicional moléculas bi-específicas y quiméricas que tengan afinidad para una proteína de la HIP otorgada por al menos una región de CDR del anticuerpo.

Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales (Ab) dirigidos contra auténticos polipéptidos de la HIP, o variantes de la HIP, y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab)_{2}, Fv y scFv pueden ser utilizados para bloquear la acción de una proteína de la HIP y permitir el estudio del papel de estas proteínas en, por ejemplo, la diferenciación del tejido. Los experimentos de esta naturaleza pueden ayudar en descifrar el papel de las proteínas de la HIP que pueden estar implicadas en el control de la proliferación respecto la diferenciación, por ej., en el diseño y la formación del tejido.

Los anticuerpos que se unen de forma específica a los epitopes de la HIP también pueden ser utilizados en tinción inmunohistoquímica de muestras de tejidos con el fin de evaluar la abundancia y el diseño de la expresión de cada uno de los polipéptidos de la HIP objeto de la invención. Los anticuerpos anti-HIP pueden ser utilizados para el diagnostico en la inmuno-precipitación y en la inmuno-formación de manchas para detectar y evaluar los niveles de proteína de la HIP en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico. Por ejemplo, dichas medidas pueden ser útiles en las valoraciones predictivas del inicio o progresión de los trastornos proliferativos o diferenciativos. Del mismo modo, la capacidad para monitorizar los niveles de proteína de la HIP en un individuo puede permitir la determinación de la eficacia de un régimen de tratamiento dado para un individuo afligido de dicho trastorno. Puede determinarse el nivel de polipéptidos de la HIP a partir de células en fluidos corporales, tal como en muestras de fluido espinal cerebral o fluido amniótico, o puede ser medido en tejido, tal como el producido por biopsia. Los ensayos de diagnóstico utilizando anticuerpos ant-HIP pueden incluir, por ejemplo, inmunoensayos diseñados para ayudar en la diagnosis temprano de un trastorno, particularmente de aquellos que se manifiesten al nacimiento. Los ensayos de diagnóstico utilizando anticuerpos de polipéptido anti-HIP también pueden incluir inmunoensayos diseñados para ayudar en la diagnosis temprano y el fenotipazo neoplástico o los trastornos hiperplásticos.

Otra aplicación de los anticuerpos anti-HIP de la presente invención está en la selección inmunológica de bibliotecas de cADN construidas en vectores de expresión tales como \lambdagt11, \lambdagt18-23, \lambdaZAP, y \lambdaORF8. Las bibliotecas de mensajeros de este tipo, que tienen secuencias de codificación insertadas en el bloque de lectura y orientación correcta, pueden producir proteínas de fusión. Por ejemplo, el \lambdagt11 producirá proteínas de fusión cuyos terminales amino consisten en secuencias de amino ácidos de \beta-galactosidasa y aquellas cuyo terminal carboxi consiste en un polipéptido extraño. Los epitopes antigénicos de una proteína de la HIP, por ej., ortólogos de la proteína de la HIP a partir de otras especies, puede ser detectada a continuación con anticuerpos, como, por ejemplo, por reacción de filtros de nitrocelulosa separada de placas infectadas con anticuerpos de anti-HIP. El fago positivo detectado por este ensayo puede ser aislado a continuación a partir de la placa infectada. De este modo, la presencia de homólogos de la HIP puede ser detectada y clonada a partir de otros animales, tales como isoformas alternativas (incluyendo variantes de empalme) de humanos.

Además, las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de genes de la HIP a partir de organismos permitirá además la generación de sondas y prímeros diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de la HIP en otros tipos de células, por ej., a partir de otros tejidos, así como homólogos de la HIP de otros organismos. Por ejemplo, la presente invención también proporciona una sonda/prímero que comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado, de modo que dicho oligonucleótido comprenda una región de la secuencia de nucleótido que se hibride bajo condiciones astringentes a al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o anti-sentido seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID No:1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 o la SEC ID No: 4 o a mutantes de la misma que se produzcan de forma natural. Por ejemplo, los prímeros basados en el ácido nucleico representado en la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 o la SEC ID No: 4, pueden ser utilizados en las reacciones de la PCR para clonar homólogos de la HIP. Del mismo modo, las sondas basadas en las secuencias de la HIP objeto de la invención pueden ser utilizadas para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifique la misma proteína o proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo marcado unido al mismo y capaz de ser detectado, por ej., el grupo marcado está seleccionado entre otros radioisótopos, compuestos fluorescentes, enzimas, y co-factores de enzimas.

Dichas sondas también pueden ser utilizadas como una parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresen mal una proteína de la HIP, tal como por medición de un nivel de un ácido nucleico que codifique la HIP en una muestra de células a partir de un animal-paciente; por ej., detectando los niveles de mARN de la HIP o determinando si un gen de la HIP genómico ha sido mutado o suprimido.

Para ilustrar, las sondas de nucleótidos pueden ser generadas a partir de genes de la HIP objeto de la invención que facilitan la selección histológica del tejido intacto y de muestras de tejido para determinar la presencia (o ausencia) de transcriptos que codifican la HIP. De forma similar a los usos para diagnostico de anticuerpos anti-HIP, el uso de sondas dirigidas a los mensajes de la HIP, o a secuencias de la HIP genómicas, puede ser utilizada tanto para la evaluación predictiva como terapéutica de mutaciones alélicas que pueden manifestarse en, por ejemplo, los trastornos degenerativos marcados por la pérdida de tipos de células particulares, apoptosis, trastornos neoplásticos y/o hiperplásticos (por ej., crecimiento de células no deseado) o diferenciación anormal del tejido. Usados conjuntamente con los inmunoensayos tal como se han descrito anteriormente, las sondas de oligonucleótidos pueden ayudar a facilitar la determinación de la base molecular para un trastorno del desarrollo que puede implicar alguna anormalidad asociada con la expresión (o falta de la misma) de una proteína de la HIP. Por ejemplo, la variación en la síntesis de polipéptidos puede ser diferenciada a partir de una mutación en una secuencia de codificación.

De acuerdo con ello, el método presente proporciona un método para la determinación de si un sujeto tiene riesgo de un trastorno caracterizado por apoptosis aberrante, proliferación de células y/o diferenciación. En realizaciones preferidas, el método puede ser generalmente caracterizado por comprender la detección, en una muestra de células a partir del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión genética caracterizada por al menos uno de (i) una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica una proteína de la HIP, o (ii) la mala expresión del gen de la HIP. Par ilustrar, dichas lesiones genéticas pueden ser detectadas averiguando la existencia de al menos uno de (i) una eliminación de uno o más nucleótidos a partir de un gen de la HIP, (ii) una adición de uno o más nucleótidos a un gen de la HIP, (iii) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen de la HIP, (iv) una gran reordenación cromosómica de un gen de la HIP, (v) una gran alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajerote un gen de la HIP, (vi) una modificación aberrante de un gen de la HIP, tal como del modelo de metilación del ADN genómico, (vii) la presencia de un modelo de de tipo no salvaje de un transcrito de ARN mensajero de un gen de la HIP, (viii) un nivel de tipo no salvaje de una proteína de la HIP, y (ix) una modificación post-traduccional inapropiada de una proteína de la HIP. Tal como se establece a continuación, la presente invención proporciona un gran número de técnicas de ensayo para la detección de lesiones en un gen de la HIP, y de forma más importante, proporciona la capacidad para discernir entre diferentes causas moleculares subyacentes en el crecimiento de células aberrante dependiente de la HIP, la proliferación y/o la diferenciación.

En una realización de ejemplo, se proporciona una composición de ácido nucleico que comprende una sonda de oligonucleótido (purificada) que incluye una región de la secuencia de nucleótido que es capaz de hibridar a una secuencia con sentido o antisentido de un gen de la HIP, tal como la representada por cualquiera de las SEC ID Nos: 1-4 y 9-14, o mutantes de los mismos que se produzcan de forma natural, o secuencias de flanqueo 5’ o 3’ o secuencias intrónicas asociadas de forma natural con los genes de la HIP sujetos de la invención o mutantes de los mismos que se produzcan de forma natural. El ácido nucleico de una célula se vuelve accesible por hibridación, la sonda es expuesta al ácido nucleico de la muestra, y se detecta la hibridación de la sonda a la muestra de ácido nucleico. Dichas técnicas pueden ser utilizadas para detectar lesiones al nivel tanto genómico como de mARN, incluyendo eliminaciones, sustituciones, etc., así como para determinar los niveles de transcrito de mARN.

En ciertas realizaciones, la detección de la lesión comprende la utilización de la sonda/prímero en una reacción de cadena de polimerasa (PCR) (ver, por ej., las patentes U.S. Nos. 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de ancla o RACE PCR, o, de forma alternativa, en una reacción de cadena de unión (LCR) (ver, por ej., Landegran y col., (1988) Science 241: 1077-1080; y Nakazawa y col., (1944) PNAS 91: 360-364) el último de los cuales puede ser particularmente útil para la detección de mutaciones de punto en el gen de la HIP. En una realización meramente ilustrativa, el método incluye las etapas de (i) toma de muestra de células de un paciente, (ii) aislamiento del ácido nucleico (por ej., genómico, mARN o ambos) a partir de células de la muestra, (iii) puesta en contacto de la muestra de ácido nucleico con uno o más prímeros que hibridan de forma específica a un gen de la HIP bajo condiciones tales en la que se produce la hibridación del gen de la HIP (en el caso en que esté presente), y (iv) detección de la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detección del tamaño del producto de amplificación y comparación de la longitud a una muestra control.

En todavía otra realización, puede detectarse el nivel de una proteína de la HIP por inmunoensayo. Por ejemplo, las células de una muestra de biopsia pueden ser lisadas, y puede cuantificarse el nivel de una proteína de la HIP presente en la célula por técnicas de inmunoensayo estándar. En todavía otra realización de ejemplo, pueden detectarse los modelos de metilación aberrante de un gen de la HIP por digestión del ADN genómico a partir de una muestra de paciente con una o más endonucleasas de restricción que son sensibles a la metilación y para los que existen sitios de reconocimiento en el gen de la HIP (incluidos en las secuencias de flanqueo e intrónicas). Ver, por ejemplo, Buiting y col. (1994) Human Mol Genet 3: 893-895. El ADN digerido es separado por electroforesis de gel e hibridazo con sondas derivadas a partir, por ejemplo, de secuencias genómicas o de cADN. Puede determinarse el estado de metilación del gen de la HIP por comparación del modelo de restricción generado a partir de la muestra de ADN con el de un estándar de metilación conocida.

En todavía otras realizaciones, el dominio de unión del ligando del receptor de la HIP puede ser utilizado para detectar de forma cuantitativa el nivel de ligandos de la HIP, por ej., de proteínas de hedgehog. Para ilustrar, una forma soluble de la proteína de la HIP puede ser generada de modo que retenga la actividad de unión de hedgehog. Las muestras del fluido(s) corporal, por ej., plasma, suero, linfa, médula, fluido cerebral/espinal, orina y similares puede ser contactada con el receptor bajo condiciones en las que pueda producirse la unión ligando/receptor, y el nivel de complejos ligando/receptor formados pueda ser detectado por una variedad de técnicas conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, los ensayos de unión competitiva utilizando muestras estandarizadas de proteínas de hedgehog puede utilizarse para cuantificar la cantidad de analito unido a la muestra de fluido.

En todavía otras realizaciones, dichos receptores de la HIP pueden ser utilizados para detectar la presencia de un ligando de la HIP en una superficie de la célula. Por ejemplo, la proteína de la HIP puede ser puesta en contacto con células de una biopsia, y así establecer la capacidad de la proteína de la HIP para decorar ciertas células de la muestra. Puede detectarse la unión de la proteína de la HIP a las poblaciones de células de la muestra, por ejemplo, por modificación química o como una proteína de fusión. Marcadores de ejemplo incluyen radioisótopos, compuestos fluorescentes, co-factores enzimáticos, que pueden ser añadidos por modificación química a la proteína, e identificadores de epitopes tales como myc, pFLAG y similares, o las actividades enzimáticas tales como GST a fosfatasa alcalina que pueden ser añadidas tanto por modificación química como por generación de una proteína de fusión.

Además, la presente invención también contempla la detección de formas solubles del receptor de la HIP en muestras de fluido corporal. Tal como se ha descrito en el estado de la técnica, por ej., Diez-Ruiz y col. (1995) Eur J Haematol 54: 1-8 y Owen-Schaub y col. (1995) Cancer Lett 94: 1-8, [describiendo los receptores de CNTF] en ciertos casos se cree que las formas solubles de receptores juegan un papel como moduladores de la función biológica de sus ligandos cognados en un modelo agonista/antagonista. En varios estados patológicos, la producción y liberación de proteínas de la HIP solubles puede mediar respuesta del huésped y determinar el curso y el resultado de la enfermedad por interacción con ligandos de la HIP y competición con receptores de superficie de las células. La determinación de receptores de la HIP solubles en los fluidos corporales es una nueva herramienta para ganar información sobre diferentes estados de la enfermedad, y puede ser de valor como pronóstico para un clínico. Por ejemplo, el nivel de proteínas de la HIP solubles en un fluido corporal proporciona información útil para la monitorización inter alia, los trastornos neurológicos así como en el tratamiento de las transformaciones neoplásticas o hiperplásticas de origen ectodérmico, mesodérmico o endodérmico.

Puede cuantificarse el nivel de receptor soluble presente en una muestra dada, a la luz de la presente descripción, utilizando procedimientos y técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden utilizarse los anticuerpos inmunoselectivos para el dominio de unión del ligando de la proteína de la HIP para detectar y cuantificar su presencia en una muestra, por ej., por técnicas de inmunoensayo bien conocidas. De forma alternativa, puede utilizarse un ligando marcado del receptor para detectar la presencia del receptor en la muestra de fluido.

Actualmente existen en el estado de la técnica un número de técnicas para identificar ligandos adicionales al receptor de la HIP. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la clonación de la expresión en una biblioteca de cADN o genómica para aislar células que son decoradas con una forma marcada del receptor. En una realización preferida, la técnica usa el receptor de la HIP en un ensayo in situ para detectar los ligandos de la HIP en muestras de tejido y de organismos completos. En general, el ensayo RAP-in situ descrito a continuación (para Receptor Affinity Probe = Sonda de Afinidad del Receptor) de Flanagan y Leder (ver las publicaciones de la patente PCT WO 92/06220; y también de Cheng y col. (1994) Cell 79: 157-168) que implican el uso de un sistema de clonación de la expresión en el que un ligando de la HIP es valorado sobre la base de la unión a una proteína de fusión de la HIP/fosfatasa alcalina. En general, el método comprende (i) proporcionar una molécula híbrida (la sonda de afinidad)incluyendo el receptor de la HIP, o al menos el dominio de unión del ligando del mismo, unido de forma covalente a un identificador enzimáticamente activo, preferiblemente para el que existan sustratos cromogénicos, (ii) poner en contacto el tejido o organismo con la sonda de afinidad para formar complejos entre la sonda y un ligando cognado en la muestra, eliminado la sonda no unida, y (iii) detectar el complejo de afinidad utilizando un sustrato cromogénico para la actividad enzimática asociada con la sonda de afinidad.

Este método, a diferencia de otros métodos del estado de la técnica que se lleva a cabo sólo en cultivos de células dispersados, proporciona un medio para investigar tejidos no dispersados y completos y muestras de animales. El método puede ser utilizado, además de para facilitar la clonación de los ligandos de la HIP, también para detectar modelos de expresión para ligandos particulares del receptor de la HIP, por medición de la afinidad de las interacciones receptor/ligando en muestras de tejidos, así como para generar ensayos de selección de fármacos en muestras de tejido. Además, la sonda de afinidad también puede ser utilizada en selección de diagnóstico para determinar si un ligando de la HIP es malexpresado.

En todavía otro aspecto de la invención, los polipéptidos de la HIP objeto de la invención, pueden ser utilizados para generar un ensayo de "dos híbridos" o un ensayo de "trampa de interacción" (ver, por ejemplo, la patente U.S. No. 5.283.317; Zervos y col. (1993) Cell 72: 223-232; Madura y col. (1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; y Brent WO 94/10300), para el aislamiento de secuencias de codificación para otras proteínas que se unen a las HIPs (``proteínas de unión a la HIP2 o "HIP-bp").

Brevemente, la trampa de interacción se basa en la reconstitución in vivo de una forma de proteína activador transcripcional funcional a partir de dos proteínas de fusión separadas. En particular, el método hace uso de genes quiméricos que expresan las proteínas híbridas. Para ilustrar, un primer gen híbrido comprende la secuencia de codificación para un dominio de unión de ADN de un activador transcripcional fusionado en cuadro a la secuencia de codificación para un polipéptido de la HIP. La segunda proteína híbrida codifica un dominio de activación transcripcional fusionado en cuadro a un gen de muestra a partir de una biblioteca de cADN. Si las proteínas que el cebo y la muestra son capaces de interaccionar, por ej., formar un complejo dependiente de la HIP, traen en una cercana proximidad los dos dominios del activador transcripcional. Esta proximidad es suficiente para causar la transcripción de un gen reportero que está unido de forma operativa a un sitio regulador transcripcional responsable del activador transcripcional, y la expresión del gen reportero puede ser detectada y utilizada para valorar la interacción de la HIP y las proteínas de la muestra.

Además, para hacer disponibles polipéptidos de la HIP purificados y recombinantes, la presente invención facilita el desarrollo de ensayos que pueden ser utilizados para seleccionar fármacos que sean tanto agonistas como antagonistas de la función celular normal de las proteínas de la HIP objeto de la invención, o de su papel en la patogénesis del mantenimiento celular, la diferenciación y/o proliferación de trastornos relacionados con el mismo. En un sentido general, el ensayo evalúa la capacidad de un compuesto para modular la unión entre un polipéptido de la HIP y una molécula, por ej., un ligando tal como una proteína de hedgehog, que interacciona con el polipéptido de la HIP. Ejemplos de compuestos que pueden ser seleccionados frente a dichas interacciones mediadas por la HIP incluyen péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas orgánicas, y bibliotecas de extractos de productos naturales, tales como los aislados de animales, plantas, hongos y/o microbios.

En muchos programas de selección de fármacos que ensayan bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alta tasa de transferencia con el fin de maximizar el número de compuestos investigados en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se llevan a cabo en los sistemas libres de células, tales como los derivados con proteínas purificadas o semi-purificadas, son a menudo preferidos como selecciones "primarias" de modo que pueden ser generados para permitir el rápido desarrollo y la relativamente fácil detección de una alteración en un objetivo molecular que esté mediado por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de la toxicidad celular y/o biodisponibilidad del compuesto de ensayo pueden ser generalmente ignorados en el sistema in vitro, en lugar de focalizar el ensayo en el efecto del fármaco en el objetivo molecular tal como ser manifiesto en una alteración de la afinidad de unión con un ligando. De acuerdo con ello, en un ensayo de selección ejemplar de la presente invención, se generó una mezcla de reacción para incluir un polipéptido de la HIP del compuesto(s) de interés, y una "molécula objetivo", por ej., una proteína, que interacciona con el polipéptido de la HIP. Ejemplos de moléculas objetivo incluyen ligandos, tales como las proteínas de hedgehog, así como otros péptidos y moléculas de interacción de tipo no-péptido. La detección y la cuantificación de la interacción del polipéptido de la HIP con la molécula objetivo proporciona un medio de determinar la eficacia de un compuesto en la inhibición (o potenciación) de la interacción entre la HIP y la molécula objetivo. La eficacia del compuesto puede ser valorada por generación de las curvas dosis respuesta a partir de los datos obtenidos utilizando varias concentraciones del compuesto de ensayo. Además, también puede llevarse a cabo un ensayo de control para proporcionar una línea de base por comparación. En el ensayo de control, se cuantificó la interacción del polipéptido de la HIP y la molécula objetivo en ausencia del compuesto de ensayo.

Puede detectarse la interacción entre el polipétido de la HIP y la molécula objetivo por una variedad de técnicas. Puede cuantificarse la modulación de la formación de complejos utilizando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable tales como polipéptidos de la HIP marcados isotópicamente, marcados de forma fluorescente, o marcados enzimáticamente, por inmunoensayo, por detección cromatográfica, o por detección de la actividad intrínseca de la acetilasa.

De forma típica, será deseable inmovilizar tanto la HIP como la molécula objetivo para facilitar la separación de complejos a partir de formas no complejadas de una o ambas proteínas, así como acomodar la automatización del ensayo. La unión de la HIP a la molécula objetivo, en presencia y ausencia del agente candidato, puede ser conseguida en cualquier vaso adecuado para contener los reactivos. Ejemplos del mismo incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añada un dominio que permita que la proteína se una a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutationa-S-transferasa/HIP (GST/HIP) pueden ser adsorbidas en gránulos de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o en placas de microvaloración derivatizadas de glutationa, que son entonces combinadas con los lisados de las células, por ej., un marcado con S^{35}, y el compuesto de ensayo, y la mezcla incubada bajo condiciones que conducen a la formación del complejo, por ej., a condiciones fisiológicas para la sal y pH, aunque pueden desearse condiciones ligeramente más astringentes. Después de la incubación, se lavan los gránulos para eliminar el marcador no unido, y la matriz inmovilizada y radiomarcada determinada directamente (por ej., los gránulos colocados en centelleo), o en el sobrenadante después de que los complejos sean disociados de forma subsiguiente. De forma alternativa, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados por SDS-PAGE, y el nivel de molécula objetivo encontrado en la fracción de gránulo cuantificada a partir del gel utilizando técnicas electroforéticas estándar.

Otras técnicas para la inmovilización de proteínas y otras moléculas o matrices también son asequibles para uso en el ensayo objeto. Por ejemplo, pueden inmovilizarse tanto la HIP como la molécula objetivo utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Por ejemplo, las moléculas de HIP biotiniladas pueden ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica (por ej., kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizadas en los pocillos de placas de 96 pocillos cubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). De forma alternativa, los anticuerpos reactivos con la HIP, pero que no interfieren con la interacción entre la HIP y la molécula objetivo, pueden ser derivatizados a los pocillos de la placa, y la HIP atrapada en los pocillos por la conjugación de anticuerpos. Tal como se ha indicado anteriormente, las preparaciones de una molécula objetivo y de un compuesto de ensayo son incubadas en los pocillos que presentan la HIP de la placa, y puede cuantificarse la cantidad de complejo atrapado en el pocillo. Métodos de ejemplo para la detección de dichos complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos GST-inmovilizados incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la molécula objetivo, o que son reactivos con la proteína de la HIP y compiten con la molécula objetivo; así como ensayos de enzima unida que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la molécula objetivo, tanto actividad intrínseca como extrínseca. En el ejemplo de este último, la enzima puede estar químicamente conjugada o proporcionada como una proteína de fusión con la molécula objetivo. Para ilustrar, la molécula objetivo puede estar químicamente reticulada o genéticamente fusionada (en el caso en que sea un polipéptido) con peroxidasa de rábano picante, y la cantidad de polipéptido atrapado en el complejo puede ser valorado con un sustrato cromogénico de la enzima, por ej., tetracloruro de 3,3’-diamino-benzadina o 4-cloro-1-naftol. Igualmente, puede proporcionarse una proteína de fusión que comprenda el polipéptido y la glutationa-S-transferasa, y el complejo de formación cuantificado para la detección de la actividad de GST utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (Habig y col. (1974) J Biol Chem 249: 7130).

Para los procedimientos que se basan en la inmunodetección para las proteínas cuantificadas atrapadas en el complejo, pueden utilizarse los anticuerpos contra la proteína, tales como los anticuerpos anti-HIP. De forma alternativa, la proteína a detectar en el complejo puede ser "identificada de epitope" en la forma de una proteína de fusión que incluye, además de la secuencia de la HIP, un segundo polipéptido para el que los anticuerpos son fácilmente asequibles (por ej. a partir de fuentes comerciales). Por ejemplo, las proteínas de fusión de GST descritas anteriormente también pueden ser utilizadas para la cuantificación de la unión utilizando anticuerpos frente a la mitad de GST. Otros identificadores de epitope útiles incluyen myc-epitopes (por ej., ver Ellison y col. 81991) J Biol Chem 266: 21150-21157) que incluyen una secuencia de 10 residuos a partir de c-myc, así como el sistema pFLAG (Internacional Biotechnologies, Inc.) o el sistema de pEZZZ-proteína A (Pharamacia, NJ).

Un ensayo de selección de fármaco de ejemplo de la presente invención incluye las etapas de (a) formar una mezcla de reacción que incluye: (i) un polipéptido de hedgehog, (ii) un polipéptido de la HIP, e (iii) un compuesto de ensayo; y (b) detectar la interacción del hedgehog y los polipéptidos de la HIP. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) en la interacción del hedgehog y los polipéptidos de la HIP en presencia del compuesto de ensayo, relativo a la interacción en ausencia del compuesto de ensayo, indica un agonista potencial (mimético o potenciador) o antagonista (inhibidor) de la bioactividad de hedgehog para el compuesto de ensayo. La mezcla de reacción puede ser una preparación de proteína libre de células, por ej., una mezcla de proteína reconstituida o un lisado de células, o puede ser una célula recombinante incluyendo un ácido nucleico heterólogo que expresa de forma recombinante el polipéptido de la HIP.

En el caso en que el polipéptido de la HIP participe como parte de un complejo oligomérico formando un receptor de hedgehog, por ej., cuyo complejo incluya otras subunidades de proteína, el sistema libre de células puede ser, por ej., una preparación de membrana celular, una mezcla de proteína reconstituida, o un liposoma reconstituyente de las subunidades de receptor como un receptor de hedgehog. De forma alternativa, pueden utilizarse las preparaciones en liposomas utilizando proteína de la HIP reconstituida. Por ejemplo, pueden purificarse las subunidades de proteína de un complejo receptor de hedgehog a partir de extractos de detergentede orígenes tanto auténticos como recombinantes que pueden ser reconstituidos en vesículas de lípidos artificiales (por ej., liposomas de fosfatidilcolina) o en vesículas derivadas de membrana celular (ver, por ejemplo, Bear y col. (1992) Cell 68: 809-818; Newton y col. (1983) Biochemistry 22: 6110-6117; y Reber y col. (1992) J Biol Chem 262: 11369-11374). La estructura laminar y el tamaño de los liposomas resultantes puede ser caracterizada utilizando microscopía electrónica. La orientación externa de la proteína de la HIP en las membranas reconstituidas puede ser demostrada, por ejemplo, por microscopía de inmunoelectrón. La interacción de una proteína de hedgehog con liposomas conteniendo dichos complejos de la HIP y liposomas sin la proteína, en presencia de agentes candidatos, puede ser comparada con el fin de identificar moduladores potenciales de la interacción polipéptido hedgehog-HIP.

En todavía otra realización, el ensayo de selección de fármaco es derivado para incluir una célula completa que exprese un polipéptido de la HIP. La capacidad de un agente de ensayo para alterar la actividad de la proteína de la HIP puede ser detectada por análisis de la célula recombinante. Por ejemplo, los agonistas y antagonistas de la actividad biológica de la HIP pueden ser detectados por valoración de las alteraciones en el crecimiento o diferenciación (fenotipo) de la célula. Las técnicas generales para la detección de cada una de ellas son bien conocidas, y variarán con respecto a la fuente de la célula reactivo particular utilizada en cualquier ensayo dado. Para los ensayos basados en células, la célula recombinante es preferiblemente una célula de metazoano, por ej., una célula de mamífero, por ej., una célula de insecto, por ej., una célula de xenopus, por ej., un oocito. En otras realizaciones, el receptor de hedgehog puede ser reconstituido en una célula de levadura.

En una realización de ejemplo, puede ponerse en contacto una célula que expresa el receptor de la HIP, por ej., tanto endógena como heteróloga, con un ligando del receptor de la HIP, por ej., una proteína de hedgehog, que sea capaz de inducir transducción de la señal desde el receptor, y la señal resultante detectada en diferentes puntos del proceso, o en la base de un cambio fenotípico para la célula reactiva. En una realización, se pone en contacto la célula de reactivo con anticuerpo que causa la reticulación del receptor, y de forma subsiguiente se detecta la cascada de señal inducida por dicha reticulación. Puede detectarse un compuesto de ensayo que modula dicho proceso, por ej., potencia o inhibe, por comparación con experimentos control a los que les falte el receptor o el compuesto de ensayo. Por ejemplo, puede utilizarse la inspección visual de la morfología de la célula reactiva para determinar si la actividad biológica de la proteína de la HIP objetivo ha sido afectada por el agente añadido.

Además de los estudios morfológicos, pueden detectarse cambio(s) en el nivel de respuesta de un segundo mensajero intracelular a la señalización por el polipéptido de la HIP. Por ejemplo, en varias realizaciones el ensayo puede valorar la capacidad del agente de ensayo para causar cambios en los modelos de fosforilación, actividad adenilato ciclasa (producción de cAMP), hidrólisis de GTP, movilización de calcio, y/o hidrólisis de fosfolípidos (IP_{3}, producción de DAG) con la estimulación del receptor. Mediante la detección de cambios en las señales intracelulares, tal como alteraciones en el segundo mensajero o expresión del gen, en células contactadas con un polipéptido de hedgehog, pueden identificarse candidatos agonistas y antagonistas a la señalización de hedgehog de pendiente de la HIP.

La transducción de ciertas señales intracelulares puede ser iniciada por la interacción específica de un polipéptido hh con proteína de la HIP, mientras que otras señales pueden ser alteradas de forma indirecta por dicha interacción. En la Drosophila, y presumiblemente también en células de vertebrados, se han implicado un número de productos de genes, incluyendo la HIP, percheados, el factor de transcripción cubitus interruptus (ci), la serina/treonina quinasa fusionada (fu) y los productos de genes del costal-2, suavizado y supresor del fusionado, han estado implicados como componentes putativos de los pasos de transducción de la señal dependiente de hedgehog. La reciente clonación de homólogos de vertebrados de los genes de drosophila sugiere que el proceso de señalización de hedgehog es altamente conservado de drosophila a especies de vertebrados. Puede detectarse la actividad de cada una de estas proteínas directamente (tal como la actividad de la quinasa de fusionada, o puede detectarse de forma indirecta por monitorización del nivel de los segundos mensajeros corriente abajo en el proceso de la señal.

Para mayor ilustración, recientes estudios han implicado la proteína quinasa A (PKA) como un posible componente de la señalización del hedgehog en drosophila y organismos vertebrados (Hammerschmidt y col. (1996) Genes & Dev 10: 647). La alta actividad PKA ha demostrado antagonizar la señalización de hedgehog en estos sistemas. Aunque no está claro si la PKA actúa directamente corriente abajo o en paralelo con la señalización de hedgehog, es posible que la señalización de hedgehog se produzca a través de los efectos de la proteína de la HIP en la inhibición de la actividad de la PKA. De este modo, la detección de la actividad de la PKA proporciona una lectura potencial para los ensayos del momento.

La unión del hedgehog a las proteínas de la HIP puede estimular la actividad de las fosfolipasas. Los lípidos de inositol pueden ser extraídos y analizados utilizando técnicas de extracción de lípidos estándar. Los derivados solubles en agua de los tres lípidos de inositol (IP_{1}, IP_{2}, IP_{3}) también pueden ser cuantificados utilizando técnicas de radiomarcaje o de HPLC.

La movilización del calcio intracelular o el influjo de calcio desde fuera de la célula puede ser una respuesta a la estimulación de hedgehog o falta del mismo. El flujo de calcio en la célula reactivo puede ser medido utilizando técnicas estándar. La selección del apropiado iniciador de calcio, fluorescente, bioluminiscente, metalocrómico, o microelectrodos sensibles a Ca^{++} depende del tipo de célula y la magnitud y la constante de tiempo del suceso bajo estudio (Borle (1990) Environ Health Perspect 84: 45-56). Como un método de ejemplo de detección de Ca^{++}, las células pueden ser cargadas con el tinte fluorescente sensible a Ca^{++} fura-2 o indo-1, utilizando métodos estándar, y cualquier cambio en el Ca^{++} medido utilizando un fluorómetro.

En ciertas realizaciones del ensayo, puede ser deseable seleccionar según los cambios en la fosforilación celular. Como un ejemplo, el gen de drosophila fusionado (fu) que codifica la serina/treonina quinasa ha sido identificado como un objetivo corriente abajo potencial en la señalización de hedgehog. (Preat y col., 1990 Nature 347, 87-89; Therond y col., 1993, Mech. Dev. 44: 65-80). La capacidad de los compuestos para modular la activación de la serina/treonina quinasa puede ser seleccionada utilizando la inmunotinción de colonias (Lyons y Nelson (1984) PNAS 81: 7426-7430) utilizando anticuerpos frente a los residuos de serina o treonina fosforilada. Los reactivos para llevar a cabo dichos ensayos son comercialmente asequibles, por ejemplo, pueden obtenerse de fuentes comerciales los anticuerpos específicos de fosfoserina y fosfotreonina que miden los incrementos en la fosforilación de aquellos residuos.

La interacción de una proteína de hedgehog con una proteína de la HIP puede poner en movimiento una cascada que implica la activación e inhibición de efectores corriente abajo, cuya última consecuencia es, en algunos casos, un cambio detectable en la transcripción o la traducción de un gen. Los objetivos transcripcionales potenciales de la señalización de hedgehog dependiente de la HIP incluyen el propio gen de la HIP, el gen parcheado (Hidalgo y Ingham (1990) Development 110, 291-301; Marigo y col. (1996) Development 122: 1225-1233), y los homólogos de vertebrados del gen de cubitus interruptus (ci) de drosophila, los genes GLI (Hui y col. (1994) Dev Biol 162: 402-413). La expresión del gen parcheado ha demostrado ser inducido en células de la yema del miembro y de la placa neural que son responsables para el Shh (Marigo y col. (1996) PNAS, en prensa; Marigo y col., supra). Los genes de GLI que codifican factores de transcripción putativos que tienen dominios de unión de ADN con dedos de zinc (Orenic y col. (1990) Genes & Dev 4: 1053-1067; Kinzler y col. (1990) Mol Cell Biol 10: 634-642). Se ha descrito que la transcripción del gen GLI está sobre-regulada en respuesta al hedgehog en las yemas del miembro, mientras que la transcripción del gen de GLI3 está infla-regulado en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo y col. (1996) Development 122: 1225-1233). Seleccionando las secuencias reguladoras transcripcionales a partir de los genes objetivo, por ej. a partir de los genes de la HIP o GLI, que son responsables de la sobre o infla-regulación de estos genes en respuesta a la inducción de hedgehog, y uniendo de forma operativa dichos promotores a un gen reportero, la presente invención proporciona un ensayo basado en la transcripción que es sensible a la capacidad de un compuesto de ensayo específico para influenciar el proceso de señalización de hedgehog.

En una realización de ejemplo, la etapa de detección de la interacción de los polipéptidos de hedgehog y de la HIP comprende la detección, en un ensayo de base celular, del cambio(s) en el nivel de expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora transcripcional responsable de la señalización por el polipéptido de la HIP. Los ensayos basados en el gen reportero de esta invención miden la etapa final de la cascada de acontecimientos anteriormente descritos, por ej., la modulación transcripcional. De acuerdo con ello, al poner en práctica una realización del ensayo, se inserta una construcción de un gen reportero en la célula reactiva con el fin de generar una señal de detección dependiente de la señalización de hedgehog. De este modo, la expresión del gen reportero, proporciona una herramienta de selección valiosa para el desarrollo de compuestos que actúan como agonistas o antagonistas de la inducción de hedgehog dependiente de la HIP.

Al poner en práctica una realización del ensayo, se inserta una construcción de un gen reportero en la célula reactivo con el fin de generar una señal de detección dependiente de segundos mensajeros generados por inducción dependiente de la HIP con una proteína de hedgehog. De forma típica, la construcción del gen reportero incluirá un gen reportero en unión operativa con uno o más elementos reguladores transcripcionales responsables de la actividad de hedgehog, con el nivel de expresión del gen reportero que proporciona la señal de detección dependiente de hedgehog. La cantidad de transcripción a partir del gen reportero puede ser medida utilizando cualquier método conocido por los expertos en la materia que sea adecuado. Por ejemplo, la expresión del mARN a partir del gen reportero puede ser detectada utilizando la protección ARNsa o la PCR basada en ENA, o el producto de proteína del gen reportero puede ser identificado por una mancha característica o una actividad intrínseca. La cantidad de expresión a partir del gen reportero es entonces comparada con la cantidad de expresión tanto de la misma célula en ausencia del compuesto de ensayo o puede ser comparada con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica a la que le falta la proteína del receptor objetivo. Cualquier diferencia estadísticamente, o de otra forma, significativa en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo tiene alterada de alguna manera la actividad inductiva de la proteína de hedgehog.

Tal como se describe con mayor detalle a continuación, en realizaciones preferidas el producto del gen del reportero es detectado por una actividad intrínseca asociada con dicho producto. Por ejemplo, el gen reportero puede codificar un producto del gen que, por actividad enzimática, produzca un aumento de una señal de detección basado en el color, la fluorescencia o la luminiscencia. En otras realizaciones preferidas, el gen reportero o marcador proporciona una ventaja de crecimiento selectiva, por ej., el gen reportero puede intensificar la viabilidad de la célula, mitiga un requerimiento nutricional de la célula, y/o proporciona resistencia al fármaco. Muchos genes reporteros son conocidos por los expertos en la materia y otros pueden ser identificados o sintetizados por métodos conocidos por los expertos en la materia. Un gen reportero incluye cualquier gen que exprese un producto del gen detectable, que puede ser ARN o proteína.

Los genes reporteros preferidos son aquellos que son fácilmente detectables. El gen reportero puede estar también incluido en la construcción en la forma de un gen de fusión con un gen que incluye las secuencias reguladoras transcripcionales deseadas o muestra otras propiedades deseables. Ejemplos de genes reporteros incluyen, pero no están limitadas a CAT (acetil transferasa del cloramfenicol) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282: 864-869) luciferasa, y otros sistemas de detección de enzimas, tales como la beta-galactosidasa; la luciferasa de luciérnaga (de Wet y col. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 725-737); la luciferasa bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin y col. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh y col. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, may y col. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101), la fosfatasa alcalina segregada por placenta humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216: 362-368).

De acuerdo con ello, todavía otra realización de los ensayos de selección del fármaco objeto de la invención de la presente invención proporcionan una célula recombinante, por ej., llevando a cabo algunos de los métodos de selección anteriores, que comprenden: (i) un gen recombinante expresable que codifica un polipéptido de la HIP heterólogo; y (ii) una construcción del gen reportero que contiene un gen reportero en unión operativa con uno o más elementos reguladores transcripcionales responsables de la actividad de transducción de la señal del polipéptido de la HIP. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona un equipo para la selección de compuestos de ensayo para identificar agentes que modulan la unión de proteínas de hedgehog con un receptor de hedgehog, incluyendo la célula anteriormente-referenciada y una preparación del polipéptido de hedgehog purificado.

En todavía otra realización de una selección de fármaco, puede generarse un ensayo de dos híbridos (descrito anteriormente) para ser generado con un polipéptido de la HIP y una molécula objetivo. Puede valorarse la inhibición dependiente del fármaco o la potenciación de la interacción.

Después de identificar ciertos compuestos de ensayo como moduladores potenciales de una o más bioactividades de una proteína de la HIP (tal como la unión de hedgehog), quien ponga en práctica el ensayo objeto de la invención continuará ensayando la eficacia y la especificidad de los compuestos seleccionados tanto in vitro como in vivo. Tanto para el subsiguiente ensayo in vivo, como para la administración a un animal como un fármaco aprobado, los agentes identificados en el ensayo objeto pueden ser formulados en preparaciones farmacéuticas para la administración in vivo a un animal, preferiblemente un humano.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para inducir y/o mantener un estado diferenciado, una supervivencia incrementada, y/o la inhibición (o de forma alternativa la potenciación) la proliferación de una célula, por contacto de las células con un agente que module el proceso de transducción de la señal dependiente de la HIP. El método sujeto puede ser utilizado para generar y/o mantener una selección de diferentes tejidos tanto in vitro como in vivo. Un "HIP terapéutica", tanto inhibitoria como potenciadota con respecto a la modulación de la actividad de una proteína de la HIP, puede ser, en el caso en que sea apropiado, cualquiera de las preparaciones descritas anteriormente, incluyendo los polipéptidos de la HIP aislados (incluyendo tanto las formas agonistas como antagonistas), las construcciones de terapia génica, las moléculas antisentido, los peptidomiméticos, o agentes identificados en los ensayos del fármacos que se proporcionan en la presente invención. En ciertas realizaciones, las formas solubles de la proteína de la HIP incluyendo el dominio ligando-unión extracelular del receptor pueden proporcionarse como un medio para antagonizar la unión de un ligando de la HIP a una receptor de la HIP de la superficie de la célula. Por ejemplo, dichas formas del receptor pueden ser utilizadas para antagonizar la bioactividad de un ligando del receptor.

Los compuestos terapéuticos de la HIP de la presente invención es probable que jueguen un papel importante en la modulación de la proliferación celular y el mantenimiento de, por ejemplo, los tejidos neuronales, testiculares, osteogénicos o condrogénicos durante los estados de la enfermedad. También será aparente que, mediante el uso transitorio de moduladores de las actividades de la HIP, puede conseguirse la reforma in vivo del tejido, por ej., en el desarrollo y el mantenimiento de órganos tales como el modelaje ectodérmico, así como ciertos procedimientos de diferenciación mesodérmicos y endodérmicos. Mediante el control del potencial proliferativo y diferenciativo de diferentes células, pueden utilizarse los terapéuticos de la HIP objeto de la invención para reformar el tejido dañado, o para mejorar injertos y morfología de tejido transplantado. Por ejemplo, los antagonistas y los agonistas de la HIP pueden utilizarse de un modo diferencial para regular diferentes etapas de la reparación de órganos después de daños físicos, químicos o patológicos. El método presente también es aplicable a las técnicas de cultivo de células.

Para ilustrar de forma adicional este aspecto de la invención, los sistemas de cultivo neuronal han demostrado ser herramientas fundamentales e indispensables para el estudio del desarrollo neuronal, así como para la identificación de factores neurotróficos tales como el factor de crecimiento nerviosos (NGF), los factores tróficos filiares (CNTF), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Una vez una célula neuronal se ha hecho diferenciada de forma terminal, ésta, de forma típica, no cambiará a otro tipo de célula diferenciada de forma terminal. Esto es comúnmente observado cuando se hacen crecer en cultivos de tejidos adultos, y cuando forman un blastema durante la regeneración. El método presente proporciona un medio de asegurar un entorno adecuadamente restrictivo con el fin de mantener las células neuronales en diferentes estados de diferenciación, y puede ser utilizado, por ejemplo, en los cultivos de células diseñados para ensayar las actividades específicas de otros factores tróficos. En dichas realizaciones del método objeto de la invención, las células cultivadas pueden ser puestas en contacto con un agente terapéutico de la HIP, por ej., tal como un agente identificado en los ensayos descritos anteriormente que potencian las bioactividades de hedgehog dependientes de la HIP, con el fin de inducir la diferenciación neuronal (por ej., de una célula raíz), o para mantener la integridad de un cultivo de células neuronales diferenciadas de forma terminal mediante la prevención de la pérdida de diferenciación. De forma alternativa, un antagonista de la inducción de hedgehog, tal como se espera que sean ciertos homólogos de la HIP de la presente invención, puede ser utilizado para prevenir la diferenciación de las células progenitoras en los cultivos.

Para ilustrar de forma adicional los usos de los terapéuticos de la HIP que pueden ser tanto agonistas como antagonistas de hedgehog, es de señalar que el injerto intracerebral ha emergido como una aproximación adicional a las terapias del sistema nervioso central. Por ejemplo, una aproximación a la reparación de los tejidos del cerebro dañado implica el transplante de células a partir de animales fetales o neonatales en el cerebro adulto (Dunnett y col. (1987) J Exp Biol 123: 265-289; y Freund y col. (1985) J Neurosci 5: 603-616). Las neuronas fetales de una variedad de regiones cerebrales pueden ser incorporadas de forma exitosa en el cerebro adulto, y dichos injertos pueden aliviar los defectos del comportamiento. Por ejemplo, el trastorno del movimiento inducido por lesiones de proyecciones dopaminérgicas a los ganglios basales puede se prevenido por injertos de neuronas dopaminérgicas embriónicas. Las funciones cognitivas complejas que están dañadas después de lesiones del neocortex también pueden ser parcialmente restauradas por injertos de células corticales embriónicas. El uso diferencial de los agonistas y antagonistas de hedgehog en el cultivo puede controlar el tiempo y el tipo de diferenciación accesible por el cultivo.

Además de la implantación de células cultivadas en presencia de agonistas y antagonistas de hedgehog y de otros usos in vitro, todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a la aplicación terapéutica de un agente terapéutico de la HIP para intensificar la supervivencia de neuronas y de otras células neuronales tanto en el sistema nervioso central como en el sistema nervioso periférico. Puede esperarse de forma razonable que la capacidad de la proteína de hedgehog para regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también de forma presumible en el estado adulto indica que algunas de las proteínas de hedgehog, y de acuerdo con ello el agente terapéutico de la HIP que modula las bioactividades de hedgehog, facilite el control de las neuronas adultas con respecto al mantenimiento, la ejecución funcional, y la edad de las células normales; los procedimientos de reparación y regeneración en células química y mecánicamente lesionadas; y la prevención de la degeneración y la muerte prematura que resulta de la pérdida de diferenciación en ciertos estados patológicos. A la luz de estos conocimientos, la presente invención contempla de forma específica las aplicaciones de los agentes terapéuticos de la HIP objeto de la invención para el tratamiento de (prevención y/o reducción de la severidad de estados neurológicos derivados de: (i) daño agudo, subagudo, o crónico al sistema nervioso central, incluyendo daño traumático, daño químico, daño basal y déficit (tales como la isquemia resultante de la apoplejía), junto con daños infecciosos/inflamatorios e inducidos por tumor; (ii) edad del sistema nervioso incluyendo enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amilotrófica y similares, así como degeneraciones espinocerebelares; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso o afectando al sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple.

Muchos trastornos neurológicos están asociados con la degeneración de poblaciones discretas de elementos neuronales y pueden ser tratados con un régimen terapéutico que incluye un agente terapéutico de la HIP que actúa como un agonista de hedgehog. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer está asociada con déficit en varios sistemas de neurotrasmisor, tanto aquellos que proyectan al neocortex como aquellos que residen con el cortex. Por ejemplo, se ha observado que el núcleo basal en pacientes con enfermedad de Alzheimer tiene una pérdida de profundidad (75%) de neuronas en comparación con los controles de edades similares. Aunque la enfermedad de Alzheimer es de lejos la forma más común de demencia, varias otras enfermedades pueden producir demencia. Varias de éstas son enfermedades degenerativas caracterizadas por la muerte de las neuronas en varias partes del sistema nervioso central, especialmente el cortex cerebral. Sin embargo, varias formas de demencia están asociadas con la degeneración del tálamo o la masa blanca que subyace en el cortex cerebral. En la presente invención, la disfunción cognitiva conduce al aislamiento de áreas corticales por la degeneración de eferentes y aferentes. La enfermedad de Huntington implica la degeneración de neuronas colinérgicas intrastraitales y corticales y neuronas GABAérgicas. La enfermedad de dic es una degeneración neuronal severa en el neocortex de los lóbulos temporales frontal y anterior, acompañado algunas veces por muerte de las neuronas en el estriado. El tratamiento de pacientes que sufren de dichos estados degenerativos puede incluir la aplicación de agentes terapéuticos de la HIP con el fin de controlar, por ejemplo, los sucesos de diferenciación y apoptóticos que producen un aumento de la pérdida de neuronas (por ej., para intensificar la supervivencia de neuronas existentes) así como para favorecer la diferenciación de la repoblación por las células progenitoras en el área afectada.

Además de las demencias inducidas de forma degenerativa, puede aplicarse de forma oportuna una preparación farmacéutica de uno o más de los agentes terapéuticos de la HIP en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que tienen manifestaciones de temblores y movimientos involuntarios. La enfermedad de Parkinson, por ejemplo, afecta ante todo a las estructuras subcorticales y está caracterizada por la degeneración del proceso nigrostriatal, el núcleo del rafe, locus cerelus, y el núcleo del motor del vago. El galismo está típicamente asociado con daño en el núcleo subtálmico, debido a menudo a un accidente vascular agudo. También se incluyen enfermedades neurogénicas y miopáticas que afectan en última instancia la división somática del sistema nervioso periférico y se manifiestan como trastornos neuromusculares. Ejemplos de ellas incluyen atrofias crónicas tales como la esclerosis lateral amiotrófica, el síndrome de Guillain-Barre y la neuropatía periférica crónica, así como otras enfermedades que pueden manifestarse como parálisis bulbar progresiva o atrofias musculares espinales. El método presente está disponible para el tratamiento de trastornos del cerebelo que dan lugar a hipotonía o ataxia, tales como aquellas lesiones en el cerebelo que producen trastornos en los miembros ipsilateralesa la lesión. Por ejemplo, puede utilizarse una preparación de un agente terapéutico de la HIP para tratar una forma restringida de la degeneración cortical cerebelar que implica los lóbulos anteriores (vermis y áreas de las piernas) tal como es común en los pacientes alcohólicos.

En una realización ilustrativa, el método objeto de la invención se utiliza para tratar esclerosis lateral amiotrófica. El ALS es un nombre dado a un complejo de trastornos que comprenden las neuronas motoras superiores e inferiores. Los pacientes pueden presentar atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, o una combinación de estos estados. La principal anormalidad patológica está caracterizada por una degeneración selectiva y progresiva de las neuronas motores inferiores en la médula espinal y en las neuronas motores en el cortex cerebral. La aplicación terapéutica de un agonista de hedgehog puede ser utilizada sola, o en conjunción con otros factores neurotróficos tales como CNTF, BDNF o NGF para prevenir y/o revertir la degeneración de las neuronas motores en pacientes de ALS.

Los agentes terapéuticos de la HIP de la presente invención también pueden ser utilizados en el tratamiento de trastornos autonómicos del sistema nervioso periférico, que incluyen trastornos que afectan la inervación del músculo liso y del tejido endocrino (tal como el tejido glandular). Por ejemplo, el método objeto de la invención puede ser utilizado para tratar la taquicardia o arritmias cardíacas atriales que pueden surgir como un estado degenerativo de los nervios que inervan el músculo estriado del corazón.

Además, un potencial papel para ciertos agentes terapéuticos de la HIP deriva del papel de las proteínas de hedgehog en desarrollo y mantenimiento de procedimientos dendríticos de neuronas axonales. Los papeles potenciales para los agonistas de hedgehog incluye de forma consecuente una guía para las proyecciones axonales de la capacidad para favorecer al diferenciación y/o el mantenimiento de las células que inervan a sus procedimientos axonales. De acuerdo con ello, las composiciones que comprenden agentes terapéuticos de la HIP que agonizan la actividad de hedgehog, pueden ser utilizados para soportar la supervivencia y la reproyección de diferentes tipos de neuronas gangliónicas simpatéticas y de neuronas sensoriales así como de neuronas motores. En particular, dichas composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, varias neuronas de la muerte inducida por lesión así como guiar la reproyección de estas neuronas después de dicho daño. Dichas enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, infarto de trauma en el CNS (sistema nervioso central) infección (tal como infección viral con varicela-zoster), enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, agentes tóxicos (tales como el tratamiento con cisplatino).

Además, algunos de los agentes terapéuticos de la HIP (por ej., los que antagonizan la inducción de hedgehog) pueden ser útiles en la ablación selectiva de neuronas sensoriales, por ejemplo, en el tratamiento de síndromes de dolor crónico.

En el caso en que sea apropiado, pueden utilizarse agentes terapéuticos de la HIP en prótesis de nervios para la reparación del daño de nervios central y periférico. En particular, cuando un axón aplastado o dañado es intubulado por uso de un dispositivo prostético, pueden añadirse ciertos agentes terapéuticos de la HIP al dispositivo prostético para incrementar la velocidad de crecimiento y de regeneración de los procedimientos dendríticos. Ejemplos de canales de guía de nervios están descritos en las patentes U. S. 5.092.871 y 4.955.892. De acuerdo con ello, puede dirigirse un procedimiento axonal severo hacia el final del nervio a partir del cual se dañó por una guía de nervios de prótesis.

En otra realización, el método sujeto puede ser utilizado en el tratamiento de transformaciones neoplásticas o hiperplásticas tales como las que se pueden presentar en el sistema nervioso central. Por ejemplo, ciertos agentes terapéuticos de la HIP pueden facilitar la interrupción de ciclos autocrine, tales como los ciclos autoestimulatorios de TGF-\beta o PDGF, los cuales se cree que están implicados en la transformación neoplástica de varios tumores neuronales. Los agentes terapéuticos de la HIP pueden, por consiguiente, ser de este modo de uso en el tratamiento de, por ejemplo, gliomas malignos, meduloblastomas, tumores neuroectodérmicos, y ependimonas.

Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a la aplicación del descubrimiento que las proteínas de hedgehog son señales morfogénicas implicadas en otros procesos organogénicos de vertebrados además de la diferenciación neuronal tal como se ha descrito anteriormente, teniendo papeles aparentes en otros modelos endodérmicos, así como tanto para los procedimientos de diferenciación endodérmica como mesodérmica. Tal como se ha descrito en la literatura, el Shh juega un papel en el crecimiento y modelaje correcto del miembro por iniciación de la expresión de las moléculas de señalización, incluyendo Bmp-2 en el mesodermo y Fgf-4 en el ectodermo. De este modo, la invención contempla que las composiciones que comprenden ciertos agentes terapéuticos de la HIP también pueden ser utilizadas tanto para el cultivo de células como para métodos terapéuticos que implican la generación y el mantenimiento del tejido no-neuronal.

En una realización, la presente invención hace uso del descubrimiento que las proteínas de hedgehog, tales como Shh, están aparentemente implicadas en el controlar el desarrollo de células del tallo responsables de la formación del aparato digestivo, el hígado, los pulmones y otros órganos que derivan del intestino primitivo. El Shh sirve como una señal inductiva a partir del endodermo al mesodermo, que es crítica para la morfogénesis del intestino. Por consiguiente, por ejemplo, los agonistas de hedgehog pueden utilizarse en el desarrollo y el mantenimiento de un hígado artificial que puede tener múltiples funciones metabólicas de las de un hígado normal. En una realización de ejemplo, un agente terapéutico de la HIP que actúa como un agonista de hedgehog puede ser utilizado para inducir la diferenciación de las células raíz del tubo digestivo para formar cultivos de hepatocitos que pueden ser utilizados para poblar las matrices extracelulares, o que pueden ser encapsulados en polímeros biocompatibles, para formar hígados artificiales tanto implantables como extracorporales.

En otra realización, las composiciones terapéuticas de agonistas de hedgehog pueden ser utilizados conjuntamente con el trasplante de dichos hígados artificiales, así como estructuras de hígado embriónico, para favorecer el implante intraperitoneal, la vascularización, y la diferenciación y el mantenimiento del tejido del hígado injertado in vivo.

En todavía otra realización, los agentes terapéuticos de la HIP pueden utilizarse de forma terapéutica para regular dichos órganos después del daño físico, químico o patológico. Por ejemplo, las composiciones terapéuticas que comprenden agonistas de hedgehog pueden ser utilizadas en la reparación del hígado subsiguiente a una hepatectomía parcial. De forma similar, las composiciones terapéuticas que contiene agonistas de hedgehog pueden ser utilizadas para favorecer la regeneración del tejido pulmonar en el tratamiento del enfisema.

En todavía otra realización de la presente invención, las composiciones que comprenden agentes terapéuticos de la HIP pueden ser utilizados en la generación in vitro del tejido esquelético, tal como el formado a partir de células de raíz esqueletogénico, así como el tratamiento in vivo de deficiencias de tejido esquelético. La presente invención contempla de forma particular el uso de agentes terapéuticos de la HIP que agonizan una actividad esqueletogénica de hedgehog, tal como una capacidad para inducir condrogénesis y/o osteogénesis. Por "deficiencia del tejido esquelético", se quiere significar una deficiencia en el hueso u otro tejido conectivo esquelético en el sitio en donde se desee restaurar el hueso o el tejido conectivo, sin tener en cuenta la deficiencia originada, por ej., si es un resultado de una intervención quirúrgica, eliminación de un tumor, ulceración, implante, fractura, u otros estados traumáticos o degenerativos.

Por ejemplo, la presente invención hace asequibles métodos y composiciones terapéuticas efectivas para restaurar el funcionamiento del cartílago a un tejido conectivo. Dichos métodos son útiles en, por ejemplo, la reparación de defectos o lesiones en el tejido del cartílago que es el resultado de un desgaste degenerativo como el que resulta en la artritis, así como otros trastornos que pueden ser causados por traumas en el tejido, tal como un desplazamiento del tejido del menisco roto, meniscectomía, una laxación de una articulación por una rotura de ligamento, daño en las articulaciones, fractura de huesos, o por enfermedad hereditaria. El presente método reparador es también útil para remodelar la matriz del cartílago, tal como en la cirugía plástica o reconstructiva, así como en la cirugía periodontal. El método presente también puede ser aplicado para mejorar un procedimiento reparador previo, por ejemplo, después de la reparación quirúrgica de un menisco, ligamento, o cartílago. Además, puede prevenir el inicio o la exacerbación de la enfermedad degenerativa si se aplica de forma suficientemente temprana después del trauma.

En una realización de la presente invención, el método objeto de la misma comprende el tratamiento del tejido conectivo afectado con una cantidad terapéuticamente suficiente de un agonista de hedgehog, particularmente un agente terapéutico de la HIP que agoniza la actividad de la Ihh, para generar una respuesta de reparación del cartílago en el tejido conectivo por estimulación de la diferenciación y/o proliferación de condorcitos incrustados en el tejido. La inducción de condorcitos por el tratamiento con un agonista de hedgehog puede resultar de forma subsiguiente en la síntesis de una nueva matriz de cartílago por las células tratadas. Dichos tejidos conectivos como el cartílago articular, el cartílago interarticular (menisco), el cartílago costal (que conecta las verdaderas costillas y el esternón), los ligamentos, y los tendones son particularmente susceptibles para el tratamiento en terapias reconstructivas y/o regenerativas utilizando el método del sujeto. Tal como se utiliza en la presente invención, las terapias regenerativas incluyen el tratamiento de los estados degenerativos que han progresado hasta el punto de que la mejoría del tejido es obviamente manifiesta, así como los tratamientos preventivos del tejido en el que es inminente la degeneración en sus estados tempranos. El método objeto de la invención puede utilizarse además para prevenir la extensión de la mineralización en tejido fibrótico manteniendo una producción constante de nuevo cartílago.

En una realización ilustrativa, el método objeto de la invención puede ser utilizado para tratar cartílago de una articulación diartroidal, tal como una rodilla, un tobillo, un codo, una HIP, una muñeca, un nudillo tanto de un dedo de la mano como del pie, o una articulación temperomandibular. El tratamiento puede ser dirigido al menisco de la articulación, al cartílago articular de la articulación, o a ambos. Para ilustrar de forma adicional, el método sujeto de la invención puede ser utilizado para tratar un trastorno degenerativo de una rodilla, tal como el que puede ser el resultado de un daño traumático (por ej., un daño por deporte o un desgaste excesivo) o osteoartritis. Puede utilizarse una inyección de un agente terapéutico de la HIP en la articulación con, por ejemplo, una aguja artroscópica, para tratar el cartílago afectado. En algunos ejemplos, el agente inyectado puede serlo en forma de un hidrogel u otro vehículo de liberación anteriormente descrito con el fin de permitir un contacto más extendido y regular del agente con el tejido tratado.

La presente invención contempla además el uso del método sujeto de la invención en el campo del trasplante de cartílago y de terapias con dispositivos prostéticos. Hasta la fecha, el crecimiento de nuevo cartílago tanto de trasplante de cartílago antólogo o alogénico ha sido durante largo tiempo no exitoso. Los problemas se presentan, por ejemplo, porque las características del cartílago y del fibrocartílago varían entre diferentes tejidos: tales como entre cartílago articular, cartílago del menisco, ligamentos, y tendones, entre los dos terminales del mismo ligamento o tendón, y entre las partes superficiales y profundas del tejido. El arreglo zonal de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades mecánicas, y se producen fallos cuando al tejido implantado que no ha sido diferenciado bajo aquellas condiciones, le falta la capacidad de responder de forma apropiada. Por ejemplo, cuando el cartílago del menisco se utiliza para reparar ligamentos cruzados anteriores, el tejido sufre un metaplasma a tejido fibroso puro. Mediante el fomento de la condrogénesis, puede utilizarse el método objeto de la invención para dirigir de forma particular este problema, causando que las células implantadas se hagan más adaptables al nuevo entorno y se parezcan a los condorcitos hipertróficos de un estado de desarrollo temprano del tejido. De este modo, la acción de condrogénesis en el tejido implantado, tal como es proporcionado por el método objeto de la invención, y las fuerzas mecánicas del tejido remodelado de forma activa pueden sinergizarse para producir un implante mejorado más adecuado para la nueva función a la que se vaya a destinar.

De un modo similar, el método objeto de la invención puede ser aplicado para intensificar tanto la generación de dispositivos de cartílago prostético como a su implantación. La necesidad de tratamiento mejorado ha motivado una investigación dirigida a crear nuevo cartílago que está baso en los patrones de colágeno-glicosaminoglicano (Stone y col. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condorcitos aislados (Grande y col. (1989) J Ortho Res 7: 208; y Takigawa y col. (1987) Bone Miner 2: 449), y los condorcitos unidos a polímeros naturales o sintéticos (Walitani y col. (1989) J Bone Jt Surg 71B: 74; Vacanti y col. (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder y col. (1991) J Biomed Mater Res 25: 329; Free y col. (1993) J Biomed Mater Res 27: 11; y la patente de Vacanti y col. U.S. No. 5.041.138). Por ejemplo, los condorcitos pueden hacerse crecer en cultivos en estructuras altamente porosas biodegradables, biocompatibles formadas a partir de polímeros tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, gel de azarosa, u otros polímeros que se degradan con el tiempo en función de la hidrólisis del esqueleto del polímero en monómeros inocuos. Las matrices son diseñadas para permitir el adecuado nutriente y el intercambio de gas a las células hasta que se produzca el injerto. Las células pueden ser cultivadas in vitro hasta que se haya desarrollado el volumen y la densidad adecuada de las células para las células a ser implantadas. Una ventaja de las matrices es que pueden ser proyectadas o moldeadas en una forma deseada en una base individual, de modo que el producto final se parezca estrechamente a la oreja o nariz propia del paciente (por vía del ejemplo), o las matrices flexibles pueden ser utilizadas de modo que permitan la manipulación en el momento del implante, como en una articulación.

En una realización del método objeto de la invención, los implantes se ponen en contacto con un agente terapéutico de la HIP durante el procedimiento de cultivo, tal como un agonista de Ihh, con el fin de inducir y/o mantener los condorcitos diferenciados en el cultivo con el fin, además, de estimular la producción de matriz del cartílago con el implante. De dicha manera, las células cultivadas pueden ser utilizadas para mantener un fenotipo típico de una célula condrogénica (es decir, hipertrófica), y con ello continuar la población de la matriz y la producción del tejido del cartílago.

En otra realización, el dispositivo implantado es tratado con un agente terapéutico de la HIP con el fin de remodelar de forma activa la matriz implantada y hacerla más adecuada para su pretendida función. Tal como se ha establecido anteriormente respecto a los tejidos transplantados, los transplantes artificiales sufren de la misma deficiencia de no estar derivados en un entorno que sea comparable al actual entorno mecánico en el que se implanta la matriz. La activación de los condorcitos en la matriz por el método objeto de la invención puede permitir que el implante adquiera características similares al tejido al que se pretende sustituir.

En todavía otra realización, el método objeto de la invención se utiliza para intensificar la unión de dispositivos prostéticos. Para ilustrar, el método objeto de la invención puede ser utilizado en el implante de una prótesis periodontal, en donde el tratamiento del tejido conectivo que lo rodea estimule la formación del ligamento periodontal sobre la prótesis, así como inhiba la formación de tejido fibrótico cerca del dispositivo prostético.

En todavía otras realizaciones, el método sujeto de la invención puede ser utilizado para la generación de hueso (osteogénesis) en un sitio en el animal en donde dicho tejido esquelético sea deficiente. El hedgehog indio está particularmente asociado con los condorcitos hipertróficos que son finalmente sustituidos por osteoblastos. Por ejemplo, puede utilizarse la administración de un agente terapéutico de la HIP de la presente invención para inducir osificación endocondral, al menos en tanto en cuanto facilite la formación de precursores de tejido cartilaginoso para formar el "modelo" por osificación. Las composiciones terapéuticas de agentes terapéuticos de la HIP puede ser suplementada, en el caso en que se requiera, con otros factores osteoinductivos, tales como los factores de crecimiento óseo (por ej., los factores de TGF-\beta, tales como los factores morfogenéticos óseos BMP-2 y BMP-4, así como la activina), y también puede incluir, o ser administrado en combinación con, un inhibidor de la resorción ósea tal como estrógeno, bisfosfonato, fluoruro sódico, calcitonina, o tamoxifeno, o compuestos relacionados. Sin embargo, será apreciado que las proteínas de hedgehog, tales como Ihh o Shh es probable que sean en corriente arriba de las BMPs, por ej., el tratamiento con un agonista de hedgehog tendrá la ventaja de iniciar la expresión endógena de las BMPs junto con otros factores.

En todavía otra realización, el agente terapéutico de la HIP de la presente invención puede ser utilizado en el tratamiento de células testiculares, de modo que module la espermatogénesis. A la luz del descubrimiento de que las proteínas de hedgehog están implicadas en la diferenciación y/o la proliferación y mantenimiento de las células de germen testicular, puede utilizarse el antagonista de hedgehog para bloquear la acción de una proteína de hedgehog que se produzca de forma natural. En una realización preferida, el agente terapéutico de la HIP inhibe la actividad biológica de Dhh con respecto a la espermatogénesis, mediante la unión competitiva del hedgehog en el testículo. Esto es, puede utilizarse el agente terapéutico de la HIP que agoniza la actividad espermatogénica del Dhh como un intensificador de la fertilidad. De un modo similar, los agonistas y antagonistas de hedgehog son potencialmente útiles para modular el funcionamiento normal del ovario.

Otro aspecto de la invención re refiere a los animales no humanos transgénicos que expresan un gen de la HIP heterólogo de la presente invención, y/o que han tenido uno o más genes de la HIP genómicos interrumpidos en al menos un tejido o tipos de células del animal. De acuerdo con ello, la invención se refiere a un modelo animal para enfermedades desarrolladas, cuyo animal tenga uno o más alelos de la HIP que estén mal-expresados. Por ejemplo, puede generarse un animal de modo que tenga eliminados uno o más alelos de la HIP o que de otro modo se hayan vuelto inactivos. Dicho modelo puede entonces ser utilizado para estudiar trastornos que se produzcan a partir de genes de la HIP mal-expresados, así como para evaluar terapias potenciales para trastornos similares.

Los animales transgénicos de la presente invención incluyen todos ellos un transgen de la presente invención dentro de una pluralidad de sus células, de modo que dicho transgen altera el fenotipo de la "célula huésped" con respecto a la regulación por la proteína de la HIP, por ej., del crecimiento, muerte y/o diferenciación de la célula. Ya que es posible producir organismos transgénicos de la invención utilizando uno o más de las construcciones del transgen descritos en la presente invención, se dará una descripción general de la producción de organismos transgénicos por referencia generalmente al material genético exógeno. Esta descripción general puede ser adaptada por aquellos expertos en la materia con el fin de incorporar secuencias de transgen específicas en organismos utilizando los métodos y los materiales descritos en la presente invención y aquellos generalmente conocidos en el estado de la técnica.

En una realización, la construcción del transgen es una construcción de eliminación. Dichas construcciones del transgen normalmente son construcciones de tipo-inserción o de tipo-sustitución (Hasty y col. (1991) Mol Cell Biol 11: 4509). Las construcciones del transgen por rotura de un gen de la HIP son diseñadas para facilitar la recombinación homóloga con una parte de un gen de la HIP genómico de modo que se pueda prevenir la expresión funcional del gen de la HIP endógeno. En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos utilizada como la construcción de eliminación puede estar comprendida de (i) ADN de alguna parte del gen de la HIP endógeno (secuencia de exón, secuencia de intrón, promotor de secuencias, etc.) que se recombinan directamente y (2) una secuencia marcador que se utiliza para detectar la presencia de la construcción de eliminación en la célula. La construcción de eliminación está insertada en una célula, y se integra con el ADN genómico de la célula en una posición tal que pueda prevenir o interrumpir la transcripción del gen de la HIP nativo. Dicha inserción puede producirse por recombinación homóloga, es decir, regiones de la construcción de eliminación que son homólogas a la secuencia del gen de la HIP endógena que hibrida al ADN genómico y recombina con las secuencias genómicas de modo que la construcción se incorpore en la posición correspondiente del ADN genómico. La construcción de eliminación puede comprender (1) una secuencia completa o parcial de uno o más exones y/o intrones del gen de la HIP a interrumpir, (2) secuencias que flanquean las terminaciones 5’ y 3’ de la secuencia de codificación del gen de la HIP, o (3) una combinación de los mismos.

Una construcción de eliminación preferida eliminará, mediante recombinación homóloga dirigida, los elementos estructurales esenciales de un gen de la HIP endógeno. Por ejemplo, la construcción objetivo puede recombinar con el gen de la HIP genómica puede eliminar una parte de la secuencia de codificación, y/o las secuencias reguladoras transcripcionales esenciales del gen.

De forma alternativa, la construcción de eliminación puede ser utilizada para interrumpir los elementos estructurales esenciales y/o los elementos reguladores de un gen de la HIP endógeno por inserción dirigida de una secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, una construcción de eliminación puede recombinar con un gen de la HIP e insertar una secuencia no-homóloga, tal como un casete de expresión neo, en un elemento estructural (por ej., un axón) y/o un elemento regulador (por ej., intensificador, promotor, sitio de división del intrón, poliadenilación, etc) para dar lugar a un alelo de la HIP que tenga una ruptura insercional. El ácido nucleico insertado puede tener un tamaño comprendido entre 1 nucleótido (por ej., para producir un desplazamiento de la estructura) y varios kilobases o más, y está limitado sólo por la eficiencia de la técnica de dirección.

Dependiendo de la localización y de las características de la rotura, puede utilizarse la construcción del transgen para generar un animal transgéncio en el que se inhiba de forma sustancial todos los elementos reguladores de la expresión en al menos una parte de las células del animal. Si sólo son objetivos los elementos reguladores, puede producirse alguna expresión de bajo nivel del gen objetivo (es decir, el alelo objetivo está "agujereado").

La secuencia(s) de nucleótidos que comprende la construcción(es) de eliminación puede ser obtenida utilizando métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, la selección de bibliotecas genómicas con sondas de cADN de la HIP con el fin de identificar los correspondientes genes de la HIP genómicos y secuencias reguladoras. De forma alternativa, cuando la secuencia de cADN va a ser utilizada como parte de la construcción de eliminación, el cADN puede ser obtenido por selección de una biblioteca de cADN tal como se ha establecido anteriormente.

En otra realización, el "animal no humano transgénico" de la invención es producido por introducción de transgenes en la línea germinal del animal no humano. Pueden utilizarse las células objetivo embrionales en varios estadios de desarrollo para introducir transgenes. Se utilizan diferentes métodos dependiendo del estado de desarrollo de la célula objetivo embrional. Se selecciona la línea(s) específica de cualquier animal utilizado para practicar esta invención para la buena salud general, buenos rendimientos de embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión, y buena idoneidad reproductiva. Además, el calotipo es un factor significativo. Por ejemplo, cuando se va a producir un ratón transgénico, se utilizan a menudo cepas tales como las líneas C57BL/6 o FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Las cepas preferidas son aquellas con calotipos H-2^{b}, H-2^{d} o H-2^{q} tales como las C57BL/6 o DBA/1. La(s) línea(s) utilizada(s) para poner en práctica esta invención pueden ser transgénicas, en sí mismas, y/o pueden ser eliminaciones (es decir, obtenidas de animales que tienen uno o más genes parcialmente o completamente suprimidos).

En una realización, la construcción del transgen es introducida en un embrión de estadio único. El zigoto es el mejor objetivo para la micro-inyección. El uso de zigotos como un objetivo para la transferencia génica tiene una principal ventaja en que en la mayoría de los casos el ADN inyectado será incorporado en el gen huésped antes de la primera rotura (Brinster y col. (1985) PNAS 82: 4438-4442). Como consecuencia, todas las células del animal transgénico llevarán el transgen incorporado. En general, esto se reflejará en la eficiente transmisión del transgen al vástago del fundador ya que el 50% de las células germen abrigarán el transgen.

La introducción de la secuencia de nucleótidos del transgen en el embrión puede conseguirse por cualquiera de los medios conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, la microinyección, la electrofiltración, o la lipofección. Después de la introducción de la secuencia de nucleótidos del transgen en el embrión, el embrión puede ser incubado in vitro durante periodos de tiempo variables, o puede ser reimplantado en el huésped subrogado, o ambos. La incubación in vitro hasta la maduración se encuentra incluida dentro del alcance de esta invención. Un método común es la incubación de los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de las especies, y a continuación reimplante del mismo en el huésped subrogado.

Puede utilizarse cualquier técnica que permita la adición de material genético exógeno en el material de ácido nucleico en tanto en cuanto no sea destructivo para la célula, la membrana nuclear u otras estructuras genéticas o celulares existentes. El material genético exógeno es insertado de forma preferencial en el material genético nucleico por microinyección. La microinyección de las células y de las estructuras celulares es conocida y utilizada en el estado de la técnica.

La reimplantación se consigue utilizando métodos estándar. Normalmente, se anestesia el huésped subrogado, y se inserta el embrión en el oviducto. El número de embriones implantados en un huésped particular variará según la especie, pero normalmente será comparable al número de especies que se producen de forma natural.

Puede investigarse la producción transgénica del huésped subrogado para determinar la presencia y/o la expresión del transgen por cualquier método adecuado. La investigación se lleva a cabo a menudo por el análisis de manchas Southern o Northern, utilizando una sonda que sea complementaria a al menos una parte del transgen. Puede utilizarse el análisis de manchas Western utilizando un anticuerpo contra la proteína codificada por el transgen como un método alternativo o adicional para la determinación de la presencia del producto del transgen. De forma típica, se prepara el ADN a partir de tejido escindido y se analiza por el análisis Southern o por la PCR para el transgen. De forma típica, el ADN es preparado a partir de tejido escindido y es analizado por el análisis Southern o por la PCR para el transgen. De forma alternativa, se analizan los tejidos o las células que se cree que expresan el transgen a los mayores niveles para determinar la presencia y expresión del transgen utilizando el análisis Southern o la PCR, aunque puede utilizarse para este análisis cualquier tejido o tipo de célula.

También puede utilizarse la infección retroviral para introducir el transgen en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo puede ser cultivado in vitro hasta el estado de blastocito. Durante este tiempo, los blastodermos pueden ser objetivos por infección retroviral (Jaenich R. 81976) PNAS 73: 1260-1264). Se obtiene la infección eficiente de los blastodermos por el tratamiento enzimático para eliminar la zona diáfana (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El sistema de vector viral utilizado para introducir el transgen es típicamente un retrovirus de replicación defectuosa que lleva el transgen (Jahner y col. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten y col. (1985) PNAS 82: 6148-6152). La transfección es obtenida de forma fácil y eficiente mediante el cultivo de los blastodermos en una monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, supra; Stewart y col. (1987) EMBO J. 6:383-388). De forma alternativa, la infección puede ser llevada a cabo en un estadio posterior. El virus o las células productoras del virus pueden ser inyectados en el blastocoelo (Jahner y col. (1982) Nature 298: 623-628). La mayoría de los fundadores será mosaico para el transgen ya que sólo se produce la incorporación en un subconjunto de células que forman el animal no humano transgénico. Además, el fundador puede contener varias inserciones retrovirales del transgen a diferentes posiciones en el genoma que generalmente segregará en el origen. Además, también es posible introducir transgenes en la línea del germen por infección retroviral intrauterina del embrión a media gestación (Jahner y col. (1982) supra).

Un tercer tipo de célula objetivo para la introducción del transgen es la célula de raíz embrional (ES). Las células ES son obtenidas a partir de embriones pre-implantados cultivados in vitro y fusionadas con embriones (Evans y col. (18981) Nature 292: 154-156; Bradley y col. (1984) Nature 309:255-258; Gossler y col. (1986) PNAS 83: 9065-9069; y Robertson y col. (1986) Nature 322: 445-448). Los transgenes pueden ser eficientemente introducidos en las células ES por transfección de ADN o por transducción mediada por retrovirus. Dichas células ES transformadas pueden ser combinadas a continuación y contribuir a la línea germinal del animal quimérico resultante. Para revisión ver R. Jaenisch (1988) Science 240: 1468-1474.

En una realización, puede utilizarse la selección de genes, que es un método de utilización de la recombinación homóloga para modificar un genoma de animal, para introducir cambios en las células de raíz embriónica. Mediante la selección del gen de la HIP en células ES, estos cambios pueden ser introducidos en las líneas germinales de animales para generar quimeras. El procedimiento de selección de genes se lleva a cabo por introducción de una construcción seleccionada de ADN en las células de cultivo de tejido que incluye un segmento homólogo a un sitio de la HIP, y que también incluye una modificación de la secuencia pretendida a la secuencia genómica de la HIP (por ej., inserción, eliminación, mutación de punto). Las células tratadas son seleccionadas a continuación por selección precisa para identificar y aislar aquellas que han sido adecuadamente seleccionadas.

La selección de genes en células raíz embriónicas es, de hecho, un esquema contemplado por la presente invención como un medio para la rotura de una función del gen de la HIP mediante el uso de una construcción del transgen objetivo diseñado para sufrir la recombinación homóloga con las secuencias genómicas de la HIP. La construcción objetivo puede ser ordenada de modo que, mediante la recombinación con un elemento de un gen de la HIP, se inserte un marcador selectivo positivo en (o sustituya a) las secuencias de codificación del gen de la HIP objetivo. La secuencia insertada rompe de modo funcional el gen de la HIP, mientras que también proporciona un rasgo de selección positivo.

Generalmente, las células de raíz embriónica (células ES) utilizadas para producir los animales de eliminación serán de las mismas especies que el animal de eliminación a generar. De este modo por ejemplo, las células de raíz embriónica de ratón se utilizarán normalmente para la generación de ratones de eliminación de la HIP.

Las células de raíz embriónica son generadas y mantenidas utilizando métodos bien conocidos para los expertos en la materia tal como los descritos por Doetschman y col. (1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45). Puede utilizarse cualquier línea de células ES, aunque, la línea escogida es típicamente seleccionada por la capacidad de las células para integrar en y formar parte de la línea del germen de un embrión en desarrollo de modo que se cree la transmisión de la línea de germen de la construcción de eliminación. De este modo, cualquier línea de células ES que se crea que tiene esta capacidad es adecuada para uso en la presente invención. Las células son cultivadas y preparadas para la inserción de la construcción de eliminación utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, tales como los establecidos por Robertson en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C. [1987]); por Bradley y col. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371); y por Hogan y col. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1986]).

La inserción de la construcción de eliminación en las células ES puede conseguirse utilizando una variedad de métodos bien conocidos en el estado de la técnica incluyendo por ejemplo, la electrofiltración, microinyección, y tratamiento con fosfato cálcico. Un método preferido de inserción es la electrofiltración.

Cada construcción de eliminación a ser insertada en la célula primero debe estar en la forma lineal. Por consiguiente, si la construcción de eliminación ha sido insertada en un vector, la linealización se consigue por digestión del ADN con una endonucleasa de restricción adecuada seleccionada para cortar sólo dentro de la secuencia del vector y no dentro de la secuencia de construcción de eliminación.

Para la inserción, la construcción de eliminación se añade a las células ES bajo condiciones apropiadas para el método de inserción escogido, tal como es conocido por el experto en la materia. Cuando se vaya a introducir más de una construcción en la célula ES, cada construcción de eliminación puede ser introducida de forma simultánea o una a un tiempo.

Si las células ES van a ser electrofiltradas, las células ES y el ADN de la construcción de eliminación son expuestas a un pulso eléctrico utilizando una máquina de electrofiltración y siguiendo las guías del fabricante para su uso. Después de la electrofiltración, las células ES son dejadas para recuperar, de forma típica, bajo condiciones de incubación adecuadas. Las células son seleccionadas a continuación para la presencia de la construcción de eliminación.

La selección puede llevarse a cabo utilizando una variedad de métodos. Cuando el gen marcador sea un gen de resistencia a los antibióticos, las células ES pueden ser cultivadas en presencia de una concentración letal de otro modo de antibiótico. Aquellas células ES que sobrevivan presumiblemente tienen integrada la construcción de eliminación. Si el gen marcador es diferente de un gen resistente al antibiótico, puede investigarse una mancha Southern del ADN genómico de la célula ES con una secuencia de ADN diseñada para hibridar sólo a la secuencia marcador. De forma alternativa, la PCR puede ser utilizada. Finalmente, si el gen marcador es un gen que codifica una enzima cuya actividad puede ser detectada (por ej., \beta-galactosidasa), el sustrato de la enzima puede ser añadido a las células bajo condiciones adecuadas y puede analizarse la actividad enzimática. Un experto en la materia será familiar con otros marcadores útiles y el medio para detectar su presencia en una célula dada. Todos dichos marcadores son contemplados como incluidos en el alcance de las enseñanzas de esta invención.

La construcción de eliminación puede integrar en varias localizaciones en el genoma de la célula ES, y puede integrar en una diferente localización en cada genoma de la célula ES debido al acontecimiento de sucesos de inserción al azar. La localización de inserción deseada está en una posición complementaria a la secuencia de ADN a eliminar, por ej., la secuencia de codificación de la HIP, la secuencia reguladora transcripcional, etc. De forma típica, menos de aproximadamente del 1-5 por cien de las células ES que llevan la construcción de eliminación integrarán realmente la construcción de eliminación en la localización deseada. Para identificar aquellas células ES con una adecuada integración de la construcción de eliminación, puede extraerse el ADN total de las células ES utilizando métodos estándar. A continuación puede investigarse el ADN en una mancha Southern con una investigación o investigaciones diseñadas para hibridar en un modelo específico para digerir el ADN genómico con una enzima(s) de restricción particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el ADN genómico puede ser amplificado por la PCR con investigaciones diseñadas específicamente para amplificar los fragmentos de ADN de un tamaño y secuencia particular (es decir, sólo aquellas células que contengan la construcción de eliminación en la posición adecuada generarán los fragmentos de ADN del tamaño adecuado).

Después de que se hayan identificado las células ES adecuadas que contengan la construcción de eliminación en la localización adecuada, las células pueden ser insertadas en un embrión. La inserción puede conseguirse de una variedad de maneras conocidas por los expertos en la materia, aunque un método preferido es por microinyección. Para la microinyección, se recogen aproximadamente de 10 a 30 células en una micropipeta y se inyectan en embriones que se encuentran en el estadio de desarrollo adecuado para permitir la integración de la célula ES extraña conteniendo la construcción de eliminación en el embrión de desarrollo. Por ejemplo, las células ES transformadas pueden ser microinyectadas en los blastocitos.

Después de que la célula ES ha sido introducida en el embrión, el embrión puede ser implantado en el útero de una madre adoptiva pseudo-preñada para la gestación. Aunque puede utilizarse cualquier madre adoptiva, se selecciona de forma típica la madre adoptiva por su capacidad para alimentar y reproducir bien, y por su capacidad para cuidar la cría. Tales madres adoptivas son preparadas de forma típica por apareamiento con machos vasectomizados de las mismas especies. La etapa de la madre adoptiva pseudo-preñada es importante para la implantación exitosa, y es dependiente de la especie.

Los recién nacidos de la madre adoptiva pueden ser inicialmente seleccionados para los perturbadores de la HIP, el ADN del tejido del recién nacido puede ser seleccionado para determinar la presencia de la construcción de eliminación utilizando manchas Southern y/o la PCR tal como se ha descrito anteriormente. Los recién nacidos que parecen ser mosaicos pueden entonces ser cruzados entre sí, si se cree que llevan la construcción de eliminación en su línea de germen, con el fin de generar animales de eliminación homozigóticos. Los homocigotos pueden ser identificados por las manchas Southern de cantidades equivalentes de ADN genómico a partir de animales que son el producto de su cruce, así como animales que son conocidos heterocigotos y animales de tipo salvaje.

Son asequibles otros medios de identificar y caracterizar las fuentes de eliminación. Por ejemplo, pueden utilizarse las manchas Northern para investigar el mARN para determinar la presencia o ausencia de transcriptos tanto del gen de la HIP, el gen marcador, o ambos. Además, las manchas Western pueden ser utilizadas para valorar la (pérdida de) nivel de expresión del gen de la HIP eliminado en varios tejidos del recién nacido por investigación de la mancha Western con un anticuerpo frente la proteína de la HIP, o un anticuerpo contra el producto del gen marcador, en donde este gen es expresado. Finalmente, puede llevarse a cabo el análisis in situ (tal como por fijación de las células y marcaje con un anticuerpo) y/o análisis FACS (fuente de células activada por fluorescencia) de varias células del recién nacido utilizando anticuerpos adecuados o ligandos de la HIP, por ej., proteínas de hedgehog, para determinar la presencia o ausencia del producto del gen de eliminación.

Se preparan de diferentes maneras los animales que contienen más de una construcción de eliminación y/o más de una construcción de expresión del transgen en cualquiera de las diferentes maneras. El modo preferido de preparación es generar una serie de animales, conteniendo cada una unos fenotipos transgénicos deseados. Dichos animales son criados juntos a través de unas series de cruces, retrocruces y selecciones, para generar en último término un animal único conteniendo todas las construcciones de eliminación deseadas y/o las construcciones de expresión, en donde el animal es de otro modo congénito (genéticamente idéntico) al tipo salvaje excepto por la presencia de la
construcción(es) de eliminación y/o el transgen(es). De este modo, las especies de aves transgénicas pueden ser generadas por cría de una primera ave transgénica en la que el gen de la HIP de tipo salvaje es roto con una segunda ave transgénica que ha sido modificada por ingeniería genética para expresar un HIP mutante que retiene otras funciones biológicas del receptor.

Los animales transformados, su progenie, y las líneas celulares de la presente invención proporcionan diferentes usos importantes que serán fácilmente aparentes para un experto en la materia en el estado de la técnica.

Para ilustrar, los animales transgénicos y las líneas celulares son particularmente útiles en la selección de compuestos que tienen potenciales tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades como las que pueden implicar la expresión aberrante, o pérdida, de un gen de la HIP, o una activación aberrante o no deseada de la señalización del receptor. La selección de un fármaco útil implicaría la administración del fármaco candidato en un rango de dosis al animal transgénico, y ensayar a diferentes puntos de tiempo para el efecto(s) del fármaco en la enfermedad o trastorno a evaluar. De forma alternativa, o adicionalmente, el fármaco puede ser administrado antes o simultáneamente con la exposición a la inducción de la enfermedad, en el caso en que sea aplicable.

En una realización, los compuestos candidatos son seleccionados para ser administrados al animal transgénico, en un rango de dosis, y evaluar la respuesta fisiológica del animal al compuesto(s) con el tiempo. La administración puede ser oral, o por inyección adecuada, dependiendo de la naturaleza química del compuesto a evaluar. En algunos casos, puede ser apropiado administrar el compuesto conjuntamente con co-factores que intensificarían la eficacia del compuesto.

En la selección de líneas celulares derivadas de los animales transgénicos sujetos de la invención para los compuestos útiles en el tratamiento de diferentes trastornos, el compuesto de ensayo es añadido al medio de cultivo celular al tiempo apropiado, y se evalúa la respuesta celular al compuesto a lo largo del tiempo utilizando los ensayos bioquímicos y/o histológicos apropiados. En algunos casos, puede ser apropiado aplicar el compuesto de interés al medio de cultivo conjuntamente con co-factores que intensificarían la eficacia del compuesto.

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2103 pares de secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CÓDIGO: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2100

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2103 pares de secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CÓDIGO: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2100

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2085 pares de secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CÓDIGO: CDS

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(B)

SITUACIÓN: 1...2082

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:

13

14

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CÓDIGO: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...171

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:

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17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº:5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 700 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: doble

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:

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18

19

20

21

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 700 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:

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22

23

24

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 694 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:

25

26

27

28

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:

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29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 444 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:10:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 958 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:

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32

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:11:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 597 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:11:

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33

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:12:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 426 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:12:

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34

35

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:13:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1011 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:13:

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36

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:14:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 660 pares de secuencia

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:14:

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37

Claims (45)

1. Un polipéptido de la HIP (Proteína que Interacciona con Hedgehog) aislado y/o producido de forma recombinante, en donde dicho polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos al menos un 60% idéntica a cualquiera de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7, SEC ID No: 8, o un fragmento interactivo de hedgehog del mismo, en donde dicho polipéptido de la HIP se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog, y en donde dicho polipéptido de la HIP secuestra la proteína de hedgehog en la superficie de la célula para controlar la concentración efectiva de proteína de hedgehog.

2. El polipéptido de la HIP de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido es un polipéptido de mamífero.

3. El polipéptido de la HIP de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido es un polipéptido humano.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido puede estar codificado por un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nos. 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 y 14.

5. El polipéptido de las reivindicaciones 1 o 4, en donde el polipéptido es de una longitud de al menos 25 residuos de amino ácidos, y en donde dicho polipéptido se una a una proteína de hedgehog.

6. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de amino ácidos idéntica al menos en un 60% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en los residuos 16-678 de la SEC ID No: 5 y los residuos 16-678 de la SEC ID No: 6, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, cuyo polipéptido regula la proliferación de condroci-
tos.

8. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, cuyo polipéptido es una proteína de fusión.

9. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde el polipéptido favorece la diferenciación o la supervivencia de las células neuronales, y en donde la célula neuronal es una neurona dopaminérgica o una neurona motora.

10. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es idéntica al menos en un 70 por cien a la secuencia representada en una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

11. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es idéntica al menos en un 80 por cien a la secuencia representada en una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

12. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es idéntica al menos en un 90 por cien a la secuencia representada en una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

13. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es idéntica al menos en un 95 por cien a la secuencia representada en una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

14. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es idéntica a una secuencia representada en una de las SEC ID No: 5, SEC ID No: 6, SEC ID No: 7 y SEC ID No: 8, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

15. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos codificada por un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones astringentes, incluyendo una etapa de lavado de 0,2 X SSC a 65ºC, al ácido nucleico de la SEC ID No: 2, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

16. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde la secuencia de amino ácidos de la HIP corresponde a un fragmento de al menos 100 residuos de amino ácidos, y en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedge- hog.

\newpage

17. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de amino ácidos de la HIP inmunológicamente cross-reactiva con un anticuerpo que se une de forma específica a una proteína de la HIP teniendo una secuencia de amino ácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID No: 1, SEC ID No: 2, SEC ID No: 3 y SEC ID No: 4.

18. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado y/o producido de forma recombinante que es específicamente inmunoreactivo con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

19. Un anticuerpo monoclonal específicamente inmunoreactivo con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

20. Un hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 19.

21. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de codificación que codifica un polipéptido de la HIP, cuyo ácido nucleico hibrida bajo condiciones de severidad, incluyendo una etapa de lavado de de 0,2 X SSC a 65ºC, a una secuencia representada en al menos una de las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog, en donde dicho polipéptido de la HIP secuestra la proteína de hedgehog en la superficie de la célula para controlar la concentración efectiva de la proteína de hedgehog, y en donde dicho polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es al menos un 60% idéntica con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nos: 5, 6, 7 y 8.

22. El ácido nucleico de la reivindicación 21, en donde el polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácidos que es al menos un 70% idéntica con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nos: 5, 6, 7 y 8, y en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog.

23. Un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de codificación de la reivindicación 21 o 22, y (ii) una secuencia reguladora transcripcional heteróloga.

24. Un vector de expresión, capaz de replicar en al menos una de una célula procariótica y una célula eucariótica, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 21 o 22.

25. Una célula huésped transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 24 y que exprese dicho polipéptido recombinante.

26. Un método de producir un polipéptido de la HIP recombinante que comprende cultivar la célula de la reivindicación 25 en un medio de cultivo de células para expresar dicho polipéptido de la HIP y aislar dicho polipéptido de la HIP a partir de dicho cultivo de células.

27. Un sistema de transfección recombinante, que comprende

(i)

una construcción de un gen que incluye el ácido nucleico de la reivindicación 21 o 22 unido de forma operable a una secuencia reguladora transcripcional para causar la expresión del polipéptido de la HIP en células eucarióticas, y

(ii)

una composición de liberación del gen para la liberación de dicha construcción del gen a una célula y causar que la célula sea transfectada con dicha construcción del gen.

28. El sistema de transfección recombinante de la reivindicación 27, en donde la composición de liberación del gen está seleccionada entre un grupo que consiste en una partícula viral recombinante, un liposoma, y un agente de unión de un ácido nucleico poli-catiónico.

29. Una preparación purificada de un ácido nucleico antisentido que hibrida de forma específica a e inhibe la expresión de un gen de la HIP bajo condiciones fisiológicas, cuyo gen de la HIP comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de severidad, incluyendo una etapa de lavado de de 0,2 X SSC a 65ºC, a una secuencia representada en al menos una de las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, y cuyo gen de la HIP comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos que es al menos un 60% idéntica con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nos: 5, 6, 7 y 8,

en donde dicho ácido nucleico antisentido es al menos uno de

(i)

un oligonucleótido sintético,

(ii)

de hebra simple,

(iii)

lineal,

(iv)

de una longitud de 10 a 50 nucleótidos, y

(v)

un análogo de ADN resistente a la degradación de nucleasa.

30. La preparación de la reivindicación 29, cuyo ácido nucleico antisentido es un análogo de ADN resistente a la degradación de nucleasa.

31. Un animal trangénico no humano en el que la vía de transducción de la señal dependiente de la HIP está inhibida en uno o más tejidos del animal por interrupción de un gen de la HIP, en donde dicho gen de la HIP comprende una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de severidad, incluyendo una etapa de lavado de 0,2 X SSC a 65ºC, a una secuencia representada en al menos una de las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog, y en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de amino ácidos que es al menos un 60% idéntica con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nos: 5, 6, 7 y 8.

32. Un ensayo para la identificación de compuestos que modula la bioactividad de la HIP, que comprende:

(a) la formación de una mezcla de reacción que incluye:

(i)

un polipéptido de la HIP, cuyo polipéptido de la HIP comprende una secuencia de amino ácido codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de severidad, incluyendo una etapa de lavado de 0,2 X SSC a 65ºC, a una secuencia representada en al menos una de las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en donde dicho polipéptido se une a una proteína de hedgehog y modula la señal de hedgehog, y en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de amino ácidos que es al menos un 60% idéntica con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nos: 5, 6, 7 y 8.

(ii)

una proteína de hedgehog, y

(iii)

un compuesto de ensayo; y

(b) la detección de la interacción del polipéptido de la HIP y de la proteína de hedgehog; en donde, un cambio en la interacción de la proteína de hedgehog y del polipéptido de la HIP en la presencia del compuesto de ensayo, en relación con la interacción en la ausencia del compuesto de ensayo, indica una potencial actividad de modulación de la HIP para el compuesto de ensayo.

33. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la mezcla de reacción es una preparación de proteína libre de células.

34. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la mezcla de reacción comprende una célula recombinante incluyendo un ácido nucleico heterólogo que expresa de forma recombinante el polipéptido de la HIP.

35. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la etapa de detección de la interacción de la proteína hedgehog y el polipéptido de la HIP comprende un ensayo de unión competitivo.

36. El ensayo de la reivindicación 34, en donde la etapa de detección de la interacción de la proteína hedgehog y el polipéptido de la HIP comprende la detección de cambio en el nivel de un segundo mensajero intracelular responsable de la señalización por la proteína de hedgehog.

37. El ensayo de la reivindicación 34, en donde la etapa de detección de detección de la interacción de la proteína hedgehog y el polipéptido de la HIP comprende la detección de un cambio en el nivel de expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora transcripcional responsable para la transducción de la señal de hedgehog.

38. El ensayo de la reivindicación 34, en donde la célula recombinante carece de la expresión de una proteína de la HIP endógena.

39. El ensayo de la reivindicación 34, en donde la célula recombinante co-expresa una proteína parcheada.

40. El ensayo de la reivindicación 34, en donde la célula recombinante co-expresa una proteína suavizada.

41. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la mezcla de reacción es una preparación de membrana celular.

42. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la mezcla de reacción es una mezcla de proteína reconstituida.

43. El ensayo de la reivindicación 32, en donde la mezcla de reacción es un liposoma reconstituyente del polipéptido de la HIP como un receptor de hedgehog.

44. El ensayo de la reivindicación 32, en donde las etapas del ensayo son repetidas para una biblioteca variada de al menos 100 compuestos de ensayo diferentes.

45. El ensayo de la reivindicación 32, en donde el compuesto de ensayo está seleccionado entre el grupo que consiste en moléculas orgánicas pequeñas, y extractos de productos naturales.